Вы находитесь на странице: 1из 104

Федеральное государственное образовательное учреждение

высшего профессионального образования


АСТРАХАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ
Кафедра «Прикладная биология и микробиология»

ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ.

МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ,

ИДЕНТИФИКАЦИИ, ХРАНЕНИЯ.

Астрахань – 2008
Составитель:
ЕРЕМЕЕВА С.В., к.б.н., доцент кафедры «Прикладная биология и
микробиология»

Рецензенты:
Егоров С.Н. – к.б.н., зав. лабораторией водных проблем и токсикологии
ФГУП «КаспНИРХ»,
Насибулина Б.М. – д.б.н., профессор кафедры экологии и БЖД АГУ,
Дороселия Г.Я. – д.б.н., профессор кафедры «Пищевая биотехнология и
технология продуктов питания» АГТУ.

Плесневые грибы. Методы выделения, идентификации, хранения:


Справочное пособие для студентов высших учебных заведений,
обучающихся по направлениям и специальностям экологического,
биологического и биотехнологического профиля. / АГТУ; Сост.:
С.В.Еремеева. – Астрахань, 2009. – 104 c.

В справочном пособии изложены методы выделения плесневых грибов на


селективные среды, основы идентификации, культивирования и хранения
грибов различных классов, приведены способы определения показателей
роста грибов, даны наиболее используемые среды для выделения и
культивирования плесневых грибов. Пособие может быть полезно для
работы на практических, лабораторных занятиях и для самостоятельной
работы студентов при выполнении научно-исследовательских работ.
Справочное пособие рассчитано для студентов высших учебных заведений,
обучающихся по направлениям и специальностям экологического,
биологического и биотехнологического профиля, аспирантов, научных
сотрудников.

Справочное пособие утверждено на заседании кафедры «Прикладная


биология и микробиология» 29.03.07 г., протокол № 13.

Справочное пособие утверждено на заседании методического совета по


специальности «Микробиология» 24.04.07 г., протокол № 7.

©Астраханский государственный технический университет

2
СОДЕРЖАНИЕ
Введение 4
1. Основы систематики и классификации грибов 5
2. Приемы выделения и культивирования
микроскопических грибов 10
2.1. Подготовка проб 10
2.2. Определение численности и состава комплекса
микромицетов 13
2.3. Учет грибов при выделении на питательные среды 14
2.4. Пересев для выделения чистых культур и накопления
биомассы 16
2.5. Определение количества и биомассы грибов 17
2.6. Определение показателей роста грибов 20
2.7. Среды и условия культивирования для выделения
различных групп грибов 24
3. Идентификация плесневых грибов 57
3.1. Изучение морфологии репродуктивных органов 58
3.2. Методы фиксации и окрашивания 59
3.3. Идентификация отдела ZYGOMYCOTA 64
3.4. Идентификация отдела ASCOMYCOTA 74
3.5. Идентификация отдела CHYTRIDIOMYCOTA 74
3.6. Идентификация отдела BASIDIOMYCOTA 84
3.7. Идентификация анаморфных грибов 85
4. Хранение культур грибов 105
Приложение 1. Словарь терминов 114
Приложение 2. Среды для культивирования 125
Список литературы 143

3
ВВЕДЕНИЕ
Микромицеты составляют неизменный компонент различных
биоценозов во всех их звеньях: взаимоотношениях с высшими растениями,
почвенной фауной, бактериями, круговороте веществ в природе и создании
почвенного плодородия. Микромицеты, обладающие значительной
полиморфностью, способны осуществлять как локальное, так и
пространственное заселение субстратов, осуществлять трансформацию
многочисленных органических и минеральных соединений в белок и
другие физиологически активные метаболиты. Среди них имеются
представители, поражающие насекомых, нематод, корни растений; многие
виды развиваются на экскрементах животных, растительных остатках;
известны грибы-микоризообразователи. Кроме этого, гифы микромицетов,
которые обладают поглотительной, адсорбционной и выделительной
функциями, представляют собой субстрат, вокруг которого происходит
интеграция многих других организмов, возникают их характерные
ассоциации и сукцессии. При этом разные виды микромицетов способны
синтезировать и выделять в окружающую среду метаболиты биотического
и абиотического действия на другие организмы и высшие растения.
Наконец, многие виды микромицетов являются источником контаминации
многих субстратов окружающей среды и индикаторами ее состояния.
Значение грибов для многих отраслей народного хозяйства обязывает
ученых возможно лучше познавать их состав на различных территориях и
субстратах.
В предлагаемом пособии изложены методы выделения плесневых
грибов на селективные среды, основы идентификации, культивирования и
хранения грибов различных классов, приведены способы определения
показателей роста грибов, даны наиболее используемые среды для
выделения и культивирования плесневых грибов, используемых в качестве
продуцентов в микробиологической промышленности.
В основу пособия положены лекции и практические занятия по
дисциплинам «Микробиология», «Основы микробиологии», «Частная
микробиология», «Почвенная микробиология», «Промышленные
микроорганизмы и методы их получения», «Биотехнология» прочитанные
сотрудниками кафедры «Прикладная биология и микробиология»
студентам АГТУ.
Пособие также может быть полезно для самостоятельной работы
студентов и при выполнении научно-исследовательских работ.

4
1. ОСНОВЫ СИСТЕМАТИКИ И
КЛАССИФИКАЦИИ ГРИБОВ
Грибы – большая группа эукариотных гетеротрофных организмов с
осмотрофным способом питания. Типичное вегетативное тело, или таллом,
большинства грибов представляет собой систему ветвящихся трубок, гиф,
с апикальным ростом и боковым ветвлением. Мицелий может быть
клеточный и неклеточный.
Неклеточный мицелий лишен перегородок. В течение его роста
деления ядер происходят в нем без образования клеточных перегородок -
септ, что ведет к развитию большой массы цитоплазмы, содержащей много
ядер. Эта многоядерность, или ценоцитичность мицелия грибов
пространственно ограничена в своем разрастании клеточными стенками
гиф. Ценоцитический мицелий фактически представляет собой одну
гигантскую многоядерную клетку. Он характерен для ряда представителей
отдела хитридиомикота, а также для представителей отделов оомикота и
зигомикота (рис. 1.1).
Другой тип вегетативного тела грибов — клеточный, или
септированный, мицелий, разделѐнный перегородками на одно-, дву- или
многоядерные клетки. Он характерен для сумчатых, базидиальных и
несовершенных, или анаморфных грибов (рис. 1.2). Септы могут
формироваться и на неклеточном мицелии, обычно это происходит при
повреждении мицелия или при образовании репродуктивных органов. При
делении клетки септа врастает с боков к центру. В центре септы обычно
остаѐтся пора, через которую из клетки в клетку перемещаются
питательные вещества и некоторые клеточные органеллы.

Рис.1. Типы мицелия: 1 — неклеточный мицелий; 2 — клеточный мицелий; 3 —


одноклеточный таллом с ризомицелием; 4 — почкующиеся клетки, псевдомицелий.

Мицелий, пронизывающий субстрат, поглощающий из него


питательные вещества и выделяющий продукты своего обмена, называют
субстратным мицелием. Часть мицелия, располагающаяся на поверхности

5
субстрата или над субстратом, составляет поверхностный, или воздушный
мицелий, на котором обычно образуются органы размножения грибов.

Царство Fungi (Mycota, Mycetalia – настоящие грибы) подразделяют


на следующие отделы: Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota,
Chytridiomycota и формальную группу, не имеющую таксономического
статуса Анаморфные грибы (Митоспоровые или несовершенные грибы,
Deuteromycetes (группа Fungi imperfecti)).
Царство FUNGI (MYCOTA, MYCETALIA) — Настоящие грибы
Отдел Chytridiomycota — Хитридиомикота
класс Chytridiomycetes — Хитридиомицеты
Отдел Zygomycota — Зигомикота
класс Zygomycetes — Зигомицеты
класс Trichomycetes — Трихомицеты
Отдел Ascomycota — Аскомикота, или сумчатые грибы
класс Archiascomycetes— Археаскомицеты
класс Hemiascomycetes — Гемиаскомицеты, или Голосумчатые
класс Ascomycetes (= Euascomycetes) - Эуаскомицеты, настоящие сумчатые,
или плодосумчатые
класс Loculoascomycetes (= Dothideomycetes) — Локулоаскомицеты
Отдел Basidiomycota — Базидиомикота
класс Basidiomycetes — Базидиомицеты
класс Urediniomycetes — Урединиомицеты
класс Ustilaginomycetes — Устилагиномицеты
Группа Анаморфные, несовершенные, или митоспоровые грибы
(Anamorphic fungi, Mitosporic fungi)
Класс Hyphomycetes - Гифомицеты
Класс Coelomycetes - Целомицеты
Класс Agonomycetes (Mycelia sterilia) – Агономицеты (мицелия стерилия)

В состав клеточной стенки как основной компонент входит хитин в


сочетании с глюканом, маннаном или (в отделе Zygomycota) с хитозаном.
Подвижные стадии (зооспоры, гаметы) в цикле развития имеются только у
представителей отдела Chytridiomycota. Царство включает пять отделов,
предположительно филогенетически связанные между собой.
Два отдела — Chytridiomycota (хитридиомикота) и Zygomycota
(зигомикота) имеют вегетативное тело, состоящее из неклеточного
мицелия. Другие отделы —Ascomycota (аскомикота), Basidiomycota
(базидиомикота) и группа митотических ("Dictionary of the Fungi", 1995),
или анаморфных ("Dictionary of the Fungi", 2001), грибов (Anamorphic fungi,

6
Mitotosporic fungi) — из клеточного мицелия. Основные признаки отделов
настоящих грибов представлены в таблице 1.
Таблица 1
Основные признаки отделов царства грибов

Отделы
Признаки Chytridiomycota Zygomycota Ascomycota Basidiomycota Anamorphic
fungi
Бесполое Зооспоры Спорангио- Конидии Редко Конидии
размножение споры фрагменты
гиф, конидии,
базидио-
споры
Половое Зиготы Зигоспоры Аскоспоры Базидиоспоры Отсутст-
размножение вует
Септа Отсутст- Отсутст- Простая Перфориро- Простая
вуют вуют пефориро- ванная, перфориро-
ванная специализи- ванная
рованная,
долиспоровая
Число видов Около 500 Около 600 Около 30000 Около 25000 Около 30000
Примеры Возбудители Серая Дрожжи Съедобные, Почвенные
рака картофеля - плесень пекарские, ядовитые, грибы,
Synchytrium, (Mucor), плесени ржавчинные, патогены
оспы кукурузы - арбускуляр- (Penicillium), головневые растений
Phyzodemra ные сморчки, (Trichoderma,
микоризные трюфели, Alternaria,
грибы многие Botrytis)
(Glomus) патогены
растений –
мучнисто-
росяные
грибы

К отделу зигомицетов гриб относят на основании обнаружения у


исследуемой культуры специальных структур - зигот, образовавшихся в
результате полового процесса (копуляции гаметангиев), имеющих
характерное строение.
Зиготы имеют толстую, обычно скульптурированную темную оболочку
и могут быть с многочисленными выростами или иметь грубо шероховатую
поверхность (рис. 3). В случае отсутствия зигот организм можно отнести к
зигомицетам по бесполым спороношениям в виде спорангиев, спорангиолей
(содержат небольшое число спор); мераспорангиев с неподвижными
спорангиоспорами. При редукции числа спор в спорангиоли до одной они
имеют вид конидий, которые образуются всегда на специальных вздутиях.

7
В большинстве случаев у зигомицетов мицелий несептированный, однако
есть исключения.

Рис. 3. Органы полового и бесполого спороношения у зигомицетов: 1- зигота, 2-


суспензор, 3- придатки зиготы, 4- спорангиеносец, 5- ризоиды, 6- спорангий, 7- столбик
спорангиеносца, 8- споры, 9- спорангиоли.

К отделу аскомицетов, или сумчатых, грибы относят на основании


образования ими сумок как конечного этапа полового процесса. Сумка
может быть разной формы (округлой, цилиндрической, булавовидной) и
размера, чаще содержит восемь аскоспор, но может иметь две, четыре и
другое количество (рис. 4).

Рис. 4. Органы полового размножения у аскомицетов: 1 - сумки различной формы, 2 -


парафизы (стерильные гифы). Плодовые тела: 3 - перитеции, 4 - клейстотеции, 5 -
апотеции

8
Сумки преимущественно находятся в плодовых телах - аскокарпах
(замкнутых, обычно круглых, без отверстия, называемых клейстотециями, и
с отверстием более разнообразной формы).
Принадлежность грибов к анаморфным грибам устанавливают по
наличию разнообразных конидиальных спороношений как открытых, так и
внутри специальных вместилищ - пикнид и отсутствии каких-либо половых
спороношений (рис. 5).
Наиболее часто из почвы на различные питательные среды
выделяются грибы из классов Zygomycetes, Ascomycetes и Hyphomycetes.
Грибы остальных классов выделяются значительно реже и, как правило,
только при использовании специальных сред и методов, поэтому в данном
пособии под термином «грибы» рассматриваются микроскопические грибы
вышеназванных классов.

Рис. 5. Различные способы агрегаций конидиальных спороношений у несовершенных


грибов: 1 - одиночные конидиеносцы, 2 - коремия, 3 - ложе, 4 - пикнида.

9
2. ПРИЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ

2.1. Подготовка проб


При изучении почвенной микофлоры готовят смешанные образцы,
отбирая пробы по диагонали участка на определенной глубине от
поверхности. Микроорганизмы в почве распространены неравномерно,
поэтому важно анализировать большое число почвенных образцов.
Почвенные образцы отбирают стерильным буром, стерильной лопатой или
стерильным ножом в заранее приготовленную стеклянную широкогорлую
стерильную банку, закрывающуюся корковой пробкой, обернутой
стерильной ватой, либо в стерильные полиэтиленовые или пергаментные
мешки. На пакеты, банки наклеивают этикетки с указанием места взятия
пробы, горизонта и других сведений. Бур, лопату и нож в поле перед
взятием образца тщательно очищают, затем обжигают горящим спиртом.
Почвенные образцы необходимо анализировать в первые сутки
(допускается хранение их в холодном помещении в течение двух дней).
Для взятия пробы почвы стерильным ножом снимают верхний слой почвы
(1,5 – 2,0 см), который может быть загрязнен посторонней микрофлорой.
Далее совком или лопатой берут 100 – 200 г почвы и насыпают в пакет или
банку. При изучении микроорганизмов на разной глубине пробы почвы
берут по генетическим горизонтам из почвенного разреза.
Пробы воды для микробиологического анализа отбирают в
стерильные емкости. Для отбора проб воды используют специально
предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости
многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на
жизнедеятельность микроорганизмов. Емкости должны быть оснащены
плотно закрывающимися пробками (силиконовыми, резиновыми или из
других материалов) и защитным колпачком (из алюминиевой фольги,
плотной бумаги) или с завинчивающимися крышками. Многоразовая
посуда, в том числе пробки, должна выдерживать стерилизацию сухим
жаром или автоклавированием. Стерильные емкости открывают
непосредственно перед отбором, удаляя пробку вместе со стерильным
колпачком. Во время отбора пробка и края емкости не должны чего-либо
касаться. Ополаскивать посуду не следует. После наполнения емкость
закрывают стерильной пробкой, обеспечивающей герметичность и не
намокающей при транспортировании (ватные пробки не применять), и
стерильным колпачком. При заполнении емкостей должно оставаться
пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не
смачивалась при транспортировке.

10
Поверхностные пробы отбирают с глубины 10-15см от поверхности
воды или от нижней кромки льда. Придонные пробы отбирают в 30-50см от
дна. Отбор проб следует производить с использованием различных
плавсредств, с мостов, помостов в местах, где глубина водоемов не менее
0,5м. Недопустимо производить отбор проб с берега. Поверхностные
пробы отбирают батометром с устройством для закрепления стерильных
емкостей. Глубинные пробы отбирают специальным батометром,
предназначенным для этих целей. При отборе одним батометром
нескольких проб его каждый раз стерилизуют фламбированием. Из одной
точки в первую очередь отбирают пробы для микробиологических
исследований, а затем для других целей. Проруби делают, избегая внесения
загрязнения со льда и инструментов. Руки перед отбором проб должны
быть обеззаражены. Объем пробы должен быть не менее 500 мл. Доставку
проб воды осуществляют в контейнерах-холодильниках при температуре
4-10°C. В холодный период года контейнеры снабжают
термоизолирующими прокладками, обеспечивающими предохранение проб
от промерзания. В лаборатории, если анализ по каким-либо причинам
откладывают, пробы следует поместить в холодильник. При соблюдении
указанной температуры транспортирования и хранения срок начала
исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 часов. Если
пробы нельзя охладить, их анализ проводят в течение 2 часов после забора.
Посуда, применяемая в микробиологической практике, должна быть
химически чистой и стерильной. Сначала посуду следует отмыть от
механических загрязнителей. Мытье производят горячей водой ершами с
мылом, содой или стиральными порошками. Часто посуду отмывают с
помощью хромовой смеси (на 1 л воды берут 50 г двухромовокислого
калия и 100 г концентрированной серной кислоты, смесь готовят в
фарфоровой кружке). Стеклянную посуду стерилизуют в автоклаве 1 ч при
давлении 1 атм (121°С) или в сушильном шкафу 2 ч при 160°С. Способ
стерилизации среды зависит от ее состава.
Предпосевная подготовка почвы осуществляется путем просеивания,
растирания увлажненной до пастообразного состояния 10 г почвенной
навески в фарфоровой ступке пестиком с резиновым наконечником для
десорбции спор и мицелия с поверхности почвенных частиц. Можно
растереть пальцем в резиновой перчатке. Навеска переносится в 90 мл
стерильной воды, перемешивается в течение 15-20 минут на качалке. Для
десорбции мицелия и спор с поверхности почвенных частиц и растений
можно добавить поверхностно-активное вещество (акилсульфат 0,01-
0,05%, пирофосфат натрия 0,1%, твин 0,0001%) (Практикум по
микробиологии, 2005).

11
Подготовка материала должна проводиться в стерильных условиях, с
соблюдением условий безопасности. Помещение (бокс), предназначенное
для работы, следует периодически тщательно мыть, а стены, пол, потолок и
все оборудование обрабатывать 2%-ным водным раствором хлорамина,
5%-ным раствором пергидроля и другими дезинфицирующими средствами.
Воздух стерилизуют бактерицидными лампами из расчета не менее 2—2,5
Вт потребляемой из сети мощности на 1м3. Перед работой помещение
облучают в течение 40—60 мин.
Для контроля чистоты воздуха в бокс на 10 мин ставят открытые
чашки Петри с сусловым и мясо-пептонным агаром, а затем помещают их в
термостат для проращивания при температуре 25 и 37°С (3— 5 сут). Для
выделения грибов обычно используют твердые (агаризованные)
питательные среды с легкодоступными источниками углерода —
сахарозой, глюкозой, декстрозой. К таким средам относятся агаризованная
среда Чапека, картофельно-декстрозный агар, агаризованное пивное сусло.
С помощью этих питательных сред обнаруживают и учитывают в основном
быстрорастущие и обильноспороносящие таксоны. Состав сред приведен в
приложении 2.
В почвах грибы находятся в ассоциациях с другими организмами.
Поэтому для подавления роста некоторой сопутствующей флоры,
например бактерий, питательные среды следует подкислять либо добавлять
к ним антибиотики. Для этих целей используют соляную, серную,
лимонную, фосфорную кислоты. Кислоты к средам добавляют до тех пор,
пока рН пробной порции не достигнет значений 4,2—4,5. Более высокая
кислотность может оказывать угнетающее действие на рост многих грибов.
В среднем на 1 л агаризованной среды добавляют 15 — 20 мл 0,1 н
раствора серной или соляной кислоты. Молочную кислоту обычно
применяют в концентрированном виде в количестве 4 мл на 1 л среды,
лимонную — в виде 50%-го раствора в количестве 10 мл на 1 л среды.
Подкисление агаровых сред до рН около 4,0 не оказывает отрицательного
влияния на их способность к переходу в твердое состояние при остывании.
Концентрированные кислоты стерилизовать не надо, 0,1 н растворы серной
и соляной кислот следует предварительно простерилизовать. Среды
подкисляют непосредствнно перед посевом.
Наиболее используемые антибиотики — стрептомицин сульфат (40
— 50 мг/л); тетрациклин, окситетрациклин, хлортетрациклин (20 — 50
мг/л); пенициллин, неомицин, полимиксин, бацитрацин (50 мг/л среды),
хлорамфеникол (100 мг/л) и красители — роданистый натрий (0,25 — 0,4
моль/л), бенгальский розовый (кислотный ксантеновый краситель) (70
мг/л). Можно 1000000 ед пенициллина растворить в 10 мл стерильной
дистиллированной воды и к каждому литру питательной среды добавить 2

12
мл полученного раствора; 1000000 ед стрептомицина растворить в 90 мл
стерильной дистиллированной воды, после чего 4 мл раствора прибавить к
1л питательной среды. Добавление кислот и других ингибиторов бактерий
производится асептически в стерильные, охлажденные до 45°С
питательные агаровые среды перед их разливом в чашки Петри. Для
ограничения роста грибов в среды добавляют антибиотики циклогексемид
(актидион) – 50-100 мг/л, неграм (невиграмон или налидиксовая кислота) -
1-10 мг/л, пимарицин и нистатин – 10-50 мг/л.

