Вы находитесь на странице: 1из 5

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ МЕДИЦИНА

УДК 612.17:612.014.42

ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА
КАРДИОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ИЗОФОРМ If КАНАЛА

Науфаль Шамилевич Загидуллин 1,2, Шамиль Зарифович Загидуллин1


1
Кафедра пропедевтики внутренних болезней (зав. — проф. Ш.З. Загидуллин)
Башкирского государственного медицинского университета Росздрава, г.Уфа,
2
клиника внутренних болезней III Кельнской университетской клиники, Германия,
е-mail: nau36@ufanet.ru

Реферат (V1/2) находилось в диапазоне от -73 [4]


Кардиальный ионный ток If, определяющий пейс- до -91 [11] и –106 мВ [5]. Аналогичной
мекерную функцию синоатриальных клеток, кодиру-
была и кинетика активации (τ).
ется 3 генами-изоформами: HCN1, HCN2, HCN4. Конс-
татировано, что HCN1 ток обладает наиболее быстрой В последнее время достаточно интен-
кинетикой активации, а HCN4 — самой медленной. сивно изучается возможность создания
При этом HCN2 ток имел наибольшее сходство с на- биологических пейсмекеров (БП), и од-
тивным If током, что является основанием для исполь- ним из его вариантов является имплан-
зования этой изоформы при создании биологического тация генетически модифицированных
пейсмекера. Повышение концентрации ионов калия клеток, например мезенхимальных, транс-
во внеклеточном растворе привело к увеличению плот-
фицированных генами, способными со-
ности тока и сдвигу кривой активации в негативную
сторону в изоформах HCN1 и, в особенности, в HCN4,
здавать пейсмекерный ток в клетке [1,
что может быть причиной остановки сердца в диасто- 2]. Для определения гена-кандидата, на-
ле при гиперкалиемии. иболее близкого If току, при трансфекции
Ключевые слова: кардиальный ионный ток If, трансплантируемых клеток необходима
гены изоформы HCN1, HCN2, HCN4, овариальные электрофизиологическая характеристика
клетки, кинетика активации. тока кардиоспецифических изоформ.
Широко известна способность повы-
В основе функционирования пейсме- шенной концентрации ионов калия в
керных клеток лежит активность ионно- крови или при перфузии гиперкалиево-
го тока If, активирующегося при деполя- го раствора через изолированное сердце
ризации и инициирующего спонтанную в эксперименте замедлять ритм сердца,
активность данных клеток. If ток обнару- а при более высоких концентрациях —
жен во многих типах возбуждаемых кле- и останавливать его в диастоле [12, 13].
ток, включая ретинальные фоторецепто- В клинической практике нередки случаи
ры, кардиальные пейсмекерные клетки, почечной недостаточности с повышени-
нейроны периферической и центральной ем концентрации данного иона, а также
нервной систем [8]. Важнейшим ша- передозировки лекарственных средств,
гом вперед в понимании молекулярных содержащих калий [10]. Использование
свойств If канала и механизмов контроля модели гиперкалиемии во внеклеточном
пейсмекерной функции сердца в начале растворе в эксперименте позволяет изу-
1990-х годов стало клонирование генов чить влияние высокого содержания ка-
трех HCN каналов — HCN1, HCN2, HCN4, лия на электрофизиологические свойства
комбинация которых и формирует дан- ионных токов HCN изоформ.
ный ток [9]. HCN изоформы существенно Целью исследования являлось изу-
различаются в своих электрофизиологи- чение электрофизиологических свойств
ческих характеристиках — плотностью HCN1, HCN2 и HCN4 изоформ по данным
тока, проводимостью и кинетикой акти- метода patch clamp (фиксации потенциа-
вации [8]. Несколько фундаментальных ла) в модификации whole cell («вся клет-
исследований, характеризующих электро- ка») в физиологическом и гиперкалиевом
физиологические свойства HCN изоформ растворах при экспрессии в овариальных
и их параметров, показали, что они весь- клетках китайских хомячков (ОККХ)
ма вариабельны. Например, для HCN2 ка- для определения гена-кандидата при со-
нала напряжение в точке полуактивации здании биологического пейсмекера.
172
Казанский медицинский журнал. 2009 г., том 90, № 2

