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Ecole supérieure des sciences et techniques de la santé

3ème année Biologie

Examen cytobactériologique
des selles

Dr Hajer RHIM – Dr Sameh BOUGHATTAS


AHU en Microbiologie
Année universitaire: 2019/2020
Composition de la flore digestive
 Tube digestif humain héberge ≈ 1014 bactéries
 > 450 espèces constantes
 Flore dominante: Anaérobies
BGN (Bacteroides…), BGP (Clostridium…), CGP
(Peptostreptococcus…)
 Flore sous dominante:
E. coli, Streptocoques, Entérocoques.......
 Flore de passage :
Corynébactéries (fromage), Lactobacillus (yaourt)…

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Rôles de la flore intestinale

 Activité métabolique dégradent les substrats


exogènes et endogènes…..
 Effet de barrière s’opposent à l’implantation de
bactéries exogènes

 Déséquilibre de la flore commensale,


pathogénicité d’une bactérie
 Ingestion d’une bactérie pathogène exogène
=> Diarrhée

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Diarrhées
 Émission d’au moins 3 selles par jour molles à
liquides depuis moins de 14 jours
 Augmentation brutale de la fréquence et du
volume des selles depuis moins de 3 jours
 Causes infectieuses (bactériennes, virales,
parasitaires)
 Causes non infectieuses (inflammatoires,
tumorales)
 Conséquence d’un traitement antibiotique

 Déshydratation : complication +++

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DIARRHEES BACTERIENNES

 Les bactéries responsables de diarrhées


sont classées, selon leur mode d’action, en
deux catégories :

 Bactéries entéro-invasives

 Bactéries sécrétrices d’entérotoxines

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Physiopathologie : Mécanisme de la diarrhée

 Pour les étiologies infectieuses 2 grands


mécanismes sont décrits, selon les facteurs de
virulence de l’agent infectieux :

 Mécanisme sécrétoire  Tableau de syndrome cholériforme

 Mécanisme entéro-invasif Tableau de syndrome dysentérique


Tableau de syndrome gastroentérique

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Physiopathologie : Mécanisme de la diarrhée

 Mécanisme sécrétoire :
 Toxine pré-formée dans l’aliment avant son ingestion
EXP : Toxi –infection à S.aureus

 Toxine secrétée par l’agent infectieux une fois celui-ci fixé à la


surface de l’épithélium digestif .
EXP : ETEC ( Diarrhée Turista) , Vibrio cholerae, rotavirus

Il n’ya NI invasion Ni destruction de l’épithélium digestif : La toxine


entraine la sécrétion active d’électrolyte et d’eau par les cellules
épithéliale de l’intestin grêle
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Physiopathologie : Mécanisme de la diarrhée

 Mécanisme entéro-invasif :
 Tableau de syndrome dysentérique (bactérie type
shigella)
 Les bactéries envahissent les cellules épithéliales et s’y
multiplient jusqu’à destruction.
 Réaction inflammatoire locorégionale intense avec présence de
sang , de glaire et de pus dans les selles et généralement de la
fièvre .
 Les lésions siègent au niveau du côlon.

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Physiopathologie : Mécanisme de la diarrhée
 Mécanisme entéro-invasif :
 Tableau de syndrome gastroentérique ( bactérie de type
salmonella ou yersinia )

 Les bactéries traversent les entérocytes et les muqueuses sans les


détruire et pénètrent dans le tissu lymphoïde sous muqueux et
mésentériques ou elles se multiplient au sein des macrophages en
donnant une réaction inflammatoire. La fièvre est fréquente
 L’atteinte siège généralement au niveau de l’intestin grêle.

