Mesure de l’activité enzymatique

- dans cette section, nous traiterons des aspects plus pratiques de la mesure
de l’activité d’une enzyme

A. Principes de base
- l’activité enzymatique est influencée à la fois par des propriétés spécifiques à
l’enzyme (concentrations des substrats, activateurs, et inhibiteurs) et par des effets
non spécifiques,
soit: des sels et tampons, pH, force ionique, température, et dans
certain cas d’autres protéines

- typiquement, les conditions sont arrangées pour que l’enzyme ait une activité
- maximale (Vmax)
A.1 Concentration de substrat, activateurs, inhibiteurs.
- de règle générale, la mesure de l’activité d’une enzyme demande des concentrations
élevées de substrat qui sont parfois difficiles à atteindre

- si l’enzyme obéit à la cinétique Michaelis-Menten, une concentration de substrat

dépassant 10 X le Km doit être utilisée (Figure 1A)

- à cette concentration de substrat, la vitesse mesurée représente 91% de la vitesse

à concentration infinie; des complications apparaissent si une concentration faible
de substrat est utilisée (Figure 1B)
A B

[Produit]

[Substrat] Temps

Effet de la consommation de substrat sur l’activité

enzymatique: (a) relation entre la vitesse et la
concentration de substrat ; (b) vitesse observée en
fonction du substrat transformé en produit, lorsque
[substrat] = 10 Km (ligne solide) et [substrat] = 2 Km
(ligne pointillée)

Figure 1
- considérant que toutes les déterminations de l’activité prennent un certain temps à
être complétées, il est important que la vitesse soit linéaire pendant la période
d’incubation utilisée pour détecter convenablement la formation du produit de la
réaction

- s’il y a accumulation du produit, la vitesse de la réaction peut être compromise par

la réaction de retour (retro-inhibition). Plusieurs stratégies peuvent être utilisées,
qui incluent :

1. mesurer la réaction enzymatique pour une courte durée afin de

minimiser l’accumulation du produit

2. l’utilisation de hautes concentrations de substrat,

3. des pH non physiologiques (s’il s’agit d’un proton) pour enlever le

proton et déplacer la réaction dans la direction de produit,

4. l’utilisation de méthodes très sensibles pour détecter le produit

afin de minimiser sa concentration

- l’inhibition par le substrat à des hautes concentrations peut aussi être due à
la formation d’interactions non appropriées au site actif et qui mènent à l’inhibition
de l’activité enzymatique
 A.2 Effets du pH, de la Force Ionique et de la Température

- les valeurs de Vmax et KM sont influencées par le pH, la force ionique, et la

température

le pH

- la valeur maximale de l’activité de certaines enzymes peut être très loin du pH

physiologique

- par exemple, la phosphatase alcaline possède une activité maximale à pH 10-11.

Cependant, son KM est plus bas à pH 7 qu’à pH 10-11; ceci est important afin de
comparer les activités entre les essais avec des conditions différentes

le tampon/force ionique

- certains tampons peuvent agir comme inhibiteurs

- par exemple, le phosphate et certaines tampons anioniques, possédant des
charges multiples tel que le citrate, compétitionnent avec des substrats
possédant des charges négatives pour lier le site actif

- puisque les concentrations de tampon sont souvent élevées, entre 10 et 100mM,

même une association faible par le tampon peut provoquer une inhibition importante

- des ions métalliques, essentiels pour l’activité, peuvent être complexés par des
tampons tels que le citrate et l’imidazole, et compromettre l’activité enzymatique
- la force ionique physiologique est entre 0.1 - 0.2M; les enzymes sont très souvent
moins actives à une force ionique inférieure par rapport à la valeur physiologique

la température

- la température en soit n’est pas une propriété essentielle mais elle intervient en
ce qui concerne le temps d’incubation

- la vitesse d’une réaction augmente en règle générale d’un facteur 2 pour chaque
10°C

- cependant, à de hautes températures, même si la température augmente la

vitesse d’une enzyme, l’enzyme peut être dénaturé pendant la période d’incubation
de l’essai

- plus la période d’incubation est courte, plus la température apparente de l’activité

maximale peut être élevée puisqu’il y a moins de temps pour que l’enzyme dénature

- la température de référence et celle choisie est très souvent est 25°C mais la
température physiologique 37°C est fréquemment utilisée
A.3 Mesure de l’activité enzymatique par méthodes discontinues

- la mesure de l’activité d’une enzyme dépend d’une méthode qui détermine la

quantité de produit généré durant la réaction;

- ceci peut impliquer la séparation du produit et du substrat après la réaction

s’il est impossible de doser le produit en présence du substrat

- il y a deux façons de mesurer l’activité enzymatique :

1) par des méthodes discontinues (flot arrêté)

2) par des méthodes continues

- les méthodes discontinues possèdent l’avantage qu’elles peuvent s’appliquer à

n’importe quel système enzymatique

- avec une méthode discontinue, l’enzyme est incubé avec ses substrats pendant une
certaine période de temps et la réaction est ensuite arrêtée.