Для исследования электрофизиологи- воздуха производили разрыв мембраны


ческих свойств HCN изоформ нами была клетки. При потенциале покоя –35 мВ
выбрана клеточная система овариальных проводилась подача тестовых импульсов
клеток китайских хомячков, достаточно с напряжением от –30 до –150 мВ с шагом
хорошо зарекомендовавшая себя в экс- –10 мВ и записывался ток через мембрану
периментах с экспрессией калиевых и клетки. В гиперкалиевом растворе мак-
других каналов и последующими микро- симальные значения не достигали «пла-
электродными исследованиями [14, 15]. то» при тестовых потенциалах до –150 мВ,
Для трансфекции были использованы и для получения сигмоидальной кривой
плазмиды pAdCGI-HCN1, pAdCGI-HCN2, активации тока при нормализованных
pAdCGI-HCN4, содержащие соответствен- значениях протокол исследования был
но гены HCN1, HCN2 и HCN4, а также модифицирован с повышением напря-
усиленный зеленый флюоресцирующий жения до –170 мВ. Для характеристики
белок (УЗФБ). За 24 часа до трансфек- электрофизиологических свойств клеток
ции ОККХ линии K1 были посеяны из полученных кривых тока клеток оп-
на чашки Петри с плотностью 2,0*105 на ределялись следующие параметры: ам-
каждые 35 мм чашки в 10% среде DMEM плитуда и плотность тока, константа
(Dialbeco modified essential medium), содер- кинетики активации (время от начала
жащей необходимые эссенциальные ами- тока до достижения 66,6% максимума
нокислоты, антибиотик (пенициллин) амплитуды тока). После нормализации
и др. Клетки были трансфицированы плотности тока и создания кривой сиг-
соответствующей HCN плазмидой с плот- моидальной регрессии соотношения
ностью 0,25 мкг/чашка с помощью моле- плотность тока/напряжение по формуле
кулярно-биологической системы «Липо- Больцмана вычисляли фактор уклона
фектамин Плюс» (липофектамин, США) кривой активации (k) и точку полуакти-
по рекомендациям производителя. Транс- вации (V1/2). Электрофизиологическое ис-
фицированные клетки выявлялись под следование проводилось в 6 группах: при
микроскопом Lieca Mycrosystems (США) физиологических концентрациях калия
как клетки с зеленым излучением с по- для изоформ HCN1, HCN2, HCN4 (n=9,
мощью ксеноновой лампы при длине вол- 11 и 10 соответственно) и в высококалие-
ны 488/530 нм (возбуждение/эмиссия). вом растворе (n=18, 11 и 12).
Электрофизиологические исследова- Статистический анализ производился
ния проводились при физиологических с помощью парного критерия Стьюдента.
концентрациях ионов внеклеточного раст- Микроэлектродные электрофизиоло-
вора и гиперкалиевого раствора (табл.1). гические исследования позволили устано-
Таблица 1
Состав внеклеточной жидкости в экспериментах по изучению электрофизиологических свойств HCN изоформ

Типы внеклеточной жидкости KCI NaCI CaCI2 Глюкоза MgCI2 HEPES


Физиологический раствор, ммоль/л 5 135 2 10 1 10
Высококалиевый раствор, ммоль/л 100 40 2 10 1 10

Интрацеллюлярный состав был постоя- вить, что при активации тока тестовыми
нен и содержал (в ммоль/л) K-глютамат потенциалами от –30 до –150 мВ наибо-
130, KCI 15, NaCI 5, MgCI2 1, HEPES 10 лее быстро активировался ток изоформы
и Mg-АТФ 5; pH был отрегулирован KOH HCN1, далее HCN2, и самой медленной
до 7,3. скоростью активации отличалась изофор-
Электрофизиологические свойства ма HCN4 (рис.1). При попарном сравне-
клеток были исследованы с помощью нии между HCN1–HCN2, HCN2–HCN4 и
стандартного микроэлектродного ме- HCN1–HCN4 разница в параметрах кон-
тода patch clamp в модификации whole станты активации τ определялась при
cell. При контакте тонкой стеклянной всех потенциалах тока (p<0,01 и p<0,001).
пипетки с электродом внутри с клеткой В то же время разница в плотности тока,
в месте контакта путем подсасывания вычисляемая как отношение силы тока к
173
Казанский медицинский журнал. 2009 г., том 90, № 2

Рис.1. Кривые тока изоформ HCN1 (слева) и HCN4


(справа), полученные при последовательных тестовых
импульсах от –30 до –150 мВ с продолжительностью
импульса от 3 до 2,45 с и последующим реполяриза-
ционным импульсом +5 мВ.

