Вы находитесь на странице: 1из 385

БИОХИМИЯ

ЧЕЛОВЕКА
Р. Марри
Д.Греннер
П. Мейес
В. Родуэлл

И ЗД А ТЕ Л Ь С Т В О
<МИР>
БИОХИМИЯ ЧЕЛОВЕКА
a LANGE medical book
1988
HARPER’S BIOCHEMISTRY
Twenty-first Edition

Robert K.Murray, MD, PhD


Professor of Biochemistry
University of Toronto

Daryl K.Granner, MD
Professor and Chairman
D epartm ent of Molecular Physiology and Biophysics
Professor of Medicine
Vanderbilt University Nashville,
Tennessee

Peter A. Mayes, PhD, DSc


Reader in Biochemistry
Royal Veterinary College
University of London

Victor W.Rodwell, PhD


Professor of Biochemistry
Purdue University W e s t Lafayette,
Indiana

APPLETON & LANGE


Norwalk, Connecticut/San Mateo, California
Р. Марри
Д . Грейнер
П. Мейес
В. Родуэлл

БИОХИМИЯ
ЧЕЛОВЕКА
В 2-х томах
Том 1

Перевод с английского
канд. физ.-мат. наук В. В. Борисова
и Е. В. Дайниченко

под редакцией
д-ра хим. наук Л .М . Гинодмана

МОСКВА «МИР» 1993


УДК 577.2
ББК 20.070
Б63

Авторы: Марри R, Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В.


Биохимия человека: В 2-х томах. Т. 1. Пер. с англ.: —М.:
Мир, 1993. —384 с., ил.
ISBN 5-03-001774-7

Настоящий учебник биологической и медицинской химии и моле­


кулярной биологии широко известен в мире и переведен на многие языки.
Авторы 21-го, переработанного издания —ученые из США, Великобрита­
нии и Канады. Благодаря энциклопедической полноте и четкости изложе­
ния книга может служить справочным пособием. На русском языке учеб­
ник выходит в 2-х томах. В первом томе рассматриваются следующие темы:
структура и функция белков, биоэнергетика, метаболизм углеводов и
липидов, обмен белков и аминокислот.
Для биохимиков, клинических биохимиков, студентов и аспиран­
тов биологов и медиков.

ББК 20.070

Федеральная целевая программа книгоиздания России

Редакция литературы по биологии

ISBN 5-03-001774-7 (русск.) © 1988 by Appleton & Lange,


ISBN 5-03-001773-9 Publishing Division of Prentice Hall
ISBN 0-8385-3648-4 (англ.) © перевод на русский язык, Борисов В.В.,
Дайниченко Е.В., 1993
Предисловие к русскому изданию

К настоящему времени в области биохимии человека и животных создана хорошая


стартовая площадка для успешного развития дальнейших исследований. Выяснены
функции многих простых и сложных биомолекул; при этом главными достижениями
являются установление информационной роли ДНК и расшифровка механизма переда­
чи информации от ДНК к белку. Выделены главные органеллы клеток животных, уста­
новлены их основные функции. Получены в высокоочищенном виде многие ферменты,
охарактеризованы механизмы регуляции их активности. Изучены формы запасания
и использования энергии. Достигнуты существенные успехи в изучении структуры
и функции мембран. Выяснено действие главных гормонов. Установлены биохимиче­
ские нарушения, лежащие в основе ряда заболеваний.
Вместе с тем остается еще немало проблем, требующих изучения. К их числу отно­
сится выяснение механизмов регуляции и координации процессов жизнедеятельности; на
начальных стадиях находятся, в частности, исследования по расшифровке механизмов
регуляции экспрессии генов, с которыми связаны процессы роста и деления клеток, их
дифференцировка, а при патологии— опухолевая трансформация. Весьма ограниченны
сведения о механизмах клеточной секреции. Остается неясной природа многих наслед­
ственных заболеваний. Не удается пока сформулировать конструктивного представле­
ния о сложных биохимических процессах, лежащих в основе функционирования цент­
ральной нервной системы.
Предлагаемый вниманию читателей учебник биохимии достаточно полно освещает
достижения биохимии человека и животных. Он вышел за рубежом 21-м изданием, что
несомненно свидетельствует о его достоинствах. В первую очередь учебник предназна­
чен для студентов-медиков, а также врачей, изучающих биохимические процессы, лежа­
щие в основе функционирования здорового организма, нарушение которых сопрово­
ждается патологическими явлениями. Такая направленность учебника нашла отражение
и в его названии при переводе на русский язык— «Биохимия человека» (так же назы­
вается и вводная глава учебника). В каждой главе после введения следует раздел «Био­
медицинское значение», в котором отмечены основные вопросы, имеющие непосред­
ственное отношение к медицине. Многие главы завершаются разделом «Клинические
аспекты», в котором указаны заболевания, связанные с нарушениями рассмотренных
в данной главе процессов метаболизма, и охарактеризованы (если они имеют место) из­
менения содержания соответствующих метаболитов в крови и в моче. Следует подчер­
кнуть, что в учебнике весьма обстоятельно изложены сведения о метаболизме липидов,
обычно весьма кратко освещаемые в других руководствах; в то же время нарушение ме­
таболизма липидов имеет непосредственное отношение к таким заболеваниям, как ате­
росклероз и ишемическая болезнь сердца. В учебник включенц главы «Питание, пище­
варение и всасывание», «Плазма крови и процессы свертывания», «Рак, онкогены и фак­
торы роста», представляющие особый интерес для медиков. Завершает учебник раздел,
в котором приведены обоснование лабораторных биохимических анализов, интерпрета­
ция их результатов и использование в диагностике.
6 Предисловие к русскому изданию

Учебник несомненно заинтересует не только медиков; он будет весьма полезным


и для широкого круга биологов, интересующихся основами биохимии. Он содержит
четкое и достаточно лаконичное изложение биохимии и молекулярной биологии *, при
этом в тексте отражены достижения биохимии последнего времени. Учебник иллюстри­
рован большим числом рисунков и схем, которые способствуют усвоению материала
и могут быть использованы при преподавании биохимии.
Л . М . Гинодман

1 Более подробное изложение ряда разделов биохимии можно найти в других учебниках, выпу­
щенных издательством «Мир»: Д. Мецлер, «Биохимия», в трех томах (1980); А. Уайт и др., «Осно­
вы биохимии», в трех томах (1981); Л. Страйер, «Биохимия», в трех томах (1984—5); А. Ленинд-
жер, «Основы биохимии», в трех томах (1985).— Прим. ред.
Предисловие

В предлагаемом пособии мы попытались кратко, но вполне исчерпывающим обра­


зом изложить принципы, лежащие в основе биохимии и молекулярной биологии. Мы
рассмотрели также биохимические аспекты некоторых патологических состояний, что
позволяет познакомить студентов-медиков с клиническими проявлениями и послед­
ствиями нарушений биохимических процессов.

Изменения в 21-м издании


При подготовке нового издания авторы ставили перед собой главным образом две
задачи: отразить новейшие достижения биохимии, важные с медицинской точки зрения,
и сделать изложение более интересным и доступным. Поэтому были внесены следую­
щие изменения.
• Книга состоит из шести больших разделов, что делает яснее логику ее построе­
ния. Крупные главы были разделены на более компактные, некоторые главы перенесены
в другие разделы, где они более логично вписываются в текст.
• Добавлены две вводные главы. Гл. 1 («Биохимия и медицина») иллюстрирует тес­
ную связь между биохимией и медициной. Студенты найдут в ней ряд интересных и ва­
жных примеров использования биохимии в медицинской науке. В гл. 2 («Биомолекулы
и биохимические методы») кратко охарактеризованы основные типы молекул, присут­
ствующих в клетках, а также методы, используемые для их изучения. Тем самым зало­
жен фундамент для всего последующего изложения. Описаны наиболее значительные
открытия, сделанные в биохимии, упомянуты перспективные направления исследова­
ний, ведущихся в настоящее время.
• Каждая глава начинается с небольшого введения, в котором кратко излагается
содержание главы и оценивается степень важности представленного материала.
• ' Сразу за введением следует небольшой раздел «Биомедицинское значение», в ко­
тором подчеркиваются те затронутые в главе вопросы, которые имеют отношение к ме­
дицине.
• Новая глава «Промежуточный обмен» (гл. 16) придает тематическое единство
всем главам о метаболизме.
• Новая глава «Технология рекомбинантных ДНК» (гл. 36) дает представление об
используемых принципах и методах и о том мощном влиянии, которое техника реком­
бинантных ДНК оказала на развитие биологии и медицины.
• Добавлена специальная глава «Рак, онкогены и факторы роста» (гл. 57), которая
вводит студентов в курс проблем в этой области и указывает на фундаментальный ха­
рактер биохимической информации, получаемой при изучении онкогенеза и факторов
роста.
• Добавлено также «Приложение», в котором представлены основные лаборатор­
ные биохимические методы анализа, используемые в клинической медицине. Рассмотре­
ны оценки чувствительности и специфичности этих методов. Приложение призвано по­
мочь студентам перекинуть мостик между общей и клинической биохимией и оценить
диагностические возможности многих биохимических тестов.
8 Предисловие

Кроме того, все главы приведены в соответствие с сегодняшним уровнем научных


знаний. Дополнительно, ввиду их особого интереса, обсуждаются следующие темы.
• Мембраны (в гл. 43).
• Питание, пищеварение и абсорбция (в гл. 53).
• Гликопротеины (в гл. 54).

План книги
Текст содержит две вводные главы и шесть крупных разделов.
Раздел I посвящен белкам и ферментам— «рабочим лошадкам» организма. Поско­
льку почти все реакции, протекающие в клетке, катализируются ферментами, необходи­
мо уяснить свойства ферментов, прежде чем рассматривать остальные вопросы.
Раздел II содержит сведения о том, как всевозможные протекающие в клетке реак­
ции связаны с выработкой или потреблением энергии. Здесь же прослеживаются пути
синтеза и распада углеводов и липидов. Обсуждаются функции различных представите­
лей этих двух классов веществ.
Раздел III посвящен аминокислотам. Прослеживается судьба этих молекул, их мета­
болизм, тоже связанный с выработкой и потреблением энергии.
Раздел IV описывает структуру и функции нуклеиновых кислот в рамках схемы
ДНК -*• РНК -*• белок. В этот раздел включена новая глава о принципах технологии ре­
комбинантных ДНК, открывшей новые перспективы развития биомедицинской науки.
Раздел V посвящен гормонам и их ключевой роли в межклеточных коммуникациях
и в регуляции метаболизма.'Воздействие гормонов на клетки неизбежно опосредуется
их взаимодействием с плазматическими мембранами, поэтому предварительно рассма­
триваются структура и функции мембран.
Раздел VI затрагивает пять специальных тем, включая новую главу «Рак, онкогены
и факторы роста».
Приложение содержит краткое описание биохимических лабораторных анализов, ин­
терпретацию результатов и использование их в диагностических целях.

Благодарности
Авторы высоко оценивают большой вклад в создание пособия, внесенный д-ром
Дейвидом Мартином в тот период, когда он возглавлял авторский коллектив. Многое
из того, что внес д-р Мартин, сохранилось и в настоящем издании. Руководство подго­
товкой этого издания взял на себя д-р Роберт Марри, старавшийся работать столь же
энергично и проявить такую же высокую биохимическую компетентность, какая была
свойственна д-ру Мартину.
Авторы выражают благодарность коллегам и друзьям из разных стран, от которых
поступили предложения по улучшению книги, а также ряд исправлений. Мы рассчиты­
ваем на их участие и интерес и в будущем. Мы приветствовали бы любые замечания и со
стороны студентов.
Авторы особенно благодарны за то широкое признание и поддержку, которые эта
книга получила во всем мире. Несколько изданий на английском языке были перепеча­
таны в Японии, Ливане, на Тайване, на Филиппинах и в Корее. Кроме того, книга была
переведена на итальянский, испанский, французский, португальский, японский, поль­
ский, немецкий, индонезийский, сербскохорватский и греческий языки.
Октябрь, 1987 Р.К.М.
Д. К. Г.
П. А. М.
В.У.Р.
Глава 1

Биохимия и медицина
Роберт Марри

ВВЕДЕНИЕ т.е. профилактической медицине. Так, например,


для предупреждения атеросклероза и рака со време­
Биохимия— это наука, занимающаяся изучением нем, вероятно, все большее значение будет придава­
различных молекул, химических реакций и процес­ ться рациональному питанию. В то же время концеп­
сов, протекающих в живых клетках и организмах. ция рационального питания должна основываться
Основательное знание биохимии совершенно на знании биохимии.
необходимо для успешного развития двух главных на­
правлений биомедицинских наук: 1) решение про­
блем сохранения здоровья человека; 2) выяснение БИОХИМИЯ И БОЛЕЗНИ
причин различных болезней и изыскание путей их )
эффективного лечения. Все болезни представляют собой проявление ка­
ких-то изменений в свойствах молекул и нарушений
хода химических реакций и процессов. Основные
БИОХИМИЯ И ЗДОРОВЬЕ факторы, приводящие к развитию болезней у живот­
Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) ных и человека, приведены в табл. 1.1. Все они ока­
определяет здоровье как состояние «полного физиче­ зывают влияние на одну или несколько ключевых
ского, духовного и социального благополучия, кото­ химических реакций или на структуру и свойства
рое не сводится к простому отсутствию болезней функционально важных молекул.
и недомоганий». Со строго биохимической точки • Вклад биохимических исследований в диагности­
зрения организм можно считать здоровым, если ку и лечение заболеваний сводится к следующему.
многие тысячи реакций, протекающих внутри клеток
и во внеклеточной среде, идут в таких условиях и Таблица 1.1. Основные факторы, приводящие к развитию
с такими скоростями, которые обеспечивают макси­ болезней. Все они оказывают влияние на различные биохи­
мальную жизнеспособность организма и поддержи­ мические процессы, протекающие в клетке или целом орга­
вают физиологически нормальное (не патологиче­ низме "
ское) состояние. 1. Физические факторы: механическая травма, экстремаль­
ная температура, резкие изменения атмосферного давле­
БИОХИМИЯ, ПИТАНИЕ, ния, радиация, электрический шок
2. Химические агенты и лекарственные препараты: некото­
ПРОФИЛАКТИКА И ЛЕЧЕНИЕ
рые токсические соединения, терапевтические препараты
Одной из главных предпосылок сохранения здо­ и т.д .
ровья является оптимальная диета, содержащая ряд 3. Биологические агенты: вирусы, риккетсии, бактерии, гри­
бы, высшие формы паразитов
химических веществ; главными из них являются ви­
4. Кислородное голодание: потеря крови, нарушение кисло-
тамины, некоторые аминокислоты, некоторые жир­ родпереносящей функции, отравление окислительных
ные кислоты, различные минеральные вещества ферментов
и вода. Все эти вещества представляют тот или иной 5. Генетические факторы: врожденные, молекулярные
интерес как для биохимии, так и для науки о рацио­ 6. Иммунологические реакции: анафилаксия, аутоиммун­
нальном питании. Следовательно, между этими ные заболевания
двумя науками существует тесная связь. Кроме того, 7. Нарушения пищевого баланса: недостаточное питание,
можно полагать, что на фоне усилий, прилагаемых избыточное питание
к тому, чтобы сдержать рост цен на медицинское об­ " Из книги Robbins S. L., Cotram R. S., Kumar V.: The Patholo­
служивание, все большее внимание будет уделяться gic Basis of Disease, 3rd ed. Saunders, 1984, с некоторыми изменения­
сохранению здоровья и предупреждению болезней, ми, с любезного разрешения авторов.
10 Глава I

Благодаря этим исследованиям можно 1) выявить и бронхиолы. Страдающие этой болезнью чаще все­
причину болезни; 2) предложить рациональный го погибают в раннем возрасте от легочной инфек­
и эффективный путь лечения; 3) разработать методи­ ции. Поскольку молекулярная основа болезни не­
ки для массового обследования населения с целью известна, возможно только симптоматическое лече­
ранней диагностики; 4) следить за ходом болезни; ние. Впрочем, можно надеяться, что в недалеком бу­
5) контролировать эффективность лечения. В При­ дущем с помощью технологии рекомбинантных
ложении описаны наиболее важные биохимические ДНК удастся выяснить молекулярную природу за­
анализы, используемые для диагностики различных болевания, что позволит найти более эффективный
заболеваний. К этому Приложению будет полезно способ лечения.
обращаться всякий раз, когда будет идти речь о био­
химической диагностике различных болезней (на­
ФОРМАЛЬНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БИОХИМИИ
пример, инфаркта миокарда, острого панкреатита
и др.). Биохимия, как следует из названия (от греческого
Возможности биохимии в отношении предупре­ bios— жизнь),— это химия жизни, или, более строго,
ждения и лечения болезней кратко проиллюстриро­ наука о химических основах процессов жизнедеяте­
ваны на трех примерах; позднее в этой же главе мы льности.
рассмотрим еще несколько примеров. Структурной единицей живых систем является
1. Хорошо известно, что для поддержания своего клетка, поэтому можно дать и другое определение:
здоровья человек должен получать определенные биохимия как наука изучает химические компоненты
сложные органические соединения— витамины. живых клеток, а также реакции и процессы, в кото­
В организме витамины превращаются в более сло­ рых они участвуют. Согласно этому определению,
жные молекулы (коферменты), которые играют биохимия охватывает широкие области клеточной
ключевую роль во многих протекающих в клетках биологии и всю молекулярную биологию.
реакциях. Недостаток в диете какого-либо из вита­
минов может привести к развитию различных забо­ ЗАДАЧИ БИОХИМИИ
леваний, например цинги при недостатке витамина
С или рахита при недостатке витамина D. Выяснение Главная задача биохимии состоит в том, чтобы
ключевой роли витаминов или их биологически ак­ достичь полного понимания на молекулярном уров­
тивных производных стало одной из главных задач, не природы всех химических процессов, связанных
которые решали биохимики и диетологи с начала с жизнедеятельностью клеток.
нынешнего столетия. Для решения этой задачи необходимо выделить
2. Патологическое состояние, известное под на­ из клеток многочисленные соединения, которые там
званием фенилкетонурия (ФКУ), в отсутствие лече­ находятся, определить их структуру и установить их
ния может привести к тяжелой форме умственной функции. В качестве примера можно указать на мно­
отсталости. Биохимическая природа ФКУ известна гочисленные исследования, направленные на выясне­
уже около 30 лет: заболевание обусловлено недо­ ние молекулярных основ мышечного сокращения
статком или полным отсутствием активности фер­ и ряда сходных процессов. В результате были выде­
мента, который катализирует превращение амино­ лены в очищенном виде многие соединения различ­
кислоты фенилаланина в другую аминокислоту, ти­ ной степени сложности и проведены детальные
розин. Недостаточная активность этого фермента структурно-функциональные исследования. В итоге
приводит к тому, что в тканях накапливается избы­ удалось выяснить ряд аспектов молекулярных основ
ток фенилаланина и некоторых его метаболитов, мышечного сокращения.
в частности кетонов, что неблагоприятно сказывае­ Еще одна задача биохимии заключается в выяс­
тся на развитии центральной нервной системы. По­ нении вопроса о происхождении жизни. Наши пред­
сле того как были выяснены биохимические основы ставления об этом захватывающем процессе далеки
ФКУ, удалось найти рациональный способ лечения: от исчерпывающих.
больным детям назначают диету с пониженным со­
держанием фенилаланина. Массовое обследование
ОБЛАСТИ ИССЛЕДОВАНИЯ
новорожденных на ФКУ позволяет в случае надоб­
ности начать лечение незамедлительно. Сфера биохимии столь же широка, как и сама
3. Кистозный фиброз— наследуемая болезнь жизнь. Всюду, где существует жизнь, протекают раз­
экзокринных, и в частности потовых, желез. Причи­ личные химические процессы. Биохимия занимается
на болезни неизвестна. Кистозный фиброз является изучением химических реакций, протекающих в ми­
одной из наиболее распространенных генетических кроорганизмах, растениях, насекомых, рыбах, пти­
болезней в Северной Америке. Он характеризуется цах, низших и высших млекопитающих, и в частно­
аномально вязкими секретами, которые закупори­ сти в организме человека. Для студентов, изучаю­
вают секреторные протоки поджелудочной железы щих биомедицинские науки, особый интерес пред­
Биохимия и медицина II

ставляют два последних раздела. Однако было бы собствовали быстрому накоплению сведений о кле­
недальновидно совсем не иметь представления точных рецепторах и о механизмах поглощения хо­
о биохимических особенностях некоторых других лестерола клетками. Интенсивное изучение онкоге­
форм жизни: нередко эти особенности существенны нов в раковых клетках привлекло внимание к моле­
для понимания разного рода ситуаций, имеющих кулярным механизмам контроля роста клеток.
прямое отношение к человеку.
Изучение низших организмов и вирусов
БИОХИМИЯ И МЕДИЦИНА Ценная информация, которая оказалась весьма
полезной для проведения биохимических исследова­
Между биохимией и медициной имеется широкая ний в клинике, была получена при изучении некото­
двусторонняя связь. Благодаря биохимическим ис­ рых низших организмов и вирусов. Например, со­
следованиям удалось ответить на многие вопросы, временные теории регуляции активности генов и фер­
связанные с развитием заболеваний, а изучение при­ ментов сформировались на базе пионерских исследо­
чин и хода развития некоторых заболеваний привело ваний, выполненных на плесневых грибах и на бакте­
к созданию новых областей биохимии. риях. Технология рекомбинантных ДНК зародилась
в ходе исследований, проведенных на бактериях
Биохимические исследования, и бактериальных вирусах. Главным достоинством
направленные на выявление причин заболеваний бактерий и вирусов как объектов биохимических ис­
В дополнение к указанным выше мы приведем следований является высокая скорость их размноже­
еще четыре примера, иллюстрирующих широту диа­ ния; это существенно облегчает проведение генетиче­
пазона возможных применений биохимии. 1. Анализ ского анализа и генетических манипуляций. Сведе­
механизма действия токсина, продуцируемого воз­ ния, полученные при изучении вирусных генов, от­
будителем холеры, позволил выяснить важные мо­ ветственных за развитие некоторых форм рака у жи­
менты в отношении клинических симптомов болезни вотных (вирусных онкогенов), позволили лучше по­
(диарея, обезвоживание). 2. У многих африканских нять механизм трансформации нормальных клеток
растений содержание одной или нескольких незаме­ человека в раковые.
нимых аминокислот весьма незначительно. Выявле­ БИОХИМИЯ И ДРУГИЕ БИОЛОГИЧЕСКИЕ
ние этого факта позволило понять, почему те люди, НАУКИ
для которых именно эти растения являются основ­
ным источником белка, страдают от белковой недо­ Биохимия нуклеиновых кислот лежит в самой ос­
статочности. 3. Обнаружено, что у комаров— нове генетики; в.свою очередь использование генети­
переносчиков возбудителей малярии— могут фор­ ческих подходов оказалось плодотворным для мно­
мироваться биохимические системы, наделяющие их гих областей биохимии. Физиология, наука о функ­
невосприимчивостью к инсектицидам; это важно ционировании организма, очень сильно перекрывае­
учитывать при разработке мер по борьбе с маля­ тся с биохимией. В иммунологии находит применение
рией. 4. Гренландские эскимосы в больших количе­ большое число биохимических методов, и в свою
ствах потребляют рыбий жир, богатый некоторыми очередь многие иммунологические подходы широко
полиненасыщенными жирными кислотами; в то же используются биохимиками. Фармакология и фарма­
время известно, что для них характерно пониженное ция базируются на биохимии и физиологии; метабо­
содержание холестерола в крови, и поэтому у них го­ лизм большинства лекарств осуществляется в резу­
раздо реже развивается атеросклероз. Эти наблюде­ льтате соответствующих ферментативных реакций.
ния навели на мысль о возможности применения по- Яды влияют на биохимические реакции или процес­
линенасыщенных жирных кислот для снижения со­ сы; эти вопросы составляют предмет токсикологии.
держания холестерола в плазме крови. Как мы уже говорили, в основе разных видов пато­
логии лежит нарушение ряда химических процессов.
Изучение болезней способствует Это обусловливает все более широкое использова­
развитию биохимии ние биохимических подходов для изучения различ­
ных видов патологии (например, воспалительные
Наблюдения английского врача сэра Арчибальда процессы, повреждения клеток и рак). Многие из тех,
Гаррода еще в начале 1900-х гг. за небольшой груп­ кто занимается зоологией и ботаникой, широко испо­
пой пациентов, страдавших врожденными наруше­ льзуют в своей работе биохимические подходы. Эти
ниями метаболизма, стимулировали исследование взаимосвязи не удивительны, поскольку, как мы
биохимических путей, нарушение которых происхо­ знаем, жизнь во всех своих проявлениях зависит о г
дит при такого рода состояниях. Попытки понять разнообразных биохимических реакций и процессов.
природу генетического заболевания под названием Барьеры, существовавшие ранее между биологиче­
семейная гиперхолестеролемия, приводящего к разви­ скими науками, фактически разрушены, и биохимия
тию тяжелого атеросклероза в раннем возрасте, спо­ все в большей степени становится их общим языком.
Глава 2

Биомолекулы и биохимические методы


Роберт Марри

ВВЕДЕНИЕ в целом позволит читателю лучше ориентироваться


в представленном материале.
Эта глава состоит из пяти основных разделов. Наконец, задача пятого раздела— показать,
В первом разделе рассматриваются состав организма насколько ограничены наши знания во многих обла­
и основные классы молекул, из которых он построен. стях биохимии; это, в частности, касается процессов
Об этих молекулах будет идти речь на протяжении развития организма, дифференцировки тканей,
всей книги. функционирования мозга, причин возникновения ра­
Основной структурной и функциональной едини­ ка и других болезней человека. Возможно, это об­
цей биологических систем является клетка. Именно стоятельство возбудит у читателей желание внести
в клетках протекает большинство химических реак­ свою лепту в развитие упомянутых областей иссле­
ций. Поэтому во втором разделе приведена краткая дования.
характеристика компонентов клетки и способов их
выделения; значительная часть этой книги будет пос­ ЭЛЕМЕНТНЫЙ СОСТАВ ОРГАНИЗМА
вящена детальному описанию функций этих компо­ ЧЕЛОВЕКА
нентов.
Задача третьего раздела вытекает из того обстоя­ Примерный элементный состав организма чело­
тельства, что биохимия является экспериментальной века представлен в табл. 2.1. Большинство биомоле­
наукой. Очень важно понимать и уметь оценивать кул состоят в основном из углерода, кислорода, водо­
различные экспериментальные подходы и методы, рода и азота. Важным компонентом нуклеиновых ки­
используемые в биохимии, чтобы ее изучение не све­ слот и других молекул является фосфат; в ионизиро­
лось к простому зазубриванию. Кроме того, биохи­ ванной форме он широко представлен в организме
мия— это не застывший свод непреложных знаний, человека. Ключевую роль в многочисленных биоло­
а постоянно развивающаяся наука. Как и в других гических процессах играет кальций; этот вопрос на­
областях биомедицинских знаний, ее успехи в значи­ ходится в центре внимания многих современных ис­
тельной степени зависят от новых эксперименталь­ следований. Элементы, перечисленные в третьем
ных подходов и прогресса в технологии. столбце таблицы, выполняют множество различных
В четвертом разделе кратко суммированы дости­ функций. Со многими из них приходится почти
жения биохимии. Общий взгляд на всю эту науку ежедневно сталкиваться в медицинской практике,
например в тех случаях, когда у больных нарушен
баланс электролитов (К +, Na+, Cl и Mg2+), наблю­
Таблица 2.1. Приблизительный элементный состав оріа-
дается анемия, связанная с недостатком железа
низма человека (в процентах к сухому весу)1’
(Fe2+), или заболевания щитовидной железы (1).
Элемент % Элемент %
ОСНОВНЫЕ КЛАССЫ ПРИРОДНЫХ
Углерод 50 Калий 1 БИОМОЛЕКУЛ
Кислород 20 Сера 0,8
Водород 10 Натрий 0,4 Как видно из табл. 2.2, основными сложными био­
Азот 8,5 Хлор 0,4 молекулами, присутствующими в клетках и тканях
Кальций 4 Магний 0,1 высших животных (включая человека), являются
Фосфор 2,5 Железо 0,01 ДНК, РНК, белки, полисахариды и липиды. Эти сло­
Марганец 0,001
Иод 0,00005
жные молекулы построены из простых биомолекул,
которые также перечислены в таблице. Строитель­
'• Из работы West E. S., Todd W. R.: Textbook of Biochemistry, ными блоками ДНК и РНК (вместе они известны как
3rd ed. Macmillan, 1961, с любезного разрешения. нуклеиновые кислоты) служат дезоксирибонуклеоти-
Биополимеры и биохимические методы 13

Таблица 23.. Основные сложные органические биомолекулы, присутствующие в клетках и тканях. Нуклеиновые кислоты,
белки и полисахариды являются полимерами, которые построены из блоков, также указанных в таблице. Липиды,
вообще говоря, не являются биополимерами, и не во всех случаях в качестве их строительных блоков используются
жирные кислоты

Биомолекулы Строительные блоки Главные функции

ДН К Дезоксирибонуклеоти- Генетический материал


ды
РНК Рнбонуклеотиды М атрица для синтеза белков
Белки Аминокислоты Весьма разнообразные; обеспечивают функционирование клетки
(ферменты, сократительные элементы)
Полисахариды (глико­ Глюкоза Кратковременное запасание энергии (в форме глюкозы)
ген)
Липиды Жирные кислоты Компоненты мембран; запасают энергию на длительное время (в
виде триацилглицеролов)

ды и рнбонуклеотиды соответственно. Строительны­ Таблица 2.3. Нормальный химический состав организма че­
ми блоками белков являются аминокислоты. Поли­ ловека весом 65 к г 1'
сахариды построены из простых углеводов; в част­ Компоненты Масса, кг Содержание, %
ности, гликоген (главный полисахарид, присут­
ствующий в тканях человека) построен из глюкозы. Белки 11 17,0
Строительными блоками липидов можно считать Жиры 9 13,8
жирные кислоты, хотя липиды и не являются поли­ Углеводы 1 1,5
Вода 2) 40 61,6
мерами жирных кислот. ДНК, РНК, белки и полиса­
Минеральные вещества 4 6,1
хариды называют биополимерами, поскольку они со­
стоят из повторяющихся строительных блоков (мо­ 11 Из работы Davidson S. D., Passmore R.. Brock J. F.: Human
номеров). Эти сложные молекулы составляют суще­ Nutrition and Dietetics, 5th ed. Churchill Livingstone, 1973, с разреше­
ния.
ственную часть «вещества жизни»; большая часть 21 Содержание воды в разных тканях существенно различае­
этой книги будет в основном посвящена описанию тся: в тканн кости, не содержащей костного мозга, на ее долю при­
различных свойств биомолекул— как биополиме­ ходится 22,5%'. Содержание воды снижается также при накоплении
ров, так и мономеров. Подобного же типа сложные жира.
молекулы присутствуют и в низших организмах,
хотя их строительные блоки в некоторых случаях, войны произошли три события, ознаменовавшие со­
как это видно из табл. 2.2, могут быть несколько бой начало периода раздельного развития биохимии
иными. Например, бактерии не содержат гликоген и клеточной биологии. Это: 1) широкое распростра­
и триацилглицеролы, зато содержат другие полиса­ нение электронных микроскопов; 2) разработка мето­
хариды и липиды. дов разрушения клеток в сравнительно мягких усло­
виях, позволяющих сохранить функции их компо­
нентов; 3) широкое распространение высокоскорост­
ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ ОРГАНИЗМА
ных ультрацентрифуг с охлаждением, с помощью ко­
ЧЕЛОВЕКА
торых можно было создавать центробежные силы,
Мы уже привели элементный состав организма достаточные для разделения компонентов разру­
человека. Его химический состав представлен в табл. шенных клеток, и избегать их перегрева. С помощью
2.3. Основными компонентами являются белки, жи­ электронной микроскопии было выявлено множе­
ры, углеводы, вода и минеральные вещества; при ство ранее неизвестных или плохо различимых кле­
этом наибольшая часть приходится на долю воды, точных компонентов, а разрушение клеток и ультра­
хотя ее содержание в разных тканях существенно центрифугирование позволили разделить их и прове­
различается. Вода— это полярное соединение, спо­ сти исследование in vitro.
собное образовывать водородные связи; именно
благодаря этим своим свойствам она является идеа­ Клетка печени крысы
льным растворителем в организме человека.
На рис. 2.1 схематически изображена клетка пече­
ни крысы (гепатоцит). Биохимические свойства этих
КЛЕТКА
клеток изучены наиболее подробно— частично из-за
Шлейден и Шванн, а также другие пионеры науки того, что клетки печени удается получать в относите­
XIX в., в частности Вирхов, считали клетку фунда­ льно больших количествах, а частично благодаря то­
ментальной единицей биологической активности. му, что они удобны для фракционирования и выпол­
Однако сразу же после окончания второй мировой няют множество функций. Гепатоцит содержит все
14 Глава 2

Эндоплазматический
ретикулум Поэтому их нужно экстрагировать в .мягких усло­
виях (в водных растворах, избегая экстремальных
значений pH, осмотического давления, а также высо­
ких температур). Большая часть операций по выде­
лению органелл производится при 0—4° С (в холод­
ной комнате или на льду). При комнатной темпера­
туре может наблюдаться значительное уменьшение
активности, частично вследствие действия различ­
ных гидролитических ферментов (протеаз, нуклеаз
и т. д.), высвобождающихся при разрушении клеток.
Обычно для экстракции органелл используют 0,25
М раствор сахарозы (изоосмотический раствор), со­
держащий ионы К + и Mg2+ в концентрации, близкой
к физиологической; pH раствора доведен до 7,4 соля­
нокислым трис-буфером (трис [гидроксиметил]-
аминометангидрохлорид) в концентрации 0,05 М.
Этот раствор часто называют СТКМ. Не все раство­
рители обеспечивают столь же мягкие условия
экстракции, как СТКМ; например, для экстракции
липидов и углеводов используют органические ра­
створители.
Б. Гомогенизация. Для выделения органелл (или
биомолекул) из клеток необходимо прежде всего
разрушить клетки в мягких условиях. Удобным ме­
тодом разрушения органов (печени, почки, мозга)
и составляющих их клеток является гомогенизация.
Для этого измельченные фрагменты соответствую­
щего органа помещают в стеклянный стаканчик под­
ходящих размеров, заполненный раствором для го­
могенизации (например, СТКМ), а затем пестиком
Рис. 2.1. Схематическое изображение клетки печени крысы, (вручную или с помощью моторчика) приводят
на котором показаны основные клеточные органеллы.
смесь во вращение. Вращение пестика с контроли­
основные типы органелл, присутствующих в клетках руемой скоростью создает силы вязкого трения, под
эукариот (табл. 2.4),— ядро, митохондрии, эндо­ действием которых клетки разрушаются и их содер­
плазматический ретикулум, свободные рибосомы, жимое высвобождается в раствор сахарозы. Полу­
аппарат Гольджи, лизосомы, пероксисомы, плазма­ ченную суспензию, содержащую многие интактные
тическую мембрану и элементы цитоскелета. (неповрежденные) органеллы, называют гомогена­
том.
Субклеточное фракционирование В. Центрифугирование. С убфракционнрованне го­
Для глубокого изучения функций любой из орга­ могената путем дифференциального центрифугиро­
нелл необходимо прежде всего получить эти орга­ вания— это один из наиболее важных методов био­
неллы в относительно чистом виде, так, чтобы их химии. В классическом случае используются три ста­
препарат был как можно меньше загрязнен другими дии центрифугирования при возрастающих скоро­
органеллами. Процесс, с помощью которого этого стях (рис. 2.2). В ходе каждой из них образуются оса­
обычно удается Достичь, называется субклеточным док и надосадочная жидкость (супернатант). Супер­
фракционированием и состоит из трех этапов: натант, полученный на каждой из стадий, подвергае­
экстракции, гомогенизации и центрифугирования. тся центрифугированию на следующей стадии. В ре­
Большинство первых работ в этой области выполне­ зультате этой процедуры образуются три типа осад­
но на печени крысы. ков, которые называют ядерной, митохондриальной
А. Экстракция. Первым шагом при выделении и микросомной фракциями. Ни одна из этих фрак­
специфических органелл (или молекул) является их ций не представляет собой абсолютно чистые орга­
экстрагирование из клеток, в которых они находя­ неллы. Однако с помощью электронного микроско­
тся. Большинство органелл и многие биомолекулы па, а также путем идентификации соответствующих
(в частности, белки) весьма лабильны (неустойчивы) «маркерных» ферментов и химических компонентов
и легко утрачивают биологическую активность. (например, ДНК или РНК) было установлено, что
Таблица 2.4. Основные клеточные органеллы и их функции. Перечислены только главные функции каждого типа органелл.
В раде случаев в этих органеллах могут протекать и другие процессы и реакции, функционировать другие метаболические
пути

Органелла или фракция1 Маркер Основные функции

Ядро ДН К Область локализации хромосом


Область ДНК-зависимого синтеза РНК (транскрипция)
Митохондрия Г лутамат дегидрогеназа Цикл лимонной кислоты, синтез АТР
Рибосом а1( Высокое содержание Синтез белка (трансляция мРНК)
РНК
Эндоплазматический ре­ Глюкозо- 6-фосфатаза Связанные с мембранами рибосомы являются главным местом
тикулум синтеза белка
Синтез различных липидов
Окисление многих ксенобиотиков (цитохромом Р-450)
Лизосома Кислая фосфатаза Место действия многих гидролаз (ферментов, катализирующих
реакции гидролитического расщепления)
Плазматическая мем­ Ы а/К +-АТРаза Транспорт молекул в клетку и из клетки, межклеточная адгезия и
брана 5'-нуклеотидаза межклеточные коммуникации
Аппарат Гольджи Галактозилтрансфераза Внутриклеточная «сортировка» белков
Реакции гликозилирования
Реакции сульфатирования
Пероксисома Каталаза Деградация некоторых жирных кислот и аминокислот
Оксидаза мочевой ки­ Образование и разложение перекиси водорода
слоты
Ц итоскелет 11 Специфические фер­ Опорные функции (микрофиламенты, микротрубочки, промежу­
менты-маркеры 2) точные филаменты)
отсутствуют
Цитозоль п Лактат-дегидрогеназа Процесс гликолиза, синтез жирных кислот

11 Органеллу можно определить как ограниченную мембраной субклеточную структуру, которую можно выделить при высокоско­
ростном центрифугировании. Согласно этому определению, рибосомы, цитоскелет и цитозоль не являются органеллами. Однако в этой та­
блице они перечислены вместе с органеллами, поскольку их тоже обычно выделяют путем центрифугирования. Их можно рассматривать
как субклеточные образования или фракции. Препарат органелл, выделенных в ходе одного цикла дифференциального центрифугирования,
редко бывает чистым; чтобы получить чистую фракцию, обычно приходится центрифугировать препарат по меньшей мере несколько раз.
21 Фракция цитоскелета идентифицируется с помощью электронной микроскопии или путем электрофоретического анализа на содер­
жание специфичных для этой фракции белков.

Рис. 2.2. Схема разделения субклеточных фракций с помощью дифференциального центрифугирования. Гомогенизиро-
ванную ткань (например, печень) сначала центрифугируют при малой скорости, что приводит к осаждению ядерной фрак­
ции (содержащей ядро и неразрушенные клетки) и отделению супернатанта (1). Супернатант осторожно сливают (декан­
тируют) и проводят центрифугирование при более высокой скорости, в результате чего разделяются митохондриальная
фракция (содержащая митохондрии, лизосомы и пероксисомы) и супернатайт (2). Последний декантируют и центрифуги­
руют при высокой скорости, в результате чего формируется микросомная фракция (содержащая смесь свободных рибо-
срм и фрагментов гладкого и шероховатого эндоплазматического ретикулума) и отделяется чистый прозрачный ра­
створ— конечный супернатант (3). Последний представляет собой цитозоль, или клеточный сок. Используя различные
модификации представленного здесь подхода, обычно выделяют каждую из клеточных органелл в относительно чистом
виде.
16 Глава 2

главными компонентами этих трех фракций являю­ Таблица 2.5. Основные методы разделения и очистки био­
тся ядра, митохондрии и микросомы соответствен­ молекул. Больш ая часть этих методов пригодна для анали­
но. «Маркерный» фермент или химическое соедине­ за компонентов, находящихся в клеточных экстрактах и
других биохимических препаратах. Для получения боль­
ние— это тот компонент, который присутствует
шинства биомолекул в чистом виде, как правило, необхо­
практически только в составе данного типа орга- димо последовательно использовать несколько методов.
нелл; например, кислая фосфатаза находится в лизо- Подробности о применении каждого из методов читатель
сомах, а Д Н К — в ядре (табл. 2.4). Таким образом, может найти в соответствующих руководствах
маркер служит индикатором присутствия или отсут­
ствия фракции тех органелл, в составе которых он Фракционирование солями (например, осаждение с сульфа­
находится. Мнкроеомная фракция (микросомы) пред­ том аммония)
ставляет собой в основном смесь фрагментов глад­ Хроматография
Бумажная
кого эндоплазматического ретикулума, шероховато­ Ионообменная (анионо- и катионообменная)
го эндоплазматического ретикулума (т. е. эндоплаз­ Аффинная
матического ретикулума с присоединенными к нему Тонкослойная
рибосомами) и свободных рибосом. Содержимое су­ Газо-жидкостная
пернатанта, полученного на конечной стадии, при­ Жидкостная под высоким давлением
близительно соответствует составу клеточного сока Гель-фнльтрацня
(цитозоля). Модификации этого основного подхода, Электрофорез
основанные на использовании различных сред для На бумаге
Высоковольтный
гомогенизации, разных условий или методов цен­
В агарозе
трифугирования (например, использование непре­ В ацетатцеллюлозе
рывного или ступенчатого градиента сахарозы), по­ В крахмальном геле
зволили выделить в более или менее чистом виде все В полиакриламиде
органеллы, показанные на рис. 2.1 и перечисленные В полиакриламиде в присутствии додецилсульфата
в табл. 2.4. Описанная выше схема применима к бо­ натрия
льшинству органов и клеток, однако в каждом слу­ У лътрацентрнфугнрованне
чае для стандартизации процедуры субклеточного
фракционирования необходимо провести серию ана­ Почти всегда очистить биомолекулы до состояния
лизов на содержание маркерных ферментов или дру­ гомогенности (т. е. до отсутствия загрязнения любы­
гих химических компонентов, а также выполнить ми другими биомолекулами) удается лишь при по­
электронно-микроскопические наблюдения. следовательном применении нескольких таких мето­
Значение субклеточного фракционирования для дов.
развития биохимии и клеточной биологии невозмо­ Важно иметь в виду, что прогресс в биохимии за­
жно переоценить. Оно составляет одно из главных висит от разработки новых методов анализа, очист­
звеньев общего экспериментального подхода (см. ки и определения структуры. Например, в области
ниже), с помощью которого удалось выяснить функ­ биохимии липидов произошел настоящий переворот
ции органелл, перечисленные в табл. 2.4. Получение после введения в практику газо-жидкостной и тонко­
этой информации представляет одно из главных до­ слойной хроматографии. Анализ мембранных и мно­
стижений биохимических исследований (см. ниже). гих других белков был крайне затруднен до тех пор,
пока не появился метод электрофореза в полиакрила­
мидном геле в присутствии додецилсульфата натрия
ОБЩИЙ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ ПОДХОД,
(ДСН-ПЭГ): применение додецилсульфата натрия
ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В БИОХИМИИ
приводит к «солюбилизации» (растворению) ряда
Этот подход состоит из трех составных частей: 1) белков, которые ранее не удавалось перевести в ра­
выделение биомолекул и органелл, находящихся створимое состояние. После такой солюбилизации
в клетке (см. предыдущий раздел о субклеточном уже можно проводить электрофорез. Разработка ме­
фракционировании); 2) определение структуры бно- тодов клонирования и секвенировання (определения
молекул; 3) использование различных препаратов для последовательности мономеров) ДНК произвела
анализа функций биомолекул и их метаболизма (т.е. подлинную революцию в изучении нуклеиновых ки­
процессов синтеза и распада). слот и вообще в биологии.
1. Выделение биомолекул. Как и в случае орга­ 2. Определение структуры бномолекул. После
нелл, для выяснения функции любой биомолекулы очистки биомолекул можно определить их структу­
необходимо прежде всего получить ее в чистом виде. ру. Э то— совершенно необходимое условие успеш­
В табл. 2.5 перечислены основные методы, исполь­ ного детального изучения корреляции между струк­
зуемые для разделения и очистки биомолекул. Здесь турой и функцией. Основные методы, используемые
мы не будем подробно обсуждать их: некоторые из для анализа структуры биомолекул, перечислены
них будут вкратце описаны в других частях кни^и. в табл. 2.6. Они должны быть знакомы читателям,
Биополимеры и биохимические методы 17

Таблица 2.6. Основные методы определения структуры био­ гликопротеинов, во многих случаях удалось устано­
молекул вить с помощью ЯМР-спектроскопии высокого раз­
решения. Наиболее детальную информацию о струк­
Элементный анализ
Спектроскопия в Уф-, видимой и инфракрасной областях, туре биомолекул дают методы рентгеновской кри­
Я МР-спектроскопия сталлографии. Именно благодаря их использованию
Использование кислотного или щелочного гидролиза для была установлена детальная структура различных
расщепления изучаемых молекул на составляющие белков и ферментов, а также открыта двойная спи­
компоненты раль ДНК.
Использование набора ферментов с известной специфично­ 3. Изучение функции и метаболизма биомолекул
стью для расщепления изучаемых молекул (например, с использованием различных препаратов. Первые био­
использование протеаз, нуклеаз, гликозидаз) химические исследования человека и животных про­
Масс-спектрометрия водились на уровне целого организма. В качестве
Специфические методы секвенирования (например, белков
или нуклеиновых кислот)
примера можно привести изучение дыхания и судь­
Рентгеновская кристаллография бы поступающих в организм соединений. Вскоре
стало ясно, однако, что целый организм слишком
сложен, чтобы можно было получить четкие ответы
изучавшим органическую химию. Специфичность на различные вопросы. Многие проблемы, возникав­
действия ряда ферментов позволяет использовать их шие при работе на целом организме, были устране­
в качестве мощных инструментов для выяснения ны после приготовления более простых препаратов
структурных особенностей некоторых биомолекул. и изучения их in vitro. В табл. 2.7 приведены различ­
Теоретический и технический прогресс, позволивший ные типы препаратов, которые используются в на­
повысить разрешающую способность масс- стоящее время для изучения биохимических процес­
спектрометрии и ЯМР-спектроскопии, способствовал сов; большинство сведений, содержащихся в этой
тому, что эти методы стали широко использоваться книге, получено именно на таких препаратах. В та­
для определения структуры молекул. Например, блице препараты перечислены в порядке уменьше­
крайне сложную структуру углеводных цепей, входя­ ния их сложности. Однако использование более про­
щих в состав некоторых биомолекул, в частности стых препаратов тоже имеет свои ограничения. Резу-
Таблица 2.7. Иерархическая последовательность препаратов, используемых для изучения биохимических процессов

