Dossier scientifique

Rôle du laboratoire de biologie médicale

dans le diagnostic microbiologique
des bactéries anaérobies
Yann Dumont1,2, Anne-Laure Michon1, Chrislène Laurens1, Lucas Bonzon1, Sylvain Godreuil1,2,
Hélène Jean-Pierre1,*
1 Hôpital Arnaud de Villeneuve, CHU de Montpellier, Laboratoire de bactériologie, Université de Montpellier, 191 avenue du Doyen
Gaston Giraud, 34295 Montpellier Cedex 5, France
2 UMR MIVEGEC IRD-CNRS-Université de Montpellier, IRD, Montpellier, France.
*Auteur correspondant : h-jean_pierre@chu-montpellier.fr (H. Jean-Pierre)

RÉSUMÉ
L’étude des bactéries anaérobies connaît un regain d’intérêt du fait de la description de leur importance dans les micro-
biotes et dans les processus infectieux. De nombreux outils commercialisés (milieux de transport, géloses et bouillons,
systèmes assurant l’anaérobiose) permettent à ce jour leur culture à partir des échantillons cliniques. La spectrométrie de
masse de type MALDI-TOF, éventuellement complétée par le séquençage de l’ARN 16S, a révolutionné leur identification,
y compris pour des espèces d’isolement moins fréquent, et diminué considérablement le délai de rendu des résultats. Les
techniques phénotypiques conventionnelles, s’appuyant sur une série de tests facilement utilisables en routine et peu coû-
teux (microscopie, tests biochimiques rapides et taxodisques) permettent d’identifier les principaux genres d’importance
clinique et parfois les espèces mais impliquent un délai de réponse de 48 h Étant donné l’évolution de la résistance aux
antibiotiques de certaines bactéries (Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, cocci à Gram positif anaérobie) il est souhai-
table de tester leur sensibilité surtout dans le cadre d’infections monomicrobiennes ou d’infections mixtes impliquant des
bactéries potentiellement résistantes. Les techniques de routine facilement utilisables et flexibles reposent actuellement
essentiellement sur les bandelettes imprégnées d’un gradient d’antibiotique. La méthode de référence (dilution en gélose)
est réservée aux laboratoires spécialisés.

ABSTRACT
Role of medical biology laboratory in the microbiological dia-
gnosis of anaerobic bacteria
There is a renewed interest in the study of anaerobes bacteria because of their role in
microbiota and in infectious processes.Various commercially available systems (trans-
port media, solid culture media and broth, systems providing suitable anaerobic envi-
ronment) allow to isolate anaerobic bacteria successfully from clinical specimens.The
MOTS CLÉS use of matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometry,
◗ antibiogramme eventually supplemented by 16S rRNA gene sequencing, has revolutionized identifi-
◗ bactéries anaérobies cation of anaerobes, with quickly and accurately results even for unusual anaerobes.
◗ culture Conventional phenotypic techniques based on routinely usable and cost-effective tests
◗ identification (microscopy, rapid biochemical tests and special potency antibiotic disks) lead to an
identification of main clinically relevant anaerobes at the genus level and sometimes
KEY WORDS at the species level but is time consuming. Because significative change in resistance
◗ anaerobic bacteria patterns of many anaerobes (Bacteroides, Parabacteroides, Prevotella, anaerobe Gram
◗ antibiogram positif cocci), antimicrobial susceptibility testing (AST) is recommended, especially in
◗ culture the case of monomicrobial infections or mixed infections incriminating potentially
◗ identification resistant bacteria. Methodology for easy and flexible routine AST of anaerobic bacteria
is essentially based to date on the use of gradient strips. Agar dilution, considered as
the reference standard for AST remains reserved for specialized laboratories.