емкости клетки (пА/пФ), при сравнении


всех трех изоформ оказалась несколько Рис.2. Нормализованное соотношение плотность тока/
менее существенной, чем при сравнении напряжение по плотности тока в изоформах HCN1
(квадраты), HCN2 (треугольники) и HCN4 (круги).
кинетики их активации. Так, разница в
плотности тока в паре HCN1–HCN2 была При нормализации кривых тока по
достоверной только в самом начале ги- максимальному значению с последую-
перполяризационного протокола (от –40 щим построением сигмоидальной регрес-
до –90 мВ, p<0,05). В паре HCN2–HCN4, сии по уравнению Больцмана изоформа
наоборот, плотность тока достоверно раз- HCN1 обладала минимальным среди всех
личалась при более отрицательных по- изоформ показателем полуактивации —
тенциалах — от –100 до –150 мВ (p<0,05 V1/2=-90,03±4,4 мВ (табл.2, рис. 2). Изофор-
и p<0,01), что, очевидно, связано с более ма HCN2, несмотря на то что имела пока-
быстрым достижением плато (насыще- затель полуактивации чуть меньший, чем
нием) у HCN4 в сравнении с другими у изоформы HCN4 (–106,92±2,2 мВ против
изоформами. И лишь при сравнении по- –108,82±1,8 мВ; p>0,05), обладала наимень-
тенциалов в паре HCN1–HCN4 значения шим фактором уклона (kHCN2=10,18
различались при всех тестовых потенци- против kHCN1=10,18±0,59; p>0,05 и про-
Таблица 2
Электрофизиологические параметры HCN изоформ в физиологическом и высококалиевом растворах

HCN1 HCN2 HCN4


Параметры
K+ 5 K+ 100 K+ 5 K+ 100 K+ 5 K+ 100
n 9 18 11 11 10 12
Плотность тока (-140 мВ) 37,2±7,8 83,8±14,1** 30,5±3,4 72,8±15,8†† 18,2±2,2 26,91±4,1‡
τ (-140 мВ) 54,62±7,6 69,5±9,3 153±12 172,0±26,4 540,2±2,3 1300,6±212‡‡
Фактор уклона (k) 13,88±2,4 17,68±2,2 10,18±0,6 14,26±2 13,55±0,7 13,8±0,8
V1/2, мВ -90,±4,4 -108,8±4,8* -106,92±2,2 -104,63±4,4 -108,82±0,7 -152,96±3,1‡‡‡
Активация тока, мВ -30 – -40 -40 – -50 -30 – -40 -30 – -40 -50 – -60 -70 – -80
Примечание. Достоверность различий при попарном сравнении для каждой из изоформ в высококалиевом/фи-
зиологическом растворе: * в изоформе HCN1, † в HCN2, ‡ в HCN4, *,†,‡ p<0,05, **,††,‡‡ p<0,01, ***,†††, ‡‡‡
p<0,001.

алах, при которых ток вообще регистри- тив kHCN4=13,55±0,67; p<0,05), т.е. имела
ровался (p<0,001). При этом активация самую вертикальную кривую активации
тока изоформы HCN4 начиналась значи- (табл.2, рис.2,).
тельно позже, чем у двух других изоформ При сравнении электрофизиологичес-
(от –50- до –60 мВ против –40 мВ). Вместе ких параметров HCN токов в высокока-
с тем ток изоформы HCN4 значительно лиевом растворе с физиологическим опре-
быстрее достигал максимальных значе- делялись следующие закономерности: во
ний (плато) начиная с –130 мВ, в то вре- всех изоформах примерно в 2-3 раза возрас-
мя как у HCN1 и HCN2 данная кривая тала плотность тока. При этом достовер-
тока переходила в пологую часть начиная ность различий увеличивалась с ростом
с –150 мВ. напряжения тестового сигнала и была
174
Казанский медицинский журнал. 2009 г., том 90, № 2