2.2. Определение численности


и состава комплекса микромицетов
Грибы изолируют из почвы и воды на питательные среды разными
методами. Один из наиболее простых — метод разведений Ваксмана.
Посев на агаровые питательные среды рекомендуется проводить из 1-4
разведений в зависимости от содержания грибов. Последнее разведение
используется для лесных подстилок. Для большинства почв оптимальным
является 2 и 3 разведение. Каждый из 5—10 образцов изучаемого
биоценоза высевают на 3 — 5 чашек Петри и инкубируют при 25 — 26°С.
Чашки Петри периодически просматривают, обычно начиная с 4—5-х сут,
и отдельные колонии грибов в случае угрозы их зарастания мицелием
быстрорастущих микромицетов отсевают в пробирки или чашки Петри.
Оптимальным считается разведение, когда на чашках Петри выросло по
10—30 колоний грибов. Окончательный учет проводят на сусло-агаре и
синтетических средах с простыми углеводами на 6-12 сутки, на средах с
целлюлозой, КМЦ через 2-3 недели, на голодном и почвенном агаре через
2-4 недели. При этом подсчитывают общее число выросших колоний,
условно допуская, что каждая колония образовалась из одной споры или
клетки гифы (Методы…, 1991).
Для выделения грибов методом прямого посева небольшие образцы
почвы (0,005—0,015 г) берут из средней пробы стерильным ланцетом и
смешивают с каплей стерильной воды на дне чашки Петри. В эту же чашку
добавляют 8—10 мл охлажденной агаризованной питательной среды и
частицы почвы равномерно распределяют по всей поверхности легким
покачиванием чашки.
Прямой посев мелкозема на питательную среду Чапека с сахарозой
дает более полное представление о микобиоте почвы. Для выделения
грибов методом прямого посева из средней пробы образца стерильным
ланцетом берется небольшая навеска почвы (50-100 мг) и равномерно
наносится на поверхность питательной среды. При использовании этого
приема предпосевная обработка почвы сведена к минимуму (Кураков,
2001). Посевы термостатируют в течение 7-10 дней при температуре 24°С.

13
Существует прием, когда стерильным пинцетом переносят точно
взвешенные навески мелкозема почвы (5 - 50 мг) в стеклянную трубку или
маленькую воронку, затянутые снизу сеткой с диаметром пор 0,25 мм.
Навеску просеивают через сетку, равномерно распределяя почвенные
частицы по поверхности агаризованной питательной среды. Из каждого
отдельно взятого образца делают высев на 3-5 чашек Петри. При посеве
мелкозема на богатые среды - сусло-агар, среды Чапека и Мартина навеска,
как правило, не превышает 5-20 мг, при посеве на бедные среды - водный и
почвенный агар - берут 50 мг почвы. Анализ состава грибов и выделение их
в чистые культуры можно провести на 5-10-е сут на богатых средах и через
2-3 недели на бедных. Для этого необходимо установить оптимальную для
исследуемой почвы массу образца, чтобы на чашке Петри вырастало не
более 10-25 колоний (в зависимости от их диаметра).
Для метода прямых отпечатков край пенополиуретанового
цилиндра длиной 40 мм и диаметром 15 мм увлажняют агаризованной
питательной средой, путем соприкосновения с ее поверхностью. Затем
увлажненный край цилиндра прижимают к подсушенному почвенному
образцу и этим же краем делают 10 последовательных отпечатков на
поверхности питательной среды в чашках Петри, которые ставят и
термостат для инкубации.
Электростатический метод основан на способности диэлектриков
притягивать положительно заряженные мелкие частицы. Для этого из
фторопласта изготовляют круглые пластинки диаметром 40 мм,
обрабатывают их антисептиком — метиловым спиртом, избыток которого
удаляют стерильной фильтровальной бумагой. Подсушенные пластинки
электризуют трением о стерильную фильтровальную бумагу.
Наэлектризованные пластинки подносят к рассыпанному ровным слоем
почвенному образцу не ближе 2—3 см, чтобы избежать притяжения
крупных частиц. Притянутые к пластинкам мельчайшие частицы
отпечатывают на агаризованных средах в чашках Петри.
Электростатический метод дает возможность изолировать значительно
большее число видов грибов, чем метод почвенных разведений.

2.3. Учет грибов при выделении на питательные среды


При выделении грибов методом разведений учет количественного
содержания грибных зародышей производят следующим образом. В
каждой засеянной чашке Петри, вычисляют общее количество колоний
грибов и находят среднее арифметическое.
Количество грибных зародышей рассчитывают на 1 г абсолютно
сухой почвы (или 1 мл воды) по формуле:

14
А = а•б•в/г,

где а — среднее количество колоний грибов в чашках Петри;


б — разведение, из которого сделан посев;
в — масса влажной почвы;
г — масса сухой почвы (для воды 1 мл).

Частоту встречаемости отдельных видов определяют по числу


образцов, в которых встречается данный вид, выраженному в процентах
общего числа образцов (%):

р = n • 100/ N,

где n — количество образцов, в которых обнаружен данный вид;


N — общее количество исследованных образцов.

Для определения общности видового состава грибов в почвах двух


разных типов или почвах различных растительных сообществ вычисляют
коэффициент общности по формуле Жаккара (%):

К = а • 100/[(в + с) — а],

где а — число общих видов;


в — число видов в почве первого растительного сообщества;
с — число видов в почве второго растительного сообщества.

Для характеристики показателя сходства видового состава грибов


двух типов почв пользуются формулой Серенсена:

S = 2 • С/(А + В),

где А — число видов в почве первого растительного сообщества;


В — число видов в почве второго растительного сообщества;
С — число видов, общих для обоих растительных сообществ.

Зависимость между количественным содержанием в почве


определенных видов грибов и внесением каких-либо удобрений или
погодными условиями — влажностью, температурой — устанавливают
посредством коэффициента корреляции, который рассчитывают по
формуле:

15
r —х) • (у—ŷ)/√∑(x—х2)∑(у—ŷ)2,

где х —количество определенных видов грибов в почве;


у— численный показатель изучаемого признака (фактора);
х и ŷ — средние показатели содержания в почве определенных видов
грибов и изучаемого признака (фактора).

Если зависимость прямая, величина r положительная, а при обратной


зависимости — отрицательная. Коэффициент корреляции может
колебаться от 0 до 1. Абсолютное значение коэффициента корреляции
никогда не превышает 1. Значение r до 0,3 указывает на слабую степень
связи, 0,3—0,7— умеренную, выше 0,7 — тесную зависимость признаков.

2.4. Пересев для выделения чистых культур


и накопления биомассы
При пересеве из пробирки в пробирку на твердые и жидкие среды из
пробирки с культурой движением от себя берут на конец петли небольшое
количество культуры в виде конидий или кусочка мицелия и переносят
двумя уколами в питательную среду так, чтобы один укол был ближе ко
дну пробирки, а второй — ближе к поверхности на 1—1,5 см. Края
пробирок и пробки проводят через пламя горелки и плотно закрывают.
Помещают пробирки в металлические или картонные коробки вертикально
и переносят в термостат.
При пересеве с твердой питательной среды на жидкую петлю с
конидиями или мицелием погружают в питательную среду и слегка
встряхивают; остальные процессы идентичны описанным выше.
При пересеве с жидкой питательной среды на жидкую с пленки на
поверхности среды осторожно снимают крючком кусочек мицелия или
небольшое количество конидий и переносят в глубину стерильной
питательной среды или на ее поверхность.
Посев гриба из пробирки в чашку Петри проводят
а) на поверхность застывшей питательной среды;
б) в стерильную чашку без среды, если засеваемый материал
находится в расплавленной и охлажденной до 45—46°С агаризованной
среде.
В первом случае стерильную чашку Петри помещают на стол вблизи
пламени газовой горелки, осторожно приоткрывают крышку пальцами
левой руки, вносят правой рукой 15—20 мл расплавленной агаризованной
среды и опускают крышку. После застывания среды (а в случае
необходимости — ее подсушивания) на поверхность среды засевают
культуру гриба 1-3 уколами микологического крючка. Крышку чашки во

16
время работы не снимают, а только слегка приподнимают, предотвращая
таким образом загрязнение среды посторонней микрофлорой. Во
избежание рассеивания спор по всей поверхности чашки, когда
необходимо получить рост в виде отдельных колоний, рекомендуется
перед посевом чашку со средой перевернуть крышкой вниз, осторожно
приподнять дно чашки и уколом снизу произвести посев в центр чашки.
После посева осторожно опускают дно чашки на крышку и в таком
положении переносят в термостат, предварительно сделав отметку на дне
чашки о виде культуры и дате посева. Микологический крючок
обязательно прокаливают перед взятием материала и после посева для
уничтожения остатков посевного материала.
Во втором случае агаризованную среду, разлитую по флаконам или
колбам, расплавляют на водяной бане или в автоклаве и охлаждают до
45°С. В охлажденную стерильную среду вносят конидии гриба
микологическим крючком (повторяя эту манипуляцию 3-4 раза) или взвесь
конидий в стерильной водопроводной воде пипеткой из расчета 0,5— 1,0
мл на 100 мл среды. Тщательно перемешивают засеваемый материал со
средой и по 15—20 мл смеси переносят в чашки Петри. После застывания
агара термостатируют. Можно определенный объем взвеси конидий (0,1—1
мл) внести пипеткой в стерильную чашку Петри, а затем влить в нее 15—20
мл расплавленной и охлажденной до 40 -500С агаризованной среды и
равномерно распределить по дну чашки.
Споры стерильно иглой можно перенести на питательную среду под
малым увеличением микроскопа.

2.5. Определение количества и биомассы грибов


Определение содержания мицелия грибов в почве методом
агаровых пленок (Метод Джонса и Моллинсона). Навеску почвы от 0,5 до 4
г (в зависимости от количества в ней грибов) помещают в фарфоровую
ступку, увлажняют небольшим количеством дистиллированной воды,
тщательно растирают пестиком или пальцем в перчатке. Растертую почву
переносят в колбу со 100 мл 1,5%-ного расплавленного и слегка
охлажденного раствора агара и равномерно перемешивают. После этого
каплю суспензии распределяют в гемоцитометре (камере Горяева).
Необходимая для просчетов глубина квадратов достигается притиранием
покровного стекла до появления полос интерференции по его краям.
Более четкая картина получается при подкраске светлоокрашенных
грибных гиф, для чего используют раствор анилинового голубого в 5%-ном
водном феноле (1 мл 1%-ного красителя в 15 мл водного фенола). Подсчет
длины гиф рекомендуется проводить с помощью окуляра-микрометра при
увеличении 10х8 или 10x20 в 40 квадратах камеры Горяева в трех

17
повторностях для каждого анализируемого образца почвы. Окончательный
расчет длины гиф в 1 г проводится по следующей формуле:

а 250 10 3 х 10 1
100
М
40 С

где М — суммарная длина грибных гиф в 1 г почвы, выраженная в


см; а — длина гиф в единицах окуляра-микрометра; х — цена деления
окуляра-микрометра (мкм); С — навеска почвы (г). Площадь одного
квадрата камеры Горяева равна 0,004 мм2, глубина— 0,1 мм, объем —
0,004 мм3, или 0,004 • 103 см3. Массу мицелия рассчитывают так же, как и в
методе мембранных фильтров.

К недостаткам метода следует отнести то, что результаты могут быть


несколько завышены за счет содержания светлоокрашенного мицелия. Это
обусловлено малым увеличением, используемым в этом методе (большие
увеличения применять невозможно из-за большой толщины камеры). При
этих условиях трудно отличить светлоокрашенный мицелий от
посторонних примесей в агаре, имеющих сходство с гифами (Методы…,
1991).
Для наблюдения за прорастанием спор, каплю неокрашенной
агаровой суспензии накрывают покровным стеклом, осторожно
придавливают до тех пор, пока агаровая среда не распределится
равномерно сужающимся тонким слоем, и располагают его под углом 10—
15° к предметному стеклу. Покровное стекло с трех сторон, за
исключением поднятой, рекомендуется заливать парафином, чтобы
избежать загрязнения и высыхания. Предметное стекло с препаратом
кладут в чашку Петри так, чтобы та сторона, где предметное и покровное
стекла не соприкасаются, была направлена вверх, и помещают в термостат.
Можно стекло поместить во влажную камеру (чашка Петри со слоем
мокрой фильтровальной бумаги), которую ставят в термостат. Наблюдения
за посевным материалом ведут через определенные промежутки времени,
начинать наблюдения необходимо через 2—12 часов после посева.
Препараты вынимают из термостата, микроскопируют и быстро помещают
обратно.
Для дифференцированного учета спор и мицелия применяют
метод мембранных фильтров. В колбу вносят навеску почвы 1 г и доливают
водой до 100 мл. Для полной десорбции микроорганизмов в суспензию
добавляют поверхностно-активное вещество Твин-60. Суспензию
обрабатывают на ультразвуковом дезинтеграторе УЗДН-1 (22 кГц, 0,44 А, 2
мин), вносят в нее смесь Са(ОН)2 и MgCО3 для коагуляции почвенных

18
частиц, взбалтывают 2 мин, переносят в мерный цилиндр на 100 мл. После
5-минутного отстаивания 5 мл суспензии профильтровывают через
мембранный фильтр. Мембранные фильтры (Сынпор, ЧССР, диаметр 0,4
мкм) предварительно выдерживают сутки в 0,5%-ном растворе
диазинового зеленого для тушения собственной люминесценции,
отмывают в воде, высушивают. После фильтрации мембранные фильтры
высушивают, окрашивают в 0,001 %-ным раствором калькофлуора 1—2
мин, снова высушивают и просматривают под микроскопом МЛ-4 и
Люмам И-3 (объектив 90х). Споры и гифы грибов имеют ярко-зеленое
свечение (Методы…, 1991).
Для прямого учета грибов в почве применяют метод Хансена —
определение длины мицелия и числа спор с помощью мембранных
фильтров. Метод, усовершенствованный Т. Г. Мирчинк и Т. С. Демкиной
(Мирчинк, 1988), состоит в следующем. Три параллельные навески по 1 г
растирают в ступке резиновым пестиком с небольшим количеством воды в
течение 5 мин. Переносят в колбу с 500 мл дистиллированной воды и
встряхивают в течение 5 мин. Почвенную взвесь переносят в цилиндр на
500 мл, отбирают пробу в 10 мл, не давая отстояться, всегда с одного и того
же уровня и фильтруют через мембранный фильтр с диаметром пор 2,5
мкм. После высушивания на воздухе мембранный фильтр окрашивают
смесью 1%-ного раствора дианилового голубого и 5%-ного водного
раствора фенола в отношении 1:5, подсушивают на воздухе и
рассматривают под микроскопом, предварительно осветляя фильтр в капле
иммерсионного масла. Для каждого почвенного образца используют два
мембранных фильтра, просматривая в каждом по 50 полей зрения.
Измеряют длину грибных гриф с помощью окуляр-микрометра.
Используют объектив большого увеличения 40х. Нефиксированные
препараты, особенно грибы с бесцветными органами спороношения, перед
исследованием окрашивают. Оптимальное число гиф должно быть 1—3
фрагмента в поле зрения.
Длину мицелия рассчитывают по формуле

b x R2 n
а
0.5 r 2 V C

где а — длина гиф в 1 г почвы (см); b — средняя длина гиф на


фильтре в одном поле зрения в единицах окуляра-микрометра; х — цена
деления окуляра-микрометра (мкм); R — радиус фильтра (мм2); п —
разведение почвенной суспензии; r — радиус поля зрения (мкм2); V—объем
наносимой суспензии; С — навеска почвы (г).
Объем гиф (см3) рассчитывается по формуле

19
V = а ·π· r· 10-8,

Если диаметр гифы принять в среднем 5 мкм, тогда

υ = a ·3,14 · (2,5)2 ·10-8,

а масса мицелия и 1 г почвы будет равна (г)

g = a 19,6 ·10-8 ·1,05,

где 1,05 — удельная масса мицелия.

Используя метод мембранных фильтров, можно рассчитывать число


спор в навеске почвы. Просчитывают число спор грибов 50 полей зрения.
Число спор в 1 г почвы рассчитывают по формуле:

m R2 n
M
5 r 2 V C 10 5

где М — число спор в 1 г почвы; т — среднее число спор в одном


поле зрения; остальные обозначения те же, что и для расчета длины
гиф.
Биомасса спор рассчитывается по формуле

g = v•d,

где v - объем клетки, d - удельная масса, равная 1,2. Объем клетки


3
(мм ) рассчитывают следующим образом:
9
v a b 10
6

где а - больший, b - меньший диаметр клетки (мкм).

2.6. Определение показателей роста грибов


Измерение линейного роста колоний. Для определения линейного
роста измеряют диаметр колоний (от места посева до конца зоны роста
мицелия), растущих на плотной среде, обычно в чашках Петри с
одинаковым слоем среды, через определенные промежутки времени. В
некоторых случаях измерение производят в специальных пробирках с
застывшим горизонтальным слоем плотной среды равномерной толщины.

20
Изучаемый гриб высевают в центр поверхности плотной питательной
среды по возможности немногочисленным инокулюмом всегда одной
плотности, особенно при изучении влияния условий культивирования на
рост колоний.
Диаметр колонии измеряют в двух взаимноперпендикулярных
направлениях в двух-трех повторностях через определенные промежутки
времени. Количество измерений зависит от скорости роста гриба, оно
больше у быстрорастущих видов (мукоровых, триходерм и некоторых
других). Результаты измерений изображают графически в равномерной или
логарифмической шкале. Уровень распространения мицелия на плотной
среде не всегда является показателем роста, то есть увеличения биомассы
гриба.
Определение линейного роста, например, малопригодно для изучения
использования грибом разных компонентов среды, так как значительное
распространение мицелия по поверхности субстрата может иметь место на
малопитательных средах. Некоторые виды грибов на поверхности плотной
среды, лимитирующей рост, образуют широко распространенную, но
тонкую, пленчатую колонию, а при росте на плотной оптимальной среде
колония гриба может достигать такого же диаметра, но быть высокой,
пушистой, войлочной, иметь обильно развитый воздушный мицелий.
Линейный рост определяют при изучении влияния температуры, инги-
биторов при росте гриба на благоприятной среде. При этом учитывают
количество ветвлений и скорость роста боковых гиф, перенос
питательных компонентов от отдельных клеток гифы к растущему ее
концу, подавление ветвления или роста боковых гиф растущим концом
главной гифы вследствие, например, конкуренции за источник питания, а
также морфологические особенности субстратного и воздушного мицелия
(рис. 6).

Рис.6. Изменение морфологии и размеров клеток воздушного и субстратного


мицелия Fusarium в зависимости от возраста культуры (а), 20-дневные гифы
воздушного мицелия Fusarium, выращенного на сусло-агаре (б).

