Вы находитесь на странице: 1из 19

Министерство науки и высшего образования

Российской Федерации
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ
ТОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ (НИ ТГУ)
Институт биологии, экологии, почвоведения, сельского
и лесного хозяйства
Кафедра физиологии человека и животных

ВИЗУАЛИЗАЦИЯ НЕЙРОГЕНЕЗА МЕТОДОМ


МРТ С ПРИМЕНЕНИЕМ ГЕНЕТИЧЕСКОГО
ВЕКТОРА

Автор работы:
студентка 4 курса НИ ТГУ А. Р. Янгалышева
Научные руководители:
д. б. н., доцент, зав. лаб. нейробиологии НИИББ НИ ТГУ
М. Ю. Ходанович;
к. б. н., ст. науч. сотр. лаб. нейробиологии НИИББ НИ
ТГУ А. О. Пищелко
Актуальность
 Постнатальный нейрогенез способствует восстановлению структур
головного мозга после его повреждений и является объектом
настоящего исследования.
 Переход к современным неинвазивным методам
исследования нейрогенеза актуален как перспективный и
диагностически более точный метод при нейродегенеративных
заболеваниях.
 Для визуализации нейрогенеза в экспериментах используют метод
МРТ с применением репортерных генов и векторных систем для их
доставки.
 Для детекции молодых нейронов используются методы мечения
вследствие встраивания маркерной последовательности в молекулу
ДНК.

2
Цель и задачи
Цель: МРТ-визуализация экспрессии гена-репортера ферритина в молодых
нейронах, отражающей нейрогенез, после интракраниальных микроинъекций
генетических векторов.
Задачи:
1. Оптимизация интракраниальных инъекций, сравнение неспецифических
векторов LV-FUGW-eGFP, AAV2/9-CMV-eGFP, LV-CMV-TagGFP2 и LV-CMV-FerrH в
отношении эффективности трансфекции клеток головного мозга.
2. Определение сроков эффективности экспрессии в in vivo векторов,
содержащих трансгены eGFP и ферритин под промоторами даблкортина и
цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH.
3. Сравнение векторов, содержащих трансгены eGFP и ферритин под
промоторами даблкортина и цитомегаловируса AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-
FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH, в отношении эффективности и специфичности
заражения молодых нейронов.
4. МРТ-визуализация экспрессии гена-репортера тяжелой цепи человеческого
ферритина, опосредованной векторами AAV-DCX-FerrH, LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и
LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH в ex vivo, с последующей гистологической валидацией.

3
Материалы и методы
Работа выполнялась на базе лаборатории
нейробиологии Научно-исследовательского
института биологии и биофизики Томского
государственного университета.
Исследование проводилось на половозрелых
крысах-самцах линии Sprague Dawley в возрасте 10
недель с исходной массой тела 250-300 г.

4
Материалы и методы

Рисунок 1 — Оптимизация угла и глубины


микроинъекции для точного попадания в область SVZ
Примечание: А, В — варианты расчетов угла и глубины
микроинъекции на основании атласа мозга крысы (Paxitos) c
малым (3°) (А) и большим (18.7°) (В) углом введения.
5
Материалы и методы
Иммуногистохимическое окрашивание препаратов
срезов мозга
Препараты срезов мозга последовательно
инкубировали в следующих растворах:
1. PBS 3 раза по 5 минут;
2. блокирующем буфере (5% бычий
сывороточный альбумин, 3% нормальная ослиная
сыворотка, 1% TritonX100, PBS) 1 час;
3. блокирующем буфере с добавлением 1%
первичных антител 1 сутки;
4. PBS 3 раза по 5 минут;
5. блокирующем буфере с добавлением 0,2%
вторичных антител 3 часа;
6. PBS 3 раза по 5 минут.

6
Материалы и методы
Иммуногистохимическое окрашивание препаратов
срезов мозга
• Первичные антитела:
– goat anti doublecortin для мечения молодых нейронов;
– rabbit anti ferritin для выявления экспрессии ферритина
зараженными клетками;
• Вторичные антитела:
– donkey anti goat AlexaFlour647;
– donkey-anti-rabbit AlexaFlour594.