Рис.3. Нормализованное по плотности тока соотноше- Рис.4. Нормализованное по плотности тока соотноше-
ние плотность тока/напряжение для изоформы HCN1 ние плотность тока/напряжение для изоформы HCN4
в высоко-/низкокалиевом растворах. в высоко-/низкокалиевом растворах.
максимальной в изоформе HCN4 (p<0,01). ния (при –130 мВ). Полученные нами
При нормализации плотности тока по электрофизиологические характеристики
максимальному значению угол наклона изоформ в целом соответствуют данным
кривой активации во всех изоформах до- литературы [4, 7, 11]. В то же время про-
стоверно не изменялся (табл.2). веденные исследования позволили уста-
В изоформе HCN1 произошел досто- новить более выраженный сдвиг парамет-
верный сдвиг кривой активации влево, ров V1/2HCN2 (–106,92±2,21 мВ) и V1/2HCN4
к более отрицательным значениям (V1/2 (–108,82±0,67 мВ) в сторону отрицатель-
(K+5)= –90,03±4,4, V1/2(K+100)= –108,8±4,75 ных показателей.
(p<0,05). Соответственно и активация тока Согласно данным литературы [6], на-
смещалась несколько левее — с– 30– –40 тивный If ток обладает средней кинети-
до –40 — –50 мВ (табл. 2, рис. 3). Повыше- кой активации (τ=-220 мс), активируется
ние концентрации хлорида калия не ска- при –60 мВ, показатель полуактивации
залось на характере кривой активации был равен –89,3±0,7 мВ, фактор уклона
изоформы HCN2 — V1/2(K+5)=–106,92±2,2, — 12,7±0,7 мВ. Сравнение этих данных с
V1/2(K+100)=–104,63±4,4 (p<0,05). Уклон соответствующими параметрами изоформ
кривой активации и первая активация HCN (табл.2) показало наибольшее сходс-
кривой также не изменялись в сравнении тво If тока с изоформой HCN2, что позво-
с таковыми в физиологическом растворе ляет считать её оптимальным кандидатом
(p>0,05). В изоформе HCN4 изменения для создания биологического пейсмекера.
кривой активации оказались наиболь- Одним из вариантов его создания может
шими: произошел значительный (на –34 быть трансгенная трансфекция мезенхи-
мВ) сдвиг влево — V1/2K+5= –108,82±0,7, мальных клеток геном изоформы HCN2 с
V1/2K+100= –152,96±3,1; p<0,001 (табл.2, последующей имплантацией компетент-
рис.4). Соответственно кривая активации ных клеток в область синоатриального
тока смещалась к –70 — –80 мВ в сравне- узла [2].
нии с –50— –60мВ в контроле. В отличие В высококалиевом экстрацеллюлярном
от плотности тока, кинетика активации растворе в сравнении с физиологическим
не была существенно изменена. значительно возрастала плотность тока,
Таким образом, из трех изоформ HCN1 причем наиболее существенно в случае
показала самую быструю кинетику акти- изоформы HCN2. В изоформе HCN1 и еще
вации, далее следовала HCN2, и самой больше в HCN4 происходили значитель-
«медленной» изоформой оказалась HCN4. ные сдвиги кривой активации влево, т.е.
Кроме того, HCN1 превосходила HCN2 и, к более отрицательным значениям. Кине-
в особенности, HCN4 в плотности тока. тика активации во всех 3 изоформах не
Ток HCN4 активировался гораздо позже претерпевала существенных изменений.
других изоформ (–50 — –60 мВ) и значи- С учетом факта высоких концентраций
тельно раньше достигал порога насыще- изоформы HCN4 в клетках синоатриаль-
175
Казанский медицинский журнал. 2009 г., том 90, № 2