21
Аналогичен описанному метод определения радиальной скорости
роста грибов, которая вычисляется как увеличение радиуса колонии на
плотной питательной среде за определенный промежуток времени. При
определении радиальной скорости роста посев производят на среду Чапека
с сахарозой (2%). Разведение подбирают таким образом, чтобы на чашке
Петри вырастало не более 3—5 колоний грибов. После 36 ч инкубации при
28°С измеряют диаметр выросших на чашках колоний при помощи
микроскопа. Эту операцию повторяют трижды через определенный
промежуток времени (12— 24 ч).
За диаметр отдельной колонии в данный момент времени принимают
среднее арифметическое измерение, выполненное в двух взаимно
перпендикулярных направлениях. Вычисление радиальной скорости
проводят по формуле
r r0
Kr
t t0

где К — радиальная скорость роста; r 0 — радиус колоний в


начальный момент времени t0; r —радиус колоний в момент времени t.
Значение Кt определяется для каждой колонии, затем вычисляют среднюю
величину К r ср для всех колоний, выросших при посеве.
Измерение плотности гиф и размеров клеток гиф. Плотность гиф
определяют их общей длиной, представляющей суммарную длину главной
гифы и ее ответвлений всех порядков, в расчете на единицу поверхности,
реже объема колонии. Плотность определяют в разных участках растущей
части колонии. Для этого 1 мм2 мицелия фиксируют, например, смесью
формалина, уксусной кислоты и этилового спирта, окрашивают
метиленовым синим, трипанблау в лактофеноле или другой
экспериментально подобранной краской. Поверхность окрашенной
периферической части колонии фотографируют под микроскопом. Длину
гиф и их плотность измеряют либо при проектировании негативной пленки
(увеличение до 200), или же непосредственно на фотографии.
Препараты для измерения размеров клеток гиф готовят из воздуш-
ного или субстратного мицелия разного возраста, взятого по радиусу из
разных участков колонии. Под микроскопом определяют длину
(расстояние между двумя перегородками) и ширину клеток главной гифы и
ее ветвлений разных порядков, затем находят соотношения длины и
ширины клеток главной гифы и ее ветвлений разных порядков. В
несептированном мицелии измеряют размеры главной гифы и ее ветвлений
разных порядков.
Определение роста по сухой массе мицелия. Сухую массу мицелия,
или общую массу гриба, определяют обычно при культивировании в

22
жидких питательных средах. Для установления интенсивности роста
мицелия сухую массу определяют в динамике в среде данного состава, а
при изучении влияния на рост различных факторов — в динамике во всех
вариантах опытов. Сроки определения сухой массы мицелия зависят от
цели исследований и условий культивирования (1—50 и более дней).
Первое определение роста осуществляют обычно через 6—12 или 18—24 ч
после посева, то есть после полного прорастания конидий. Желательно
сочетать определение интенсивности роста мицелия с комплексным
изучением других свойств гриба и культуральной жидкости.
Перед определением сухой массы мицелий освобождают от
культуральной жидкости фильтрованием или центрифугированием, затем
несколько раз промывают физиологическим раствором и вновь фильтруют
или центрифугируют при 2500—3000 об/мин. Мицелий высушивают в
сушильном шкафу при температуре 105°С до постоянной массы. При
физиолого-биохимических исследованиях мицелия его отделяют от
культуральной жидкости, промывают водой на холоду, центрифугируют в
градуированных пробирках, затем часть мицелия отбирают для
исследований, а часть — для определения сухой массы и последующего
пересчета на всю биомассу.
Рекомендуется параллельно с определением сухой массы мицелия
проводить микроскопические исследования, определять характер роста,
наличие спороношения, количество живых и мертвых клеток, наличие
включений в клетках. Проводят многократное микроскопирование средней
навески мицелия (из пробы, предварительно подвергнутой встряхиванию)
и подсчитывают общее число клеток в счетных камерах или под
микроскопом. На основании этих исследований судят о процессах
морфогенеза гриба, стадиях роста, биосинтетической активности как общей
массы, так и только живых клеток, а также об их соотношении в растущей
культуре.
Культуральная жидкость после отделения на холоду от мицелия
может быть использована для определения наличия ферментов, токсинов,
антибиотиков и других внеклеточных метаболитов, а также для их
выделения различными методами.
Определение интенсивности спорообразования. Интенсивность
спорообразования (то есть увеличение числа клеток) при росте гриба на
плотной среде определяют в счетной камере или в нескольких полях зрения
микроскопа по количеству спор в определенном объеме взвеси. Для этого
блок агаровой культуры определенной площади помещают в определенный
объем физиологического раствора или жидкой среды и в течение
нескольких минут встряхивают на качалке для освобождения спор и
перехода их во взвесь. Блоки агаровой культуры можно брать

23
лабораторным сверлом. При росте гриба в чашках Петри, например, блоки
вырезают вдоль линии окружности. В этом случае определяют
интенсивность спорообразования в зависимости от возраста гриба. При
взятии блоков вдоль линий окружности на разных расстояниях от центра
роста культуры выясняют влияние степени истощения субстрата и других
условий на спорообразование.
При поверхностном или погруженном культивировании в жидкой
питательной среде интенсивность спорообразования определяют по
количеству конидий в определенном объеме культуральной жидкости.
Пробу культуры, помещенную в жидкую среду, встряхивают на аппарате в
течение 15—30 мин и центрифугируют. Время осаждения спор зависит от
вида гриба и определяется экспериментально. Из определенной навески
осадка спор готовят взвесь и в счетной камере подсчитывают число спор в
единице объема. Густоту взвеси можно измерить нефелометрическим
методом (Методы…, 1991).

2.7. Среды и условия культивирования для выделения различных


групп грибов
Метод выделения грибов на растительные остатки предполагает
выращивание грибов и условиях, приближенных к естественным.
Измельченную стерню злаковых, головки цветков клевера помещают в
чашки Петри на увлажненную фильтровальную бумагу и стерилизуют.
Затем на них высевают исследуемую почву и по мере появления колоний
грибов отвивают последние на питательные среды. Метод предусматривает
обнаружение в почвах многих медленнорастущих грибов, в том числе и
сумчатых.
Методом водных смывов выделяют грибы с поверхности опавших
листьев, валежника и других растительных остатков. С корней или других
растительных остатков осторожно стряхивают почву, ножницами,
предварительно погруженными в банку со спиртом и обожженными над
пламенем горелки, разрезают корни на отрезки 3—5 см, которые
стерильным пинцетом переносят (обычно по 3—4 отрезка) в заранее
подписанные колбы, содержащие по 100 мл стерильной воды, и
встряхивают в течение 5 мин. Затем по 1 мл полученной суспензии
высевают в чашки, предварительно приготовив нужное разведение.
После этого чашки Петри ставят в термостат для инкубации.
Оставшуюся в колбе водную суспензию почвы осторожно
отфильтровывают через предварительно взвешенный и надписанный
бумажный фильтр, который высушивают до постоянной массы для
определения сухой массы почвы, смытой с поверхности корней. В колбу с
корнями повторно вливают 100 мл стерильной воды, с которой поступают

24
так же, как и с первой порцией. Обычно делают 5—10 смывов. Либо
высевают 2-5 разведение первого смыва. На питательные среды в чашки
Петри чаще всего высевают разведения 1-го, 5-го и 10-го смывов. Основная
масса грибных зародышей отделяется с корней в первые смывы. После 10
смывов грибных зародышей на поверхности корней остается мало.
Ризосферную почву возможно собрать с корней не прибегая к водным
смывам, осторожно с соблюдением условий стерильности, удаляя ее с
поверхности корней скальпелем и кисточкой. Затем почву взвешивают, и
навески (не менее 0,5-1 г) вносят в колбы со 100 мл стерильной воды.
Несколько навесок используют для определения влажности почвы
(Методы…, 1991).
Метод посева растертых корней. Тщательно отмытые стерильной
водой от почвы корни режут на кусочки и просушивают между двумя
листами стерильной фильтровальной бумаги. Берут навески корней по 1 г и
растирают их в стерильной фарфоровой ступке с кварцевым песком.
Растертую массу переносят в колбу со 100 мл стерильной воды и
встряхивают в течение 5 мин. Далее готовят серию разведений и проводят
посев на питательные среды.
Метод посева фрагментов корней. На поверхность питательных
сред помещают отрезки корня, с которого удалена ризосферная почва. В
случае если раскладывают фрагменты размером 1-3 см, то часто отдельные
быстрорастущие виды могут покрыть поверхность всего кусочка корня и
среды в чашке Петри. Это не позволяет обнаружить другие виды
микромицетов, населяющих данный фрагмент корня. Для устранения этого
недостатка необходимо проводить раскладывание мелких кусочков корней
(0,5-1 мм, толстые корни предварительно расщепляют). Для избежания
нарушений пространственного распределения грибов вдоль корня
рекомендуется проводить удаление ризосферной почвы не водными
смывами, а скальпелем, препаравальной иглой или кисточкой. Небольшие
кусочки корня стерильной препаравальной иглой или пинцетом с
заостренными концами переносят на поверхность среды в чашке Петри, 5-6
кусочков распределяют равно удаленно друг от друга. В случае
раздельного размещения на чашках кусочков с различных зон корня
(корневого кончика, зоны растяжения, зоны корневых волосков, базальной
части корня) можно изучать также локальные различия в составе
микромицетов ризопланы. Раскладывают порядка 50-100 кусочков корня
на различные питательные среды. Чашки просматривают в течение 3-10
суток и выделяют микромицеты в чистые культуры с помощью
препаравальной иглы при необходимости под контролем микроскопа или
бинокулярной лупы.

25
Метод накопления во влажных камерах. Метод используют для
выявления грибов, развивающихся на поверхности корней и
инфицирующих их внутренние ткани. В качестве влажных камер
применяют чашки Петри, на дно которых помещают стерильную
фильтровальную бумагу. Влага в чашках держится дольше, если под
фильтровальную бумагу подкладывают стерильную марлю или вату.
Фильтровальную бумагу увлажняют стерильной водой, не создавая при
этом избытка воды на поверхности. Отрезки корней (3-5 см) раскладывают
на поверхность фильтровальной бумаги, и чашку Петри ставят в термостат
для инкубации при температуре 18-24°С. Периодически, начиная со 2-х
суток, корни просматривают под бинокулярной лупой и с помощью
препаравальной иглы выделяют грибы в чистую культуру.
При посеве ризосферной почвы и выделении сапротрофных грибов с
корней используют различные среды - сусло-агар, среды Чапека, Мартина,
глюкозо-пептонные среды, приготовленные на растительных отварах,
овсянную, картофельную и другие. Инкубируют чашки при температуре
24-26°С в течение 1-3 недель. Для изоляции фитопатогенных видов
применяют различные селективные среды, состав которых зависит от вида
изучаемого патогена. Все методы описанные для выделения грибов с
корней могут быть использованы для изучения микобиоты надземных
частей растений и растительных остатков на различных стадиях
разложения
Сукцессионный и обогатительный методы. Сукцессионный метод
заключается в инкубировании почвы в течение 1 - 4 недель и более при
различных температуре, влажности, без обогащения и с обогащением ее
различными соединениями (глюкозой, целлюлозой) и проведением посевов
на 3, 7, 14, 30-е сутки. Инкубация образцов после их увлажнения с
добавкой субстрата или без нее ведет к развитию и смене (сукцессии)
разных групп грибов в ходе трансформации веществ в почве, что позволяет
более полно изучить качественный состав почвенных микромицетов.
Принцип накопительной культуры (обогатительный метод)
заключается в обеспечении благоприятных условий для роста грибов с
определенными свойствами, что приводит к увеличению их численности в
почве. Следует однако учитывать, что при секреции внеклеточных
ферментов при разложении субстрата, использованного как
селектирующий фактор на конкретную группу грибов, продукты их
ферментативного гидролиза могут быть использованы и другими
микроорганизмами. Поэтому важно выявить ранние стадии повышения
плотности популяций интересующей исследователя группы грибов. Так,
при внесении фильтровальной бумаги и инкубации увлажненной почвы
при температурах более 45°С в течение 7-14 дней можно добиться

26
преимущественного развития целюлозолитических и термофильных
микромицетов.
Тепловая обработка почвы. Образцы увлажненной почвы или
почвенной суспензии выдерживают в термостате при температуре 60-80°С
в течение нескольких часов. Образцы почвы можно также прогреть паром
при 60-65°С в течение 30 мин и затем высевать на агаризованные
питательные среды. Тепловую обработку в течение нескольких часов (до
12 часов) проводят и засеянных методом разведений или (что эффективнее)
мелкоземом агаризованных сред в чашках Петри. Эти приемы используют
для изолирования главным образом сумчатых грибов и термотолерантных
видов - Eurotium, Neosartoria, Emericella, Aspergillus terreus, A. fumigatus, A.
ochraceus.
Фумигация почвы. Метод рекомендуют для выделения сумчатых
грибов. Для фумигации чаще всего используют формалин, метилбромид,
пары которых легко проникают в исследуемые образцы и могут быстро
удаляться из них проветриванием. Просеянную почву (2-4 мм) помещают в
стеклянную трубку с несколькими боковыми отверстиями, вводят через
них нужную дозу фумиганта и закрывают резиновыми пробками.
Через несколько часов экспозиции резиновые пробки заменяют на
ватные. Обработку почвы парами химикатов проводят в эксикаторе
аналогично процедуре фумигационного метода определения микробной
биомассы. Фумигация почвы этими веществами в определенной дозе не
убивает аскоспоры многих видов родов Chaetomium, Sordaria, телеоморф
аспергилов и пеницилов. Дозировка и время экспозиции зависят от типа
почвы и вида гриба и ее подбирают экспериментально. Так, песчанную
почву обрабатывают метилбромидом в течение 4 часов в дозе 0,6 мл на 1 г
почвы.
Метод флотации применяют для учета и выделения из почвы спор
грибов комплекса Helminthosporium, которые имеют характерные крупные
споры. 10 г почвы суспендируют в 90 мл стерилизованной воды и
добавляют 5-10 мл стерильного вазелинового масла. Колбы помещают на
качалку (150-180 об/мин) от 1 до 6 часов. Суспензии дают отстояться и с
помощью стерильной пипетки берут несколько капелек для учета в камере
Горяева и делают посев на питательные среды для выделения грибов в
чистые культуры. Эмульсия, собирающаяся на поверхности воды,
содержит большую часть спор, имеющихся в почве.
Центрифугирование водно-почвенной суспензии дает
возможность изолировать Chaetomium, имеющего крупные споры,
многочисленные стерильные изоляты, хламидоспоры Fusarium. Почву
предварительно просеивают через сито с отверстиями в 2 мм, затем образец
массой 10 г энергично взбалтывают в 100 мл стерильной воды, отстаивают

27
30 сек и сливают надосадочную суспензию, осадок удаляют. Процедуру
повторяют 4 раза, в результате удаляют песок и другие крупные частицы.
После этого взвесь центрифугируют 5 мин при 500 об/мин. Осадок
переносят в 20 мл стерильной воды, взбалтывают, отбирают 10 мл и
пропускают через колонку с растворами сахарозы. Затем центрифугируют
30 мин при 350 об/мин для освобождения от минеральных частиц. Один
объем суспензии разбавляют тремя объемами стерильной воды и
центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Полученный осадок переносят в
пробирку с 3 мл стерильной воды и засевают по 0,25 мл в чашку Петри на
агаризованную среду.
Облучение ультрафиолетовыми лучами. Метод применяют для
выделения темноокрашенных грибов. Засеянные почвенной суспензией
или мелкоземом чашки Петри облучают ультрафиолетовыми лучами в
течение 15-240 сек. Облучение чашек Петри в течение 15 сек уменьшает
количество грибов на 20%, 240 сек - на 50%. Уменьшение количества
выросших колоний происходит за счет гибели грибов с тонкостенными
спорами (виды Penicillium, Aspergillus, Mucor). Для подавления развития
быстро- и широкорастущих представителей порядка Mucorales,
стимулирования развития видов родов Aspergillus, Fusarium, не изменяя
видового состава темноцветных гифомицетов, почвенную суспензию в
разведении 1:10 разливают в пробирки (по 5-8 мл) и облучают при
постоянной интенсивности дозой γ-лучей 100 крад. Посев облученных
почвенных суспензий проводят, применяя разведение на 1-2 порядка
меньше, чем при посеве необлученных почвенных образцов (Кураков,
2001).
Подавляющее большинство грибов — мезофилы, оптимальная
температура для их выделения 22— 26°С. Для изоляции грибов, способных
к росту при пониженных температурах, инкубацию посевов проводят при 4
— 8°С, для термофильных— 42 — 55°С, чаще всего 45°С, и
термотолерантных грибов — 35— 42°С. Чашки Петри с посевом
помещают в эксикаторы или пластиковые пакеты для предотвращения
высыхания среды.
Многие микроорганизмы, в том числе грибы, меняют рН среды в
зоне роста на оптимальный для своего развития. Поэтому для выделения
алкалотолерантных и ацидофильных грибов в среды вводят соединения,
обеспечивающие буферность среды. Используют двузамещенный фосфат
натрия и однозамещенный фосфат калия, которые в различных пропорциях
позволяют создать и поддерживать рН среды в широком диапазоне (от
кислой до щелочной области). При изоляции алкалотолерантных грибов в
среды рекомендуется добавлять соли Na2C03, NaHC03, K2C03, Na3P04 в

28
концентрациях от 0,5 до 2%, которые поддерживают рН в интервале 8,5 —
11.
Инкубация посевов при дневном свете резко снижает
спорообразование у некоторых видов грибов (Chaetomium), а в
большинстве случаев свет не вреден или оказывает благоприятное
воздействие (за исключением прямого солнечного света). Обычный
дневной свет и близкий к ультрафиолетовому (в черной области — 310 —
360 нм) усиливают образование плодовых тел у аскомицетов, пикнид у
целомицетов и конидий у гифомицетов (особенно темноокрашенных).
Для выделения быстрорастущих и эффективно усваивающих
легкодоступные углеводы грибов используют сусло-агар 3 — 4° по
Баллингу (как правило, сусло разбавляют водой в соотношении 1: 3),
картофельно-глюкозный агар и синтетические среды с простыми
углеводами — среды Чапека, Чапека с дрожжевым экстрактом, Мартина,
Ролэна, пептоно-глюкозный агар Ваксмана, почвенный агар с добавкой
углеводов.
Для обнаружения медленнорастущих и слабоконкурентных видов в
среды рекомендуется добавлять вещества, ограничивающие рост
быстрорастущих форм микромицетов, такие, как бенгальский розовый (30
мг/л), пропионат натрия (0,1 %), дихлоран (2,6-дихлор-4-нитроанилин) для
подавления мукоровых, фундазол (беномил) — пенициллов, и ряд других
веществ — циклоспорин, детергенты.
Олиготрофные грибы и те, которые не выдерживают конкуренции
за моносахара при высоких их концентрациях в среде и способны к росту
при их следовом количестве, выделяют на «голодные» среды — водный
агар, агар с почвенной вытяжкой, агар с разведенным в 8 — 10 раз суслом.
На этих средах большинство микромицетов развивается медленно,
образуют мелкие (2 — 3 мм в диаметре) колонии, при оптимальном
разведении удаленные друг от друга, что удобно для выделения грибов в
чистые культуры.
При учете и выделении дрожжевых грибов методом посева
используется разведение 1:5 — 1:50 для минеральных горизонтов и 1:100
— 1:1000 для подстилки, поверхности растений. Наиболее широко
применяется сусло-агар (6 — 7° по Баллингу с молочной кислотой — 4
мл/л), глюкозопептонный агар, глюкозоминеральная среда. Для
ингибирования роста бактерий применяют также антибиотики —
стрептомицин сульфат (20 мг/л) с левомицитином (20 мг/л) и
хлортетрациклином солянокислым (100 мг/л). Развитие мицелиальных
грибов подавляют циклогексимидом (50 — 500 мг/л) и пропионатом натрия
(0,15 — 0,25 %). Эти соединения подавляют рост и отдельных групп
дрожжей (циклогексимид уже в концентрации 50 мг/л — представителей

29
рода Cryptococcus, пропионат натрия — рода Rhodotorula). Поэтому для
этих целей используются и другие ингибиторы: дифенил (0,005 — 0,01%),
красители бенгальский розовый (0,003%), кристаллический фиолетовый
(0,001%), бромкрезол пурпурный (0,002 %). Олигонитрофильные дрожжи,
относящиеся главным образом к липомицетам, учитывают на среде Эшби и
других безазотистых средах. Для липомицетов рекомендована также среда
Юргенсена и Даниелсона. Посевы разведений инкубируют при 18—20°С,
или при 0°С для психрофилов и 5—7°С для мезофилов, для выделения
патогенных видов при 37°С. Учет и выделение проводят на 3—4-е сут
инкубирования при 37°С, на 7—10-е сут — при комнатной температуре,
14-е сут — при 5—7°С и после 20 сут — при 0°С. Рекомендуется
применять низкотемпературное инкубирование, которое снимает
необходимость добавки ингибиторов роста микроскопических
мицелиальных грибов при температурах выше 24—26°С. При низкой
плотности популяций липомицетов используют посев на среду Эшби со
стептомицином рассыпкой почвенного мелкозема и метод почвенных
комочков, приготовленных из густой водно-почвенной пасты. Из 100 мг
почвы готовят около 100 комочков, раскладывают по 50 на чашку и
инкубируют 3 — 4 нед при 18 — 22°С. Край слизистых обрастаний
просматривают под микроскопом и выделяют из него культуры
липомицетов.
Для выделения фитопатогенных грибов из почвы используют среды
с антигрибными антибиотиками (приложение 6). Наиболее часто
применяют полиеновые антибиотики (эндомицин, нистатин, пимарицин) и
циклогексимид, обладающие широким фунгицидным действием, но вместе
с тем не подавляющие рост и развитие отдельных видов фитопатогенных
микромицетов. Широко используются для этих целей и такие химические
соединения, как красители (бенгальский розовый, кристалл- и
генцианвиолет, малахитовый зеленый), спирты, хлораты, фенолы,
пентахлорбензол и его производные — коммерческие фунгициды (каптан,
пентахлорнитробензол, беномил, ботран). При изоляции фитопатогенных
грибов родов Bipolaris, Curvularia, Drechslera, Exserohilum для подавления
быстрорастущих сапротрофных грибов можно использовать дезоксихолат
натрия (1 % от состава среды), желчные кислоты (1 — 5 %), сорбит (1 %).
Для выделения фитопатогенных грибов из почв и растений предложено
множество сред. Широко используют различные растительные среды:
картофельный, картофельно-морковный, мучной (овсяный, кукурузный)
агар, среды на основе овощного сока V-8.
Для выделения хищных микромицетов из почвы предложен водный
агар (4 — 5 %) без добавки питательных веществ. Добавка нематод или их
личинок повышает эффективность обнаружения нематофаговых грибов.