© 2018 – Elsevier Masson SAS
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Introduction
Les bactéries anaérobies restent encore trop souvent les
« mal aimées » et les « laissées pour compte » dans les
laboratoires spécialisés en bactériologie. Plusieurs causes
peuvent en être responsables : nature des échantillons
parvenant au laboratoire, échantillons potentiellement
contaminés par de la flore commensale, coût des milieux
de transport et des techniques d’anaérobiose, culture plus
lente, difficultés d’identification au sein des flores mixtes
associant des bactéries aérobies ou aéro-anaérobies
facultatives en l’absence de géloses sélectives, difficul-
tés d’identification du genre et de l’espèce, absence de
recommandations actuelles pour la réalisation en rou-
tine de tests de sensibilité aux antibiotiques,
et, en conséquence de l’ensemble de ces
difficultés techniques, rendu tardif des
résultats. Et pourtant les infections
bactériennes incriminant des bacté-
Les avancées
ries anaérobies seules ou en asso-
ciation ne sont pas rares, voire technologiques
même en augmentation du fait du moléculaires actuelles
nombre de plus en plus élevé de
patients présentant des comorbi- ont permis
dités (diabète, néoplasies, immu- un grand nombre de
nodépression). Les avancées tech-
nologiques moléculaires actuelles
bactéries
ont permis de découvrir un grand
nombre de bactéries anaérobies, la plu-
part appartenant au microbiote digestif ou
au microbiote oral, mais aussi des pathogènes
émergents comme Atopobium deltae ou Eisenbergiella
tayi [1]. Par ailleurs les bactéries anaérobies (surtout
au sein des genres Bacteroides/Parabacteroides mais aussi
des Prevotella et des cocci à Gram positif) ont acquis
des résistances aux antibiotiques, certaines espèces de
Bacteroides étant même rapportées comme multirésis-
tantes, compromettant parfois les traitements anti-infec-
tieux [2,3]. Ce chapitre a pour objectif de « dédramati-
ser » la recherche de bactéries anaérobies au laboratoire
de la culture à la réalisation de tests de sensibilité et
d’encourager les microbiologistes à s’y intéresser.
Les anaérobies :
étape pré-analytique
Avant d’entreprendre une recherche de bactéries anaé-
robies il est essentiel de s’assurer de la qualité de l’échan-
tillon. Les bactéries anaérobies sont abondantes voire
prédominantes dans les différents microbiotes commen-
saux (cavité orale, peau, tractus des voies aériennes supé-
rieures, digestif, urogénital), et la majorité des infections
les incriminant sont d’origine endogène, par rupture des
barrières cutanéo-muqueuses. Le prélèvement doit per-
mettre d’éviter une contamination par les microbiotes
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Les bactéries anaérobies
commensaux souvent très riches en bactéries anaéro-
bies. Les échantillons prélevés par écouvillonnage de
sites où ces microbiotes sont naturellement présents
ne doivent pas faire l’objet d’une recherche de bacté-
ries anaérobies : écouvillons de gorge, expectorations,
aspirations endotrachéales ou bronchiques, écouvil-
lons vaginaux, écouvillons réalisés en superficie d’une
plaie chronique sans débridement ni décontamination
cutanée, urines (à l’exception des urines prélevées par
ponction sus-pubienne et des urines pyéliques), selles
(à l’exception d’une recherche de Clostridium difficile ou
dans le cadre de l’entérocolite ulcéro-nécrosante du
nouveau-né). Par contre les échantillons de liquides ou
de collections purulentes, d’abcès (de préférence préle-
vés soit par ponction ou aspiration à l’aiguille, soit
en per-opératoire), les biopsies tissulaires ou
osseuses, les prélèvements pulmonaires
protégés et les prélèvements pro-
fonds de plaies chroniques doivent
être mis en culture en anaérobiose.
Pour tout échantillon destiné à la
recherche de bactéries anaéro-
bies, il faut éviter l’exposition à
de découvrir l’oxygène et au froid. Les milieux
de transport pour anaérobies
sont à privilégier, et sont même
anaérobies, obligatoires si le prélèvement a été
fait par écouvillon. Le transport se
fait rapidement (idéalement en moins
de 2 h mais reste acceptable sur milieu
de transport jusqu’à 48 h) et à température
ambiante. L’utilisation de flacons d’hémoculture doit
être réservée aux liquides a priori monomicrobiens
(liquide articulaire, liquide d’ascite) car, dans le cadre
d’infections mixtes (pleurésie purulente et péritonites
par exemple), ces flacons contenant des facteurs de
croissance peuvent donner un avantage aux bactéries
aéro-anaérobies de culture plus rapide. Il est alors préfé-
rable d’utiliser des milieux de transport pour les liquides
(type Portagerm®). La survie des bactéries anaérobies
reste cependant possible au sein d’un pus de volume
prélevé supérieur à 1 mL ou au sein d’une biopsie de
plus de 1 cm3.
Les anaérobies :
étape analytique
Examen direct
L’examen direct par coloration de Gram peut per-
mettre de reconnaitre des morphologies cellulaires
évocatrices (longs bacilles à Gram négatif effilés pour
Fusobacterium, bacilles à Gram positif trapus à bout car-
rés pour Clostridium perfringens, filaments Gram positif
branchés pour Actinomyces,…) ou montrer un polymor-
phisme témoignant d’une infection polymicrobienne.