7
Результаты
Модификация стереотаксической установки

Рисунок 2 — Модификация стереотаксической установки SR-5R


Примечание: А — стереотаксическая установка SR-5R до модификации;
В — стереотаксическая установка SR-5R после
модификации.
8
Результаты
Оптимальные координаты, объем и время
введения микроинъекции
• Оптимальные координаты введения микроинъекции:
– расстояние от Брегма 0.0 мм;
– латерально от срединного шва 3.5 мм;
– угол наклона 18.7° (при МРТ-исследовании угол
наклона 90°);
– глубина введения 4.67 мм.
• Оптимальный объем микроинъекции, сводящий к
минимуму повреждение тканей, но достаточный для
детекции сигнала — 1-1.2 мкл.
• Оптимальное время введения такого объема — 10 мин.

9
Результаты
Сравнение неспецифических векторов на основе AAV и LV в отношении
эффективности трансфекции клеток головного мозга

Рисунок 3.1 — Сравнение вирусных векторов разного типа по


эффективности и специфичности заражения молодых нейронов в SVZ
Примечание: А — сравнение векторов с экспрессией eGFP LV-FUGW-eGFP
(lv) и AAV2/9-CMV-eGFP (aav);
B — сравнение LV-векторов с экспрессией eGFP LV-CMV-
TagGFP2 (lv/gfp) и ферритина LV-CMV-FerrH (lv/ferr).
* — p < 0.05, ** — p > 0.05, *** — p < 0.001. 10
Результаты
Сравнение неспецифических векторов на основе AAV и LV в отношении
эффективности трансфекции клеток головного мозга

Рисунок 3.2 — Микрофотографии SVZ,


окрашенной DCX, для указанных типов векторов.

11
Результаты

Таким образом, векторы на основе


аденоассоциированных вирусов и
лентивирусов могут применяться в
дальнейшем как основа для
конструирования векторов с трансгенами
eGFP и ферритин.

12
Результаты
Определение сроков эффективности экспрессии и сравнение векторов, содержащих
трансгены eGFP и ферритин, в отношении эффективности и специфичности

Рисунок 4.1 — Результаты оценки эффективности и специфичности вирусных


векторов, экспрессирующих ферритин, в отношении молодых нейронов на 3 и 14
сутки после инъекции
Примечание: A — динамика общего количества клеток, экспрессирующих
ферритин, для каждого из исследованных векторов на 1 срезе мозга;
B — динамика процентного отношения количества молодых
нейронов среди экспрессирующих ферритин клеток SVZ.
* — p<0.05, *** — p<0.001;
++ — p<0.01, +++ — p<0.001;
## — p<0.01. 13
Результаты
МРТ-визуализация экспрессии ферритина
МРТ проводилась на томографе Philips Achieva 1.5 Тл согласно
протоколу, включающему следующие ИП:
1) 2D T2 TSE:
TR 8000 мс, TE 90 мс, FA 90°, NA 3, FOV 30 x 30 мм, толщина среза 1 мм,
матрица сбора данных 208x156, реконструированная матрица 512x512,
размер вокселя 0.06 x 0.06 mm2.
2) 3D T2 FFE со спектральным подавлением сигнала от жира (SPIR):
TR 70.6 мс, TE 23 мс, FA 25°, NA 3, толщина среза 1 мм,
реконструированная матрица 512x512, размер вокселя 0.06 x 0.06 x 0.09
mm2.
3) 2D T2* FFE:
TE 12 мс, TR 500 мс, FA 20°, NA 4, толщина среза 1 мм,
реконструированная матрица 512х512, размер вокселя 0.05 x 0.05 mm3.
Сканирование проводилось c использованием приемно-передающей
радиочастотной катушки, предназначенной для сканирования глазного
яблока.