30
Обнаруженные грибы пересевают на арбузно-пептонный агар.
Одновременно таким способом можно выявить в почве
микопаразитические виды зигомицетов. Амебофаговые грибы выделяют,
используя газон Azotobacter chroococcum на чашке Петри, который
инокулируют исследуемой почвой. На нем развиваются амебы,
инфицированные или служащие приманкой для амебофаговых грибов.
Энтомопатогенные грибы обычно выделяют на сусло-агар, картофельно-
декстрозный агар и среду Сабуро. В случае аскомицетов образцы
насекомых помещают в чашку Петри и отстреленные споры переносят на
агаровые среды. Другие грибы довольно успешно выделяют из тканей
инфицированных беспозвоночных.
Копрофильные грибы часто выделяют, инкубируя образцы
субстратов на влажной фильтровальной бумаге в чашке Петри и
периодически просматривая под лупой. С помощью препаровальной иглы
или оттянутой стеклянной пипетки спорулирующие дейтеромицеты,
аскомицеты и зигомицеты переносят на питательные среды. Споры
Pilobolus и отстреливающих аскомицетов часто можно обнаружить на
крышке чашки Петри и пересеять на питательные среды иглой.
Для выделения термофильных грибов в качестве стандартной среды
предложен YpSS-arap; применяют также сусло-агар, овсяный агар, среду
Сабуро (которая широко используется для выявлении оппортунистических
и патогенных микромицетов) и ряд других сред с повышенной (1,5—3 раза)
концентрацией антибактериальных антибиотиков (стрептомицина) (50—
100 мг/л), ауреомицина (до 800 мг/л).
Для изоляции грибов, способных к росту в анаэробных условиях,
— фузариев, мукоровых, триходерм, используют модификации методики
Хангейта. Посев проводят на глюкозоминеральную агаризованную (3%-й
агар) среду следующего состава (г/л): КН2Р04 - 1,0; КС1 - 0,5; MgS04 - 0,5;
FeS04 - 0,01; (NH4)2S04 - 2,0; пептон - 5,0; глюкоза - 5,0; дрожжевой
экстракт - 0,5; 1 мл/л раствора микроэлементов (мг/л): ЭДТА - 500;
FeCl2•7Н20 - 200; ZnCl2•7Н20 - 10; MgCl2•4Н20 - 3; Н3В04 - 30; СоС12•6Н20 -
2; СиС12•2Н20 - 1; Na2Mo04 - 3; NiCl2•6H20 - 2 и 1 мл/л раствора витаминов
(мг/л): 4-аминобензойной кислоты - 25; D-биотина - 100; никотиновой
кислоты - 25; пантотената кальция - 25; пиридоксина гидрохлорида - 25;
фолиевой кислоты - 10; рибофлавина - 25; В12 - 0,5; липоевой кислоты - 25.
Применяются также ряд других сред (Чапека, сусло-агар).
Для выявления грибов, развивающихся на различных субстратах в
почве, применяют методы приманок, в качестве которых в почву
помещают различные органические вещества, растительные или животные
субстраты. Эти методы широко распространены в фитопатологии и
почвенной микологии для выявления грибов, разлагающих целлюлозу,

31
хитин, кератин, растительные остатки (опад, солому). В последние
десятилетия методы приманок применяют для выделения грибов-
деструкторов синтетических органических веществ. Эти методы
используют как в полевых, так и в лабораторных исследованиях
(инкубация почв с добавкой различных субстратов во влажной камере).
Целлюлозоразрушающие грибы изолируют на питательные среды,
содержащие целлюлозу (фильтровальную бумагу) или же синтетические
среды с целлюлозой либо карбоксиметилцеллюлозой. Для выделения
грибов на фильтровальную бумагу последнюю нарезают полосками,
складывают продольными складками («гармошкой») и помещают в
пробирки. Потом в каждую пробирку добавляют 2—3 мл жидкой среды
Чапека или Гетчинсона без источники углерода и стерилизуют 30 мин при
температуре 115° С. Метод индукции прорастания пропагул можно
использовать для повышения разнообразия выделяемых видов
целлюлозолитических микромицетов. В качестве индуктора можно
использовать добавку целлобиозы (0,3-30 мМ), D-сорбозы (0,05-2 мМ),
арабинозы (0,05-0,5мМ) или лактозы (0,1-2,0 мМ) в водно-почвенные
суспензии за несколько часов до посева на агаровые среды с
микрокристалической или аморфной целлюлозой. Прием основывается на
том, что невысокие концентрации этих соединений могут индуцировать
синтез целлюлаз у микроорганизмов (Кураков, 2001).
Метод выделения целлюлозоразлагающих грибов в полевых
условиях. Стерильное хлопчатобумажное полотно, фильтровальную
бумагу, целлофан, прикрепленные к стеклянным пластинам
(аппликационный метод), погружают в почву на необходимую глубину,
предварительно выкопав прикопку или разрез. После определенного
периода инкубации (от нескольких дней до месяцев) пластинки осторожно
извлекают из почвы, просматривают целлюлозный субстрат под
бинокулярной лупой и появившиеся грибы (мицелий, репродуктивные
структуры) отсевают с помощью препаравальной иглы на агаризованные
питательные среды. При закладке пластинок в достаточной повторности
можно исследовать динамику заселения различными грибами целлюлозы и
их состав при различных погодных условиях.
Существует способ изучения состава грибов на целлюлозе с
последующей "проявкой" (Методы…, 1991). Стерильные куски
фильтровальной, крафтовой бумаги или целлофана размером 5x5 см
закрепляют в диапозитивных рамках для проектора и помещают
вертикально в соответствующий горизонт исследуемого почвенного
профиля. После экспозиции, время которой определяется предварительно
экспериментальным путем (например, для фильтровальной бумаги в
верхнем горизонте почвы 7-10 дней), куски целлюлозы извлекают из

32
почвы, очищают и помещают на твердую питательную среду с
стрептомицин сульфатом (50 мг/л), а затем на неделю в термостат.
Целесообразно использовать минеральную среду Гетчинсона без добавок
органического вещества. Экспозиция на питательной среде и
выдерживание в термостате как бы "проявляют" субстрат, так как
стимулируют развитие спороношений у грибов и дают возможность их
родовой идентификации. Пластинку микроскопируют целиком, оценивая
заселенность отдельными грибами от общей площади пластинки и частоту
их встречаемости на нескольких (5—10) пластинках в каждом варианте.
Затем при визуальном микроскопическом контроле грибы выделяют
стерильной иглой в чистую культуру для видовой идентификации. При
использовании этого метода наряду с обычными целлюлозоразлагающими
грибами удается выделить медленно растущие темноокрашенные
микромицеты, которые часто плохо выделяющихся на твердые
питательные среды.
Метод приманок для выделения целлюлозоразрушающих грибов
из почв в лабораторных условиях. Почву увлажняют до пастообразного
состояния (60% от полной влагоемкости) в чашках Петри. С помощью
слегка увлажненного шпателя поверхность почвы выравнивают и
помещают полоску стерильной фильтровальной бумаги,
хлопчатобумажного полотна или природные материалы с высоким
содержанием целлюлозы (измельченную солому злаков, древесные
опилки). На поверхность почвенной пластинки можно нанести тонкий слой
порошковидной микрокристалической целлюлозы или
карбоксиметилцеллюлозы. Необходимо плотно прижать наносимый
субстрат к почве и следить, что он был увлажнен. Почвенные пластинки
помещают во влажную камеру и инкубируют в термостате при 25-27°С в
течение нескольких недель. Если используются пластиковые чашки Петри
диаметром 3 см, то их можно поставить в стеклянные чашки Петри
диаметром 10 см, в которые налита вода (1-2 мл). Появление грибного
мицелия на целлюлозосодержащих материалах, как правило, происходит
после недельной инкубации почвы, спорообразование - через 2-4 недели.
Выделение грибов осуществляют непосредственно с почвенной пластинки
с субстратом на питательные среды Гетчинсона с фильтровальной бумагой,
сусло-агар и Чапека (кусочек мицелия или споры берут препаравальной
иглой под контролем микроскопа). Аналогичным образом, нанося субстрат
на поверхность почвенной пластинки можно выделять микроскопические
грибы, разрушающие пектин, ксилан, белки.
Для выделения грибов, разлагающих целлюлозу, гемицеллюлозу,
пектин, хитин и другие соединения, их вводят в состав питательных сред в
качестве источника углерода, минеральная основа которых аналогична

33
среде Гетчинсона-Частухина, которые содержат в качестве источника
углерода целлюлозу или карбоксиметилцеллюлозу (в концентрациях 0,8 —
1,0 %), (возможна замена NaN03 на NH4N03). Если микромицет
продуцирует фермент, расщепляющий данный субстрат, то проявление
этой ферментативной активности можно обнаружить в виде зоны
просветления в среде. В случае синтеза ферментов, связанных с клеткой,
необходимо удалить колонию с пластинки агара, чтобы обнаружить пятно
на месте гидролиза субстрата. Нерастворимые субстраты (хитин,
целлюлоза) вносят в среду в виде тонко размолотого порошка. Хитин
можно получить из покровных тканей насекомых или крабов.
Предварительно ткани декальцинируют в 10%-ной НС1. Полученный
хитино-протеиновый комплекс гидролизуют 6 ч 10%-ной NaOH при 105°С
в автоклаве. Хитозан удаляют 5%-ной НС1. Такой хитин можно в виде
пленки толщиной 0,25 мм разрезать на квадраты 0,5x0,5 см и на
покровном стекле поместить в почву. После инкубации посева вокруг
колоний грибов, продуцирующих фермент, появляются зоны просветления.
Для выявления зон просветления растворимых субстратов их осаждают или
окрашивают. Необходимо учитывать, что краситель часто убивает
микроорганизмы, поэтому, если требуется выделить культуру,
предварительно делают реплику колоний. Существует альтернативный
способ, заключающийся в присоединении красителя к субстрату. Для этого
обычно используют ремазол, бриллиантовый синий или азур. Эти приемы
широко используют при первичном скрининге продуцентов различных
ферментов. Также можно стерильную фильтровальную бумагу
раскладывать на поверхность питательной среды или вносить в нее в
измельченном виде (растертой в ступке или шаровой мельнице в порошок).
Фильтровальную бумагу следует предварительно прокипятить в
дистиллированной воде и проверить отсутствие в ней примеси крахмала по
отрицательной йодной реакции. Для приготовления среды необходимо
брать очищенный агар. К минеральной основе среды можно также
добавлять микрокристаллическую целлюлозу или аморфную целлюлозу
(обработанную предварительно фосфорной кислотой и промытую
дистиллированной водой). Проводят посев разведений или почвенных
комочков (по 50 комочков на чашку). Эти среды часто используют для
выделения сумчатых грибов (рода Chaetomium).
Выделение кератиноразлагающих грибов. Кератины —
специфические серосодержащие белки, характеризующиеся высокой
устойчивостью к различным биологическим и химическим воздействиям. В
почву кератины попадают с покровных тканей животных (эпидермиса
кожи, роговых образований, перьев, шерсти). Ряд грибов может разлагать
кератины, причем одни виды используют кератин мертвых тканей, другие

34
способны развиваться и на живых тканях, вызывая заболевания -
дерматомикозы. Поэтому выявление качественного состава и плотности
популяций этих грибов важно для специфических местообитаний - почв
животноводческих угодий, на территориях переработки
кератинсодержащих соединений.
Образцы почв (20-100 г) в нескольких повторностях отбирают с
исследуемого участка, помещают в чашки Петри и увлажняют стерильной
водой. На поверхность почвы наносят стерилизованные волосы (в виде
кусочков длиной 4-7 мм) или другие приманки - шерсть животных, кусочки
роговых тканей. Чашки термостатируют в темноте при 20-25°С в течение 1-
6 недель. Контроль осуществляют микроскопически при малых
увеличениях. При появлении мицелия на приманках их извлекают из почвы
и переносят на среду Сабуро, содержащую циклогексимид (0,5 г/л) и
хлорамфеникол (0,05 г/л). Мицелий, выросший вокруг приманок,
пересевают на свежие косяки со средой Сабуро. В качестве показателя
плотности в почвах отдельных видов кератинразлагающих грибов
учитывается процент приманок, заросших определенными видами.
При работе с кератиноразлагающими грибами следует соблюдать
особую осторожность, так как наряду с сапротрофными микромицетами
возможно выделение патогенных дерматофитов.
Грибы, способные разлагать лигнин, изолируют на питательные
среды с лигнином. Разрушающие лигнин микромицеты можно выделить,
используя силикагельные пластинки, пропитанные минеральными солями,
на поверхность которых нанесен порошкообразный лигнин в количестве
0,25 г на чашку. Чашки инокулируют 1 мл почвенной суспензии и
инкубируют при 280С во влажной камере. Колонии микромицетов
появляются на поверхности лигнина через 3-4 нед. В качестве
единственного источника энергии в среды добавляют также различные
производные лигнина (ванилин, сирингальдегид, n-гидроксибензальдегид).
Эти вещества в концентрации не выше 0,01 % вводят в минеральную
основу среды Чапека 10-кратноразбавленную. Повышать концентрацию
производных лигнина не рекомендуется, поскольку они, как и все фенолы,
токсичны для микроорганизмов.
Для обнаружения в почве грибов, принимающих участие в
разложении гумуса, к питательным средам прибавляют в качестве
источника углерода и азота гумат натрия (в концентрации до 0,01%) в
качестве источника углерода в минеральной основе среды Гетчинсона с
NH4N03; применяют также силикагелевые пластинки, пропитанные
минеральным раствором Виноградского (2-3 мл на чашку) и гуматом
натрия (8-10 мг на чашку в 0,02 н растворе гидроокиси натрия). Эти же
грибы можно выделять и на почвенный агар — вытяжку почвы с агаром.

35
Грибы, которые могут расти в условиях дефицита органических
веществ, выделяют на голодный агар.
Метод «ловчих растений» для выделения фитопатогенных
грибов. Метод «ловчих растений», то есть вегетирующих растений-хозяев,
их проростков или укорененных пасынков, с успехом применяется для
выявления фитофторовых грибов. Почву в чашках Петри заливают водой
до полного насыщения. Здоровые сеянцы восприимчивого растения на
стадии семядольных листьев, которые предварительно были пророщены в
чашках Петри на увлажненной фильтровальной бумаге, раскладывают в
чашки Петри с почвой. Для стимулирования инфицирования сеянцев их
перед высадкой в почву накалывают препаровальной иглой. При таком
способе на растениях через 5 — 7 дней инкубирования при 20 — 22 °С в
зараженной почве обычно хорошо заметны первые признаки развития
возбудителя. На зародышевых корешках сеянцев обнаруживаются участки
с побуревшей и размягченной тканью. При микроскопическом анализе
хорошо просматриваются образующиеся на поверхности пораженных
корней спорангии. Органы полового размножения (ооспоры) гриба
образуются спустя 10—15 сут.
Выделение фитопатогенных грибов методом приманок. Для
выделения фитопатогенных грибов, которые определенный период своего
жизненного цикла функционируют в почве как сапротрофы, в качестве
приманок используют различные органы растений. При выявлении видов
Fusarium хорошими приманками служат стерильные кусочки клубней
картофеля, для Verticillium - отрезки стеблей, черенки и листья шелковицы,
ивы, томатов, для видов Phytophthora - яблоки, ягоды земляники. Для
подавления роста типичных сапротрофных грибов на приманках в почву
можно вносить фунгицид. Так, беномил добавляют для обнаружения
грибов рода Phytophthora. Исследуемую почву (не менее 10 г)
раскладывают в стерильные чашки Петри или стеклянные стаканчики,
заливают стерильной водой (в ряде случаев необходимо увлажнять до 60%
от полной влагоемкости), помещают приманки и инкубируют в термостате,
поддерживая постоянную влажность почвы. Через 2-3 суток приманки
начинают просматривать под микроскопом и появившиеся грибы отсевают
на агаризованные среды. Используют, как правило, среды в состав которых
входят растительные отвары - овсянный, картофельный, кукурузный и
дрожжевой экстракты.
При выделении грибов Verticillium свежесобранный растительный
материал разрезают на фрагменты, очищают от коры, стерилизуют в 96°
спирте и помещают в стаканчики с почвой на глубину 7-8 см. После 3
суток экспонирования при 24-26°С палочки вынимают и микроскопируют,
регистрируя наличие конидиального налета Verticillium на участке,

36
расположенном на границе почвы с воздухом. По количеству отрезков с
конидиальным спороношением можно характеризовать относительную
инфицированность образцов почвы. Однако следует учитывать, что такой
тип конидиального спороношения свойственен и другим видам Verticillium,
обитающим в почве. Поэтому в данном случае, как и с другими
фитопатогенами необходимо их выделение в чистую культуру на
питательные среды, которые существенно различаются по составу для
разных фитопатогенных видов грибов.
Выделение микромицетов, способных к разложению
ксенобиотиков можно определять по способности к росту в присутствии
загрязняющего вещества (ЗВ) методом измерения радиальной скорости
роста колоний на среде Чапека с добавлением 0,01-0,15% ЗВ (Кураков,
2001). Радиальная скорость роста вычисляется как увеличение радиуса
колоний на плотной питательной среде за определенный промежуток
времени. Посев чистых культур микромицетов, производят на среду Чапека
без сахарозы с добавлением исследуемого вещества и параллельно на среду
Чапека с сахарозой (контроль). Через 36 часов инкубации при температуре
28˚С измеряют диаметр выросших колоний и сопоставляют с диаметром
колоний выросших на контрольных чашках. Измерение повторяетсяь
трижды через 24 часа (Методы…, 1991).
Для культивирования грибов на парафинах на жидкой
минеральной питательной среде используют виды с высоким
температурным оптимумом (42—56° С) — Aspergillus oryzae, Asp. niger,
Mucor pusillus, Rhizopus oryzae, Absidia corymbifera, A. ramosa. Для
выращивания грибов используют минеральную среду Чапека, рН среды 5,2.
По 500 мл среды разливают в колбы Эрленмейера емкостью 0,75л и
стерилизуют при давлении 0,5 атм в течение 20 мин. После стерилизации в
колбы над пламенем горелки добавляют отдельно перетопленный,
взвешенный и измельченный до порошкообразного состояния парафин (4 г
на 500 мл среды). Парафин вводят двумя порциями: во время посева грибов
и на 2-3-й день культивирования. Среду засевают культурами,
выращенными на сусловом агаре. Плотность посева 6•106—1•107 конидий
на 1 мл среды.
В зависимости от вида культивируемого гриба посевной материал
выращивают в течение 48 ч при температуре 45; 52 и 56° С. Выращенный
посевной материал переносят в ферментационные колбы из расчета 5—
10% объема среды. В процессе ферментации в зависимости от требований,
предъявляемых к получаемому продукту, можно регулировать уровень рН
(который обычно повышают от 5,2—5,5 до 6,5— 7,5) КОН, NaOH или
аммиаком. Для ускорения процесса используют стимуляторы роста —
дрожжевой автолизат, экстракт липидов и другие.

