Тема 8 КУЛЬТИВИРОВАНИЕ И РОСТ МИКРООРГАНИЗМОВ

8.1 Закономерности роста популяций микроорганизмов

8.2. Понятие о чистых и накопительных культурах микроорганизмов
8.3 Процессы культивирования микроорганизмов
8.4 Закономерности роста статической и непрерывной культуры
8.5. Хранение микроорганизмов
8.1. Закономерности роста популяций микроорганизмов

Под ростом понимают согласованное увеличение количества всех химических

компонентов, формирующих клеточные структуры.
Рост клеток обычно сопровождается увеличением их массы и размеров. Однако эта
закономерность наблюдается не всегда, так как в некоторых условиях клетки способны
просто накапливать запасные или резервные вещества, т. е. масса может увеличиваться, но
роста при этом не наблюдается.
В подходящей же среде, к которой бактерии полностью адаптированы, они
находятся в состоянии сбалансированного роста. В период сбалансированного роста
удвоение биомассы сопровождается удвоением всех других учитываемых параметров
популяции, например количества белка, ДНК, РНК и внутриклеточной воды. Иными
словами, культуры, растущие сбалансированно, сохраняют постоянный химический
состав.
В условиях сбалансированного роста легко определить величину скорости роста
бактериальной популяции в каждый момент времени, если измерить прирост любого
компонента клетки по отношению к его исходному количеству.
Таким образом, в культуре, растущей сбалансированно, скорость прироста
вещества клеток в любой данный момент пропорциональна числу или массе
имеющихся в это время бактерий.
Коэффициент пропорциональности называют удельной скоростью роста (µ).
Данная величина отличается для разных культур, и даже для одной культуры в зависимости
от условий выращивания она меняется.
Удельную скорость роста рассчитывают по формуле:

где N0, N – число клеток в единице объема; t0, t – время.

Зная удельную скорость роста, можно определить время генерации (g – время,

необходимое для удвоения числа клеток популяции (в часах или минутах):

Таблица 8.1. Время генерации микроорганизмов

Микроорганизмы Температура, oC Время генерации, ч
Бактерии:
Escherichia coli 40 0,35
Bacillus subtilis 40 0,43
Clostridium botulinum 37 0,58
Mycobacterium tuberculosis 37 12
Грибы:
Saccharomycescerevisiae Monilia fructicola 30 2
25 30
 Масса клеток, образованная на единицу использованного компонента среды,
представляет собой величину, которую называют экономическим коэффициентом (или
выходом биомассы) – Y. Эту величину определяют по уравнению
𝑋 − 𝑋0
𝑌=
𝑆0 − 𝑆
где Х – масса сухого вещества клеток (г/мл культуры), вступившей в
стационарную фазу роста; Х0 – масса сухого вещества клеток в 1 мл среды сразу после
инокуляции среды; (Х – Х0) – урожай бактериальной культуры (урожай зависит от
количества и природы используемых питательных веществ, а также от условий
культивирования); (S0 – S) – количество потребленного субстрата (компонента среды).

8.2. Понятие о чистых и накопительных культурах микроорганизмов

Выращивание микроорганизмов в лабораторных условиях на питательных средах
называется культивированием, а развившиеся в таких средах микроорганизмы -
культурой.
При культивировании происходит рост культуры - физиологический процесс, в
результате которого увеличивается биомасса - масса клеточного вещества данного
микроорганизма.
Чистой культурой микроорганизма называют культуру, которая представлена
потомством одной клетки.
При определении чистоты культуры учитывают морфологию колоний,
формирующихся на плотных питательных средах, оценивая следующие признаки:
 размер (диаметр) – измеряют в миллиметрах. Различают мелкие колонии
диаметром 1-3 мм, средние размером от 2 до 4 мм и крупные, размер которых составляет 4
мм и более. Если размеры колонии не превышают 1 мм, то их называют точечными;
 цвет – бесцветная (грязно-белые колонии относят к бесцветным) или
пигментированная; особо отмечают выделение в субстрат пигмента; Цвет колоний иногда
является видовым признаком и входит в название. Например, золотистый стафилококк,
цианобактерии, пурпурные бактерии, синегнойная палочка и другие получили свои
названия из-за характерной окраски их колоний, выращенных на питательной среде.
 профиль – плоский, выпуклый, кратерообразный, конусовидный и т.д.;

Рис. 8.1. Профиль колонии

1 – изогнутый; 2 – кратерообразный; 3 – бугристый;
4 – врастающий в субстрат; 5 – плоский; 6 – выпуклый;
4 – каплевидный; 8 – конусовидный