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À noter que la présence d’un petit bacille à Gram posi-
tif dans une urine, bien que la coloration de Gram ne
soit plus réalisée systématiquement dans tous les labo-
ratoires, doit faire penser à un Actinotignum qui cultive
préférentiellement en anaérobiose.
Ensemencement
L’ensemencement doit comporter au minimum une
gélose au sang (Columbia, Brucella ou Schaedler) et un
bouillon en tube ensemencé à la base en évitant l’in-
troduction d’air (type Schaedler enrichi en vitamine K1
et hémine). Il est possible pour les échantillons poly-
microbiens d’ajouter des géloses sélectives comme par
exemple une gélose Schaedler au sang additionnée de
vancomycine et de néomycine. Ces antibiotiques per-
mettent d’inhiber la croissance de la majorité des bacilles
à Gram négatif aéro-anaérobies facultatifs et aérobies
stricts et la plupart des bactéries à Gram positif et auto-
risent la culture des Bacteroides, des Prevotella et des Fuso-
bacterium (mais pas des Porphyromonas).
Anaérobiose
La mise en anaérobiose des géloses ensemencées doit
être rapide dans les 15 à 20 minutes. Selon l’importance
du plateau technique on peut avoir recours à des sachets
ou à des jarres utilisant des générateurs d’anaérobiose,
à des systèmes d’évacuation/remplacement (Anoxomat®
par exemple), voire à une chambre anaérobie qui reste le
gold standard mais n’est pas obligatoire pour cultiver la
majorité des bactéries anaérobies d’intérêt clinique. Pour
les deux premières techniques, un indicateur d’anaéro-
biose de type résazurine doit être ajouté. Pour rappel,
l’atmosphère anaérobie se définit par un mélange de
5 à 10 % d’hydrogène, de 5 à 10 % de CO2 et d’azote
qsp 100 %.
Il est préférable, si on ne dispose pas de chambre anaéro-
bie, de ne techniquer les géloses ensemencées qu’après
48 h d’incubation afin de ne pas exposer à l’oxygène de
l’air certaines bactéries de culture plus tardive et qui
seraient alors seulement en phase de croissance expo-
nentielle. Après l’observation à 48 h, les géloses sont
incubées à nouveau pour une durée totale d’au moins
5 jours, voire 3 semaines dans le cadre de recherche
d’Actinomyces. Les bouillons ne sont pas obligatoirement
repiqués en cas de culture sur gélose positive. Ils sont
conservés 14 jours, permettant ainsi la culture de bac-
téries à croissance plus tardive comme par exemple
Cutibacterium (ex Propionibacterium) acnes.
Identification
La première étape avant d’entreprendre une identifi-
cation est l’observation des cultures, celle-ci pouvant
nécessiter l’aide d’une lampe loupe afin de mieux dif-
férencier les colonies surtout si elles sont de petite
taille. La comparaison du nombre de morphotypes et
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de leurs quantités respectives observés sur la gélose au
sang anaérobie avec les résultats de la culture aérobie, et
l’observation de colonies caractéristiques (Fusobacterium,
Clostridium, colonies pigmentées de certaines Prevotella
ou Porphyromonas,…), conduisent à suspecter ou non
la présence de bactéries anaérobies. Il faut savoir à cette
étape que certaines bactéries non classées dans les anaé-
robies stricts peuvent en primoculture ne cultiver qu’en
anaérobiose : les streptocoques « du groupe milleri » et
notamment l’espèce S. constellatus, d’autres streptocoques
(S. pyogenes, S. pneumoniae), Eikenella corrodens…
De même certaines bactéries comme Pseudomonas aerugi-
nosa (capable de respirer les nitrates), Haemophilus influen-
zae (qui perd sa double dépendance en anaérobiose) et
certains mycoplasmes (M. hominis, M. salivarium) peuvent
cultiver sur une gélose enrichie au sang en anaérobiose.
Si on suspecte la présence de bactéries anaérobies la
décision de poursuivre l’analyse par des identifications et
éventuellement des antibiogrammes dépend de la nature
de l’échantillon et du polymorphisme bactérien observé.
Il est possible dans certains cas de signaler simplement la
présence d’une flore anaérobie polymorphe afin que le cli-
nicien puisse en tenir compte dans le traitement éventuel
instauré. Cependant, il est souhaitable, en particulier dans
les processus infectieux développés aux dépens de la flore
digestive endogène (liquides péritonéaux, abcès d’organes),
d’identifier les Bacteroides du groupe fragilis et de contrôler
leur sensibilité aux principaux antibiotiques utilisés dans
ce contexte. En effet, c’est au sein de ce groupe que la
résistance a le plus évolué. Dans des échantillons précieux
(hémoculture, infection ostéo-articulaire, abcès du cer-
veau), ou dans le cadre d’une culture monomicrobienne
(quel que soit le foyer infectieux), il est important d’iden-
tifier la ou les différentes bactéries cultivées.
