TRASTORNO DE HIPERSENSIBILIDAD DE TIPO RETARDADA EN PACIENTES

CON ERITEMA NUDOSO

El eritema nudoso es la variante más frecuente de paniculitis, proceso inflamatorio

del panículo adiposo o tejido graso de la piel de distintas partes del
cuerpo,principalmente de los miembros inferiores. Consiste en una reacción cutánea
que puede asociarse con una amplia variedad de enfermedades o situaciones
clínicas(infecciosas, sarcoidosis, enfermedades autoinmunes sistémicas,
enfermedades inflamatorias intestinales, uso de determinados fármacos,
embarazo,neoplasias,entre otras).

El eritema nudoso se manifiesta por la aparición de nódulos y placas sobreelevadas,

eritematosas, calientes y dolorosas, localizadas en la zona pretibial y con una
distribución simétrica. Inicialmente, los nódulos son de color rojo brillante, pero en
pocos días se vuelven de color rojo claro o púrpura y, finalmente, toman una
apariencia amarillenta, azulada o verdosa, simulando el aspecto de una equimosis
profunda. Los nódulos no se ulceran y curan sin dejar atrofia ni cicatriz.
Habitualmente, regresan de forma espontánea en unas pocas semanas. Desde el
punto de vista histológico el EN es el prototipo de una paniculitis de predominio
septal, sin vasculitis. Los septos de la grasa subcutánea están engrosados e
infiltrados por células inflamatorias que se extienden a las áreas periseptales de los
lobulillos grasos. La composición de dicho infiltrado inflamatorio varía con el tiempo
de evolución de la lesión. Un hallazgo histopatológico característico son los
granulomas radiales de Miescher, los cuales consisten en pequeños agregados
nodulares de histiocitos dispuestos radialmente alrededor de una hendidura central
con forma variable. El tratamiento del eritema nudoso debe ir dirigido a la
enfermedad causal, si ésta puede identificarse y el reposo en cama suele ser el
único tratamiento necesario (1,2,3,4).
El mecanismo íntimo de producción del EN y de otras paniculitis no se conoce,
probablemente sea multifactorial. Podría tratarse de un proceso de base
inmunológica mediado por autoanticuerpos, inmunocomplejos circulantes, activación
del complemento, vasculitis o hipersensibilidad celular retardada. El depósito de
inmunocomplejos y la activación del complemento serían responsables de las
lesiones histopatológicas.

La urticaria crónica autoinmune (UCA) consiste en un síndrome reaccional de la piel

y mucosas caracterizado por ronchas pruriginosas ocasionadas por edema
vasomotor transitorio y circunscrito de la dermis que dura algunas horas, en
ocasiones acompañado de angioedema, cuyo origen es inmunológico y causado por
autoanticuerpos contra el receptor de alta afi nidad para IgE (FcRI) y anti-IgE.1-5

Epidemiología​.
El EN tiene una incidencia muy variable (de 5 a 25 casos por 100.000
habitantes/año), de unas regiones a otras. En los adultos es más frecuente en las
mujeres (ratio 5:1), sin embargo, en los niños la incidencia es similar en ambos
sexos. Aunque puede aparecer a cualquier edad, su máxima incidencia ocurre entre
los 30 y 50 años. La etiología y características epidemiológicas pueden ser variables
de unas zonas geográficas a otras, dependiendo de la prevalencia de las diferentes
enfermedades causales, sobre todo las de origen infeccioso y la sarcoidosis. Se ha
descrito una mayor incidencia en invierno y primavera, quizá en relación con la
aparición de infecciones de vías respiratorias altas.

