Immunoanal Biol Sp6c (1993) 8, 43-49 43

© Elsevier, Paris

Techniques au quotidien

I valuation analytique d'une technique

immuno-enzymofluorimdtrique de dosage
de la T3 libre. Effets de la concentration
de sdrum albumine
D Kha!fon, MP Coulhon, D Duchassaing

Service de biochimie, CH Victor-Dupouy, 69, rue du Lt-ColoneI-Prudhon, 95107 Argenteuil Cedex, France

(Re£u le 17 mars 1992; accept~ le 15 juin 1992)

R6sum~ - - Le dosage de la. T3 libre sur I'lMx, recemment commercialise par la societ6 Abbott, a et6 ~value
analytiquement et I'influence de diverses pathologies sur ce parametre a et6 6tudi6e. II s'agit d'une m~thode
immuno-~enzymofluorim~trique en deux 6tapes, utilisant des microparticules sph~riques rev~tues d'un anticorps
anti-T3. Notre etude a montr6 que cette methode associe & une tres bonne praticabilite (r~alisation automa-
tique) des resultats analytiques satisfaisants (r6p6tabilite < 3%, reproductibilite < 10%, limite de detection &
0,60 pmol/I). Les valeurs de r#ference des temoins sains (5,5 & 8,8 pmol/I) different statistiquement de celles
des hospitalis6s (3,2 & 7,6 pmol/I; P< 0,001). La baisse de la T3 libre est significative dans le groupe <<r6-
animation >>, dans lequel les patients sont tous hypoalbuminemiques. Albumine et T3 libre sont correlees
positivement (test de Pearson, r= 0,79).
triiodothyronine libre / dosage immuno-enzymofluorim~trique / statut thyroi'dien

Summary m Analytical evaluation of an immunofluorimetric assay of free T3. Analytical results of free
triiodothyronine (FT3 - /Mx - Abbott) as we// as the influence of some pathologies are reported. /t is a
two-step enzyme-immunofluorimetric assay using antibody anti-T3 coated micropartic/es. /t associates practical
use (automatic rea/isation) with satisfactory analytical results: reproductibi/ity intra-assay CV < 3%, between-
assay CV < 10% and tbw detection limit (0,60 pmo///). Reference ranges were statistically different for non-
hospitalized (5,5 ~ 8,8 pmo///) and hospitalized euthyroid patients (3,2 to 7,6; P < 0,001). The lower/eve/ of
the FT3 is significant in the 'intensive care" group in which patients are all hypoa/buminemic. We found a
significant correlation between FT3 and albuminemia (Pearson's test, r = 0,79).
free triiodothyronine / enzyme immunofluorimetric assay / thyroid status

Introduction Notre travail a pour but d'6valuer analytique-

La triiodothyronine (T3) et la thyroxine (T4) cir-
culent dans le serum sous forme liee & des
proteines: thyroxine b i n d i n g g l o b u l i n (TBG),
thyroxine b i n d i n g p r e a l b u m i n e (TBPA) et albu-
mine. On estime qu'environ 80% de la T3
s6rique est li~e & la TBG, le reste ~tant lie &
la TBPA et & I'albumine.
Environ 0,3% de la T3 circule sous forme
libre en 6quilibre avec la fraction li6e. Cette
fraction libre represente I'hormone thyrotdienne
physiologiquement active [5, 8].
La mesure de la fraction fibre n'est pas in-
fluencee par la concentration des prot~ines
vectrices, cet avantage consid6rable explique
I'expansion de ces techniques qui ont supplan-
te le dosage de la T3 totale (libre + liee) [6].
ment une nouvelle methode, (IMx Abbott), de
definir les valeurs usuelles de notre population
et d'~tudier I'influence de diverses pathologies
sur ce param~tre.
Matdriel et m ~ t h o d e s
Population
La population saine est composee de 100 sujets
donneurs de sang, &ges de 22 b.~8 ans venus au
CH d'Argenteuil.
Les patients hospitalis#s sont euthyrofdiens
d'apres I'examen clinique et le dosage de la TSH
(thyreostimuline). Ont ~t~ exclus ceux dont la prise
m6dicamenteuse interfere sur le dosage des hor-
mones thyro'fdiennes (amiodarone...). Cinquante-
44 D Khalfon et al