La poursuite de l’identification dépend de l’équipement
du laboratoire. Si la spectrométrie de masse est dispo-
nible (technique MALDI-TOF), les différentes colonies
sont répertoriées, identifiées et repiquées en parallèle
sur une gélose au sang en anaérobiose. La technique
MALDI-TOF ne nécessite que très peu de matière bac-
térienne et le plus souvent il est possible à partir d’une
colonie isolée de réaliser un fin dépôt et un repiquage.
Si les colonies sont trop fines ou mal isolées dans une
flore mixte, il est cependant préférable de les repiquer
avant de réaliser un dépôt. Les méthodes d’extraction
des protéines par l’acide formique sont recommandées
pour certaines bactéries à Gram positif (en particulier
pour les Actinomyces). De nombreuses études témoignent
de la performance de cette technique de spectromé-
trie de masse pour l’identification des bactéries anaéro-
bies, avec des pourcentages d’identification qui augmen-
tent avec l’enrichissement des bases de données [4-8].
Les résultats rapides raccourcissent le délai de rendu
de l’identification des anaérobies d’au moins 48 h. Cette
technique permet aussi de faire du sous-typage pour
certaines espèces (Bacteroides fragilis, Clostridium difficile,
Cutibacterium acnes) et d’identifier rapidement les bac-

téries directement à partir des flacons d’hémoculture
[9-11].
Si cette technique n’est pas disponible au laboratoire (ou
dans les rares cas où elle est en échec), il faut alors avoir
recours aux méthodes traditionnelles phénotypiques
après avoir fait un repiquage de chaque morphotype
de colonie en parallèle sur une gélose chocolat supplé-
mentée en atmosphère enrichie en CO2 et une gélose
au sang en anaérobiose afin de confirmer le caractère
anaérobie. Les caractères recherchés s’appuient sur les
caractéristiques des colonies (taille, pigmentation brun à
noir parfois tardive de certaines Prevotella et Porphyromo-
nas, présence d’une hémolyse…), l’aspect à la coloration
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Les bactéries anaérobies
de Gram, l’étude de la mobilité entre lame et lamelle, la
recherche d’une catalase, d’une oxydase, d’une uréase,
d’une nitrate réductase, de la production d’indole par
un test rapide. On peut tester des disques (vancomy-
cine 5 μg, kanamycine 1 000 μg, colistine 10 μg et bile
1 000 μg pour les bactéries à Gram négatif, vancomy-
cine 5 μg, sodium polyanéthol sulfonate (SPS) 1 000 μg et
métronidazole 50 μg pour les bactéries à Gram positif)
[12]. Ces moyens simples et peu coûteux d’identification
présomptive permettent le plus souvent de se diriger
au sein des bactéries à Gram négatif d’intérêt clinique
vers un genre bactérien et parfois même d’identifier une
espèce [13] (tableau 1) mais demandent au moins 48 h

Tableau 1. Identification présomptive des principales bactéries anaérobies à Gram négatifa.

Principales bactéries
Vancomycine Kanamycine Colistine Réduction
anaérobies à Gram- Bile Catalase Oxydase Uréase Indole Pigment Mobilité
5 ␮g 1 000 ␮g 10 ␮g des nitrates
(groupes ou espèces)
Bacteroides
R R R R V - V -
du groupe fragilis
Parabacteroides R R R R V - - - -
Alistipesb R R R R V - V + -
-
Odoribacter R R R V V
Prevotella R RS V S - -+ V
Porphyromonasc S R R S V - +- +-
Tannerella R S S S V - - - -
Campylobacter R S S S -+
V V + - V
C. ureolyticus R S S S - + + + - -
C. gracilis R S S S - - + - -
Campylobacter spp. R S S S - + - + - +-
Sutterella spp. R S S R - - - + - -
Bilophila spp. R S S R + - +- + - -
Fusobacterium R S S V - - -+ V -
Leptotrichia R S S R - - - - -
Capnocytophaga spp. R S
S R S -+
- +
- V
Desulfovibrio spp. R S R V V V V V V
D. piger R S R R - - - -
D. fairfieldensis R S R R + + - +
D. desulfuricans R S R S - + - +
D. vulgaris R S R R - - + +
Selenomonas R S R S - - - - +
Centipeda periodontii R S R S - - + - +
Dialister R S R S - - - - -
Veillonellad R S S S V - - + -
a. R : résistant, S : sensible, RS : la majorité des souches sont résistantes, + : positif, - : négatif, V : variable, -+ : négatif pour la majorité
des souches, positif pour quelques, +- : positif pour la majorité des souches, négatif pour quelques.