37
Продолжительность культивирования 7—9 дней. После окончания
ферментации культуральную жидкость с выращенным грибом
центрифугируют для отделения неиспользованного парафина. Затем
жидкость сливают, а мицелий промывают на капроновом фильтре водой,
нагретой до 50—60°С. Для полного удаления парафина на фильтре
мицелий промывают гексаном. Если при культивировании используют
парафиновый гач, то промывать мицелий лучше метилэтилкетоном или
метилазобутилкетоном.
На основе метода проращивания грибных зачатков во влажной
камере (Иванова, 1999), можно определять способность грибов к
ассимиляции различных субстратов, например, нефти. На стекло
предварительно наносится тонким слоем стерильная нефть, на нее
наносится капля споровой суспензии чистой культуры темноокрашенных
грибов (их легче считать). Споровая суспензия готовится следующим
образом: грибы 10 дней выращивают на среде Чапека в пробирках
(скошенный агар), после производят смыв 10 мл стерильной воды. Для
удаления обрывков мицелия суспензию фильтруют через 2-слойную
стерильную марлю. Чистоту и плотность суспензии проверяют при
микроскопировании в камере Горяева. Для основных опытов плотность
споровой суспензии составляет 106 спор в мл. Прорастание спор начинают
учитывать через 24 часа. Просматривают 100 мелких спор и 50 крупных,
что составляет примерно 20 полей зрения (повторность 3-кратная).
Прорастание спор рассчитывается как отношение числа проросших спор к
общему числу просмотренных. Наблюдение проводят на 1, 2, 3, 7, 15-е
сутки. Стекло микроскопируют, учитывая: прорастание спор (%), длину
проростков (в мкм).
Метод инициированного сообщества предназначен для оценки
изменений в комплексе почвенных микроорганизмов под действием
антропогенного воздействия. Метод является модификацией приема
«добавок», широко используемого в экологии микроорганизмов
(Методы…, 1991). Он может быть использован для выделения
микромицетов, обладающих амилазами и грибов, развивающихся на
продуктах гидролиза крахмала в почве.
Для синхронной активизации микроорганизмов необходимо,
использовать образцы почвы, не менее 2 недель выдержанные в воздушно-
сухом состоянии, и инициировать развитие микроорганизмов внесением в
почву полимерного питательного субстрата. Почву освобождают от
растительных остатков, измельчают и просеивают через сито с диаметром
отверстий 1 мм. После увлажнения ее до 60% от полной ее влагоемкости из
почвенной пасты приготавливают почвенные пластинки в чашках Петри
диаметром 3-4 см, которые 2 сут предынкубируют при 25°. Постоянную

38
влажность поддерживают, помещая чашки во влажную камеру. Можно
поставить маленькие чашки в большие, в которые налито 1-2 мл воды. Для
осуществления инициации развития амилолитических микроорганизмов в
почве крахмал наносят тонким слоем (в несколько зерен) на поверхность
почвенной пластины в виде полоски шириной 1 см. Удобно крахмал
наносить напылением, и его количество не должно превышать нескольких
десятых долей процента от массы почвы. Можно слегка прижать
почвенную пластинку к нанесенному на лист порошку крахмала.
Через 2—3 недели инкубации описывают видовой состав и
организацию амилолитического микробного сообщества почвы.
Представленность популяций в сообществе отражают в трех градациях
обилия: доминант — организм, составляющий более 20% от общей
биомассы сообщества; часто встречающийся организм — 5—20%; редко
встречающийся организм — менее 5%. Для исследования сообщества
используют прямое микроскопирование, а также традиционные методы
выделения и идентификации микроорганизмов. Хорошо воспроизводимые
результаты обеспечиваются постановкой экспериментов в 10-кратной
повторности. Кроме крахмала можно использовать любые органические и
неорганические субстраты.

39
3. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ
Идентификация мицелиальных грибов основана главным образом на
сопоставлении макроскопических и микроскопических признаков
исследуемой культуры с ранее описанными признаками известных грибов;
физиологических тестов используется немного. Для выявления
дифференцирующих признаков организм следует высевать на
соответствующую среду, подходящую для развития у него
диагностических структур. Предпочтительной средой для большинства
мицелиальных грибов служит среда на растительной основе. Записи
полученных данных необходимо сохранять, чтобы можно было сравнивать
выделяемые в разное время штаммы одного и того же гриба, которые могут
несколько различаться.
Для каждой идентифицируемой культуры необходимо определить
цвет поверхности (у некоторых организмов и обратной стороны) и фактуру
колоний, а также скорость роста по диаметру колоний (макроскопические
признаки). Иногда грибы издают особый запах, но при его определении
ОСТЕРЕГАЙТЕСЬ ВДОХНУТЬ КУЛЬТУРУ! ПРИ РАБОТЕ ПО
ИДЕНТИФИКАЦИИ ГРИБОВ НЕОБХОДИМО РАБОТАТЬ В
РЕСПИРАТОРЕ (МАСКЕ). Некоторые грибы могут образовывать видимые
невооруженным глазом половые структуры или крупные склероциальные
зоны. Следует отмечать температуру, среду и срок инкубации, при которых
получены данные характеристики.
В качестве видовых дифференцирующих признаков помимо
морфологических используют культуральные признаки. Часто для
дифференциации не только видов, но и групп видов важно определение
роста культуры при разных температурах.
Для определения видовой принадлежности грибной культуры ее
высевают на плотные питательные среды, наиболее благоприятные для
образования репродуктивных структур. Быстрорастущие грибы (например,
мукоровые) следует сеять одной колонией в центре чашки. Для каждой
таксономической группы используют наиболее благоприятные среды,
которые указаны в приложении 2.
Для характеристики культуральных признаков наблюдение за
развитием гриба, проводят от нескольких дней до 1-2-х недель. Изучение
морфологических признаков культуры начинают, просматривая ее на чашке
при увеличении x8, х20, х40 микроскопа. Культуру на чашке просматривают
для того, чтобы отметить характер прикрепления спороношений к
воздушному или субстратному мицелию, ветвление спорангиеносцев и
конидиеносцев, характер агрегации спор и конидий (одиночные или
группами).

40
3.1. Изучение морфологии репродуктивных органов
Дальнейшая работа по идентификации связана с приготовлением
препаратов репродуктивных органов и микроскопированием их на
увеличении х40 и х60. Препараты с использованием прозрачной клейкой
ленты (скотча) легко приготовить, и они позволяют сохранить
большинство структур неповрежденными. С помощью этого метода можно
практически сразу же идентифицировать гриб, если культура дает
конидиальное спороношение. Однако для приготовления постоянных
препаратов этот метод малопригоден; не удается также сделать через ленту
хорошие фотоснимки. В большинстве случаев готовят препарат
«раздавленная капля» на стеклах, как для более точного анализа
конидиогенеза, так и для сохранения постоянного образца изолята.
Признаки, которые следует определять, варьируют в зависимости от рода и
вида объекта, однако у всех культур нужно отмечать характер
септирования гиф (септированные, с редкими перегородками или с
пряжками), тип конидиогенных клеток и вид их репродуктивных пропагул
— как половых, так и бесполых (если они имеются).
Препарат «раздавленная капля». На середину чистого предметного
стекла наносят небольшую каплю воды, бульона или физиологического
раствора (0,5%-ный раствор NaCl). В нее вносят петлей или иглой
исследуемый материал, после чего осторожно распределяют материал в
суспензии. При рассмотрении микроорганизмов, выросших в жидких
средах, каплю воды на предметное стекло можно не наносить. Покровное
стекло ставят на ребро у края капли с микроорганизмами и постепенно
опускают, стараясь, чтобы между стеклами не образовались пузырьки
воздуха, мешающие микроскопированию. Ручкой петли прижимают
покровное стекло к предметному. Излишек жидкости, выступающий за
края покровного стекла, удаляют полоской фильтровальной бумаги.
Приготовленный препарат сразу же исследуют, так как жидкость высыхает
и микроскопирование затрудняется.
В препарате «раздавленная капля» в светлом и темном поле можно
установить форму и размеры клеток, их физиологическое состояние,
характер размножения, расположения спор, наличие запасных питательных
веществ в клетке, подвижность. В последнем случае необходимо отличать
истинное движение от броуновского, при котором клетки остаются на
месте, совершая колебательные движения, или перемещаются по току
жидкости.

3.2. Методы фиксации и окрашивания

41
Основная цель фиксации — прервать течение жизненных процессов
объекта исследования и сохранить неизмененной тонкую структуру его
клеток.
Кипячение применяют при изучении морфологических особенностей
мицелия, выросшего в естественных условиях или в культуре на жидких и
агаризованных средах. При этом в пробирку с кипящей водой погружают и
тут же извлекают объект исследования.
Высушивание применяют при цитологических исследованиях. На
предметное стекло в каплю воды помещают препарат, подсушивают на
воздухе в течение 20—30 мин.
Фиксация химическими реактивами.
Этиловый спирт (96%-ный) хорошо фиксирует мицелий, полученный
в культуре. Время фиксации мицелия — до 1 ч, конидий — 30 мин — 1 ч,
прорастающих конидий — 2—5 мин.
Спирт с формалином применяют при исследовании внешних
структур, не содержащих клеток. Состав: спирт (70%-ный), формалин
(94—98%-ный) (6:2). Время фиксации от 1 мин до суток.
Спирт с уксусной кислотой применяют при изучении ядер. Состав:
спирт (96%-ный), уксусная кислота крепкая (2:1). Время фиксации 6—24 ч.
Жидкость Карнуа применяют при цитологических исследованиях.
Состав: абсолютный спирт, хлороформ, уксусная кислота ледяная (6:3:1).
Время фиксации — от нескольких минут до нескольких часов. Жидкость
Карнуа особенно рекомендуется при последующем окрашивании пре-
паратов фуксином и эритрозином.
Жидкость Флемминга считается наилучшим фиксатором при
цитологических исследованиях. Состав: хромовая кислота 1%-ная (25 мл),
уксусная ледяная кислота (10 мл), осмиевая кислота 2%-ная (10 мл). Время
фиксации — 1 —15 мин.
Фиксатор Шаудина используют при изучении ядер. Состав: по 2
части насыщенного водного раствора сулемы и абсолютного спирта, 1
часть 2%-ной уксусной кислоты.
Фиксируют препарат, наливая фиксатор на поверхность препарата.
После фиксации препарат обязательно промывают дистиллированной
водой до полного исчезновения фиксатора.
Витальное окрашивание представляет собой сложную реакцию, с
помощью которой можно воспроизвести модель некоторых процессов
клеточного обмена, и не вызывает заметных нарушений жизнедеятельности
объектов исследования. Основной краской гранулярного типа,
применяемой для этих целей, является нейтральная красная. При подкра-
шивании клетки 0,02%-ным раствором нейтральной красной вакуоли
приобретают розовую окраску, а гранулы метахроматина — ярко-красную.

42
Наиболее часто применяемые в микологической практике красители для
контрастного окрашивания мицелия — метиленовый синий, метиловый
фиолетовый, генциановый фиолетовый, раствор Люголя.
Метиленовый синий применяют в виде спиртовых, водных,
щелочных растворов: 1) спиртовой раствор: к 100 мл 96%-ного спирта
добавляют 3 г краски, взбалтывают, оставляют отстояться на несколько
суток, фильтруют, перед употреблением разводят в 5—10 раз, раствор
прочный;
2) водный раствор: к 100 мл воды добавляют 2 г краски, отстаивают 2
сут; периодически взбалтывают. На дне сосуда должен остаться избыток
нерастворенной краски. Раствор быстро портится;
3) щелочной раствор (синь Леффлера): к 100 мл дистиллированной
воды добавляют 30 мл насыщенного спиртового раствора краски и 1 мл
1%-ного раствора едкого калия. Раствор сохраняется долго;
4) для приготовления полупостоянных препаратов применяется
раствор метиленового синего, 96%-ного спирта, глицерина и воды (1:1:1:1).
Метиловый фиолетовый:
1) к 96 мл воды добавляют 4 мл анилина, хорошо взбалтывают и
добавляют 10 мл насыщенного раствора краски;
2) к 20 мл дистиллированной воды добавляют 2,5 мл уксусной
кислоты, затем 10 мл насыщенного спиртового раствора краски.
Генциановый фиолетовый применяется обычно в виде 1—0,1%-ного
водного раствора. Способ приготовления такой же, как и предыдущего
красителя.
Раствор Люголя: растворяют 2 г йодистого калия в 5 мл воды, затем
добавляют 1 г металлического йода. Объем доводят до 300 мл ди-
стиллированной водой.
Дифференциальное окрашивание содержимого гиф грибов. Готовят
смесь Судана 3, хлопчатобумажного синего и йода в молочной кислоте
(1:1:1). В гифах жир окрашивается в ярко-оранжевый цвет, гликоген — в
буро-красный, а протоплазма — в синий.
Окрашивание амилоидной оболочки. Применяют для большинства
базидиальных, сумчатых и несовершенных грибов. Краситель — раствор
Люголя. Несколько капель раствора добавляют к готовому препарату на
предметное стекло. Время окрашивания от нескольких секунд до I ч.
Амилоидные оболочки окрашиваются в синий цвет.
Окрашивание клеточной оболочки.
Танин применяют для окрашивания всех групп грибов. Препарат
фиксируют над пламенем, горелки и добавляют каплю 20%-ного водного
раствора танина. Время окрашивания 20—30 мин.

43
Метод Гутштейна. Препарат фиксируют на предметном стекле над
пламенем горелки, помещают на 20—30 мин в 5%-ный раствор танина,
промывают водой 1—5 мин и окрашивают карболфуксином (фуксин,
карболовая кислота, спирт, вода — 1:5:10:100) в течение 1—2 мин;
тщательно промывают. Оболочка окрашивается в интенсивно красный
цвет.
Метод Кнейси. Препарат фиксируют на предметном стекле над
пламенем горелки и помещают в раствор, состоящий из 70 мл насыщенного
водного раствора калийных квасцов и 30 мл 20%-ного водного раствора
танина на 2—3 мин. Промывают дистиллированной водой 3—5 мин,
добавляют каплю карболфуксина и накрывают покровным стеклом, не
удаляя краски. Оболочка окрашивается в синий цвет.
Метод Пешкова. Применяют для дрожжей и низших грибов.
Препарат фиксируют в жидкости Карнуа и опускают на 2—5 мин в 10%-
ный водный раствор танина, тщательно промывают и красят фуксином в
течение 30—60 с, не промывая микроскопируют. Оболочки окрашиваются
в синеватые цвета.
Окрашивание генциановым фиолетовым и конго красным.
Применяют для всех грибов. Препарат фиксируют любым способом,
помещают в 0,5%-ный водный раствор генцианового фиолетового на 1,5—
2 мин, промывают, помещают в 0,5%-ный водный раствор конго красного
на 2—3 мин, промывают, подсушивают. Оболочки окрашиваются в темно-
синий или черный цвет.

Перед определением нужно четко разобраться в наблюдаемых


структурах и сделать описание культуральных и морфологических признаков
объекта, которые будут необходимы, чтобы пользоваться ключами в
соответствующих определителях. Описание культуральных и
морфологических признаков грибов проводят по схеме, имеющей различия в
зависимости от таксономического положения определяемых видов. Поэтому
перед описанием необходимо определить крупный таксон (класс, порядок),
к которому принадлежит культура, чтобы потом пользоваться
соответствующим определителем для этого класса или порядка.

3.3. Идентификация отдела ZYGOMYCOTA


Подвижные стадии в цикле развития отсутствуют. Вегетативное тело
— обильно разветвлѐнный неклеточный многоядерный мицелий,
субстратный и воздушный. У части видов в зрелом состоянии образуются
клеточные перегородки, разделяющие мицелий на отдельные
многоядерные фрагменты. У немногих видов, в основном
узкоспециализированных, таких как паразиты насекомых (энтомофторовые

44
грибы) или паразиты других беспозвоночных (зоопаговые грибы), мицелий
с самого начала его существования многоклеточный. В оболочках клеток
содержится хитин в комплексе с хитозаном, что отличает эту группу от
двух других отделов неподвижных хитинсодержащих грибов с клеточным
мицелием — аскомицетов и базидиомицетов, у которых второй компонент
клеточной стенки в основном глюкан, как и у хитридиомицетов. Запасное
вещество — гликоген.
Бесполое размножение осуществляется неподвижными эндогенными
спорангиоспорами, образующимися в спорангиях, или реже экзогенными
конидиями. В ряде семейств можно проследить эволюцию бесполого
размножения: видоизменение специализированных структур, анаморф, от
эндогенных спорангиоспорр через малоспоровые спорангии к экзогенным
конидиям, что вероятно связано с переходом этих грибов к наземному
образу жизни.
Отдел зигомикота включает более 500 видов, относящихся к двум
классам: Zygomycetes (зигомицеты) и Trichomycetes (трихомицеты). Почти
все они наземные организмы: в основном почвенные сапротрофы, в
меньшей степени паразиты насекомых и других беспозвоночных, грибов,
высших растений, теплокровных животных и человека.
КЛАСС ZYGOMYCETES
Характеристика класса в общих чертах повторяет характеристику
отдела. По уровню организации и дифференцировки таллома,
особенностям развития, морфологии анаморф и отчасти по эколого-
трофическим признакам (специализация к конкретному субстрату или
хозяину в значительной степени влияет на структуру таллома и может
приводить к изменениям в бесполом и отчасти половом процессах) класс
подразделяют на шесть порядков. Основные порядки: Mucorales,
Endogonales, Entomophthorales, Zoopagales.
К зигомицетам относятся:
• Формы, образующие многочисленные спорангиоспоры внутри
округлых спорангиев. Спорангии в основном находятся на
спорангиеносцах и могут иметь колонки и апофизы. Возможно присутствие
ризоидов (в узлах или междоузлиях), а также столонов. Спорангиоспоры
гладкие или орнаментированные (например, с полосатой исчерченностью),
почти округлые, удлиненные или угловатые (рис. 7).

45
Absidia corymbifera
Apophysomyces elegans
Mucor circinelloides
Mucor ramosissimus
Rhizomucor pusillus
Rhizopus arrhizus
Rhizopus microsporus
Rhizopus schipperae

Рис. 7. Спорангиеносцы и спорангии зигомицетов

•Формы, образующие многочисленные спорангиоспоры в спорангии, имеющем


форму вазы

Рис. 8. Saksenaea vasiformis

• Формы, образующие одну спорангиоспору в спорангии.

Рис. 9.Cunninghamella bertholletiae

• Формы, образующие по несколько спорангиоспор, расположенных в ряд


внутри длинного трубковидного спорангия (мероспорангий).

Рис. 10. Syncephalastrum racemosum

• Формы, образующие многочисленные спорангиоспоры внутри


многочисленных спорангиол (мелкие спорангии) на изогнутых ножках;
спорангиолы формируются на апикальных вздутиях.

46
Рис. 11. Cokeromyces recurvatus

Наиболее часто встречаемые представители зигомицетов относятся


преимущественно к порядку Mucorales (мукоралес). Поскольку
большинство мукоральных грибов - гетероталличные виды, образование
продуктов полового спороношения — зигоспор — происходит у них
только при условии скрещивания совместимых типов. В то же время
спорангиоспоры (споры бесполого размножения) образуются у них легко и
различными путями. Выделяются чаще из почвы.
Схема определения представителей этого порядка включает
культуральные и морфологические признаки. Описание представителей
порядка Mucorales следует проводить на сусло-агаре, картофельно-
декстрозном (КДА) и глюкозо-пептонном агаре.
Культуральные признаки: внешний вид колонии, ее текстура
(пушистая, шерстистая, войлочная, бархатистая), наличие в колонии зон или
лопастей, степень развития субстратного и воздушного мицелия, наличие
ярусов в спороношениях, наличие столонов - нитей воздушного мицелия,
соединяющих отдельные спорангиеносцы, цвет колонии, температурные
границы роста с установлением оптимума.
Морфологические признаки. Наличие и строение хламидоспор -
толстостенных клеток на мицелии и спорангиеносцах. Строение бесполых
спороношений, представленных спорангиеносцами со спорангиями -
вместилищами с большим числом спор внутри, спорангиолями с небольшим
числом спор или конидиями - отдельными наружными спорами (рис. 4) и
мероспорангиями - цилиндрическими образованиями, отходящими обычно
от вздутия на спорангиеносце. Учитывается ширина и длина спорангиеносца,
форма спорангия или спорангиоли (округлая, грушевидная), наличие,
размеры и форма спор (округлые, эллиптические, неправильной формы, с
придатками), их поверхность (гладкая, шероховатая, ребристая), наличие
апофизы - вздутия на конце спорангиеносца ниже спорангия.
Спорангиеносцы прямые или изогнутые, прямостоячие или поникающие.
Ветвление спорангиеносцев (моноподиальное, симподиальное, смешанное,
дихотомическое, мутовчатое) (рис. 12). На спорангиеносцах могут быть
вздутия разнообразной формы, придатки, зубчики. Отмечается наличие
ризоидов на спорангиеносцах.

47
Рис. 12. Типы ветвления спорангиеносцев у мукоровых грибов: 1 - неветвящийся, 2 -
моноподиальное, 3 – симподиальное, 4 - дихотомическое, 5 - столоны, 6 - ризоиды.