 поверхность – гладкая, шероховатая, бороздчатая, складчатая, морщинистая,

с концентрическими кругами или радиально исчерченная;
 консистенцию: колония может легко сниматься с агара, быть плотной,
мягкой или врастающей в агар, маслянистой, слизистой (прилипает к петле), вязкой,
пленчатой (снимается целиком), быть хрупкой (легко ломается при прикосновении петлей);
  форму – округлая, амебовидная, неправильная, ризоидная и т.д.;

Рис. 8.2. Форма колонии

1 – круглая; 2 – круглая с фестончатым краем; 3 – круглая с валиком по краю;
4, 5 – ризоидные; 6 – с ризоидным краем; 7 – амебовидная; 8 – нитевидная;
9 – складчатая; 10 – неправильная; 11 – концентрическая; 12 – сложная

 край – ровный, волнистый, зубчатый, лопастной, ризоидный, бахромчатый и

т.д.;

Рис. 8.3. Край колонии

1 – гладкий; 2 – волнистый; 3 – зубчатый; 4 – лопастной; 5 – неправильный; 6 –
реснитчатый; 7 – нитчатый; 8 – ворсинчатый; 9 – ветвистый

 структуру – однородная, мелко- или крупнозернистая, струйчатая и т.д.;

Рис. 8.4. Структура колонии

1 – однородная; 2 – мелкозернистая; 3 – крупнозернистая;
4 – струйчатая; 5 – волокнистая
  блеск и прозрачность – колония блестящая, матовая, тусклая, мучнистая,
прозрачная;
 пропускание света. Бывают просвечивающие, или прозрачные, и
непрозрачные бактериальные колонии;
 степень погружения в среду. Большинство колоний живут на поверхности
субстрата. Однако существуют также глубинные, в виде чечевичек, погруженных в толщу
среды, и донные бактерии, образующие пленки на дне сосудов с питательной средой;
 люминесценция. Известны также несколько видов аэробных бактерий,
способные к фосфоресценции (люминесценции). Их колонии способны до суток светиться
желтоватым или зеленоватым цветом. Фотобактерии – жители различных водоемов,
встречаются на чешуе и мясе рыбы. Их морфология может быть различной – среди
светящихся видов встречаются кокки, вибрионы, палочки.
В жидком субстрате морфология бактериальных колоний характеризуется
образованием равномерной мути, пленки или осадка.

Рис. 8.5. Морфология бактериальных колоний в жидком субстрате

В полужидких средах при посеве уколами подвижные бактерии вызывают

помутнение в толще среды вокруг места посева, а неподвижные – только в самом месте
укола. Некоторые бактерии в аэробных и анаэробных условиях выделяют различные газы
(индол, скатол, меркаптан, сероводород, масляная кислота, диэтиловый эфир и тому
подобное).
Естественным путем получить чистую культуру почти невозможно, поэтому ее
получают искусственно.
Свойства микроорганизмов, учитываемые при выделении культуры
1. Тип дыхания.
2. Спорообразование. Способность некоторых бактерий к спорообразованию
обеспечивает защиту и сохранность микроорганизмов.
3. Устойчивость бактерий к агрессивному воздействию щелочей и кислот.
Устойчивость некоторых видов бактерий к данным веществам обеспечивает максимальное
очищение исследуемого материала от примеси других бактерий с применением растворов
щелочи либо кислоты.
4. Подвижность бактериальных организмов.
5. Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам, некоторым химическим
веществам и другим антимикробным средствам. Для некоторых возбудителей наиболее
предпочтительны методы выделения культур с применением селективных
(специфических) питательных сред.
6. Антибиотики. Очищают материал от дополнительных микроорганизмов.
Для выделения чистой культуры используют плотные питательные среды, на
которых каждая клетка вырастает в виде изолированной колонии - популяции
микроорганизмов одного вида.
 Методы выделения чистых культур
1. Механическое разобщение на поверхности плотной питательной среды (метод
штриха обжигом петли, метод разведений в агаре, распределение по поверхности твёрдой
питательной среды шпателем, метод Дригальского).
2. Использование элективных питательных сред.
3. Создание условий, благоприятных для развития одного вида (рода) бактерий
(среды обогащения).
Перед выделением чистой культуры из какого-либо пищевого продукта или
природного субстрата (например: почвы, воды), в котором данный микроорганизм
находится в небольших количествах, вначале получают накопительные культуры,
проводя культивирование в элективных условиях.
Понятие «накопительная культура» было придумано российским микробиологом
Виноградским.
Накопительные культуры состоят преимущественно из клеток микроорганизмов
одного вида.
Элективные (накопительные) условия - условия, способствующие развитию
одной культуры и ограничивающие развитие сопутствующих микроорганизмов.
Создать накопительные условия можно путем использования накопительных сред.
Примером элективных условий может быть повышенная температура (для
выделения термоустойчивых форм бактерий), повышенная кислотность, повышенная
концентрация соли и т.д.
В микробиологии выведение бактерий аэробного типа может происходить в
следующих условиях:
 Условия, для которых берутся плотные питательные среды либо прослойка
жидкой среды, в которой получение кислорода происходит из окружающего воздуха.
 Условия, при которых размножение происходит в питательных жидких
средах (глубинный метод культивирования). Получение кислорода микроорганизмами в
данном случае происходит из растворенных в жидкости молекул. Чтобы при низком
содержании кислорода бактерии аэробного типа росли более интенсивно, жидкость
необходимо постоянно аэрировать.
Используя такие методы, можно получить чистые аэробные культуры,
используемые для разнообразных целей в пищевой индустрии (Например, бифидобактерии
рода Sporolactobacillus и Bacillus).
Принципы выращивания анаэробных микроорганизмов представляют собой более
длительную и хлопотную процедуру, чем культивирование аэробных форм. Связано это с
тем, что контакт культур с кислородом нужно свести к минимуму.
Чтобы анаэробные условия были правильными, применяются разные методы,
которые условно разделяются на:
- физические;
- химические;
- биологические.
Несмотря на свои особенности, все они имеют один сходный принцип – обеспечение
замкнутого пространства.