b. L’espèce A. putredinis est non pimentée, sensible à la bile et ne fermente pas les hydrates de carbone.
c. P. catoniae est non pigmenté et résiste à la vancomycine.
d. Exceptions : V. montpellierensis et V. seminalis résistent à la colistine

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de délai. Ils peuvent être complétés par l’utilisation de kits
commerciaux manuels ou automatisés à la recherche de
caractères enzymatiques et/ou de la capacité à fermen-
ter certains sucres. Certaines galeries demandent une
incubation en anaérobiose de 24 h., d’autres détectent
de manière plus rapide (4 à 6 h.) des enzymes préformés
mais nécessitent un fort inoculum exigeant parfois un
repiquage et donc un délai supplémentaire. L’identifica-
tion à l’espèce est recommandée au sein du groupe fragilis
car toutes n’ont pas les mêmes résistances aux antibio-
tiques. Dans le genre Fusobacterium, deux espèces d’intérêt
clinique et d’isolement fréquent, F. nucleatum et F. necropho-
rum (principal responsable des phlegmons amygdaliens)
peuvent être identifiés grâce à leurs caractéristiques à la
coloration de Gram, l’aspect de leurs colonies et la
production d’indole. Cependant, l’identifica-
tion à l’espèce reste difficile surtout dans
les genres Prevotella, Porphyromonas et
Fusobacterium du fait de la description Le genre
continue de nouveaux taxons par-
fois sans précision de leurs carac-
Clostridium , regroupe
tères enzymatiques, de l’insuffi- plus de 200 espèces
sance des bases de données qui
ne sont pas toujours mises à jour,
très hétérogènes
du caractère parfois peu discrimi- phylogénétiquement et
nant des tests proposés, voire de la
morphologiquement
pauvreté des caractères positifs de
certaines bactéries. Par exemple les
différentes espèces de Veillonella (cocci à
Gram négatif) ou de Dialister (coccobacille
à Gram négatif) ne peuvent être identifiées par
des caractères phénotypiques [13].
Au sein des cocci à Gram positif anaérobies (CGPA), de
nombreuses espèces initialement décrites dans le genre
Peptostreptococcus ont été reclassées dans les genres Fine-
goldia, Parvimonas, Anaerococcus, Peptoniphilus et Gallicola puis
de nouveaux genres (Murdochiella) [14] et de nouvelles
espèces ont été décrits. L’identification phénotypique de
ces espèces est peu fiable excepté par des techniques
MALDI-TOF, bien que l’enrichissement des bases de don-
nées ne suive pas la description des nouveaux taxons et
qu’alors le seul recours soit l’identification génotypique.
On pourra cependant reconnaître sur leurs caractères
cellulaires, culturaux et enzymatiques Parvimonas micra,
Finegoldia magna (deux CGPA d’isolement fréquent) et
Peptostreptococcus anaerobius (sensible au SPS) [15].
Quand on a affaire à un bacille à Gram positif, peu de
techniques faciles d’utilisation en routine autorisent
un diagnostic de genre et d’espèce. Classiquement, les
bacilles anaérobies à Gram positif comprennent les
bacilles sporulés (Clostridium) et les non sporulés (Acti-
nomyces, Actinobaculum, Propionibacterium, Eubacterium,
Atopobium et Lactobacillus pour les principaux).