 Il existe un risque de diffusion bactériémique notamment chez


l’immunodéprimé et le drépanocytaire
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Autres mécanismes :
Modèle EPEC / EHEC
 EPEC :
Phénomène attachement - effacement

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Autres mécanismes :
Modèle EPEC / EHEC

 EHEC : Production de Toxines « Shiga like»


appelé SLT
=> Passage dans le sang
=> Thrombose de la microcirculation intestinale
et rénale
=> Colite hémorragique pouvant
se compliquer de SHU
Sérotype O157 H7 le plus fréquent
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Clinique : Syndrome cholériforme
 Selles aqueuses , profuses en « eau de riz »
 Signes de déshydratation fréquents sur Terrains à
risque ( nourrissons , personnes âgées fragiles et /ou
polymédiquées)
 Pas de fièvre (sauf si déshydratation intracellulaire )
 Douleurs abdominales et vomissements inconstants

Bactéries:
Vibrio cholerae O1 et O139
E. coli entérotoxinogènes (ETEC)
S.aureus , clostridium perfringens

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Clinique : Syndrome dysentérique

 Selles nombreuses, afécale , glairo-sanglantes


 Douleurs abdominales diffuses ou colique en cadre,
 Epreinte ( Dlr abdominale + contraction douloureuse et répétitive de la
partie terminale du colon et du rectum s’achevant par une fausse envie
impérieuse d’aller à la selle )
 Ténesme anal ( sensation de tension douloureuse dans la région
anale avec faux besoin )
 Fièvre le plus souvent ( absente dans les amoeboses coliques)

Bactéries:
Shigella dysenteriae
E. coli entéroinvasifs (EIEC)
certaines souches de Campylobacter 14
Clinique: Syndrome gastroentéritique

 Diarrhée banale, aspécifique ( ni aqueuse ,ni glairosanglante)

 Douleurs abdominales diffuses

 Vomissements +/- fièvre

Bactéries:
Salmonella non typhi
E. coli entéropathogènes (EPEC)
Campylobacter jejuni, yersinia

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Diagnostic Etiologique
DIARRHEES BACTERIENNES
Bactéries et mécanisme d’agression
Entéro-invasif Toxinique
EIEC ETEC

Salmonella Staphylococus aureus


Shigella Clostridium difficile
Campylobacter Clostridium perfringens et
botulinum
Yersinia Vibrio cholerae

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Diarrhée post-antibiotique

La diarrhée post-antibiotiques (ou diarrhée des


antibiotiques) est définie par l’émission d’au
moins trois selles très molles à liquides par 24
heures, pendant au moins 24 heures,
survenant pendant un traitement antibiotique,
ou dans les deux mois suivant son arrêt.
Bactéries : Clostridium difficile (responsable de 15 à 25 %
de diarrhées post-ATB et plus de 95 % de colite pseudomembraneuse.
1ère cause de diarrhée nosocomiale )

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EXAMEN
CYTOBACTERIOLOGIQUE
DES SELLES (COPROCULTURE)

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OBJECTIFS
 Rechercher l’agent bactérien responsable de la
diarrhée au sein d’une flore complexe
 Mise en évidence de toxines dans les selles
 Recherche de bactérie responsable d’une IAS
 Recherche de portage de bactérie dans
l’entourage du patient, personnel soignant,
cuisinier
 Étudier sa résistance aux antibiotiques

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Coproculture - Prélèvements
 Selles:

Noix de selles à l’aide d’une spatule, au niveau des


parties mucopurulentes ou sanglantes

Récipient sterile

Acheminement rapide au laboratoire

sinon qlq heures à une nuit à +4°C

au-delà : milieu de transport glycériné

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Coproculture - Prélèvements
 Écouvillonnage rectal: nouveau né, petit enfant,
enquête épidémiologique (BMR)

 Biopsie rectale / colique

 Renseignements cliniques:

Âge, Origine géographique, Voyage récent

Cas similaires dans l’entourage

Prise récente d’ATB

Signes associées (fièvre, douleurs abdominales…)


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Coproculture standard:
Examen macroscopique : Aspect des selles

 Consistance: liquides, molles, solides…

 Couleur verte: transit accéléré

 Couleur noire: méléna ou traitement martial

 Syndrome dysentérique: selles glairo-sanglantes

 Syndrome cholériforme: diarrhée aqueuse profuse ++

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Coproculture standard: Examen
microscopique