La incidencia estimada de urticaria autoinmune en la población general es del 15 al

25%. Se presenta con mayor frecuencia en adultos que en niños, afecta a un 6-7%
de los niños en edad preescolar.Del 12-14% de los pacientes con UC tienen en la
circulación autoanticuerpos antitiroideos (antitiroglobulina o antiperoxidasa), tal cifra
es significativamente mayor que la incidencia en la población normal de 3-6%. De
estos pacientes, aproximadamente el 5-34% son clínica y bioquímicamente
eutiroideos. Del 5-10% tienen la enfermedad clínicamente aparente. La prevalencia
de la autoinmunidad tiroidea en niños va del 0.35 a 4.3%.1(9)

Etiología

Entre el 30% y el 50% de los casos de EN son idiopáticos. Requena y Sánchez Yus
han recogido recientemente más de 150 causas diferentes de eritema nudoso
secundario (4). Aunque la etiología es muy variada,en nuestro medio, la mayoría de
las veces se debe a infecciones faríngeas por Streptococcus ß- hemolítico del grupo
A, infecciones intestinales por diferentes microorganismos (Salmonella, Shigella,
Yersinia o Campylobacter), tuberculosis, fármacos (sobre todo los antibióticos
betalactámicos, sulfamidas y anticonceptivos orales), sarcoidosis y embarazo. No
obstante, teniendo en cuenta la diversidad etiológica y la potencial gravedad de
algunas de las enfermedades que lo provocan, es preciso realizar una valoración
adecuada de todos los pacientes que permita diagnosticar o descartar los casos
más graves precozmente (1-6).

La distinción clínica de esta enfermedad muchas veces no es posible, aun para el

médico experto. Incluso el diagnóstico diferencial histopatológico constituye una
tarea ardua para el anatomopatólogo interesado en esta patología, ya que procesos
de enorme trascendencia, como son los linfomas del tejido celular subcutáneo,
podrían confundirse con otros más banales.También hay que tener en cuenta que
hay personas con patologías similares, como por ejemplo en el caso de la urticaria
cuando la histamina se libera y se almacena en los mastocitos causando la
formación de ronchas y picor,en este caso los antihistamínicos sirven para tratarla,
pero en muchos pacientes no funciona, lo que significa que algunos tipos de
urticaria son autoinmunes, es decir que hay una presencia de anticuerpos que
producen la estimulación crónica de los mastocitos provocando la aparición de los
síntomas. De la urticaria 30-45% de los adultos tienen una etiología autoinmune. La
evidencia inicial se realizó por Hide et al. quienes mostraron anticuerpos IgG,
principalmente de la subclase de IgG1, IgG3, dirigidos contra el receptor alfa de alta
afinidad de IgE FcRI en un 35-40% y contra IgE en un 5-11% de los mastocitos y
basófilos. La IgG4 también participa, aunque, a diferencia de IgG1 e IgG3, no se fija
al complemento (9)

Las microvesiculas son estructuras vesiculares que se forman de manera

dependiente del calcio a partir de las membranas de diversas fuentes celulares,
fueron consideradas inicialmente como subproductos celulares inertes sin funciones
biológicas aparentes. Sin embargo, su extensa caracterización, ha llevado a
descubrir que poseen un amplio espectro de actividades biológicas, que incluyen la
comunicación intercelular,diferentes fases de la inmunidad innata y adaptativa, la
apoptosis y la homeóstasis celular. La participación de las MP en uno u otros
procesos se debe esencialmente a su composición que varía de acuerdo al origen
celular y a la forma como se generen estas estructuras; las MP se producen
principalmente durante la muerte celular y la activación de la respuesta inmune (7).
Se considera que las MP producidas bajo condiciones basales son responsables de
la activación homeostática y que mantienen los umbrales de activación frente a
autoantígenos. Pero en el caso del eritema nudoso es posible considerar que hay
una desviación en el fenotipo y función de las MP circulantes en estos pacientes y
que, dado el tipo de daño que se observa es posible postular que forman complejos
inmunes capaces de activar células endoteliales.

En el contexto de paniculitis, la presente propuesta se basa específicamente en

estas preguntas:

1. ​¿Qué alteraciones fenotípicas y cuantitativas existen en las MP de estos

pacientes en comparación con los controles sanos?
2.​ ¿Se asociarán el fenotipo y número de las subpoblaciones de monocitos
con la presencia de MP y los CI que formen?
3​. ¿Se asociarán las alteraciones fenotípicas o numéricas de las MP y los CI
que formen con la actividad de ambas enfermedades?
4.​ ¿Cómo afectarán las MP y los CI que formen la diferenciación a macrófagos
y activación de los fagocitos mononucleares?