Le genre Clostridium, proposé par Prazmowski en 1880,
avec comme espèce type Clostridium butyricum regroupe
plus de 200 espèces très hétérogènes phylogénéti-
quement et morphologiquement. Ce genre connait lui
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aussi de nombreuses révisions taxonomiques avec par
exemple récemment la création du genre Peptoclostri-
dium, du genre Clostridioides auquel est rattaché Clostri-
dium difficile ou du genre Hathewaya regroupant 3 anciens
Clostridium dont C. histolyticum [16-18]. En pratique, l’ob-
servation de spores ovoïdes ou sphériques, souvent
déformantes, terminales ou subterminales orientent
vers le genre, mais certaines espèces ne sporulent que
très difficilement comme C. ramosum. Il est alors pos-
sible de réaliser un test de sporulation par chauffage à
80 ºC 10 minutes ou par traitement à l’éthanol. Certaines
espèces de Clostridium prennent mal la coloration de
Gram et apparaissent donc à Gram négatif (espèces du
complexe clostridioforme, Clostridium symbosium, Clostri-
dium ramosum) mais la sensibilité à la vancomycine et
la résistance à la colistine permettent de rec-
tifier le Gram. Cependant certains Clostri-
dium résistent naturellement à la vanco-
mycine (C. innocuum, C. ramosum). Les
colonies de Clostridium présentent
souvent des bords irréguliers et
sont assez larges, avec pour cer-
taines espèces une tendance à l’en-
vahissement des géloses (C. septi-
cum par exemple). C. perfringens
est facilement identifiable sur ses
caractères morphologiques cellu-
laires (bacille trapu à bouts carrés) et
culturaux (colonies plates, à bords irré-
guliers et présentant une double hémo-
lyse caractéristique, mieux observée après un
passage de 1 heure à +4 ºC : une zone d’hémolyse
complète au contact de la colonie entourée d’un halo
trouble de lyse incomplète). L’identification des espèces,
en absence de spectrométrie de masse repose sur l’ob-
servation de la spore et sur la recherche d’activités glu-
cidolytiques et protéolytiques [15] effectuées à l’aide de
kits commerciaux manuels ou automatiques.
Lorsqu’on se dirige vers un bacille à Gram+ non spo-
rulé, l’observation des caractéristiques cellulaires à la
coloration de Gram, la recherche d’une catalase, de la
réduction des nitrates, de la production d’indole et la
sensibilité au métronidazole sont des éléments d’orienta-
tion importants. Un bacille diphtéroïde irrégulier ou avec
ramifications fera évoquer les genres Propionibacterium,
Bifidobacterium et Actinomyces alors qu’un petit bacille
assez régulier orientera vers un Eubacterium ou appa-
renté. Le genre Propionibacterium n’a pas échappé aux
changements de taxonomie [19]. Cutibacterium (ex Pro-
pionibacterum) acnes, espèce très fréquemment isolée
en particulier dans les infections ostéo-articulaires sur
matériel et dans les empyèmes cérébraux post-chirur-
gicaux, a la particularité de posséder une catalase, de
produire de l’indole et de réduire les nitrates (deux de
ces tests positifs permettent son identification). Cutibacte-
rium (ex Propionibacterium) avidum a des colonies entou-
rées d’une large zone de bêta-hémolyse et ne produit

pas d’indole. Les propionibacteries sont naturellement
résistants au métronidazole, tout comme les Actinomyces.
Le pus des actinomycoses est caractéristique avec pré-
sence de grains blancs, jaunes ou bruns constitués par
l’enchevêtrement de fibrine, de polynucléaires et de
filaments d’Actinomyces. Les principales espèces isolées
chez l’homme sont A. israelii, A. naeslundii, A. odontolyticus,
A. viscosus et A. meyeri [15]. L’espèce-type, A. israelii, est un de masse, seule l’identification génotypique est possible,
bacille à Gram positif polymorphe, filamenteux, possé-
dant des renflements terminaux, dont les colonies sont
caractéristiques, irrégulières et blanches. La croissance
est lente, au minimum de 5 jours et jusqu’à 21 jours.
Les autres espèces d’Actinomyces sont anaérobies facul-
tatifs (A. meyeri n’est pas ou peu aérotolérant) et poly-
morphes. Ils peuvent se présenter sous la forme
d’éléments coccobacillaires chez certaines
espèces (A. odontolyticus et A. meyerii), mais
aussi sous l’aspect de fins filaments plus
ou moins ramifiés pouvant atteindre
10 à 50 μm de longueur et ressem-
blant à un mycélium. Les colonies La spectrométrie de
d’A. odontolyticus sont pigmentées
en rouge ou brun après plusieurs masse a révolutionné
jours d’incubation. l’identification des
Les Bifidobacterium, présents au
sein des microbiotes surtout bactéries anaérobies
intestinal mais aussi vaginal, sont
essentiellement des pathogènes
opportunistes et comprennent plus
de 40 espèces. Ces bactéries connaissent
un regain d’intérêt de par les propriétés
bienfaitrices de certaines espèces utilisées comme
probiotiques. Ils doivent leur nom à leur aspect bifide à
la coloration de Gram mais apparaissent souvent poly-
morphes. Ils sont anaérobies stricts (rarement microaé-
rophiles), dépourvus de catalase et réduisent les nitrates.