deux patients sont retenus. IIs se repartissent, selon Rdsultats et discussion

leur pathologie, en six groupes: 14 diabetes, trois
insuffisances renales chroniques, neuf cardiopa-
thies, sept tumeurs malignes, 12 divers et sept pa-
tients hospitalises en reanimation.
M#thodes
E-chantillons
Les serums sont conserves & - 2 0 °C dans I'attente
de dosage.
- Mesure de I'albumine: par nephelemetrie (BNA,
Behring).
- Mesure de la T3 libre: aspect theorique.
Le dosage de la T3 libre repose sur un principe
nouveau: technique immun-oenzymatique micro-
particulaire (MEIA). Son originalite repose sur I'uti-
lisation d'une phase solide de microparticules de
tres faible diam~tre recouvertes d'un anticorps de
tres haute specificite.
L'importance de la surface de contact offerte au
complexe antigene-anticorps augmente la vitesse
de reaction et reduit le temps d'incubation.
II s'agit d'une saturation sequentielle en deux
etapes en phase heterogene:
- immuno-extraction de la T3 libre de I'echantillon
gr&ce & un anticorps anti-T3 fixe sur les micropar-
ticules;
- saturation des sites restes libres par un conjugue
T3-phosphatase alcaline.
Ce conjugue catalyse I'hydrolyse du phosphate
de methyl-4-ombelliferone (MOP) en methyl-4 om-
belliferone (MO) fluorescente qui emet apres exci-
tation & 365 nm une fluorescence lue & 448 nm. La
lecture du signal est faite en cinetique de fluores-
cence, son intensite varie en fonction inverse de la
concentration en T3 libre de I'echantillon.
Mode op#ratoire
La calibration de I'appareil est realisee & chaque
changement de lot, en dosant chaque standard en
double. La courbe est alors memorisee. Elle s'etend
de 0 & 46 pmol/l.
L'ajustement de la courbe de calibration est as-
suree & I'aide d'un calibrateur. Les resultats sont
exprimes en pente de cinetique de fluorescence,
correspondant au mot rates (R) utilise par I'appareil.
La cadence de I'automate permet la realisation
de 24 tests en 40 minutes.
Comparaison de methodes
Pour les calculs de correlation, les dosages RIA ont
ete effectues & I'H6pital americain par la technique
Amerlex M (Amersham). C'est une methode radio-
immunologique par competition utilisant comme tra-
ceur un analogue de la T3 marque & 1'1251.
E-valuation analytique
Elle a ~te realis6e selon les recommandations
de la SFBC [1, 2, 11].
E-tude de la precision
La reproductibilit6 intras6rie (r~p~tabilite) est
realisee sur trois niveaux de contr61e (ta-
bleau I) ainsi que sur chaque point de la
gamme d'etalonnage mesur~ en dix r6plicates
dans les m~mes conditions, m6me reactif,
meme materiel, m6me exp~rimentateur. Les
param~tres statistiques: moyenne, ~cart type
et coefficient de variation (CV %) ont ~t~ cal-
culus, & partir de la pente de cin~tique de fluo-
rescence, et portes dans le tableau I1. Les CV,
inf~rieurs & 3%, sont excellents.
La reproductibilite interseries regroupe les
valeurs obtenues sur les trois niveaux de
contrSle (tableau III) ainsi que sur la gamme
d'etalonnage, au cours de s6ries differentes,
donc dans des conditions diff6rentes: r6actifs
de lots diff~rents, manipulateurs diff6rents (ta-
bleau IV).
Les CV sont bons, inferieurs & 10%.
Courbe erreur en fonction de la reponse:
courbe RER
On ~tablit une courbe reliant 1'6cart type & I'in-
tensit~ de la r6ponse (R) en coordonn6es li-
n~aires (fig 1).
L'6quation de la droite est ~ = 0,02R + 1,02.
Intervalle de confiance
L'intervalle de confiance t c~ est obtenu en mul-
tipliant I'ecart type G par la valeur t tir~e de
la table de Student; on choisit une valeur de
Tableau I. Reproductibilite intras6rie sur les trois niveaux
de contrSle.
C (pmol/I) Moyenne Ecart type CV %
L 4,4 0,33 7,4
M 9,1 0,32 3,5
H 29,6 1,42 4,8