ного узла [3] сдвиг кривой активации вле- 6. Hoppe U.C., Beuckelmann D.J. Characterization
во способен увеличить порог активации и of the Hyperpolarization-activated Inward-Current (If) in
Isolated Human atrial Myocytes//Cardiovasc. Res. —1998. —
время достижения следующего потенциа-
Vol. 38. — P. 788–801.
ла действия, что, в свою очередь, может 7. Ludwig A., Zong X., Jeglitsch M. et al. A family of
замедлить ритм сердца вплоть до его оста- hyperpolarization-activated mammalian cation channels//
новки в диастоле. Nature. — 1998. — Vol. 393. — P. 587–591.
8. Moosmang S., Stieber J., Zong X. et al. Cellular
ВЫВОДЫ expression and functional characterization of four
hyperpolarization-activated pacemaker channels in cardiac
and neuronal tissues// Eur. J Biochem. — 2001. — 268. —
1. В микроэлектродных исследованиях 1646–1652.
при трансгенной экспрессии в овариаль- 9. Santoro B., Tibbs G. The HCN gene family: molecular
ных клетках китайских хомячков кардио- basis of the hyperpolarization-activated pacemaker
специфические изоформы HCN1, HCN2 и channels. In: Molecular and functional diversity of ion
HCN4 показали различную кинетику ак- channels and receptors// Ann. NY Acad. Sci. —1999. —
тивации тока с наиболее быстрой у HCN1 Vol. 868. — P.741–764.
10. Takaichi K., Takemoto F., Ubara Y., Mori Y.
и медленной у HCN4. Analysis of factors causing hyperkalemia// Intern Med. —
2. Изоформа HCN2 по электрофизиоло- 2007. — Vol. 46 (12). — P. 823–829.
гическим параметрам наиболее близка к 11. Ulens C., Tytgat J. Functional heteromultimerization
нативному If току, что позволяет рекомен- of HCN1 and HCN2 pacemaker channels// J. Biol. Chem. —
довать её в качестве реального кандидата 2001. — Vol. 276. — P.6069–6072.
при создании биологического пейсмекера. 12. Vuckovic K., Richlin D. Bradycardia induced by
hyperkalemia //Am. Ass. Occupat. Heath Nuks. J. –2004. —
3. Повышенная концентрация калия Vol. 52 (5). — 186–187.
во внеклеточном растворе приводит к уве- 13. Walter R.B., Bachli E.B. Near-fatal arrhythmia
личению плотности тока во всех изофор- caused by hyperkalaemia// Heart. — 2002. — Vol. 88 (6). —
мах и сдвигу активации тока изоформ P. 578.
HCN1 и HCN4 влево, являясь причиной 14. Whitaker G.M., Angoli D., Nazzari H. et al. HCN2
при данных параметрах электролитного and HCN4 isoforms self-assemble and co-assemble with
equal preference to form functional pacemaker channels//
состава отрицательного хронотропного
J. Biol. Chem. — 2007. — Vol. 282 (31). — P. 2900– 2909.
действия. 15. Yu H., Robinson I., Wymore B. et al. MinK-Related
Peptide 1: A subunit for the Ion Channel Subunit Family
Исследование было выполнено при поддержке Enhance Expression and Speeds Activation// Circ. Res. —
гранта Deutsche Herzstiftung. 2001. — Vol. 88. — P. 84–87.
Поступила 07.04.08.
ЛИТЕРАТУРА
ELECTROPHYSIOLOGICAL CHARACTERIZATION
1. Загидуллин Н.Ш., Загидуллин Ш.З. Возможности OF CARDIO SPECIFIC ISOFORMS OF THE IF
конструкции биологических водителей ритма при по- CHANNEL
ражении синусового узла // Вестн. Военно-мед. акад. —
2007. — № 2 (18). — С.59–62. N.Sh. Zagidullin, Sh.Z. Zagidullin
2. Barbutti A., Baruscotti M., DiFrancesco D. The
pacemaker current: from basic to the clinics// J. Cardiovasc. Summary
Electrophysiol. — 2007. — Vol. 18. — P. 342–347. Cardiac pacemaker ion current If, which determines the
3. Biel M., Schneider A., Wahl C. Cardiac HCN pacemaker function of sinoatrial cells is coded by 3 gens-
channels: structure, function, and modulation// Trends isoforms – HCN1, HCN2 and HCN4. It is noted that HCN1
Cardiovasc. Med. — 2002. — Vol. 12(5). — P. 206–212. current has the fastest speed of activation and HCN4 –
4. Chen J., Wang J., Siegelbaum S.A. Properties of the slowest. HCN2 current showed greatest similarity to
hyperpolarization-activated pacemaker current defined the native If channel and could potentially be used as a
by coassembly of HCN1 and HCN2 subunits and basal basis for creation of the biological pacemaker. The increase
modulation by cyclic nucleotide. // J. Gen. Physiol. — 2001. — of potassium ion concentration in the extracellular bath
Vol. 117. — P. 491–504. solution led to an increase in current density and shifted
5. Er F., Ludwig A., Biel M. et al. Dominant-negative the activation curve in the negative direction in isoforms
suppression of HCN channels markedly reduces the HCN1 and especially in HCN4 which could possibly be the
native pacemaker current I(f) and undermines beating of cause of cardiac arrest during diastole with hyperkalaemia.
neonathal cardiomyocytes// Circulation. — 2003. — 107. — Keywords: cardiac ion current If; gen isoforms HCN1,
Vol. 485–489. HCN2 and HCN4; ovarian cells; activation kinetics.

176