L’identification des espèces et sous-espèces est difficile
et nécessite des techniques de séquençage [20]. Une
espèce proche des Bifidobacterium, Alloscardovia omni-
colens, donnant de petites colonies alpha-hémolytiques
sur gélose au sang, catalase négative, bien identifié par la
spectrométrie de masse, a été isolée dans divers sites
infectieux, principalement génito-urinaires [21].
De nombreux genres bactériens sont apparentés aux
Eubacterium, certaines espèces d’Eubacterium y ayant
été reclassées (Filifactor, Mogibacterium, Bulleidia, Pseudo-
ramibacter, Slackia, Collinsella, Holdemania, Solobacterium,
Flavonifractor, Eggerthella, Paraeggerthella, Atopobium).
L’identification de ces genres et espèces n’est souvent
possible que par la spectrométrie ou par les techniques
génotypiques [15].
En conclusion de ce chapitre, il est évident que la spec-
trométrie de masse a révolutionné l’identification des
bactéries anaérobies. Si les techniques convention-
nelles utilisables en routine (nous n’avons pas évoqué
les méthodes réservées aux laboratoires de référence
comme l’analyse des produits terminaux du méta-
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Les bactéries anaérobies
bolisme par chromatographie en phase gazeuse) per-
mettent d’identifier les bactéries d’intérêt clinique les
plus fréquentes, elles sont dans un certain nombre de
cas insuffisantes pour distinguer les espèces (cas des Pre-
votella) voire se diriger vers un genre (cas des bacilles
à Gram positif). Enfin pour certaines bactéries anaéro-
bies, et notamment en cas d’échec de la spectrométrie
le plus souvent par séquençage du gène codant l’ARN
ribosomique 16S mais qui peut être pris en défaut car
insuffisamment discriminant (c’est le cas des espèces de
Veillonella ou de Fusobacterium). D’autres gènes peuvent
être analysés (codant pour l’ARN polymérase B rpoB, ou
des protéines de choc thermique hsp par exemple) et
on peut avoir recours aussi au séquençage total qui est
de plus en plus utilisé dans la description de
nouveaux taxons.
Antibiogramme
La décision d’effectuer des tests
de sensibilité aux antibiotiques va
dépendre de l’espèce identifiée,
du caractère monomicrobien
ou pas de la culture et du type
d’échantillon. Il est important de
rappeler que les résultats des tests
de sensibilité sont indispensables
pour le suivi épidémiologique de la
résistance, suivi qui permet de valider
les traitements à visée anti-anaérobies.
Dans le contexte d’une infection monomi-
crobienne à bactérie anaérobie, il est nécessaire de
tester les antibiotiques a priori actifs et qui diffusent
au niveau du foyer infectieux. Lorsqu’un microbiome
mixte aéro- et anaérobie est impliqué dans le proces-
sus infectieux, il est possible de n’étudier que les Bac-
teroides du groupe fragilis qui peuvent avoir acquis des
résistances aux associations pénicillines et inhibiteurs,
voire aux carbapénèmes et au métronidazole. Enfin
dans certaines infections (comme par exemple dans
les abcès du cerveau) plusieurs bactéries anaérobies
peuvent être impliquées sans bactérie aérobie associée,
on peut alors en fonction du nombre et des espèces
tester un petit nombre d’antibiotiques ou congeler la
culture en suivant l’évolution clinique sous traitement
probabiliste. La méthodologie de l’antibiogramme n’est
pas aussi bien déterminée [22]. La technique de réfé-
rence proposée par le Clinical and Laboratory Standards
Institute (CLSI, États-Unis) est la méthode de dilution
en gélose, non utilisable en routine. Des kits utilisant la
microdilution en bouillon sont commercialisés mais ne
sont valides que pour les Bacteroides du groupe fragilis.
La méthode la plus utilisée en pratique courante est la
diffusion utilisant des bandelettes contenant un gradient
d’antibiotique (E-test ou MIC Evaluator). Elle n’est pas
parfaitement corrélée avec la technique de référence
(en particulier pour le métronidazole, la pénicilline G et
45
Dossier scientifique
l’association piperacilline-tazobactam) [23,24]. L’utilisa-
tion des disques n’est référencée que dans le Comité de
l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie
(CA-SFM) de 2013. Un groupe d’experts européens tra-
vaille actuellement dans l’objectif de la réactualiser. Selon
les antibiotiques et les espèces la corrélation entre CMI
et diamètres n’est pas très bonne et il faut être prudent
et ne pas hésiter à réaliser une CMI lorsque le diamètre
est proche du seuil. Nagy et coll. ont étudié la diffusion
avec des disques en comparaison de la détermination de
la CMI par dilution en gélose sur 381 Bacteroides fragilis
[25]. Ils ont conclu à une bonne corrélation pour l’imi-
pénème, le méropénème, la tigécycline, la moxifloxacine
et le métronidazole, moins bonne pour les associations
amoxicilline-acide clavulanique et piperacilline-tazobac-
tam (les souches sensibles et intermédiaires présentaient
des diamètres identiques) et mauvaise pour la céfoxitine
bien que les souches résistantes aient été bien séparées.