Метод Комментарии

Исследования на уровне целого организ­ Они могут включать


ма 1) удаление органа (например, гепатэктомия)
2) изменение диеты (голодание— усиленное питание)
3) прием лекарств (например, фенобарбитала)
4) введение токсических веществ (например, четыреххлористого углерода)
5) наблюдение за животным со специфическими заболеваниями (например,
сахарным диабетом)
6) использование сложных методов, таких, как Я МР-спектроскопия и пози­
тронно-эмиссионная томография
Исследование изолированного перфузи- Наиболее пригодны сердце, печень, почки
руемого органа
Использование тканевых срезов Особенно срезы печени
Использование целых клеток 1. Особенно это относится к клеткам крови, которые относительно легко
поддаются выделению
2. Клетки в культурах тканей являются незаменимым объектом во многих
областях биологии
Использование гомогената 1. Позволяет работать с бесклеточными препаратами
2. Можно добавлять или удалять (путем диализа) различные соединения и
наблюдать за последствиями
3. Путем центрифугирования можно провести дальнейшее субфракциониро­
вание, что позволяет получить индивидуальные клеточные органеллы
Исследование изолированных клеточных Широко используется для изучения функций митохондрий, эндоплазматиче­
органелл ского ретикулума, рибосом и т.д.
Субфракционирование органелл Широко используется, например, при изучении функций митохондрий
Выделение и характеристика метаболи­ Важнейшая часть анализа любой химической реакции или метаболического
тов и ферментов пути
Клонирование генов, кодирующих фер­ Выделение клонированного гена необходимо для изучения деталей его струк­
менты и другие белки туры и регуляции; позволяет установить аминокислотную последовате­
льность белка, который им кодируется
18 Гпака 2

льтаты экспериментов in vitro могут оказаться оши­ Дополнительные замечания по препаративной


бочными, например в том случае, когда при гомоге­ работе и стратегии исследования
низации клеток высвобождаются ферменты, частич­
Полезно сделать еще несколько замечаний по не­
но разрушающие исследуемые соединения.
которым позициям, указанным в табл. 2.7 и на рис.
2.3. 1. Возможность артефактов нисколько не сни­
Общая стратегия изучения мает абсолютной необходимости выделения и иден­
биохимических процессов тификации каждого компонента, участвующего
в биохимическом процессе, в чистом виде; без этого
В этой книге основное внимание уделено сло­ невозможно понять, как протекает процесс на моле­
жным биохимическим процессам (например, синтезу кулярном уровне. Подтверждением этому могут
белков, мышечному сокращению), в том числе и раз­ служить многочисленные примеры, которые нам
личным метаболическим путям. Метаболический встретятся в дальнейшем. 2. Важно научиться рекон­
путь— это совокупность реакций, ответственных за струировать процесс in vitro путем систематического
синтез сложных соединений из более простых и за ра­ подбора индивидуальных компонентов. Если после
спад соединения до конечных продуктов. Тот или сборки всех компонентов системы процесс все-таки
иной сложный биохимический процесс или метабо­ не идет, это может означать отсутствие какого-то ва­
лический путь иногда проявляется на уровне целого жного компонента, который был пропущен при
организма. Примером такого рода может служить идентификации и не добавлялся при сборке. 3. Бла­
сокращение мышц. Мы знаем, что глюкоза является годаря достигнутым в последние годы успехам
источником энергии для человека и других живот­ в области технологии (например, в ЯМР-
ных, а это означает, что в организме человека она спектроскопии и позитронно-эмиссионной томогра­
должна распадаться (подвергаться метаболизму) фии) появилась возможность выявлять определен­
с выделением энергии. Однако для того, чтобы полу­ ные биомолекулы на уровне обследования целых ор­
чить полное представление о том, каким образом ганов и следить за изменением их содержания во вре­
происходит метаболизм глюкозы в клетке— а мы мени. Это позволяет анализировать многие сложные
такого представления (в частности, о механизме ре­ биохимические процессы in vivo. 4. Лишь после того,
гуляции) пока не имеем,— необходимо провести ис­ как наблюдения, выполненные на разных уровнях,
следования на других уровнях. На рис. 2.3 представ­ дадут согласующиеся между собой результаты, мо­
лены различные типы наблюдений и анализа, кото­ жно с уверенностью говорить о реальных успехах
рые позволяют полностью охватить весь биохими­ в понимании изучаемого биохимического процесса.
ческий процесс, такой, например, как распад глюко­ Если же при использовании разных подходов возни­
зы и высвобождение энергии (этот процесс известен кнут существенные расхождения, следует искать при­
как гликолиз). Эта схема в общих чертах применима чину этих расхождений до тех пор, пока не будет
ко всем основным биохимическим процессам, обсу­ найдено рациональное объяснение. 5. Описанное вы­
ждаемым в этой книге, и, таким образом, иллюстри­ ше сочетание разных уровней исследования и разно­
рует общую стратегию изучения биохимических про­ го рода препаратов может использоваться для выяв­
цессов; об этом следует помнить, рассматривая лю­ ления биохимических изменений у животных,
бой биохимический процесс (гликолиз, окисление связанных с изменениями метаболизма (например,
жирных кислот и т. д.). при ограниченном или усиленном питании) или
Вывод о существовании биохимического процесса или метаболического пути, сделанный на основании наблюдений над целым организмом
Анализ механизмов, контролирующих процесс in vivo
Анализ нарушений процесса, вызванных специфическими болезнями (врожденные ошибки метаболизма, рак и т.д.).
Локализация процесса в одном или нескольких органах
Локализация процесса в одной или нескольких клеточных органеллах или субклеточных фракциях
Рассмотрение процесса в виде отдельных реакций
Очистка его индивидуальных субстратов, продуктов, ферментов, кофакторов и других компонентов
Анализ механизмов, контролирующих процесс in vitro
Изучение механизмов отдельных реакций
Реконструкция процесса
Изучение процесса на генетическом уровне методом рекомбинантных ДНК

Рис. 2 3 . Стратегия изучения метаболического процесса или метаболического пути. Используемая процедура не обязатель­
но должна включать все перечисленные здесь этапы. Однако применение именно этих подходов позволяет обычно выяс­
нить детали биохимических процессов или метаболических путей. Эта схема в общем виде использовалась для изучения
главных метаболических путей, рассматриваемых в последующих главах.
Биополимеры и биохимические методы 19

с определенными заболеваниями (сахарный диабет, достигнут в последнее время в секвенировании ну­


рак). 6. Большая часть описанных выше методов клеиновых кислот и в развитии радиоиммунных ме­
и подходов применима для изучения клеток или тка­ тодов для измерения очень малых количеств соеди­
ней человека в норме и патологии. При этом необхо­ нений в биологических системах, также был обуслов­
димо тщательно следить за тем, чтобы использова­ лен в значительной степени применением изотопов.
лись только свежеприготовленные препараты, а кро­
ме того, следует обращать особое внимание на эти­ ОСНОВНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ БИОХИМИИ
ческие вопросы, связанные с проведением экспери­
ментов на человеке. Суммируем основные достижения в области био­
химии, в особенности в биохимии человека.
Использование изотопов в биохимии • Определен химический состав клеток, тканей и це­
лого организма. Выделены основные соединения,
Очень большую роль сыграло введение в биохи­ присутствующие в этих системах, и установлена
мическую практику изотопов в 1930-х гг. Ранее было их структура.
очень трудно пометить биомолекулы, чтобы затем • Выяснены — по крайней мере в общих чертах-
следить за их превращениями в ходе метаболизма. функции многих простых биомолекул. Установ­
В пионерских исследованиях, прежде всего Шонхей- лены также функции наиболее важных сложных
мера и его коллег, для решения многих биохимиче­ биомолекул. Центральное место среди всех этих
ских задач использовались стабильные изотопы (2D, открытий принадлежит установлению того факта,
15N), за судьбой которых далее следили с помощью что ДНК — это генетический материал и содержа­
масс-спектрометрии. Например, синтезировали щаяся в нем информация передается от нее одно­
определенные аминокислоты, сахара и жирные ки­ му из видов РНК (информационной РНК), кото­
слоты, в состав которых вводили стабильные изото­ рая в свою очередь определяет последовательно­
пы, а затем добавляли эти соединения в пищу живот­ сть аминокислот в белках. Поток информации, ис­
ным или к препаратам in vitro, чтобы можно было ходно заключенной в ДНК, удобно представить
следить за их метаболизмом (определять время по­ в виде схемы ДНК ->РНК ->Белок.
лужизни, превращение в другие биомолекулы и т. д.). • Выделены главные органеллы животных клеток,
Именно таким способом были выяснены многие установлены их основные функции.
аспекты метаболизма белков, углеводов и липидов. • Показано, что почти все реакции, протекающие
Стало ясно, что метаболизм— очень активный про­ в клетках, катализируются ферментами; многие
цесс: большая часть соединений в клетке постоянно ферменты получены в чистом виде и изучены,
синтезируется и распадается, хотя скорости этих выявлены общие принципы механизмов их дей­
процессов могут сильно различаться. Суммирование ствия.
всех этих результатов позволило Шонхеймеру сфор­ • Прослежены метаболические пути синтеза и ра­
мулировать представление о «динамической приро­ спада главных простых и сложных биомолекул.
де метаболизма». Показано, что пути синтеза данного соединения
Очень важное значение имело последующее испо­ в общем случае отличаются от путей его распада.
льзование радиоактивных изотопов и приборов, по­ • Выяснены многие аспекты регуляции метаболиз­
зволяющих определять их количество. Стабильные ма.
и радиоактивные изотопы, широко используемые • В общих чертах установлено, каким образом клет­
при работе с биологическими системами, перечисле­ ки запасают и используют энергию.
ны в табл. 2.8. Их применение сыграло решающую • Выяснены основные особенности строения
роль в развитии ряда областей биохимии. Многие и функции различных мембран, показано, что ос­
исследования простых и сложных биомолекул in vivo новными их компонентами являются белки и ли­
и in vitro в значительной мере опираются именно на пиды.
использование изотопов. Тот прогресс, который был • Накоплено значительное количество данных о ме­
Таблица 2.8. Изотопы, наиболее широко используемые в ханизме действия главных гормонов.
биохимических исследованиях • Установлены биохимические основы значитель­
ного числа заболеваний.
Стабильные изотоны Радиоактивные изотопы
КАК МАЛО МЫ ЗНАЕМ
2D 3Н
,5N 14С Нисколько не умаляя значения того огромного
,8о 32р количества биохимических данных, которое нако­
35S плено к настоящему времени, очень важно уяснить,
35С а как скудны наши знания во многих областях биохи­
1251
131 у
мии. Среди тех проблем, которые еще предстоит
решить, пожалуй, наиболее важны две: выяснение
20 Глава 2

биохимических основ индивидуального развития несколько лет благодаря развитию техники реком­
и дифференцировки и функций мозга. Хотя химиче­ бинантных ДНК здесь будут достигнуты заметные
ская природа генетического материала детально изу­ успехи. К началу следующего века, а возможно, и ра­
чена, о механизме включения и выключения генов ньше, будет определена нуклеотидная последовате­
в процессе развития организма мы не знаем почти льность всего генома человека; правда, остаются со­
ничего. Выяснение механизма регуляции генов совер­ мнения, является ли этот подход оптимальным
шенно необходимо для изучения процессов диффе­ с точки зрения использования человеческих и финан­
ренцировки клеток и превращения нормальных кле­ совых ресурсов.
ток в раковые. Сейчас о делении и росте клеток—
нормальных и опухолевых— и о регуляции этих
ЛИТЕРАТУРА
процессов мы знаем крайне мало. Практически ниче­
го не известно о биохимической основе сложных про­ Freifelder D. Physical Biochemistry: Applications to Biochemi­
цессов нервной деятельности, включая такие явления, stry and Molecular Biology, Freeman, 1982.
как сознание и память. Весьма ограниченны сведе­ Fruton J. S. Molecules and Life: Historical Essays on the Inter­
play o f Chemistry and Biology, Wiley-Interscience, 1972.
ния о механизмах клеточной секреции. Несмотря на
Weinberg R. A. The molecules o f life, Sei. Am. (Oct.), 1985,253,
определенный прогресс, неизвестна молекулярная 48. (Интересны и все другие статьи этого номера жур­
природа многих распространенных генетических бо­ нала.)
лезней; впрочем, можно надеяться, что в ближайшие
Раздел I
Структура и функции
белков и ферментов
Глава 3

Аминокислоты
Виктор Родуэлл

ВВЕДЕНИЕ некоторых аминокислот образуются соответствую­


щие амины, и некоторые из них [гистамин, у-
В живых клетках синтезируется множество ма­ аминомасляная кислота (ГАМК)] выполняют ва­
кромолекул (белков, нуклеиновых кислот, полисаха­ жные биологические функции. Ряд заболеваний
ридов), которые играют роль структурных компо­ связан с нарушениями транспорта аминокислот вну­
нентов, биокатализаторов, гормонов, рецепторов трь клеток. Эти заболевания часто сопровождаются
или хранилищ генетической информации. Эти ма­ значительным повышением содержания одной или
кромолекулы представляют собой биополимеры, по­ нескольких аминокислот в моче; такое состояние на­
строенные из мономерных единиц, или строительных зывают аминоацидурией.
блоков. В нуклеиновых кислотах мономерными еди­
ницами служат нуклеотиды, в сложных полисахари­
дах— сахара и их производные, в белках—
L-a-амннокислоты. АМ ИНОКИСЛОТЫ
Белки помимо аминокислот могут содержать
и другие компоненты, однако трехмерная структура
белков, а следовательно, и их биологические свой­ Аминокислоты содержат в качестве функциона­
ства определяются в основном аминокислотным со­ льных групп аминогруппу и карбоксильную группу.
ставом, порядком чередования аминокислот в поли­ В a -аминокислотах обе они связаны с одним и тем
пептидной цепи и как следствие их взаимным про­ же (а) углеродным атомом (рис. 3.1).
странственным расположением. В природе существует около 300 аминокислот,
Аминокислоты в клетках выполняют множество однако в белках обнаружены только 20 из них. В ре­
важных функций; некоторые из биологически ва­ зультате полного гидролиза1 белков высвобождае­
жных соединений, образующихся из аминокислот, тся 20 L-a-аминокислот (табл. 3.2). Одни и те же 20
приведены в табл. 3.4 и 3.5. аминокислот присутствуют в белковых молекулах
всех форм жизни— растений, животных и микроор­
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ганизмов. Почему это так— мы поймем позже, ког­
да будем обсуждать универсальную природу генети­
Аминокислоты, являясь строительными блоками ческого кода (гл. 30). Однако в ряде белков встре­
пептидов и белков, выполняют и ряд других важных чаются производные некоторых аминокислот, обра­
функций. Некоторые из них, по-видимому, уча­ зующиеся уже после включения обычных аминоки­
ствуют в передаче нервных импульсов; примерами слот в молекулу белка (табл. 3.4).
служат глицин и глутаминовая кислота. В пище дол­ За исключением глицина, у которого R — это
жны содержаться незаменимые аминокислоты, по­ атом водорода, у всех аминокислот четыре группы,
скольку организм человека не способен синтезиро­ связанные с a -углеродным атомом, различны. Бла­
вать их в количествах, достаточных для роста (в дет­ годаря тетраэдрическому расположению четырех
стве) и поддержания здоровья (во взрослом состоя­
нии). В результате метаболизма аминокислот обра­
зуются многие соединения, имеющие биомедицин­ 1 Гидролиз— это разрыв ковалентной связи с присое­
ское значение. Например, при декарбоксилировании динением атомов молекулы воды.
22 Г,шва 3

Н nh2
ряет свой протон намного раньше, чем R — NH +j.
I« При высоких значениях pH, достаточных для пере­
R - C - NH2
I хода аминогруппы преимущественно в форму неза­
соон ряженного сопряженного основания, карбоксильная
о группа будет находиться в виде карбоксилатного ио­
на (R — СОО- ). Однако для удобства во многих
Рнс. 3.1. Два способа изображения a -а минокислоты. уравнениях, когда речь не идет о протонных равно­
весиях, часто используется структура, изображенная
разных групп относительно а-углеродного атома на рис. 3.2,Б.
аминокислота обладает оптической активностью Относительную кислотность слабых кислот мо­
(способностью поворачивать плоскость поляриза­ жно охарактеризовать с помощью константы диссо­
ции плоскополяризованного света). Одни аминоки­ циации кислоты Ка или соответствующего ей рА,—
слоты, входящие в состав белков, являются (при pH отрицательного логарифма константы диссоциации:
7,0) правовращающими, а другие— левовра­ рА. = — log А..
щающими, однако все они имеют абсолютную кон­
фигурацию L-глицеральдегида и поэтому являются В табл. 3.1 представлены кислотные группы
L-a-аминокислотами. и значения рА для функциональных групп 20 амино­
кислот, входящих в состав белков.
Полный (суммарный) заряд (алгебраическая сум­
ма всех положительных и отрицательных зарядов)
аминокислоты зависит от pH, т.е. от концентрации
ИОННЫЕ ФОРМЫ АМИНОКИСЛОТ протонов в окружающем растворе. Заряд аминоки­
Аминокислоты несут по крайней мере две слоты или ее производного можно изменить, варьи­
слабоионизируемые кислые группы, —СООН и руя pH; это облегчает физическое разделение амино­
—N H +3. В растворе эти группы находятся в двух кислот, пептидов и белков.
формах, заряженной и незаряженной, между кото­ Значение pH, при котором суммарный заряд ами­
рыми поддерживается протонное равновесие: нокислоты равен нулю и поэтому она не перемещае­
тся в постоянном электрическом поле, называется ее
R — СООН R — COO- -I- Н +, изоэлектрической точкой (рі). Для алифатических
R — N H +3 R — NH2 + Н +. аминокислот, таких как аланин, изоэлектрическая
R — СООН и R — NH здесь являются протониро­
+3
форма имеет вид, представленный на рис. 3.3.
ванными партнерами, т. е. кислотами, а R — СОО- Изоэлектрическая точка находится посредине ме­
и R — NH2— сопряженными основаниями (т.е. акцеп­ жду ближайшими значениями рА диссоциирующих
торами протонов) соответствующих кислот. M R — групп по разные стороны от рі. Для аминокислоты,
СООН, и R — NH 4 — это слабые кислоты, и все же
3 имеющей только две диссоциирующие группы, ника­
R — СООН является в несколько тысяч раз более кой неоднозначности при подсчете рі не возникает.
сильной кислотой, чем R — N H +3. При значениях Найдем, например, рі для аланина. Поскольку рА,
pH, характерных для плазмы крови и межклеточной (R — СООН) = 2,35 и рК2 (R — N H +3) = 9,69, изо­
жидкости (7,4 и 7,1 соответственно), карбоксильные электрическая точка (рі) аланина равна
группы находятся исключительно в форме карбокси- р А. + рК2 2,35 + 9,69
латных ионов, R — С О О . При этих значениях pH рі = .-------------= ------- ------- = 6,02.
большая часть аминогрупп находится преимуще­
ственно в ассоциированной (протонированной) фор­ Рассчитать рі для соединения, содержащего бо­
ме, R — N H +3. Преобладающая ионная форма ами­ лее двух диссоциирующих групп, труднее, и в этом
нокислот, присутствующих в крови и в большинстве
тканей, представлена на рис. 3.2,А. Структура, изо­
браженная на рис. 3.2.2>, не может существовать ни
при каких pH. При значениях pH, достаточно низких
для протонирования карбоксильной группы, амино­
группа, намного более слабая кислота, также будет
протонирована. Примерные значения р Кя
a -карбоксильной и a -аминогрупп а-аминокислоты
равны 2 и 10 соответственно (табл. 3.1). Кислота при
pH ниже своего рКя будет преимущественно прото­ Рнс. 3.2. А. Правильная ионная структура аминокислоты
нирована, причем если pH будет сдвинуто на 2 еди­ при значениях pH , близких к физиологическим. Б. Незаря­
женная форма, которая не может существовать ни при ка­
ницы ниже рАа, она будет протонирована на 99%. ких- значениях pH; впрочем, такого типа формулу удобно
По мере увеличения pH карбоксильная группа те­ использовать при обсуждении химии аминокислот.
Аминокислоты 23

Таблаца 3.1. Слабокислые группы аминокислот, входящих в состав белков

Г руппа Сопряженная Сопряженное Примерное


кислота основание значение
p К.

а-Карбоксильная R-COOH R -C O O - 2,1 ± 0,5

CO
о

о
+l
©-Карбоксильная (аспартат, глутамат) R-COOH R -C O O -

г = г " Г = Г "
Имидазольная (гистидин) H N ^+^N H 6,0

а-Аминогруппа R -N H ,+ R-NH, 9,8 ± 1,0

е-Аминогруппа (лизин) R -N H ,+ R-NH, 10,5

Фенольная ОН-группа (тирозин) R 0H 10,1

H NH, H NH
1 1*+ 1 II
Гуанидиновая (аргинин) R — N— C — NH2 R — N —C —NH2 12,5

Сульфгидрильная (цистеин) R-SH R -S -


8,3

случае можно ошибиться. Чему, например, будет данного примера


равна изоэлектрическая точка для аспарагиновой ки­ рІ = 2,09 + 3,86 _ 2 98
слоты, если исходить из данных, приведенных на
рис. 3.4? Чтобы однозначно ответить на этот вопрос,
нужно выписать все ионные структуры, возможные Этот подход в равной мере применим для других
для данного соединения, в том порядке, в котором аминокислот с диссоциирующими группами в боко­
они образуются при переходе от сильнокислого к вой цепи, например для лизина или гистидина. Вы­
щелочному раствору (как это было сделано для аспара­ писав формулы для всех возможных заряженных
гиновой кислоты на рис. 3.4). Затем следует найти форм основных аминокислот, лизина и аргинина,
область pH изоионной (цвиттерионной), т.е. ней­ получаем
тральной, формы (как на рис. 3.4,Б), р і— это значе­
ние pH посредине между ближайшими значениями р і- Р * г+Р*>.
рК по разные стороны от изоионной формы. Для
Для лизина рі = 9,7, для аргинина рі = 10,8. Предла­
гаем вам найти рі гистидина.
NH 3+ Описанный выше подход— оценка заряда струк­
тур, рК которых находится по разные стороны от рі
цвиттериона,— пригоден не только для аминоки­
слот. Его можно применять для оценки заряда моле­
О кулы с любым числом диссоциирующих групп. Уме­
ние выполнять такие расчеты оказывается очень цен­
Рас. 3.3. Изоэлектрическая форма аланина («цвиттерион»).
Хотя цвиттерион содержит заряженные группы, его заряд
ным для работы в клинической лаборатории, поско­
равен нулю, поэтому в постоянном электрическом поле он льку позволяет предсказать подвижность соедине­
не перемещается. ний в электрическом поле и подобрать соответ-
24 Гпава 3

В сильно кислой среде При pH около 3 При pH в интервале 6—8 в сильно щелочной среде
(pH < 1) полный заряд = О полный заряд = —1 (pH > 1 1 )
полный заряд = —2
полный заряд = +1

Рис. 3.4. П р о то н н о е равновесие д л я асп араги н овой кислоты .

ствующий буфер для их разделения. Например, для сукцинат (табл. 3.4) участвуют в метаболизме моче­
разделения двух соединений со значениями рі 6 и вины. В природных объектах обнаружено свыше 20
8 пригоден буфер с pH 7,0, поскольку при этом pH D-аминокислот. К их числу относятся D-аланин и D-
молекулы с рі = 6 будут нести суммарный отрицате­ глутамат, входящие в состав клеточных стенок неко­
льный заряд, а молекулы с рі = 8 — положительный. торых бактерий; ряд D-аминокислот входят в состав
антибиотиков.
СТРУКТУРА АМИНОКИСЛОТ
РАСТВОРИМОСТЬ АМИНОКИСЛОТ
Аминокислоты, входящие в состав белков, мо­
жно разбить на две большие группы на основе того, Аминокислоты содержат по нескольку заряжен­
какими являются R-группы, связанные с атомом а- ных групп, поэтому они легко сольватируются и хо­
углерода,— полярными или неполярными (табл. рошо растворяются в полярных растворителях (во­
3.2). да, этанол) и не растворяются в растворителях непо­
В табл. 3.3 приведены трехбуквенные и однобук­ лярных (бензол, гексан, эфир).'Температура плавле­
венные обозначения аминокислот, которые широко ния аминокислот весьма высока (> 200° С). Это то­
используются в биохимии. Однобуквенные обозна­ же обусловлено присутствием в них заряженных
чения применяются для записи наиболее длинных групп. Для разрыва ионных связей, стабилизирую­
аминокислотных последовательностей (например, щих структуру кристалла, нужно сравнительно боль­
полных аминокислотных последовательностей бел­ шое количество энергии.
ков).
Аминокислоты, находящиеся в свободном со­ ОБЩИЕ ХИМИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ
стоянии или входящие в состав других соединений
(не белков), выполняют важную функцию во многих Карбоксильные и аминогруппы аминокислот
метаболических процессах (табл. 3.4 и 3.5). Напри­ вступают во все реакции, характерные для этих
мер, аминокислоты орнитин, цитруллин и аргинино- групп, т.е. в реакции образования солей, этерифика­
ции и ацилирования.
Таблица 3.2. К лассиф икация L ra -ам и н оки сл от, входящ их в
состав б елков, осн ован н ая на о тн оси тел ьн ой п олярности их Цветные реакции
R-rpyrm
Нингидрин (рис. 3.5) осуществляет окислительное
Неполярные Полярные
декарбоксилирование a -аминокислот с образова­
Аланин Аргинин - нием С 0 2, NH3 и альдегида, содержащего на один
Валин Аспарагин атом углерода меньше, чем исходная аминокислота.
Изолейцин Аспарагиновая кислота Восстановленный нингидрин далее реагирует с выс-
Лейцин Г истидин О
Метионин Глицин II
Пролин Глутамин
Триптофан Глутаминовая кислота
Фенилаланин Лизин
Серин
Тирозин
Треонин О
Цистеин Рис. 3.5. Н ингидрин.
Таблица 3.3. L-a-аминокислоты, входящие в состав белков"
Наименование Сокращенное обозначение Структурная формула

С алифатическими боковыми цепями


Глицин Gly(G)
н н н

Аланин А1а(А)
|Л и з

н3с
Валин ѴаІ(Ѵ)
нзс З ІЙ Я ®

нзс
Чсн-сн9— £ Н —С6СГ
Лейцин Leu(L) / г i
Н3С +NH3

СН,
\ J
сн2
Изолейцин He(I) / CH-feHvCOQ~
сн3 +| Ц

С боковыми цепями, содержащими гидроксильные ( ОН) группы


Серин Ser(S)
сн- нденбоот
i 2 \ :
ОН ♦NHJ

Треонин Thr(T) CH3-CH^dW ^C0O^


3 i i ;*%
OH f f l H j '.

Тирозин Tyr(Y) См. ниже

С боковыми цепями, содержащими атом серы


Цистеин 21 Cys(C) | 2" К Т Г
sh ш А 'іу

Метионин Met(M) СН9-С Н ,-'С Н -*С О С Г


Г 2 2 I
S— СН3 +NH3

С боковыми цепями, содержащими кислые группы или их амиды


Аспарагиновая кислота Asp(D)

H2 N -C — CH
Аспарагин Asn(N) II
О
" За исключением гидроксилизина (Hyl) и гидроксипролина (Hyp), которые включаются в полипептидную цепь в виде лизина и про­
лина, а затем гидроксилируются (см. гл. 29 и 54). Для всех перечисленных в таблице аминокислот имеются специфические тРНК, поэтому их
включение в белок осуществляется под прямым генетическим контролем.
2> Цистин состоит из двух остатков цистеина, связанных дисульфидной связью:
NHi*

ООС—СН—СНі—S—S—СН 2—СН—соо-
26 Глава 3
Наименование Сокращенное Структурная
обозначение формула

Глутаминовая кислота Glu(E) OÖC—СН2—-СН 2

Глутамин Gln(Q) H .N - C -C H ,— СН
II
О

С боковыми цепями, содержащими основные группы


Аргинин Arg(R)

nh2

Лизин Lys(K) c h 2— c h 2— c h 2—

+NH3
Г истидин His(H)

\= 3 ~
HN +NH

Содержащие ароматические кольца


Г истидин His(H)
/ V
Фенилаланин Phe(F) \ = /

Тирозин Tyr(Y)

Триптофан Trp(W)
СН-— . СН-НРОО^

ДЗ - '.z

Иминокислоты
Пролин Рго(Р)
Таблица 3.4. Некоторые а-аминокислоты, не входящие в состав белков, но играюіцие важную роль в метаболизме

Название Формула при нейтральном pH Роль

Гомоцистеин Промежуточное соединение в биосинтезе


(2-Амино-4-мер-
сн,— цистеина (гл. 29)
каптомасляная кис­ I I
SH +NH3
лота)

Цистеинсульфиновая Промежуточное соединение в катаболиз­


кислота (2-Амино- сн 2— CH-COO“ ме цистеина (гл. 31)
3-сульфинопропио- I I ‘
новая кислота) SOj +NH3

Г омосерин Промежуточное соединение в метаболиз­


(2-Амино-4-гидро- с н 2— с н 2—СН-СОО- ' ме треонина, аспарагиновой кисло­
ксимасляная кисло­ I I ты и метионина (гл. 31)
та) ОН +NH3

Орнитин Промежуточное соединение в метаболиз-


СН-— СН-——СН-—5- CH-COO“
(2,5-Бисаминопен- 1 1 1 ме треонина, аспарагиновой кисло-
тановая кислота) +NH3 +NH3 ты и метионина (гл. 31)

Цитруллин Промежуточное соединение в биосинтезе


(2-Амино-5-уреидо- сн2-сн 2-сн,-сн-соо_ мочевины (гл. 31)
пентановая кисло- 1 1
та) NH +NH3
1
с=о
nh2

Аргининоянтарная Промежуточное соединение в биосинтезе


+ СН-—СН-— СН-— СН-СОСТ*
лота NH * 1 г мочевины (гл. 31)
II
HN—С—
I
_ ООС-СН2— С-СОО"

3,5,3'-Трииодтиронин (Тз)

Тироксин (3,5,3',5'-
Тетраиодтиронин;
Ъ)
28 Глава 3

Таблица 3.5. Некоторые аминокислоты, не содержащие а-аминогрупп и играющие важную роль в метаболизме млекопи­
тающих

Обычное и систематическое название Формула при нейтральном pH Роль

ß-Аланин СНз—СНз—с о о - Составная часть кофермента А и витамина пан­


(З-Аминопропионат) 1 тетеина (гл. 17)
+N H j

Таурин СН і—C H j—SOT Находится в желчи в составе конъюгатов желч­


(2-Аминоэтилсульфонат) 1 ных кислот (гл. 27)
+N H j

у-Аминомасляная кислота (ГАМ К) СНг—СНг—СНі—С О О Нейромедиатор, образующийся из глутамата в


1 ткани мозга (гл. 32)
+N H j

ß-Аминоизомасляная кислота H jN +—СНг—с н —с о о - Конечный продукт катаболизма пиримидинов,


(2-Метил-З-аминопропионат) 1 иногда обнаруживаемый в моче некоторых
СНз больных (гл. 35)

вободившимся аммиаком, образуя голубой ком­ о


плекс с максимумом поглощения при Хтах = 570 нм.
Образование этого окрашенного соединения исполь­
зуется в количественном тесте на а-аминокислоты,
с помощью которого можно обнаружить аминоки­
слоты, даже если их количество не превышает 1 мкг.
Нингидрин реагирует не только с а-
аминокислотами, но и с другими аминами; при этом
тоже появляется голубая окраска, но без выделения
С 0 2. Таким образом, выделение С 0 2 является инди­ ч^ н 2о
катором участия в реакции а-аминокислоты. NH3
и пептиды тоже вступают в реакцию, но менее ак­
тивно, чем а-аминокислоты. Продукт реакции ме­ 8
жду пролином (или 4-гидроксипролином) и нингид-
рином имеет желтую окраску.
Флуорескамнн (рис. 3.6) является еще более чув­
ствительным реагентом, позволяющим обнаружи­
вать аминокислоты в количестве порядка нано­
Аланил-валин
грамм. Как и нингидрин, он образует комплекс не (А Іа -Ѵ а І), дипептид
только с аминокислотами, но и с другими аминами.
Рис. 3.7. Соединение аминокислот пептидной связью (зате­
ненная область).
Образование пептидных связей
Наиболее важной реакцией, в которой участвуют
аминокислоты, является образование пептидных сие сильно сдвинуто в сторону гидролиза пептидной
связей. При этом высвобождается одна молекула во­ связи. Для образования пептидной связи между
ды (рис. 3.7). Однако реакция осуществляется не так, двумя аминокислотами карбоксильная группа дол­
как она представлена на рисунке, поскольку равнове- жна быть предварительно активирована. Химиче­
ский синтез осуществляется путем предварительного
образования хлорангидрида. Биологическая актива­
ция включает взаимодействие с АТР.

СВОЙСТВА ИНДИВИДУАЛЬНЫХ АМИНО­


КИСЛОТ
Глицин, наименьшая из аминокислот, может ло­
кализоваться в таких областях трехмерной структу­
ры белковой молекулы, которые недоступны другим
аминокислотам.
Аминокислоты 29

Алифатические R-группы аланина, валина, лей­ белков в этой области обусловлено в основном трип­
цина и изолейцина и ароматические R-группы фени­ тофаном.
лаланина, тирозина и триптофана гидрофобны; это
свойство приводит к одному очень важному послед­ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ
ствию— образованию упорядоченного поверхност­
ного слоя молекул воды в области поверхности мо­ Хроматография
лекулы белка, где экспонированы неполярные R-
группы. Заряженные R-группы основных и кислых При всех хроматографических методах разделе­
аминокислот играют важную роль в стабилизации ния молекулы распределяются между стационарной
специфической конформации белка путем образова­ и подвижной фазами (табл. 3.6). Разделение зависит
ния солевых связей. Кроме того, аминокислоты с по­ от относительной способности содержащихся в смеси
ложительно и отрицательно заряженными R- молекул к более прочной ассоциации с одной или дру­
группами, а также гистидин могут участвовать гой фазой.
в формировании систем «переноса заряда», которые Здесь мы рассмотрим в основном методы разде­
в ходе ферментативного катализа обеспечивают ления аминокислот, однако применение этих мето­
перемещение заряда на значительные расстояния. дов ни в коей мере не ограничивается данными моле­
Наконец, уникальная и очень важная роль в фермен­ кулами.
тативном катализе принадлежит гистидину— рА
имидазольной группы таково, что эта аминокислота Хроматография на бумаге
при pH = 7 может попеременно выступать в роли ос­
новного или кислотного катализатора. Сейчас этот метод в значительной мере вытеснен
Первичная спиртовая группа серина и первичная более совершенными методами, однако он все же
тиоспиртовая (—SH) группа цистеина являются применяется для разделения аминокислот. Образцы
в определенных условиях хорошими нуклеофилами наносят на бумагу в заранее отмеченную точку, от­
и участвуют в ферментативном катализе. Хотя вто­ ступив примерно 5 см от верхнего края полоски
ричная спиртовая группа треонина тоже является ну­ фильтровальной бумаги. Затем полоску подвеши­
клеофилом, данные о ее возможной каталитической вают в закрытом сосуде, на дно которого налита
роли отсутствуют. Помимо каталитической функ­ смесь растворителей (рис. 3.9).
ции —ОН-группа серина участвует в регуляции ак­ Для разделения аминокислот используют поляр­
тивности некоторых ключевых ферментов метабо­ ные растворители в виде бинарных, тройных и более
лизма, активность которых зависит от фосфорили­ сложных смесей воды, спиртов, кислот и оснований.
рования определенных остатков серина. Более полярные компоненты растворителя ассоции­
Аминокислоты не поглощают свет в видимой руются с целлюлозой и образуют стационарную фа-
области (иными словами, они не окрашены). За ис­
ключением ароматических аминокислот триптофа­
Таблица 3.6. Физическое состояние фаз в хроматографиче­
на, тирозина, фенилаланина и гистидина, они не по­ ских системах, используемых в биохимии
глощают и в ультрафиолетовой области при длинах
волн выше 240 нм. Как видно из рис. 3.8, поглощение Хроматографическая система Стационарная Подвижная
фаза фаза

Распределительная хрома­ Жидкая Жидкая


тография на бумаге, в
тонком слое порошка
целлюлозы, на колонке
с инертным носителем,
покрытым тонким сло­
ем жидкости; гель-
фильтрация
Ионообменная хромато­ Твердая »
графия: адсорбция на
тонких слоях или ча­
стицах, заполняющих
колонку
Распределительная хрома­ Жидкая Г азообразная
тография (между тон­
ким слоем жидкости на
Рис. 3.8. Спектры поглощения триптофана, тирозина и фе­ носителе и подвижным
нилаланина в УФ-области. газом)
30 Глава 3

Направление
• Ш Точка нанесения
миграции ?
растворителя
І Cys

Lys His
Asp Arg
Gly Ser

Glu
Thr

Ala

Pro
Рис. 3.9. Устройство для хроматографии на бумаге (в нис­
ходящем варианте).
Tyr
зу, а менее полярные составляют подвижную фазу.
Э то— нормальная распределительная хроматогра­ Val Met
фия. В распределительной хроматографии с обращен­
ной фазой полярная и неполярная фазы меняются ме­
стами (для этого, например, бумагу предварительно Trp
погружают в раствор силикона). Распределительная Ile
Phe
хроматография с обращенной фазой используется
для разделения неполярных пептидов или липидов; Leu
для таких полярных соединений, как аминокислоты,
она непригодна. Растворитель перемещается по бу­
маге вверх или вниз (восходящая или нисходящая Рис. 3.10. Идентификация аминокислот, входящих в состав
белков. После хроматографического разделения на бумаге
хроматография). Когда он доходит почти до конца, с использованием в качестве растворителя системы бута-
полоску вынимают из сосуда, высушивают и обра­ нол/уксусная кислота (нисходящий вариант) аминокислоты
батывают определенным образом, чтобы на ней окрашивают нингидрином.
проявились интересующие исследователя соедине­
ния (при разделении аминокислот используют обра­ известной смесью проводить хроматографирование
ботку 0,5%-ным нингидрином в ацетоне с последую­ известной стандартной смеси аминокислот. В этом
щим прогреванием в течение нескольких минут при случае подвижность исследуемой аминокислоты мо­
90— } 10 ). Аминокислоты с объемными неполярны­ жно отнести к подвижности стандарта (например, не
ми боковыми цепями (Leu, Ile, Phe, Trp, Val, Met, R(, а /?А1а). Подвижности, выраженные относительно
Tyr) перемещаются быстрее, чем аминокислоты стандарта, меняются от эксперимента к эксперимен­
с более короткими неполярными боковыми цепями ту в меньшей степени, чем R{.
(Pro, Ala, Gly) или с полярными боковыми цепями Для количественного анализа аминокислот каж­
(Thr, Glu, Ser, Arg, Asp, His, Lys, Cys) (рис. 3.10). Это дое пятно вырезают и элюируют (вымывают) веще­
обусловлено большей растворимостью полярных ство подходящим растворителем; затем проводят
молекул в гидрофильной стационарной фазе и непо­ количественный колориметрический (нингидрино­
лярных— в органических растворителях. Отметим, вый) анализ. В другом варианте бумагу опрыски­
что в ряду неполярных аминокислот (Gly, Ala, Val, вают нингидрином и измеряют с помощью фотоме­
Leu) при увеличении длины неполярной боковой це­ тра интенсивность окрашивания пятна в проходя­
пи, сопровождающемся усилением ее неполярного щем или отраженном свете.
характера, увеличивается и подвижность аминоки­ При двумерной хроматографии на бумаге образец
слоты. наносят на один из углов квадратного листа бумаги
Отношение расстояния, на которое перемещается и проводят разделение в одной системе растворите­
данная аминокислота, к расстоянию, пройденному лей. Затем лист вынимают, высушивают, поворачи­
фронтом растворителя (оба они отсчитываются от вают его на 90° и хроматографируют в другом ра­
точки нанесения смеси аминокислот), обозначают створителе (рис. 3.11).
через Rf (подвижность по отношению к фронту ра­
створителя). Значение R{ для данной аминокислоты
Тонкослойная хроматография
зависит от условий эксперимента, например от типа
растворителя. Хотя предварительную идентифика­ Имеются два четко различающихся варианта
цию аминокислоты можно провести исходя лишь из тонкослойной хроматографии. Распределительная
ее значения R{, рекомендуется одновременно с не- тонкослойная хроматография (РТСХ) сходна с рас-
Аминокислоты 31

Бутанол/уксусная кислота/вода (4:1:5) собностью растворителя (этот растворитель не обя­


. * Точка Ä Asp
зательно является бинарной или более сложной
2
о
X нанесения ЩШ . смесью) элюировать компоненты образца с места его
Н «С у, Glu
а адсорбции на активированном сорбенте, например
£ А Ser
на нагретом силикагеле. АТСХ применима для раз­
с_
о «
|AspNH2' * # T h r деления таких неполярных соединений, как липиды,
и . #A la
LyS § ’ * G I u NH2
Tyr
но не для разделения аминокислот и большинства
пептидов.
Автоматическая ионообменная хроматография
8£ His л #V al
& Разделение аминокислот можно проводить раз­
Argi Met # He Leu
ными методами, но для анализа аминокислотного
состава полипептида после его гидролиза обычно
M T ry p #
используют автоматическую ионообменную хромато­
* РГО *P h e графию. Полное разделение аминокислот, их иденти­
фикация и количественная оценка занимают менее
Рис. 3.11. Двумерная хроматограмма аминокислот, входя­ трех часов. В методе Мура и Штейна используют ко­
щих в состав белка (воспроизведена с некоторыми модифи­ роткую и длинную колонки, заполненные смолой из
кациями из работы Anal. Chem. 1953:25:396).
сульфонированною полистирола в N a+-форме. Ког­
да кислотный гидролизат при pH 2 наносят на ко­
пределительной хроматографией на бумаге, а ад­ лонку, аминокислоты связываются в результате ка­
сорбционная тонкослойная хроматография (АТСХ) тионного обмена с N a+. Далее колонку элюируют
основана на совершенно иных принципах. раствором цитрата натрия при заранее запрограм­
При проведении РТСХ на порошке целлюлозы или мированных значениях pH и температуры. Корот­
на других сравнительно инертных носителях можно кую колонку элюируют одним буфером, длинную—
использовать такие же системы растворителей и та­ двумя. Элюат обрабатывают нингидрином, измеряя
кие же проявляющие реагенты, как и при хромато­ интенсивность окраски с помощью проточного ко­
графии на бумаге. Возможна и РТСХ с обращенной лориметра. Данные автоматически регистрируются
фазой. на ленте самописца и могут передаваться в компью­
Разделение с помощью АТСХ определяется спо­ тер для вычисления площади под пиком (рис. 3.12).

Рас. 3.12. Автоматический анализ кислотного гидролизата эндосперма пшеницы по Муру и Штейну на колонках днуэкс-
50 (при 55°С). Л . Д ля идентификации оснбвных аминокислот используется короткая колонка (5 х 0,9 см); элюирование
проводят при pH 5,28, продолжительность опыта 60 мин. Б. Для разделения нейтральных и кислых аминокислот исполь­
зуется более длинная колонка (55 х 0,9 см); элюирование проводят сначала буфером с pH 3,25, а затем буфером с pH 4,25.
В качестве внутреннего стандарта добавлен норлейцин. Оснбвные аминокислоты остаются на колонке. Продолжительно­
сть-опыта 180 мин. Элюируемые фракции автоматически обрабатываю т нингидрином, после чего измеряют их оптиче­
скую плотность при 570 и 440 нм. Регистрация при длине волны 440 нм используется исключительно для идентификации
пролина и гидроксипролина (в эндосперме пшеницы они отсутствуют). (С любезного разрешения Е. Т. Mertz, Purdue Uni­
versity.)
32 Глава 3

Высоковольтный электрофорез на инертных Выбор pH определяется значениями рК диссо­


носителях циирующих групп, входящих в состав молекул сме­
си. При pH 6,4 глутамат и аспартат несут заряд — 1
В биохимии широкое применение нашло разделе­ и движутся к аноду; разделение их осуществляется
ние аминокислот, полипептидов и других амфоли­ благодаря различию в молекулярной массе. Лизин,
тов (молекул, суммарный заряд которых зависит от аргинин и гистидин движутся в противоположном
pH среды) под действием наложенного постоянного направлении, а все другие аминокислоты, входящие
электрического поля. При разделении аминокислот в состав белка, остаются вблизи места нанесения.
в качестве инертных носителей чаще всего исполь­ При разделении пептидов, образовавшихся в резуль­
зуют полоски бумаги или тонкие слои целлюлозного тате ферментативного расщепления, уменьшение pH
порошка. Разделение проводят в течение 0,5—2 ч при до 3,5 приводит к увеличению заряда катионных
напряжении 2000—5000 В в зависимости от суммар­ групп и обеспечивает лучшее разделение.
ных зарядов амфолитов и их молекулярных масс.
Среди молекул, несущих одинаковый заряд, более
легкие мигрируют быстрее. Но более важным пара­
метром при разделении является суммарный заряд.
Метод применяется для разделения аминокислот, ЛИТЕРАТУРА
низкомолекулярных пептидов, некоторых белков, Barrett G. С. Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids,
нуклеотидов и сахарофосфатов. Образец помещают Chapman and Hall, 1985.
на носитель, смачивают буфером при соответствую­ Cooper T.G . The Tools of Biochemistry, Wiley, 1977.
щем pH и соединяют с буферным резервуаром поло­ Friedman M . The Chemistry and Biochemisrty of the Sulfhydryl
ской фильтровальной бумаги. Бумагу прикрывают G roup in Amino Acids, Peptides, and Proteins, Pergamon
стеклянной пластинкой или погружают в углеводо­ Press, 1973.
родный растворитель для охлаждения. В электриче­ Greenstein J .P ., Winitz M . Chemictry of the Amino Acids,
3 vols, Wiley, 1961.
ском поле молекулы, несущие при данном pH отри­ Heftman E. Chromatography: A Laboratory Handbook of
цательный заряд, мигрируют к аноду, а те, которые Chromatographic and Electrophoretic Methods, 3rd ed.,
несут положительный заряд,— к катоду. Далее высу­ Van N ostrand, 1975.
шенную электрофореграмму «проявляют» нингид- Touchstone J. C. Practice o f Thin Layer Chromatography, Wi-
рином (при работе с аминокислотами, пептидами) ley-Interscience, 1978.
или измеряют поглощение в Уф-свете (при работе Zweig G., Sherma J. H andbook of Chromatography, 2 vols,
с нуклеотидами). CRC Press, 1972.
Глава 4

Пептиды
Виктор Родуэлл

ВВЕДЕНИЕ
Когда карбоксильная и аминогруппа аминоки­
слот соединяются, образуя пептидную связь, соот­
ветствующие аминокислоты превращаются в амино­
кислотные остатки. Пептид состоит из двух или более
аминокислотных остатков, связанных пептидными
связями. Пептиды из более чем 10 аминокислотных
остатков называются полипептидами.
Алания Цистеинил Валин
Рис. 4.1. Структурная формула трипептида. Пептидные
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ связи для наглядности затенены.
Пептиды имеют очень большое биомедицинское изображать так, чтобы N-концевой остаток (содер­
значение; особенно велика их роль в эндокриноло­ жащий свободную а-аминогруппу) располагался сле­
гии. Пептидами являются многие важнейшие гормо­ ва, а С-концевой остаток (со свободной а-
ны человека. Их часто назначают больным для кор­ карбоксильной группой)— справа. Такой пептид
рекции соответствующей недостаточности. Самый имеет только одну свободную а-аминогруппу и толь­
известный пример— введение инсулина больным са­ ко одну а-карбоксильную группу. Это справедливо
харным диабетом. Пептидами являются также раз­ для всех полипептидов, которые образованы только
личные антибиотики (валиномицин, грамицидин А) аминокислотными остатками, соединенными друг
и некоторые противоопухолевые препараты (напри­ с другом пептидными связями, образовавшимися
мер, блеомицин). Разработанные в последние годы между а-аминогруппой и а-карбоксильной группой.
методы быстрого химического синтеза пептидов по­ В некоторых пептидах концевая аминогруппа или
зволили наладить производство пептидных гормо­ концевая карбоксильная группа модифицирована
нов в значительных количествах; это разрешило (примером могут служить ацильное производное
многие проблемы, поскольку обычно гормоны при­ аминогруппы или амид карбоксильной группы) и,та­
сутствуют в организме животных в очень малых ким образом, не является свободной.
концентрациях и их трудно выделить в количествах,
достаточных для терапевтических целей. По той же
технологии осуществляется синтез и других пепти­ Запись структурной формулы пептидов
дов, которые ввиду их малого содержания тоже Укажем самый простой способ записи. Во-
трудно выделять из природных источников; в част­ первых, нарисуем «остов» из связанных друг с дру­
ности, это относится к вирусным пептидам, исполь­ гом a-NH2- и а-СООН-групп и из атомов а-
зуемым в качестве вакцин. углерода. Эти группы чередуются вдоль остова це­
пи. Затем подсоединим к a-углеродным атомам со­
СТРУКТУРА ПЕПТИДОВ ответствующие боковые группы. Опишем эту проце­
дуру подробнее.
Общие сведения о структуре пептида 1. Вычертим зигзагообразную линию произво­
льной длины и добавим слева N-концевую амино­
На рис. 4.1 изображен трипептид, состоящий из группу:
аминокислотных остатков аланина, цистеина и вали­
на. Отметим, что трипептид содержит три остатка, но
не три пептидные связи. Структуру пептида принято
21573
34 Глава 4

2. Встроим в цепочку а-углеродные атомы, а- Glu-Lys-(Ala, Gly, Tyr)-His-Ala


карбоксильную и а-аминную группы:
О Рис. 4.3. Гептапептид, содержащий участок, точная пер­
вичная структура которого не установлена.