HIPÓTESIS.
Los pacientes con paniculitis y urticaria autoinmune presentan una frecuencia mayor
de MP en circulación con un fenotipo característico de cada enfermedad asociado a
la actividad de las mismas. Estás MP y los complejos inmunes que forman pueden
activar las células endoteliales hacia un perfil pro-inflamatorio y explicar en parte la
actividad de la enfermedad.
Objetivo General.
Caracterizar fenotípica y cuantitativamente las MP de pacientes con paniculitis y
urticaria autoinmune, así como el efecto de las MP y los CI que formen además de
su capacidad de activar células endoteliales, comparados con controles sanos.

Objetivos Específicos.
1​. Comparar los números absolutos y el fenotipo (marcadores celulares de
superficie de leucocitos CD45, CD41a, CD33, CD19 y CD3 endoteliales CD31;
positividad para Anexina V, péptidos citrulinados, HGMB1 y ácidos nucleicos) de
las MP circulantes, así como su participación en la formación de CI entre los
pacientes con paniculitis,urticaria autoinmune y controles sanos.
2. Evaluar el efecto de las MP de pacientes con paniculitis, urticaria autoinmune y
controles sanos,opsonizadas y no opsonizadas mediante el suero de estos
pacientes, sobre la activación del endotelio.
3​.Comparar la respuesta de los mecanismos inmunológicos en dos enfermedades
similares que afectan la piel, paniculitis y urticaria autoinmune.

4. ESTRATEGIA METODOLÓGICA.

4.1. Tipo de Estudio.

La primera fase de este estudio es de carácter transversal, analítico y descriptivo
de un grupo de pacientes diagnosticados con eritema nudoso y otro grupo con
urticaria autoinmune, comparados con controles sanos. La segunda fase del
proyecto es de índole experimental, en la que se pretende comparar el efecto de las
MP y los CI que formen sobre la activación de células endoteliales HUVEC.

4.2. Población de Estudio.

4.2.1. Pacientes.

Pacientes con eritema nodoso.

Corresponden a pacientes con paniculitis diagnosticados por un dermatólogo a
través de biopsia en la IPS Universitaria de la ciudad de Medellín.

Pacientes con urticaria autoinmune.

Corresponden a pacientes con urticaria diagnosticados por un dermatólogo por
medio de un test autólogo, el cual consiste en una inyección intradérmica de suero
autólogo en la piel,con histamina como control positivo y suero fisiológico como
negativo, el cual se realizará en la IPS Universitaria de la ciudad de Medellín.

Criterios de inclusión de pacientes con eritema nodoso y urticaria

autoinmune. ​Ser mayor de 18 años.Diagnóstico de forma clínica,además por
biopsia o test y que hayan firmado el consentimiento informado.
Criterios de exclusión pacientes con eritema nodoso y urticaria autoinmune:
Haber recibido terapias biológicas (como anti-TNF-alfa, anti-CD20, anti-CTLA-4,
entre otras) o experimentales (tratamientos que todavía no se hayan aprobado para
su uso en humanos o que se encuentren en fases preclínicas de evaluación).
Pacientes con diagnóstico o historia previa de cáncer, diabetes, inmunodeficiencias,
enfermedad renal o hepática. Evidencia clínica de un proceso infeccioso al momento
de la toma de la muestra.

4.2.2. Controles.

Individuos sanos.
Personas clínicamente sanas al momento de la toma de la muestra, que se captarán
de la población general de la Sede de Investigación Universitaria de la Universidad
de Antioquia. Se aclara que para la primera fase se seleccionarán individuos
pareados por género y con un rango de edades similares (+ 2 años) al grupo de
pacientes con paniculitis y urticaria autoinmune. Para la segunda fase no se
requerirá de estas especificaciones en los donantes sanos.