14
Результаты
МРТ-визуализация экспрессии ферритина, опосредованной вектором
AAV-DCX-Ferr, с гистологической валидацией
Рисунок 5.1 —
Сопоставление МРТ и
иммуногистохимических
данных для вектора AAV-DCX-
Ferr
Примечание: (a) —
Микрофотография среза мозга,
окрашенного на Ferr (красный) и
DCX (зеленый),
соответствующего МРТ-
изображениям (ex vivo) T2* FFE;
(b), T2 FFE (c), T2 TSE (d).
Красными стрелками отмечены
области сверхэкспрессии Ferr —
в области стриатума
ипсилатерального полушария и
SVZ обоих полушарий.
15
Результаты
МРТ-визуализация экспрессии ферритина, опосредованной вектором
LV-CMV-eGFP-Ferr, с гистологической валидацией

Рисунок 5.2 — Сопоставление


МРТ и иммуногистохимических
данных для вектора LV-CMV-eGFP-
Ferr
Примечание: (a), (e)
Микрофотографии целого среза
мозга, окрашенного на Ferr
(красный), зеленый цвет
соответствует свечению eGFP.
Срез (a) соответствует МРТ-
изображениям (ex vivo): T2* FFE (b),
T2 FFE (c), T2 TSE (d). Красными
стрелками отмечены области
сверхэкспрессии ферритина и eGFP
на микрофотографиях и МРТ-
изображениях — в верхней части
SVZ ипсилатерального полушария.

16
Результаты
МРТ-визуализация экспрессии ферритина, опосредованной вектором LV-DCX-
eGFP-Ferr, с гистологической валидацией

Рисунок 5.3 — Сопоставление МРТ и


иммуногистохимических данных для
вектора LV-DCX-eGFP-Ferr
Примечание: (a) — микрофотография
среза мозга, окрашенного на Ferr (красный),
зеленый цвет соответствует свечению
eGFP; (b) — микрофотография среза мозга,
окрашенного на DCX (красный), зеленый
цвет соответствует свечению eGFP. Срезы
соответствуют МРТ-изображениям (ex
vivo): T2* FFE (c), T2 TSE (d). Красными
стрелками отмечены области
сверхэкспрессии Ferr и eGFP — в области
вблизи нижней части SVZ
ипсилатерального полушария.

17
Выводы:
1. Были определены стереотаксические координаты введения интракраниальной
микроинъекции: расстояние от Брегма 0.0 мм, латерально от срединного шва 1.5 мм, глубина
введения 4.67 мм с оптимальным обьемом инъекции 1-1.2 мкл. и временем введения 10
минут. Посредством интракраниальной микроинъекции были введены вирусные векторы с
различной конструкцией и проанализированы на эффективность и специфичность
трансфицирования молодых нейронов.
Векторы с неспецифическим промотором на основе аденоассоциированного вируса и
лентивируса показали значимый уровень трансфекции, что позволяет использовать эти
типы вирусов для создания конструкций с репортерными генами под специфическим
промотором с целью визуализации нейрогенеза.
2. Экспрессия трансгенов обоих типов векторов наблюдалась уже на третьи сутки, однако
трансфекция вектором AAV-DCX-FerrH вызывает более обширную экспрессию ферритина,
чем вектором LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH. К 14 суткам эти различия
увеличиваются.
3. Сравнение векторов в отношении эффективности и специфичности трансфекции
показывает, что эффективность, специфичность и уровень экспрессии трансгена вирусом
AAV-DCX-FerrH выше, чем вирусов LV-DCX-eGFP-T2A-FerrH и LV-CMV-eGFP-T2A-FerrH.
4. Методом МРТ на основе Т2-взвешенных изображений головного мозга крысы ex vivo
был визуализирован ферритин, экспрессированный посредством векторов AAV-DCX-Ferr и LV-
CMV-eGFP-Ferr, LV-DCX-eGFP-Ferr. Гистологически нейрогенез был валидирован только после
введения векторов AAV-DCX-Ferr и LV-CMV-eGFP-Ferr. Для животного с вектором LV-DCX-eGFP-
Ferr гистологический анализ показал неспецифическую экспрессию в клетках
активированной микроглии, что было вызвано, очевидно, не точным попаданием в
таргетную зону.
18
Благодарю за внимание!