О
3. Присоединим соответствующие R-группы (они Физиологические последствия изменений
затенены) и атомы а-водорода к а-углеродным ато­ в первичной структуре
мам:
SH Замена всего одной аминокислоты на другую
о Н в линейной последовательности из 100 и более ами­
II 2 Н
h 2n 'С au нокислот может привести к снижению или полной
/ \ / со° потере биологической активности пептида, а это
н
> сн. "
о Н " > N ch
повлечет за собой весьма серьезные последствия (в
качестве примера можно привести серповиднокле­
сн, сн,
точную анемию; см. гл. 6). Многие наследуемые на­
рушения метаболизма обусловлены именно одиноч­
ными заменами такого типа. С развитием новых
мощных методов определения структуры белков
и ДНК удалось выяснить биохимическую основу
Glu-Ala-Lys-Gly-Tyr-Ala многих наследуемых болезней, связанных с наруше­
Е А К G Y А ниями метаболизма.
Рис. 4.2. Представление первичной структуры гексапепти­ ИОННЫЕ ФОРМЫ ПЕПТИДОВ
да с помощью трехбуквенных и однобуквенных обозначе­
ний аминокислотных остатков. Данный гексапептид содер­ Пептидная (амидная) группа остается незаряжен­
жит на N-конце глутамат (Glu. Е). а на С-конце аланин
(Ala, А). ной при всех физиологических значениях pH. Обра­
зование пептида из аминокислот при pH 7,4 сопрово­
ждается потерей одного отрицательного и одного
положительного заряда на каждую образовавшуюся
Первичная структура пептида пептидную связь. Однако пептиды при физиологиче­
ских pH несут суммарный заряд, поскольку заряжен­
Линейная последовательность аминокислотных ными являются С- и N-концевые группы и связанные
остатков в полипептидной цепи называется первич­ с а-углеродными атомами заряженные боковые цепи
ной структурой пептида. Чтобы определить первич­ (табл. 3.1).
ную структуру Полипептида, нужно установить Полипептиды, так же как аминокислоты и другие
число, химическую структуру и порядок расположе­ заряженные молекулы, можно выделить с помощью
ния всех аминокислотных остатков, входящих в его методов, основанных на разделении по заряду (элек­
состав. трофорез, ионообменная хроматография). Значение
Полипептиды (белки) могут содержать 100 и бо­ рК С-концевой карбоксильной группы полипептида
лее остатков, поэтому традиционные структурные выше, чем у а-карбоксильной группы соответствую­
формулы оказываются неудобными для представле­ щей аминокислоты (т. е. пептидная СООН-
ния первичной структуры. «Химическая скоропись» группа— более слабая кислота). Протонированная
использует либо трехбуквенные, либо однобуквен­ N-концевая аминогруппа, напротив, является более
ные обозначения аминокислот, выписанные во вто­ сильной кислотой (с более низким значением рК),
ром столбце табл. 3.3 (рис. 4.2). При наименовании чем аминогруппа соответствующей свободной ами­
пептида его рассматривают как производное С- нокислоты, от которой она произошла (табл. 4.1).
концевого аминокислотного остатка.
Если первичная структура однозначно установле­
на, то трехбуквенные обозначения аминокислотных Таблица 4.1. Значения рА'для глицина и глициновых пепти­
остатков соединяют черточками. Однобуквенные дов
обозначения черточками не соединяют. Если на ка­ рАГ(СООН) pA(NHn)
ком-то участке полипептидной цепи точный порядок
следования аминокислотных остатков неизвестен, Gly 2,34 9,60
эти остатки заключают в скобки и разделяют запя­ Gly-Gly 3.12 8,17
тыми (рис. 4.3). Gly-Gly-Gly 3,26 7,91
Пептиды 35

КОНФОРМАЦИЯ ПЕПТИДОВ В РАСТВОРЕ тион вместе с ферментом глутатионредуктазой уча­


ствует в образовании «правильных» дйсульфидных
Теоретически пептид может находиться в самых связей во многих белках и полипептидных гормонах
разнообразных конформационных состояниях (т.е. (гл. 5).
иметь множество вариантов пространственного ра­ Полипептидные антибиотики, синтезируемые
сположения атомов). Однако, судя по имеющимся грибами, часто содержат как D-, так и L-
данным, в растворе диапазон возможных конформа­ аминокислоты, а также некоторые аминокислоты, не
ций невелик. Наличие преимущественных конформа­ встречающиеся в белках. Примерами могут служить
ций обусловлено такими факторами, как стерические тироцидин и грамицидин S— циклические полипеп­
ограничения, кулоновские взаимодействия, водород­ тиды, содержание D-фенилаланин и «небелковую»
ные связи и гидрофобные взаимодействия (гл. 5). аминокислоту орнитин. Синтез этих полипептидов
Как и в случае белков, физиологическая активность осуществляется не в рибосомах.
полипептидов (например, ангиотензина и вазопрес- Еще одним примером служит тиреолиберин (рис.
сина) тоже зависит от их конформации (гл. 45, 48). 4.5). Его N-концевой глутамат циклизован с образо­
ванием остатка пироглутаминовой кислоты, а С-
Физиологически активные пептиды концевая карбоксильная группа пролина амидирова-
на.
Животные, растительные и бактериальные клет­
ки содержат множество разных полипептидов (от
3 до 100 аминокислотных остатков), обладающих
высокой физиологической активностью. Некоторые
из них, в частности большинство полипептидных
гормонов млекопитающих, содержат только пеп­
тидные связи, образованные между а-амино- и а-
карбоксильной группами двадцати L-
а-аминокислот, входящих в состав белков. Однако
в полипептидах (но не в белках) могут содержаться Рис. 4.5. Тиреолиберин (пироглутамилгистидилпролин-
амид).
и другие аминокислоты или производные обычных,
встречающихся в белках, аминокислот. Приведем
несколько примеров такого рода. В организме млекопитающих синтезируется по­
Короткие полипептиды брадикинин и каллидин липептид, включающий несколько полипептидов,
вызывают расслабление гладких мышц и являются потенциіально обладающих физиологической актив­
продуктами ограниченного протеолиза специфиче­ ностью. ß-Липотропин— гипофизарный гормон,
ских белков плазмы. Поскольку эти пептиды проис­ стимулирующий освобождение жирных кислот из
ходят из белков, они содержат только аминокисло­ жировой ткани,— содержит аминокислотные после­
ты, встречающиеся в белках: довательности, идентичные последовательностям
некоторых других полипептидных гормонов с иной
Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg физиологической активностью (рис. 4.6). Этот высо­
Брадикинин комолекулярный полипептид служит предшествен­
Lys-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg ником полипептидов меньшего размера.
Каллидин
Глутатион (рис. 4.4) встречается во всех видах ор­ МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ ПЕПТИДОВ
ганизмов; это атипичный трипептид, в котором N-
концевой глутамат и цистеин связаны не а- Хроматография и высоковольтный
пептидной связью. В организме человека и других электрофорез
животных глутатион необходим для работы ряда
ферментов. По имеющимся представлениям, глута- Эти методы (гл. 3) применимы для разделения не
только аминокислот, но и низкомолекулярных поли­
SH пептидов.

Г ель-фильтрация
При автоматическом секвенировании (определе­
нии аминокислотной последовательности) исполь­
Н—С—NH3+ зуют крупные (30— 100 остатков) пептиды. Однако
соо- многие денатурированные высокомолекулярные по­
липептиды оказыватся нерастворимыми. Это связа­
Рис. 4.4. Глутатион (у-глутамилцистеинилглицин). но с тем, что гидрофобные остатки, ранее укрытые

2*
36 Глава 4

ТГ-Эндорфин
I

а-Эндорфин
I - ■

i Мет-энкефалин i

Рис. 4.6. Первичная структура ß-липотропина. Фрагмент, включающий остатки 41 —58. соответствует меланоцитстиму-
лирующему гормону (ß-MCT), а фрагмент, состоящий из остатков 61—91, включает последовательности указанных
эндорфинов.

внутри молекулы, при денатурации могут экспони­ а также полимер акриламида (СН2= CHCONH2) с
роваться. Такие полипептиды можно в принципе ра­ поперечными сшивками. Если электрофорез проводи­
створить в мочевине, спиртах, органических кисло­ тся в полиакриламидном геле (ПАГ), то раствор бел­
тах и основаниях, но это ограничивает возможности ка наносят на насыщенные буфером блоки поли­
последующего разделения пептидов с помощью ио­ акриламида, «прошитого» метиленбисакриламидом
нообменной хроматографии. Впрочем, гель- («бис») (степень сшивания 2— 10%) или другим ана­
фильтрацию крупных гидрофобных пептидов можно логичным сшивающим реагентом. Для проявления
проводить в 1—4 М муравьиной или уксусной кисло­ используют кумасси синий или Ag+ (полипептиды),
те (рис. 4.7). бромистый этидий (полинуклеотиды) и т.д. Весьма
распространено использование электрофореза в по­
лиакриламидном геле в денатурирующих условиях.
Жидкостная хроматография на колонках
Белок прогревают и затем проводят электрофорез
с обращенной фазой при высоком давлении
в присутствии денатурирующих агентов — моче­
Мощным методом очистки высокомолекуляр­ вины или додецилсульфата натрия (ДСН), чтобы
ных неполярных пептидов является жидкостная хро­ создать условия, благоприятные для разделения
матография при высоком давлении на неполярных молекул по размеру. Электрофорез в ПАГ -ДСН ши­
материалах с использованием для элюирования по­ роко используется для определения молекулярной
лярных растворителей. Рис. 4.8 иллюстрирует разде­ массы белковых субъединиц; метод основан на срав­
ление с помощью этого метода тех же бромциано- нении их подвижности с подвижностью стандартных
вых фрагментов фетального глобина человека, кото­ препаратов известной молекулярной массы.
рые фигурировали на рис. 4.7. Совместно используя
гель-фильтрацию и указанный метод, можно разде­ ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМИНОКИСЛОТНОГО
лить сложные смеси пептидов, полученные путем ча­ СОСТАВА ПЕПТИДОВ
стичного протеолиза. Для разделения крупных пеп­
тидов созданы новые стационарные фазы. Прежде всего путем гидролиза разрушают пеп­
тидные связи. Поскольку при нейтральных pH пеп­
тидные связи стабильны, применяют кислотный или
Высоковольтный электрофорез
на молекулярных ситах щелочной катализ. Ферментативный катализ для
полного гидролиза менее пригоден. Полный гидро­
В этом методе используются одновременно лиз белка на составляющие аминокислоты неизбе­
и разделение по заряду, и эффект молекулярного си­ жно сопровождается частичной потерей некоторых
та. В качестве сита применяют крахмал и агарозу, аминокислотных остатков. Лучше всего проводить
Пептиды 37

Рис. 4.7. Гель-фильтрация бромциановых (СВ) фрагментов Рис. 4.8. Жидкостная хроматография с обращенной фазой
фетального глобина человека. Хроматография проведена при высоком давлении: профиль элюирования бромциано­
на колонке сефадекс G-50, уравновешенной 1%-ным вых (СВ) фрагментов фетального глобина человека. Нуме­
НСООН, с последующей элюцией тем же раствором. Ну­ рация фрагментов а- и у-цепей произвольна. (С любезного
мерация фрагментов а- и у-цепей произвольна. (С любезно­ разрешения J. D. Pearson et al., Department of Biochemistry,
го разрешения J. D. Pearson et al., Department of Biochemi­ Purdue University.)
stry, Purdue University.)

гидролиз в 6 и. HCl при 110°C в вакуумированной в кислотостабильные производные (например,


ампуле. В этих условиях полностью разрушаются в цистеиновую кислоту). Для анализа триптофана
триптофан к цистеин и частично цистин. В присут­ проводят щелочной гидролиз; при этом происходят
ствии металлов наблюдается частичная потеря ме­ разрушение серина, треонина, аргинина и цистеина
тионина и тирозина. Глутамин и аспарагин количе­ и рацемизация всех аминокислот. По окончании гид­
ственно дезамидируются в глутамат и аспартат. Со­ ролиза аминокислотный состав можно определить
держание серина и треонина тоже оказывается зани­ с помощью автоматической ионообменной хромато­
женным, причем в тем большей степени, чем дольше графии (см. рис. 3.12) или жидкостной хроматогра­
проводится гидролиз. Наконец, некоторые с^язи ме­ фии под давлением.
жду нейтральными остатками (Val-Val, Ile-Ile, Val-
Ile, Ile-Val) даже через 20 ч гидролизуются лишь на
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
50%. Обычно параллельные пробы гидролизуют
ПОЛИПЕПТИДОВ
в течение 24, 48, 72 и 96 ч. Затем данные по серину
и треонину наносят на график в полулогарифмиче­ Уже более трех десятилетий минуло с тех пор, как
ском масштабе и проводят экстраполяцию к нулево­ Сенгер поразил биохимический мир, установив с по­
му моменту времени. По валину и изолейцину испо­ мощью химических и ферментативных методов пол­
льзуют результаты, полученные при 96-часовом гид­ ную первичную структуру гормона инсулина. Под­
ролизе. Дикарбоновые кислоты и их амиды опреде­ ход Сенгера состоял в следующем. Сначала он раз­
ляются суммарно и регистрируются как “Glx” или делил две полипептидные цепи инсулина, А и В, и да­
“Asx” . Цистеин и цистин до гидролиза превращают лее провел их специфическое ферментативное расще-
38 Глава 4

пление на небольшие пептиды, содержащие перекры­ осложнением при секвенировании эукариотических


вающиеся участки последовательности. Он разделил генов является присутствие внутри гена нитронов (гл.
эти пептиды и, используя реагент 1- 38), которые не считываются в ходе экспрессии и не
фтор-2,4-динитробензол (рис. 4.9), идентифицировал представлены в зрелом белке. В то же время боль­
их N-концевые остатки. Кроме того, он определил шим преимуществом метода секвенирования ДНК
аминокислотный состав пептидов и в итоге смог является относительная легкость обнаружения и се­
установить их структуру. Сравнивая последователь­ квенирования участков, присутствующих только
ности перекрывающихся пептидов, он однозначно в предшественнике белка и отщепляемых при его со­
установил первичную структуру обеих цепей, А и В. зревании. Таким образом, секвенирование ДНК
В общих чертах стратегия Сентера сохранила и автоматическая процедура Эдмана дополняют
свое значение и до наших дней, однако за истекшие друг друга; их совместное использование коренным
десятилетия были разработаны два новых подхода, образом изменило и расширило наши знания о пер­
которые произвели революцию в определении пер­ вичной структуре белков. Секвенирование ДНК мы
вичной структуры полипептидов (белков). Первый рассмотрим в гл. 38, а процедуру Эдмана— в сле­
подход основан на разработанной Эдманом в 1967 г. дующем разделе.
автоматической процедуре последовательного от­
щепления и идентификации N-концевых аминоки­ АВТОМАТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
слотных остатков в виде их фенилтиогидантоиновых АМИНОКИСЛОТНОЙ
производных. Второй подход связан с методом, раз­ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ПОЛИПЕПТИДОВ
работанным Сенгером и, независимо, Максамом МЕТОДОМ ЭДМАНА
и Гилбертом, позволяющим проводить быстрое
и однозначное секвенирование гена, кодирующего Разделение на линейные полипептиды
рассматриваемый белок. Оптимальная стратегия со­
стоит в одновременном использовании обоих подхо­ Молекулы многих белков содержат более одной
дов. Автоматическая деградация по Эдману, намно­ полипептидной цепи; эти цепи связаны либо некова­
го более быстрая по сравнению с первоначальным лентными связями, либо дисульфидными мостика­
ручным методом Сенгера, тем не менее сильно усту­ ми. Поэтому первым шагом должно быть выделение
пает по скорости методам секвенирования ДНК индивидуальных полипептидных цепей. Диссоциа­
и сопряжена с рядом трудностей. С другой стороны, цию нековалентно связанных полипептидов прово­
секвенирование ДНК не всегда дает однозначную дят с помощью денатурирующих агентов (мочеви­
первичную структуру исследуемого белка. Главным ны, гуанидингидрохлорида), которые разрывают во­
дородные связи. Дисульфидные мостики разрушают
с помощью окисляющих и восстанавливающих аген­
тов (рис. 4.10). Затем проводят хроматографическое
Н R разделение полипептидов.
0,N Н —N -C H -С О О Н
Расщепление полипептида на фрагменты,
пригодные для автоматического
HF секвенирования
Приборы для автоматического секвенирования
N02
Н R (секвенаторы) работают наиболее эффективно, ког­
N -C H -C O O H
да длина полипептидов составляет 20—60 остатков.
o 2n
Эти требования в значительной мере способствова­
ли разработке методов расщепления полипептидов
Рис. 4.9. Реакция аминокислоты с 1-фтор- на фрагменты нужного размера и их очистки. Основ­
2,4-динитробензолом (реагентом Сенгера). Реагент назван ной задачей стало не получение большого числа ма­
в честь нобелевского лауреата (1958 г.) биохимика Фреде­
рика Сенгера, который использовал его для определения лых фрагментов, пригодных для ручного секвениро­
первичной структуры инсулина. Вначале арилируют вания, а расщепление на малое число крупных фраг­
(с количественным выходом) всех свободные аминогруп­ ментов (от 30 до 100 остатков). При этом желатель­
пы, после гидролиза пептида образуются 2,4- но было осуществить полное высокоспецифичное
динитрофенил-производные аминокислот, обладающие
яркой желтой окраской. Количественный анализ этих про­ расщепление по ограниченному числу связей. Этим
изводных осуществляют спектрофотометрическими ме­ требованиям отвечает расщепление цианогенброми-
тодами. С динитрофторбензолом реагируют также дом (CNBr), трипсином и о-иодозобензолом.
е-аминогруппа лизина, имидазольная группа гистидина, A. CNBr. Предварительно проводят модифика­
ОН-группа тирозина и SH-группа цистеина. Динитрофе-
нильные группы не отщепляются при кислотном гид­ цию остатков цистеина иодоуксусной кислотой. Да­
ролизе и используются для идентификации N -концевых лее с помощью CNBr специфически расщепляют
аминокислот в полипептидах. связи на СООН-стороне от остатков метионина,
Пептиды 39

но редкие связи типа Тгр-Х. Предварительной защи­


ты других остатков при этом не требуется.
Г. Гидроксиламин. Гидроксиламин ''расщепляет
сравнительно редко встречающиеся связи Asn-Gly,
но выход не является количественным.
Д. Протеаза из Staphylococcus aureus V8 расще­
пляет связи типа Glu-X, преимущественно в тех слу­
чаях, когда X — гидрофобный остаток. Связь Glu-
Lys не расщепляется. Эта реакция полезна также для
последующего расщепления CNBr-фрагментов.
Е. Мягкий кислотный гидролиз. Расщеплению
подвергаются редко встречающиеся связи Asp-Pro.
Двух-трех наборов фрагментов, обычно получае­
мых при расщеплении исходного полипептида по
остаткам Met, Тгр, Arg и по связям Asn-Gly, вместе
с субфрагментами, полученными при дополнитель­
ном расщеплении, обычно оказывается достаточно
для определения полной первичной структуры поли­
пептида. Если не возникает каких-либо непредвиден­
ных трудностей в очистке фрагментов, то при дол­
жной тщательности для всей процедуры необходимо
всего несколько микромолей полипептида.
Фрагменты очищают с помощью гель-
фильтрации в уксусной или муравьиной кислоте
(рис. 4.7), с помощью жидкостной хроматографии
с обращенной фазой при высоком давлении (рис. 4.8)
или ионообменной хроматографии на фосфоцеллю-
лозе или на сульфофенил-сефадексе.

Реагент Эдмана и реакция Эдмана


При автоматическом секвенировании вместо ре­
Рис. 4.10. Две соседние полилептидные цепи соединены ди­ агента Сентера применяют фенилизотиоцианат (реа­
сульфидной связью (затенена). Расщепление этой связи пу­
тем окисления надмуравьиной кислотой (слева) или путем гент Эдмана); в результате реакции происходит от­
восстановления ß-меркаптоэтанолом (справа) приводит щепление N-концевого остатка в виде его фенилтио-
к образованию двух пептидов, содержащих остатки цистеи­ гидантоинового производного (реакция Эдмана;
новой кислоты или цистеина соответственно. рис. 4.11).
Все реакции протекают в пленке раствора, кото­
рая покрывает стенки вращающейся цилиндриче­
в большинстве случаев с количественным выходом. ской камеры. Это облегчает экстракцию и последую­
Остатки метионина в полипептидах встречаются до­ щее удаление растворителей. Несколько фирм выпу­
статочно редко, поэтому в результате такого расще­ скают приборы, позволяющие проводить полно­
пления образуются пептидные фрагменты желаемо­ стью автоматизированное определение последовате­
го размера. льности полипептидов, содержащих до 30—40 остат­
Б. Трипсин. Трипсин расщепляет связи на СООН- ков (в некоторых случаях до 60 или даже до 80 остат­
стороне от остатков лизина и аргинина. Чтобы огра­ ков) за один прогон. В прибор заложена программа
ничить число мест разрыва, остатки лизина предва­ последовательного отщепления -по Эдману N-
рительно модифицируют цитраконовым ангидри­ концевых остатков полипептида. После отщепления,
дом (реакция носит обратимый характер); в резуль­ выделения и идентификации исходной N-концевой
тате положительный заряд остатков лизина заменяе­ аминокислоты (рис. 4.11) образуется эдмановское
тся на отрицательный. Модификация остатков арги­ производное следующей аминокислоты и т. д. Иден­
нина менее целесообразна, поскольку остатки лизи­ тификацию фенилтиогидантоиновых производных
на встречаются относительно чаще. Однако она бы­ производят с помощью жидкостной хроматографии
вает полезна для дальнейшего расщепления CNBr- под давлением. На таком приборе можно опреде­
фрагментов. лить последовательность значительно более длин­
В. о-Иодозобензол. Этот реагент специфически и ных участков, чем при секвенировании вручную,
с количественным выходом расщепляет сравнитель­ причем гораздо быстрее.
40 Г. шва 4

Пептид X Пептид Y

Пептид Z

4 -------------- V------------ '

С-концевой N -концевой

Взаимодействие пептида с фенилизо-


фрагмент фрагмент
тиоцианатом (реагентом Эдмана) пептида X пептида Y

Рис. 4.12. Используя пептид Z, последовательность кото­


рого перекрывается с последовательностями пептидов X
и Y, можно установить, что в исходном белке пептиды X
и Y располагаются в порядке X-»Y, но не Y->X.

АВТОМАТИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ПЕПТИДОВ


н R' О
Фенилтиогидантоиновая кислота С помощью классических химических методов
Н +. нитро- ^ Н ,о удалось синтезировать октапептиды вазопрессин
метан и окситоцин, а позднее— брадикинин, однако выхо­
ды конечного продукта были столь низкими, что
нельзя было надеяться на возможность синтеза бо­
лее длинных полипептидов или белков. Эту задачу
удалось решить методом автоматического твердо­
фазного синтеза, разработанным Меррифилдом.
Весь процесс проводится в одном сосуде, в который
автоматически по заданной программе, через опре­
деленные промежутки времени, добавляются реаген­
ты, удаляются продукты и т. д. Процесс состоит из
Фенилтиогидантоин и пептид, следующих этапов.
укороченный на один остаток
1. Аминокислота, которая будет находиться на
Рис. 4.11. Образование фенилтиогидантоина из аминоки­
С-конце полипептида, присоединяется к нераствори­
слоты (или N -концевого остатка полипептида). Фенилизо- мой частичке смолы.
тиоцианат реагирует с аминогруппами аминокислот или 2. Вводится вторая аминокислота с предварите­
пептидов с образованием фенилтиогидантоиновых про­ льно блокированной соответствующим реагентом
изводных. Последующая их обработка кислотой в раство­
рителях, не содержащих гидроксильных Трупп, приводит аминогруппой, и в присутствии дегидратирующего
к циклизации производных с образованием фенилтиоги- агента дициклогексилкарбодиимида образуется пеп­
дантоинов. Э та реакция, позволяющая идентифицировать тидная связь.
N -концевой остаток пептида, используется при автомати­ 3. Блокирующая группа отщепляется кислотой;
ческом секвенировании полипептидов.
при этом образуются газообразные продукты, кото­
рые удаляются.
4. Стадии 2 и 3 повторяются со следующей при­
соединяемой (второй) аминокислотой, далее с тре­
тьей, и так до тех пор, пока к частичке смолы не ока­
Установление полной первичной структуры жется присоединенным полностью синтезированный
путем сравнения последовательностей полипептид.
перекрывающихся пептидов 5. Полипептид отщепляется от частички смолы.
Последний шаг состоит в воссоздании последова­ Процесс протекает быстро и с прекрасным выхо­
тельности, в которой просеквенированные пептиды дом. На образование каждой пептидной связи затра­
располагались в исходном белке. Для этого необхо­ чивается около 3 ч. Этим методом за 8 сут была син­
димо иметь пептиды, полученные разными метода­ тезирована A-цепь инсулина (21 остаток) и за 11
ми в результате разрыва белковой цепи в различных сут— В-цепь (30 остатков). Наиболее выдающийся
местах (например, с использованием трипсина и хи- результат состоял в полном синтезе панкреатиче­
мотрипсина). Сопоставив последовательности полу­ ской рибонуклеазы (124 остатка; рис. 5.10) с общим
ченных пептидов, однозначно устанавливают пер­ выходом 18%; это был первый синтезированный
вичную структуру (рис. 4.12). фермент. Это достижение ознаменовало собой нача­
Пептиды 41

ло новой эры не только в области изучения структу­ Chromatographic and Electrophoretic Methods, 3rd ed.,
ры белка, но и в смежных областях, например в им­ Van Nostrand, 1975.
мунологии, в производстве вакцин, а также, возмо­ Jauregui-Adell J., M arti J. Acidic cleavage of the aspartyl-
жно, в медицине при лечении болезней, связанных proline bond and the limitations o f the reaction, Anal.
Biochem., 1975, 69, 468.
с врожденными нарушениями метаболизма. Ряд фи­
Mahoney W. C., Hermodson M. A. High-yield cleavage of tryp-
зиологически важных пептидов был синтезирован из tophanyl peptide bonds by o-iodosobenzoic acid, Bioche­
L-аминокислот с помощью методов, исключающих mistry, 1979, 18, 3810.
их рацемизацию; полученные продукты в полной ме­ Mahoney W .C ., Smith P .K ., Hermodson M .A . Fragmentation
ре обладали физиологической активностью. Приме­ o f proteins with o-iodosobenzoic acid: Chemical mecha­
рами служат октапептиды окситоцин и вазопрессин, nism and identification o f o-iodosobenzoic acid as a reacti­
адренокортикотропный гормон (АКТГ) и мелано- ve contam inant that modifies tyrosyl residues, Biochemi­
цитстимулирующий гормон (гл. 45). stry, 1981, 20, 443.
Marglin A.. Merrifield R. B. Chemical synthesis o f peptides and
proteins, Annu. Rev. Biochem., 1970, 39, 841.
ЛИТЕРАТУРА Needelman S .B . (ed.) Protein Sequence Determination, Sprin­
Cantor C .R .. Schimmel P .R . Biophysical Chemistry, Part I: ger-Verlag, 1970.
The Conformation o f Macromolecules, Freeman, 1980. Patthy L., Smith E. L. Reversible modification o f arginine res­
[Имеется перевод: Кантор Ч., Шиммел П. Биофизиче­ idues: Application to sequence studies by restriction of
ская химия.— М: Мир, 1984.] tryptic hydrolysis to lysine residues, J.Biol. Chem., 1975,
Chin С. С. О., Wold F. Separation o f peptides on phosphöcellu- 250, 557.
lose and other cellulose ion exchangers, Methods Enzymol, Pearson J. D. et al. Reversed-phase supports for the resolution
1977, 47, 204. o f large denatured protein fragments, J. Chromatogr.,
Cooper T.G . The Tools o f Biochemistry, Wiley, 1977. 1981, 207, 325.
Craig L. C., Cowburn D., Bleich H. Methods of the study of Regnier E. F., Gooding К. M. High performance liquid chroma­
small polypeptide hormones and antibiotics in solution, tography of proteins, Anal. Biochem., 1980, 103, 1.
Annu. Rev. Biochem., 1975, 44, 509. Snyder S. H., Innes R. B. Peptide neurotransmitters, Annu. Rev.
D ayhoff M . (ed.) Atlas o f Protein Sequence and Structure, Vol. Biochem., 1979, 48, 755.
5, National Biomedical Research Foundation, Washing­ Stewart J. M., Young J. D. Solid Phase Peptide Synthesis, Free­
ton, DC, 1972, Suppl. 1, 1973; Suppl. 2, 1976; Suppl. 3, man, 1969.
1979. Storm D. R., Rosenthal K. S., Swanson P. E. Polymyxin antibio­
Hash J. H. (ed.) Antibiotics. In: Methods in Enzymology, Vol. tics, Annu. Rev. Biochem., 1977, 46, 723.
43, Academic Press, 1975. Zweig G., Sherma J. Handbook o f Chromatography, 2 vols,
Heftman E. Chromatography: A Laboratory Handbook o f CRC Press, 1972.
Глава 5

Белки: структура и свойства


Виктор Родуэлл

ВВЕДЕНИЕ КЛАССИФИКАЦИЯ БЕЛКОВ


Все белки являются высокомолекулярными поли­ Удовлетворительной универсальной системы
пептидами. Условную границу между крупными по­ классификации белков не существует. Имеется лишь
липептидами и белками обычно проводят в области несколько общеупотребительных систем классифи­
мол. масс 8000— 10000. Простые белки содержат то­ кации, частично противоречащих одна другой.
лько аминокислоты, а сложные— еще и неаминоки­ С точки зрения ключевых Свойств белков все они
слотные компоненты: гем, производные витаминов, имеют ограниченную ценность. Однако эти системы
липидные или углеводные компоненты. В этой главе и соответствующая терминология используются
мы рассмотрим свойства простых белков. Уникаль­ в клинических лабораториях, поэтому имеет смысл
ные свойства специфических сложных белков, в том вкратце рассмотреть их. Мы обсудим главные осо­
числе гемопротеинов (гл. 6), гликопротеинов (гл. 54) бенности систем классификации белков, основанных
и липопротеинов (гл. 26), будут рассмотрены позд­ на растворимости, форме молекул, функциях, физи­
нее, как и свойства простых белков с уникальной ческих свойствах и трехмерной структуре.
структурой, таких, как коллаген и сократительные
белки (гл. 56), Растворимость
Классификация белков, основанная на их раство­
римости, была введена в 1907— 1908 гг. и используе­
тся до сих пор, особенно в клинической биохимии
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ (табл. 5.1). Строго установленных границ между
Белки играют центральную роль в процессах жи­
знедеятельности клеток (примером служат фермен­ Таблица 5.1. Классификация белков, основанная на их ра­
створимости
ты) и в формировании клеточных структур. Анализ
содержания в крови определенных белков и фермен­ Альбумины Растворимы в воде и солевых раство­
тов широко используется в диагностических целях. рах. Не имеют особенностей в
В частности, при заболеваниях печени диагностиче­ смысле содержания отдельных
ское обследование непременно включает электрофо­ аминокислот
ретическое определение относительного содержания Г лобулины Слаборастворимы в воде, но хорошо
альбуминов и глобулинов в плазме крови. Анализ растворимы в солевых раство­
содержания в плазме липопротеинов и иммуногло­ рах. Не имеют особенностей в
смысле содержания отдельных
булинов с помощью электрофореза и других мето­
аминокислот
дов обычно используется при диагностике специфи­ Проламины Растворимы в 70—80%-ном этаноле,
ческих типов гиперлипопротеинемии и иммунных но нерастворимы в воде и в абсо­
нарушений. Моча человека в норме не содержит бел­ лютном этаноле. Богаты аргини­
ков; поэтому обнаружение в моче даже небольших ном
количеств белка (протеинурия) с помощью соответ­ Г И С ТО Н Ы Растворимы в солевых растворах
ствующих лабораторных анализов служит важным Склеропротеины Нерастворимы в воде и солевых ра­
показателем заболевания почек, в частности различ­ створах. Повышено содержание
ных форм нефритов. Gly, Ala, Pro
Белки: структура и свойства 43

классами не существует. Например, четкое разграни­ чия в пределах семейств сходных белков. Например,
чение между альбуминами и глобулинами невозмо­ широко используются две и обсуждается третья си­
жно, если исходить только из их растворимости в во­ стема номенклатуры липопротеинов плазмы. В пер­
де и солевых растворах. Поэтому глобулины подраз­ вой системе липопротеины классифицируют в соот­
деляют на псевдоглобулины, легко растворимые ветствии с их поведением в электрическом или грави­
в воде, и эуглобулины, нерастворимые в воде, сво­ тационном поле; так, на основе электрофоретиче­
бодной от солей. ской подвижности при pH 8,6 различают «старто­
вые» а,-, а 2-, ß- и у-липопротеины. Вторая система
Форма молекул классификации липопротеинов основана на их плот­
ности в гидратированном состоянии; в этом случае
Если исходить из отношения осей (продольной различают хиломикроны, ЛПОНП, ЛПНП, ЛПВП
и поперечной), можно выделить два больших класса и ЛПОВП (гл. 26). Возможен и третий тип классифи­
белков. У глобулярных белков отношение составляет кации, основанный на первичной структуре апобел-
менее 10 и в большинстве случаев не превышает 3— ков. В этой системе различают шесть классов липо­
4. Они характеризуются компактной укладкой поли- протеинов плазмы, характеризующихся присут­
пептидных цепей. Примерами служат инсулин, аль­ ствием апобелков А, В, С, D, Е и F соответственно.
бумины и глобулины плазмы, многие ферменты. Фи­ Апобелки можно различать, используя иммунологи­
бриллярные белки, у которых отношение осей превы­ ческие критерии.
шает 10, состоят из пучков полипептидных цепей,
спирально навитых друг на друга и связанных между
Трехмерная структура
собой поперечными ковалентными или водородны­
ми связями. Примерами служат кератин, миозин, Белки можно разграничивать и на основании то­
коллаген и фибрин. го, имеют ли они четвертичную структуру (см. ни­
же). Кроме того, ценной основой для классификации
Функции белков служит структурное сходство ряда белков,
выявляемое главным образом с помощью рентге­
Белки можно классифицировать в соответствии новской кристаллографии. Например, белки, связы­
с их биологическими функциями; например, можно вающие нуклеотиды, обычно характеризуются при­
подразделить белки на структурные, каталитические сутствием в их третичной структуре «нуклеотидсвя-
и транспортные (табл. 5.2). В свою очередь катали­ зывающего домена» и, возможно, являются эволю-
тические белки (ферменты), которые включают ционно родственными белками.
большинство различных типов белков, можно под­
разделить в соответствии с типом катализируемой
ими реакции (гл. 7). СВЯЗИ, ОТВЕТСТВЕННЫЕ ЗА
ФОРМИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ БЕЛКА
Первичная структура белков формируется в резу­
Физические свойства
льтате соединения L-a-аминокислот пептидными
Для ряда белков, представляющих медицинский связями. Об этом свидетельствует множество раз­
интерес, существуют специализированные системы личных данных, однако наиболее убедительным до­
классификации, позволяющие устанавливать разли- казательством стал химический синтез инсулина
и рибонуклеазы, осуществленный путем последова­
Таблица 5.2. Основные функции белков
тельного соединения аминокислот пептидными
Функция Белки связями.
Структура большинства белков стабилизируется
Каталитическая Ферменты двумя классами прочных связей (пептидных и дису-
Сократительная Актин, миозин льфидных) и тремя классами слабых связей (водо­
Регуляция работы Гистоны, негистоновые ядерные бел-
генов ки
родных, гидрофобных и электростатических, т. е. со­
Г ормональная Инсулин левых).
Защитная Фибрин, иммуноглобулины, интерфе­
рон Ж есткость пептидной связи
Регуляторная Кальмодулин
Структурная Коллаген, эластин, кератины В структурных формулах пептидов связь между
Транспортная Альбумины (переносят билирубин, карбонильной группой и атомом a-азота изображае­
жирные кислоты и т. д.), гемогло­ тся как одинарная, однако на самом деле эта связь
бин (кислород), липопротеины между атомами углерода и азота носит характер ча­
(различные липиды), трансфер- стично двойной связи (рис. 5.1). Свободное вращение
рин (железо)
вокруг нее невозможно, и все четыре атома на рис.
44 Глава 5

эти остатки. Эта связь остается стабильной в тех


условиях, при которых белок обычно денатурирует.
Обработка белка надмуравьиной кислотой (оки­
I I сляющей связи S—S) или ß-меркаптоэтанолом (вос­
Н н станавливающим связи S—S с регенерацией двух
остатков цистеина) приводит к разделению полипеп-
Рис. 5.1. Резонансная стабилизация пептидной связи при­ тидных цепей, связанных дисульфидными связями;
дает ей характер частично двойной связи; этим объясняется их первичная структура при этом не затрагивается
жесткость связи С—N.
(см. рис. 4.10).
5.1 лежат в одной плоскости (компланарны). Враще­
ние же вокруг остальных связей полипептидного Стабилизация полипептидов межцепочечными
остова, наоборот, достаточно свободно. Это поло­ и внутрицепочечными водородными связями
жение иллюстрирует рис. 5.2, где связи, вокруг кото­ Водородные связи образуются 1) между группа­
рых возможно свободное вращение, охвачены кру­ ми, входящими в состав боковых цепей и способны­
глыми стрелками, а группы компланарных атомов ми к формированию водородных связей; 2) между
затенены. Эта полужесткость ведет к важным по­ атомами азота и кислорода, принадлежащими пеп­
следствиям, сказывающимся на более высоких уров­ тидным группам остова; 3) между полярными остат­
нях структурной организации белка. ками, расположенными на поверхности молекулы
белка, и молекулами воды. Все они играют важную
Межцепочечные и внутрицепочечные поперечные роль в стабилизации вторичной, третичной и т.д.
дисульфидные связи структур белка (см. разд. «а-Спираль» и «Складча­
тый ß-слой»).
Дисульфидная связь образуется между двумя
остатками цистеина и «сшивает» два участка поли­
пептидной цепи (или цепей), которым принадлежат

Гидрофобные взаимодействия
Неполярные боковые цепи нейтральных амино­
кислот в белках имеют тенденцию к ассоциации.
Стехиометрические соотношения при этом не со­
блюдаются, так что никаких связей в обычном смы­
сле не возникает. Тем не менее эти взаимодействия
играют важную роль в поддержании структуры бел­
ка.

Электростатические связи
Эти солевые связи возникают между разноимен­
но заряженными группами, входящими в состав бо­
Рис. 5.2. Параметры полностью вытянутой полипептидной
ковых цепей аминокислот. Например, е-
цепи. Четыре атома, расположенные в затененных обла­ аминогруппа лизина при физиологических pH несет
стях, компланарны и образуют пептидную связь. В незате­ заряд + 1, а карбоксильная группа аспартата или
ненных областях находятся атом а-углерода, атом а- глутамата в составе боковой цепи несет заряд - 1.
водорода и a-R -группа соответствующей аминокислоты. Следователльно, эти группы могут электростатиче­
Вокруг связей, соединяющих а-углерод с а-азотом и а-
карбонилом, возможно свободное вращение (показано ски взаимодействовать, стабилизируя структуру
стрелками). Таким образом, вытянутая полипептидная белка.
цепь — это полужесткая структура, в которой две трети
атомов остова- (если рассматривать атомы по группам,
образующим пептидную связь) занимают друг относитель­ Прочность связей
но друга фиксированное положение и находятся в одной
плоскости. Расстояние между соседними атомами а-угле­ В ходе денатурации белков (например, при обра­
рода 0,36 нм. Показаны также другие межатомные рас­ ботке мочевиной или додецилсульфатом натрия
стояния и валентные углы (они неэквивалентны). (С разре­ в присутствии избытка ионов Н + и ОН ) водород­
шения, из работы Pauling L., Corey R. В, Branson Н. R.: The
structure o f proteins. Two hydrogen-bonded helical configura­ ные и гидрофобные связи, а также связи электроста­
tions o f the polypeptide chain. Proc. Natl. Acad. Sei. USA тической природы разрушаются, а пептидные и ди­
.1951:37:205.) сульфидные сохраняются.
Белки: структура и свойства 45

УПОРЯДОЧЕННЫЕ КОНФОРМАЦИИ
ПОЛИПЕПТИДОВ

а-Спираль
Основополагающим моментом в нашем понима­
нии принципов организации белков послужило
выявление того факта, что полипептидные цепи мо­
гут находиться в высокоупорядоченной конформа­
ции, стабилизируемой водородными связями между
пептидными группами. Впоследствии существование
подобных высокоупорядоченных структур было
многократно подтверждено данными ретгенострук-
турного анализа кристаллов белков при высоком
разрешении, однако вначале концепция носила чисто
теоретический характер.
Согласно рентгенографическим данным, полу­ Рис. 5.4. Вид а-спирали сверху. R — боковые цепи, высту­
ченным в начале 1930-х гг., а-кератины волос и ше­ пающие из спирали. Вандерваальсовы радиусы атомов зна­
чительно больше, чем это представлено на рисунке, поэто­
рсти обладают продольной периодичностью 0,5— му внутри спирали почти не остается свободного простран­
ства. (Воспроизведено с небольшими изменениями из кни­
ги Stryer L. Biochemistry, 2nd ed.. Freeman, 1981. Имеется
перевод: Страйер Л. Биохимия. В 3-х т.— М: Мир, 1985.)

0,55 нм. Однако в вытянутой полипептидной цепи


расстояний, порождающих такую периодичность,
найти не удавалось (рис. 5.2). Это кажущееся проти­
воречие было устранено Полингом и Кори, предпо­
ложившими, что полипептидные цепи а-кератина
имеют форму а-спирали (рис. 5.3). В этой структуре
R-группы при а-углеродных атомах направлены от
оси спирали (рис. 5.4). На один виток спирали прихо­
дится 3,6 аминокислотных остатка, а шаг спирали
составляет 0,54 нм, что близко к периодичности
0,5—0,55 нм, наблюдаемой на дифракционных кар­
тинах. Смещение вдоль оси, приходящееся на один
остаток, равно 0,15 нм, что тоже согласуется с рент­
геновскими данными. Основные характеристики й-
спирали сводятся к следующему (рис. 5.5).
1. а-Спираль стабилизируется водородными
связями между атомом водорода, присоединенным
к атому азота пептидной группы, и карбонильным
кислородом остатка, отстоящего от данного вдоль
цепи на четыре позиции.
2. В образовании водородной связи участвуют
все пептидные группы. Это обеспечивает максималь­
ную стабильность а-спирали.
3. В образование водородных связей вовлечены
все атомы азота и кислорода пептидных групп, что
в значительной мере снижает гидрофильность а-
спиральных областей (и увеличивает их гидрофобно-
сть).
4. а-Спираль образуется самопроизвольно
и является наиболее устойчивой конформацией по­
липептидной цепи, отвечающей минимуму свобод­
ной энергии.
5. В цепи из L-аминокислот правая спираль,
Рис. 5.3. Расположение атомов остова пептидной цепи от­ обычно обнаруживаемая в белках, намного стабиль­
носительно оси а-спирали. нее левой.
46 Гш ва 5

Таблица 5.3. Влияние различных аминокислот на формиро­


вание а-спирали
Способствуют Дестабилизируют Препятствуют

Ala Arg Pro


Asn Asp Hyp
Cys Glu
Gin Gly
His Lys
Leu Ile
Met Ser
Phe Thr
Irp
Туг
Val

когда соседние полипептидные цепи складчатого ß-


слоя идут в противоположных направлениях (за по­
ложительное принимается направление от N- к С-
концу), структуру называют антипараллельным
складчатым ß-слоем (она изображена на рис. 5.6).
Когда соседние цепи идут в одном направлении,
структуру ß-слоя называют параллельной (на рисун­
ке не показана).
Области складчатой ß-структуры имеются во
многих белках, причем встречается и параллельная,
и антипараллельная форма. В формировании таких

Рис. 5.5. Структура а-спирали. а-Спиральная конформа­


ция во многом определяется характером R-групп и стаби­
лизируется водородными связями между атомами Н и
О (показаны пунктирными линиями). (Воспроизведено
с разрешения из книги Haggis G. Н. et al., Introduction to
Molecular Biology. Wiley. 1964.)

Некоторые аминокислоты препятствуют сверты­


ванию цепи в а-спираль, и в месте их расположения
непрерывность а-спирали нарушается. К ним отно­
сятся пролин (в нем атом азота служит частью жест­
кой кольцевой структуры, и вращение вокруг связи
N — Са становится невозможным), а также аминоки­
слоты с заряженными или объемными R-группами,
которые электростатически или механически препят­
ствуют формированию а-спирали (табл. 5.3).

Складчатый ß-слой
Полинг и Кори предложили и другую упорядо­
Рис. 5.6. Антипараллельный складчатый ß-слой. Направле­
ченную структуру— складчатый ß-слой (обозначе­ ние соседних цепей взаимно противоположно. Структуру
ние ß указывало, что предложенная ими структура стабилизируют водородные связи между NH- и СО-
является второй после а-спирали). В то время как группами соседних цепей. Боковые группы (R) располагаю­
в а-спирали полипептидная цепь находится в конден­ тся выше или ниже плоскости слоя. Черные кружки —
атомы углерода, серые — атомы азота, светлые — атомы
сированном состоянии, в складчатом ß-слое цепи водорода. (Из книги Stryer L. Biochemistry, 2nd cd.. Free­
почти полностью вытянуты (рис. 5.6). В тех случаях, man, 1981, с изменениями.)
Белки: структура и свойства 47

УРОВНИ СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ


БЕЛКА

Первичная структура
Под первичной структурой, уже знакомой нам из
главы о пептидах (гл. 4), понимается последователь­
ность аминокислот в полипептидной цепи (или це­
пях) и положение дисульфидных связей, если они
имеются.