 Etat frais:
 Leucocytes: > 5/champ → Processus
invasif
 Hématies
 Mobilité caractéristique de
Campylobacter: en vol de mouche
V. cholerae: en bande de poisson

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Coproculture standard: Examen
microscopique
 Coloration de Gram:
 Flore normale:
 Majorité BGN (60%)
 Présence de BGP (40%)

 Evaluation de toute perturbation notable de


l’équilibre bactérien

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Coproculture standard: Examen
microscopique

 Coloration de Gram:
 Morphotypes
particuliers

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Coproculture / Culture
 Impossible de rechercher tous les germes
entéropathogènes

 Coproculture standard: liste de bactéries


recherchées préétablie / composition dépend de
l’épidémiologie propre à chaque région

 Coproculture orientée: par les signes cliniques,


biologiques et par les données épidémiologiques

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Bactéries recherchées par coproculture
en fonction du contexte
Coproculture standard Salmonella, Shigella, Campylobacter

Salmonella, Shigella, Campylobacter, EPEC


Âge < 2ans

Salmonella, Shigella, Campylobacter, EIEC,


Dysenterie EHEC

Salmonella, S. aureus, V. parahemolyticus,


Intoxication alimentaire
C. perfringens, Yersinia
Diarrhée au cours ou au
C. difficile, S. aureus, K. oxytoca,
décours d’un traitement
P. aeruginosa
antibiotique

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Recherche de Salmonella - Shigella
 Toute coproculture doit systématiquement
mettre en œuvre la recherche de Salmonella et
Shigella
 Milieu d’enrichissement pour Salmonella
Bouillons Mueller-Kauffmann / Sélénite
 Milieu sélectif
 Hektoen

 SS

 XLD

 Milieu chromogène ( salmonella)

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Recherche de Salmonella - Shigella

 Il est recommandé de repiquer le milieu


d’enrichissement sur gélose sélective après 3 à
6 h d’incubation à 37°C
 Milieux Hektoen / SS : repiquer les colonies
suspectes ( 5 au moins) sur milieux urée indole
 Urée négative : ensemencer les milieux sur
galeries d’identification / Urée positive : Proteus
 Salmonella et Shigella : Sérogroupage OxHyHz

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Milieu Hektoen

Couleur Germes
Jaune saumon E. coli, Citrobacter, Klebsiella,
Enterobacter, Serratia, S. arizonae, Vibrio
cholerae (ox+), Aeromonas (ox+), Yersinia

Jaune saumon Proteus vulgaris


à centre gris-noir
Bleues à centre noir Proteus mirabilis
Salmonella
Vertes Shigella, S. Typhi
Pseudomonas spp (ox+)

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Milieu SS

 Lecture: Fermentation du
lactose (colonies rouges) et
production H2S (centre noir)

 Colonies suspectes

Salmonelles = incolore / centre noir

Shigelles = incolore / centre clair

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Bactéries en fonction du milieu de culture
Milieux Caractères de Bactéries y Bactéries
sélectifs différenciation poussant recherchées
SS L(+) rouges, L(-) à centre orange Eliminées

Lactose( -) incolores Shigella, Salmonella, Shigella,


Serratia, Yersinia Yersinia,
Salmonella
Lactose( -) à centre noir Proteus, Salmonella, Salmonella
Citrobacter
HEKTOE Colonies saumon +/-centre noir Eliminées
N Colonies gris-bleu à centre Salmonella, Proteus Salmonella
noir Edwarsiella