- le produit est dosé et son évolution est assumée linéaire pendant la période de
l’incubation
 - une des premières choses à vérifier est l’évolution linéaire de la réaction
->une seule donnée peut sous-estimer la vitesse initiale dû à des temps
d’incubation trop longs

Vraie vitesse
Produit initiale à l’état
stationnaire Arrêt de la
réaction
enzymatique

Vitesse
mesurée

Temps
- également, un délai dans la réaction peut sous-estimer la vitesse à partir d’un
seul point

- il est essentiel de faire plusieurs incubations à des temps différents afin de vérifier
si la réaction est linéaire

- ceci est très important dans le cas d’ extraits à partir d’une lyse cellulaire à cause
de la possibilité de réactions secondaires
- par exemple dans un extrait contenant l’enzyme subséquent dans une
voie métabolique, une autre enzyme consume le produit qu’on veut mesurer
 A.3.1 Conditions d’incubation.

- il n’y a pas des contraintes véritables en ce qui concerne des conditions

d’incubation

- l’échantillon contenant l’enzyme est ajusté à temps zéro et rapidement mélangé; la

réaction est incubée pendant des temps fixe et ensuite arrêtée.

- la réaction est arrêtée par une méthode qui provoque la dénaturation instantanée
de l’enzyme ou déplace l’équilibre de la réaction afin que l’enzyme ne soit plus
active

- les méthodes souvent utilisées sont la précipitation par acide trichloracétique ou

perchlorique ou par dénaturation thermique de l’enzyme

- on peut également utiliser le SDS pour dénaturer l’enzyme

- la réaction peut être arrêtée également par des méthodes non dénaturantes qui
inactivent l’enzyme

- i.e. changement de pH, ajout d’EDTA si des ions métalliques sont essentiels,
dilution avec un substrat non-radioactif si un produit marqué par un isotope
radioactif est mesuré
 A.3.2 Mesure du produit.

- la mesure du produit par des méthodes enzymatiques est très souvent employée

• plusieurs produits de réactions enzymatiques peuvent être difficile à détecter

- une approche utilisée pour les détecter est de convertir le produit directement
ou indirectement en un autre produit qui lui est plus facile à détecter

- les techniques de détection utilisées le plus fréquemment sont la

spectrophotométrie ou la fluorométrie

Figure montrant le principe de la spectrophotométrie

- - le but de ces méthodes est que la détection du produit final dépend de
la production d’un chromatophore ou fluorophore important et qui est
facile à détecter.

- Les approches utilisées sont :

1) la détection directe Æ un des produits de la réaction enzymatique absorbe la

lumière, par exemple, la formation de NADH par
réduction de NAD+ (le NADH absorbe la lumière à 340
nm et émet de la fluorescence à 450 nm)

(a) Spectre d’absorption du NADH, (b) Spectre d’émission de fluorescence du

comparé avec celui du NAD+ NADH, avec excitation à 365 nm
2) détection indirecte Æ ajoute une enzyme qui utilise le produit de la réaction
pour former du NADH par couplage avec une autre réaction.

- méthode par essais couplés

Principe de mesure du produit par essai couplé

Produit P
- pour cette approche,
Échantillon pris pour mesurer [P] il est essentiel que la
réaction couplée
détecte de façon
stœchiométrique la
Temps formation du produit
Première incubation original (une
molécule de P
produit une molécule
Enzymes couplées

Réaction de R)
observée

Formation de R

Temps
Deuxième incubation
- la formation d’un produit possédant un chromatophore représente une autre
approche; par exemple, la formation de nitrophénolate qui absorbe à 400 nm.

- des techniques comme la chromatographie peuvent être utilisées afin de séparer

les réactants (substrats et produits) avant qu’ils soient dosés.

- la figure suivante montre l’utilisation d’un essai couplé afin de déterminer la

concentration de glucose sanguin
- les enzymes utilisés sont la glucose oxydase (enzyme P) et la peroxydase
(enzyme Q) qui donne lieu à un produit coloré vert détecté par
spectrophotométrie

Détermination enzymatique du glucose

A.4 Mesure de l’activité enzymatique par méthodes continues
- les méthodes continues impliquent que le progrès de la réaction soit observé
pendant toute la réaction et généralement de façon instantanée
- il y a un nombre important d’enzymes dont l’activité peut être suivie directement
grâce à la différence en absorbance ou fluorescence entre le produit et le substrat

LDH
lactate -----→ pyruvate
NAD NADH

(ncat= nombre
d’unité cata-
lytique)

Détermination de l’activité de la lactate-déshydrogénase (LDH) par spectrophotométrie

- les catégories d’enzymes dont ont peut mesurer l’activité en méthode continue sont:
- les déshydrogénases qui utilisent NAD ou NADP,
- les hydrolases qui peuvent utiliser des substrats synthétiques qui libèrent des
produits colorés ou fluorescents
- polymères endohydrolases qui par leur activité réduisent la viscosité d’un
polymère

A.4.1 Méthodes couplés.

- le principe de la méthode couplée est comme celui de l’essai couplé où le produit

qui ne peut pas être observé directement est transformé chimiquement ou
enzymatiquement en un composé qui peut être observé

- mais en méthode continue, les réactants utilisés doivent fonctionner sous les
conditions de la réaction enzymatique à mesurer

- dans la mesure de la vitesse de la réaction, la vitesse de transformation du

produit par le système d’enzyme couplé ajouté doit être suffisante afin de suivre
quantitativement la formation du produit

- une réponse linéaire par le système d’enzyme couplé assure le couplage quantitatif
avec la formation du produit de l’enzyme d’intérêt

- réponse linéaire veut dire que l’activité mesurée par le système couplé
augmente de façon proportionnelle avec la quantité d’enzyme utilisé dans l’essai