Tableau II. Reproductibilite intras~rie sur les points de gamme.

C (pmol/I) 0 2, 15 5,40 10,75 23,00 46, 1

R
Moyen ne 969,4 813,8 646,4 415,0 200,1 109,7
Ecart type 15,7 14,2 11,8 6,7 4,6 2,6
CV % 1,6 1,7 1,8 1,6 2,2 2,3

n= 10; R= pente de cin6tique de fluorescence.

 I~valuation analytique d'une technique de dosage 45

t pour une probabilit6 de 95% et un nombre
de degres de liberte ~, egal & n - 1 , n etant le
nombre de r6plicates (n= 10; y= 9; t= 2,262).
Courbe d'#talonnage et enveloppe
courbe (tableau V)
Par interpolation lineaire, on trace la courbe
moyenne: R= f(C), (C: concentration en
pmol/I) et son enveloppe. Nous obtenons deux
courbes passant par R - t o e t R + t o (fig 2).
Profil de precision (tableau VI)
de la
Par le calcul, on 6value AC (egal & t o / p e n t e
de la courbe) pour chaque point de gamme.
On trace la courbe: A C = f(C) (fig 3). La va-
leur de AC peut ~tre divisee par C afin d'ob-
tenir le coefficient de variation: AC/C, qui est
ensuite porte en ordonn~e sur la m~me figure:

.j/.
AC/C= f(C) (fig 3).
Cette courbe, exprimant le coefficient de va-
riation de chaque serum de contrSle en fonc-
tion de sa concentration: CV = f(C), permet de
determiner la precision du systeme en fonction
de la concentration mesuree. Le profil de pr6-
cision permet donc d'apprecier la fiabilite ana-
lytique. Le CV est ~lev6 (29%) dans les tr~s
faibles concentrations (2,25 pmol/I); il est au-
tour des 10% aux concentrations habituelles
d'utilisation.

Limite de detection
On d6finit la limite de detection comme la plus
petite concentration fournissant une reponse
significativement differente de celle d'un blanc
(6chantillon identique en tous points & I'echan-
tillon a doser mais de concentration nulle). Elle
est appel~e aussi d6tectabilite ou CMD:
concentration minimale detectable. Elle est &
distinguer de la sensibilite. En effet, bien que
ces crit~res expdment tous deux I'aptitude
d'une m6thode & differencier les reponse four-
nies par deux ~chantillons de concentration
voisine, la sensibilit~ s'adresse & toutes les
R~IES
concentrations diff~rentes de z~ro alors que la
dMectabilit~ interesse le domaine de concen-
Fig 1. Courbe RER [o (R)= f(R)]. trations faibles ou nulles. Elle peut etre d6ter-
minee & partir de la courbe d'etalonnage ou
du profil de precision ou par le calcul.
Tableau II1. Reproductibilit~ interseries sur les trois ni-
veaux de contr61e. Determination a partir du profil de precision.
On peut deduire du profil de precision la valeur
C (pmol/I) n Moyenne Ecart type CV %
de Sco. Cette derni~re est la limite de la fonc-
L 33 4,4 0,51 11,6 tion Sc= f(C) Iorsque la concentration tend
M 33 9,1 0,73 8,0 vers z~ro. Elle est de 0,60 pmol/I.
H 31 31,2 1,58 5,1

Tableau IV. Reproductibilite inters~ries sur les points de gamme.