Criterios de inclusión​: Individuos mayores de 18 años. Firma de consentimiento

informado.
Criterios de exclusión:​ Antecedentes de cáncer, autoinmunidades, algún tipo de
diabetes, inmunodeficiencias primarias o adquiridas, disfunción renal y
antecedentes de falla hepática. Evidencia clínica de un proceso infeccioso al
momento de toma de la muestra o infecciones recientes.

Muestra.
En esta parte del estudio se pretende captar 60 pacientes con eritema nudoso, 60
pacientes con urticaria autoinmune y 60 controles sanos. Este número de pacientes
se basa en la frecuencia de pacientes atendidos por año en los Servicios de la IPS
Universitaria en un lapso de dos años.

ESTRATEGIAS DE LABORATORIO.
A continuación, se describen brevemente las técnicas de laboratorio para cada
objetivo del proyecto (Ver anexo)

Caracterización y cuantificación de MP.

Las MP serán aisladas del plasma pobre en plaquetas (PP) como previamente se ha
reportado (8). Brevemente,5ml de sangre venosa anticoagulada con citrato será
centrifugada a 1.800 x g durante 10 min a temperatura ambiente, se colectará el
plasma al cual se le hará una segunda centrifugación a 3.000 g para obtener PP. El
PP será dividido en alícuotas de 225 L y congelado a -80ºC.
Al PP se le harán los siguientes procedimientos:

1.​ Para identificar la procedencia de las MP se inmunotipificarán con anticuerpos

para:

CD45​:Proteína tirosin fosfatasa presente en mayor proporción en los linfocitos B y T,

también está presente en los leucocitos
CD41a:​Se encuentra en plaquetas y precursores de plaquetas en la adhesión y
agregación de estas. Actúa como receptor de fibrinógeno, factor de von Willebrand
(vWf), fibronectina y vitronectina
CD33:​r​eceptor transmembrana expresado en células del linaje ​mieloide​,también se
puede encontrar en algunas células ​linfoides.
CD19: Proteína transmembrana expresada específicamente en linfocitos B, forma
un complejo con CD21 y CD88
CD3: ​Transducción de señales de TCR,se expresa específicamente en timocitos y
linfocitos T
CD31: Molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias,desempeña un
papel importante en la eliminación de neutrófilos envejecidos del cuerpo

La inmunotipificación se llevará a cabo mezclando las microvesículas aisladas de

plaquetas, con un anticuerpo específico(mencionado anteriormente) en función de
su movilidad electroforética y en un ph alcalino,la muestra migrará a través de un
tubo capilar.​Una prueba positiva va a involucrar la inmuno sustracción de los
componentes monoclonales sin importar que sea una cadena pesada, ligera o
ambas. La unión entre anticuerpo presente en la muestra y el antisuero presente en
el reactivo genera un compuesto más pesado y de mayor carga negativa,
provocando una migración más rápida, permitiendo tipificar las gammapatias
monoclonales de acuerdo a su cadena pesada y ligera que puede ser observable y
cuantificable.

2​. Para evaluar algunos componentes de las MP se adicionará Anexina V con el fin
de detectar células apoptóticas presentes,también se usaran anticuerpos contra
péptidos citrulinados las cuales van dirigidas a las proteínas propias del individuo y
contra HGMB1(alarmina) ya que es un medidor de citoquinas de inflamación que
inhibe la eliminación de células apoptoticas manteniendo asi la inflamación.Se
espera ver la reacción de las microvesículas de pacientes sanos como enfermos
con cada una de estas moléculas y asi observar si hay algun tipo de respuesta por
parte de ellas, para de este modo saber si juegan un papel importante en la
inflamación de los tejidos.

3​. Para evaluar la presencia en las MP de ácidos nucleicos ARN y ADN, se hará
una tinción con yoduro de propidio en presencia o ausencia de enzimas que
degradan ADN o ARN.Esto porque las microvesículas se desprenden de plaquetas
y pueden tener ADN ARN o lípidos.

4​. Para evaluar si las MP están formando complejos inmunes se adicionarán

anticuerpos fluorescentes contra IgM, IgG que son las inmunoglobulinas encargadas
de la defensa contra microorganismos y se observarán las reacciones.Todas las
muestras se analizaran por citometría de flujo Cytoflex (BeckmanCoulter).