Ils ont confirmé que la répartition des diamètres autour
du disque de méropéneme permettait mieux que l’uti-
lisation du disque d’imipénème de repérer les souches
non sauvages (porteuses du gène cfiA) avec des CMI aux
carbapénèmes augmentées. Quelle que soit la technique
en diffusion utilisée (E-test ou disques) il convient de res-
pecter les règles de taille d’inoculum, de gélose à utiliser
et de condition et de délai d’incubation. La gélose recom-
mandée est une gélose Brucella + 5 % de sang de mou-
ton et + vitamine K1 (1 mg/L). La lecture se fait à 48 h
pour la clindamycine pour mieux détecter la résistance
inductible. Le contrôle de la qualité de l’anaérobiose est
impératif car sinon il est possible de rendre des fausses
résistances au nitro-imidazolés (métronidazole). Dans
tous les cas, un résultat intermédiaire ou résistant à ces
antibiotiques chez une espèce habituellement sensible
doit être contrôlé. Il est bien sûr recommandé de tester
à une fréquence définie une souche de référence (Bacte-
roides fragilis ATCC 25285). Il est possible pour certains
bacilles à Gram négatif (en particulier les Prevotella et
Fusobacterium) d’effectuer une recherche de bêta-lacta-
mase par un test chromogénique rapide. La positivité de
ce test indique une résistance aux pénicillines (pénicilline,
aminopénicillines et carboxypénicillines) mais il peut être
pris en défaut (positivité tardive, difficulté de lecture pour
les espèces pigmentées) et ne dispense pas de la réalisa-
tion d’une CMI en cas de négativité.
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46 REVUE FRANCOPHONE DES LABORATOIRES • N° 505 • SEPTEMBRE-OCTOBRE 2018
Conclusion
Les bactéries anaérobies ont connu et connaissent encore
un bouleversement taxonomique : description continuelle
de nouveaux taxons, reclassification de bactéries dans
de nouveaux genres. Ces remaniements perturbent les
microbiologistes et les cliniciens. Cependant de nouveaux
outils permettent une identification fiable et non fasti-
dieuse, en particulier l’utilisation de la spectrométrie de
masse MALDI-TOF. Les moyens techniques permettant
le transport, la culture, l’incubation sont facilement acces-
sibles. Il nous paraît impensable actuellement de ne pas
rechercher les bactéries anaérobies, étant donné leur rôle
non négligeable dans les processus infectieux et la pos-
sibilité de résistance acquise compromettant l’efficacité
thérapeutique. QQ
Liens d’intérêts : Yann Dumont déclare avoir des liens avec
MSD France, Correvio, et Pfizer PFE France. Les autres
auteurs déclarent ne pas avoir de liens d'intérêts.
Points à retenir
◗tLes infections incriminant des bactéries anaérobies sont
fréquentes et les échantillons prélevés dans leur contexte et
dans le respect des conditions pré-analytiques doivent être
ensemencés en anaérobiose au minimum sur gélose au sang
et bouillon d’enrichissement.
◗tEn l’absence de chambre anaérobie, les géloses sont
observées à 48 h et comparées aux résultats des cultures
aérobies et en atmosphère CO2.
◗tL’identification par spectrométrie de masse de type MALDI-
TOF est à prioriser. En son absence, la confirmation du
caractère anaérobie et l’utilisation de tests peu coûteux
permet de se diriger vers un genre au sein des bactéries à
Gram négatif et d’identifier quelques espèces importantes en
clinique au sein des Gram positif.
◗tIl est important de vérifier la sensibilité aux antibiotiques les
plus utilisés dans le traitement des infections à anaérobies car
l’augmentation des résistances n’a pas épargné les bactéries
anaérobies.
◗tActuellement, la technique de référence de dilution en gélose
est réservée aux laboratoires spécialisés et la méthode
applicable en routine est l’utilisation des bandelettes avec
gradient d’antibiotique en respectant les recommandations
(gélose, inoculum, anaérobiose et délai de lecture).
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Dossier scientifique
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