Вторичная структура
На этом структурном уровне описываются стери-
ческие взаимосвязи между расположенными близко
друг к другу вдоль цепи аминокислотами. Вторич­
ная структура может быть регулярной (а-спираль,
Рис. 5.7. Схематическое изображение укладки цепи в моле­ складчатый ß-слой) или не обнаруживать никаких
куле бычьей .панкреатической рибонуклеазы — единой по­ признаков регулярности (неупорядоченная конфор­
следовательности из 124 остатков. Структура стабилизиро­ мация).
вана четырьмя поперечными дисульфидными связями.
Область а-спирали выделена овальным пунктирным конту­
ром, область складчатого слоя затенена. Другие части
структуры имеют нерегулярную конформацию. Локализа­ Третичная структура
цию активного центра (гл. 8) указывает ион Р 0 1_4. (Из ра­
боты K artha G ., Bello J., Harker D.: Tertiary structure o f ribo- Общее расположение, взаимную укладку различ­
nuclease. Nature 1967:213:862.) Этот белок удалось синтези­ ных областей, доменов и отдельных аминокислот­
ровать чисто химическим путем. ных остатков одиночной полипептидной цепи назы­
вают третичной структурой данного белка. Четкой
границы между вторичной и третичной структурами
структур могут участвовать от двух до пяти сосед­ провести нельзя, однако под третичной структурой
них полипептидных цепей. На рис. 5.7 представлен понимают стерические взаимосвязи между аминоки­
участок молекулы рибонуклеазы, в котором склад­ слотными остатками, далеко отстоящими друг от
чатая ß-структура образована тремя участками по- друга по цепи.
липептидной цепи. Во многих белках одновременно
имеются и а-спирали, и складчатая ß-структура (рис.
5.7). Четвертичная структура
В а-спирали стабилизирующие водородные связи
образуются между пептидными группами, отстоя­ Если белки состоят из двух и более полипептид­
щими одна от другой вдоль цепи на четыре остатка, ных цепей, связанных между собой нековалентными
а складчатая ß-структура формируется благодаря (не пептидными и не дисульфидными) связями, то го­
образованию водородных связей между пептидами, ворят, что они обладают четвертичной структурой.
удаленными по цепи намного дальше. Это обстояте­ Такие агрегаты стабилизируются водородными
льство также иллюстрирует рис. 5.7. связями и электростатическими взаимодействиями
между остатками, находящимися на поверхности по­
липептидных цепей. Подобные белки называют оли­
Неупорядоченная конформация (клубок)
гомерами, а составляющие их индивидуальные поли­
Те участки белковой молекулы, которые не отно­ пептидные цепи— протомерами, мономерами или
сятся к спиральным или складчатым структурам, субъединицами.
обычно называют неупорядоченными. Как показано Многие олигомерные белки содержат два или че­
на рис. 5.7, в такой конформации может находиться тыре протомера и называются димерами или тетра­
значительная часть белковой молекулы. Термин «не­ мерами соответственно. Довольно часто встречают­
упорядоченный» не вполне удачен: создается впечат­ ся олигомеры, содержащие более четырех протоме-
ление, что это указывает на меньшую биологиче­ ров, особенно среди регуляторных белков (пример—
скую значимость таких участков по сравнению с вы­ транскарбамоилаза). Олигомерные белки играют
сокоупорядоченными периодическими. В то же вре­ особую роль во внутриклеточной регуляции: их про­
мя с точки зрения биологической функции неупо­ томеры могут слегка менять взаимную ориентацию,
рядоченные, нерегулярные участки столь же важны, что приводит к изменению свойств олигомера. Наи­
как и а-спирали и складчатые ß-слои. более изученный пример— гемоглобин (гл. 16).
48 Глава 5

Роль первичной структуры в формировании


более высоких уровней структурной
организации белка
Вторичная и третичная структуры белка форми­
руются самопроизвольно и определяются первичной
структурой его полипептидной цепи. Параллельно
синтезу цепи происходят ее локальное свертывание
(образование вторичной структуры) и специфическая Рис! 5.8. Схематическое изображение денатурации прото­
мера.
агрегация свернутых участков (формирование тре­
тичной структуры). Эти процессы детерминируются рассматривать как разупорядочение конформации
химическими группами, отходящими от атомов а- полипептидной цепи без изменения первичной струк­
углерода соответствующих остатков. Например, туры. Если речь идет о протомере, то процесс можно
обработка мономерного фермента рибонуклеазы представить так, как это показано на рис. 5.8.
мягким восстанавливающим агентом (ß-меркап- При денатурации олигомерного белка происхо­
тоэтанолом) и денатурирующим агентом (мочеви­ дит диссоциация на протомеры, которая может со­
ной или гуанидином; см. ниже) приводит к инактива­ провождаться или не сопровождаться изменением
ции белка и переходу его в неупорядоченную кон­ их конформации.
формацию. Если медленно удалять денатурирую­ Большинство белков теряют биологическую ак­
щий агент и осуществлять постепенное реокисление, тивность в присутствии сильных минеральных ки­
то вновь образуются S— S-связи и практически вос­ слот или оснований, при нагревании и обработке
станавливается ферментативная активность. Нет ни­ ионными детергентами (амфифильными соедине­
каких оснований думать, что существует независимый ниями), хаотропными агентами (мочевиной, гуани­
генетический контроль за формированием уровней дином), тяжелыми металлами (Ag, Pb, Hg) или орга­
структурной организации белка выше первичного, по­ ническими растворителями. Денатурированные бел­
скольку первичная структура специфически опреде­ ки обычно менее растворимы в воде и часто из вод­
ляет и вторичную, и третичную, и четвертичную ного раствора выпадают в осадок. Это свойство ши­
структуру (если она имеется)— т.е. конформацию бел­ роко используется в клинической лаборатории. Про­
ка. Нативной конформацией белка, в частности ри­ бы крови или сыворотки, взятые для анализа на со­
бонуклеазы, по-видимому, является термодинамиче­ держание в них малых молекул (глюкозы, мочевой
ски наиболее устойчивая структура в данных усло­ кислоты, лекарственных препаратов), сначала обра­
виях, т.е. при данных гидрофильных и гидрофобных батывают трихлоруксусной, фосфовольфрамовой
свойствах среды. или фосфомолибденовой кислотой для осаждения
Структура белка после его синтеза может моди­ белка. Осадок удаляют центрифугированием, а сво­
фицироваться (посттрансляционный процессинг); бодную от белка надосадочную жидкость анализи­
так, часто наблюдается превращение препрофермен­ руют.
та в каталически активную форму или удаление «ли­ Чувствительность большинства ферментов к на­
дерной» последовательности, детерминирующей греванию, кислотам и протеазам позволяет провести
транспорт белков через мембраны (гл. 42). предварительное тестирование на ферментативный ха­
рактер реакции. Если клеточный экстракт обладает
каталитической активностью и теряет ее после кипя­
Макромолекулярные белковые комплексы чения, подкисления среды и последующей ее нейтра­
Полифункцион'альные макромолекулярные ком­ лизации или после обработки какой-либо протеазой,
плексы, образующиеся в результате агрегации раз­ то можно предположить, что катализатором служит
личных функциональных белков, каждый из которых фермент.
обладает всеми четырьмя уровнями структурной ор­ Часто на процесс денатурации оказывает влияние
ганизации, функционируют в цепи транспорта элек­ присутствие субстрата. Этот эффект объясняют кон-
тронов (гл. 12), участвуют в биосинтезе жирных ки­ формационными изменениями фермента, сопрово­
слот (гл. 23) и метаболизме пирувата (гл. 18). ждающими связывание субстрата. Новая конформа­
ция может быть более стабильна или менее стабиль­
ДЕНАТУРАЦИЯ на, чем исходная.

Сравнительно слабые связи, ответственные за


МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРВИЧНОЙ
стабилизацию вторичной, третичной и четвертичной
СТРУКТУРЫ
структуры белка, легко разрушаются, что приводит
к потере его биологической активности. Такое разру­ Сначала сложные белки освобождают от просте-
шение нативной структуры называют денатурацией. тических групп (например, от гема) и окисляют дису­
С физической точки зрения денатурацию можно льфидные группы; в результате образуются линей-
Белки: структура и свойства 49

Таблица 5.4. Модификация групп а-СООН и а -NH:. находя­ S -S


щихся в составе белков 11
20
А-цепь 1 Г лицин >21
а-СООН a-NH: 11
Амид N -формил N-ацетил N-метил

A la A la
A sp A sp A sp
G lu
G ly G ly G ly G ly
В-цепь { Ф енилаланин .30
H is 19
M et M et M et M et
Phe
Рис. 5.9. А- и В-цепи инсулина человека, соеди н и ные ди­
P ro
сульфидными связями.
Ser Ser
Thr Thr
Tyr
рый после синтеза подвергается протеолитическому
Val Val
процессингу, ведущему к образованию инсулина (гл.
11 С изменениями, из работы Uy R., Wold F.: Posttranslational 51).
covalent modification of proteins. S c ie n c e : 1977: 198: 890, с любезного Рибонуклеаза состоит из одиночной цепи длиной
разрешения авторов. 124 остатка, с Lys на N-конце и Val на С-конце. Во­
ные полипептиды (см. рис. 4.10). Методы секвениро- семь остатков цистеина соединены дисульфидными
вания этих полипептидов уже обсуждались в гл. 4. связями, так что в белке образуются четыре попереч­
Большинство белков содержит только те аминоки­ ные связи (рис. 5.10).
слоты, которые перечислены в табл. 3.3, однако в не­
которых белках встречаются производные этих ами­ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ВТОРИЧНОЙ И ТРЕТИЧНОЙ
нокислот (табл. 5.4 и 5.5). Методы идентификации СТРУКТУРЫ МЕТОДОМ РЕНТГЕНОВСКОЙ
производных аминокислот выходят за рамки данной КРИСТАЛЛОГРАФИИ
главы; отметим только, что их присутствие усло­
жняет определение первичной структуры. Ранее для выявления спиральных структур в бел­
ках широко использовались такие методы, как ди­
Первичная структура инсулина сперсия оптического вращения и тритиевый обмен
и рибонуклеазы лабильных протонов; в дальнейшем все эти методы
были вытеснены гораздо более мощным методом
Инсулин состоит из двух полипептидных цепей, рентгеновской кристаллографии. В этом случае не­
ковалентно связанных дисульфидными связями (рис. обходимо получить белок в кристаллическом виде.
5.9). В A-цепи на N-конце находится остаток Gly, Кроме того, нужно, как правило, иметь еще и кри­
а на С-конце— Asn; в В-цепи N- и С-концевыми сталл производного этого же белка, содержащего
остатками являются Phe и Ala соответственно. При ионы тяжелых металлов. Рентгеновские лучи, про-
окислении инсулина надмуравьиной кислотой дису­
льфидные связи между А- и В-цепями разрываются.
В ходе биосинтеза обе цепи вначале находятся в со­
ставе одной полипептидной цепи проипсулина, кото-
Таблица 5.5. Модифицируемые функциональные группы в
боковых цепях аминокислот в составе белков"

-O H —N (в боковой цепи) Л Ш -М а-С у » -Щ и > О Іу А ір ,- Гп>-іуг^Ш -Т>«Л ЬЫ Ш -ТІи.Л ір-Л ІгЭ аг£^
Те
fry ^ 1
—_________УН ^:
PO,H2 N-метил N-ди метил N-триметил ІЧ ^-1-у»*М р-А Ів-£и-Т *г-Т !іг-1.у-'Т уг-А Іа-С уа-л»»-Р по-'Т уг*1.у»*Э т7^

Hia - Va] - Т г о - l y t - C y i ^ r j Ь р -І у ^ П іИ а и м у Л і^
A rg A rg
H is
Lys Lys Lys
Ser Рис. 5.10. Структура бычьей рибонуклеазы. Последовате­
Thr льность аминокислотных остатков представлена в виде
T yr двумерной схемы: изображены дисульфидные связи.
Стрелки указывают направление пептидной цепи, начиная
11 С изменениями, из работы Uy R., Wold F.: Posttranslational с N -конца. (Из работы Smyth D. G., Stein W. Н., Moore S.:
covalent modification of proteins. S c ie n c e : 1977: 198: 890, с лю­ The sequence o f amino acid residues in bovine pancreatic ribo-
безного разрешения авторов. nuclease. Revisions and conformations. J. Biol. Chem.
1963:238:227, с любезного разрешения.)
50 Глава 5

ходя через кристалл, рассеиваются, причем распре­ Ультрацентрифугирование


деление интенсивности рассеяния зависит от распре­
Этот метод, разработанный Сведбергом, осно­
деления электронной плотности в кристалле. Распре­ ван на измерении скорости седиментации (осажде­
деление интенсивностей регистрируют с помощью ния) под дейст вием центробежных сил. которые со­
фотографической пленки и расчетным путем полу­ здается в ультрацентрифуге при ускорении порядка
чают карты электронной плотности. По этим кар­
там (в виде плоских сечений), наложенным друг на 105g.
друга, получают достаточно достоверную модель
рассматриваемого белка. Рентгеновская кристалло­ Центрифугирование в градиенте
графия является дорогостоящим методом, требует плотности сахарозы
больших затрат времени и солидного профессиона­
льного опыта, но в итоге она позволяет получить Набор белковых стандартов и исследуемый бе­
очень подробную и точную картину взаимной лок наслаивают поверх налитого в пластмассовую
ориентации всех аминокислот во многих белках. Ее пробирку раствора сахарозы, плотность которого
вклад в наши сегодняшние представления о структу­ изменяется так, что образуется градиент концентра­
ре белка трудно переоценить. ций от 5 до 20%; далее в течение ночи проводят цен­
трифугирование при 105g. После этого дно про­
бирки прокалывают иголкой, содержимое собирают
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ по каплям в небольшие пробирки, устанавливают
СТРУКТУРЫ относительное положение белков вдоль градиента
Определение четвертичной структуры олигомер­ плотности и проводят необходимые расчеты.
ных белков включает идентификацию протомеров
каждого типа, определение их взаимной ориентации Фильтрация через молекулярные сита
и изучение взаимодействий, стабилизирующих всю
структуру. Вначале проводят калибровку колонки с сефадек-
Для определения молекулярной массы олигоме­ сом или сходным наполнителем, используя набор
ра пригодны многие из применяемых для этой цели белков известной молекулярной массы. Затем оцени­
методов, лишь бы они не приводили к денатурации вают молекулярную массу неизвестного белка, срав­
олигомера. Если же предварительно провести дена­ нивая его подвижность с подвижностью стандартов.
турацию олигомера, то можно теми же методами Однако, если белок представляет собой высокоасим­
определить молекулярную массу протомера. метричную молекулу или же взаимодействует с на-

Таб.іица 5.6. Четвертичная структура некоторых ферментов

Фермент (олигомер) Ч и сл о М ол ек ул я р н ая
протомеров масса
проз омера
Аспартат-трансаминаза из сердца курицы (L-аспартат: 2-кетоглутарат ами 2 50000
нотрансфераза, КФ 2.6.1.1)
Синтаза жирных кислот из печени голубя 2 230000
Фруктозо-бисфосфатаза из печени кролика (D -фруктозо-І.б-бисфосфат- 2’1 29000
1-фосфогидролаза, КФ 3.1.3.11) ?> 37 000
Орнитинтрансаминаза из печени крысы (Ь-орнитин:2-кетокислота—амино- 4 ЗЗООО
трансфераза. КФ 2.6.1.13)
Пропионил-СоА-карбоксилаза из сердца свиньи (пропионил-СоА:СО лигаза 4 175000
[ADP], КФ 6.4.1 3)
Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) из сердца, печени или мышцы быка (L-лактат: 42, 35 000
NAD оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.27)
Митохондриальная АТРаза из сердца быка (АТР-фосфогидролаза, КФ 10 26000
3.6.1.3)
Глутаминсинтаза из E coli (L-глутамат: N H ' лигаза [ADP], КФ 6.3.1.2) 12 48 500
Ацетил-СоА-карбоксилаза из печени курицы (ацетил-СоА : СО.’ лигаза [ADP], 2 3' 4100000
КФ 6.4.1.2) ІО21 409000

11 Из обзора Klotz I. М ., Langerman N .R ., Darnall D. W .: Quaternary structure of enzymes . Amu. Rev. Biochcm. 1970:39:25.
!l Неидентичные субьсдиницы.
Белки: структура и свойства 51

полнителем (молекулярным ситом), могут возни­ рых формируется четвертичная структура ряда фер­
кать серьезные ошибки. ментов.

Электрофорез в полиакриламидном геле


Набор стандартных белков разделяют с помо­ ЛИТЕРАТУРА
щью электрофореза в гелях различной пористости Advances in Protein Chemistry, Academic Press, 1944- 1987.
с содержанием поперечных сшивок 5— 15%. Выяв­ (Ежегодник.)
ляют белок, окрашивая его кумасси синим или сере­ Aisen P.. Listowsky I. Iron transport and storage proteins, An-
бром, и определяют молекулярную массу, сравнивая nu. Rev. Biochem., 1980. 49, 357.
подвижность белка и стандарта. Особенно широкое Baldwin R. L. Intermediates in protein folding, Annu. Rev.
применение этот метод нашел при определении мо­ Biochem., 1975, 44,453.
лекулярной массы протомера; сначала осуществ­ Chou P. Y., Fassman G. D. Empirical predictions of protein
structure, Annu. Rev. Biochem., 1978, 47, 251.
ляют денатурацию олигомера (например, кипяче­
Croft L. R. Handbook of Amino Acid Sequences of Proteins,
нием в детергенте в присутствии ß-меркап- Joynson-Bruvvers Ltd. (Oxford, England), 1973.
тоэтанола), а затем проводят разделение в гелях, Gurd F .N ., Rothgeh T .M . Motions in proteins, Adv. Protein
содержащих ионный детергент — додецилсуль- Chem., 1979, 33, 74.
фат натрия. Haschemeyer R. H., deHarven E. Electron microscopy o f enzy­
mes, Annu. Rev. Biochem., 1974, 43, 279.
Lennarz W. J. (ed.) The Biochemistry o f Glycoproteins and Pro­
Электронная микроскопия teoglycans, Plenum Press, 1980.
С помощью электронного микроскопа можно по­ Lijas A., Rossman M .G. X-ray studies of protein interactions,
лучать изображения малых объектов при линейном Annu. Rev. Biochem., 1974, 43, 475.
Neurath H., Hill R .L . (ed.) The Proteins, 3rd ed., Academic
увеличении в 100000 раз. Это открывает возмож­ Press. 1975.
ность визуализации высокомолекулярных белков Osborne J. C. Jr., Brewer H. B. Jr. The plasma lipoproteins,
в составе вирусных частиц, ферментных комплексов, Adv. Protein Chem., 1977, 31, 253.
олигомерных белков. Smith L. C., Pownall H. J., Got to A. M. Jr. The plasma lipopro­
В табл. 5.6 приведены выборочные данные teins: Structure and metabolism, Annu. Rev. Biochem.,
о числе и молекулярной массе протомеров, из кото­ 1978, 47, 751.
Глава 6

Белки: миоглобин и гемоглобин


Виктор Родуэлл

ВВЕДЕНИЕ в особенности. Эти два сложных белка содержат


в качестве простетической группы гем— циклический
Белки, о которых здесь пойдет речь, имеют кар­
тетрапиррол, присутствием которого объясняется
динальное биологическое значение. Очень важно
и красный цвет этих белков, и их способность запа­
и то, что на их примере можно проследить взаимо­
сать кислород (миоглобин) и обеспечивать его
связь между структурой белков и их биологическими
транспорт (гемоглобин). Тетрапирролы состоят из
функциями.
четырех молекул пиррола (рис. 6.1), связанных четы­
рьмя а-метиленовыми мостиками с образованием
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ плоской кольцевой структуры. Что при этом обра­
Гемсодержащие белки участвуют в процессах зуется— гем или какое-то родственное соединение—
связывания и транспорта кислорода, в транспорте зависит от природы ß-заместителей в пиррольных
электронов и фотосинтезе. Детальное изучение гемо­ кольцах. Замещающими группами в геме являются
глобина и миоглобина выявляет ряд структурных метальная (М), винильная (V) и пропионатная (Рг)
аспектов, общих для многих белков. Говоря о боль­ группы, расположенные в таком порядке: М, V, М,
шом биомедицинском значении этих белков, мы V, М, Рг, Рг, М (рис. 6.2). В центре плоского кольца
имеем в виду, что результаты, полученные при их ис­ находится один атом железа в ферро-состоянии
следовании, наглядно иллюстрируют структурно­ (Fe2+). Тетрапиррольные простетические группы
функциональные взаимосвязи. Кроме того, эти ис­ и связанные с ними ионы металлов содержат и дру­
следования выявляют молекулярную основу ряда ге­ гие белки: цитохромы (Fe2+ и Fe3+), некоторые фер­
нетических болезней, таких, как серповидноклеточ­ менты, например каталаза, триптофанпирролаза,
ная анемия (возникающая в результате изменения и хлорофиллсодержащие белки (Mg2+). В цитохро-
свойств поверхности ß-субъединицы гемоглобина) мах происходит попеременное окисление и восста­
или талассемия (хроническое наследуемое гемолити­ новление атома железа, играющее определяющую
ческое заболевание, характеризующееся нарушения­ роль в их функционировании (транспорт электронов;
ми процессов синтеза гемоглобина). Летальный см. гл. 12). Напротив, в миоглобине и гемоглобине
эффект цианида и окиси углерода объясняется тем, окисление Fe2+ приводит к потере их биологической
что эти вещества блокируют физиологическую функ­ активности.
цию гемопротеинов— цитохромоксидазы и гемо­
глобина соответственно. Наконец, стабилизация чет­
вертичной структуры дезоксигемоглобина 2,3-
бисфосфоглицератом (ДФГ) занимает центральное
место в исследовании механизмов кислородной не­
достаточности в условиях высокогорья и процессов ß ß
адаптации к этим условиям.

ГЕМ ОПРОТЕИНЫ — МИОГЛОБИН • Он


И ГЕМОГЛОБИН
Рис. 6.1. Пиррол. Атомы а-углерода соединены метилено­
На примере миоглобина и гемоглобина очень выми мостиками с образованием тетрапиррола. При ато­
четко прослеживается связь между структурой мах ß-углерода находятся заместители, характерные для
и функцией белков вообще и глобулярных белков того или иного тетрапиррола, в частности гема.
Белки: миоглобин и гемоглобин 53

руются внутрь глобулы. Если не считать двух остат­


ков гистидина, принимающих участие в связывании
кислорода, то внутренние области миоглобина содер­
жат только неполярные остатки (например, Leu, Val,
Phe, Met).

Вторичная и третичная структура


миоглобина
Как показывает рентгеноструктурный анализ,
миоглобин представляет собой компактную, при­
мерно сферическую молекулу размером
4,5 ж 3,5 ж 2,5 нм (рис. 6.3). Примерно 75% остатков
образуют восемь правых а-спиралей, содержащих от
7 до 20 остатков. Начиная с N-конца, спирали обо­
значают буквами от А до Н. Участки, соединяющие
спирали, обозначают двумя буквами, указывающи­
ми соответствующие спирали. Индивидуальным
остаткам присваивают букву, указывающую спи­
раль, в которой они находятся, и порядковый номер,
отсчитываемый от N-конца спирали. Например, His
Рис. 6.2. Гем. Пиррольные кольца и атомы углерода, уча­
ствующие в образовании метиленовых мостиков, находя­ F8 — восьмой остаток в спирали F, им является ги­
тся в одной плоскости; почти не выходит из этой плоскости стидин. Остатки, далеко отстоящие друг от друга
и атом железа (Fe2+). Пятое и шестое координационные по­ вдоль цепи (например, принадлежащие разным спи­
ложения находятся выше и ниже плоскости гемового коль­ ралям), могут быть пространственно сближены; на­
ца на линии, перпендикулярной плоскости. Обратите вни­
мание на природу заместителей при ß-атомах углерода пример, довольно близко находятся остатки гисти­
пиррольных колец: полярная часть гема в молекуле мио­ дина F8 (проксимальный) и Е7 (дистальный) (рис.
глобина обращена в сторрну ее поверхности (на рисунке — 6.3).
слева внизу). Ряд данных свидетельствует о том, что в раство­
ре вторичная и третичная структуры миоглобина

МИОГЛОБИН

Биологическая функция миоглобина


Миоглобин содержится в красных мышцах и уча­
ствует в запасании кислорода. В условиях кислород­
ного голодания (например, при сильной физической
нагрузке) кислород высвобождается из комплекса
с миоглобином и поступает в митохондрии мышеч­
ных клеток, где осуществляется синтез АТР (окисли­
тельное фосфорилирование; см. гл. 13).

Первичная структура и распределение


аминокислот
Миоглобин состоит из единичной полипептидной
цепи с мол. массой 17000; никаких особенностей
в характере составляющих его 153 аминокислотных
остатков не обнаруживается. При анализе же их про­
странственного распределения четко выявляется од­
на особенность: на поверхности молекулы находятся
полярные остатки, а внутри структуры— неполярные;
это свойство характерно для глобулярных белков. Рис. 6.3. Модель молекулы миоглобина. Контуры — это
Остатки, содержащие одновременно и полярные, очертания, наблюдаемые при низком разрешении. Изобра­
жены в основном только атомы а-углерода и гем. (Из ста­
и неполярные группы (например, Thr, Тгр и Туг), тьи Dickerson R. Е. In: The Proteins, 2nd ed., Vol. 2. Neurath
расположены так, что неполярные группы ориенти­ H. (editor). Academic Press, 1964, с любезного разрешения.)
54 Глава 6

близки к структуре кристаллического миоглобина. Проксимальный


His (F8)
В обоих случаях наблюдаются практически идентич­
ные спектры поглощения; кристаллический миогло-
бин связывает кислород; содержание а-спиралей
в растворе, оцениваемое по дисперсии оптического
вращения и круговому дихроизму, сходно с данны­
ми, полученными методом рентгеноструктурного
анализа.

Влияние гема на конформацию миоглобина


При понижении pH до 3,5 образуется апомиогло-
бин (миоглобин, не содержащий гема), и содержание
а-спиралей резко падает, а последующее добавление
мочевины к апомиоглобину при нейтральном pH
приводит к почти полному их исчезновению. После­
дующее удаление мочевины диализом и добавле­
ние гема полностью восстанавливает число а-
спиралей, а добавление Fe2+ приводит к полному
восстановлению биологической (кислородсвязываю- N
щей) активности. Таким образом, информация, со­
держащаяся в первичной структуре апомиоглобина,
в присутствии гема однозначно детерминирует свер­
тывание молекулы белка с образованием нативной,
биологически активной конформации. Это важное Дистальный
His (Е7)
положение распространяется и на другие белки: пер­
вичная структура белка определяет его вторичную Рис. 6.4. Положение молекулы кислорода в геме после ок-
и третичную структуру. сигснирования. Изображены также имидазольные кольца
двух важных остатков гистидина в глобиновой цепи, кото­
рые располагаются рядом с атомом железа. (Из работы
Пространственная ориентация атома железа, Harper Н. А. et al., Physiolögische Chemie. Springer-Verlag,
проксимального и дистального остатков 1975, с любезного разрешения.)
гистидина в молекуле миоглобина
Гем в молекуле миоглобина расположен в щели плоскости кольца; в результате эта область белко­
между спиралями Е и F; его полярные пропионатные вой глобулы принимает новую конформацию.
группы ориентированы к поверхности глобулы,
а остальная часть находится внутри структуры
Лиганды
и окружена неполярными остатками, за исключе­
нием His F8 и His F7. Пятое координационное поло­ Связь, образующаяся между атомом кислорода
жение атома железа занято атомом азота гетероци­ и атомом Fe2+, при оксигенировании миоглобина
клического кольца проксимального гистидина His F8 направлена перпендикулярно плоскости кольца ге­
(рис. 6.4). Дистальный гистидин (His Е7) расположен ма. Второй атом кислорода удален от дистального
по другую сторону гемового кольца, почти напротив гистидина, и связь между атомами кислорода обра­
His F8, но шестое координационное положение ато­ зует относительно плоскости гема угол 121° (рис.
ма железа His Е7 остается свободным (рис. 6.4). 6.5).

Расположение атома железа


0
В неоксигенированном миоглобине атом железа ^ 0 III
на 0,03 нм выступает из плоскости кольца в направ­ о * С
лении His F8. В оксигенированном миоглобине атом 1 1
кислорода занимает шестое координационное поло­ Fe ШШШШ Fe
жение атома железа, а сам атом железа выступает из
плоскости гема только на 0,01 нм. Таким образом,
оксигенирование миоглобина сопровождается сме­
Рис. 6.5. Предпочтительные ориентации молекул кислоро­
щением атома железа и, следовательно, His F8 и ко­ да и окиси углерода, связанных с атомом железа изолиро­
валентно связанных с ним остатков в направлении ванного гема (темные полоски).
Белки: миоглобин и гемоглобин 55

• Окись углерода (СО) связывается с изолирован­


ным гемом примерно в 25 000 раз более прочно, чем
кислород. Поскольку атмосферный воздух содержит
следы СО и еще небольшое количество СО образуе­
тся в ходе нормального.катаболизма гема, возни­
кает вопрос: почему же шестое координационное по­
ложение железа в миоглобине занято не СО, а моле­
кулой 0 2? Связано это со стерическими ограничения­
ми, возникающими в миоглобине. Молекула СО,
связываясь с гемом, стремится принять такую
ориентацию, при которой все три атома (Fe, С, О)
находятся вдоль линии, перпендикулярной плоско­
сти кольца гема (рис. 6.6). Для изолированного гема
такая ориентация вполне возможна, но в миоглоби­
не связыванию СО в такой ориентации стерически пре­
пятствует дистальный гистидин (рис. 6.6). Поэтому Рис. 6.7. Кривая насыщения миоглобина кислородом.
СО связывается в менее благоприятной конфигура­
ции, что понижает прочность связи СО с гемом бо­ Р0 в ткани, окружающей легочные капилляры, со­
лее чем на два порядка, так что она становится всего ставляет 100 мм рт. ст., поэтому миоглобин в легких
лишь в 200 раз прочнее, чем связь гем— 0 2. Тем не мог бы весьма эффективно насыщаться кислородом.
менее небольшая часть молекул миоглобина (около В венозной крови Р0 равно 40 мм рт. ст., а в активно
1%) в нормальных условиях связывает СО. работающей мышце— около 20 мм рт. ст. Но даже
при парциальном давлении 20 мм рт. ст. степень на­
Кинетика оксигенирования миоглобина сыщения миоглобина кислородом будет весьма зна­
чительной, и поэтому миоглобин не может служить
Почему миоглобин неспособен транспортиро­ средством его доставки от легких к периферическим
вать кислород, но зато эффективно его запасает? Ко­ тканям. Однако при кислородном голодании, кото­
личество кислорода, связывающегося с миоглоби- рым сопровождается тяжелая физическая работа, Р0
ном («процент насыщения»), зависит от концентра­ в мышечной ткани может понизиться и до 5 мм рт.
ции кислорода в среде, непосредственно окружаю­ ст.; при столь низком давлении миоглобин легко от­
щей молекулу белка (эту концентрацию выражают дает связанный кислород, обеспечивая тем самым
как Р0 — парциальное давление кислорода). Зависи­ окислительный синтез АТР в митохондриях мышеч­
мость ‘ между количеством связанного кислорода ных клеток.
и Р0 можно представить графически в виде кривой
насыщения миоглобина кислородом (кривой диссо­
циации кислорода). Для миоглобина изотерма ад­ ГЕМОГЛОБИНЫ
сорбции кислорода имеет форму гиперболы (рис. 6.7).
Биологическая функция гемоглобинов
Гемоглобины— структурно-родственные белки,
находящиеся в эритроцитах позвоночных. Они вы­
полняют две важные биологические функции:
1) переносят 0 2 из легких к периферическим тканям;
2) переносят СО, и протоны от периферических тка­
ней к дыхательным органам для последующего вы­
ведения из организма. Сравнительная биохимия
гемоглобинов чрезвычайно интересна сама по себе,
однако мы здесь сосредоточим внимание только
на гемоглобинах человека.

Первичная структура гемоглобина А


В отличие от миоглобина, который не имеет чет­
вертичной структуры, гемоглобины представляют
Рис. 6. 6. Ориентация молекул кислорода и окиси углерода, собой тетрамерные белки, молекулы которых обра­
связанных с атомом железа гема в составе миоглобина. Д и­
стальный гистидин Е7 препятствует связыванию СО
зованы различными типами полипептидных цепей
в предпочтительной для этой молекулы ориентации— под (они обозначаются а, ß, у, 5, S и т. д.). В состав моле­
углом 90° к плоскости гемового кольца. кулы входят по две цепи двух разных типов. Длина
56 Г. шва 6

а- и ß-цепей примерно одинакова— a -цепь содержит 100


1 - 1 -------------
141 остаток, а ß-цепь— 146; однако а- и ß- 90 Миоглобин
полипептиды гемоглобина А (НЬА) кодируются раз­ 80 Оксигенированная <ровь,_
ПОСТ упающая из лег ких
ными генами и имеют разную первичную структуру.
* 70
В то же время первичная структура ß-, у- и 6-цепей І 60 7
гемоглобина человека в значительной степени кон­
сервативна. § 50
Іu
C
x
40
30
/ Дезо кс игенир □ванная кровь,
возвраідающаічея из т каней
-

-
Вторичная и третичная структура гемоглобина А 20
Несмотря на различия в длине цепи и аминоки­ 10 _ Геме глобин
i
слотной последовательности миоглобина и ß- 0 l_ L _ i ___ i___ ___ і _ ___1___

полипептида НЬА, они имеют почти идентичную 0 20 40 60 80 100 120 140


вторичную и третичную структуру. Это поразитель­ Давление газообразного кислорода, мм рт. ст.
ное сходство, которое распространяется на располо­
жение гема и восьми спиральных участков, частично Рис. 6.8. Кривые связывания кислорода гемоглобином
обусловлено тем, что в эквивалентных положениях и миоглобином. Парциальное давление кислорода в арте­
первичной структуры миоглобина и ß-субъединицы риальной крови составляет около 100 мм рт. ст., в венозной
НЬА находятся хотя и различающиеся, но сходные крови около 40 мм рт. ст., в капиллярах кровеносных со­
судов активной мыш цы— около 20 мм рт. ст.; минималь­
по своим свойствам аминокислоты. а-Полипептид ное давление, необходимое для функционирования фермен­
также весьма сходен с миоглобином, хотя в нем со­ тов цитохромной системы, равно ~ 5 мм рт. ст. Из рисунка
держится семь, а не восемь спиралей. Как и в мио- видно, что ассоциация цепей с образованием теграмерной
структуры приводит к существенному повышению эффек­
глобине, гидрофобные остатки у него размещаются тивности снабжения тканей кислородом по сравнению
внутри структуры, а гидрофильные (опять-таки за с мономерными белками. (Изолированные цепи гемогло­
исключением двух остатков гистидина)— на поверх­ бина обладают примерно таким же сродством к кислороду,
ности; это в одинаковой мере свойственно и а-, что и миоглобин, и характеризуются аналогичной гипербо­
лической кривой насыщения.) (Из работы Stanbury J. В.,
и ß-субъединицам. Wyngaardcn J.B ., Fredrickson D. S. (editors): The Metabolic
Basis o f Inherited Diseases. 4th ed. McGraw-Hill, 1978, с изме­
нениями.)
Четвертичная структура гемоглобина А
Свойства индивидуальных гемоглобинов нераз­
рывно связаны с их четвертичной, равно как и вто­ вать 0 2 зависит от того, содержатся ли в данном те­
ричной и третичной, структурами. Наиболее распро­ трамере другие молекулы 0 2. Если да, то последую­
страненные гемоглобины имеют следующую тетра- щие молекулы 0 2 присоединяются легче. Следова­
мерную структуру: НЬА (нормальный гемоглобин тельно, для гемоглобина характерна кинетика коо­
взрослого человека)— ot2ß2; HbF (фетальный гемо­ перативного связывания, благодаря которой он
глобин)— а2у2; HbS (гемоглобин при серповидно­ связывает максимальное количество 0 2 в легких
клеточной анемии)— a2S2; НЬА2 (минорный гемо­ и отдает максимальное количество 0 2 при тех PQ,
глобин взрослого человека)— а262. Четвертичная которые имеют место в периферических тканях.
структура наделяет гемоглобин дополнительными Сравните, например, какие количества кислорода
важными особенностями (отсутствующими у мио­ связываются гемоглобином и миоглобином в лег­
глобина), которые способствуют выполнению гемо­ ких, при Р0 = 100 мм рт. ст., и какие в тканях, при
глобином его уникальной биологической функции Р0 = 20 мм рт. ст. (рис. 6.8).
и обеспечивают возможность строгой регуляции его Сродство гемоглобинов к 0 2 характеризуется ве­
свойств. Гемоглобин обладает аллостерическими личиной P jo— значением Р 0 , при котором наблюдае­
свойствами (от треч. аллос— другой, стерос— тся полунасыщение гемоглобина кислородом. Значе­
место, пространство), и на его примере можно луч­ ние Рх у разных организмов существенно различае­
ше понять свойства других аллостерических белков. тся, но во всех случаях оно превышает значение Р0 в
периферических тканях рассматриваемого организ­
ма. Это хорошо иллюстрирует фетальный гемогло­
Кинетика оксигенирования гемоглобина
бин человека (HBF). Для НЬА Рх = 26 мм. рт. ст.,
Гемоглобин связывает четыре молекулы кисло­ а для HBF Рзд = 20 мм рт. ст. Благодаря этой разни­
рода на тетрамер (по одной на гем в каждой субъе­ це гемоглобин F отбирает кислород у НЬА, находя­
динице); особенно важным отличием его от миогло­ щегося в плацентарной крови. Однако после рож­
бина является характерная кривая насыщения кисло­ дения ребенка HBF утрачивает свою функцию; обла­
родом, которая имеет сигмоидную форму (рис. 6.8). дая более высоким сродством к 0 2, он высвобожда­
Таким образом, способность гемоглобина связы- ет меньшее его количество в тканях.
Белки: миоглобин и гемоглобин 57

Оксигенирование сопровождается
значительными конфирмационными
изменениями в гемоглобине
Связывание О, сопровождается разрывом соле­
вых связей, образованных концевыми карбоксиль­
ными группами субъединиц (рис. 6.9). Это облегчает
связывание следующих молекул 0 2, поскольку при
этом требуется разрыв меньшего числа солевых
связей. Указанные изменения заметно влияют на
вторичную, третичную и особенно четвертичную
структуру гемоглобина. При этом одна a/ß-napa
субъединиц поворачивается относительно другой
a/ß-пары, что приводит к компактизации тетрамера Рис. 6.9. Солевые связи между субъединицами в дезоксиге­
и повышению сродства гемов к 0 2 (рис. 6.10 и 6.11). моглобине. При оксигенировании эти нековалентные связи,
Четвертичная структура частично оксигенирован­ обусловленные электростатическими взаимодействиями,
разрушаются. (Из книги Stryer L.: Biochemistry, 2nd ed..
ного гемоглобина описывается как Т-состояние (от Freeman, 1981, с изменениями.)
англ, taut — напряжение); полностью оксигенирован­
ному гемоглобину (Н Ь02) отвечает R-состояние {re­
laxed— релаксированное) (рис. 6.12). Термины R- гистидин (F8), а также связанные с ним соседние
и Т-состояния используют для характеристики чет­ остатки.
вертичной структуры аллостерических ферментов;
меньшим сродством к субстрату обладает Т- Транспорт двуокиси углерода
состояние.
Гемоглобин не только переносит кислород от
легких к периферическим тканям, но и ускоряет
Конформационные изменения в окружении
гемогруппы транспорт С 02 от тканей к легким. Гемоглобин
связывает С 0 2 сразу после высвобождения кислоро­
Оксигенирование гемоглобина, как и миоглоби- да; примерно 15% С 0 2, присутствующего в крови,
на, сопровождается структурными изменениями переносится молекулами гемоглобина. Находя­
в окружении гемогруппы. При оксигенировании щаяся в эритроцитах карбоангидраза катализирует
атом железа, который в дезоксигемоглобине высту­ превращение поступающего из тканей С 0 2 в уголь­
пал на 0,06 нм из плоскости гемового кольца, втяги­ ную кислоту (рис. 6.14). Угольная кислота быстро
вается в эту плоскость (рис. 6.13). Вслед за атомом диссоциирует на бикарбонат-ион и протон, причем
железа ближе к гему перемещается и проксимальный равновесие сдвинуто в сторону диссоциации. Для

Т-форма R -форма

Рис. 6.10. Переход гемоглобина из Т- в R-форму сопровождается поворотом одной пары жестко связанных субъединиц
(a 2/ß2) на 15 относительно другой такой же пары (a,/ß,). Ось вращения эксцентрична, т. е. одновременно происходит сдвиг
димера (a 2/ß2) ближе к оси тетрамера. На этом рисунке показан поворот и смещение затененной а 2,ф2-пары относительно
незатененной а,/р,-пары (последняя считается неподвижной)
Гистидин F 8
F -спираль
02-Субмдиимца 9 \ СН
нг /
N
Стерическое t
отталкивание I
Плоскость
» 1-Субъединица <5> .порфири-
нового
кольца
+о,
F - спираль
\
С —N
// \\
НС^ СН
Nr

Рис. 6.11. Изменения, происходящие в области a ,,ß 2-KOH- Рис. 6.13. При оксигенировании диаметр координационной
такта при оксигенировании. Контакт как бы «переска- сферы атома железа становится меньше, и он втягивается
кивает» с одного зубца на другой, с заменой одной водо- в плоскость гема. Вместе с атомом железа смещается ги-
родной связи на другую. Остальные связи образованы не- стидин F 8. (Из книги Stryer L: Biochemistry, 2nd ed., Free-
полярными остатками. (Из работы Perutz М. F.: Molecular man, 1981, с некоторыми изменениями.)
pathology of human hemoglobin. Stereochemical interpretation
o f abnormal oxygen affinities. Nature 1971:232:408, с любезно­
го разрешения.)

T - форма

R -форма

Рис. 6.12. Вероятность перехода из Т-формы в R-форму повышается по мере последовательного оксигенирования каждой
из четырех гемогрупп. В представленной здесь модели солевые мостики (прямые линии), связывающие субъединицы в Т-
форме. разрушаются по мере присоединения кислорода, и даже те солевые мостики, которые остаются неразрушенными,
постепенно ослабляются (волнистые линии). Переход из Т- в R-состояние не связан однозначно с присоединением опреде­
ленного числа молекул кислорода, однако при связывании каждой новой молекулы кислорода вероятность этого перехода
повышается. На переход между двумя состояниями оказывают влияние протоны, двуокись углерода, хлорид и ДФГ. Чем
выше их концентрация, тем большее число молекул кислорода должно связаться, чтобы оказался возможным переход.
Полностью оксигенированные молекулы в Т-состоянии и полностью дезоксигенированные в R-состоянии не показаны —
они слишком неустойчивы, чтобы присутствовать в заметном количестве. (Из работы Perutz М. F.: Hemoglobin structure
and respiratory transport. Sci. Am. [Dec.] 1978:239:92, с изменениями.)
Белки: миоглобин и гемоглобин 59

со 2+ н2о т ■—- н 2со 3 ве кооперативных эффектов. У миоглобина эффект


Карбоангидраза Угольная Бора не обнаруживается.
кислота

* HCOJ + н +
Молекулярная основа эффекта Бора
Самопроизвольно
Протоны, ответственные за эффект Бора, высво­
Рис. 6.14. Образование угольной кислоты в ходе реакции, бождаются в результате разрушения солевых мости­
катализируемой карбоангидразой эритроцитов, и ее диссо­ ков, которым сопровождается связывание кислоро­
циация на бикарбонат-ион и протон.
да с Т-структурой; они отсоединяются от атомов
предотвращения опасного повышения кислотности азота остатков гистидина (146) в ß-цепях. Эти прото­
крови должна существовать буферная система, спо­ ны сдвигают равновесие в сторону образования
собная поглощать избыток протонов. Гемоглобин угольной кислоты, которая расщепляется карбо­
связывает два протона на каждые четыре освободив­ ангидразой с образованием СО; (рис. 6.15).
шиеся молекулы кислорода и определяет буферную Наоборот, при высвобождении кислорода вновь
емкость крови (рис. 6.15). В легких идет обратный формируется Т-структура с присущими ей солевыми
процесс: присоединение кислорода к дезоксигемогло­ мостиками, при образовании которых происходит
бину сопровождается высвобождением протонов, ко­ присоединение протонов к остаткам гистидина в ß-
торые связываются с бикарбонат-ионами, переводя цепях. Таким образом, в периферических тканях про­
их в угольную кислоту. Далее эффективно действую­ тоны благоприятствуют образованию солевых мо­
щая карбоангидраза катализирует превращение стиков путем протонирования (по атому азота) кон­
угольной кислоты в углекислый газ, выдыхаемый цевых остатков гистидина в ß-субъединицах. Обра­
из легких. Таким образом, связывание кислорода тесно зование солевых мостиков форсирует освобождение
сопряжено с выдыханием С 02. Это обратимое явле­ кислорода из оксигенированной R-формы гемогло­
ние известно как эффект Бора. Эффект Бора является бина. Итак, повышение концентрации протонов спо­
свойством тетрамерного гемоглобина и определяе­ собствует освобождению кислорода, а повышение кон­
тся гем-гемовым взаимодействием, лежащим в осно- центрации кислорода стимулирует высвобождение
протонов. Первый из этих эффектов проявляется
Удаляется вместе с
в сдвиге кривой диссоциации кислорода вправо при
выдыхаемым воздухом повышении концентрации ионов водорода (прото­
нов).
2С0, + 2Н,0
(I I Карбоан Регуляция 2,3-бисфосфоглицератом
|| I гидраза
2Н,СО,
Недостаток кислорода в периферических тканях
приводит к накоплению 2,3-бисфосфоглицерата (ди-
фосфоглицерата, ДФГ) (рис. 6.16). Это соединение
образуется из 1,3-бисфосфоглицерата. промежуточ­
ного продукта гликолиза. Тетрамер гемоглобина
связывает одну молекулу ДФГ, которая размеща­
ется в центральной полости, выстланной остатками
всех четырех субъединиц. Объем этой полости доста­
точен для размещения ДФГ только в том случае,
когда молекула гемоглобина находится в Т-форме
и образуется достаточно широкий просвет между Н-
Образуется в
цикле Кребса 0
Рис. Ъ.15. Эффект Бора. Двуокись углерода, образовав­
шаяся в периферических тканях, реагирует с водой, образуя
угольную кислоту, которая диссоциирует на бикарбонат- 0^ \
ион и протон. Дезоксигенированный гемоглобин выпол­
няет роль буфера — он связывает протоны и поставляет их
в легкие. В легких связывание гемоглобином кислорода со­ о-
провождается высвобождением протонов из гемоглобина.
Протоны соединяются с бикарбонат-ионом, образуя уголь­
ную кислоту, которая при участии карбоангидразы превра­
V
- о " ' \\
щается в двуокись углерода и воду. Двуокись углерода о
(углекислый газ) удаляется из легких с выдыхаемым возду­
хом. Рис. 6.16. Структура 2.3-бисфосфоглицерага.
60 Глава 6

спиралями ß-цепей. Связывание ДФГ осуществля­ Мутантные гемоглобины человека


ется путем образования солевых мостиков между
Мутации генов, кодирующих а- и ß-цепи, могут
атомами кислорода ДФГ и группами, принадлежа­
существенным образом сказываться на их биологи­
щими обеим ß-цепям: концевыми аминогруппами ческой функции. Известно несколько сот мутантных
остатков ValNAl, аминогруппами остатков LysEF6 гемоглобинов человека (в большинстве случаев
и боковыми группами остатков His Н21 (рис. 6.17).
функционально активных), и о некоторых из них, от­
Таким образом, ДФГ стабилизирует дезоксигениро­
личающихся сильным изменением биологических
ванную Т-форму гемоглобина, образуя поперечные
функций, речь пойдет ниже. Патологическое состоя­
связи между ß-цепями— дополнительные солевые
ние, при котором мутация вызывает изменение био­
мостики, которые должны быть разрушены при
логической функции темоглобина, называют гемо­
переходе гемоглобина из Т- в R-форму.
глобинопатией.
С фетальным гемоглобином ДФГ связывается ме­ В семействе гемоглобинов М остатки проксималь­
нее прочно, чем с гемоглобином взрослого человека,
ного или дистального гистидина в а- или ß-
поскольку в его ß-цепи в положении Н21 находится
субъединицах заменены на остатки тирозина. Атом
не His, а Ser, который не может участвовать в фор­
железа в составе гема находится в этом случае
мировании солевых мостиков, удерживающих ДФГ
в Fe3+-состоянии, что обусловлено образованием
в центральной полости. -Поэтому ДФГ в меньшей
прочного ионного комплекса с фенолятным анио­
степени способствуют стабилизации Т-формы феталь­
ном тирозина. Результатом такой аномалии явля­
ного гемоглобина и последний обладает более высо­
ется метгемоглобинемия, поскольку ферри-гем не
ким сродством к кислороду по сравнению с гемогло­
способен связывать 0 2. В a-цепи гемоглобина
бином взрослого человека. М R — Т-равновесие сдвинуто в сторону образова­
Пусковым механизмом перехода между R- и Т-
ния Т-формы. Сродство к кислороду низкое, эффект
формами гемоглобина служит перемещение атома
Бора отсутствует. В ß-цепях гемоглобинов М может
железа в плоскость порфиринового кольца или от нее.
происходить переход между R- и Т-состояниями и,
Источником свободной энергии для этих процессов
следовательно, наблюдается эффект Бора.
(около 3000 кал/моль) служат стерические и электро­
Мутации, приводящие к преимущественному
статические факторы. Таким образом, совсем небо­
образованию R-формы (в качестве примера можно
льшое смещение атома Fe2+ относительно порфири­
привести гемоглобин Чезапик), отличаются тем, что
нового кольца вызывает значительные изменения
соответствующие гемоглобины обладают повышен­
конформации гемоглобина и решающим образом ным сродством к кислороду. Подобные гемоглобины
воздействует на его ответную реакцию на сигнал, по­
не способны поставлять достаточное количество ки­
ступающий из внешней среды.
слорода периферическим тканям. Возникает ткане­
вая гипоксия, ведущая к развитию полицитемии (по­
вышению концентрации эритроцитов).