Порядок Mucorales (Мукоровые)


Самый большой по количеству видов порядок (около 400 видов),
включающий в основном почвенных сапротрофов, особенно обильно
развивающихся в окультуренных почвах, где они активно участвуют в
круговороте органических веществ. Так же хорошо мукоровые развиваются
на растительных остатках, навозе травоядных (копрофильные виды), на
других грибах, в основном шляпочных или других мукоровых
(микофильные виды). Некоторые виды паразитируют на теплокровных
животных и человеке.
Бесполое размножение осуществляется эндогенными
спорангиоспорами, редко конидиями. В этой группе 3/4 видов
гетероталличны и 1/4 гомоталличны. Именно на этой группе грибов
впервые было установлено явление гомогетероталлизма у грибов. Для
идентификации мукоровых грибов следует использовать определители
Gilman, 1959; Zycha, Siepmann, Linnemann, 1969; Милько, 1974; Schipper, 1976;
Schipper, Stalpers, 1984; Domsch, Gams and Anderson, 1993.
Наиболее широко в природе распространены виды рода Мисоr
(мукор). Его мицелий пронизывает субстрат (почву, растительные остатки,
а также многие продукты питания: хлеб, овощи), который покрывается
сероватым налѐтом водушного мицелия. Он в основном состоит из
бесцветных гиф, сильно ветвится и не имеет перегородок, которые
появляются у некоторых видов только при старении или при
культивировании в жидкой среде. В последнем случае мицелий часто
распадается по перегородкам на отдельные клетки, которые затем
размножаются почкованием (так называемые "мукоровые дрожжи",
например Mucor racemosus). На мицелии в большом количестве
формируются одиночные или сильно разветвленные спорангиеносцы с
темно окрашенными шаровидными спорангиями на вершине. Эти
спорангии хорошо заметны даже невооружѐнным глазом в виде буроватых
и чѐрных точек. В спорангиях содержатся многочисленные споры, которые

48
освобождаются после расплывания или разрыва его оболочки. Каждая
спора дает начало новому мицелию.
У видов рода Мисоr спорангиеносец обычно вздувается внутрь
спорангия, образуя колонку. У многих видов при разрушении оболочки
спорангия у основания колонки остается еѐ кутинизированная часть,
образуя так называемый воротничок (рис. 13).
Для близкого и столь же широко распространенного рода Rhizopus
(ризопус) характерно образование толстых воздушных гиф, столонов,
которые располагаются над субстратом. В том месте, где они с ним
соприкасаются, образуются ризоиды, внедряющиеся в субстрат, а вверх в
этом месте отходят пучки неразветвлѐнных спорангиеносцев со
спорангиями (рис. 14).
Наиболее крупные спорангиеносцы и спорангии у видов рода
Phycomyces (фикомицес). Темные сине-зеленые, отливающие характерным
металлическим блеском спорангиеносцы характеризуются положительным
фототропизмом, а крупные, сначала ярко-желтые, а в зрелости черные
спорангии содержат до 70 тыс. спор.
Своеобразно устроен спорангиеносец копрофильного рода Pilobolus
(пилоболус), который легко увидеть невооружѐнным глазом на навозе
травоядных (рис. 15). Он растет вверх от находящейся в субстрате вздутой
желтоватой клетки — трофоцисты. Спорангиеносец на вершине
расширяется в блестящий пузырь, на котором располагается чѐрный
шаровидный немного приплюснутый спорангий. За счет тургорного
давления, развивающегося в пузыре и достигающего 5,5 атмосфер,
спорангий отбрасывается целиком на расстояние до двух метров.
Спорангий плотно прилипает к траве и вместе с ней попадает в
пищеварительный тракт животного. Под действием пищеварительных
ферментов кутинизированная оболочка спорангия разрушается, споры
освобождаются и, оказавшись на навозе травоядных, прорастают в
мицелий.
У части мукоровых наблюдается переход от спорангиоспор к
конидиям через малоспоровые и односпоровые спорангии, называемые
спорангиолями. В качестве примера такого перехода можно привести род
Thamnidium (тамнидиум). Виды этого рода копротрофы и часто
встречаются на конском навозе. У них на конце очень длинного
спорангиеносца расположен крупный многоспоровый спорангий с
колонкой. На концах боковых ответвлений этого же спорангиеносца сидят
многочисленные мелкие спорангиоли, не имеющие колонки и содержащие
мало спор от 4 до 10 (рис. 18). У видов рода Chaetocladium (хетокладиум),
паразитирующих на других мукоровых грибах, формируются только
односпоровые спорангиоли, которые можно сравнить с конидиями. От

49
настоящих экзогенно формирующихся конидий они отличаются двойной
оболочкой - один слой собственно споры, второй - сохранившаяся
оболочка спорангия (рис. 19.1).

Рис. 13. Мисоr: 1 - спорангиеносцы со Рис. 14. Rhizopus stolonifer: а - спорангий, б -


спорангиями, 2 - строение спорангия (а спорангиеносец, в - ризоиды, г - зигоспора, д -
- колонка, б - воротничок, в - споры). подвески суспензоры, е - столон.

Рис. 15. Piolobus: 1 - общий вид, 2 - Рис. 16. Absidia: 1 - столон с пучком
зрелый спорангий, 3 - отбрасывание спорангиеносцев со спорангиями; 2 -
спорангия. расплывшийся спорангий; 3 - зигота с
суспензорами и придатками.

Рис. 17. Piptocephalis: 1 - Рис. 18. Thamnidium: a - спорангий, б -


спорангиеносец со спорангиолями, 2 - спорангиоли, в - спорангиеносец
деталь строения одной ветви

Интересен механизм паразитизма видов хетокладиум. Уже на


некотором расстоянии от мицелия паразита гифа хозяина начинает расти
по направлению к ней и сильно ветвится, особенно если мицелий хозяина

50
принадлежит к противоположному полу. После соприкосновения кончика
гифы паразита с гифой хозяина этот кончик отделяется перегородкой, а
перегородка между гифой хозяина и отделившейся клеткой паразита
исчезает. При этом содержимое гифы хозяина (цитоплазма, ядра)
переходит в разрастающуюся клетку паразита и формируется так
называемая насасывающая клетка (рис. 19.2).
Спорангиоли могут приобретать вытянутую форму, например, виды
рода Piptocephalis (пиптоцефалис) (рис. 17). В этом случае они имеют
наибольшее морфологическое сходство с цепочками конидий на
конидиеносце.

Рис. 19. Chaetocladium: А-спорангиеносец с зиготой (3) и спорангиолями (СП), Б(1-5)-


стадии формирования насасывающей клетки (НК).

Некоторые морфологические особенности отличают зиготы


отдельных родов. Так, у видов родов Phycomyces и Absidia (рис. 16) от
суспезоров (подвесков) или зигофоров, отделяющих сливающиеся клетки-
гаметангии от остального мицелия, отходят выросты - придатки,
окружающие зиготу.

Рис. 20. Mortierella: A — спорангиеносец с многоспоровыми спорангиями, Б — зигота с


окружающими ее гифами (зачаточное "плодовое тело").

У видов рода Mortierella (мортиерелла) зиготы окружены рыхлым


сплетением таких придатков, которые часто переплетаются с
ответвлениями вегетативных гиф, образуя как бы рыхлую обертку вокруг

51
зиготы. В результате образуется как бы зачаточное плодовое тело —
зигокарп (рис. 20).

Порядок Endogonales (Эндогоновые)


У грибов порядка эндогоновых зиготы и многоспоровые спорангии
без колонки формируются внутри плотной обертки из гиф, в результате
чего образуются плодовые тела, спорокарпы. Они имеют вид плотных
желтоватых клубеньков от нескольких мм до 2-3 см в диаметре. Обычно
спорокарпы развиваются в почве. Эндогоновые — почвенные грибы или
сапротрофы на растительных остатках. Наиболее распространенный вид,
обитающий на мертвой древесине на мелких валежных веточках, Endogone
lactiflua, с желтоватыми спорокарпами 1-2 см в диаметре. Если разрезать
незрелый спорокарп этого гриба, то на разрезе выступает бледно-розоватая
жидкость ("млечный сок").
Порядок Glomerales( Гломовые)
Микоризные грибы, облигатные симбиотрофы, образующие
эндотрофную арбускулярную микоризу с травянистыми растениями. В
основном это виды рода гломус Glomus. Грибам этой группы в последнее
десятилетие уделяется значительное внимание исследователей и практиков,
поскольку ее представители, называемые АМ-грибами, способствуют
повышению урожая ряда сельскохозяйственных культур. Типичный
половой процесс — зигогамия описан только у двух видов этого порядка.

3.4. Идентификация отдела ASCOMYCOTA


Аскомикота — грибы с клеточным, или септированным мицелием,
включающие около 30 000 видов, очень разнообразных по строению,
размерам, образу жизни, объединяемых одним общим признаком: в
результате полового процесса у них образуются эндогенные споры —
аскоспоры, заключѐнные в одноклеточном вместилище — сумке или аске
(шаровидной, булавовидной или цилиндрической формы). Второй важный
диагностический признак отдела аскомикота — присутствие ламеллярных
двуслойных клеточных стенок с тонким электронноплотным наружным
слоем и относительно толстым электроннопрозрачным внутренним слоем.
В состав клеточной стенки, как и у хитридиомицетов, входят полисахариды
— хитин и β-глюкан. У части видов, объединяемых в класс
Hemiascomycetes — маннан и β-глюкан.

52
Рис. 21 Типы конидиальных спороношений сумчатых грибов: 1 - отдельные
конидиеносцы с конидиями, 2 - ложе, 3 - пикниды

Вегетативное тело — разветвлѐнный гаплоидный мицелий,


состоящий из одно- или многоядерных клеток, разделѐнных
перегородками, или септами. В центре септы остаѐтся пора, через которую
из клетки в клетку мигрируют клеточные органеллы и осуществляется
связь между цитоплазмой отдельных клеток. У некоторых аскомицетов,
например, дрожжей (порядок Saccharomycetales) вегетативное тело —
одиночные почкующиеся клетки. Бесполое размножение экзогенными
конидиями, формирующимися на конидиеносцах разнообразного строения
(рис. 21). В цикле развития аскомикота часто преобладает конидиальное
спороношение, которое служит для массового расселения в течение
вегетации. У паразитных аскомикота конидиальное спороношение чаще
развивается на живом растении-хозяине, а сумчатое — уже на его
отмерших частях (листьях, стеблях). Грибы с половым размножением часто
имеют также и бесполую стадию (анаморфу); она присутствует в культуре
задолго до того, как разовьются половые структуры. К культуральным
признакам, которые могут предшествовать развитию половых структур,
относятся образование экссудата и мелких, видимых невооруженным

53
глазом более темных зон внутри колоний, а также группировка гиф и/или
образование на них узлов. Гомоталличные аскомицеты (образующие
плодовые тела и аскоспоры без скрещивания совместимых штаммов)
включают следующие морфологические типы:
• Формы с аскокарпом в виде клейстотеция (округлая структура
полового спороношения, содержащая сумки и аскоспоры и не имеющая
выводного отверстия). Клейстотеции хорошо видны в стереоскопический
микроскоп, а также заметны невооруженным глазом (рис. 22).

Aphanoascus fulvescens — Chtysosporium


keratinophilum
Emericella nidulans - Группа Aspergillus nidulans
Eurotium herbariorum — Группа Aspergillus glaucus
Fennellia flavipes - Aspergillus flavipes (может не
образовывать клейстотеции)
Monascus ruber — Basipetospora rubra
Рис.22. Клейстотеций
Neosartorya fischeri — Aspergillus fischerianus
Pseudallescheria boydii - Scedosporium apiospermum

• Формы с аскокарпом в виде перитеция (структура округлой или


грушевидной формы, содержащая аскоспоры внутри параллельно
расположенных сумок и имеющая выводное отверстие на вершине).
Перитеции видны в стереоскопический микроскоп, а также заметны
невооруженным глазом.

Microascus cinereus - Scopulariopsis cinereus — демациевые виды


Microascus cirrosus - Scopulariopsis sp. - демациевые виды
Microascus manginii — Scopulariopsis сandida - монилиевые виды
Microascus trigonosporus — Scopulariopsis sp. - демациевые виды
Chaetomium atrobrunneum - колонии серой окраски
Chaetomium globosum - колонии серовато-зеленой окраски
Сhaetomium strumarium - колонии белые с красной обратной
стороной
Рис. 23. Перитеций

• Формы с аскокарпом в виде гимнотеция (рыхлое сплетение гиф


(перидиальные гифы), окружающее сумки с аскоспорами). Гимнотеций
обычно нельзя увидеть невооруженным глазом.

54
Auxarthron spp.
Gymnoascus dankaliensis
Myxotrichum deflexum — гимнотеции темно-
коричневые

Рис. 24. Гимнотеций

Гомоталличные аскомицеты различаются, кроме того, фактурой


стенки плодового тела (перидия), строением стенки (однослойное или
двухслойное) и сумки, а также формой и размерами аскоспор.
По месту формирования сумок, особенностям их строения и
результатам молекулярно-генетических исследований во многих системах
грибов аскомикота подразделяют на следующие классы.
Класс Археаскомицеты—Archiascomycetes (=Taphrinomycetes).
Класс выделен на основании сравнения результатов секвенирования
нуклеиновых кислот. Наиболее древняя группа, являющаяся
предположительно исходной для остальных аскомикота. Плодовые тела в
основном отсутствуют.
Класс Гемиаскомицеты, или Голосумчатые — Hemiascomycetes —
плодовые тела отсутствуют, сумки образуются непосредственно на
мицелии или при слиянии одиночных клеток.
Класс Настоящие сумчатые (аскомцеты или эуаскомицеты) —
Ascomycetes (=Euascomycetes) — сумки образуются внутри или на
поверхности плодовых тел.
Класс Локулоаскомицеты—Loculoascomycetes (=Dothideomycetes)
— сумки образуются в особых полостях (локулах), возникающих в
сплетении мицелия — аскостроме, или псевдотеции.
Аскомикота включает около 75 % всех описанных видов грибов. В
настоящее время к сумчатым грибам относят анаморфные несовершенные
(митоспоровые) грибы — дейтеромицеты (в традиционном смысле),
характеризующиеся сходным строением вегетативных структур и
клеточной стенки при отсутствии в цикле развития сумок и наличии только
конидиальной (бесполой) стадии — анаморфы. В эту же группу включают
лихенообразующие симбиотрофные грибы, составляющие почти четверть
видов аскомикота. Последние в ряде систем грибов ранее (в классических
учебниках) рассматривались в качестве самостоятельного отдела
лишайники — Lichenes или Mycophycophyta. Аскомикота широко
распространены в природе. Среди них можно найти представителей почти

55
всех эколого-трофических групп грибов, как сапротрофов, так и паразитов
растений, животных, человека.
Класс Archiascomycetes - Археаскомицеты
Плодовые тела отсутствуют. Разнородная по морфологии группа:
некоторые виды одноклеточные, другие образуют как одиночные клетки,
так и многоклеточные гифы. Включает по разным источникам от 2 до 5
порядков. Содержит часть видов, ранее относившихся к классу
голосумчатых (Hemiascomycetes), в частности, род Taphrina (тафрина),
делящиеся дрожжи Schizosaccharomycetes.
Класс Hemiascomycetes - Гемиаскомицеты
Класс объединяет примитивные сумчатые грибы, у которых нет
плодовых тел, сумки образуются на мицелии непосредственно из зиготы
или специальных аскогенных клеток. Стадия аскогенных гиф отсутствует.
Половой процесс напоминает зигогамию, когда сливаются две
многоядерные клетки, однако, в отличие от зигоспоры мукоровых, зигота
гемиаскомицетов не переходит в состояние покоя, а непосредственно
превращается в сумку. Основной порядок, выделяемый по строению
вегетативного тела, образу жизни и особенностям цикла развития —
Saccharomycetales.
Порядок Saccharomycetales — Сахаромицетовые Сумки
располагаются на мицелии беспорядочно, поодиночке. У многих
представителей порядка (дрожжей) настоящий мицелий отсутствует.
Вместо него имеются почкующиеся клетки.
В этом случае сумки формируются как одиночные клетки
непосредственно из зиготы. Дикариотичной стадии нет. Сахаромицеты
живут как сапротрофы на субстратах, богатых сахарами: в сахаристых
истечениях растений, на поверхности плодов, в нектаре цветов. Есть среди
них почвенные виды. Широкое распространение и особо важное значение
имеют дрожжи из семейства Saccharomycetaceae.

Рис. 25. Saccharomyces cerevisiae — "пекарские дрожжи": 1 — клетка дрожжей, 2 —


почкующиеся клетки, 3 — сумка со спорами.

Их одиночные клетки, размножающиеся почкованием, представляют


собой вторично упрощѐнный таллом, где упрощение от клеточного

56
мицелия к отдельным клеткам связано с обитанием в жидких средах с
высоким содержанием сахаров.
В некоторых условиях (например, при снижении концентрации
сахара в среде) у ряда видов дрожжей клетки после почкования не
расходятся и образуют псевдомицелий. Развиваясь на средах с сахарами,
дрожжи вызывают спиртовое брожение — превращение сахара в этиловый
спирт и углекислый газ.
Род Saccharomyces (сахаромицес) включает как виды обитающие в
природе, так и известные только в культуре. К последним относятся
"пекарские дрожжи" — S. cerevisiae (рис. 25), которые представлены
сотнями рас, различающихся по физиолого-биохимическим свойствам, и
широко используются в хлебопечении, виноделии и спиртовой
промышленности.
Класс Ascomycetes - Аскомицеты
Сумки образуются из аскогенных гиф внутри или на поверхности
плодовых тел. У большинства видов наблюдается активное отбрасывание
аскоспор. Класс включает около 90% видов отдела Ascomycota.
Большинство недавно проведѐнных молекулярно-генетических
исследований достаточно чѐтко очерчивают этот класс. Плодовые тела —
аскокарпы, или аскомы трѐх типов. Клейстотеций — замкнутое
шаровидное плодовое тело, одетое плотной, чаще тѐмноокрашенной
оболочкой — перидием. Сумки в нем располагаются беспорядочно.
Оболочки сумок быстро разрушаются. Сумки и аскоспоры освобождаются
пассивно после разрушения перидия и оболочек сумок.
По типу плодового тела в пределах класса эуаскомицетов выделяют
три группы порядков: плектомицеты (или клейстомицеты) - с
клейстотециями, пиреномицеты — с перитециями и дискомицеты — с
апотециями. В некоторых системах грибов этим группам присваивается
ранг классов.
Группа порядков Плектомицеты
Плодовые тела — клейстотеций, размером 1-2 мм в диаметре, чаще
тѐмно-окрашенные. Освобождение аскоспор всегда пассивное. Сумки в
плодовых телах расположены беспорядочно. По особенностям строения
клейстоциев и биологическим характеристикам выделяют следующие
порядки —Ascosphaerales, Onygenales, Elaphomycetales, Eurotiales.
Типичный для этой группы порядок —Eurotiales (Эвроциевые).
Порядок Eurotiales - Эвроциевые
Клейстотеций типичный, шаровидный с беспорядочно
расположенными сумками. Образуется обычно на мицелии. Бесполое
размножение конидиями, расположенными одиночно или цепочками на

57
одноклеточных или многоклеточных, часто сильно разветвлѐнных
конидиеносцах.

Рис. 26. Конидиальные стадии и строение конидиеносцев эвроциевых грибов: 1 —


Aspergillus, 2 — Penicillium.

Стадия бесполого размножения обычно преобладает в цикле развития


эвроциевых грибов. Сумчатая стадия — клейстотеций — образуется реже,
а у части видов она отсутствует (или до сих пор не обнаружена) и тогда
такие виды относят к анаморфным грибам. Потеря сумчатой стадии —
аском — известна и для других сумчатых грибов. По этой причине
исторически сложилось так, что конидиальные стадии — анаморфы многих
сумчатых грибов имеют собственные названия и относятся к группе
анаморфных грибов, а их сумчатые стадии к соответствующим группам
аскомикота. Большинство эвроциевых — почвенные сапротрофы. Они
широко распространены в почвах различных климатических областей,
принимая участие в почвообразовательном процессе. Много среди них
сапротрофов.
Наиболее распространены виды из родов Eurotium (эвроциум) и
Emericella (эмерицелла), анаморфные (конидиальные) стадии которых
имеют собственные названия и относятся к родам несовершенных грибов
Penicillium и Aspergillus (рис. 26). Сумчатая стадия (телеоморфа) относится
к роду Thermoascus - конидиальная стадия к роду Paecilomyces, Amaroascus
- Chrysosporium, Arachnotheca - Geotrichum.
Сумчатые спороношения представителей этого порядка образуются в
замкнутых без отверстия плодовых телах - клейстотециях, имеющих размеры
от 100 мкм до нескольких мм. У некоторых представителей плодовые тела

58
отсутствуют и сумки собраны в клубки с очень рыхлым покровом. Сумки
круглые или овальные расположены беспорядочно и заполняют всю полость
плодового тела (рис. 5). Для получения сумчатых спороношений у
представителей этого порядка хорошие результаты дает использование среды
Чапека с низким содержанием сахарозы (0,1%).
Морфологические признаки. Описывают форму, размеры, цвет,
консистенцию клейстотециев. Последняя может быть мягкой в виде рыхлого
сплетения мицелия, углистой или кожистой. Большое значение имеют форма
и размеры сумок, форма и размеры аскоспор, поверхность аскоспор (гладкая,
шероховатая, шиповатая, имеющая кольца или желобки). Для извлечения
сумок из клейстотециев нужно осторожно надавить на покровное стекло
поверх препарата.
Дифференцирующими признаками для выделения семейств в порядке
Eurotiales служат строение покрова плодового тела - перидия (рыхлый или
плотный), наличие ножки, тип конидиального спороношения. Для выделения
родов - детали строения перидия, наличие отростков у плодового тела,
форма и строение аскоспор. Для видов - цвет, детали строения и размеры
аскоспор, а также характер строения и особенности конидиальных
спороношений.
Используют определители Gilman, 1959; Raper, Fennell, 1965;
Кириленко, 1978; Stolk, Samson, 1983; Pitt, 1991; Domsch, Gams and
Anderson, 1993.