5​. Se cultivarán células endoteliales HUVEC y se expondrán a las MP de los

pacientes y los controles, para evaluar la expresión del ICAM-1 y VCAM-1 las cuales
son moléculas de adhesión que pueden encontrarse en las membranas de las
células endoteliales y aumentar su concentración en presencia de citoquinas pro
inflamatorias, esta prueba se realizará mediante anticuerpos monoclonales por
citometría de flujo, también se estudiará la acumulación de TNF-alfa mediante
CBA-FlexSET (BD Biosciences), estas citocinas que intervienen en la inflamación y
la apoptosis.

RESULTADOS ESPERADOS

● Las microvesículas se pueden encontrar en circulación por medio de

exosomas, en una persona sana, estas vienen de las plaquetas y en una
persona enferma vienen de otras células, teniendo como punto de partida
esta afirmación, se espera que en las MP de pacientes sanos se encuentre
ADN o ARN ya que es propio de este tipo de células,se espera también que
en las MP de pacientes enfermos no se encuentre.
● Se espera que las microvesículas de los pacientes con eritema nudoso sean
inmunogénicas, es decir que activen por medio de sus componentes al
sistema inmune,es por ello que las células endoteliales que sean puestas en
contacto con estas microvesículas van a registrar la presencia de citoquinas y
otros factores como ICAM-1 y VCAM-1, tambien se encontrara una alta
acumulacion de TNF-alfa.
● Los pacientes con paniculitis y urticaria autoinmune presentan una mayor
proporción de MP en circulación que los controles sanos, además de que
forman complejos inmunes con otras moléculas como IgM, IgG
● Las MP van a formar complejos inmunes que mediaran a activacion de los
fagocitoss mononucleares.
● En cuanto a la procedencia de las MP se espera que no se encuentre CD31
ni CD41a en los pacientes enfermos.
● Es posible que no se encuentren celulas apoptóticas en los componentes de
las MP de pacientes enfermos y que se encuentre presencia de calreticulina
como HMGB1 en la superficie ya que esperamos que las microvesiculas sean
inmunogenicas.
Referencias.
1. Requena L, Sánchez Yus E. Panniculitis. Part I. Mostly septal panniculitis. J Am
Acad Dermatol. 2001;
45: 163-83.
2. Requena L, Sánchez Yus E. Panniculitis. Part II. Mostly lobular panniculitis. J Am
Acad Dermatol. 2001;
45: 325-61.
3. Requena L. Normal subcutaneous fat, necrosis of adi- pocytes and classification
of the panniculitides.
Semin Cutan Med Surg. 2007; 26: 66-70
4. Requena L, Sánchez Yus E. Erythema nodosum. Semin Cutan Med Surg. 2007;
26: 114-125.
5. Giménez Camarasa JM. Paniculitis. En: Tratado de Reumatología. Eliseo Pascual
Gómez, Vicente
Rodríguez Valverde, Jordi Carbonell Abelló, Juan J. Gómez-Reino Carnota Editores.
ARÁN Ediciones,
S.A. 1998. páginas 775-787.
6. Jeffrey P Callen. Panniculitis. En: Rheumatology. Edited by: Marc C Hochberg,
Alan I Silman, Josef S
Smolen, Michael E Weinblat, Michael H Weisman. Trird edition. Mosby. 2003.
páginas 1683-1687.
7. Morel O, Jesel L, Freyssinet JM, Toti F. Cellular mechanisms underlying the
formation of circulating
microparticles. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2011;31(1):15-26.
8. Nielsen CT, Ostergaard O, Johnsen C, Jacobsen S, Heegaard NH. Distinct
features of circulating
microparticles and their relationship to clinical manifestations in systemic lupus
erythematosus.
Arthritis Rheum. 2011;63(10):3067-77.
9.Urticaria cronica autoinmune como posible manifestacion no endocrina de un
sindrome poliangular autoinmune- endocrinologia y nutricion