Гемоглобин при серповидноклеточной


анемии
В гемоглобине S остаток Glu A2(6)ß замещен на
Val. Остаток А2 (Glu или Val) располагается на по­
верхности молекулы гемоглобина и контактирует
с водой, и замещение полярного остатка Glu на не­
полярный Val приводит к появлению на поверхности
ß-субъединицы «липкого участка». Этот липкий уча­
сток присутствует как в оксигенированном, так и
в дезоксигенированном гемоглобине S (в гемоглоби­
не А он отсутствует). На поверхности дезоксигениро-
ванного гемоглобина существует комплементарный
участок, способный прочно связываться с липким
участком ß-субъединицы, тогда как в оксигенирован­
ном гемоглобине этот участок маскируется другими
группами (рис. 6.18). Когда гемоглобин S переходит
Рис. 6.17. Механизм связывания ДФ Г с дезоксигемоглоби- в дезоксигенированное состояние, его липкий уча­
ном человека. ДФ Г взаимодействует с тремя положитель­ сток связывается с комплементарным участком на
но заряженными группами в каждой из ß-цепей. (Из работы другой молекуле дезоксигенированного гемоглоби­
Am one A.: X-ray diffraction study of bonding o f 2,3-
diphosphoglycerate to human deoxyhemoglobin. Nature на. Происходит полимеризация дезоксигемоглобина
1972:237:146, с разрешения.) S и его осаждение в виде длинных волокон. Волокна
Белки: миоглобин и гемоглобин 61

Окси А Дезокси А Окси S Дезокси S

Дезокси А Дезокси S

Рис. 6.18. Схема, поясняющая взаимодействие липкого участка гемоглобина S (черный треугольник) с рецептором липко­
го участка (светлый треугольник) дезоксигемоглобина А и дезоксигемоглобина S. Наличие комплементарных участков на
поверхности молекулы дезоксигемоглобина S способствует его полимеризации с образованием волокнистых структур.
В присутствии дезоксигемоглобина А процесс полимеризации останавливается, поскольку на поверхности этой молекулы
липкого участка нет. (Из книги Stryer L.: Biochertiistry, 2nd ed., Freeman, 1981, с некоторыми изменениями.)

дезоксигемоглобина S механически деформируют


эритроцит, придавая ему серповидную форму, что
приводит к лизису клеток и множеству вторичных
клинических проявлений. Таким образом, если бы
можно было поддерживать гемоглобин S в оксигени­
рованном состоянии или по крайней мере свести
к минимуму концентрацию дезоксигенированного
гемоглобина S, то нам удалось бы предотвратить
полимеризацию дезоксигенированного гемоглобина
S и образование «серповидных» клеток. Ясно, что
полимеризации подвержена Т-форма гемоглобина S.
Интересно отметить (хотя в практическом плане это
мало существенно), что ферри-ион метгемоглобина
А остается в плоскости порфиринового кольца и тем
самым стабилизирует R-форму гемоглобина. То же
относится и к гемоглобину при серповидноклеточ­
ной анемии: гемоглобин S в ферри-состоянии (метге-
моглобин S) не подвержен полимеризации, посколь­
ку он стабилизирован в R-форме.
В дезоксигемоглобине А тоже имеется рецептор­
ный участок, способный взаимодействовать с лип­
ким участком оксигенированного или дезоксигени­
рованного гемоглобина S (рис. 6.18), но присоедине­
ния «липкого» гемоглобина S к дезоксигемоглобину
А недостаточно для образования полимера, поско­
льку сам дезоксигемоглобин А липкого участка не
содержит и не может связать следующую молекулу
гемоглобина. Следовательно, связывание дезоксиге­
моглобина А с R- или Т-формой гемоглобина S преры­
вает полимеризацию.
В результате полимеризации дезоксигемоглобина
S образуются спиральные фибриллярные структуры.
При этом каждая молекула гемоглобина контакти­
рует с четырьмя соседними молекулами (рис. 6.19). Рис. 6Л9. Предполагаемая спиральная структура волокна
из агрегированных молекул дезоксигемоглобина S. (Из ра­
Образование подобных трубчатых волокон ответ­ боты Maugh Т. II: A new understanding o f sickle cell emerges.
ственно за механические нарушения в содержащем Science 1981:211:265, с разрешения.)
62 Глава б

Рис. 6.20. Электронные микрофотографии нормального (А) и серповидного (Б) эритроцитов. Изменения в молекуле ß-
глобина, приводящие к такому изменению формы клетки, вызваны мутацией единственного основания в ДН К (А вместо
Т), в результате чего в цепи ß-глобина происходи! замена глутамата на валин (гл. 36).

их эритроците: он приобретает серповидную форму ЛИТЕРАТУРА


(рис. 6.20), становится подверженным лизису в мо­
Dean J.. Schechter А. N. Sickle-cell anemia: Molecular and cel­
мент прохождения им щелей в синусоидах селезенки.
lular basis o f therapeutic approaches. (3 parts). N. Engl. J.
Med.. 1978. 299. 752, 804, 863.
Талассемии Klotz I.M .. Haney D .N ., King L.C . Rational approaches to
chemotherapy: Antisickling agents. Science, 1981,213, 724.
Другая важная группа нарушений, связанных Perutz M. F. Hemoglogin structure and respiratory transport.
с аномалиями гемоглобина — талассемии. Для них Sei. Am. (Dec.). 1978, 239, 92.
характерна пониженная скорость синтеза а-цепей Perutz M. F. The regulation of oxygen-affinity of hemoglobin:
гемоглобина (а-талассемия) или ß-цепей (ß-та- Influence of structure of globin on heme iron, Annu. Rev.
лассемия). Это приводит к анемии, которая может Biochem.. 1979, 48. 327.
принимать очень тяжелую форму. В последние годы Stamatoyannopöulos G. The molecular basis of hemoglobin di­
sease, Annu. Rev. Genet., 1972, 6, 47.
достигнут ощутимый прогресс в выяснении молеку­
Winslow R .M ., Anderson W.F. The hemoglobinopathies. Page
лярных механизмов, ответственных за развитие та­ 1666. In: The Metabolic Basis of Inherited Disease, 5th ed.,
лассемии (см. гл. 36). Stanbury J. B. et al. (eds.), McGraw-Hill, 1983.
Глава 7

Ферменты: общие свойства


Виктор Родуэлл

ВВЕДЕНИЕ ролизующие жиры (липос), —липазами; ферменты,


гидролизующие белки (протеины),— протеиназами.
Катализаторы — это вещества, ускоряющие хи­ Позднее ферментам, катализирующим сходные по
мические реакции; в ходе реакции они претерпевают типу реакции, стали давать название, указывающее
физические изменения, но по ее завершении возвра­ тип соответствующей реакции — дегидрогеназы, ок­
щаются в исходное состояние. Ферменты являются сидазы. декарбоксилазы, ацилазы и т. д. Многие из
белковыми катализаторами биохимических реакций, этих названий используются и теперь.
большая часть которых в отсутствие ферментов про­ Номенклатура, введенная Международным био­
текала бы крайне медленно. В отличие от небелко­ химическим союзом (IUB), на первый взгляд кажется
вых катализаторов (Н +, ОН ', ионы металлов) каж­ сложной и громоздкой, но зато она является одно­
дый фермент способен катализировать лишь очень значной. Главный ее принцип состоит в том, что
небольшое число реакций, часто только одну. Таким ферменты называют и классифицируют в соответ­
образом, ферменты представляют собой реакционно­ ствии с типом катализируемой химической реакции
специфические катализаторы. Практически все биохи­ и ее механизмом; это существенно облегчает систе­
мические реакции катализируются ферментами. матизацию данных, относящихся к различным
аспектам метаболизма. Основные черты системы,
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ введенной IUB, состоят в следующем.
1. Реакции и ферменты, которые их катализи­
Ферменты совершенно необходимы для суще­ руют, подразделяются на шесть классов, в каждом из
ствования жизни на Земле. Поэтому неудивительно, которых имеется несколько подклассов (от четырех
что мы встречаемся с ними во многих областях био­ до 13).
медицинских наук. Многие болезни (врожденные на­ 2. Название фермента состоит из двух частей: пер­
рушения метаболизма) определяются генетически вая часть — название субстрата (или субстратов);
обусловленными нарушениями в синтезе ферментов. вторая указывает тип катализируемой реакции и
При повреждении клеток (вызванном, например, не­ оканчивается на -аза.
достатком кровоснабжения или воспалением) неко­ 3. Дополнительная информация, если она необ­
торые ферменты попадают в плазму крови. Измере­ ходима для уточнения, заключается в скобки.
ние активности таких ферментов обычно исполь­ Например, фермент, катализирующий реакцию
зуется для диагностики многих распространенных L-малат + NAD+ = Пируват + СО, + NADH + Н
заболеваний (например, инфаркта миокарда). Диаг­ имеет номер 1. 1. 1.37 и называется L-малат: N A D f
ностическая энзимология является областью меди­ оксидоредуктаза (декарбоксилирующая).
цины, использующей ферменты для диагностики 4. Каждый фермент имеет кодовый номер по клас­
и контроля за результатами лечения. Ферменты при­ сификации ферментов (КФ); первая цифра характери­
меняются и в терапии. зует класс реакции, вторая —подкласс и третья —
КЛАССИФИКАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ подподкласс. Четвертая цифра указывает порядко­
И НОМЕНКЛАТУРА вый номер фермента в его подподклассе. Таким
образом, КФ 2.7.1.1 означает, что фермент относит­
Первоначально ферментам давали названия, ся к классу 2 (трансфераза), подклассу 7 (перенос
образуемые путем добавления окончания -аза к на­ фосфата) и подподклассу 1 (акцептором фосфата
званию субстрата, на который данный фермент дей­ является спирт). Последняя цифра обозначает фер­
ствует. Так, ферменты, гидролизующие крахмал мент гексокиназу, или АТР; D-гексозо-б-фос-
(амилон), были названы амилазами; ферменты, гид­ фотрансферазу, т. е. фермент, катализирующий
64 Глава 7

перенос фосфата с АТР на гидроксильную груп­ 3.1.1.8. Ацилхолин— ацилгидролаза [псевдохо­


пу атома углерода в шестом положении глюкозы. линэстераза]
Ниже представлены все шесть классов ферментов Ацилхолин + Н20 = Холин + Кислота.
и некоторые конкретные примеры. В скобках указа­
но рекомендуемое название. 3.2. Ферменты, действующие на гликозильные со­
единения. Например:
3.2.1.23. ß-D-Галактозид— галактогидролаза [ß-
1. Оксидоредуктазы.Ферменты, катализирующие галактозидаза]
окислительно-восстановительные реакции с уча­
стием двух субстратов, S и S': ß-D-Г алактозид + Н20 = Спирт + D-Г алактоза.
S
^»осст 4-
» ° окисл — ‘S-'окиси 4- S' восст*
1 u
3.4. Ферменты, действующие на пептидные связи.
Классификация (с подразделением на 11 подклассов)
Катализируют реакции, в которых участвуют такие учитывает различия между пептидазами и протеаза­
группы, как СН—ОН, СН—СН, С = О, СН— ми, выделяет ферменты, гидролизующие дипептиды
NH2 и —СН—NH—. Некоторые подклассы: или более крупные пептиды, отщепляющие одну или
1.1. Ферменты, действующие на группу СН— большее число аминокислот, атакующие связь на С-
ОН (донор электронов). Например: или N-конце. Протеиназы в соответствии с механиз­
1.1.1.1. Алкоголь: NAD+оксидоредуктаза [алко- мом катализа подразделяются на сериновые, тиоло-
гольдегидрогеназа] вые и металлозависимые. Например:
Спирт + NAD+ = Альдегид или кетон + 3.4.21. Сериновые протеиназы. Например: химо-
NADH + Н +. трипсин, трипсин, плазмин, факторы свертывания
крови ІХа и ХІа.
1.4. Ферменты, действующие на группу СН—NH,
3.4.23. Карбоксильные (кислые) протеиназы. На­
(донор электронов). Например:
пример: пепсины А, В и С.
1.4.1.3. L-Глутамат: NAD(P)+ оксидоредуктаза
(дезаминирующая) [глутаматдегидрогеназа из пече­ 4. Лиазы. Ферменты, отщепляющие группы от
ни животных]. Запись NAD(P)+ означает, что акцеп­ субстратов по негидролитическому механизму,
тором электронов может служить либо NAD+, либо с образованием двойных связей.
NADP+.
X Y
L-Г лутамат + Н20 + NAD(P)+ =
= а-Кетоглутарат + N H +4 + NAD(P)H + Н +. I I
С—С = X—Y + С = С
2. Трансферазы. Ферменты, катализирующие Ферменты, действующие на связи С—С, С—О, С—
перенос группы G (отличной от атома водорода) N, С—S и С — галоид. Некоторые подгруппы:
с субстрата S на субстрат S': 4.1.2. Альдегид-лиазы. Например:
4.1.2.7. Кетозо-1-фосфат-альдолаза [альдолаза]
S—G + S' = S'—G + S. •
Кетозо-1-фосфат = Дигидроксиацетонфосфат +
Катализируют перенос одноуглеродных групп, аль­ Альдегид.
дегидных или кетонных остатков, а также ацильных,
алкильных, гликозильных групп и групп, содержа­ 4.2. Углерод— кислород лиазы. Например:
щих фосфор и серу. Некоторые подклассы: 4.2.1.2. L-малат— гидро-лиаза [фумараза]
2.3. Ацилтрансферазы. Например: L-малат = Фумарат + Н20 .
2.3.1.6. Ацетил-СоА:холин О-ацетилтрансфераза
[холин-ацетилтрансфераза] 5. Изомеразы. В этот класс включены все фер­
Ацетил-СоА + Холин = СоА + О-Ацетилхолин. менты, катализирующие взаимопревращения опти­
ческих, геометрических и позиционных изомеров.
2.7. Ферменты, катализирующие перенос группы, Некоторые подклассы:
содержащей фосфор. Например: 5.2. Ц и с -гп р а н с -и зо т ле р я зы . Например:
2.7.1.1. АТР: D-гексоза 6-фосфотрансфераза [гек- 5.2.1.3. все-трянс-Ретиналь 11-цис-транс-изоме-
сокиназа] раза [ретинальизомераза]
АТР + D-Гексоза = ADP + D-Гексозо-б-фосфат. все-транс- Ретиналь = 11-і/ис-Ретиналь.
3. Гидролазы. Ферменты, катализирующие гид­ 5.3. Ферменты, катализирующие взаимопревраще­
ролиз эфирных, сложноэфирных, пептидных и глико­ ние альдоз и кетоз. Например:
зильных связей, кислотных ангидридов, связей С— 5.3.1.1. D-Гл ицерал ьдегид-3-фосфаткетол-изо-
С, С-галоида и Р—N. Например: мераза [триозофосфатизомераза]
3.1. Ферменты, действующие на сложноэфирные D-Глицеральдегид-З-фосфат = Дигидроксиаце­
связи. Например: тонфосфат.
Ферменты: общие свойства 65

6. Лигазы, (от лат. лигаре— связывать). Фермен­ ОН


I он
ты, катализирующие соединение двух молекул, со­ СН О” С сг
пряженное с разрывом пирофосфатной связи АТР
или подобного соединения. В этот класс включены
ферменты, катализирующие реакции, в ходе кото­
рых образуются связи С—О, С—S, С—N и С—С. Не­
которые подклассы:
6.3. Ферменты, катализирующие образование
связей С—N. Например:
6.3.1.2. L-Глутаматіаммиак лигаза (ADP) [глу-
таминсинтетаза] Рис. 7.1. Пример окислительно-восстановительной реак­
АТР + L-Глутамат + NH^ = ADP + ции, в которой NAD* выступает в роли косубстрата.
Ортофосфат + L-Глутамин.
6.4. Ферменты, катализирующие образование страт в двух сочетанных реакциях и как переносчик
связей С—С. Например: аминогруппы между различными а-амино- и <х-
6.4.1.2. Ацетил-СоА:С02 лигаза (ADP) [ацетил- кетокислотами.
Со А — карбоксилаза] Вторая причина, по которой кофермент можно
считать равноправным участником реакции, заклю­
АТР + Ацетил-СоА + С 0 2 = ADP + Р, + чается в том, что именно его участие может иметь
Малонил-СоА. фундаментальное физиологическое значение. Напри­
мер, работа мышцы в анаэробных условиях сопро­
вождается превращением пирувата в лактат. Но
в этом случае важны совсем не лактат и не пируват:
КОФЕРМЕНТЫ предназначением реакции является превращение
NADH в NAD+. В отсутствие NAD+ гликолиз про­
Многие ферменты оказывают каталитическое должаться не может и анаэробный синтез АТР (а
действие на субстраты только в присутствии специ­ следовательно, и работа мышцы) прекращается.
фического термостабильного низкомолекулярного Восстановление пирувата до лактата в анаэробных
органического соединения— кофермента. В таких условиях обеспечивает окисление NADH в NAD+,
случаях холофермент (каталитически активный ком­ необходимый для синтеза АТР. Функцию образова­
плекс) состоит из апофермента (белковая часть) ния N A D + могут выполнять и другие реакции. Зна­
и связанного с ним кофермента. Кофермент может чение этого процесса становится очевидным, если
быть связан с апоферментом ковалентными или не­ перейти от животных к другим формам жизни.
ковалентными связями. Термин «простетическая У бактерий и дрожжей, растущих в анаэробных
группа» относится к ковалентно связанному кофер­ условиях, вещества, образующиеся из пирувата, слу­
менту. К числу реакций, требующих присутствия ко- жат окислителями для NADH, при этом сами они
ферментов, относятся окислительно-восстано­ восстанавливаются (табл. 7.1).
вительные реакции, реакции переноса групп и изоме­
ризации, а также реакции конденсации (по системе
IUВ это классы 1, 2, 5 и 6). Реакции расщепления, на­
пример гидролитические реакции, катализируемые
пищеварительными ферментами, протекают в от­ Таблица 7.1. Системы анаэробной регенерации NAD-
сутствие кофермента (по системе IUB это классы 3
и 4). Окислитель Восстановленный Организмы, ткани
продукт
Коферменты как вторые субстраты Пируват Лактат Мышцы, гомо­
ферментатив­
Кофермент можно рассматривать как второй
ные молочно­
субстрат, или косубстрат, по двум причинам. Во- кислые бакте­
первых, в ходе реакции кофермент претерпевает хи­ рии
мические изменения, в точности противоположные из­ Ацетальдегид Этанол Дрожжи
менениям, которые происходят в субстрате. Напри­ Дигидроксиаце- а-Г лицсрофосфат E. coli
мер, в окислительно-восстановительных дегидроге- тонфосфат
назных реакциях молекула субстрата окисляется, Фруктоза Маннитол Гетерофермента-
а молекула кофермента восстанавливается (рис. 7.1). тивные мо-
Подобным же образом в реакциях переаминиро- лочнокисые
бактерии
вания пиридоксальфосфат выступает как второй суб-
3 1573
66 Глава 7

Роль коферментов как переносчиков групп в коферментах— производных витамина В6. Вита­
на промежуточных стадиях метаболизма мины группы В— ннкотинамид, тиамин, рибофлавин
и пантотеновая кислота— являются компонентами
Биохимические реакции переноса можно предста­
коферментов, участвующих в процессах биологиче­
вить в виде
ского окисления и восстановления, а коферментные
D—G -Ь А А—G -1- D. формы фолиевой кислоты и кобамида участвуют
Здесь функциональная группа G переносится от мо­ в переносе одноуглеродных фрагментов.
лекулы донора, D—G, на молекулу акцептора А. Ко- Структурным компонентом многих коферментов
фермент в этом случае может выступать либо как ко­ является адениновое кольцо, соединенное с D-
нечный акцептор (в реакциях отщепления водорода), рибозой и неорганическим фосфатом. Эти кофер­
либо как промежуточный переносчик (в реакциях менты можно рассматривать, следовательно, как
переаминирования). Эту вторую функцию можно производные аденозинмонофосфата (АМР) (см.
проиллюстрировать следующим образом: табл. 34.1). Структурные формулы NAD4 и NADP+
приведены на рис. 7.2.
D-GЛ - 'у - СоЕ A-G
D- * ^ 4s*'CoE-G А «ТРЕХТОЧЕЧНАЯ ФИКСАЦИЯ» СУБСТРАТОВ
На этой схеме показан только один комплекс (СоЕ— НА ФЕРМЕНТАХ
G), но может участвовать и несколько таких проме­
Большинство субстратов образует по меньшей
жуточных комплексов.
Если переносимой группой является атом водо­ мере три связи с ферментом. Благодаря такой «трех­
точечной фиксации» симметричная молекула может
рода, то обычно указывают лишь левую полуреак-
проявлять асимметрию. Чтобы это пояснить, пред­
цию:
ставим область фермента, связывающую субстрат,
СоЕ как участок плоской поверхности (хотя, как мы вско­
D СоЕ-Н ре увидим, субстратсвязывающая «площадка» фер­
мента редко бывает плоской, а возможно, и не бы­
Реакции переноса водорода, протекающие в жи­ вает совсем). На рис. 7.3 молекула субстрата пред­
вых клетках (табл. 7.1), идут по схеме ставлена в виде атома углерода с заместителями,
D-H А-Н три из которых взаимодействуют с тремя точками
на плоском участке поверхности фермента. Если мо­
D А
лекула субстрата может подойти к этому участку то­
лько с одной стороны и взаимодействовать могут
Можно предложить следующую классификацию
коферментов:
Коферменты, участвующие в переносе любых
групп, кроме атомов водорода:
Сахарофосфаты
CoASH
Т иаминпирофосфат
Пиридоксальфосфат
Фолиатные коферменты
Биотин
Кобамидные (В|2) коферменты
Липоевая кислота
Коферменты, участвующие в переносе атомов во­
дорода:
N A D \ NADP+
FMN, FAD
Липоевая кислота
Кофермент Q

Коферменты— производные
витаминов группы В и АМ Р
Витамины группы В входят как составная часть
во многие коферменты. Например, ферменты, уча­ Рис. 7.2. N A D (P)+; R = Н (в случае N A D +) или
ствующие в метаболизме аминокислот, нуждаются ~ 0 P 0 2_j( b случае N A D P+).
Ферменты: общие свойства 67

4 Оптическая специфичность ферментов


За исключением эпимераз (рацемаз), которые ка­
тализируют взаимопревращение оптических изоме­
ров, ферменты в общем случае проявляют асболют-
ную оптическую специфичность, по крайней мере но
отношению к одному из участков молекулы субстра­
та. Так, ферменты гликолитического и прямого оки­
слительного пути катализируют превращения толь­
ко D-, но не L-фосфосахаров. За единичными исклю­
Участок поверхности чениями (например, почечная оксидаза D-ами-
фермента
нокислот) большинство ферментов млекопитаю­
щих катализирует превращение только L-изомеров
аминокислот.
Рис. 7.3. «Трехточечная фиксация» субстрата на плоском Оптическая специфичность может относиться как
активном центре фермента. к фрагменту молекулы, так и к молекуле в целом.
Иллюстрацией служит специфичность гликозидаз.
только комплементарные структуры субстрата Эти ферменты катализируют гидролиз гликозидных
связей между сахаром и спиртовой группой: они вы­
и фермента (в реальных ферментах оба этих условия
соблюдаются), то молекула субстрата может связы­ сокоспецифичны как к сахарному фрагменту, так и
ваться с ферментом единственным способом, даже к характеру гликозидной связи (а или ß), но относи­
если группы 1 и 3 идентичны. Перебирая мысленно тельно неспецифичны к спиртовому фрагменту мо­
все возможные пространственные ориентации моле­ лекулы.
кулы субстрата, мы можем убедиться, что с тремя
точками плоской поверхности (с одной и той же сто­ Группоспецифичность ферментов
роны) молекула может связаться только в одной
ориентации. Отсюда следует, что группы 1 и 3, хотя Литические ферменты действуют на специфиче­
они и идентичны, при связывании с ферментом ста­ ские химические группировки: гликозидазы — на
новятся неэквивалентными из-за различия в их окру­ гликозидные связи, пепсин и трипсин — на пептид­
жении. Химические изменения будут происходить ные связи, эстеразы— на сложноэфирные связи. Дей­
только с группой 1, но не с группой 3 (или наоборот). ствие этих ферментов распространяется на большое
Обобщая эти рассуждения, мы можем объяснить число субстратов, что позволяет организму обой­
теперь, почему ферментативное восстановление оп­ тись небольшим числом пищеварительных фермен­
тически неактивного пирувата приводит к образова­ тов— иначе их потребовалось бы намного больше.
нию именно L-, а не D, L-лактата. Многие протеазы способны также катализировать
гидролиз сложных эфиров. Хотя способность про­
теаз гидролизовать сложноэфирные связи не имеет
СПЕЦИФИЧНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ физиологического значения, использование сло­
Способность фермента катализировать одну и то­ жноэфирных синтетических субстратов для изучения
лько одну специфическую реакцию является, пожалуй, механизма их действия оказалось весьма ценным.
наиболее важным его свойством. Благодаря этому Отдельные литические ферменты отличаются бо­
скорости специфических метаболических процессов лее высокой группоспецифичностью. Так, химотрип-
могут регулироваться путем изменения каталитиче­ син гидролизует преимущественно пептидные связи,
ской активности специфических ферментов. Правда, в которых карбоксильная группа принадлежит аро­
многие ферменты катализируют реакции одного ти­ матическим аминокислотам — фенилаланину, тиро­
па (перенос фосфата, окислительно-восстано­ зину или триптофану. Карбоксипептидазы и амино­
вительные реакции и т.д.), субстратами при этом пептидазы отщепляют аминокислоты по одной
является небольшое число структурно сходных со­ с карбоксильного или с амино-конца соответствен­
единений. Реакции с альтернативными субстратами но.
происходят в тех случаях, когда эти субстраты при­ Некоторые оксидоредуктазы способны использо­
сутствуют в высоких концентрациях. Протекают ли вать в качестве акцепторов электронов и NAD+, и
в живых организмах все реакции, возможные при NADP4, но большая их часть использует только
участии данного фермента, зависит от относитель­ один из них. Обобщая, можно сказать, что оксидоре­
ной концентрации альтернативных субстратов дуктазы млекопитающих, которые участвуют в'био­
в клетке и относительного сродства фермента к этим синтетических процессах (например, в синтезе жирных
субстратам. Ниже мы рассмотрим некоторые общие кислот или стероидов), обычно используют в качестве
аспекты специфичности ферментов. восстановителя NADPH, тогда как ферменты, уча-
з*
68 Глава 7

ствующие в процессах расщепления (гликолиз, окисле­


ние жирных кислот), в качестве окислителя исполь­
зуют преимущественно NAD+.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ
Ферменты в отличие от органических или неорга­
нических веществ присутствуют в клетках в чрезвы­
чайно малых количествах, и определение их содер­
жания в тканевых экстрактах или жидкостях пред­
ставляет особую проблему. К счастью, весьма чув­
ствительные и специфичные методы оказалось возмо­
жным создать на основе определения каталитической
активности ферментов.
Чтобы оценить количество фермента в пробе тка­
невого экстракта или биологической жидкости, из­
меряют скорость реакции, катализируемой содержа­
щимся в этой пробе ферментом. При определенных Рис. 7.4. Спектры поглощения NAD* и NADH. Концен­
условиях измеряемая скорость пропорциональна ко­ трация растворов 44 мг/л, длина оптического пути 1 см.
Аналогичные спектры имеют N A D P+ и NADPH соответ­
личеству присутствующего фермента. Поскольку при ственно.
этом трудно определить число молекул фермента
в пробе или их общую массу, результаты выражают
в условных единицах активности фермента. Далее Сопряженный ферментный анализ
сравнивают относительные количества фермента В предыдущем примере оценка ферментативной
в различных экстрактах. Единицы активности удоб­ активности основывалась на измерении скорости
нее всего выражать в микромолях (мкмоль, ІО 6 образования продукта (NADH). Скорость образова­
моль), наномолях (нмоль, ІО-9 моль) или пикомолях ния продукта (или, реже, скорость расходования суб-
(пмоль, 10 12моль) израсходованного субстрата или
образовавшегося продукта за единицу времени (в
минуту). Соответствующие международные едини­
цы активности ферментов обозначаются pU, nU или
pU.

Пример количественного анализа


ферментативной активности;
определение содержания дегидрогеназы
При измерении скоростей реакций, протекающих
с участием NAD+ или NADP+ (реакции катализи­
руются дегидрогеназами), можно воспользоваться
тем обстоятельством, что NADH и NADPH (но не
NAD+ и NADP+) поглощают свет с длиной волны
340 нм (рис. 7.4).
Окисление NADH в NAD+ (или обратный про­
цесс) сопровождается изменением оптической плот­
ности (D) растворов при 340 нм, и при определенных
условиях скорость изменения D оказывается пропор­
циональна активности фермента (рис. 7.5). Рис. 7.5. Принцип измерения активности NADH- или
N A D PH -зависимой дегидрогеназы. Измеряют скорость из­
Для получения калибровочной кривой (рис. 7.6) менения оптической плотности при 340 нм, обусловленного
строят график зависимости скорости изменения оп­ превращением восстановленного кофермента в окислен­
тической плотности (наклона прямых на рис. 7.5) от ную форму. В кювету добавляют окисленный субстрат (S).
объема добавленного ферментного препарата. Ко­ восстановленный кофермент и буфер и регистрируют по­
глощение при 340 нм. Вначале наблюдается высокая опти­
личество фермента, присутствующего в исследуе­ ческая плотность из-за сильного поглощения NADH (или
мом растворе, можно найти по наблюдаемой скоро­ NADPH). При добавлении 0,025- 0,2 мл стандартною ра­
сти изменения D при 340 нм. створа фермента оптическая плотность понижается.
Ферменты: общие свойства 69

ВЫДЕЛЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

Вся информация об отдельных метаболических


реакциях, о промежуточных соединениях, образую­
щихся на последовательных этапах различных мета­
болических путей, а также о механизме регуляции
работы катализаторов получена главным образом
с использованием очищенных препаратов фермен­
тов. Высокоочищенные препараты ферментов необ­
ходимо иметь также и для того, чтобы получить на­
дежные данные о кинетике, кофакторах, активных
центрах, о структуре и механизме действия фермен­
тов.
Процесс очистки состоит в выделении данного
фермента из грубого клеточного экстракта, содержа­
щего множество других компонентов. Небольшие
молекулы удаляются диализом или гель-
Рис. 7.6. Калибровочная кривая для определения количе­ фильтрацией; нуклеиновые кислоты — осаждением
ства фермента. По оси ординат отложен тангенс угла на­
клона прямых, приведенных на рис. 7 5, по оси абсцисс — путем добавления антибиотика стрептомицина
количество фермента. и т.д. Основная проблема— отделить нужный фер­
мент от сотен химически и физически сходных бел­
ков.
страта) можно использовать для определения актив­
ности не только дегидрогеназ, но и других фермен­ Классические методы очистки
тов. Конкретный метод количественной оценки дик­ Широко используются следующие методы очист­
туется физико-химическими свойствами продукта ки: осаждение при различных концентрациях солей
или субстрата. Во многих случаях бывает удобно (чаще всего сульфата аммония или сульфата на­
подвергать образовавшийся продукт реакции дей­ трия), а также органическими растворителями (аце­
ствию дегидрогеназы, для которой этот продукт тоном, этанолом); дифференциальная денатурация
является субстратом (рис. 7.7). путем нагревания или изменения pH; дифферен­
циальное центрифугирование, гель-фильтрация
и электрофорез.
Г люкоза
Для масштабной и быстрой очистки белков
успешно применяются избирательная адсорбция
^ А Т Р , М д2+ и элюция белков с целлюлозного анионообменника
Гексокиназа диэтиламиноэтилцеллюзлозы и катионообменника
^ AD P , Мд2+ карбоксиметилцеллюлозы. Широко используется
также разделение белков по размерам на молекуляр­
Г люкозо-6-фосфат ных ситах, например сефадексе. Эти методы явля­
ются, однако, относительно малоселективными (если
NADP+ они не используются в сочетании) для отделения ин­
( дивидуального белка от всех остальных, находя­
Глю козо-6 фосфатдегидрогеназа
щихся в смеси. Такая задача легче решается методом
NADPH + Н+
аффинной хроматографии.
Типичная процедура очистки одного из ферментов
6-Фосфоглюконолактон
печени с хорошим выходом и 490-кратной степенью
Рис. 7.7. Определение активности гексокиназы в системе,
очистки препарата описана в табл. 7.2. Обратите
в которой протекает сопряженная ферментативная реак­ внимание на изменение при очистке удельной актив­
ция, катализируемая глюкозо- 6-фосфатдегидрогеназой. ности и выхода фермента. Процедура направлена на
Глюкозо- 6-фосфатдегидрогеназа, глюкоза, ATP, Mg2+ и то, чтобы достичь максимальной удельной активно­
N A D P+ добавлены в избытке. В этих условиях скорость сти (число единиц активности фермента на 1 мг бел­
общей сопряженной реакции зависит от количества добав­
ленной гексокиназы. Эту скорость определяют по образо­ ка) при возможно большем выходе исходной сум­
ванию NADPH, который поглощает свет при 340 нм. марной активности.
70 Глава 7

Таблица 7.2. Типичная процедура очистки фермента

Фракция, содержащая фермент Суммарная Суммарный Удельная активность, Выход, %


активность, pU белок, мг pU/мг

Грубый гомогенат печени 100000 10000 10 ( 100)


Супернатант после центрифугирования
при 100000 g 98000 8000 12.2 98
Осадок, образующийся в 40—50%-ном
(NH^SO« 90000 1500 60 90
Осадок, образующийся в 20—35%-ном
ацетоне 60000 250 240 60
Фракции 80— ПО после хроматографии
на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой 58000 29 2000 58
Осадок, образующийся в 43—48%-ном
(N H ^S O . 52000 20 2600 52
Первая кристаллизация 50000 12 4160 50
Перекристаллизация 49000 10 4900 49

М етод аффинной хроматографии носителях с NAD+ в качестве лиганда. При этом


Замечательным достоинством этого метода с лигандом могут связываться несколько дегидроге­
очистки является то, что он позволяет избирательно наз, которые при элюировании их раствором N A D b
извлекать из сложной смеси белков один конкретный выходят вместе, и их дальнейшее разделение прово­
белок или по крайней мере небольшое их число. Ме­ дят, используя уже не коферментные, а субстратные
тод основан на использовании иммобилизованного аффинные носители или применяя для элюирования
лиганда, который специфически взаимодействует «тупиковые тройные смеси», содержащие кофер-
с тем белком, который требуется пблучить в очи­ мент, специфический субстрат и специфический про­
щенном виде. Из всех белков, присутствующих дукт.
в смеси, с этим иммобилизованным лигандом связы­ С аффинной хроматографией во многом сходна
ваются только те белки, которые способны вступать хроматография, при которой в качестве лигандов
с ним в сильное взаимодействие. После удаления используются красители (голубая, зеленая или крас­
всех прочих несвязавшихся белков нужный фермент ная сефароза), а также хроматография на гидрофоб­
элюируют с иммобилизованного лиганда либо кон­ ных лигандах, где носителем является октил- или фе-
центрированными солевыми растворами, либо ра­ нилсефароза. В первом случае в качестве иммобили­
створом, содержащим растворимую форму лиганда. зованного лиганда используют органический краси­
Успешное применение метода аффинной хромато­ тель, являющийся аналогом субстрата, кофермента
графии позволяет добиться в ходе очистки порази­ или аллостерического эффектора. Элюирование
тельных результатов, обычно превосходящих резуль­ обычно осуществляют солевым раствором увеличи­
таты последовательного применения многочислен­ вающейся концентрации.
ных классических методов. В случае хроматографии на гидрофобных лиган­
Чаще всего ферменты проявляют высокую специ­ дах к носителю (например, сефадексу) присоединяют
фичность по отношению к своим субстратам и ко- алкильные или арильные углеводороды. Связывание
ферментам, поэтому наиболее подходящими лиган­ белков с такими носителями обусловлено гидрофоб­
дами служат производные субстратов и кофермен- ными взаимодействиями между алкильными цепя­
тов, ковалентно связанные с носителем, например ми и гидрофобными участками белковой молекулы.
с сефадексом. Они могут быть присоединены к носи­ Белки наносят в составе растворов с высоким содер­
телю либо непосредственно, либо через связующую жанием соли, например (NH4)2 S 04, и элюируют ра­
«ножку» (линкер) из 3—8 атомов углерода. Исполь­ створом с понижающейся концентрацией этой же со­
зование линкера помогает разрешить проблемы, ли.
связанные с тем, что присоединение лиганда к носи­
телю может препятствовать его взаимодействию
Определение гомогенности белкового
с ферментом. Вместе с тем введение гидрофобного
препарата с помощью электрофореза
линкера иногда осложняет выделение из-за проявле­
в полиакриламидном геле
ния эффектов хроматографии на гидрофобных ли­
гандах (см. Ниже). Примером успешного применения Гомогенность белковых препаратов лучше всего
аффинной хроматографии может служить очистка устанавливать с помощью электрофореза в полиа­
множества различных дегидрогеназ на аффинных криламидном геле в разных условиях. При одномер­
Ферменты: общие свойства 71

ном электрофорезе нативного белка (при наличии в разных тканях одного организма, в разных типах
достаточного количества препарата) можно обнару­ клеток одной ткани и даже в прокариотическом ор­
жить как основные, так и минорные белковые приме­ ганизме, например в E. coli. Это открытие было сде­
си. В двумерном варианте (по О’Фаррелу) в одном лано благодаря применению электрофоретических
направлении проводят разделение денатурирован­ методов разделения белков, в результате чего были
ных белков в соответствии с их значениями рі (в при­ обнаружены электрофоретически разные формы
сутствии мочевины) в градиенте pH, который со­ определенной ферментативной активности.
здается по димеризованными амфолитами. Во вто­ Термин «изофермент» («изозим») охватывает все
ром направлении белки, денатурированные с по­ вышеупомянутые физически различимые белки
мощью додецилсульфата натрия, разделяют в соот­ с данной каталитической активностью, однако на
ветствии с размерами протомеров (если белок яв­ практике, и особенно в клинической медицине, его
ляется олигомером). употребляют в более узком смысле, подразумевая
физически различимые и поддающиеся разделению
ВНУТРИКЛЕТОЧНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ формы данного фермента, присутствующие в раз­
ФЕРМЕНТОВ личных типах клеток данного эукариотического ор­
ганизма, например человека. Изозимы неизменно
Пространственное распределение и клеточная обнаруживаются в сыворотке и в тканях всех позво-
компартментация ферментов, субстратов и кофакто­ нрчных, насекомых и в одноклеточных организмах.
ров (см. гл. 2) имеют кардинальное значение. Напри­ При этом число ферментов и их содержание сильно
мер, в клетках печени ферменты гликолиза локали­ варьируют. Известны изоферментные формы дегид­
зованы в цитоплазме, а ферменты цикла лимонной рогеназ, оксидаз, трансаминаз, фосфатаз, трансфос-
кислоты — в митохондриях. форилаз и протеолитических ферментов. В различ­
Распределение ферментов по субклеточным орга- ных тканях могут находиться разные изоферменты,
неллам изучают после предварительного фракцио­ и эти изоферменты могут иметь неодинаковое срод­
нирования клеточных гомогенатов путем высоко­ ство к субстратам.
скоростного центрифугирования, определяя содер­
жание ферментов в каждой фракции (см. гл. 2).
Локализацию данного фермента в ткани или Диагностическое значение изозимов
клетке часто удается установить in situ гисто­
химическими методами («гистоэнзимология»). Для Медицинский интерес к изозимам возник после
этого тонкие (от 2 до 10 мкм) срезы заморожен­ того, как было обнаружено, что сыворотка человека
ной ткани обрабатывают раствором субстрата, к ко­ содержит несколько изозніиов лактатдегидрогеназы
торому специфичен данный фермент. В тех местах, и что их относительное содержание значительно изме­
где находится фермент, образуется продукт катали­ няется при определенных патологических состояниях.
зируемой этим ферментом реакции. Если продукт Впоследствии было выявлено много других случаев
окрашен и нерастворим, он остается на месте обра­ изменения относительного содержания изозимов
зования и позволяет локализовать фермент. Ги­ при разных заболеваниях.
стоэнзимология дает наглядную и в известной мере Изозимы сывороточной лактатдегидрогеназы
физиологичную картину распределения ферментов. обнаруживаются после электрофореза при pH 8,6 на
крахмальном, агаровом или полиакриламидном ге­
лях. При указанном значении pH изозимы несут раз­
ИЗОФЕРМЕНТЫ (ИЗОЗИМЫ) ный заряд и распределяются на электрофореграмме
Когда мы говорим «малатдегидрогеназа» или в пяти разных местах. Далее изозимы можно обна­
«глюкозо-6-фосфатаза», то обычно имеем в виду ружить благодаря их способности катализировать
конкретный белок, обладающий форментативной восстановление бесцветных красителей в нераство­
активностью, однако в действительности эти наиме­ римую окрашенную форму.
нования охватывают все белки, катализирующие Типичный набор реагентов для обнаружения изо­
окисление малата в оксалоацетат или гидролиз глю- зимов дегидрогеназы включает:
козо-6-фосфата с образованием глюкозы и Р*. В част­ 1) восстановленный субстрат (например, лактат);
ности, после выделения малатдегидрогеназы из раз­ 2) кофермент (NAD+);
личных источников (печени крысы, E. coli) обнару­ 3) краситель в окисленной форме (например, го­
жилось, что ферменты из печени и фермент из E. coli, лубая нитротетразолиевая соль);
катализирующие одну и ту же реакцию, различаются 4) переносчик электронов от NADH к красителю
во многих отношениях по своим физическим и хими­ [например, феназинметасульфат (ФМС)];
ческим свойствам. Физически различимые формы 5) буфер; активирующие ионы (если требуются).
ферментов, обладающие одним и тем же видом ка­ Лактатдегидрогеназа катализирует перенос двух
талитической активности, могут присутствовать электронов и одного иона Н + от лактата к NAD+
72 Глава 7

ностью обладает только тетрамерная молекула.