3.5. Идентификация отдела CHYTRIDIOMYCOTA и


BASIDIOMYCOTA
Отдел Chytridiomycota включает один класс — хитридиомицеты
(Chytridiomycetes). В цикле развития имеются подвижные стадии с одним
гладким бичевидным жгутиком, направленным назад. В полисахаридный
состав клеточной стенки входит комплекс — хитин с глюканом.
Представители класса связаны в основном с водной средой обитания.
Большинство из них — паразиты водорослей, водных грибов,
беспозвоночных. Есть наземные почвенные виды, паразитирующие на
высших растениях в условиях повышенной влажности. Значительно
меньшую часть составляют сапротрофы, поселяющиеся в воде на
растительных и животных остатках. В состав класса включают шесть
порядков, выделяемых в основном по уровню организации таллома и типу
полового процесса. Основные порядки: Chytridiales, Blastocladiales,
Monoblepharidales.

Базидиомицеты — грибы с клеточным мицелием, объединяющие


около 30 тыс. видов. Клеточная стенка состоит из хитина и глюканов, у

59
некоторых — маннана, обычно ламеллярная, многослойная и
электроннопроницаемая. Кроме типичного клеточного мицелия у
некоторых групп видов встречается дрожжеподобная стадия. Половое
спороношение — экзогенные базидиоспоры, сидящие на особых
образованиях базидиях (мейоспорангиях), возникающих а результате
полового процесса. По типу развития и строения базидий базидиальные
грибы в настоящее время разделяют на три класса: Basidiomycetes,
Urediniomycetes, Ustilaginomycetes
Класс Basidiomycetes. В разных системах в класс включают от 15 до
32 порядков. Шляпочные грибы, ксилотрофы или микопаразиты.
Класс Urediniomycetes (Teliomycetes). Облигатные паразиты растений
и насекомых. Включает 2-4 порядка (по разным источникам), из которых
основной порядок Uredinales — ржавчинные.
Класс Ustilaginomycetes (Ustomycetes). Включает в основном
паразитов растений, некоторых сапротрофов. Подразделяется на 2-7
порядков. Практически важный порядок Ustilaginales — головнѐвые грибы.

3.7. Идентификация анаморфных грибов


К этой группе относятся грибы с клеточным мицелием, утратившие в
ходе эволюции половую стадию (сумчатую или реже базидиальную) и
размножающиеся только бесполым путем — конидиями или вегетативно
почкованием. Таким образом, виды этой группы связаны происхождением
с аскомицетами и базидиомицетами и рассматриваются как новая,
находящаяся в процессе становления эволюционная ветвь грибов
полифилетического происхождения. Эволюция группы на данном этапе
направлена на усовершенствование конидиального аппарата — основного
органа размножения и на компенсацию отсутствующего полового процесса
другими механизмами (гетерокариозом, парасексуальным процессом),
которые обеспечивают этим грибам новые механизмы микроэволюции. Эта
группа включает 3 класса: Coelomycetes — Целомицеты; Hyphomycetes —
Гифомицеты; Agonomycetes — Агономицеты. По классификации Саккардо
(Saccardo, I-X, 1882-1892) отдел включал три порядка: Hyphomycetales,
Sphaeropsidales, Melanconiales. По классификации, предложенной
Айнсворт, Бисби (Ainswort, Bisby, 1971) и другими, порядок
Hyphomycetales рассматривают на уровне класса Hyphomycetes, а порядки
Sphaeropsidales и Melanconiales объединяются в один класс Coelomycetes.
Ранние определители несовершенных грибов составлены по классификации
Саккардо, для построения которой используют строение зрелых конидий,
окраску и способ их аггрегации. Но большинство современных
определителей составлено так, что в их основу положена классификация
по типу конидиогенеза.

60
Выявление принадлежности видов этой группы к отделам сумчатых
или базидиальных грибов возможно только по молекулярно-генетическим
и микроморфологическим (строение септы, наличие пряжек) признакам.

Рис. 27. Спороношения анаморфных грибов: 1 — одиночные конидиеносцы с


конидиями; 2 — ложе, 3 — спородохий, 4 — коремии; 5 — пикнида.

У некоторых, однако далеко не всех видов этой группы, установлена


связь между бесполым спороношением (анаморфами) и половой стадией
(телеоморфой). Поэтому, хотя некоторые исследователи рекомендуют
относить отдельные виды этой группы с известными телеоморфами к
соответствующим группам сумчатых или базидиальных грибов,
прагматический подход приводит к созданию формальной, далекой от
филогенетической, но пригодной для идентификации системе, которая в
большинстве случаев принимается в настоящее время.
Класс Hyphomycetes с порядком Hyphomycetales включает виды со
свободными, простыми или ветвящимися конидиеносцами,
развивающимися на мицелии одиночно, или плотными пучками
(коремиями) или соединенными в подушечки (спородохии) (рис. 27,1, 3, 4).
Гифомицеты подразделяют на четыре семейства, различающихся по
строению и окраске конидиеносцев и конидий: монилиевые, демациевые,
стильбелловые и туберкуляриевые.
Класс Hyphomycetes - Гифомицеты
К гифомицетам относятся митоспоровые грибы (для части их
известны телеоморфы, относящиеся к аскомицетам или, редко, к
базидиомицетам), у которых конидиальные структуры спороношения не
заключены в конилиомы какого-либо типа. Идентификацию гифомицетов
осуществляют главным образом по таким признакам, как способ бесполого
размножения (конидиогенез), а также тип и размеры образующихся
бесполых пропагул (конидий). Конидиогенез у этих грибов происходит по
одному из двух основных способов - бластическому или таллическому.
При бластическом конидиогенезе конидии «выдуваются»

61
энтеробластически (из фиалиды или аннелиды) или голобластически
(синхронно или симподиально). Таллический тип конидиогенеза — это
образование конидий (артроконидий) из ранее существовавших гиф (рис.
28,29).

Рис. 28. Виды конидиогенеза у гифомицетов

Если при таком типе конидиогенеза в образовании конидии


участвуют оба слоя оболочки, то тип конидиогенеза будет
голобластическим. По голобластическому типу образуются бластоспоры и
алевроспоры, если участвует только внутренний слой оболочки – то
конидиогенез энтеробластический.

Рис. 29. Типы конидиогенеза у дейтеромицетов: 1 - артроспоры, 2 - алевроспоры, 3 -


бластоспоры, 4 - пороспоры, 5 - фиалоспоры.

При энтеробластическом типе конидиогенеза хорошо заметны


шрамы, образовавшиеся на месте отпавшей конидии. Энтеробластический
способ образования конидий может быть третичным, когда из наружной
оболочки конидиогенной клетки не формируется воротничок (такой тип
конидиогенеза приводит к образованию пороспор), и фиалидным, в этом
случае из наружной оболочки конидиогенной клетки образуется
воротничок, а с участием внутреннего слоя формируются фиалоспоры
(рис. 29).
Гифомицеты можно также различать по менее стабильным, то есть во
многом искусственно вызванным, признакам, которые, однако, легче
наблюдать - например, по окраске колоний (светлая, монилиевые виды или
62
темная, демациевые виды), скорости роста в лабораторных условиях
(медленная или быстрая), диморфизму и полиморфизму (наличие у
организма нескольких форм).
• Мицелиальные гифомицеты, у которых колонии
светлоокрашенные (монилиевый тип; окраска от белой до бежевой или
других светлых тонов, то есть не серая, коричневая или черная). В
приведенном ниже списке родов отмечены относительная величина
конидий - крупные (К) или мелкие (М) и таллический тип конидиогенеза (в
остальных случаях он бластический).
Монилиевые гифомицеты
Асrетопшт spp. - М
Acrodontium spp. — М
Arthrinium spp. - К
Aspergillus spp. — М
Arthrographis spp. - артроконидии
Beauveria spp. — M
Chrysosporium spp. - артроконидии, алеуроконидии
Cylindrocarpon spp. — K/M
Дерматофиты (Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton spp.) - K/M
Диморфные грибы (Blaslomyces dermatitidis,Coccidioides immitis -
артроконидии;
Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Penicillium marneffei)
— K/M
Engyodontium album - M
Fusarium spp. - K/M
Geomyces spp. — артроконидии
Geotrichum spp. - артроконидии
Gliocladium spp. - M
Hyphopichia burtonii — M
Lecythophora hoffmanni — M
Metarrhizium spp. — M
Paecilomyces spp. — M
Penicillium spp. — M
Phialemonium spp. - M
Pythium insidiosum — может образовывать только стерильные гифы
Scopulariopsis brevicaulis, S. candida — К
Scytalidium hyalinum - артроконидии
Torulomyces spp. — M
Trichoderma spp. — M
Trichothecium spp. - К
Tritirachium spp. - M

63
Sporothrix cyanescens и другие виды этого рода — М
• Мицелиальные гифомицеты, у которых колонии целиком
темные (демациевый тип; окраска от серой до оливковой, коричневой или
черной) или в колониях имеются темные конидиогенные зоны. В списке
родов (ниже) отмечены относительная величина конидий - крупные (К) или
мелкие (М) - и таллический тип конидиогенеза (в остальных случаях он
бластический).
Демациевые гифомицеты
Alternaria spp. - К
Arthrinium spp. — К
Bipolaris spp. - К
Cladophialophora spp. — M
Cladosporium spp. - M
Curvularia spp. - К
Диморфные грибы — Sporothrix schenckii — M
Drechslera biseptata — К
Epicoccum spp. — K
Exophiala spp. — M
Exserohilum spp. - К
Humicola spp. - К
Lecytophora mutabilis — M
Leptodontium camptobactrum - M
Nigrospora spp. — К
Nodulosporium spp. — M
Ochroconis spp. — К
Oidiodendron spp. — артроконидии.
Phialophora spp. — M
Pithomyces spp- - К
Ramichloridium spp. - К
Rhinocladiella spp. - M
Scedosporium spp. - M
Scolecobasidium spp. — К
Scopulariopsis brumptii spp. — К
Scopulariopsis spp. - К
Scytalidium dimidiatum — артроконидии
Septonema spp. - К
Speggazinia spp. - К
Stemphylium spp. — К
Ulocladium spp. — K.
Wallemia sebi — M
Wardomyces inflatus — К

64
Zygosporium spp. — M

Схема определения дейтеромицетов включает морфологические и


культуральные признаки. Описание производят на сусло-агаре, среде
Чапека, картофельно-декстрозном и овсяном агаре. Для получения
спороношений у некоторых видов хорошие результаты дает водный агар.
Морфологические признаки. Отмечают наличие конидиеносца,
степень его развития (насколько он отличается от вегетативного мицелия);
конидии образуются прямо на мицелии или путем расчленения мицелия.
Если конидиеносцы имеются, то отмечают наличие или отсутствие
ветвления, тип ветвления (моноподиальное, дихотомическое, мутовчатое),
наличие септ. Отмечают наличие узлов на конидиеносце или вздутия на
вершине. В описании отмечают также способы агрегации конидиеносцев.
Они могут одиночно располагаться на мицелии, объединены в пучки -
коремии, образовывать скопления коротких конидиеносцев на сплетении
мицелия - спородохии, которые у некоторых видов погружены в слизь
(пионоты). Описывают цвет и форму конидий, наличие, число и
расположение перегородок, наличие придатков у конидий. Следует обращать
внимание на расположение конидий на конидиеносцах (одиночные,
скопления в виде головки, цепочками), расположение их на зубчиках,
выростах, фиалидах - специальных конидиеносных структурах бутыльчатой,
игловидной или кеглевидной формы. У некоторых дейтеромицетов может
быть несколько типов конидиальных спороношений у одного вида,
например Fusarium имеет макро- и микроконидии. Для рода Penicillium
большое значение имеет число ярусов мутовок (1, 2, 3 и более), первый ярус
образуют фиалиды, второй - метулы, третий - веточки. Отмечают форму и
размеры вышеперечисленных структур, их поверхность (шероховатые или
гладкие). Характер строения конидиеносца и поверхность колонии
(бархатистая, войлочная, пушистая, гранулярная) служит основанием для
выделения секций. Диагностирующим признаком для видов является
наличие или отсутствие колонки, образованной из цепочек конидий,
отходящих от фиалид (развиваются цепочки строго параллельно или
расходятся и переплетаются), связь конидиеносца с субстратом (прикреплен
конидиеносец к субстратному или воздушному мицелию), форма конидий
(округлая, цилиндрическая, эллиптическая), поверхность (гладкая,
шероховатая, шиповатая), размеры. У грибов рода Aspergillus выделяют
секции по наличию или отсутствию профиалид. Отмечают цвет
конидиеносца, так как он может быть бесцветным или окрашенным, форму
головки вместе с цепочками конидий (сферическая, с радиально
расходящимися цепочками конидий, или булавовидная), форму вздутия на
вершине конидиеносца (округлая, овальная, булавовидная).

65
Культуральные признаки имеют большее значение для
идентификации видов родов Penicillium и Aspergillus - скорость роста
колонии, желательно при трех температурах: +5, +25, +37°С, внешний вид
колонии, ее текстура (бархатистая, пушистая, шерстистая, шероховатая).
Бархатистость колонии определяется плотно растущими спороношениями,
отходящими непосредственно от субстратного мицелия, пушистость -
обильно развитым воздушным мицелием, на котором могут образовываться
спороношения, шерстистость - за счет большого количества тяжей,
шероховатая, гранулированная поверхность возникает в результате обильного
образования коремий, то есть структур, представляющих собой плотное
объединение нескольких конидиеносцев в пучки.

Рис. 30. Анаморфные грибы: 1 — Botrytis, 2 — Verticillium 3 — Cladosporium, 4 —


Trichoderma, 5 — Trichothecium.

Описывают форму и цвет края колонии, окраску спороносящей части


и стерильного мицелия, изменения окраски во времени (сохраняется ли
первоначальная окраска или она меняется). Отдельно отмечают цвет
обратной стороны колонии и диффузию пигмента в агар, определяющую
окраску окружающего агара, зональность колонии, появление
зональности по мере роста, складчатость, наличие экссудата, его цвет,
запах культуры. Фиксируют наличие или отсутствие склероциев - жестких
структур, образованных плотным переплетением мицелия, по внешнему

66
виду напоминающих плодовые тела - клейстотеции, но не образующих
сумок, остающихся стерильными. Описывают их форму, текстуру, цвет,
размеры.

Семейство Мопiliасеае - Монилиевые. У представителей этого


семейства мицелий, конидиеносцы и конидии бесцветные, иногда конидии
могут быть окрашены, но мицелий и конидиеносцы бесцветные всегда.
Конидиеносцы — одиночные или собраны в небольшие, рыхлые группы.
Семейство включает множество родов и видов. Главнейшие из них
следующие.
Род ботритис — Botrytis. Конидиеносцы древовидно разветвленные,
конидии эллиптические, собраны в головки. Многие виды паразитируют на
растениях и вызывают гнили. В. cinerea — возбудитель серой гнили
плодов, ягод и овощей, В. allii — возбудитель шейковой гнили лука (рис.
30, 1).
Род ооспора — Oospora. Мицелий в основном поверхностный,
конидиеносцы неразветвленные, короткие, конидии от бочкообразных до
шаровидных. Большинство видов сапротрофы. Патогенные грибы рода
вызывают заболевание растений, получившее название ооспороз. О.
pustulans — возбудитель ооспороза, или бугорчатой парши клубней
картофеля; О. lactis — возбудитель гнили плодов томата.
Род оидиум — Oidium. Конидиеносцы у грибов этого рода слабо
развиты, неветвящиеся, конидии в цепочках. Его виды представляют собой
конидиальные стадии сумчатых грибов из порядка Эризифовые —
возбудителей настоящией мучнистой росы.
Род вертициллиум — Verticillium. Для грибов этого рода характерны
мутовчато разветвленные конидиеносцы, одноклеточные, мелкие конидии.
Некоторые виды вызывают увядание хлопчатника, картофеля, овощных,
ягодных и плодовых культур. Так, V. dahliae—возбудитель
вертициллезного увядания хлопчатника, V. albo-atrum — возбудитель
вертициллезного увядания и сухой гнили картофеля (рис. 30, 2).
Род пенициллиум — Penicillium. Конидиеносцы на вершине
кистевидно разветвлены, конидии в цепочках. Широко представлены в
почве. Большое значение имеют представители рода, синтезирующие
биологически активные вещества — антибиотики (рис. 26).
Род аспергиллус — Aspergillus. Для грибов этого рода характерны
шаровидно или булавовидно вздутые конидиеносцы, несущие на вершине
цепочки конидий. В основном почвенные сапротрофы. Большинство -
фитопатогенные виды (рис. 26).

67
Рис 31. Анаморфные грибы: 1 —Bipolaris; 2 — Drechslera; 3 — Alternaria; 4 —
Fusarium; 5 — Colletotrichum; 6 — Gloeosporium.

Род триходерма — Trichoderma. Конидиеносцы мутовчато


разветвленные. Конидии — шаровидные, собранные в головки. Отдельные
виды вызывают гнили. Некоторые виды рода, например Т. viride,
используют в борьбе с фитопатогенными грибами (рис. 30, 4).
Род трихотециум — Trichothecium. У грибов этого рода
конидиеносцы простые, удлиненные, конидии двухклеточные, бесцветные,
одиночные или собранные в головку. Наиболее известен Т. roseum —
обычная розовая плесень — почвенный сапротроф, или сапротроф на
растительных остатках (рис 30, 5).
Семейство демациевые — Dematiaceae. У грибов этого семейства
мицелий, конидиеносцы и конидии темно-окрашенные — оливковые,
коричневые, бурые, черные. В отдельных случаях (виды рода церкоспора)
конидии могут быть почти бесцветными. Конидиеносцы — одиночные или
собраны небольшими рыхлыми группами. Семейство включает ряд
фитопатогенных видов, вызывающих опасные болезни растений.
Главнейшие роды следующие.

68
Род альтернария — Alternaria. Для видов этого рода характерны
обратно-булавовидные, оливково-бурые конидии в цепочках на
неразветвленных конидиеносцах. Его виды широко представлены в
природе сапротрофами, встречающимися обычно на растительных
остатках, на листьях здоровых растений в качестве эпифитов, всегда
присутствуют на семенах. При сильном их развитии семена теряют
всхожесть, но обычно присутствие гриба на семени не сказывается на
дальнейшем развитии растения. Некоторые виды представляют собой
паразитов высших растений (рис. 31, 5).
Род кладоспориум — Cladosporium. Конидиеносцы
слаборазветвленные, собраны в виде пучков, конидии одноклеточные или с
одной-двумя перегородками, овальные, окрашенные. Есть фитопатогенные
виды (рис. 31, 3).
Анаморфный род гельминтоспориум — Helminthosporium по
результатам изучения ряда признаков — особенностям строения основания
конидий, пролиферации конидиеносцев, характеру прорастания конидий и
характеру образования септ в конидиях разделен на 4 рода: Bipolaris (рис.
31, 1), Curvularia, Drechslera (рис. 31, 2), Exserohilum и назван комплексом
Helminthosporium s.l. В целом бывший формальный род гельминтоспориум
отличается характерной формой конидий. Они прямые или слегка
изогнутые, веретеновидные или обратно булавовидные с несколькими
поперечными перегородками, темно-окрашенные. Конидиеносцы —
неразветвленные, хорошо развиты, собраны пучками. К важнейшим
представителям рода относятся возбудители болезней злаков, называемых
гельминтоспориозами. Поскольку формальный род гельминтоспориум в
последние десятилетия подвергся существенному пересмотру, название
гельминтоспориозы имеет скорее историческое значение. Однако на
практике в российской фитопатологии оно широко распространено.
Семейство Tuberculariaceae— Туберкуляриевые
Конидиальное спороношение представлено в виде состоящих из
неразветвленных или разнообразно разветвленных конидиеносцев,
собранных в подушечки различной окраски. Конидии — разнообразны по
окраске, форме и строению. Наиболее вредоносные патогены растений
относятся к родам фузариум и туберкулярия.
Род фузариум — Fusarium. Конидиальное спороношение
чрезвычайно разнообразно по морфологии конидий. Грибы этого рода
имеют два типа конидий — макро- и микроконидии. Конидии серповидно
изогнуты. Мицелий чаще белый, бело-розовый, розово-сиреневый или
бурый. У отдельных видов образуются хламидоспоры, в некоторых случаях
— склероции. Большинство грибов — возбудители болезней растений (рис.
31, 4).