Colonies vertes Shigella, Aeromonas, Shigella


Providencia, (Aeromonas)
Pleisiomonas
XLD Colonies jaunes Eliminées
Colonies rouges Shigella, Salmonella, Shigella,
Providencia Salmonella
Colonies rouges + centre noir Salmonella, Edwarsiella Salmonella 32
Recherche de Campylobacter
 La recherche de Campylobacter est
systématiquement réalisée chez les enfants
 Chez l’adulte : sur demande ou selles liquides
 Milieux sélectifs : Skirrow ++, Karmali, Butzler…
 En microaérophilie (5 % O2, 10% CO2, 85% N2)
 Incubation : 37°C, certaines espèces 42°C
 Lecture à partir J2  J8

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Identification de Campylobacter

 Caractères culturaux:
petites, brunâtres, muqueuses ou en voile
 Identification morphologique:
petit BGN, spiralé, très mobile, forme en S,
en longues spires
 Identification biochimique:
catalase +, oxydase +

34
Identification de Campylobacter

35
Recherche de V. cholerae

 La recherche de V. cholerae est effectuée dans le


contexte d’épidémie
 Isolement facile chez le malade: germe abondant dans
les selles
 Isolement chez les porteurs sains: procédé
d’enrichissement: 3 à 4 passages successifs en 3 à 4 h
d’intervalle, en Eau Peptonée Alcaline + Gélose TCBS

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Recherche de V. cholerae

 Enrichissement: à partir des selles, ensemencer un


tube d’eau peptonée alcaline
 Incuber pendant 3 à 6h à 37°C
 Puis prélever 1 dose de la culture en surface et
ensemencer un 2ème tube d’eau peptonée alcaline salée ou
non ainsi qu’un 1milieu sélectif gélosé TCBS
 Incuber 18 à 24h à 35°C en aérobie

37
Identification de V. cholerae

 Colonies jaunes, plates, 2 à 3mm de diamètre,


oxydase +
 Identification biochimique par Api 20E
 Identification antigénique :
Agglutination avec sérums anti-Vibrio cholerae anti O1
et anti O139 à partir de colonies repiquées sur GO
 Détermination de la sensibilité au composé
vibriostatique O/129
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TCBS Thiosulfate, Citrate, Bile, Saccharose

V.Parahaemolyticus
V.Cholerae sur TCBS
sur TCBS

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Recherche de E. coli

 Non exigeant (SS, Hektoen..)


 Gélose Mac Conkey ou gélose Drigalski +++
 Identification selon les tests biochimiques classiques
 Une diarrhée à E. coli pathogène est soupçonnée
devant une selle monomorphe ne présentant que des
BGN à l’ED et donnant une culture pure d’E. coli

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Recherche de E. coli

 Différence entre E. coli commensaux et pathogènes :


mee des facteurs de pathogénicité :
 Toxines, Facteurs d’adhésion, Gènes (PCR)
 Laboratoires très spécialisés

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EHEC
Dépistage d’E. coli O157:H7

 colonies Sorbitol (-)


 agglutination sur lame
MERCI

pour votre attention

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DIAGNOSTIC DES INFECTIONS A EHEC Selles
écouvillonnage rectal

Milieu
d’enrichissement Mise en culture
SMAC Sorbitol

PCR stx

PCR stx PCR stx


négative positive
Isolement de
souche de STEC
Caractérisation
par PCR :
stx1,stx2,eae Caractérisation des souches de
STEC :
galerie d’identification,
stx1,stx2,eae 44
Physiopathologie des diarrhées
bactériennes
 Modèle entérotoxinique:
V. cholerae
 Modèle entéroinvasif:
Modèle Shigella - Modèle Salmonella
 Modèle entéropathogène / Modèle
entérohémorragique

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1- Le modèle entérotoxinique
Entérotoxine
=> sécrétion intestinale hydro-électrolytique

 La toxine du Vibrion cholérique:


première connue et étudiée

 deux sous-unités A et B

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1- Le modèle entérotoxinique
 Mode d’action de la toxine cholérique:
 Fixation de ss unité B sur un récepteur
spécifique (GM1)
=> passage intracellulaire de la ss unité A
=> Activation de l’adényl cyclase cellulaire
=> ↗ AMP cyclique
=> Fuite d’eau, NaCl, K+,HCO3-