Если порядок соединения протомеров не имеет зна­
чения, то протомеры могут быть скомпонованы
пятью способами:
НННН
НННМ
ННММ
нммм
мммм
Рис. 7.8. Реакция, катализируемая L-лактатдегидро- Маркерт подобрал условия для разрушения и ре­
геназой. конструкции четвертичной структуры и сумел выяс­
нить взаимоотношения между изозимами лактатде­
гидрогеназы. Расщепление и реконструкция лактат-
дегидрогеназ I, и І5 не приводят к образованию но­
(рис. 7.8). Если электрофореграмму опрыскать при­ вых изозимов. Следовательно, эти два изозима
веденной выше смесью и затем инкубировать при содержат только один тип протомеров. Когда такой
37°С, то реакция сопряженного переноса электронов же процедуре была подвергнута смесь лактатдегид-
будет протекать только в тех местах, где присут­ рогеназ I, и І5, появились тікже формы І2, І3 и І4.
ствует лактатдегидрогеназы (рис. 7.9). Относитель­ Соотношение изозимов соответствует приведенному
ную плотность окраски полос можно далее оценить ниже субъединичному составу:
количественно с помощью сканирующего фотоме­ Изозимы лактатдегид- Субъединичный состав
тра (рис. 7.10). Изозим с наибольшим отрицатель­ рогеназы
ным зарядом обозначают I,. I, НННН
12 НННМ
Физическая природа изозимов 13 ННММ
14 НМММ
Олигомерные ферменты, образованные разными 15 ММММ
протомерами, могут быть представлены нескольки­
ми формами. Часто определенная ткань продуци­ Синтез Н- и М-субъединиц детерминируется разны­
рует преимущественно один из протомеров. Если ак­ ми генетическими локусами, и они по-разному
тивный олигомерный фермент (например, тетрамер) экспрессируются в разных тканях (например, в сер­
может быть построен из таких протомеров в различ­ дечной и скелетной мышцах).
ных комбинациях, то образуются изозимы.
Изозимы лактатдегидрогеназы различаются на ФЕРМЕНТЫ В КЛИНИЧЕСКОЙ
уровне четвертичной структуры. Олигомерная моле­ ДИАГНОСТИКЕ
кула лактатдегидрогеназы (мол. масса 130000) со­
стоит из четырех протомеров двух типов, Н и М (оба Различия между функциональными
с мол. массой около 34000). Каталитической актив- и нефункциональными ферментами
плазмы
( Лактат) Некоторые ферменты, проферменты и их суб­
страты в норме постоянно циркулируют в крови че­
ловека и выполняют физиологические функции.
Примерами функциональных ферментов плазмы
являются липопротеинлипаза, псевдохолинэстераза,
а также проферменты компонентов систем сверты­
вания крови и растворения кровяного сгустка. Они
синтезируются в печени, и их концентрация в крови
Восстановленный ФМ С Окисленный ФМ С либо такая же, как в тканях, либо более высокая.
Как следует из названия, нефункциональные фер­
менты плазмы не выполняют в крови никаких извест­
ных физиологических функций. Их субстраты в плаз­
Окисленный краситель Восстановленный краситель
ме обычно не обнаруживаются, и в норме их концен­
(бесцветный) (голубой формазан)
трация в крови человека почти в миллион раз ниже,
Рис. 7.9. Локализация лактатдегидрогеназы на электрофо- чем в тканях. Появление этих белков в плазме в по­
реграммс с использованием системы сопряженных реак­ вышенных концентрациях указывает на повышен­
ций. ную скорость деструкции тканей. Таким образом.
Ферменты: общие свойства 73

5 4 3 2 1

Рис. 7.10. Содержание изозимов лактатдегидрогеназы Б


(ЛДГ) в сыворотке крови в норме и патологии. Изозимы
сывороточной Л Д Г разделяли методом электрофореза на
ацетатцеллюлозе при pH 8,6' и выявляли с помощью реак­
ции, в результате которой образуется краситель. Фотоме­
трическое сканирование пятен позволяет оценить относи­
тельное содержание изозимов. А. Сыворотка больного ин­
фарктом миокарда. Б. Сыворотка здорового человека. В. В
Сыворотка пациента с заболеванием печени. (С любезного
разрешения Dr. Melvin Black and Mr. Hugh Miller, St Luke’s
Hospital, San Francisco.)
5 4 3 2 1

измерение в крови уровня нефункциональных фер­ ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ И ПРОГНОСТИЧЕСКОЕ


ментов плазмы дает врачу ценную диагностическую ЗНАЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ
и прогностическую информацию.
Нефункциональные ферменты плазмы включают Практикующие врачи уже используют количе­
белковые секреты экзокринных желез и истинно вну­ ственные определения некоторых нефункциональ­
триклеточные белки. Ферменты, выделяемые экзо­ ных ферментов плазмы. Получение этой ценной
кринными железами,— панкреатическая амилаза, диагностической и прогностической информации
панкреатическая липаза, щелочная фосфатаза (из теперь во многих случаях полностью автоматизиро­
желчи) и кислая фосфатаза из простаты— вано. В табл. 7.3 приведен перечень ферментов, кото­
поступают в плазму путем простой диффузии. рые используются в диагностической энзимологии.
Истинно внутриклеточные белки в норме в систему Дальнейшие детали, касающиеся их использования,
кровообращения не поступают. приведены в Приложении, где рассматриваются так­
же вопросы, связанные с чувствительностью и специ­
Происхождение нефункциональных фичностью диагностических тестов.
ферментов плазмы
Нефункциональные ферменты, обычно обнару­ ПРИМЕНЕНИЕ ЭНДОНУКЛЕАЗ РЕСТРИКЦИИ
живаемые в плазме в малых количествах, по- В ДИАГНОСТИКЕ
видимому, появляются в ней вследствие нормально Диагностика генетических заболеваний получила
идущих процессов разрушения эритроцитов, лейко­ мощный стимул благодаря последним достижениям
цитов и других клеток. При ускорении гибели клеток в технологии рекомбинантных ДНК. Уже давно
в кровоток поступают растворимые ферменты. известно, что все наследственные болезни обуслов­
Именно с этим процессом обычно связывают повы­ лены изменениями в ДНК, однако методы прямого
шение содержания ферментов в плазме, но поступле­ определения нуклеотидной последовательности
нием в плазму значительных количеств мышечных ДНК появились лишь в последнее время. Например,
ферментов сопровождается и выполнение тяжелой на основе гибридизационного поиска фрагментов
физической работы. ДНК (Southern, 1975) удалось разработать достаточ-
74 Гпава 7

Таблица 7.3. Основные ферменты сыворотки, используемые щью ДНК-зонда, сконструированного на основе не­
в клинической диагностике. Многие из приведенных фер­ активного мутантного аллеля гена а,-антитрипсина
ментов не являются специфичными для указанных в табли­ (Kidd et al., 1983).
це заболеваний; дополнительные данные об условиях, при Гибридизационные зонды могут использоваться
которых активность этих ферментов изменяется, приведе­ также для обнаружения генетических изменений, ве­
ны в Приложении дущих к потере рестрикционного сайта (см. гл. 38).
Фермент Заболевание Например, при серповидноклеточной анемии на­
блюдается точечная мутация в кодоне GAG (Glu),
Аминотрансферазы
в результате которой появляется кодон GTG (Val);
Аспартатаминотран- Инфаркт миокарда
сфераза
такую мутацию в ß-глобиновом гене можно обнару­
Аланинаминотрансфе- Вирусный гепатит жить, взяв для анализа всего 10 мл амниотической
раза жидкости и используя эндонуклеазу рестрикции Mst
Амилаза Острый панкреатит II или Sau I (Orkin et al., 1982).
Церулоплазмин Гепатолентикулярная деге­ ДНК-зонды можно использовать и для обнару­
нерация (болезнь Вил­ жения последовательностей ДНК, прочно сцеплен­
сона) ных с интересующим нас геном, но не принадлежа­
К реатинфосфокиназа Заболевание мышц и ин­ щих самому этому гену. Подобный анализ может
фаркт миокарда применяться и для выявления хромосомного поли­
у-Г лутамилтранспептидаза Различные заболевания пе­
чени
морфизма (различий в последовательностях гомоло­
Лактатдегидрогеназа (изо- Инфаркт миокарда гичных хромосом). Расщепление ДНК эндонуклеа­
зимы) зой рестрикции дает в таких случаях неодинаковые
Липаза Острый панкреатит рестрикционные карты (наборы фрагментов ДНК),
Кислая фосфатаза М етастазирующая карци­ свидетельствующие о различиях в последовательно­
нома предстательной стях оснований гомологичных генов. Это явление
железы получило название полиформизма длины рестрик­
Щелочная фосфатаза (изо- Различные заболевания ко- ционных фрагментов (ПДРФ). При рестрикционном
зимы) стей, закупорка прото­ анализе обнаруживаются две гибридизационные по­
ков печени
лосы (если бы гены были идентичны, наблюдалась
бы только одна полоса). У потомков, унаследовав­
но чувствительный метод пренатального скрининга ших дефектную хромосому, тоже выявляется одна
наследственных нарушений; с этой целью с помо­ гибридизационная полоса, но ее положение отлича­
щью ферментов рестрикции проводят картирование ется от положения полосы нормальных хромосом.
ДНК, извлеченной из зародышевых клеток, находя­ Феномен ПДРФ применялся и для обнаружения гена
щихся в амниотической жидкости. серповидноклеточной анемии (сцепленного с сайтом
В принципе можно сконструировать пробы ДНК рестрикции Нра I), а также ß-талассемии (сцепленно­
для диагностики большей части генетических забо­ го с сайтами рестрикции Hind III и Bam H I) (Little et
леваний. Например, для пренатального выявления al., 1980; Woo et al., 1983).
талассемии (нарушения в синтезе субъединиц гемо­ Скрининг, основанный на полиморфизме рестрик­
глобина; см. гл. 6) можно синтезировать пробу ДНК ционных фрагментов, использовался также для ран­
по фрагменту гена, кодирующего нормальную субъ­ ней диагностики фенилкетонурии (Woo et al., 1983)
единицу гемоглобина, и с ее помощью выявить уко­ (см. гл. 31). Отметим, однако, что сам ген, ответ­
рочение или отсутствие рестрикционного фрагмента, ственный за фенилкетонурию, не влияет на распреде­
обусловленное делецией в этом гене. Именно такие ление рестрикционных фрагментов, однако он тесно
делеции характерны для некоторых видов а- сцеплен с сайтом рестрикционного полиморфизма.
талассемии и нескольких редких типов ß- и ß,8- Перспективы использования полиморфизма рес­
талассемии (Dozy, Forman, Abuelo, 1979; Kan, трикционных фрагментов могут быть связаны с пои­
Chang, Dozy, 1982). Предложен и альтернативный сками генов, ответственных за то или иное заболева­
подход, основанный на конструировании синтетиче­ ние, которые сцеплены с полиморфным участком.
ской кДНК, гибридизующейся с ß-глобиновой по­ Этот подход уже применялся для скрининга мута­
следовательностью, которая содержит нонсенс- ций, приводящих к развитию ретинобластомных
мутацию, характерную для некоторых видов ß- опухолей (Cavenee et al., 1983) и болезни Гентингто-
талассемии (Pirastu et al., 1984). Отсутствие в плазме на (Gusella et al., 1984).
а, -антитрипсина— ингибитора протеаз— приводит Дальнейшие примеры использования рестрик­
к развитию эмфиземы и раннему циррозу печени. ционных фрагментов в целях диагностики будут да­
Неактивный а,-антитрипсин был обнаружен с помо­ ны в гл. 36.
Ферменты: общие свойства 75

ЛИТЕРАТУРА Mosbach К. (ed.). Immobilized enzymes. In: Methods in Enzy­


mology, Vol. 44, Academic Press, 1976.
Общая энзимология
Внутриклеточное распределение ферментов
Boyer Р. D.. Lardy Н., Myrbäck К. (eds.) The Enzymes, 3rd ed.,
7 vols. Academic Press, 1970—1973. De Pierre J. W., Ernster L. Enzyme topology o f intracellular
Nord F.F. (ed.) Advances in Enzymology, Interscience. [Issued membranes, Annu. Rev. Biochem., 1977, 46, 201.
annually.]
Клиническая энзимология
Bergmeyer H. V. Aspartate aminotransferase, Test of the
Структура ферментов
M onth 6, 1980, No. 2.
Fersht A. Enzyme Structure and Mechanism, 2nd ed., Freeman, Bergström К. Determination o f serum alkaline phosphatase ac­
1985. tivity, Test o f the M onth 1, 1974, No. 22.
Hirs С. H. W., Timascheff S. N. (eds.) Enzyme structure. Parts Cavanee W. K. et al. Expression o f recessive alleles by chromo­
A — H. In: Methods.in Enzymology, Vol. 11, 1967; Vols 25 somal mechanisms in retinoblastomas, Nature, 1983, 305,
and 26, 1972; Vol. 27, 1973; Vol. 47, 1977; Vols. 48 and 49, 779.
1978; Vol. 49. 1979. Academic Press. Dozy A .M ., Forman E .N ., Abuelo D .N . Prenatal diagnosis of
homozygous a-thalassemia, JAMA, 1979, 241, 1610.
Fishinger A. F. Creatine phosphokinase and its izoenzymes, Test
Коферменты o f the M onth 2, 1976, No. 6.
McCormick D. B., Wright L. D. (eds.) Vitamins and coenzymes, Gusella J. F. et al. DNA markers for nervous system diseases,
Parts A — F. In; Methods in Enzymology, Vol. 18A, 1970; Science, 1984, 225, 1320.
Vols 18B and 18C, 1971; Vol. 62, 1979; Vols 66 and 67, Kan Y. W., Chang J.. Dozy A. M. Pages 275—283. In: Thalasse­
1980. Academic Press. mia: Recent .Advances in Detection and Treatment, Cao
A., Carcassi U., Rowley P. (eds.), A. R. Liss, 1982.
Kidd V.J. et al. a,-Antitrypsin deficiency detection by direct
Номенклатура analysis o f the mutation in the'gene, Nature, 1983, 304,
230.
Enzyme Nomenclature, 1978. Recommendations of the N o­
Little P. F. R. et al. Model for antenatal diagnosis o f ß-
menclature Committee o f the International Union o f Bioc­
thalassemia and other monogenic disorders by molecular
hemistry op the Nomenclature and Classification of Enzy­
analysis o f linked DNA polymorphisms. Nature, 1980,
mes, Academic Press, 1979.
285, 144.
McNair R .D . Lactate dehydrogenase. Test o f the Month 2,
Оценка содержания и очистка ферментов 1976, No. 3.
Orkin S. H. et al. Improved detection o f the sickle mutation by
Bergmeyer H.-U. (ed.). Methods of Enzymatic Analysis, 2nd DNA analysis: Application to prenatal diagnosis, N. Engl.
English ed. 4 vols. Academic Press, 1974. J. Med., 1982, 307, 32.
Boyer P. £>., Lardy H., Myrbäck К. (eds.). The Enzymes, 3rd ed. Pirastu M . et al. Multiple mutations produce 5ß°-thalassemia in
7 vols, Academic Press, 1970— 1973. Sardinia, Science, 1984, 223, 929.
Colowick S. P., Kaplan N. O. (eds.). Methods in Enzymology, 69 Southern E .M . Detection o f specific sequences among DNA
vols, Academic Press, 1955— 1987. fragments separated by gel electrophoresis, J. Mol. Biol.,
Hqffmann-Ostenhoff O. et al. Affinity Chromatography. Perga­ 1975, 98, 503.
mon Press, 1978. Wilkinson J. H. Clinical applications o f isozymes, Clin. Chem.,
Jacoby W. B. (ed.) Enzyme purification and related techniques. 1970, 16, 733.
In: Methods in Enzymology, Vol. 22, Academic Press, Wilkinson J. H. Clinical significance o f enzyme activity measu­
1971. rements, Clin. Chem., 1970, 16, 882.
Jacoby W. B., Wilchek M. (eds.). Affinity techniques. In: Met­ Woo S. L. C. et al. Cloned human phenylalanine hydroxylase
hods in Enzymology, Vol. 34, 1974; Vol. 46, 1977, Acade­ gene allows prenatal diagnosis and carrier detection o f clas­
mic Press. sical phenylketonuria, Nature, 1983, 306, 151.
Глава 8

ФЕРМЕНТЫ: КИНЕТИКА
Виктор Родуэлл

ВВЕДЕНИЕ логии, необходимо иметь четкое представление о ме­


ханизмах ингибирования ферментов.

В предыдущих главах мы рассмотрели физиче­ ОБРАЗОВАНИЕ И РАСПАД


ские и химические свойства белков и связь структуры ПЕРЕХОДНЫХ СОСТОЯНИЙ
белка с его функцией. В гл. 5 и 11 обсуждаются об­ Рассмотрим реакцию замещения, в которой при­
щие свойства ферментов и энергетические измене­ ходящая группа Y замещает уходящую группу X:
ния, обычно сопровождающие биохимические реак­
ции, большую часть которых катализируют спе­ Y + R —X?±Y — R + X.
цифические ферменты. В этой главе мы рассмот­ Эта реакция состоит из двух полуреакций: 1)
рим химическую природу ферментативного катализа образование переходного состояния, в котором
и природу фермент-субстратных взаимодействий, к группе R присоединен и Y, и X; 2) распад переход­
ответственных за специфичность этих биологических ного состояния с образованием продуктов:
катализаторов.
Y + R —X S* Y -R -X S* Y — R + X.
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ Переходное
Из всех тех факторов, от которых зависит опре­ состояние
деление активности фермента — концентрация фер­ Каждая из полуреакций, как и любая другая хи­
мента и субстрата, температура, pH и присутствие мическая реакция, характеризуется определенным
ингибиторов,— наибольший клинический интерес изменением свободной энергии. Обозначим через
представляют последние три. Активность фермен­ AGF изменение свободной энергии, связанное с обра­
тов растет с повышением температуры, поэтому ско­ зованием переходного состояния, а через AGD изме­
рость метаболических процессов значительно повы­ нение свободной энергии, связанное с его распадом
шается при лихорадке. Если температура в конце и образованием продуктов:
концов не понизится, последствия будут фатальны.
С другой стороны, понижение температуры тела (ги­ [Y -R -X ]
AGF = ДС° + R T In
потермия)— и, следовательно, понижение активно­ [Y ][R -X ]’
сти большинства ферментов— весьма полезно в тех
случаях, когда требуется снизить общие метаболиче­ [ Y - R] [X]
ДСП= АG°+ R T ln
ские потребности (например, при операции на сердце [Y -R -X ]
или транспортировке органов для трансплантаци­ Суммарное изменение свободной энергии полной
онной хирургии). Кардинальным биологическим реакции, АС, равно сумме изменений свободной
принципом является гомеостаз — поддержание вну­ энергии каждой из полуреакций:
тренней среды организма в состоянии, максимально AG = AGf + AGd.
близком к норме. Активность многих ферментов
и белков изменяется даже при сравнительно неболь­ Как и в любом уравнении, где есть два слагае­
ших изменениях pH. Большинство лекарственных мых, невозможно лишь по алгебраическому знаку
препаратов оказывает свое действие, влияя на соот­ и величине АС установить знак или величину АСН
ветствующие ферментативные реакции. Многие та­ и AGd. Иначе говоря, мы не можем, зная изменение
кие препараты сходны с природными субстратами свободной энергии полной реакции АС, сказать что-
и потому могут действовать как конкурентные инги­ либо об изменениях свободной энергии, связанных
биторы ферментов. Чтобы понять многие процессы, с образованием и распадом переходных состояний.
которые существенны для фармакологии и токсико- Поскольку катализ теснейшим образом связан со
Ферменты: кинетика 77

значениями AGF и AGD, ясно, что термодинамиче­


ские параметры полной реакции (AG) ничего не гово­
рят нам о пути реакции (т. е. о ее механизме). Этот
вопрос и является предметом кинетики.

ИЗМЕНЕНИЯ СВОБОДНОЙ ЭНЕРГИИ,


СВЯЗАННЫЕ С ОБРАЗОВАНИЕМ
И РАСПАДОМ ПЕРЕХОДНЫХ Рис. 8.3. Энергетические профили реакции, в ходе которых
СОСТОЯНИЙ могут образовываться два разных переходных состояния.
[Y R . .. x ]J и [Y— R •• Х]ь- Дб'і' и AGf — свободная
Сформулированные выше положения проиллю­ энергия образования указанных комплексов.
стрированы графически на рис. 8.1 и 8.2; на этих ри­
сунках изображены «профили реакций», которые от­ ное состояние [Y -R -X ]b, ниже, чем энергетический
ражают связь между AG, AGF и AGD. Обратите вни­ барьер реакции, проходящей через переходное со­
мание, что AG на рис. 8.1 отрицательно (AG<0), а на стояние [Y -R -X ]8. В приведенном выше примере
рис. 8.2 положительно (AG>0); тем не менее в обоих [Y -R -X ]“ представляет собой переходное состояние
случаях AGf положительно (AGF>0), a AGD некатализируемой реакции, тогда как [Y -R -X ]b—
отрицательно (AGD<0). Следовательно, как и было это переходное состояние катализируемой реакции.
сказано, знак и величина AG еще ничего не говорят Все катализаторы, включая и ферменты, уменьшают
о знаке и величине AGF или AGD. свободную энергию образования переходного состоя­
ния AGf. Заметим далее, что на величину AG катали­
затор не влияет: изменение свободной энергии полной
РОЛЬ КАТАЛИЗАТОРОВ В ОБРАЗОВАНИИ
реакции не зависит от присутствия катализаторов.
ПРОДУКТИВНЫХ ПЕРЕХОДНЫХ
Константа равновесия химической реакции является
СОСТОЯНИЙ
функцией изменения стандартной свободной энергии
Рассмотрим профили реакций, различающихся этой реакции:
только образованием двух разных переходных со­
стояний (рис. 8.3). AG0 = _ R T In К^.
В обоих случаях величина свободной энергии Отсюда следует, что ферменты и другие катализа­
образования переходного состояния характеризует торы не влияют на константу равновесия реакции.
энергетический барьер полной реакции. Но энергети­
ческий барьер реакции, проходящей через переход-
ТЕОРИЯ СТОЛКНОВЕНИЙ
Кинетическая теория, или теория столкновений.
основывается на двух ключевых положениях.
1. Для протекания реакции молекулы должны
сталкиваться друг с другом, т.е. сближаться на рас­
стояния, достаточные для образования связей.
Свободная
2. Чтобы столкновение было продуктивным (т.е.
приводило к протеканию реакции), реагирующие
энергия
молекулы должны обладать энергией, достаточной
для преодоления энергетического барьера.
Отсюда следует, что при наличии у реагирующих
Рис. 8.1. Энергетический профиль реакции замещения, для
молекул достаточной энергии все факторы, повы­
которой характерно отрицательное изменение свободной шающие частоту их столкновений, будут повышать
’ энергии (A G < 0). скорость реакции. И наоборот, факторы, понижаю­
щие частоту столкновений молекул или их кинетиче­
скую энергию, снижают скорость реакции.
Если не все молекулы в популяции обладают
энергией, достаточной для осуществления реакции,
то повышение температуры, сопровождающееся уве­
личением кинетической энергии молекул, приведет
к повышению скорости реакции. Эти положения схе­
матически иллюстрирует рис. 8.4. В случае А ни одна
Рис. 8.2. Энергетический профиль реакции замещения, для из молекул, в случае Б — часть, а в случае В — все
которой характерно положительное изменение свободной молекулы обладают кинетической энергией, доста­
энергии (А С > 0). точной для преодоления энергетического барьера.
78 Гпава 8

Энергетический барьер полняет функцию катализатора (т. е. он требуется


лишь в следовых количествах и возвращается в ис­
ходное состояние по окончании реакции), в каждой
из полуреакций фермент выступает как стехиометри­
ческий реагент (т. е. реагирует с другими реагентами
в молярном отношении 1:1).
Многие другие биохимические реакции можно
рассматривать как частные случаи реакций переноса,
в которых отсутствуют либо А, либо D, либо оба ре­
агента. Так, реакцию изомеризации (например, взаи­
Рис. 8.4. Концепция энергетического барьера химической
реакции. мопревращение глюкозо-6-фосфата и глюкозо-
1-фосфата) можно представить как реакцию перено­
В'отсутствие ферментов многие химические реак­ са, в которой отсутствуют D и А:
ции при температуре, характерной для живых кле­
ток, идут исключительно медленно. Однако даже " у ' Enz у * 1
и при этой температуре молекулы находятся в дви­
жении и сталкиваются друг с другом. Правда, они не Ч -E n z -S ^
могут реагировать быстро, поскольку большинство из
них не обладает достаточной кинетической энергией В таком представлении, однако, теряется из виду
для преодоления энергетического барьера. При доста­ еще одно ключевое свойство ферментативных реак­
точно большом повышении температуры (т. е. при ций— участие в полной реакции двух и более форм
повышении кинетической энергии) реакция пойдет комплекса Enz —S h последовательное проз екание не­
быстрее. То, что реакция вообще идет (т. е. проте­ скольких стадий реакции. Для того чтобы отразить
кает самопроизвольно), следует из условия ÄG< О, это свойство, реакцию переноса можно представить
но при низких температурах она идет медленно. Фер­ в следующем виде:
менты ускоряют реакции, протекающие самопроизво­ Enz
льно при условиях, преобладающих в живых клетках. D -G y
D
РОЛЬ ФЕРМ ЕНТОВ В РАЗРЫ ВЕ Enz-G Enz-G*
И ОБРАЗОВАНИИ КОВАЛЕНТНЫ Х
СВЯЗЕЙ Enz-G*
Большинство химических реакций, представляю­ где Enz —G, Enz —G * и Enz —G** — формы ком­
щих биохимический интерес, сопряжено с разрывом плекса Enz —S, последовательно образующиеся
или образованием ковалентных связей. Рассмотрим, в ходе полной реакции.
например, реакцию переноса, о которой говорилось
Из всего сказанного выше ясно, что для протека­
в гл. 7: ния реакции необходимо, чтобы все участвующие
D —G + A t± A — G + D, в ней реактанты сближались на расстояния, доста­
в которой группа G переносится с донора, D —G, на точные для образования (или для разрыва) связей,
т. е. сталкивались друг с другом. В химии гомоген­
акцептор А. Полная реакция включает как разрыв
связи D —G, так и образование новой связи, А —G. ных растворов концентрация реагирующих молекул
Однако если реакция переноса катализируется фер­ в отсутствие катализаторов считается постоянной во
ментом, ее лучше записывать следующим образом: всем растворе. Однако в присутствии катализатора
это условие перестает соблюдаться. Для эффектив­
ной работы катализатор должен иметь на своей по­
D-G -ѵ Enz A-G верхности участки связывания реагирующих моле­
кул. Такое связывание представляет собой обрати­
D Enz-G А
мый процесс, однако равновесие сильно сдвинуто
в сторону образования комплекса. Качественно это
Такое ее представление подчеркивает три важных можно представить следующим образом:
признака ферментативных реакций переноса групп. Реактант + Катализатор Комплекс реактанта
1. Каждая полуреакция сопровождается и разры­ с катализатором.
вом, и образованием ковалентной связи.
2. Фермент является равноправным реагентом, Прочность комплекса реактанта R и катализатора
таким же как D —G и А. С можно охарактеризовать количественно с помо­
3. В то время как в полной реакции фермент вы­ щью константы диссоциации комплекса R —С (Кй)
Ферменты: кинетика 79

или константы равновесия реакции:


R —С R + С,

[R - С]
Таким образом, чем прочнее комплекс R —С, тем Рис. 8.5. Образование комплекса Enz S согласно модели
меньше Кй. «жесткой матрицы» Фишера.
Отсюда мы получаем одно важное следствие:
связывание реактанта с катализатором приводит к за­ тром. Вначале было непонятно, почему молекулы
метному повышению локальной концентрации реаген­ ферментов столь велики, если только часть их струк­
та по сравнению с его концентрацией во всем растворе. туры участвует в связывании субстрата и непосред­
Таким образом, мы переходим из области химии го­ ственно в катализе. Однако, как показал анализ
могенных растворов в область химии гетерогенных трехмерной структуры ферментов, с субстратом
растворов. взаимодействует намного большая часть белковой
Если катализатор биомолекулярной реакции молекулы, чем предполагалось ранее. Если еще уче­
(идущей с участием двух реактантов) связывает оба сть включение в работу ферментов аллостерических
реактанта, то локальная концентрация каждого из центров такого же размера (см. гл. 10), не прихо­
них повышается, причем степень этого повышения дится удивляться объемности ферментов.
зависит от сродства катализатора к данному реак­
танту (ÄTd). Как мы увидим ниже, скорость бимолеку­
лярной реакции М одель «ключ— замок»
А + В -►А —В Первоначальная модель каталитического центра,
предложенная Эмилем Фишером, трактовала взаи­
пропорциональна концентрации обоих реактантов, модействие субстрата и фермента по аналогии с си­
А и В, поэтому связывание А и В с катализатором стемой «ключ — замок». Эта модель, которую иног­
может приводить к чрезвычайно большому (в не­ да называют моделью «жесткой матрицы» (рис. 8.5),
сколько тысяч раз) увеличению скорости реакции. не утратила своего значения для понимания некото­
Одним из ключевых факторов, позволяющих рых свойств ферментов, например их способности
ферменту служить катализатором, является его спо­ к строго определенному связыванию двух или боль­
собность эффективно связывать один или (чаще) оба шего числа субстратов (рис. 8.6), или для объяснения
реактанта, участвующие в бимолекулярной реакции, кинетики насыщения субстратом.
что приводит к повышению локальной концентра­
ции реактантов и, следовательно, к локальному по­
вышению скорости реакции. То обстоятельство, что М одель индуцированного соответствия
ферменты по сравнению с большинством небелко­ Недостатком модели Фишера является подразу­
вых катализаторов необычайно эффективны и высо­ меваемая в ней жесткость каталитического центра.
коизбирательны, требует дальнейшего объяснения. Более общий характер имеет модель индуцированно­
Чтобы понять эти отличительные свойства фермен­ го соответствия, предложенная Кошландом. Эта мо­
тов, мы должны ввести понятие активного, или ката­ дель основывается на весьма убедительных экспери­
литического, центра1. ментальных данных. Ее существенной чертой явля­
ется гибкость каталитического центра. В модели Фи­
КАТАЛИТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР шера каталитический центр считается заранее подог­
Размеры белков намного превышают размеры нанным под форму молекулы субстрата. В модели
низкомолекулярных субстратов, в связи с чем воз­
никло представление о том, что в катализе участвует
лишь ограниченная область молекулы фермента.
Эту область мы и называем каталитическим цен­

1 Во многих руководствах понятия «активный центр»


и «каталитический центр» рассматриваются как синонимы,
однако некоторые ферменты имеют дополнительные «ак­
Рис. 8.6. Последовательное связывание ферментом кофер­
тивные центры», предназначенные для регуляции активно­ мента (СоЕ) и двух субстратов (S, и S2) в рамках гипотезы
сти фермейта и непосредственно не связанные с химически­ «жесткой матрицы». Предполагается, что кофермент со­
ми превращениями на различных стадиях каталитического держит участок, способный связывагь первый субстрат (S,);
процесса. Поэтому, чтобы избежать неоднозначности, мы после связывания первого субстрата облегчается связыва­
используем термин «каталитический центр». ние второго субстрата S2.
80 Глава #

Рис. 8.7. Схематическое представление конформационных


изменений в молекуле фермента при связывании субстрата
согласно модели индуцированного соответствия. Обратите
внимание на расположение ключевых остатков до и после
связывания субстрата (по Кошланду).

же индуцированного соответствия субстрат индуци­


рует конформационные изменения фермента, и лишь Рис. 8.9. Схема альтернативных путей реакции при индуци­
ровании субстратом конформационных изменений в фер­
в результате этих изменений аминокислотные остат­ менте. Фермент сначала претерпевает конформационное
ки и другие группы фермента принимают простран­ изменение (А ), затем связывает субстрат (В). На альтерна­
ственную ориентацию, необходимую для связыва­ тивном пути фермент сначала связывает субстрат (В), а за­
тем претерпевает конформационное изменение (Д). Нако­
ния субстрата и катализа. При этом другие аминоки­ нец, оба процесса могут развиваться согласованным обра­
слотные остатки могут погрузиться в глубь молеку­ зом (Г) с образованием конечной конформации (/Г).
лы фермента.
В примере, приведенном на рис. 8.7, в связывании индуцируется неправильное расположение этих
субстрата принимают участие гидрофобные и заря­ групп. Еще одной структурной особенностью фер­
женные группы (области, выделенные точками). Не­ мента является небольшая выемка в правой части.
посредственно в катализе участвуют остаток фосфо- Представим, что в эту выемку попадает регулятор­
серина (Р) и —SH-группа цистеина. Другие остатки, ная молекула, «удерживающая» один из полипеп-
не вовлеченные ни в тот, ни в другой процесс, пред­ тидных участков, который несет каталитическую
ставлены остатками Lys и Met. В отсутствие суб­ группу, от перемещения. Тогда будет происходить
страта каталитические и субстратсвязывающие лишь связывание субстрата, но не катализ.
группы находятся друг от друга на расстоянии, в не­ Остается выяснить точную последовательность
сколько раз превышающем длину связи. Субстрат событий, из которых складываются индуцирован­
по мере сближения с ферментом индуцирует в по­ ные субстратом конформационные изменения. Здесь
следнем конформационные изменения, в результате возможно несколько путей, представленных на рис.
которых соответствующие группы занимают поло­ 8.9.
жение, необходимое для связывания субстрата и для Предположим, что нам известна полная первич­
катализа. Одновременно меняется пространственное ная структура фермента. Даже в этом случае обычно
расположение других остатков — Lys и Met теперь бывает трудно решить, из каких именно остатков
оказываются сближенными (рис. 8.7). формируется каталитический центр. Как явствует из
Аналоги субстрата тоже могут вызывать конфор­ модели индуцированного соответствия, эти остатки
мационные изменения, но не все из них являются могут располагаться далеко один от другого в пер­
«правильными» (рис. 8.8). При связывании истинно­ вичной структуре, но быть сближены в трехмерной
го субстрата (А) все группы (черные кружочки) зани­ (третичной) структуре.
мают нужное положение. При связывании же анало­ В формировании каталитического центра прини­
га субстрата— более объемного (рис. 8.8,Б) или, мают участие аминокислотные остатки нескольких
наоборот, меньшего по размеру (рис. 8.8,і?) — сегментов полипептидной цепи, как в случае гемо­
глобина (гл. 6) или химотрипсина (гл. 9).

Каталитический центр лизоцима


Лизоцим присутствует в составе слез, носовой
слизи, слюны, желудочного секрета, в различных
тканях, а также в молоке и яичном белке. Этот фер­
мент катализирует гидролиз ß- 1,4-связей N-
Рис. 8.8. Схематическое представление конформационных ацетилнейраминовой кислоты (см. гл. 13 и 33), вхо­
изменений в ферменте при связывании истинного субст рата дящей в состав протеогликанов и глюкозаминогли-
(А) и его аналогов (Б, В). канов. Лизоцим, присутствующий в слезах и носовой
Ферменты: кинетика 81

(A) Asp 101

Тгр 62 В Ser 100


ТгрбЗ ^

Asn 59
Asn 46
Asp 52 Glu 35
Ala 110
С
Ser 36 4
(F ) Arg 114

Рис. 8.10. Схематическое представление каталитического


центра, расположенного в щели, которая проходит посре­
дине молекулы лизоцима. Гликозильные звенья гексасаха­ Рис. 8.11. Структура рибонуклеазы по данным рентгено-
рида обозначены буквами от А до F. Указаны некоторые структурного анализа. Указаны номера специфических
остатки, выстилающие щель активного центра, и их номера остатков. (См. также рис. 5.7.)
в аминокислотной последовательности лизоцима.

слизи, разрушает клеточные стенки многих попа­ тоже имеется щель, сходная со щелью в лизоциме,
дающих из воздуха грамположительных бактерий. в которую выступают два остатка, His 12 и His 119.
Лизоцим (мол. масса около 15 000) образован одной Из полученных ранее химических данных следовало,
полипептидной цепью, содержащей 129 остатков. что эти остатки входят в состав каталитического
Поскольку в составе молекулы нет ни кофермента, центра. Оба они располагаются вблизи места связы­
ни ионов металлов, катализ, специфичность и трех­ вания уридиловой кислоты (рис. 8.11).
мерная структура лизоцима целиком определяются
аминокислотной последовательностью. В молекуле
имеются небольшие области складчатого слоя, не­
сколько коротких а-спиралей и достаточно большие Аминокислотные последовательности
участки с нерегулярной структурой. Цветной снимок в области каталитического центра
трехмерной модели лизоцима в комплексе с субстра­ Первичная структура в окрестности каталитиче­
том можно найти в работе J. Biol. Chem. 1968: 243, ского центра у различных семейств гидролитических
1663. Посредине молекулы лизоцима проходит глу­ ферментов оказывается довольно близкой (табл.
бокая щель, в которой находятся остатки, форми­ 8.1). Это позволяет предполагать, что механизмы
рующие каталитический центр и субстратсвязываю- гидролиза связей в биологических системах относи­
щую область; последняя содержит шесть участков, тельно немногочисленны. Поэтому неудивительно,
взаимодействующих с разными субстратами или ин­ что аминокислотные последовательности в области
гибиторами (рис. 8.10). Остатки, ответственные за каталитического центра у одного и того же фермен­
расщепление связи, располагаются между участками та, выделенного из разных видов, еще более сходны.
D и Е; наиболее важную роль играют карбоксильные
группы остатков Asp 52 и Glu 35. Последний, по всей
вероятности, протонирует гликозидную связь суб­ Ф АКТОРЫ , ВЛИЯЮ Щ ИЕ
страта, а отрицательно заряженный остаток Asp 52, НА АКТИВНОСТЬ ФЕРМ ЕНТОВ
располагающийся на противоположной стороне,
стабилйзирует образующийся в результате карбо-
ниевый ион. Ферментативная активность зависит в основном
от следующих факторов: концентрация фермента
Каталитический центр рибонуклеазы и субстрата, температура, pH, присутствие ингиби­
торов.
В отличие от ситуации с лизоцимом информация
о каталитическом центре рибонуклеазы была в зна­ ТЕМ П ЕРАТУРА
чительной мере получена еще до определения ее
трехмерной структуры. Выводы, основанные на хи­ В некотором ограниченном интервале темпера­
мических исследованиях, подтверждены кристалло­ тур скорость ферментативной реакции повышается
графическими данными. В молекуле рибонуклеазы с ростом температуры. Коэффициент, указываю-
82 Глава 8

Таблица 8.1. Аминокислотные последовательности вблизи важных в каталитическом отношении остатков серина (S) и ги­
стидина (Н) в нескольких бычьих протеазах. Использованы однобуквенные обозначения аминокислот (гл. 3). (Из работы
Dayhoff М. О., ed.: Atlas of Protein Sequence and Structure. Vol. 5. National Biomedical Research Foundation, 1972, с разреше­
ния.)

Ф ерм ен г А м и н оки сл отн ы е о статк и А м и н оки слотн ы е остатки


вблизи серина (S) вблизи гисгидина (Н)

Трипсин D S C Q D G (S )G G P V V C S G K V V S A A (H )C Y K S G
Х и м отрипсин А S S C M G D (S )G G P L V C K K N V V T А А( Н )G G ѴТТ
Х и м отрипсин В S S C M G D (S )G G P L V C Q K N V V T A A (1I)C G V T T
Тром бин D A C E G D (S )G G P F V M K S P V L T A A (H )C L L Y P

щий, во сколько раз повышается скорость реакции 1. Денатурацией фермента при очень высоких или
при повышении температуры на 10°, называется тем­ очень низких pH.
пературным коэффициентом и обозначается Ql0. Для 2. Изменением величины заряда молекул субстра­
многих биологических реакций при повышении тем­ та или фермента. Активность фермента может изме­
пературы на 10° скорость удваивается (Qi0 = 2) и, няться в результате изменений либо его структуры,
аналогично, при понижении температуры на 10" либо заряда функциональных остатков, участвую­
уменьшается вдвое. Многие физиологические про­ щих в катализе или связывании субстрата. Рассмо­
цессы (например, скорость сокращения изолирован­ трим для примера взаимодействие отрицательно за­
ной сердечной мышцы) тоже характеризуются ряженного фермента (Enz ) с положительно заря­
коэффициентом Qt0, близким к двум. женным субстратом (SH+):
Типичная зависимость скорости ферментативной Enz- + SH+ -» Enz — SH.
реакции от температуры представлена на рис. 8.12.
Видно, что при некой оптимальной температуре ско­ При низких pH происходит протонирование Enz- :
рость реакции максимальна. Повышение скорости Enz- + H + -» EnzH,
реакции по мере приближения к оптимальной темпе­
ратуре слева объясняется увеличением кинетической а при высоких pH — депротонирование субстрата:
энергии реагирующих молекул. При дальнейшем по­ SH+ - S + H +.
вышении температуры кинетическая энергия моле­
кулы фермента становится достаточной для разрыва Поскольку взаимодействовать друг с другом мо­
связей, поддерживающих вторичную структуру фер­ гут только SH + и Enz- , при крайних значениях pH
мента в нативном, каталитически активном состоя­ эффективная концентрация Enz- или SH+ будет низ­
нии (происходит тепловая денатурация фермента). кой, что приведет к снижению скорости реакции
Вторичная и третичная структура фермента разру­ (рис. 8.13). И только в области, выделенной двойной
шается, что сопровождается потерей каталитической штриховкой, в нужном ионном состоянии находятся
активности. одновременно и Enz, и S, а максимальной концен­
Для большинства ферментов оптимальная тем­ трации они достигают в точке X.
пература равна или выше той температуры, при ко­ Оптимальная температура
торой в норме находятся клетки. Для ферментов ми­
кроорганизмов, адаптировавшихся к обитанию
в природных горячих источниках, оптимальная тем­
пература может быть близка к точке кипения воды.

рн
Умеренные изменения pH оказывают влияние на
ионное состояние фермента, а зачастую и субстрата.
Как показывают измерения ферментативной актив­
ности при различных pH, оптимум активности нахо­
дится обычно между pH 5,0 и 9,0. Вместе с тем отде­
льные ферменты, например пепсин, активны при зна­
чениях pH, лежащих далеко за пределами этого ин­
тервала.
Зависимость активности от pH определяется сле­ Рис. 8.12. Влияние температуры на скорость гипотетиче­
дующими факторами. ской ферментативной реакции.
Ферменты: кинетика 83

SH+ X ШШ e™ - Для реакции


А + 2В -►AB,
выражение для скорости реакции имеет вид
Скорость реакции ос [А][В][В]
или
Скорость реакции ос [А][ВР.
В общем случае, когда п молекул А реагируют с
т молекулами В,
Низкий pH Высокий пА + «г В -» А„Вт,
выражение для скорости реакции принимает вид
Рис. 8.13. Влияние pH на активность фермента. Скорость реакции ос [А]"[В]т.

При изменении pH ферменты могут претерпевать КОНСТАНТА РАВНОВЕСИЯ


конформационные изменения. Для поддержания ак­
тивной третичной или четвертичной структуры мо­ Поскольку все химические реакции обратимы,
жет оказаться необходимым присутствие определен­ для обратной реакции (по отношению к той, когда
ного заряда на группе, удаленной от области связы­ п молекул А реагируют с пг молекулами В)
вания субстрата; именно такая ситуация наблюдае­ АЛВ,П- иА + т В
тся в случае гемоглобина (гл. 6). Если заряд этой соответствующее выражение для скорости реакции
группы изменится, могут произойти частичное раз­ будет иметь вид
вертывание белковой цепи, или, наоборот, компак-
тизация молекулы, или же ее диссоциация на прото­ Скорость реакции ос [A A J.
меры — во всех случаях с потерей активности. Обратимость обозначается двойными стрелками:
пА + тВ <=»А„В„.
КОНЦЕНТРАЦИЯ РЕАКТАНТОВ
Это выражение следует читать: п молекул А и т мо­
При увеличении концентрации реактантов возра­ лекул В находятся в равновесии с А,Д„. Знак про­
стают число молекул, обладающих достаточной для порциональности ос можно заменить на знак равен­
реакции энергией, и частота их столкновений. Рас­ ства, если ввести коэффициент пропорциональности
смотрим реакцию между двумя разными молекула­ к, характерный для рассматриваемой реакции.
ми А и В: В общем случае
А + В -AB. пА + тВ <=*A B
Удвоение концентрации А или В приведет к увеличе­ выражения для скорости прямой реакции (Скоро­
нию вдвое скорости реакции, а удвоение концентра­ сть,) и обратной реакции (Скорость ,) принимают
ций одновременно А и В повысит вероятность их вид
столкновений в четыре раза. Следовательно, скоро­ Скорость, = /С|[А]И[В]'",
сть реакции возрастет вчетверо. Скорость реакции
пропорциональна концентрациям реагирующих моле­ Скорость , = к ,[A„BJ.
кул. Квадратные скобки используются для указания Когда скорости прямой и обратной реакций равны,
молярных концентраций 1, символ ос означает про­ говорят, что система находится в равновесии:
порциональность. Выражение для скорости прини­
мает вид Скорость, = Скорость.,,
*,[А]"[ВГ = к ,[A„BJ.
Скорость реакции ос [Реагирующие молекулы],
Отсюда
или
*i [A „B J
Скорость реакции ос [А][В].
к- ! [А ]-[В ]"‘

Отношение к х к к _, называется константой равнове­


1 Строго говоря, должны использоваться не молярные сия Keq. Следует запомнить следующие свойства си­
концентрации, а молярные активности. стемы, находящейся в состоянии равновесия
84 Глава 8

1. Константа равновесия равна отношению кон­ Кроме того, на начальной стадии реакции концен­
стант скоростей прямой и обратной реакций, трация субстрата соответствует его исходному коли­
2. В равновесии скорости прямой и обратной ре­ честву. Поэтому скорость в начале реакции, т. е. ее
акций (но не их константы) равны. начальная скорость (г), будет прямо пропорциональна
3. Равновесие является динамическим состоянием. концентрации фермента [Enz] (гл. 7).
Хотя суммарного изменения концентрации реагентов Фермент является реактантом, который соеди­
и продуктов в равновесии не происходит. А и В по­ няется с субстратом, образуя фермент-субстратный
стоянно превращаются в А„Вт, и наоборот. комплекс Enz —S, распадающийся на свободный
4. Если известны равновесные концентрации А, В фермент и продукт Р. В простейшей форме можно
и А„В,„, можно найти численное значение константы записать ^
равновесия. Enz + S *4 Enz + Р.
k -1
Связь между константой равновесия Отметим, что хотя в выражения для скоростей
и изменением стандартной свободной энергии прямой и обратной реакций входит член [Enz]:
(Д С °) реакции Скорость, = /c,[Enz][S],
Константа равновесия связана с AG соотноше­ Скорость = А. ,[Enz][P],
нием
в выражении для константы равновесия [Enz] уже не
AG = - R T In Кец. содержится:
к. [Enz] [Р] [Р]
Здесь R — газовая постоянная, Т — абсолютная тем­
пература. Поскольку их значения известны, зная [Enz] [S] [S]'
численное значение Keq, можно найти AG . Если кон­ Таким образом, концентрация фермента не оказывает
станта равновесия больше единицы, реакция идет са­ влияния на константу равновесия. К не зависит от то­
мопроизвольно, т. е. в том направлении, как она на­ го, каким образом достигается равновесие— с уча­
писана (слева направо). Если же константа равнове­ стием фермента или без него (вспомним о величине
сия меньше единицы, то самопроизвольно идет АС°). Фермент меняет путь, по которому идет реак­
обратная реакция. Заметим, однако, что константа ция, но не конечные (равновесные) концентрации ре­
равновесия указывает направление, в котором реак­ агентов и продуктов, от которых зависят Ксц и AG
ция может идти самопроизвольно, но не позволяет
судить, будет ли реакция идти быстро. Иными слова­
ми, она ничего не говорит о высоте энергетического
КОНЦЕНТРАЦИЯ СУБСТРАТА
барьера реакции (A(7F; см. выше). Это следует из то­
го, что определяет только AG°. Скорости реакций Далее мы будем рассматривать ферментативные
зависят от высоты энергетического барьера, но не от реакции, в которых имеется единственный субстрат
величины AG ’. и единственный продукт. Такая ситуация действи­
Большинство факторов, влияющих на скорости тельно наблюдается для некоторых ферментатив­
ферментативных реакций, оказывают свое действие ных реакций, однако большинство из них протекает
путем изменения локальных концентраций реаген­ с участием двух и более субстратов и продуктов.
тов. Это, однако, нисколько не снижает ценности даль­
нейших рассуждений. То. что справедливо для одно­
го субстрата, остается верным и для двух.
КОНЦЕНТРАЦИЯ ФЕРМЕНТА При увеличении концентрации субстрата [S] и со­
хранении всех остальных условий начальная скоро­
Во многих случаях бывает недостаточно знать, сть V(скорость, измеряемая в период, когда израсхо­
что данный фермент присутствует в системе, нужна дована очень малая доля субстрата) будет повы­
еще информация о его количестве. При определен­ шаться до максимальной величины Kmas, после чего
ных условиях скорость ферментативной реакции пря­ останется постоянной (рис. 8.14).
мо пропорциональна количеству фермента (гл. 7). По мере повышения концентрации субстрата ско­
Это бывает не всегда, что можно проиллюстри­ рость будет расти до тех пор, пока не произойдет на­
ровать на примере прямой реакции, идущей в равно­ сыщения фермента субстратом. Измеренная в таких
весных условиях. Даже если мы знаем, что прямая условиях начальная скорость уже не будет возра­
реакция действительно идет, нам будет казаться, что стать при дальнейшем повышении концентрации
скорость ее равна нулю, поскольку с такой же скоро­ субстрата. Отметим, что субстрат обычно берут
стью идет и обратная реакция. Когда же фермента­ в значительном молярном избытке по отношению
тивная реакция только начинается, продукт еще к ферменту. Например, если фермент с мол. массой
практически отсутствует и обратная реакция не идет. 100 00U взаимодействует с субстратом с мол. массой
Ферменты: кинетика 85

С шение [S], хотя и повысит частоту столкновений Enz


с S, не сможет привести к повышению скорости реак­
ции— среди молекул фермента уже не будет таких,
которые были бы свободны для реакции с субстра­
том.
Случай В представляет особый теоретический ин­
терес, поскольку при этом ровно половина молекул
фермента насыщена субстратом. Соответственно
скорость равна половине максимальной скорости
( ^шах/2), достижимой при данной концентрации фер­
Рис. 8.14. Влияние концентрации субстрата на скорое іь мента.
фермен газ йеной реакции.
УРАВНЕНИЕ МИХАЭЛИСА—МЕНТЕН
100 и оба присутствуют в концентрации 1 мг/мл, то
на каждый моль фермента будет приходиться 1000 Графическое определение константы
молей субстрата. Более реальными являются сле­ Михаэлиса Ам
дующие величины:
Концентрация субстрата, при которой скорость со­
[Enz] = 0,1 мкг/мл = 10-9 М, ставляет половину максимальной, обозначается через
[S] = 0,1 мг/мл — 10_3 М, К м и называется константой Михаэлиса. Ее можно
определить из графика зависимости г от [S] (рис.
т.е. молярный избыток субстрата по отношению 8.14). Обратите внимание, что Км имеет размерность
к ферменту составляет 106. молярной концентрации.
Даже если [S] уменьшить в 100 раз, его концен­ Когда [S] приближается к Км, ѵ становится весьма
трация все еще в 10000 раз будет превышать концен­ чувствительной к изменению [S]; в этой области фер­
трацию фермента. мент работает со скоростью, равной половине мак­
Ситуация, соответствующая точкам А, В и С на симальной. Многие ферменты характеризуются та­
рис. 8.14, проиллюстрирована на рис. 8.15. В точках кими значениями Км, которые примерно соответ­
А и В в комплексе с субстратом находится лишь ствуют физиологическим концентрациям их субстра­
часть молекул фермента, хотя молекул субстрата на­ тов.
много больше, чем молекул фермента. Это происхо­ Уравнение Михаэлиса—Ментен
дит потому, что константа равновесия реакции
с rmax[S]
Enz + S Enz —S (образование комплекса Enz —S)
хотя и велика, но конечна. Таким образом, в точках Ам + [S]
А и В повышение или понижение [S] будет приводить описывает поведение многих ферментов при измене­
к увеличению или уменьшению доли молекул Enz, нии концентрации субстратов. Используя это урав­
связанных с S (т. е. доли молекул Enz —S), и ѵ будет нение, зависимость начальной скорости фермента­
зависеть от [S]. В точке С практически все молекулы тивной реакции от [S] и Км можно проиллюстриро­
фермента связаны с субстратом, и дальнейшее повы­ вать на следующих конкретных примерах.