К физическим методам накопления относят:

 регуляцию роста температурой,
 тепловую и ультразвуковую обработку,
 ультрафиолетовое облучение,
Эти методы приводят к гибели или подавлению роста других организмов,
присутствующих в популяции, но существенно не затрагивают выделяемые клетки. Можно
также использовать преимущества в некоторых физических свойствах изучаемого
микроорганизма, таких как его размеры и подвижность; это позволяет в значительной мере
отделить данный организм от других в популяции.
Под физическими методами культивирования подразумевается выращивание
микроорганизмов посредством микроанаэростата. В данном вакуумном агрегате вместо
воздуха применяется газовая смесь.
К химическим методикам культивирования можно отнести:
 методы, при которых используются химические вещества, способные
поглощать кислородные молекулы. Для реализации в лабораторных условиях берутся
хлорид меди одновалентной (CuCl), дитионит натрия (Na₂S₂O₄), а также другие реактивы.
 метод, для которого используются восстанавливающие агенты, добавляемые
с целью уменьшения окислительно-восстанавливающего эффекта среды. Происходит это
благодаря, например, аскорбиновой кислоте или цистеину.
Для выполнения биологических способов размножения бактерий применяется, к
примеру, чашка Петри, разделенная на две половины посредством желобка. В одной из
половин помещаются анаэробные, а в другой – аэробные микроорганизмы, после чего края
чаши заливаются парафином. Как только аэробы используют весь кислород, активируется
рост анаэробных организмов.
Для культивирования, например, молочнокислых бактерий могут применяться
следующие способы:
1. Посев в высокие слоя питательных сред.
2. Размножение в плотных средах (с самой их толще).
3. Размножение в вязких условиях, при которых процесс диффузии
кислородных молекул в жидкость снижается при повышении ее плотности.
4. Культивирование при помощи вазелинового масла либо стерильного
парафина, заливаемого в питательную среду.
В пищевой промышленности применяют чистые культуры дрожжей,
молочнокислых, уксуснокислых, пропионовокислых бактерий, обладающих ценными
свойствами для производства. В последнее время находят успешное применение
многокомпонентные чистые культуры, состоящие из двух и более видов микроорганизмов.
Работа по получению и поддержанию чистых культур промышленных
микроорганизмов осуществляется в научно-исследовательских лабораториях. Там они
выделяются из различных субстратов, изучаются и наиболее продуктивные, пригодные для
производства, хранятся в коллекции музея чистых культур, откуда рассылаются
отраслевыми научно-исследовательскими институтами на предприятия. В заводской
лаборатории микробиолог подготавливает культуру для производственного цикла,
проверяет ее биологическую чистоту, активность.

Литература

1. Шлегель Г. Общая микробиология. -М.: Мир.1987.- 500 с.

2. Грачева И.М. Технология микробного синтеза белков, аминокислот. - М.: Пищевая
пром-ть, 1980. - 400 с.
3. Чурбанова И.Н. Микробиология. - М-: Высшая школа, 1987.