C (pmol/I) 0 2, 15 5,4 10,75 23,00 46, 1

R
Moyen ne 996,4 871,4 688,8 475,1 258,7 135,4
Ecart type 104,6 81,6 55,6 38,6 16,3 3,9
CV % 10,0 9,3 8,0 8,1 6,3 2,9

n = 15; R = pente de cinetique de fluorescence.

46 D Khalfon et al

D#termination par le calcul.
• L = t(cqy) Sco (1/nb + 1/ny)112; t(ccy) est la va-
riable de Student pour un risque ot donne et
un nombre y de degres de libertY: t(1%, 10);
n b e t ny sont respectivement le nombre de re-
petitions du blanc et des ~chantillons dans les
conditions habituelles d'utilisation de la me-
RATES
thode. SCo est I'~cart type exprim6 en concen-
tration pour des mesures de concentration
nulle.
• t(o~,7) (1~rib + 1/ny) 1/2= k; pour des determi-
nations en simple k = 3,3 d'o0 L = 3,3 Sco. Sco
est aussi egal & Sb/(dy/dc)co, Sb 6tant I'ecart
type des reponses fournies par le blanc et
(dy/dc)co la pente de la courbe 6talon & I'ori-
gine.
• L = k Sb/(dy/dc)co = 0,69 pmol/I.
La limite de d6tection est donc suffisante
pour I'utilisation en clinique.

Correlation
Elle a 6t6 6tablie sur des patients suspects de
dysfonctionnement thyroYdien. La m~thode RIA
prise comme methode de r~f6rence pratique
est la RIA FT3 Amerlex M.
Les couples de valeurs sont tous coh6rents
( n = 38). La correlation est bonne ( r = 0,93),
m6me dans la zone des faibles valeurs.
L'equation de la droite de regression est : y =
1 , 1 6 x - 0,45 (fig 4).

Evaluation clinique

Les valeurs de T3 libre obtenues respective-

ment chez les temoins sains, dans la popula-
tion hospitalisee et ses differents groupes
pathologiques sont rassemblees dans le ta-
bleau VII.

0 lQ 2D
Temoins sains
Les valeurs de reference determin6es sur la
population saine non alit6e (7,2 + 1,7 pmol/I)
Fig 2. Courbe d'etalonnage et enveloppe de la courbe sont plus elev~es que celles annonc~es par le
[R = f(C)].
fabricant (5,9 + 2,3 pmot/I).

Tableau V. Courbe d'etalonnage et enveloppe de la courbe.

C (pmol/I) 0 2,15 5,4 10,75 23 46, 1

R
Moyenne 969,4 8t 3,8 646,4 415,0 200,1 109,7
Ecart type 15,7 14,2 11,8 6,7 4,6 2,6
to 35,5 32,1 26,7 15,1 10,4 5,8
R + t• 1 004,9 845,9 673,1 430,1 210,5 115,5
R - t~ 933,9 781,7 619,7 399,9 189,7 103,9

Tableau Vl. Profil de precision.

C (pmol/I) 0 2,15 5,4 10,75 23 46, 1

R
Pente 72,4 51,5 43,3 17,5 3,9 1,5
to 35,5 32,1 26,7 15,1 10,4 5,8
AC 0,49 0,62 0,62 0,86 2,65 4,00
AC/C x 29% 11% 8% 11% 8,6%
 Evaluation analytique d'une technique de dosage 47

~a

coNc DES E~LOeS FT3 FT3 RIA (pnolfl)

Fig 3. Profil de precision [AC = f(C) et CV = f(C)]. Fig 4. Correlation entre les resultats de T3 libre RIA Amer-
lex Met MEIA Abbott (r= 0,93; y= 1,16x-0,45).