Рис. 8.15. Схема, поясняющая связывание субстрата ферментом при низкой (А) и высокой (С) концентрации субстрата,
а также при концентрации субстрата, равной Км (В). Состояния А, В и С отвечают точкам А, В, С на кривой, приведенной
на рис. 8.14.
86 Глава 8

1. [S] много меньше Км (точка Л на рис. 8.14 и 8.15). Итак, мы имеем уравнение прямой
В этом случае величину [S] в знаменателе можно опу­
стить, и он будет практически равен Км. Отношение у = ах + Ь,
двух констант, Ѵта% и Км, можно заменить новой
константой К. Таким образом, имеем: где у = \/ѵ и эс = 1/[S].
Если построить график зависимости у (т.е. 1/ѵ) от
эс (т.е. 1/[S]), то длина отрезка Ь, отсекаемого от оси
K n a .C S ] К » , [S ]
V V ^K [S] у , будет равна \/Ѵтах, а тангенс угла наклона а —
*M + [S ] ' K J V max. Длину отрезка, отсекаемого от оси х (в
области отрицательных значений), можно получить,
( ~ означает «примерно равно»). приравняв у нулю. Тогда
Другими словами, когда концентрация субстрата
значительно ниже той, при которой скорость реакции
составляет половину максимальной (т. е. значительно
меньше Км)ч начальная скорость ѵ пропорциональна
концентрации субстрата [S]. График уравнения Михаэлиса— Ментен в обрат­
2. |S| много больше К м (точка С на рис. 8.14 ных координатах называют графиком Лайнуивера—
и 8.15). В этом случае член Км в знаменателе можно Бэрка (рис. 8.16). Используя его, Км можно найти
опустить, т. е. либо из наклона прямой и длины отрезка, отсекае­
мого от оси у, либо из длины отрезка, отсекаемого
Knax [S]
i) —------------■ і; ^ Vmax [S] ~ ¥/
у в области отрицательных значений от оси х. Поско­
K M+ IS Y [S] льку [S] имеет размерность молярной концентрации,
Км тоже измеряется в молях на литр. Скорость ѵ мо­
жет быть выражена в любых единицах, поскольку Км
Это означает, что при концентрации субстрата [S], не зависит от [Enz.]. График, построенный в обрат­
намного превышающей Kw начальная скорость ѵ рав­ ных координатах, позволяет определить Км по отно­
на максимальной Утах. сительно небольшому числу точек, именно поэтому
3. |S| = ЛГМ (точка В на рис. 8.14 и 8.15). он часто используется для нахождения Км.
Используя график Лайнуивера— Бэрка на прак­
K „,[S] . = vm [S] _ ѵт [S] _ тике для оценки Км, иногда сталкиваются с тем, что
" KM+ [S ]' v [S] + [S] 2[S] 2 ' почти все точки оказываются в области низких кон­
центраций субстрата. Это происходит в том случае,
Это означает, что при концентрации субстрата, когда измерения проводят через равные интервалы
равной Км, начальная скорость реакции ѵ составляет [S]. Чтобы этого избежать, измерения следует прово­
половину максимальной. Отсюда же следует способ дить при таких значениях [S], которые соответ­
оценки Км: надо экспериментально определить кон­ ствуют равным интервалам по шкале обратных ве­
центрацию субстрата, при которой начальная скорость личин.
равна половине максимальной. Альтернативный подход к экспериментальной
Для многих ферментов определение Ѵтах (а зна­ оценке Км и Ѵтш предложили Иди и Хофсти. Уравне­
чит, и/См) непосредственно из графика зависимости ние Михаэлиса — Ментен можно преобразовать
v от [S] оказывается затруднено. Для этого исполь­
зуют уравнение, обратное уравнению Михаэлиса —
Ментен, т. е.
1 К м + [S]
’v Vmax [S]

и представляют его правую часть в виде суммы двух


слагаемых:
І_Км I И
•> Knax [S] K „ ,[S ]'

Отсюда, упростив, получаем


Рис. 8.16. Г рафик Лайнуивера — Бэрка в двойных обратных
! = *м ._L . J _ координатах (зависимость 1jvx от 1/[S]), используемый для
Р К * [S ] графического определения К м и Ѵтах.
Ферменты: кинетика 87

к виду чем скорость диссоциации на фермент + продукт:


к
Щ_ _ _ J _ Клах
Enz— S Enz + Р.
[S] ѴК и к и•
-2
Чтобы найти Км и Ѵтах, строят график зависимости
v/[S] (ось у) от V (ось х). Тогда длина отрезка, отсе­ Из уравнения Михаэлиса — Ментен следует, что ве­
каемого от оси у, будет равна Ѵтах/Км, а отрезка, от­ личина [S3, при которой V = равна
секаемого от оси л:,— Ѵтах. Тангенс угла наклона ра­
вен— \/К м. к2 +
Уравнения Лайнуивера— Бэрка и Иди — Хофсти
[S3 = = *м-
весьма удобны в некоторых случаях, однако для Но если
строгого определения Км и Ѵтах требуется соответ­ к _, » к2
ствующая статистическая обработка.
Оценки Км имеют практическую ценность. При
концентрациях субстрата, в 100 раз превышающих
Кш фермент будет работать практически с макси­
мальной скоростью, поэтому максимальная скорость
( Гтах) будет отражать количество присутствующе­ [SJ = ^ K d.
го активного фермента. Это немаловажное обстояте­
льство используют для оценки содержания фермен­ При этих условиях 1/АГМ= \ 'КА и равно сродству
та в препарате. Значение АГМ позволяет ориентиро­ фермента к субстрату. Если к2 + к_, # к ,, то 1/Км
ваться, какое количество субстрата следует добавить даст заниженную оценку сродства.
для определения Утах. Графики, построенные
в обратных координатах, находят широкое примене­
ние при оценке действия ингибиторов. ОГРАНИЧЕНИЯ, ПРИСУЩИЕ УРАВНЕНИЮ
МИХАЭЛИСА — МЕНТЕН
Некоторые ферменты и другие лигандсвязываю-
Соотношение между ІГМ и К й— константой щие белки, например гемоглобин (см. гл. б и 10), не
диссоциации фермент-субстратного комплекса подчиняются классической кинетике насыщения Ми­
хаэлиса— Ментен. График зависимости ѵ от [S] но­
Сродство фермента к субстрату равно величине, сит в этом случае сигмоидный характер (рис. 8.17).
обратной константе диссоциации Кл комплекса Enz— S: Это обычно указывает на кооперативное связывание
к субстрата многими центрами — связывание с одним
Enz + S Л Enz— S, центром влияет на связывание с другим, как это про­
исходит с гемоглобином (гл. 6).

Иными словами, чем слабее выражена тенденция


фермент-субстратного комплекса к диссоциации, оо
тем выше сродство фермента к субстрату.
Мерой Кй может ориентировочно служить значе­
ние Км для данного фермента по отношению к его
субстрату. Однако это возможно только в том слу­
чае, если справедливо допущение, использовавшееся
при выводе уравнения Михаэлиса— Ментен. Оно со­
стояло в том, что первая стадия ферментативной ре­
акции
к
Enz + S Enz— S
к
-1

идет быстро и при этом всегда на этой стадии под­


держивается равновесие. Другими словами, скоро­
сть диссоциации Enz— S на Enz + S намного выше, Рис. 8.17. Сигмоидная кинетическая кривая с насыщением.
88 Глава 8

В таком случае описанный выше метод графиче­ ИНГИБИРОВАНИЕ АКТИВНОСТИ


ской оценки концентрации субстрата, при которой ФЕРМЕНТОВ
скорость реакции составляет половину максималь­
Различают два больших класса ингибиторов фер­
ной, оказывается непригодным (прямой в соответ­
ментативной активности— конкурентные и неконку­
ствующих координатах уже не получается). Здесь
рентные— на основании того, ослабляется (конку­
следует обратиться к графическому представлению
рентное ингибирование) или не ослабляется (некон­
уравнения Хилла, первоначально предложенного
курентное ингибирование) их ингибирующее дей­
для описания кооперативного связывания 0 2 с гемо­
ствие при повышении концентрации субстрата. На
глобином (гл. 6). Уравнение Хилла, преобразован­
практике многие ингибиторы не проявляют тех
ное так, чтобы график в соответствующих координа­
свойств, которые характерны для чисто конкурент­
тах представлял собой прямую, имеет вид
ного или чисто неконкурентного ингибирования.
V Другой способ классификации ингибиторов основы­
log—--------= wlog[S] - log к',
Knax - Г вается на характере места их связывания. Одни из
где к' — константа. Из уравнения следует, что в усло­ них связываются с ферментом в том же месте, что
виях, когда [S] мало по сравнению с к', скорость реак­ и субстрат (в каталитическом центре), а другие— на
ции возрастает как п-я степень [S]. На рис. 8.18 приве­ значительном расстоянии от активного центра (в ал­
ден график Хилла, построенный по кинетическим лостерическом центре).
данным для фермента, характеризующегося коопе­
ративным связыванием субстрата. График зависи­ Конкурентное ингибирование аналогами
мости log (v/VmaK— ѵ) от log [S] представляет собой субстрата
прямую с тангенсом угла наклона, равным и, где п —
эмпирический параметр, зависящий от числа суб- Классическое конкуретное ингибирование осно­
стратсвязывающих центров и характера взаимодей­ вано на связывании ингибитора с субстратсвязываю-
ствия между ними. При п = 1 связывающие центры щим (каталитическим) центром. Химическая струк­
не зависят друг от друга. При п > 1 между центрами тура аналога субстрата, действующего как ингиби­
имеется кооперативное взаимодействие; чем больше тор (I), обычно сходна со структурой субстрата (S).
и, тем выше степень кооперативности и тем более Поэтому ингибитор может обратимо связываться
выражена сигмоидность кривых насыщения. При с ферментом, образуя вместо Enz — S комплекс
п < 1 говорят об отрицательной кооперативности. Enz — I, т.е. фермент-ингибиторный комплекс. Ког­
Когда скорость реакции равна половине макси­ да в реакционной смеси одновременно присутствуют
мальной (г = Ѵ ^/2), ѵ/(Vma— v) = 1 и log [ѵ/(Kmax— и субстрат, и ингибитор указанного типа, они конку­
—г)] = 0. Таким образом, чтобы определить величи­ рируют за один и тот же связывающий центр на по­
ну S50 (концентрацию субстрата, при которой скоро­ верхности фермента. Один из наиболее подробно
сть вдвое меньше максимальной), нужно из точки на изученных примеров конкурентного ингибирова­
прямой, для которой log [v/( Vmax—г)] = 0, опустить ния — это ингибирование сукцинатдегидрогеназы
перпендикуляр на ось х. малонатом (I), конкурирующим за один и тот же
центр с субстратом сукцинатом (S).
Сукцинатдегидрогеназа катализирует образова­
ние фумарата в результате отщепления атома водо­
V
рода от каждого из двух а-углеродных атомов сук­
цината (рис. 8.19). Малонат ( ООС—СН2—СОО )
способен связываться с дегидрогеназой, образуя
комплекс Enz — I. От Са-атома малоната отщепле­
ния атома водорода произойти не может. Комплекс
Enz — I может только распадаться на свободный
фермент и ингибитор. Для этой обратимой реакции
к
Enz—I *і Enz + I
к
-I
константа равновесия К, равна

Рис. 8.18. Графический способ определения из уравнения


Хилла концентрации субстрата, при которой скорость ре­ [Enz] [1] к,
акции составляет половину максимальной, в условиях, ког­
да кинетическая кривая носит сигмоидный характер. [Enz— I] /с_!
Ферменты: кинетика 89

Н Графическая оценка констант


I
н -с-со о - н -с -с о о - конкурентного ингибирования
-2 Н II л
“ ООС-С-Н -о о с -с -н На рис. 8.20 приведен типичный случай конку­
I С ук ц и н а т- рентного ингибирования, представленный в форме
Н дегидро­
графика Лайнуивера— Бэрка. Скорость реакции (г)
геназа
Сукцинат Ф умарат
измеряется при разных значениях концентрации S
и при фиксированной концентрации ингибитора.
Рис. 8.19. Сукцинатдегидрогеназвая реакция. Прямые, проведенные через экспериментальные точ­
ки, пересекаются в одной и той же точке на оси у.
Длина отрезка, отсекаемого от оси у, равна 1/Ктах;
Действие конкурентных ингибиторов можно это означает, что при бесконечно большой концентра­
представить в виде следующих реакций: ции S (1/[S) = 0) V будет такой же, что и в отсутствие
Erui - к - Enz + Р ингибитора. Однако длина отрезка, отсекаемого от
тивн.) оси X (а эта величина определяет значение Км), в при­
Enz
EnzS(aKTHBH) -* Enz + Р сутствии ингибитора уменьшается (— 1/А"М< — 1/АГМ).
Таким образом, конкурентный ингибитор повышает
Скорость образования продукта— обычно имен­ кажущееся значение Км (/См) для субстрата. Для про­
но она является объектом измерения — зависит стого конкурентного ингибирования длина отрезка,
только от концентрации комплекса Enz— S. Пред­ отсекаемого от оси х, будет равна
положим, что I очень прочно связывается с фермен­
том (К, мала). Тогда количество свободного фермен­ I
та (Enz), который мог бы присоединять S, образуя
комплекс Enz — S, а затем и Enz + Р, будет весьма
мало. Таким образом, скорость реакции (образова­
ния Р) будет мала. По аналогичным причинам при
той же концентрации слабо связывающегося ингиби­ Определив Км в отсутствие I, можно найти из этого
тора (А* велика) катализируемая реакция существен­ уравнения К Если концентрация добавленного 1
но не замедлится. Предположим теперь, что при значительно превышает концентрацию фермента, то
фиксированной концентрации ингибитора 1 добав­ можно считать [I] равной концентрации добавленно­
ляется все большее количество субстрата S. Это по­ го ингибитора.. Значения К, для ряда аналогов суб­
вышает вероятность образования комплекса Enz — S страта (конкурентных ингибиторов) показывают, ка­
по сравнению с комплексом Enz— I. С ростом отно­ кой из них наиболее эффективен. Ингибиторы с наи­
шения [Enz — S]/[Enz — I] будет расти и скорость ре­ меньшими Kt даже при малых концентрациях могут
акции. При достаточно высокой концентрации оказывать сильное ингибирующее действие.
S концентрация комплекса Enz— I станет исчезающе Многие лекарственные препараты, широко при­
мала. Но тогда скорость катализируемой реакции меняющиеся в клинике, действуют как конкурентные
будет такой же, что и в отсутствие I (рис. 8.20). ингибиторы очень важных ферментов, функциони­
рующих как в микробных, так и в животных клетках.

Обратимое неконкурентное ингибирование


Как следует уже из самого названия, в этом слу­
чае конкуренция между S и I отсутствует. При этом
ингибитор обычно ничем не напоминает S и, как мо­
жно предположить, связывается с другим участком
фермента. Обратимые неконкурентные ингибиторы
понижают максимальную скорость, достижимую при
данном количестве фермента (понижают Fmax), но, как
правило, не влияют на Км. Поскольку I и S связы­
ваются с разными центрами, возможно образование
как комплекса Enz — I, так и комплекса Enz— IS.
Комплекс Enz — IS тоже распадается с образова­
Рис. 8.20. Г рафик Лайнуивера — Бэрка для случая классиче­
ского конкурентного ингибирования. Обратите внимание нием продукта, однако с меньшей скоростью, чем
на полное отсутствие ингибирующего действия при высо­ Enz— S; поэтому реакция будет замедляться, но не
ких значениях [S] (низких значениях (1/[S]). остановится. Таким образом, могут протекать еле-
90 Глава .8

дующие конкурентные реакции: скольку и обратимое, и необратимое неконкурент­


Enzl ное ингибирование характеризуются сходной кине­
тикой.
Enz EnzlS -* Enz + P
* 4 EnzS МОДУЛЯТОРЫ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ
і АКТИВНОСТИ
Enz + Р Поток энергии и вещества (в виде атомов углеро­
На рис. 8.21 представлена зависимость \/v от 1/[S] да) в ходе метаболизма зависит от процессов синтеза
в присутствии и в отсутствие ингибитора (предпола­ ферментов и активации проферментов. Однако про­
гается, что связывание I не приводит к существен­ цессы эти необратимы. Как и все белки млекопитаю­
ным изменениям в работе активного центра). щих, ферменты распадаются на аминокислоты (об­
новление белков). В бактериальных клетках активно­
сть фермента может «разбавляться» из-за распреде­
Необратимое неконкурентное ингибирование ления его среди дочерних клеток, образующихся
Ферментативная активность может уменьшаться в результате последовательных делений. Хотя оба
в присутствии многих «ядов», таких, как иодацета- механизма приводят к уменьшению концентрации
мид, ионы тяжелых металлов (Ag+, Hg2+), оки­ фермента и как следствие к уменьшению каталитиче­
сляющие агенты и т.д. В присутствии одного или ской активности, идут такие процессы медленно
нескольких субстратов или продуктов скорость и сопровождаются большими затратами вещества:
инактивации фермента может снижаться. Тот кине­ представим себе по аналогии, что мы выключали бы
тический анализ, о котором здесь шла речь, может свет, разбивая лампочку, а затем, чтобы снова его
оказаться недостаточным для того, чтобы отличить включить, вкручивали бы новую лампочку. Ясно,
действие ферментных ядов от действия неконкурент­ что гораздо эффективнее регулировать активность
ных обратимых ингибиторов. Обратимое неконку­ фермента, «включая» и «выключая» его. Каталити­
рентное ингибирование встречается сравнительно ческая активность некоторых ключевых ферментов
редко. К сожалению, оно не всегда выявляется, по- действительно регулируется с помощью низкомоле­
кулярных метаболитов (см. гл. 6). Низкомолекуляр­
ные модуляторы, подавляющие ферментативную ак­
тивность, называют отрицательными модуляторами,
а повышающие ее— положительными. Мы рассмо­
трим их в гл. 10 и в последующих главах.

ЛИТЕРАТУРА
Christensen Н. N. Dissociation, Enzyme Kinetics, Bioenergetics,
Saunders, 1975.
Engle P. C. Enzyme Kinetics, Wiley, 1977.
Piszkiwicz D. Kinetics o f Chemical and Enzyme-Catalyzed Re­
actions, Oxford Univ. Press, 1977.
Segel I.H . Enzyme Kinetics. Wiley, 1975.
Sigman D .S., Mooser G. Chemical studies o f enfcyme active si­
tes, Ann. Rev. Biochem., 1975, 44, 889.
Van Tamlen E.E. (ed.) Bioorganic Chemistry, Vol. 1, Enzyme
Рис. 8.21. График Л айну ивера — Барка для случая обраіи- Action, 1977; Vol. 2, Macro- and Multimolecular Systems,
мого неконкурентного ингибирования. 1977; Vol. 3, Substrate Behavior, 1978, Academic Press.
Глава 9

Ферменты: механизм действия


Виктор Родуэлл

ВВЕДЕНИЕ ров. Эта его способность не имеет физиологического


В этой главе мы детально опишем каталитиче­ значения, но она успешно используется в экспери­
ское действие протеолитического фермента химо- ментах, направленных на детальное изучение меха­
трипсина, чтобы проиллюстрировать принципы ка­ низма катализа.
тализа, общие для всех ферментов.
л-Нитрофенилацетат, полезный
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ синтетический субстрат

Чем обусловлены столь высокая каталитическая Использование синтетического субстрата «-


эффективность ферментов и их специфичность? Это нитрофенилацетата (рис. 9.1) позволяет определять
одна из фундаментальных научных проблем, хотя активность химотрипсина колориметрическими ме­
некоторые ее аспекты имеют и прикладное значение. тодами, поскольку гидролиз «-нитрофенилацетата
Переход неактивных проферментов в каталитически приводит к образованию «-нитрофенола, который
активное состояние, который наблюдается в клетках в щелочной среде превращается в имеющий желтую
при определенных патологических условиях (напри­ окраску «-нитрофенолят-анион.
мер, при остром панкреатите), приводит к внутри­
клеточному перевариванию и разрушению тканей. Изучение кинетики методом остановленной
Проводя фундаментальные иследования механизма струи
действия ферментов, мы в конце концов сможем,
Кинетику гидролиза «-нитрофенилацетата химо-
используя технологию рекомбинантных ДНК и ме­
трипсином можно изучать с помощью так называе­
тод направленного точечного мутагенеза, система­
мого метода остановленной струи. Метод состоит
тически синтезировать ферменты с более высокой
в смешивании примерно эквимолярных количеств
каталитической активностью или новой специфично­
фермента и субстрата и немедленном (в течение не­
стью. Некоторые из этих «синтетических» фермен­ сколько миллисекунд) измерении. Растворы реаген­
тов могут оказаться мощными терапевтическими
тов заливают в два шприца и с помощью механиче­
агентами. Если мы хотим понять, как действуют ме­
ского устройства одновременно и практически мгно­
таллы на биологические системы, мы тоже должны
венно выталкивают их в очень узкую трубку, прохо­
исследовать их влияние на работу ферментов.
дящую через спектрофотометр. На экран осцилло­
графа выводятся данные об оптической плотности
МЕХАНИЗМ КАТАЛИТИЧЕСКОГО как функции времени, прошедшего с момента сме­
ДЕЙСТВИЯ ХИМОТРИПСИНА шивания.

Природа и специфичность полной реакции


Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных
связей, в которых карбоксильная группа принадле­
жит ароматической аминокислоте (Phe, Туг или Тгр)
или аминокислоте с объемной неполярной R.-
группой (Met).
Как и многие другие протеазы, химотрипсин ка­
тализирует также гидролиз некоторых сложных эфи­ Рис.. 9.1. и-Нитрофенилацетаі.
92 Глава 9

Enz — C H jO H + F — p”= 0 Enz— C H 2 — O — P = 0

О
А .
ДИФФ

Рис. 9.4. Реакция гидроксила Scr 195 в составе химоірипси-


на с диизопропилфторфосфатом (ДИФФ).

Рис. 9.2. Кинетика освобождения л-нитрофснолят-аниона


в ходе гидролиза и-нитрофснилацетата химотрипсином. ре­ химотрипсина в состав комплекса ХТ-Ац с одновре­
гистрируемая методом остановленной струи. Количество менным образованием п-нигрофенолят-аниона. Ос­
выделившегося «-нитрофенола определяется путем измере­ вобождение этого продукта сразу вслед за быстрой
ния оптической плотности.
фазой обусловлено медленным высвобождением хи­
мотрипсина в процессе гидролиза комплекса ХТ-Ац.
Двухфазный характер гидролиза Этот свободный химотрипсин снова включается
л-нитрофенилацетата в реакцию образования комплексов ХТ-ПНФ и
ХТ-Ац, сопровождающуюся выделением п-нитро-
Кинетическая кривая образования п- фенолят-аниона. Количество выделившегося п-нит-
нитрофенолят-аниона имеет две четко различаю­ рофенолят-аниона прямо пропорционально числу
щиеся фазы (рис. 9.2): 1) фаза «выброса», характери­ молей химотрипсина, присутствующего в смеси.
зующаяся быстрым образованием п-
нитрофенолят-аниона, 2) последующее медленное
образование еше некоторого количества п- Роль Ser 195 в катализе
нитрофенолят-аниона. Ацильная группа, входящая в состав интермедиа­
та ацил-XT, связана с высокореакционноспособным
Образование и распад фермент-субстратного остатком серина — Ser 195. Особая роль и высокая
комплекса реакционная способность Ser 195 проявляется в спо­
собности этого остатка (отсутствующей у остальных
Двухфазный характер образования п- 27 сериновых остатков химотрипсина) вступать в ре­
нитрофенолят-аниона можно объяснить, рассматри­ акцию с диизопропилфторфосфатом (ДИФФ) (рис.
вая последовательные стадии катализа, приведенные 9.4). Аналогичные реакции характерны и для других
на рис. 9.3. сериновых протеаз.
Медленная стадия представляет собой гидролиз При модификациии Ser 195 химотрипсин инакти­
химотрипсин-ацетатного комплекса (ХТ-Ац). После вируется. По аналогичному механизму в присут­
того как весь имеющийся химотрипсин перейдет ствии ДИФФ происходит инактивация и ряда других
в состав комплекса, выделение п-нитрофено- протеаз. Все они называются сериновыми протеаза­
лят-аниона замедлится из-за отсутствия свободного ми.
фермента, который освобождается лишь по мере
медленного отщепления от комплекса ацетат-иона
(рис. 9.3). Фаза «выброса» и-нитрофенолят-аниона Система переноса заряда
(рис. 9.2) соответствует переходу всего имеющегося В ходе катализа в молекуле химотрипсина функ­
Фенол H jO Ац
ционирует система переноса заряда, которая служит
каналом переноса протона. Эта система включает
три аминокислотных остатка, далеко отстоящих
Х Т + П Н ф -------------- ► Х Т -П Н Ф ^ » Х Т -А ц L_L XT друг от друга в первичной структуре, но сближенных
в рамках третичной структуры до расстояний, допу­
Быстро Быстро Медленно
скающих возможность взаимодействия. Этими
Рис. 9.3. Промежуточные стадии катализируемого химо­ остатками являются Asp 102, His 57 и Ser 195. Хотя
трипсином гидролиза п-нитрофенилацетата. XT в химотрипсине большинство заряженных остатков
химотрипсин; П Н Ф — и-нитрофенилацетат; ХТ- находится на поверхности молекулы, остатки, из ко­
ПНФ комплекс химотрипейна с и-нитрофенилацетагом; торых формируется система переноса заряда, укры­
ХТ-Ац — ацегилхимотрипсин; фенол я-нитрофено-
лят-анион; Ац ацетат-анион. Образование комплекса ты во внутренней неполярной части молекулы. Три
ХТ-ПНФ 'и ацетилфермента ХТ-Ац идет намного быстрее упомянутых остатка образуют цепочку Asp 102 ...
гидролиза ХТ-Ац. His 57 .... Ser 195.
Ферменты: механизм действия 93

О белка в зрелый белок осуществляется путем избира­


II
— с —о • •••Н— N тельного протеолиза. В пробелке происходит один
А*р V- —^ 1__ 1 или несколько последовательных протеолитических
His С уб (т. в. А ц - ) разрывов, после чего появляется характерная для
I зрелого белка активность (например, ферментатив­
1 ная). К числу белков, синтезируемых в виде пробел­
О
II ков, относятся гормон инсулин (его пробелком
—С—О—Н •N N— Н О — Ser
является проинсулин), пищеварительные ферменты
^ -сЛ пепсин, трипсин и химотрипсин (пробелки —
пепсиноген, трипсиноген и химотрипсиноген), неско­
Рис. 9.5. Функционирование системы переноса протонов лько факторов каскадных систем свертывания крови
в химотрипсинс при ацилировании остатка Ser 195 субстра­
том (Суб~). и растворения кровяного сгустка (см. гл. 55), белок
соединительной ткани коллаген (пробелок—
проколлаген).
Напомним, что Ser 195— это тот самый остаток,
который в ходе катализа подвергается ацилирова­ Почему некоторые белки секретируются в неак­
нию. Сближение ацетат-аниона (образующегося из тивной форме? Дело в том, что есть два типа белков.
ц-нитрофенилацетата) с атомом кислорода R- Одни из них необходимы практически постоянно,
группы Ser 195 приводит к последовательному пере­ надобность же в других (например, ферментах, уча­
носу протона от Ser 195 к His 57 и далее к Asp 102 ствующих в образовании и растворении кровяного
(рис. 9.5). сгустка) возникает лишь эпизодически. Однако когда
В ходе деацилирования комплекса ацил-Ser 195 в этих, в норме отсутствующих, ферментах возни­
протон перемещается в обратном направлении. Ана­ кает реальная потребность, они оказываются необ­
логичный перенос протона, как полагают, происхо­ ходимыми немедленно. Некоторые физиологические
дит и при гидролизе физиологических субстратов хи- процессы, например пищеварение, тоже не идут не­
мотрипсина — пептидов. прерывно, но они более или менее регулярны и пред­
сказуемы (правда, у первобытного человека это мо­
гло быть и не так). В других случаях (например, при
РОЛЬ ИЗБИРАТЕЛЬНОГО ПРОТЕОЛИЗА образовании кровяного сгустка, при его растворении
В ФОРМИРОВАНИИ АКТИВНЫХ или при восстановлении поврежденной ткани) фи­
ЦЕНТРОВ ФЕРМЕНТОВ зиологические процессы являются непосредственной
реакцией на внезапно возникшие физиологические
Превращение прохимотрипснна в химотрипсин потребности организма или патологические
Прохимотрипсин— это полипептид, состоящий состояния. Понятно, что процессы образования кро-
из 245 аминокислотных остатков. Его превращение
в активный фермент, а-химотрипсин, начинается
с протеолитического разрыва, приводящего к обра­
зованию каталитически активного я-химотрипсина
149
(л-ХТ), который далее протеолитически расщепля­
ется еще в трех местах (рис. 9.6). £
13 1 4 1 5 /1 6 146 245
П р о -Х Т

В а-химотрипсине цепи А, В и С (рис. 9.6) оста­


ются связанными друг с другом двумя межцепочеч­
ными дисульфидными связями (рис. 9.7). 1 1 3 ^ 4 15 16 146 ( { 149 245
Л “ t г

Проферменты 2 4 - 1 5 - * /| 4*- 147-148

Многие белки синтезируются и секретируются іб 146 149 245


о -Х Т
в форме неактивных белков-предшественников, ко­
торые называют пробелками. В тех случаях, когда Рис. 9.6. Схема превращения прохимотрнпсина (про-ХТ)
белки являются ферментами, пробелки называют в л-химотрипсин (л-ХТ) и далее в зрелый, каталитически
активный а-химотрипсин (а-ХТ).
проферментами или зимогенами. Превращение про-

Рис. 9.7. Схема внутри- и межцепочечных дисульфидных связей в а-химотрипсине (а-ХТ).


94 Глава 9

вяного сгустка и его растворения должны быть УПОРЯДОЧЕННОЕ И НЕУПОРЯДОЧЕННОЕ


скоординированы, чтобы был достигнут гемостаз. СВЯЗЫВАНИЕ СУБСТРАТОВ
Наконец, следует указать, что синтез протеаз в виде
каталитически неактивных предшественников защи­ Многие ферменты катализируют реакцию между
щает ткани, в которых они синтезируются (напри­ двумя и более субстратами, в результате которой
мер. ткань поджелудочной железы), от самоперева- образуется один или несколько продуктов. Для про­
ривания (такое самопереваривание наблюдается при текания одних ферментативных реакций необходимо
панкреатите). одновременное присутствие всех субстратов. В дру­
Синтез новых белков, потребность в которых гих случаях фермент сначала взаимодействует с од­
обусловливается патологическими факторами (на­ ним субстратом, а затем катализирует его реакцию
пример, потерей крови), может осуществляться до­ с другим субстратом. Связывание субстратов может
вольно быстро. Однако для этого необходимо, чтобы происходить неупорядоченным или упорядоченным
имелся соответствующий и достаточно полный пул образом (рис. 9.8).
аминокислот; кроме того, процесс секреции может Многие ферментативные реакции, требующие
оказаться слишком медленным, чтобы удовлетво­ обязательного присутствия коферментов, проте­
рить внезапно возникшую физиологическую потреб­ кают по «челночному» механизму, при котором фер­
ность в том или ином белке. мент попеременно находится в состояниях Е и Е'
Рассмотрим общие принципы превращения про­ (рис. 9.9 и 9.10).
белка в зрелую, физиологически активную форму. Хотя кофермент часто может рассматриваться
1. Процесс включает избирательный протеолиз, как второй субстрат, некоторые коферменты кова­
в некоторых случаях он сводится к осуществлению лентно связываются с ферментом или связываются
единственного протеолитического разрыва. нековалентно, но настолько прочно, что диссоциа­
2. Полипептидные продукты могут далее функ­ ции практически не наблюдается (тиаминпирофос-
ционировать как индивидуальные молекулы или же фат). В этих случаях мы считаем,- что ферментом
могут оставаться ассоциированными друг с другом служит весь фермент-коферментный комплекс.
в зрелой форме белка.
3. Процесс можег (но необязательно) сопрово­ ФЕРМЕНТЫ КАК КАТАЛИЗАТОРЫ
ждаться значительными изменениями молекулярной ОБЩЕГО КИСЛОТНОГО
массы. И ОБЩЕГО ОСНОВНОГО ТИПА
4. Главным следствием избирательного протео­
После связывания субстрата в области каталити­
лиза является изменение конформации молекулы.
ческого центра заряженные (или способные нести за­
5. Если пробелок превращается в фермент, то
ряд) функциональные группы боковых цепей могут
указанные выше конформационные изменения иг­
рают важную роль в формировании каталитическо­
го центра фермента. В этом смысле избирательный
протеолиз профермента можно рассматривать как І— Ш
процесс запуска конформационных изменений, обе­
спечивающих формирование каталитического цен­
тра. р
Обратите внимание, что остатки His 57 и Asp 102 І ^ Е
находятся в составе В-пептида а-химотрипсина, тог­
да как Ser 195 — в С-пептиде (рис. 9.6). Таким обра­ Неу порядоченное
зом, избирательный протеолиз прохимотрипсина
(химотрипсиногена) обеспечивает сближение трех А В
остатков, участвующих в переносе заряда. Этот при­
Е -^ -► Е А ----- ^ > -Е А В -►EPQ ^ О
мер наглядно показывает, как с помощью избирате­
льного протеолиза может формироваться каталити­ Упорядоченное
ческий центр. Следует еще отметить, что каталити­
Рис. 9.8. Неупорядоченное и упорядоченное присоединение
ческие остатки и остатки субстратсвязывающего субстратов А и В к фермецту и высвобождение продуктов
центра, попадая в разные полипептидные цепи, тем Р и О из комплекса с ферментом Е.
не менее оказываются на таких расстояниях друг от
друга, при которых они могут взаимодействовать
с субстратом. Г* г ы U
- ^ ► Е А ------- » - Е Р - ^ » E'— W e 'B ------»-E Q—^ ■»

Рис. 9.9. Схема механизма «пинг-понг» ферментативного


катализа.
Ферменты: механизм действия 95

Ala Руг KG Glu


сно /
CH j NH j I /CHjNH, СНО
Е -С Н О - ■ W -►ЕЕ ■E—CH j NH j ^-►Е -►Е J U E-,сно
\ \ \ \
Ala Руг KG Glu

Рис. 9.10. Механизм «пинг-понг» при переаминировании. Е—СНО и Е—С Н 2 N H 2— комплексы фермента с пиридоксаль-
фосфатом и пиридоксаминфосфатом соответственно. (A la— аланин, Руг пируват, KG - п-кетоглутарат. Glu
глутамат.)

участвовать в катализе в качестве кислотных или ос­ льку SH+ является субстратом лимитирующей ста­
новных катализаторов. дии, возрастет и скорость полной реакции. Матема­
Мы различаем две широкие категории фермента­ тически это можно записать следующим образом:
тивного кислотно-основного катализа: общий ки­
слотный (или основный) и специфический кислотный ^ ^ [Р ] = к [SH ],
(или основный). Скорость реакции = ------
dt
Реакции, скорость которых изменяется при изме­
нении концентрации ионов Н + или Н30 +, но не за­ где Р — продукт, / — время, к — удельная константа
висит от концентрации других кислот или основа­ скорости, [SH+] — концентрация сопряженной ки­
ний, присутствующих в растворе, рассматриваются слотной формы субстрата.
как реакции, осуществляемые в результате специфи­ Поскольку концентрация SH+ зависит одновре­
ческого кислотного или специфического основного ка­ менно от концентраций S и Н30 +, общее выражение
тализа. Реакции, скорость которых зависит от при­ для скорости реакции, катализируемой по типу спе­
сутствия в растворе любых кислот (доноров прото­ цифического кислотного катализа, примет вид
нов) и любых оснований (акцепторов протонов),
рассматриваются как реакции, осуществляемые в ре­
зультате общего кислотного или общего основного ка­ ^Ер= і с 'і З і [ н , о ч .
тализа.
Для того чтобы решить, какой именно катализ
имеет место в данной ферментативной реакции — Обратите внимание на свойственную специфическо­
общий или специфический кислотный или основ­ му кислотному катализу особенность: в выражение
ный,— нужно измерить скорость реакции в следую­ для скорости реакции входят только члены [S]
щих условиях: 1) при различных pH, но при постоян­ и [Н3ОЧ.
ной концентрации буфера; 2) при фиксированном Рассмотрим теперь в дополнение к описанному
pH, но при различных концентрациях буфера. выше специфическому кислотному катализу также
Если скорость реакции при постоянной концентра­ и катализ, осуществляемый ионом имидазолия ими­
ции буфера изменяется с изменением pH, то имеет дазольного буфера. Поскольку имидазол — это сла­
место специфический основный катализ (при pH > 7) бая кислота (рКа 7), он является плохим донором
или специфический кислотный катализ (при pH < 7). протонов; поэтому реакция
Если же скорость реакции при фиксированном pH S + Имидазол Н + -+ SH+ + Имидазол
возрастает с повышением концентрации буфера, то протекает медленно и лимитирует скорость полной
осуществляется общий основный катализ (при реакции. Отметим, что быстрая и медленная стадии
pH > 7) или общий кислотный катализ (при pH < 7). в случаях специфического и общего кислотного ката­
В качестве примера специфического кислотного лиза меняются местами. Выражение для скорости
катализа рассмотрим превращение субстрата S реакции в случае общего кислотного катализа часто
в продукт Р. Реакция протекает в две стадии: за бы­ имеет довольно сложный вид и поэтому здесь не
строй стадией, включающей обратимый перенос рассматривается.
протона:
S+ Н30 + SH* + н 2о,
ИОНЫ МЕТАЛЛОВ
следует более медленная, лимитирующая скорость
всего процесса стадия превращения протонирован- Свыше 25% всех ферментов содержат прочно
ного субстрата в продукт: связанные ионы металлов или активны только в их
присутствии. Для изучения функций ионов металлов
SH+ + Н20 ? ± Р - | - Н 30 +.
используются методы рентгеновской кристаллогра­
Повышая концентрацию ионов гидрония фии, ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и элек­
[Н30 +], мы повышаем концентрацию SH +— тронного парамагнитного резонанса (ЭПР). В соче­
сопряженной кислотной формы субстрата; поско­ тании со сведениями об образовании и распаде ме-
96 Г tшва 9

таллсодержащих комплексов и о реакциях, в кото­ Комплексы с мостиковым ферментом


рых затрагивается координационная сфера ионов (М — Enz— S)
металлов, данные, полученные этими методами, по­
Металлы в комплексах с мостиковым фермен­
зволяют лучше понять роль ионов металлов в фер­
том, по-видимому, выполняют структурную роль,
ментативном катализе. Об этой роли и говорится
поддерживая активную конформацию (примером
ниже.
служит глутаминсинтаза), или образуют мостик
с другим субстратом (как в пируваткиназе). В пиру-
Металлоферменты и ферменты, ваткиназе ион металла играет не только структур­
активируемые металлами ную роль, но и удерживает один из субстратов (АТР)
Металлоферменты содержат определенное коли­ и активирует его:
чество ионов металлов, имеющих функциональное
значение и остающихся связанными с молекулой /V
Пируваткиназа—АТР
фермента в ходе его очистки. Ферменты, активируе­ хКреатин.
мые металлами, связывают последние менее прочно,
но для своей активности требуют добавления метал­
лов в среду. Таким образом, разграничение между Комплексы с мостиковым субстратом
металлоферментами и ферментами, активируемыми
Образование тройных комплексов с мостиковым
металлами, основано на сродстве данного фермента субстратом, которое наблюдается при взаимодей­
к иону «своего» металла. Механизмы, основанные на ствии ферментов с нуклеозидтрифосфатами, по-
участии ионов металлов в катализе, в обоих случаях,
видимому, связано с выстеснением Н20 из координа­
по-видимому, сходны.
ционной сферы металла, место которой занимает
АТР.
Тройные комплексы фермент— металл —
субстрат А Т Р" + М(Н20 )2+6 АТР— М(Н20 ) 2, + ЗН20 .
Для тройных (трехкомпонентных) комплексов, Затем субстрат связывается с ферментом, образуя
включающих каталитический центр (Enz), ион ме­ тройной комплекс:
талла (М) и субстрат (S) со стехиометрией 1:1:1, воз­
можны четыре различных схемы образования: АТР— М(Н20 )2і , + Enz
Enz— S — М М — Enz— S Enz — АТР—М(Н20 )2:ѵ
Комплекс с мостиковым Комплекс с мостиковым
сѵбстратом ферментом В фосфотрансферазных реакциях ионы металлов,
М как полагают, активируют атомы фосфора и обра­
Enz— М — S Enz^ I зуют жесткий полифосфат-адениновый комплекс
S в соответствующей конформации, который вклю­
чается в состав активного четырехкомпонентного
Простой комплекс с Циклический комплекс комплекса.
мостиковым металлом с мостиковым металлом
В случае ферментов, активируемых металлами, Комплексы с мостиковым металлом
реализуются все четыре схемы. Для металлофермен- м
тов образование комплекса Enz— S— М невозмо­
жно, иначе они не могли бы удерживать металл Enz—М—SnnnEnz^ I
в процессе очистки (они находятся в форме Enz — S
— М). Можно сформулировать три общих правила. Кристаллографические данные, а также анализ
1. Большинство (но не все) киназ (АТР:фосфо- первичной структуры показывают, что в активных
трансферазы) образуют комплексы с мостиковым центрах многих белков в связывании металла уча­
субстратом типа E nz—нуклеозид— М. ствует остаток гистидина (примерами служат кар­
2. Фосфотрансферазы, использующие в качестве боксипептидаза А, цитохром с, рубредоксин, мет-
субстрата пируват или фосфоенолпируват, другие миоглобин и метгемоглобин; см. гл. 6). Лимитирую­
ферменты, катализирующие реакции с участием щей стадией образования бинарных (двухкомпо­
фосфоенолпирувата, а также карбоксилазы обра­ нентных) комплексов Enz— М во многих случаях
зуют комплексы с мостиковым металлом. является вытеснение воды из координационной сфе­
3. Данный фермент может быть способен к обра­ ры иона металла. Активация многих пептидаз иона­
зованию мостикового комплекса одного типа с од­ ми металла является медленным процессом,
ним субстратом и другого типа — с другим. длящимся несколько часов. Эта медленная реакция,
Ферменты: механизм действия 97

по всей вероятности, состоит в конформационной Таблица 9.1. Примеры, иллюстрирующие роль ионов ме­
перестройке бинарного комплекса Enz— М, приво­ таллов в механиме действия ферментов"
дящей к формированию активной конформации. Фермент Роль иона металла
Этот процесс можно представить таким образом:
Г истидиндезаминаза Маскирование нуклеофила
Связывание металла' Киназы, лиазы, пируватде- Активация электрофила
Быстрая карбоксилаза
стадия Карбоангидраза Активация нуклеофила
Enz + М (Н20 )6----- »-Enz— М (Н20 )6_и + wH20 Кобамидные ферменты Металл действует как ну­
клеофил
Пируваткарбоксилаза, кар­ Удаление л-электронов
Перестройка с образованием активной конформации боксипептидаза, алко-
(Enz*): гольдегидрогеназа
Негемовые железопротеи­ М еталл служит донором
Медленная ны л-электронов
стадия Пируваткиназа, пируват­ Ион металла связывает ли­
карбоксилаза, адени- ганды и ориентирует их
Enz— М (Н 20 ) 6_и ------- ►Enz*— М (Н 20 ) 6_„. латкиназа друг относительно дру­
га
В случае металлоферментов образование тройно­ Фосфотрансфераза, D -кси- Индукция напряженного со­
го комплекса с мостиковым металлом должно про­ лозоизомераза, гемо­ стояния
исходить путем присоединения субстрата к бинарно­ протеины
му комплексу:
Из работы Mildvan А. S.: Metals in enzyme catalysis. Vol. 2,
М p. 456 in: E n z y m e s , Boyer P. D., Lardy H., Myrbäck К. (editors). Aca­
demic Press. 1970, с изменениями.
Enz—М + S ~ Enz-M-SwwiEnz^ |
S
pa металла может обеспечивать контактирование
фермента и субстрата (сближение) либо путем обра­
Роль металлов в катализе зования хелатов переводить фермент или субстрат
Ионы металлов могут участвовать в каждом из в напряженное состояние. Ион металла может ма­
четырех известных типов механизмов, с помощью скировать нуклеофил, предотвращая побочные реак­
которых ферменты ускоряют химические реакции: 1) ции. Наконец, возможен стереохимический контроль
общий кислотно-основный катализ; 2) ковалентный хода ферментативной реакции, который обеспечи­
катализ; 3) сближение реактантов; 4) индукция на­ вается способностью координационной сферы ме­
пряжения в ферменте или субстрате. Помимо ионов талла играть роль трехмерной матрицы, удержи­
железа, которые функционируют в гемсодержащих вающей реагирующие группы в нужной простран­
белках, в ферментативном катализе чаще всего уча­ ственной ориентации (табл. 9.1).
ствуют Mg2+, Мп2+ и Са2+, хотя в работе некото­
рых ферментов важную роль играют и другие ионы
(например, К +).
Ионы металлов, как и протоны, являются льюи- ЛИТЕРАТУРА
совыми кислотами (электрофилами) и могут образо­ Crane F. Hydroquinone dehydrogenases, Annu. Rev. Biochem.,
вывать со своими лигандами 5-связь за счет поде­ 1977, 46, 439.
ленной электронной пары. Ионы металлов можно Fersht A. Enzyme Structure and Mechanism, 2nd ed., Freeman,
рассматривать также как «сверхкислоты», поскольку 1985. [Имеется перевод 1-го издания: Фёршт Э. Струк­
они устойчивы в нейтральном растворе, часто несут тура и механизм действия ферментов.— М.: Мир,
1980.]
положительный заряд (> 1) и способны к образова­
Kraut J. Serine proteases: Structure and mechanism of catalysis,
нию л-связей. Кроме того (в отличие от протонов), Annu. Rev. Biochem., 1977, 46, 331.
металлы могут служить трехмерной матрицей, Mildvan A. S. Mechanism of enzyme action, Annu. Rev. Bio­
ориентирующей основные группы фермента или суб­ chem., 1974, 43, 357.
страта. Purich D .L . (ed.) Enzyme kinetics and mechanisms. Parts
Ионы металлов могут функционировать как ак­ A and B. In: Methods in Enzymology, Vol. 63, 1979; Vol.
цепторы электронов с образованием 5- или л-связей, 64, 1980, Academic Press.
активируя электрофилы или нуклеофилы (общий ки­ Wimmer M .J., Rose I. A. Mechanisms o f enzyme-catalyzed
слотно-основный катализ). Металлы могут активи­ group transfer reactions, Annu. Rev. Biochem., 1978, 47,
1031.
ровать нуклеофилы, отдавая электроны, или же сами
Wood H .G ., Barden R .E . Biotin enzymes, Annu. Rev. Bioc­
действовать как нуклеофилы. Координационная сфе- hem., 1977, 46, 385.
4 1573
Глава 10