47
1- Le modèle entérotoxinique
 E. coli entérotoxinique ou ETEC: structure
et mode d’action ≈ toxine de V. cholerae

48
2- Le modèle entéro-invasif
 Adhésion de la bactérie à la membrane
apicale de l’entérocyte
 Internalisation de la bactérie entéro-invasive
au sein d’une vésicule d’endocytose
 Multiplication dans l’entérocyte, altération
de sa structure, sa destruction
=> extension horizontale de l’infection
 Invasion du tissu conjonctif sous-jacent

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Modèle Shigella / E. coli entéro-invasif
 Phase préalable d’adhésion : LPS
 Formation d’une vésicule d’endocytose qui
permet son internalisation
 Destruction des vésicules / multiplication
des bactéries dans cytoplasme
 Facteurs d’invasion (Ipa: A,B,C,D) et facteurs
de lyse vacuolaire (virf F et virf G)
Facteurs polarisant les filaments d’actine
(envahissement des cellules voisines)
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Modèle Shigella / E. coli entéro-invasif

 La destruction qui s’ensuit de l’épithélium


explique la fuite hydrique
 Elle place également les Shigelles au
contact des tissus sous-jacents
vascularisés
 Les réactions immunitaires sont mises
en jeu, en particulier une intense
réaction inflammatoire

51
Modèle Shigella / E. coli entéro-invasif

 Formation d’abcès : selles purulentes


 Ulcérations de la muqueuse

 Elimination des germes qui ne passent pas


sauf exceptions, dans le sang
 Les coprocultures sont donc positives, avec
présence de pus, de glaires, parfois de sang;
les hémocultures restent négatives

52
Modèle Shigella / E. coli entéro-invasif

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Modèle Salmonella
 Adhésion des bactéries à des récepteurs
cellulaires spécifiques (EGF)
 Formation de vacuole d’endocytose,
multiplication de Salmonella
 Migration de la vacuole vers la membrane
latérobasale et expulsion des bactéries
 Les bactéries sont prises en charge par les
macrophages des follicules lymphoïdes et
des ganglions mésentériques

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Modèle Salmonella
 Si elles sont éliminées, l’infection reste
localisée: coproculture positive et hémoculture
négative
 Dans le cas inverse, les Salmonella passent
dans le sang: coproculture et hémoculture
positives
 Pas de destruction des entérocytes (≠ Shigella)
 Réaction inflammatoire moins intense

55
Modèle Salmonella

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3- Modèle EPEC / EHEC

 Phénomène attachement - effacement

 EPEC :
Malabsorption sévère

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3- Modèle EPEC / EHEC
 EHEC : Production de Vérotoxines VT1-VT2
ou Toxine « Shiga like »
=> Passage dans le sang
=> Thrombose de la microcirculation intestinale
et rénale
=> Colite hémorragique pouvant
se compliquer de SHU

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Diarrhée post-antibiotique :
1er Mécanisme
 Tous les antibiotiques administrés par voie orale ou
parentérale (à l’exception des aminosides) sont
responsables d’une dysbiose aiguë , rapidement
réversible . Cette dysbiose peut être la cause (dans 5 à
20 % des cas selon les antibiotiques) d’une diarrhée
fonctionnelle modérée, bénigne et autolimitée, attribuée
à une altération des capacités fermentaires des résidus
glucidiques par les bactéries du côlon droit et/ou par une
altération du métabolisme des sels biliaires.

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Diarrhée post-antibiotique :
2éme Mécanisme
 Plus rarement (1 à 2 % des prescriptions
antibiotiques), du fait du déséquilibre
écologique induit par les antibiotiques, des
agents bactériens pathogènes déjà résidents
ou de rencontre (Clotridium difficile et plus
rarement Salmonella et Klebsiella oxytoca,
peuvent proliférer et donner lieu à une
infection intestinale symptomatique, souvent
autolimitée.

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