Tableau VII. Valeurs de rdfdrence de T3 libre (pmol/I) des tdmoins non alitds et des hospitalises.

T6moins Hospitalisds Diabbte Insuffisance Cardiopathie Tumeur Divers Reanimation

sains r6nale maligne
n 100 67 14 3 9 7 12 22
Moyenne 7,2 5,0 5,6 5,1 5,6 6,0 5,8 3,7
Ecart type 0,84 1,30 0,48 0,72 0,72 1,1 1,2 1,1
Extr6mes 5,0-10,3 1,9-7,9 4,5-6,3 4,3-5,7 4,6-6,6 4,1-7,2 4,4-7,9 1,9-6,4

Population hospitalisde tients hospitalises en reanimation sont hypoal-

Nous avons de ce fait ~tudie une population
hospitalisde euthyro'fdienne. Les valeurs de T3
libre sont significativement plus basses dans
la population hospitalisde que chez les tdmoins
sains (test t Student, P < 0 , 0 0 1 ) . De plus, le
test de Kruskal-Wallis et I'analyse de variance
objectivent que les groupes pathologiques dif-
ferent statistiquement entre eux (P = 0,006) et
que la diminution de la T3 libre est essentiel-
lement significative dans le groupe des pa-
tients de rdanimation.
Desai [4] et al et Sapin et al [10] ddcrivent
une forte diminution de la T3 libre chez les su-
jets les plus gravement atteints et formulent
alors I'hypoth~se de I'incidence d'une hypoal-
bumindmie. De fait, dans notre etude, les pa-
buminemiques. Nous avons dans un second
temps individualisd une partie de notre popu-
lation hospitalisde en deux nouveaux groupes
selon leur albumindmie.
Chez les patients hypoalbumindmiques (AI~)
< 30 g/I), la T3 libre est statistiquement infd-
rieure (4,1 + 1,8 pmol/I) & celle des normoalbu-
minemiques (5,9 + 1,6 pmol/I) (test t Student,
P < 0,0001). La T3 libre et I'albumine sont cor-
relees positivement (test de Pearson, r = 0,79).
Ces faits sont en accord avec des dtudes re-
centes [4, 10].
Une comparaison avec la methode Amerlex
M a ete menee chez les patients hypoalbumi-
nemiques (tableau VIII). Devant I'effondrement
des valeurs de T3 libre obtenues par la me-
48 D Khalfon et al