Ферменты: регуляция активности


Виктор Родуэлл

ВВЕДЕНИЕ выше областей биомедицины, связанная с действием


лекарств: здесь мы тоже обнаруживаем множество
В этой главе мы рассмотрим на нескольких при­ примеров, свидетельствующих о важности процес­
мерах механизмы регуляции метаболических про­ сов регуляции работы ферментов. В частности,
цессов, в которых участвуют ферменты. При этом известно, что введение некоторых лекарств приво­
мы постараемся обрисовать общую картину регуля­ дит к усилению синтеза ряда ферментов (эти лекар­
ции. В дальнейшем в этой книге мы не раз встре­ ства действуют как индукторы ферментов). Напри­
тимся и со многими другими примерами, иллюстри­ мер, фенобарбитал приводит к значительному (в 3 —
рующими многообразие процессов регуляции мета­ 5 раз) увеличению содержания микросомного фер­
болизма. мента цитохрома Р-450, который играет централь­
ную роль в метаболизме самого фенобарбитала
БИОМЕДИЦИНСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ и многих других лекарственных препаратов. Один из
таких препаратов— варфарин, препятствующий
Механизмы, посредством которых клетки и це­ свертыванию крови. Если больной принимает вар­
лые организмы координируют и регулируют весь на­ фарин, а затем ему назначают фенобарбитал, то до­
бор метаболических процессов, представляют инте­ за варфарина должна быть существенно увеличена,
рес для ученых, работающих в самых разных обла­ чтобы компенсировать его разрушение под дей­
стях биомедицинских наук. Сюда можно отнести ствием индуцированного цитохрома /М50. Индук­
проблемы канцерогенеза, сердечно-сосудистых забо­ ция ферментов— это один из важных биохимиче­
леваний, старения, физиологии микроорганизмов, ских механизмов взаимообусловленного действия
дифференцировки, метаморфоза, действия гормонов лекарств, когда прием одного препарата сопровож­
и лекарственных препаратов. Во всех этих областях дается значительным изменением в метаболизме
наблюдаются примеры нарушений регуляции рабо­ другого.
ты ферментов, имеющие важное медицинское значе­
ние. Например, изучение экспериментальных опухо­
РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА
лей показывает, что во многих раковых клетках на­
блюдаются нарушения регуляции, приводящие к из­
Гомеостаз
менению пропорций при образовании ферментов
(отсутствие их индукции или репрессии). Это подтвер­ Представление о гомеостатической регуляции
ждает хорошо известное положение, согласно кото­ внутренней среды было введено Клодом Бернаром
рому одним из фундаментальных признаков рако­ в конце XIX в. Эта способность животного поддер­
вых клеток является нарушение системы генетиче­ живать постоянным состав внутриклеточной среды
ского контроля. Или другой пример: некоторые он­ означает, что все необходимые ферментативные ре­
когенные вирусы содержат ген, кодирующий тирози- акции протекают со скоростями, соответствующими
новую протеинкиназу; когда эта киназа экспресси­ изменениям внутренней среды организма и его окру­
руется в клетках хозяина, она фосфорилирует мно­ жения. Клетку или организм можно считать больны­
гие белки и ферменты, которые в норме не фосфори- ми, если они неадекватно реагируют на внутреннее
лированы, что приводит к серьезным изменениям или внешнее воздействие. Чтобы понять механизмы
клеточного фенотипа. Изменения подобного харак­ гомеостаза нормальных клеток и выяснить молеку­
тера, по-видимому, лежат в основе целой категории лярные основы различных заболеваний, важно пред­
клеточных трансформаций, вызываемых онкогенны­ ставить, от каких факторов зависят скорости фер­
ми вирусами. И наконец, последняя из упомянутых ментативных реакций.
Ферменты: регуляция активности 99

Все химические реакции, в том числе и фермента­


тивные, до некоторой степени обратимы 1. Однако
внутри живых клеток такой обратимости может и не
быть, поскольку продукты реакции быстро удаля­
ются в результате других ферментативных реакций.
Поток метаболитов в живых клетках можно уподо­
бить течению воды по водопроводной трубе. Хотя
вода может течь по трубе в обе стороны, на практике
она течет всегда в одном направлении. Поток мета­
болитов в клетках тоже в основном является однона­
правленным. Истинное равновесие, совершенно не­
характерное для живых существ, устанавливается Рис. 10.1. Схематическое представление клетки в стацио­
нарном состоянии.
лишь после гибели клеток. Живая клетка— это ди­
намическая стационарная система, в которой под­ мов отсутствуют сложные системы гормонального
держивается однонаправленный поток метаболитов и нервного контроля и молекулярные процессы
(рис. 10.1). В зрелых клетках средние концентрации можно исследовать генетическими методами. Од­
метаболитов в течение длительного периода време­ нако сейчас мы имеем возможность всесторонне
ни остаются примерно постоянными12. Гибкость изучать механизмы регуляции на молекулярном уров­
стационарной системы обеспечивается всевоз­ не и в животных клетках.
можными подстроечными и компенсационными про­ Для изучения заболеваний, связанных с наруше­
цессами, с помощью которых организм поддерживает ниями метаболизма, и для разработки методов их
постоянство внутренней среды, несмотря на разно­ лечения совершенно необходимо иметь представле­
образие диеты, различия в количестве потребляемой ние о регуляторных процессах, осуществляющихся
жидкости и поступающих минеральных веществ, в клетках человека. В то же время регуляция на мо­
объеме выполняемой работы и температуре окру­ лекулярном уровне многих метаболических процес­
жающей среды. сов у млекопитающих изучена недостаточно. Ясно,
что регуляция метаболизма у млекопитающих суще­
ственно отличается от внешне сходных процессов
Общая картина регуляции метаболизма у бактерий. Тем не менее мы все же рассмотрим эти
вопросы именно для бактерий, поскольку это позво­
Для нормального функционирования организма лит нам охарактеризовать общие принципы регуля­
должна осуществляться точная регуляция потока ции, которые сохраняют свое значение и при изуче­
метаболитов по анаболическим и катаболическим нии процессов регуляции у человека.
путям. Все сопутствующие химические процессы
должны протекать со скоростями, отвечающими
требованиям организма как целого в условиях окру­ Способы регуляции работы ферментов
жающей среды. Генерация АТР, синтез макромоле­ Поток углерода, «проходящий» через ту или
кул, транспорт, секреция, реабсорбция в почеч­ иную ферментативную реакцию, можно регулиро­
ных канальцах должны чутко реагировать на самые вать, изменяя следующие параметры: 1) абсолютное
небольшие изменения в окружении, в котором нахо­ количество присутствующего фермента; 2) пул ре­
дится клетка, орган, животное. Эти процессы долж­ агентов (помимо фермента); 3) каталитическую
ны быть скоординированы и отвечать на изменения эффективность фермента. Большинство форм жизни
во внешней среде (например, на поступление пи­ использует все три типа регуляции.
тательных веществ или их удаление), а также
на периодически происходящие внутриклеточные
события (например, репликацию ДНК). До недавнего РЕГУЛЯЦИЯ КОЛИЧЕСТВА ФЕРМЕНТА
времени детали регуляции на молекулярном уровне ПУТЕМ РЕГУЛЯЦИИ СКОРОСТИ
изучались только на бактериях; у этих организ- ЕГО СИНТЕЗА И РАСПАДА

Общие принципы
Абсолютное количество фермента в клетке опре­
1 Легко обратимая реакция характеризуется малым по
деляется скоростями его синтеза (/ссинт) и распада
асболютной величине A U. Реакции с большим отрицатель­
ным A G для большинства биохимических систем могут
(fcpacn) (рис. 10.2). Соответственно количество фер­
считаться практически необратимыми. мента увеличивается либо в результате повышения
2 При этом, однако, наблюдаются кратковременные скорости его синтеза (увеличением fcclWT), либо сниже­
колебания концентраций метаболитов и содержания фер­ ния скорости распада (уменьшением к ^ ) , либо
ментов, которые имеют важное физиологическое значение. обоими способами сразу. Подобным же образом ко-

100 Г шва 10

Фермент торая распадается на глюкозу и галактозу. Если


в питательную среду добавить лактозу или некото­
рые другие ß-галактозиды, то индуцируется синтез
ß-галактозидазы, и культура клеток обретает спо­
собность сбраживать лактозу.
Аминокислоты
Индуктор (лактоза) является субстратом индуци­
руемого белка (ß-галактозидазы). Многие индукто­
Рис. 10.2. К оличество ф ерм ен та определяется б алан сом ры одновременно служат субстратами ферментов,
процессов его синтеза и распада. которые они индуцируют, однако в роли индукторов
могут выступать и соединения, структурно сходные
личество фермента уменьшается в результате либо с субстратом, но сами не являющиеся субстратами.
уменьшения £синт, либо увеличения /грасп, либо и тем И наоборот, соединение может быть субстратом, но
и другим путем. В клетках человека может происхо­ не являться индуктором. Нередко какое-либо соеди­
дить изменение и кс„т, и к ^ . У всех живых организ­ нение индуцирует сразу несколько ферментов данно­
мов синтез ферментов (и всех других белков) из ами­ го катаболического пути. В этих случаях говорят,
нокислот и распад фермента (белка) на аминокисло­ что структурные гены, кодирующие группу катабо-
ты представляют собой разные процессы, которые лических ферментов, составляют оперон, и все фер­
катализируются совершенно разными наборами менты, кодируемые генами оперона, индуцируются
ферментов. В этих условиях легко осуществляется единственным индуктором (координированная ин­
независимая регуляция скорости синтеза фермента дукция). Способность регулировать синтез фермен­
и скорости его распада. тов с помощью того или иного питательного ве­
щества позволяет бактерии использовать это пита­
тельное вещество с максимальным для себя преи­
Синтез ферментов детерминируется муществом; в то же время «ненужные» ферменты
информацией, содержащейся в Д Н К бактерия не синтезирует.
Первичная структура фермента, как и любого Ферменты, концентрация которых в клетке не за­
другого белка, определяется той информацией, кото­ висит от добавления индукторов, называются кон­
рая записана в информационной (матричной) РНК ститутивными. Данный фермент может быть консти­
(мРНК) и считывается с помощью трехбуквенного тутивным для одного штамма, индуцируемым для
(триплетного) кода. Нуклеотидная последователь­ другого и вообще отсутствовать в третьем. Обычно
ность мРНК в свою очередь определяется компле­ клетки содержат небольшое, но измеримое количе­
ментарной последовательностью оснований ДНК- ство соответствующего фермента даже в отсутствие
матрицы, т.е. соответствующего гена (см. гл. 38 индуктора. Э то— базовый уровень. Величина откли­
и 40). ка данного организма на введение индуктора опре­
В результате мутаций нуклеотидная последовате­ деляется генетически (см. гл. 41). При индукции раз­
льность ДНК может измениться, и будут синтезиро­ личных штаммов может наблюдаться повышение
ваться белки с измененной первичной структурой. содержания фермента, варьирующее от двукратного
Если новая аминокислота сильно отличается по до тысячекратного. Таким образом, содержащаяся
своим свойствам от исходной, изменения могут в клетке наследственная генетическая информация
охватить высокие уровни структурной организации определяет и характер, и величину реакции на введе­
и может произойти частичная или полная утрата ка­ ние индуктора. Следовательно, понятия «конститу­
талитической активности (впрочем, в редких случаях тивный» и «индуцируемый» относительны: они ха­
наблюдается, напротив, ее повышение). Мутации рактеризуют лишь крайние точки всего спектра воз­
в различных генетических локусах могут приводить можных реакций.
к нарушению синтеза самых разных ферментов и тем Индукция ферментов наблюдается и у эукариот.
самым к развитию многих генетических заболева­ Примерами индуцируемых ферментов у млекопи­
ний. тающих являются триптофанпирролаза, треонинде-
гидраза, тирозин-а-оксоглутарат—трансаминаза,
Индукция ферментов инвертаза, ферменты цикла мочевины, HMG-
СоА-редуктаза и цитохром Р-450.
Клетки могут синтезировать специфические фер­
менты в ответ на присутствие специфических низко­
Репрессия и дерепрессия ферментов
молекулярных индукторов. Индукцию ферментов
можно проиллюстрировать на следующем примере. Бактерии, способные синтезировать определен­
Клетки Escherichia coli, выращенные на глюкозе, не ный метаболит, при наличии этого метаболита
способны сбраживать лактозу из-за отсутствия фер­ в среде могут приостановить его синтез в результате
мента ß-галактозидазы, гидролизующей лактозу, ко­ репрессии. В этом случае небольшая молекула, на-
Ферменты: регуляция активности 101

пример пурин или аминокислота, действуя как коре- Аспартат


прессор, блокирует синтез ферментов, участвующих
в биосинтезе самого корепрессора. Например, до­
Аспартокиназа
бавление гистидина в среду, на которой растет бак­
терия Salmonella typhimurium, подавляет (репресси­ EnZj
рует) синтез всех ферментов биосинтеза гистидина;
0-Аспартилфосфат
добавление в среду лейцина репрессирует синтез пер­
вых трех ферментов, которые участвуют исключите­
Enz2
льно в биосинтезе лейцина. В обоих случаях гены
ферментов, ответственных за биосинтез данного ме­
Аслартат-лолуальдегид
таболита, образуют оперон: добавление в среду ко­
нечного продукта биосинтеза, гистидина или лейци­
на, вызывает координированную репрессию. Коорди­ Enz,
нированная репрессия наблюдается не для всех путей
биосинтеза. После удаления из среды корепрессора
или же при истощении его запасов биосинтез соот­
ветствующих ферментов возобновляется. Это явле­
ние называют дерепрессиен. Дерепрессия может быть
координированной и некоординированной.
Приведенные выше примеры иллюстрируют ре­
прессию конечным продуктом по принципу обратной *
связи, характерную для процессов биосинтеза в бак­ ♦
териях. Сходное явление— катаболитная репрес­
сия— состоит в том, что одно из промежуточных со­ Изолейцин
единений в цепочке катаболических ферментативных
реакций репрессирует синтез катаболических фер­
Рис. 10.3. Синтез аминокислот семейства аспартата. Под
ментов. Оно было впервые обнаружено при изучении EnzL и E dZt подразумеваются группы ферментов, уча­
культуры E. coli, растущей на среде, которая содер­ ствующих в биосинтезе лизина и треонина соответственно.
жит в качестве источника углерода не глюкозу, Число стрелок соответствует числу стадий.
а другое соединение (X). Добавление глюкозы ре­
окажутся излишними; их репрессия была бы выгодна
прессировало синтез ферментов, участвующих в ка­
бактерии, поскольку позволила бы более эффектив­
таболизме X. Это явление вначале называли
«эффект глюкозы», но потом обнаружилось, что но использовать имеющиеся питательные вещества.
В присутствии всех конечных продуктов, обра­
сходные эффекты могут вызывать и другие окисляе­
зующихся на различных ответвлениях пути биосин­
мые питательные вещества; поэтому был предложен
теза, может наблюдаться мультивалентная репрес­
термин «катаболитная репрессия». Катаболитная
сия. Это происходит только тогда, когда все конеч­
репрессия осуществляется при участии сАМР. Моле­
ные продукты, синтезируемые данным набором фер­
кулярные механизмы индукции, репрессии и дере­
ментов, присутствуют в избытке. Следовательно,
прессии осуждаются в гл. 41.
В разветвленных процессах биосинтеза, напри­ для полной репрессии аспартокиназы (Enz,) необхо­
димо присутствие не только лизина и треонина, но
мер при биосинтезе аминокислот с разветвленными
боковыми цепями или аминокислот семейства также еще и метионина, и изолейцина.
аспартата, ферменты начальных стадий участвуют
в биосинтезе нескольких аминокислот (рис. 10.3). Обновление ферментов
Если в среду, на которой растут бактерии, добавить
лизин, репрессируется синтез ферментов, участвую­ В быстро растущих бактериях общая скорость
щих исключительно в биосинтезе лизина (EnzL). До­ распада белков составляет около 2% в час. Иное по­
бавление в среду треонина вызывает репрессию фер­ ложение складывается, когда бактерии находятся
ментов, участвующих только в биосинтезе треонина в условиях голодания или их переносят на свежую
(EnzT). Э то— примеры простой репрессии конечным среду, бедную углеродом. В этих условиях распад
продуктом. В то же время ферменты Enz, и Enz2 бактериальных белков идет со скоростью 7—10%
(рис. 10.3) участвуют одновременно в биосинтезе в час.
и лизина, и треонина. Если бы репрессию их синтеза Сочетание процессов синтеза и распада фермен­
вызывал каждый из конечных продуктов по отдель­ тов называют обновлением ферментов. Обновление
ности, то наблюдался бы недостаток другой амино­ происходит и у бактерий, и у млекопитающих, одна­
кислоты. Если же в среду добавить одновременно ко значение распада ферментов как средства регуля­
и лизин, и треонин, то ферменты Enz, и Enz2 ции их количества у бактерий недооценивалось.
102 Глава 10

В клетках млекопитающих обновление белков было нает индукцию субстратом, наблюдающуюся у бак­
обнаружено гораздо раньше, чем у бактерий. Указа­ терий. Для триптофанпирролазы ситуация иная:
ния на этот процесс у человека были получены более в бактериальных клетках Тгр может действовать как
ста лет назад на основании наблюдений за людьми, индуктор (увеличивая &СН11Т), но в тканях млекопи­
получавшими специальную диету. Однако лишь по­ тающих он действует только на процесс распада
сле классических работ Шёнхеймера, начатых неза­ фермента (уменьшает /срасп).
долго до второй мировой войны, было твердо уста­ Содержание ферментов в тканях млекопитающих
новлено, что обновление клеточных белков происхо­ может изменяться в результате действия различных
дит на протяжении всей жизни. Измеряя скорость физиологических и гормональных факторов, а также
включения в данный белок 15N-меченных аминоки­ под влиянием диеты. Известно много примеров та­
слот и скорость утраты метки белком, Шёнхеймер кого рода для разных тканей и различных метаболи­
пришел к выводу, что белки в организме человека ческих путей (табл. 10.1), однако наши знания о мо­
находятся в состоянии «динамического равновесия»; лекулярном механизме процессов носят фрагмен­
это представление позднее было распространено на тарный характер.
другие компоненты организма, включая липиды Глюкокортикоиды повышают концентрацию ти-
и нуклеиновые кислоты. розин-трансаминазы, увеличивая ктт. На этом при­
мере была впервые четко показана гормональная ре­
Регуляция синтеза и распада ферментов гуляция синтеза фермента в тканях млекопитающих.
Инсулин и глюкагон, несмотря на взаимный антаго­
Основные этапы синтеза белков достаточно хо­ низм их физиологического действия, оба независимо
рошо изучены, чего нельзя сказать о процессах ра­ повышают ктт в 4—5 раз. Действие глюкагона, ве­
спада ферментов. Распад ферментов происходит роятно, опосредуется сАМР, который оказывает
в результате их гидролиза протеолитическими фер­ аналогичное гормону действие в органной культуре
ментами, но о механизме регуляции этой протеоли­ печени крысы.
тической активности мало что известно. Установле­
но только, что процессы регуляции могут быть со­
пряжены с расходованием АТР. Чувствительность Превращение проферментов
фермента к протеолизу зависит от его конформации. в активные ферменты
Присутствие или отсутствие субстратов, кофермен-
Ферментативная активность может регулирова­
тов, ионов металлов — все это способно влиять на ться путем превращения неактивного профермента
конформацию белка и его чувствительность к про­
в каталитически активную форму. Чтобы перейти
теолизу. Поэтому скорость распада специфических
в такую форму, профермент должен подвергнуться
ферментов может зависеть от концентрации в клет­ ограниченному протеолизу, сопровождающемуся
ке субстратов, коферментов и, возможно, ио­
конформационными изменениями; при этом проис­
нов. Эти представления можно хорошо проиллю­
ходит либо демаскирование каталитического цен­
стрировать на примере аргиназы и триптофанокси- тра, либо его формирование (см. гл. 8). Синтез
геназы (триптофанпирролазы). Регуляция содержа­ в форме каталитически неактивных проферментов
ния аргиназы в печени может осуществляться путем является характерным свойством пищеварительных
изменения либо /сСИІІГ, либо красп. Переход на обога­ ферментов, а также ферментов системы свертывания
щенную белковую диету приводит к возрастанию со­ крови и системы фибринолиза (см. гл. 55).
держания аргиназы из-за повышения скорости ее
синтеза. Содержание фермента в печени возрастает
также у голодающих животных. Но это обусловлено
снижением скорости распада аргиназы, поскольку
значение ксті остается постоянным. Теперь о ситуа­ РЕГУЛЯЦИЯ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ
ции, которая наблюдается со вторым ферментом: АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ
инъекция млекопитающим глюкокортикоидов, как
и инъекция триптофана, повышает содержание трип-
Определения
тофаноксигеназы. Гормон вызывает повышение ско­
рости синтеза фермента /гсннт, тогда как Тгр не ока­ Если в результате физиологических процессов из­
зывает влияния на &СНН1, а понижает £расп, повышая меняется активность фермента, то мы часто не мо­
устойчивость оксигеназы к протеолизу. Сравним оба жем сказать, чем это обусловлено — изменением ко­
этих примера с индукцией ферментов у бактерий. личества фермента или эффективности его функцио­
В случае аргиназы повышенное потребление азота нирования. Мы будем называть все изменения актив­
при нахождении на обогащенной белковой диете мо­ ности фермента, происходящие при постоянном коли­
жет увеличить содержание аргиназы (см. гл. 30). По­ честве присутствующего фермента, изменением его
вышение скорости синтеза аргиназы внешне напоми­ каталитической эффективности.
Ферменты: регуляция активности 103

Таблица 10.1. Некоторые ферменты печени крысы, скорость синтеза которых изменяется в зависимости от условий среды"
Фермент Время Внешний стимул Относительное
полуобновления, изменение скорости
t\ 2 . 4 синтеза

Метаболизм аминокислот
Аргиназа 100— 120 Голодание, глюкокортикоиды +2
Переход от обогащенной к бедной белком диете -2
Сериндегидратаза 20 Глюкагон, аминокислоты + 100
Гистидаза 60 Переход от бедной к обогащенной белком диете + 20
Углеводный обмен
Глюкозо- 6-фосфатдегидроге- 15 Гормоны щитовидной железы; переход от бедной + 10
наза диеты к диете с высоким содержанием углево­
дов
D -Глицерофосфатдегидроге- 100 Гормоны щитовидной железы + 10
наза
Ф руктозо-1,6-фосфатаза Глюкоза + 10
Липидный обмен
Цитратлиаза Переход от голодания к диете с высоким содержа- + 30
нием углеводов и низким содержанием жиров
Синтаза жирных кислот Голодание -1 0
Переход от голодания к диете, не содержащей жи­ + 30
ров
HM G-CoA-редуктаза 2—3 Постная диета, 5% холестерола в пище -1 0
Суточные вариации ±5
Инсулин, гормон щитовидной железы от 2 до 10
Метаболизм пуринов и пирими-
динов
Ксантиноксидаза Переход к богатой белками диете -1 0
Аспартат-транскарбамоилаза 60 1 %-ная оротовая кислота +2
Дигидрооротаза 12 1 %-ная оротовая кислота +3

*’ Все данные, за исключением данных по HMG-CoA-редуктазе, взяты из работы Annu. Rev. Biochem. 1970: 39: 929.

Концентрации реактантов наиболее тонкую регуляцию метаболизма. Одновре­


менно при этом возникает новая проблема —
Изучение кинетических и регуляторных свойств
прохождение метаболитов через разделяющие ба­
ферментов позволяет лучше понять характер физио­
рьеры. Эта проблема решается с помощью «челноч­
логических процессов, протекающих в неповрежден­
ных механизмов», переводящих метаболит в форму,
ных клетках, в тканях и целом организме. Однако
которая способна проходить через барьер. Затем по
большая часть информации получена при изучении
другую сторону барьера происходит обратное пре­
ферментов in vitro, в условиях, существенно отли­ вращение метаболита в первоначальную форму.
чающихся от тех, которые имеют место в живых В связи с наличием барьеров возникает потребность
клетках. Поэтому распространение полученных дан­
в функционировании, например, цитозольной и ми­
ных на условия in vivo требует осторожности. На­
тохондриальной форм некоторых ферментов. По­
пример, концентрации субстратов in vitro могут зна­ скольку эти формы фермента физически разделены,
чительно отличаться от тех, которые имеются in vi­
их независимая регуляция облегчается. Роль челноч­
vo. ных механизмов в поддержании равновесия между
метаболическими пулами восстановительных экви­
Компартментация ферментов валентов промежуточных продуктов цикла лимон­
ной кислоты и ряда других интермедиатов обсу­
Роль компартментации (пространственного раз­ ждается в гл. 17.
деления) метаболических процессов в клетках эука­
риот, в том числе в клетках млекопитающих, трудно
Макромолекулярные комплексы
переоценить. Локализация специфических метаболи­
ческих процессов в цитозоле или в клеточных орга- Объединение набора ферментов, катализирую­
неллах облегчает независимую регуляцию этих про­ щих многоступенчатую последовательность метабо­
цессов. Развитая компартментация метаболических лических реакций, в макромолекулярный комплекс
процессов особенно характерна для высших форм позволяет координировать работу ферментов и ка­
живых организмов — она позволяет осуществлять нализирует перемещения интермедиатов по метабо-
104 Глава Ю

лическому пути. Адекватное взаимное расположение стве субстрата фигурирует комплекс между АТР
ферментов облегчает перенос продукта от одного и ионом металла, максимальная активность чаще
фермента к другому без его предварительного урав­ всего наблюдается при молярном отношении
новешивания с метаболическим пулом. Это обеспе­ ATP/металл ~ 1. Избыток металла или избыток
чивает более эффективный метаболический кон­ АТР оказывает ингибирующее действие. Поскольку
троль, чем в том случае, когда компоненты комплек­ нуклеозидди- и трифосфаты образуют прочные ком­
са изолированы друг от друга. Кроме того, конфор- плексы с двухвалентными катионами, внутриклеточ­
мационные изменения в одном из компоненте мо­ ные концентрации нуклеотидов сказываются и на
гут передаваться через межбелковые взаимодей­ внутриклеточных концентрациях свободных ионов
ствия на другие компоненты комплекса. Это позво­ металлов, а следовательно, и на активности некото­
ляет усиливать регуляторные эффекты. рых ферментов. Например, в отсутствие ионов ме­
таллов глутаминсинтаза в клетках E. coli принимает
«релаксированную», каталитически неактивную кон­
Эффективные концентрации субстратов, формацию. Ионы Mg2+ или Мп2+ превращают синта­
зу в активную, «напряженную» форму. Кроме того,
коферментов и катионов
аденилирование синтазы меняет ее специфичность —
Средние внутриклеточные концентрации субстра­ фермент отдает предпочтение уже не Mg2+, а Мп2+.
та, кофермента или ионов металлов мало что могут И наконец, активность аденилированного фермента
сказать нам о поведении фермента in vivo. Необхо­ становится чувствительной к отношению ATP/Mg2+,
димо иметь информацию о концентрациях соответ­ тогда как неаденилированная форма этой особенно­
ствующих метаболитов в непосредственном окруже­ стью не обладает.
нии рассматриваемого фермента. Однако даже изме­
рение концентрации метаболита в отдельных ком- АЛЛОСТЕРИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ
партментах клетки не позволяет учесть локальные
перепады его концентрации внутри компартмента, Принципы
обусловленные, например, приближением к месту
поступления или синтеза метаболита. Наконец, да­ Каталитическая активность некоторых регуля­
леко не всегда обращают достаточное внимание на торных ферментов может модулироваться низкомо­
различие между общей концентрацией метаболита лекулярными аллостерическими эффекторами,
и концентрацией свободного метаболита. Напри­ обычно имеющими либо незначительное структур­
мер, общая концентрация 2,3-бисфосфоглицерата ное сходство с субстратами или с коферментами ре­
в эритроцитах очень велика, тогда как концентрация гулируемого ими фермента, либо не имеющими его
свободного бисфосфоглицерата в этих клетках срав­ вообще. Ингибирование фермента, катализирующе­
нима с его концентрацией в других тканях. Эритро­ го одну из реакций в цепи, конечным продуктом этой
циты содержат приблизительно 5 ммолей гемогло­ цепи называют ингибированием по принципу обратной
бина, которые связывают 1 моль бисфосфоглицера­ связи. В цепи реакций биосинтеза D из А, катализи­
та на моль дезоксигенированного тетрамера. Поэто­ руемой ферментами Enz,, ... Enz3:
му при общем содержании бисфосфоглицерата E n z, _ E n z E n /,
4 ммоля концентрация свободного бисфосфоглицера­ -> В С D,
та в эритроцитах венозной крови оказывается значи­
тельно меньше. Подобные же явления наблюдаются при высоких концентрациях D обычно наблюдается
и в случае других метаболитов в присутствии эффек­ ингибирование превращения А в В. Это не простое
тивно связывающих их белков, значительно пони­ «обращение» реакции, связанное с накоплением про­
жающих концентрацию свободных метаболитов. межуточных продуктов, а следствие того, что про­
Кинетический анализ Михаэлиса — Ментен осно­ дукт D способен связываться с ферментом Enz,, вы­
ван на предположении, что общая концентрация суб­ ступая в качестве его ингибитора. Таким образом, D
страта равна концентрации свободного субстрата. действует как отрицательный аллостерический эффек­
Как мы видим, in vivo это предположение может не тор фермента, или ингибитор, действующий по прин­
выполняться, поскольку в этом случае концентрация ципу обратной связи. Следовательно, ингибирова­
свободного субстрата часто бывает примерно того ние Enz, под действием D регулирует синтез D.
же порядка, что и концентрация фермента. Обычно D связывается с ингибируемым ферментом
Ионы металлов, играющие каталитическую в аллостерическом центре, удаленном от каталитиче­
и структурную роль в действии многих ферментов (в ского центра.
их число попадает свыше четверти всех известных В кинетическом плане ингибирование по принци­
ферментов, см. гл. 9), могут осуществлять и регуля­ пу обратной связи может быть конкурентным, не­
торные функции, особенно в тех случаях, когда суб­ конкурентным, частично конкурентным и смешан­
стратом служит АТР. В реакциях, в которых в каче­ ным. Ингибирование по принципу обратной связи
Ферменты: регуляция активности 105

характерно для биосинтетических путей. Очень часто


ингибитор, действующий по принципу обратной связи,
является последней малой молекулой перед синтезом
макромолекулы (например, аминокислотой, если
речь идет о синтезе белков, или нуклеотидом в синте­
зе нуклеиновых кислот). Регуляция по принципу
обратной связи обычно происходит на первой функцио­
нально необратимой1 стадии, уникальной для данной
цепи реакций биосинтеза. Рис. 10.4. Ингибирование по принципу обратной связи на
Примерами ингибирования по принципу обрат­ различных участках разветвленного биосинтетического пу­
ти. S ,- S j— промежуточные соединения, образующиеся
ной связи в микроорганизмах могут служить инги­ в ходе биосинтеза конечных продуктов A —D. Прямые
бирование фосфорибозил: АТР— пирофосфорилазы стрелки соответствуют ферментам, катализирующим ука­
гистидином, антранилатсинтазы— триптофаном, занные превращения. Кривыми стрелками указаны петли
аспартаттранскарбамоилазы — под действием СТР. обратной связи и вероятные участки ингибирования по
принципу обратной связи специфическими конечными про­
В каждом случае регуляторный фермент участвует дуктами.
в цепи реакций биосинтеза единственного конечного
продукта — His, Тгр или СТР. гибировании ингибирующее действие двух и более
Цепь реакций биосинтеза часто бывает разветв­ конечных продуктов на один и тот же регулируемый
ленной— ее первые реакции дают начало синтезу фермент строго аддитивно.
сразу двух или большего числа метаболитов. На рис. В случае согласованного или мультивалентного
10.4 указаны вероятные участки в разветвленной це­ ингибирования полное ингибирование наблюдается
пи биосинтеза, по которым осуществляется простое только тогда, когда в избытке одновременно присут­
ингибирование по принципу обратной связи (инги­ ствуют два или более конечных продукта.
биторами могут служить аминокислоты, пурины При кооперативном ингибировании ингибирующее
или пиримидины). S,, S2 и S3 являются предшествен­ действие на регуляторный фермент оказывает избы­
никами всех четырех конечных продуктов (А, В, С ток каждого из конечных продуктов, но ингибирую­
и D), S4— предшественником В и С, a S5— щее действие сразу двух и более конечных продуктов
предшественником только D. Последовательности намного превосходит аддитивный эффект, характер­
S3->A, ный для кумулятивного ингибирования.
S4 —*■В, Еще один вариант регуляции наблюдается в слу­
s4- c , чае ферментов аспартатного семейства: оно вклю­
чает множественные формы ферментов (изозимы),
S3-> S5-> D
каждый из которых имеет свои регуляторные харак­
являются линейными и могут подвергаться ингиби­ теристики. В E. coli синтезируются три аспартокина-
рованию конечными продуктами по принципу зы. Одна из них (AKL) специфически и полностью
обратной связи. ингибируется лизином, другая (АКТ) — треонином,
Более тонкая регуляция осуществляется с помо­ а третья (АКН) — гомосерином, предшественником
щью множественных петель обратной связи (рис. Met, Thr и Ile (рис. 10.6). Избыток Lys ингибирует
10.5). Например, если В присутствует в избытке, то AKl, ч т о приводит к снижению синтеза ß-
снижается потребность в S2. Следовательно, способ­ аспартилфосфата. Но одного только этого еще недо-
ность В ингибировать процесс, в котором сам этот
продукт образуется, представляется биологически
целесообразной. Однако, если избыток В ингиби­
рует не только реакции, которые связаны исключи­
тельно с синтезом В, но и те реакции, которые одно­
временно ведут к синтезу А, С и D, то он будет пре­
пятствовать синтезу всех четырех продуктов. Это,
конечно, нецелесообразно. Впрочем, сформирова­
лись механизмы, позволяющие преодолеть эту труд­
ность.
Существует несколько вариантов ингибирования
по принципу обратной связи. При кумулятивном ин- Ряс. 10.5. Множественное ингибирование по принципу
обратной связи на различных участках разветвленного био­
синтетического пути. Помимо простых петель обратной
1 Имеется в виду реакция, равновесие которой (в тер­ связи (кривые штриховые стрелки) указаны петли (кривые
модинамическом смысле) сильно смещено в одну сторону, сплошные стрелки), регулирующие активность ферментов,
т. е. реакция, характеризующаяся большим по величине от­ общих для процессов биосинтеза нескольких конечных про­
рицательным значением Д G. дуктов.
106 Г. шеи 10

Аспартат Таблица 10.2. Варианты аллостерической регуляции аспар­


токиназы

*
<
a k l АКТ

X
Организм Ингибитор, действующий Репрессор
по принципу обратной
ß-Аспартилфосфат связи

E. coli (киназа I) Гомосерин


E. coti (киназа II) Lys Lys
E. coti (киназа III) Thr
R. rubrum Thr
В. subtilis Thr -I- Lys
/ \
четыре аспартатсвязывающих центра, а каждый ре­
гуляторный— по меньшей мере два СТР-
связывающих (регуляторных) центра. Каждый тип
протомеров находится под независимым генетиче­
ским контролем. Это было показано путем отбора
мутантов, лишенных нормального контроля со сто­
Изолейцин
роны СТР; из этих мутантов были получены ревер-
танты, обладающие практически нормальными ре­
Рис. 10.6. Регуляция активности аспартокиназы (АК) гуляторными свойствами.
в клетках Е.соіі. Изоформы фермента подвергаются изби­
рательному ингибированию отдельными конечными про­
дуктами— лизином (А К ,), треонином (АКТ) и гомосери­ Данные о существовании аллостерических
ном (А К Н). центров у регуляторных ферментов
Примерно в 1963 г. Моно обратил внимание на
статочно, чтобы направить метаболиты на синтез отсутствие структурного сходства между ингибито­
гомосерина и последующих продуктов. Переключе­ ром, действующим на фермент по принципу обрат­
ние на этот канал биосинтеза происходит с помо­ ной связи, и субстратом этого фермента. Отсутствие
щью ингибирования по принципу обратной связи изостеричности с субстратом позволяет говорить об
ферментов, участвующих в следующих звеньях пути аллостеричности соответствующих эффекторов. Ис-
биосинтеза. Лизин ингибирует также первый фер­
мент в последовательности реакций, ведущих от ß- О
и
аспартилфосфата к лизину. Это облегчает неограни­ -О- сN
ченный синтез гомосерина, а, следовательно, также h 2n сн2
треонина и изолейцина. Следующее место регуляции
находится на участке разветвления, из которого од­ I + I
С
на ветвь ведет к метионину, а другая — к треонину П Э зР О ^ Д N СОО-
и изолейцину. W Нэ+
О том, что рассмотренные варианты регуляции Карбамоил- + ЬАсПартат
метаболизма реально функционируют, свидетель­ фосфат
ствуют данные о характере ингибирования конечны­
ми продуктами пути биосинтеза, начинающегося
с аспартата, у различных бактерий (табл. 10.2). Рі Аспартат-
транскарбамоилаза
Наиболее полно изученный аллостерический фер­
мент, аспартат-транскарбамоилаза, катализирует
первую реакцию, уникальную для биосинтеза пири-
мидинов (рис. 10.7). Аспартат-транскарбамоилаза О
ii
(АТКаза) ингибируется по принципу обратной связи О-С
цитидинтрифосфатом (СТР). После обработки рту­ HjN СН,
тьсодержащими реагентами АТКаза теряет чувстви­ н
тельность к СТР, но сохраняет полную активность ^С С'
при синтезе карбамоиласпартата. Это означает, что о N соо
СТР связывается не в тех участках, где находятся Н

центры связывания субстратов, а в специальном ал­ Карбамоил аспартат


лостерическом центре. АТКаза состоит из двух ката­
литических и трех или четырех регуляторных прото­ Рис. 10.7. Реакция, катализируемая аспартат-транс-
меров. Каждый каталитический протомер содержит карбамоилазой (АТКазой).
Ферменты: регуляция активности 107

ходя из этого, Моно предположил, что ферменты, стигать значений.* близких к тем, которые наблю­
регулируемые такими аллостерическими эффектора­ даются в отсутствие ингибитора. Обратите внима­
ми (в частности, ингибиторами по принципу обрат­ ние на аналогию, которая прослеживается в этом
ной связи), связывают эффектор в аллостерическом случае с кривыми насыщения кислородом миоглоби-
центре, физически не совпадающем с каталитическим на и гемоглобина (гл. 6).
центром. Таким образом, аллостерические фермен­ По данным кинетического анализа, ингибирова­
ты — это ферменты, активность каталитического ние по принципу обратной связи может быть конку­
центра которых изменяется под действием аллосте­ рентным, неконкурентным, частично конкурентным
рических эффекторов, связывающихся в аллостери­ или может носить иной характер. Если при высоких
ческом центре. Данные о наличии у регуляторных концентрациях S активность фермента примерно
ферментов физически обособленных аллостериче­ одинакова в присутствии и в отсутствие аллостери­
ских центров сводятся к следующему. ческого ингибитора, то кинетика внешне сходна с ки­
1. Регуляторные ферменты после модификации нетикой конкурентного ингибирования. Однако, по­
химическими или физическими методами часто ста­ скольку кривая насыщения субстратом все-таки но­
новятся нечувствительны к аллостерическим эффек­ сит сигмоидный, а не гиперболический характер, ме­
торам, сохраняя каталитическую активность. Пока­ тод построения графиков в обратных координатах
зана избирательная денатурация аллостерических для аллостерических ингибиторов непригоден; он
центров при действии на ферменты ртутьсодержа­ предложен для конкурентного ингибирования в ка­
щих реагентов, мочевины, рентгеновских лучей, про­ талитическом центре. Поскольку аллостерические
теолитических ферментов, растворов с экстремаль­ ингибиторы связываются с ферментом в другом (ал­
ными значениями ионной силы или pH, при длитель­ лостерическом) центре, исходная кинетическая мо­
ном хранении при 0—5° С, замораживании или на­ дель утрачивает силу.
гревании. Сигмоидный характер зависимости V от [S]
2. Аллостерические эффекторы часто защищают в присутствии аллостерического ингибитора обу­
каталитический центр от денатурации в условиях, словлен эффектом кооперативности. При низких кон­
когда субстрат такого защитного действия не оказы­ центрациях S активность в присутствии ингибитора
вает. Трудно представить себе ситуацию, при кото­ существенно ниже, чем в его отсутствие. Однако при
рой эффектор, связываясь в каталитическом центре, увеличении [S] ингибирующее действие становится
защищает фермент, а субстрат такой способностью менее выраженным. Такая же кинетика наблюдае­
не обладает. Поэтому естественнее предположить, тся. когда имеются два или больше взаимодей­
что эффектор связывается в другом, аллостериче­ ствующих субстратсвязывающих центра: присут­
ском, центре фермента. ствие молекулы субстрата в одном каталитическом
3. Обнаружены мутантные клетки бактерий центре облегчает связывание молекулы второго суб­
и млекопитающих, в которых регуляторные фермен­ страта в другом центре. Кооперативность связыва-
ты имели существенно иные регуляторные свойства,
чем ферменты из клеток дикого типа, но обладали
в точности такими же каталитическими свойствами. оо
Отсюда следует, что структура аллостерического
и каталитического центров детерминируется разны­
ми участками гена.
4. Показано, что связывание субстратов и алло­
стерических эффекторов с регуляторным ферментом
происходит независимо.
5. В некоторых ферментах (например, в АТКазе)
аллостерический и каталитический центры локали­
зованы в разных протомерах.

Кинетика аллостерического ингибирования


На рис. 10.8 представлены зависимости скорости
реакции, катализируемой типичным аллостериче­
ским ферментом, от концентрации субстрата в при­
сутствии и в отсутствие аллостерического ингибито­
ра. В отсутствие ингибитора наблюдается гипербо­
лическая кривая насыщения. В его присутствии кри­
вая приобретает сигмоидный вид; при высоких кон­ Рис. 10.8. Сигмоидная кинетическая кривая насыщения суб­
центрациях субстрата скорость реакции может до­ стратом в присутствии аллостерического ингибитора.
108 Глава 10

ния субстратов была описана в гл. 6 на примере ге­ ствие как раз тогда, когда в нем имеется наибольшая
моглобина. Сигмоидный характер кривой насыще­ необходимость: при низких внутриклеточных кон­
ния гемоглобина кислородом обусловлен коопера­ центрациях субстрата. По мере повышения концен­
тивными взаимодействиями четырех связывающих трации субстрата необходимость в строгой регуля­
0 2 центров, локализованных в разных протомерах. ции уменьшается, поэтому степень ингибирования
понижается, что приводит к образованию большего
Модели аллостерии количества продукта. По аналогии с гемоглобином
сигмоидная кривая насыщения субстратом в присут­
Попытки описать кинетику аллостерического ин­ ствии ингибитора означает, что относительно малые
гибирования как «конкурентную» или «неконкурент­ изменения концентрации субстрата влекут за собой
ную» по отношению к субстрату основаны на чисто большие изменения активности. Это обеспечивает
механической аналогии, которая может ввести в за­ тонкую регуляцию каталитической активности при
блуждение. Поэтому мы будем говорить о двух малых изменениях концентрации субстрата. Нако­
классах регуляторных ферментов— ферментах FC- нец, как и при насыщении кислородом гемоглоби­
ряда и ферментах Ѵ-ряда. Насыщение субстратом нов разных видов животных, для регулятор­
аллостерических ферментов К-ряда выглядит как ных ферментов из разных источников сигмоид­
конкурентный процесс в том смысле, что Км ные кривые насыщения могут быть сдвинуты влево
увеличивается (уменьшается сродство к субстрату), или вправо; это обеспечивает лучшее соответствие
и при этом значение Ѵтях никак не изменяется. В слу­ тем концентрациям субстрата, которые преобла­
чае аллостерических ферментов Ѵ-ряда уменьшается дают in vivo.
Ѵтлх (снижается каталитическая эффективность), но
кажущееся значение Км остается неизменным. Изме­ Регуляция по принципу обратной связи
нения Км или Ѵтм, по всей вероятности, обусловле­ в клетках млекопитающих
ны конформационными изменениями в каталитиче­
ском центре, вызванными связыванием аллостериче­ В клетках млекопитающих, так же как и в бакте­
ского ингибитора в аллостерическом центре. В алло­ риальных клетках, конечные продукты регулируют
стерических ферментах К-ряда эти конформацион- свой собственный синтез по принципу обратной
ные изменения приводят к ослаблению связи между связи. В некоторых случаях (в частности, в случае
субстратом и субстратсвязывающими остатками. АТКазы) ингибирование по принципу обратной
В аллостерических ферментах Ѵ-ряда основной связи направлено на первый из ферментов биосинте­
эффект заключается в изменении ориентации ката­ тической цепи. Однако мы должны различать поня­
литических остатков, что приводит к понижению тия регуляции по принципу обратной связи — общий
Ѵтях. Однако могут наблюдаться и промежуточные термин, не содержащий никаких указаний на меха­
случаи, когда конформационные изменения сказы­ низм,— и ингибирования по принципу обратной
ваются и на Км, и на Ѵтах. связи — механизм регуляции многих ферментов бак­
Для описания регуляции аллостерических фер­ терий и млекопитающих путем ингибирования. На­
ментов были предложены различные модели, однако пример, поступающий с пищей холестерол подав­
вряд ли можно выбрать какую-то одну, способную ляет свой собственный синтез из ацетата в тканях
объяснить поведение всех регуляторных ферментов. млекопитающих. Этот тип регуляции, однако, не на­
Поскольку сигмоидный характер кривой насыще­ правлен непосредственно на ингибирование первого
ния субстратом влечет за собой определенные регу­ фермента пути биосинтеза холестерола. Ингибиро­
ляторные преимущества, любая мутация, приводя­ вание затрагивает один из ферментов (HMG-
щая к сигмоидной кривой насыщения, будет иметь СоА-редуктазу); функционирующий на ранних ста­
тенденцию к закреплению в популяции. Едва ли мо­ диях биосинтеза механизм включает подавление хо-
жно ожидать, что все эти мутации детерминируют лестеролом или его метаболитами экспрессии генов,
один и тот же механизм ингибирования. Поэтому кодирующих образование HMG-CoA-редуктазы.
сигмоидность кинетики еще ничего не говорит о ме­ Холестерол, непосредственно добавленный в систе­
ханизме ингибирования. му с HMG-СоА-редуктазой, никакого действия на ее
каталитическую активность не оказывает.
Физиологические последствия кооперативности
КОВАЛЕНТНАЯ МОДИФИКАЦИЯ
Кооперативность связывания субстратов приво­
ФЕРМЕНТОВ
дит к таким же последствиям, как и кооперативность
связывания О, гемоглобином. При низких концен­
Общие при