Tableau VIII. Comparaison de la T3 libre par diff6rentes La pathologie des patients hospitalises en
techniques chez des patients hypoalbumin6miques.
reanimation, accompagnee principalement par
Patient Albumine T3 libre T3 fibre T3 fibre une denutrition et une insuffisance hepatique,
(g/I) (pmol/I) (pmol/I) (pmol/I) pourrait expliquer la diminution de la T3 libre
Amerlex M MEIA MAB par une probable inhibition de la 5'desiodase.
L'inhibition de cette desiodase serait-elle un
1 27,5 1,70 4,98 4,70
2 19,4 < 1,00 4,07 4,70 moyen d'epargne des fonctions vitales, d'utili-
3 19,0 < 1,00 2,69 3,60 sation du minimum necessaire, afin de laisser
4 25,5 < :1,90 4,04 4,70 I'organisme en etat de veille? II conviendrait
5 16,4 < 1,00 3,00 3,50 de verifier et de pouvoir expliquer ces hypo-
6 17,6 < 1,00 1,95 2,60
th6ses.
7 20,7 < 1,00 3,39 5,30
8 11,6 < 1,00 4,30 4,20 Les anticorps anti-T3 pourraient interferer
9 18,3 < 1,00 4,40 4,70 dans le dosage, selon la methode utilisee. Une
10 23,5 1,80 6,40 6,20 methode <<deux e t a p e s , dans laquelle I'hor-
11 25,9 1,20 4,80 4,90 mone libre est separee physiquement des pro-
12 26,2 1,10 3,20 3,40
teines de liaison serait une methode utilisable
13 20,1 < 1,00 2,80 3,00
14 20,8 < 1,00 3,20 3,80 m6me en presence d'autoanticorps. Par
contre, les methodes <<une etape >, utilisant un
analogue de I'hormone thyro'fdienne donne-
raient des resultats surestimes, dus & la
thode Amerlex M chez ces patients (alors que reaction croisee entre I'analogue et les anti-
chez les patients sains, les deux techniques corps.
sent parfaitement correlees), il a ete entrepris La methode Amerlex M (une etape, avec
de doser ces quelques serums par une nou- analogue) donne des resultats surestimes en
velle technique en fin d'evaluation (FT3 MAB) presence d'anticorps anti-T3 [9].
qui West pas une methode avec analogue, II conviendra de confronter ces resultats
mais oQ I'anticorps est marque. Les resultats avec la methode MEIA qui est une methode
obtenus sont tres proches de la methode Ab- <<deux etapes >>.
bott. Les resultats ne permettent pas, cepen-
dant, de conclure directement & un effet de
I'hypoalbuminemie sur la diminution de la T3
libre ou que la concentration d'albumine affecte Conclusion
directement la mesure des hormones libres.
Le groupe des insuffisants renaux chroni-
ques s'individualise egalement. Une tendance Sur le plan analytique, la trousse FT3 IMx Ab-
& la diminution de T3 libre est observee dans bott presente des resultats tr6s satisfaisants.
ce groupe, dont les patients sont tous normoal- La fiabilite analytique est correcte avec une
buminemiques; cependant, son faible effectif bonne repetabilite intra- et interessais. C'est
ne permet pas sa confirmation statistique. Se- une methode <<deux etapes >,, et de ce fait, ses
Ion Liewendahl et a l [7], la T3 totale, essen- performances sont souvent meilleures que
tiellement constituee de T3 lice, est abaissee celles de methodes RIA <<une etape>>. L'in-
chez ces patients du fait d'une diminution des fluence de plusieurs pathologies sur la T3 libre
proteines de liaison. Par contre, la diminution a ete etudiee.
de la T3 libre observee est moindre et depend En I'absence d'hypoalbuminemie, tous nos
de la technique de dosage employee. resultats ont ete concordants avec les signes
Les resultats obtenus avec la technique cliniques. Cependant, comme pour la trousse
MEIA se rapprochent de ceux obtenus avec Amerlex M, les resultats apparaissent abaisses
celle utilisant la dialyse & I'equilibre [7]. en cas d'hypoalbuminemie. II conviendra ega-
On peut supposer, comme le font Desai et lement de verifier que la presence d'anticorps
a l [4], que le degre d'alt~ration du patient influe anti-T3 en perturbe pas le dosage.
plus que la concentration d'albumine sur le re- II serait necessaire de poursuivre I'etude de
sultat de T3 libre. L'alteration du metabolisme cette population de fa£on & definir si les va-
peripherique serait moins marquee dans le leurs basses de T3 libre sont en relation avec
groupe des normoalbuminemiques, peut-6tre une alteration du metabolisme peripherique par
parce que leur pathologie serait moins Iourde inhibition de la 5'-desiodase, et de fa£on &
que celle des hypoalbuminemiques. preciser le r61e eventuel de cette inhibition.
 Evaluation analytique d'une technique de dosage
Remerciements
Nous remercions M me Grare du Centre de transfu-
sion sanguine pour la fourniture des s~rums, Mme
Garcia pour la dactylographie de ce manuscrit, ainsi
que I'H6pital americain pour I'~tude de la correlation
et la societe Abbott pour la fourniture des trousses
n6cessaires & cette etude.
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