69
Род туберкулярия — Tubercularia. Характерны яркие, чаще красные
конидиальные подушечки, выступающие через разрывы коры ветвей.
Конидии одноклеточные, светлые, яйцевидно-цилиндрические.
Конидиеносцы простые. Представляет интерес Т. vulgaris, вызывающий
усыхание и отмирание побегов смородины, вишни, березы.
Семейство Stilbaceae — Стильбелловые
Конидиеносцы соединены в коремии. Важнейший род графиум —
Graphium. У видов этого рода конидии погружены в слизь, в
распространении их участвует вода и насекомые. С. ulmi (сумчатая стадия
Ophiostoma ulmi) — возбудитель голландской болезни вязов.
Класс Coelomycetes - Целомицеты
К целомицетам относятся митоспоровые грибы (для части их
известны телеоморфы, отнесенные к аскомицетам), у которых конидии
(бесполые пропагулы) расположены внутри или на поверхности бесполых
плодовых тел, называемых конидиомами, в отличие от половых плодовых
тел у аскомицетов, называемых аскомами. Спороносные структуры
целомицетов могут быть открытыми и чашевидными (ложа) с конидиями в
виде палисадного слоя либо же более или менее округлыми (пикниды) с
выводными отверстиями для высвобождения конидий. Образование
пикнид происходит у многих видов только после длительной инкубации -
до 2 мес.
Целомицеты включает виды с собранными в группы
конидиеносцами. Подразделяется на два порядка Меланкониевые
(Melanconiales) и Сферопсидные (Sphaeropsidales) или пикнидиальные.
Порядок Melanconiales - Меланкониевые
Melanconiales содержит виды, конидиеносцы которых собраны
плотным слоем на поверхности сплетения гиф — ложа (рис. 153, 2). Среди
них в основном сапротрофы на растительных остатках и паразиты
растений. Меланкониевые вызывают главным образом пятнистости и
антракнозы растений, при котором развивается пятнистость листьев и
образуются глубокие язвы на плодах, ветвях и стеблях.
Порядок включает одно семейство Melanconiaceae —
меланкониевые. Характеристика семейства соответствует характеристике
порядка. В состав семейства входит большое число фитопатогенных видов,
вызывающих болезни различных сельскохозяйственных культур. Наиболее
важные с точки зрения фитопатологии виды представлены в следующих
родах.

70
Рис 32. Конидии меланкониевых грибов: 1 — Collelotrichum, 2 — Marsonina, 3 —
Entomosporium, 4 — Cylindrosporium, 5 — Melanconium, 6 — Cotyneum, 7 — Peslalotia.

Род коллетотрихум — Collelotrichum. Конидисносцы короткие,


расположены скученно, по краям конидиального ложа находятся темные
щетинки. Конидии одноклеточные, овальные, яйцевидные или
серповидные. Представители рода вызывают антракнозы тыквенных, льна,
фасоли и других культур (рис. 31, 5; 32).
Род цилиндроспориум — Cylindrosporium. Конидии нитевидные,
бесцветные. Среди его видов много паразитов ценных деревьев и
кустарников. С. hiemale — конидиальная стадия сумчатого гриба
Coccomyces hiemalis.
Порядок Sphaeropsidales— Сферопсидные или Pycnidiales —
пикнидиальные
Конидии образуются внутри шаровидных или грушевидных
вместилищ — пикнид, с отверстием на вершине (рис. 27, 5; 33). В пикниде
формируется слой тонких конидиеносцев, образующих конидии или
пикноспоры. Пикниды имеют шаровидную или грушевидную форму.
Конидии в пикнидах обычно погружены в слизь и выходят наружу при ее
набухании (рис. 34). У грибов этого семейства пикниды темно-
окрашенные, шаровидные, жесткие, кожистые, с устьицем или замкнутые,
свободные или погруженные в субстрат.
Большая часть сферопсидных грибов сапротрофы, но среди них
много и паразитов растений. Симптомы поражения этими грибами
пятнистости, некрозы, усыхания. Общий признак заболевания образование
на пораженных частях растений многочисленных пикнид возбудителя в
виде бугорков или черных точек. Многочисленные роды, относящиеся к
этому порядку, различаются строением, формой и окраской конидий.

71
Род фома — Phoma (рис. 33,1). Характеризуется шаровидными,
эллипсоидальными, погруженными в субстрат, реже выступающими
пикнидами и одноклеточными, бесцветными конидиями. Большинство
грибов этого рода сапротрофы или факультативные паразиты, которые
часть своего цикла развития проводят на растении. Чаще всего они
поражают стебли растений. Болезни, вызываемые грибами рода фома,
называют фомозами.

Рис. 33. Пикниды родов: 1 — Phoma, 2 — Plenodomus, 3 — Chaetomella, 4 —


Wojnowicia, 5 — Dinemasporium, 6 — Discella.

Рис. 34. Многообразие конидий сферопсидных грибов.

Род сферопсис — Sphaeropsis. Для грибов этого рода характерны


шаровидные пикниды, яйцевидные, темно-окрашенные пикноспоры.
Наиболее вредоносен возбудитель черного рака плодовых деревьев — S.
malorum.
Класс Agonomycetes – Агономицеты
Включает грибы, не образующие спороношений (Mycelia sterilia). В
цикле их развития имеются только мицелий и склероции. Виды рода
Sclerotium вызывают сухие гнили тканей растений — стеблей кукурузы,
подсолнечника, корней сахарной свеклы и др. В роде Rhizoctonia наиболее

72
известен R. solani, поражающий многие культурные и дикорастущие
растения. Гриб вызывает черную паршу картофеля, заболевание всходов
сахарной свеклы, хлопчатника, томатов и других растений. У гриба
известна телеоморфа — базидиомицет Thanatephorus cucumeris.
Для идентификации анаморфных грибных культур используют
определители - Raper, Thom, 1949; Пидопличко, 1953; Gilman, 1959; Rifai,
1962; Raper, Fennell, 1965; Литвинов, 1967; Barren, 1968; Booth, 1971; Ellis,
1971; Barnettand Hunter, 1972; Booth, 1977; Кириленко, 1978; Билай,
Коваль, 1988; Pitt, 1991; Domsch, Gams and Anderson, 1993; Саттон и др.,
2001.

73
4. ХРАНЕНИЕ КУЛЬТУР ГРИБОВ
Методы хранения культур должны обеспечивать сохранение
типичных морфологических, культуральных признаков и физиологических
свойств. Сохранность и выживаемость коллекционных культур зависят от
состава, рН, температуры, влажности питательной среды. Наиболее
пригодны для длительного хранения культур при периодических пересевах
плотные среды, имеющие относительно низкую влажность и способные
терять ее постепенно. Полужидкие и жидкие среды применяют только для
отдельных видов, когда применение плотных сред невозможно.
Для хранения используют: а) природные субстраты (специально
обработанное зерно злаков, корнеплоды); б) искусственные среды,
полученные путем переработки природных субстратов с добавкой агар-
агара или желатина; в) иногда — синтетические агаризованные среды с
добавкой специфических экстрактов, соков, отваров. Для хранения
большинства видов грибов разработан ряд стандартных питательных сред.
Лишь некоторые виды нуждаются в специфических средах, которые
обычно состоят из естественного субстрата или синтетической среды с
добавкой вытяжки, сока, экстракта или отвара тех субстратов, из которых
гриб выделен. Вытяжки (настои) готовят на холоду, без кипячения, иногда
с легким подогревом. Как правило, настаивают 100—150 г субстрата в 1 л
воды в течение от нескольких часов до суток. Настой сливают, фильтруют
и стерилизуют. Отвары готовят кипячением определенной навески
субстрата в 1 л воды в течение часа (например, гороха или бобов — 100 г,
кукурузной муки — 500, картофеля—250—300, овсяной муки — 50—100
г). Для приготовления отваров из сухих субстратов берут не более 50 г
субстрата на 1 л. Во всех случаях после варки объем воды доводят до
исходного. Затем отвар фильтруют, при необходимости осаждают или
подкисляют, разливают в микробиологическую посуду и стерилизуют. Для
приготовления агаризованных сред добавляют к фильтратам 1,5—3% агара.
Наиболее часто для хранения применяют сусло-агар или другие
агаризованные среды. Приготовленные субстраты после стерилизации
проверяют на стерильность. Для этого пробирки, флаконы или ампулы с
субстратом заливают питательной средой и выдерживают в термостате при
28° С неделю, а затем уже всю партию высевают на хранение. Для
обеспечения организма разнообразными питательными веществами
некоторые исследователи рекомендуют при пересевах смену субстратов, в
частности синтетических растительными, или добавление к синтетическим
средам органических субстратов (кусочков стеблей, коры).
Высушенные культуры в запаянных ампулах хранят при комнатной
температуре (18—20° С). Пересеянные на твердые субстраты культуры

74
тоже можно хранить при комнатной температуре, но оптимальной для
хранения культур между пересевами считается температура 4—5° С.
Генетическая однородность материала, который закладывают на
хранение, играет существенное значение для поддержания стабильности
культуры. Гетерогенность чище проявляется при выращивании культур из
спор, реже — из вегетативного мицелия. При пересевах обильно
спороносящих культур, в частности при периодических пересевах,
переносить на среду следует минимальное количество спор (конидий). При
пересеве неспорообразующих форм кусочки мицелия нужно брать из
краевой зоны колонии, так как, если мицелий берется из середины колонии,
где накапливаются продукты обмена, изменчивость культур повышается.
Для предупреждения гибели культур рекомендуется хранить их
одновременно несколькими способами, не менее чем в двух коллекциях и
периодически пересевать на свежие питательные среды. Независимо от
способа хранения необходимо вести микроскопический контроль за
чистотой культуры, а в случае хранения продуцентов биологически
активных веществ — биохимический контроль активности.
Хранение грибов на агаризованных средах. Периодические
пересевы. Метод периодических пересевов на свежие питательные среды
является классическим и довольно распространенным. Положительными
сторонами этого метода являются постоянная доступность культур для
работы и возможность непосредственного контроля за их чистотой.
В пробирки заливают агаризованную среду, оптимальную для
хранения данной культуры, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин и при
застывании слегка скашивают. Высота столбика среды 5—6 см. В
большинстве случаев не следует употреблять свежеприготовленные среды,
содержащие конденсационную воду. Их следует слегка подсушить при
комнатной температуре в течение 10—12 дней. Пересев культуры гриба
производят путем переноса инокулюма из жидкой среды или кусочков
воздушного и субстратного мицелия или спор (конидий, склероциев) из
плотной среды. Затем культуры выращивают при оптимальной для их
роста температуре до появления спороношений. В течение первых дней
желательно вести наблюдение за ростом, так как в это время легче
обнаружить загрязнение. Выращенные культуры закрывают колпачками из
фильтровальной или другой влагопроницаемой бумаги. Оптимальная
температура хранения 4—5° С, допускается хранение при 15—18° С.
Большинство культур пересевается 1—3 раза в год. Обычно для
грибов, обильно спороносящих или образующих хламидоспоры и
склероции, интервал между пересевами больше. Однако при этом нередко
существенно изменяются морфолого-физиологические признаки грибов, а
иногда наблюдается потеря отдельных свойств. Дегенерация культур

75
выражается в изменении размеров и формы конидиеносцев и
спорангиеносцев, в полной утрате спорообразования или резком
сокращении количества спор, в изменение размеров клеток мицелия и
перерождении их содержимого, утрате полового спороношения и
способности образовывать склероции. Часто изменяется вид всей колонии
гриба — образуются слизистые, складчатые и другие не свойственные виду
формы. Потеря признаков и свойств возрастет как с увеличением числа
nеpecевoв, так и при пересевах с большими промежутками.
Хранение под вазелиновым маслом. Этот метод значительно
увеличивает период выживаемости грибов на косяках агара (до 3 лет и
более), не требует дорогостоящего оборудования, скор и прост,
предохраняет культуры от клещей. Основной недостаток метода —
разбрызгивание масла со спорами при обжигании иглы во время пересевов,
вследствие чего инфекция может распространиться в лаборатории. Этого
можно избежать, медленно прогревая иглу или опуская ее предварительно
в сосуд с водой. Культуры выращивают на природной среде, как правило
агаризованной, застывшей в виде короткого косяка, обычно 2-х недельного
возраста заливают маслом на 1 см.
Масло уменьшает доступ кислорода к культуре и предотвращает
высыхание, однако полностью не изолирует культуру от воздуха, поэтому
последняя продолжает слабо развиваться и расти. Масло должно быть
высоко очищенным с удельным весом 0,8—0,9 г/см3. Лучшим является
медицинское вазелиновое масло. Перед заливом масло стерилизуют в
автоклаве или сушильном шкафу при 150—170° С в течение 1—2 ч. Более
тонкий слой не предохраняет культуру от высыхания, а под толстым слоем
культуры могут погибнуть от недостатка кислорода. Культуры из-под
масла необходимо пересевать на свежие среды первый раз через год после
погружения под масло, а затем каждые 2—3 года. Если через год культуры
утратили жизнеспособность, то их восстанавливают из коллекции,
поддерживаемой периодическими пересевами, вновь погружают под масло
и пересевают в более короткие сроки.
Культуры, залитые маслом, могут храниться без пересевов 3—6 и
более лет. Большинство культур грибов под маслом целесообразно хранить
при 4° С. Хорошая выживаемость под маслом отмечена у базидиомицетов,
дискомицетов, некоторых патогенных для человека штаммов.
Хранение на естественных субстратах. Методы хранения культур
на естественных субстратах давно нашли, широкое применение и
некоторые из них используются наряду с лиофилизацией в промышленных
лабораториях и коллекциях для хранения споровых форм — это хранение
на зерне, в почве, песке.

76
Хранение на пшене (зерне). В пробирки или флаконы вносят
соответственно по 5—10 и 10—15 г чистого сухого пшена. Закрывают
ватными пробками и стерилизуют в автоклаве при давлении 1,5—2 атм в
течение 0,5 ч. Сухое пшено стерилизуют дважды с интервалом до 24 ч.
После второй стерилизации в пробирки с пшеном добавляют 60—70%
стерильной водопроводной воды и стерилизуют еще раз. Сразу после
последней стерилизации пробирки с пшеном следует встряхнуть, чтобы
при охлаждении не образовались комки. Засевают культуру 1 мл суспензии
в стерильной водопроводной воде конидий гриба, выращиваемого на
косяках сусло-агара в течение 2 нед, или спорами либо конидиями 2-
недельного возраста, которые снимают с поверхности колоний. Пробирки и
флаконы встряхивают для равномерного распределения конидий. Культуры
выращивают при оптимальной для них температуре до получения
спороношения. Выращенную культуру высушивают в вакуум-аппарате при
24—25° С в течение 2—3 сут. Абсолютная влажность после сушки не
должна превышать 6—8%. По окончании сушки пробирки и флаконы
парафинируют и хранят при комнатной температуре. Аналогичным
образом хранят культуры грибов на просе и других сортах зерна. Этот
метод пригоден также для получения посевного материала (инокулюма).
Срок годности культур в этом случае 1 год.
Хранение в стерильной почве. Садовую почву тщательно просевают
через мелкое сито, переносят по 5 г в пробирки и ежедневно в течение 4
дней стерилизуют в автоклаве в течение 30 мин при давлении 1,51•10 6 Па.
Споры и мицелий культуры, растущей на агаре Чапека или сусло-агаре,
снимают петлей и в несколько приемов переносят в пробирку со
стерильной почвой. Ватные пробки в пробирках обрезают вровень с
пробиркой и заливают парафином. Пробирки заворачивают в бумагу и
хранят при комнатной температуре. Метод более пригоден для хранении
многих культур, в частности видов родов Penicillium, Aspergillus, Fusarium,
порядка Mucorales, некоторых патогенных форм, чем хранение под
вазелиновым маслом. Процент выживаемости спор достаточно высок через
6 и даже 7— 10 лет.
Хранение в кварцевом песке. Речной песок промывают в проточной
воде 5—6 ч, прокаливают 0,5 ч для удаления органических примесей,
охлаждают и просевают сквозь мелкое сито. Просеянный песок насыпают в
стеклянные ампулы и дважды стерилизуют при 120° С в течение часа.
Споры 2-х недельного возраста снимают петлей с поверхности колоний,
выращенных на косяках агара, и в несколько приемов переносят в ампулы с
песком, которые закрывают ватными пробками. Ампулы со споровым
материалом подсушивают в термостате при 37° С 2—3 сут, заливают
ватные пробки парафином и хранят при комнатной температуре. Этот

77
метод достаточно эффективен для хранения видов родов Aspergillus и
Penicillium, однако некоторые виды Penicillium при этом теряют
способность образовывать склероции.
Определение процента выживаемости. Независимо от метода
хранения необходимо периодически вести контроль выживаемости
культур. Для этого сравнивают количество живых клеток в препаратах
перед хранением и после определенного периода хранения. Количество
жизнеспособных клеток определяют при высеве суспензии на
агаризованную среду в чашки Петри. По разности содержания
жизнеспособных клеток в суспензиях до и после хранения (высушивания) с
учетом степени разведения и дозы высева суспензии находят число
конидий, сохранивших жизнеспособность в процессе хранения. Количество
жизнеспособных клеток можно определить и путем подсчета проросших и
непроросших конидий или при определении всхожести спор на
предметном стекле. Количество спор подсчитывают каждые 2 ч в течение
суток.
Подсчет проросших спор проводят также во влажной камере. Споры
проращивают в висячей капле стерильной среды. Для посева готовят такое
разведение споровой суспензии, чтобы в капле было не более 10—15
конидий (спор). После инкубации при оптимальной температуре в течение
10—15 ч подсчитывают число проросших и непроросших конидий. В
зависимости от особенностей хранившейся культуры инкубация бывает
более длительной. Общее количество просмотренных конидий в каждой
партии материала составляет 400—500. Отношение проросших конидий к
общему количеству просмотренных, выраженное в процентах, и
определяет всхожесть культуры после хранения.
«Оживление» культур и восстановление некоторых утраченных
признаков. При длительном хранении культуры без контроля на
выживаемость обычный перенос спор воздушного мицелия или суспензии
на свежую питательную среду не всегда дает положительный результат.
Тогда поступают следующим образом: после особо тщательного обжигания
пробки и горлышка пробирки в случае хранения на агаризованных средах
содержимое переносят пинцетом или путем встряхивания на новую
агаризованную питательную среду в другую пробирку. Среда должна быть
свежеприготовленной и содержать немного пептона, а из сахаров — по
возможности мальтозу (мальц-экстракт, солодовый экстракт, пивное
сусло). Если культуры хранились в почве, песке, на зерне, то содержимое
пробирки высыпают в несколько пробирок или чашек Петри со свежей
средой так, чтобы была покрыта вся поверхность. Если высушивали или
замораживали суспензии спор, то ресуспендированную культуру рассевают
в несколько пробирок или колб с твердой или жидкой питательной средой.

78
Культуру помещают в термостат с оптимальной для роста температурой.
Наблюдения показывают, что в случае хранения на агаризованных или
твердых естественных средах в этих условиях оживает грибница,
находящаяся в глубоких слоях субстрата.
Помимо метода «оживлении» культур некоторые исследователи
предприняли попытку восстановить признаки, утраченные в процессе
хранения грибов. Спорообразование, например, восстанавливается после
нескольких последовательных пересевов па свежие питательные среды в
случае хранения культуры под вазелиновым маслом, а в других случаях
после смены питательной среды при последовательных пересевах. Потерю
некоторых признаков можно предотвратить, подкисляя питательную среду
или выращивая исследуемую культуру совместно с другими
микроорганизмами. Так, у ряда сумчатых грибов спороношение
восстанавливается при совместном выращивании с другими грибами и
чашках Петри. Утрату способности образовывать склероции при хранении
можно замедлить, закладывая на хранение грибы, выращенные из одного
склероции. Способность образовывать склероции восстанавливается при
подкислении питательной среды до рН 2,85—3,5, совместном
выращивании с другими грибами, добавление в среду экстрактов из
мицелия некоторых актиномицетов и грибов.
Ни один из способов длительного хранения не гарантирует культуры
от изменчивости, поэтому необходимо постоянно вести отбор типичных
форм.

79
Приложение 1
СЛОВАРЬ ТЕРМИНОВ

Аделофиалида Редуцированная форма фиалиды без перегородки у


основания. Обычно на одну клетку гифы приходится одна или лишь
несколько аделофиалид.
Адиоспора Крупная толстостенная клетка, которая значительно
увеличивается в диаметре при температуре 37°С и выше.
Акропетальная цепочка конидий Цепочка конидий, в которой
самая молодая конидия находится на конце, а самая старая — в основании.
Акроплеурогенный Развивающийся у вершины и побокам.
Алеуроконидия Таллическая конидия, высвобождается путем
разрыва несущей ее клетки. Характерные признаки алеуроконидий —
усеченное основание и кольцевидный валик.
Анаморфа Бесполая репродуктивная форма гриба.
Анаморфные грибы Грибы, размножающиеся посредством митоза,
или митоспоровые грибы.
Аннелида Пролиферирующая конидиогенная клетка, у которой
первая конидия голобластическая, а каждая последующая —
энтеробластическая. Образование колец происходит по мере
высвобождения аннелоконидий. К родам, у которых конидиогенные клетки
— аннелиды, относятся Exophiala, Scedosporium и Scopulariopsis. С
образованием каждой новой конидии аннелида становится длиннее и уже.
Антропофильные виды Виды дерматофитов, для которых
предпочтительным хозяином, или субстратом, служит человек, но не
животные или почва.
Апекс Вершина, кончик.
Апофиза Расширение в виде воронки, иногда с отгибом, под
спорангием и у вершины конидиеносца. Выражена у представителей родов
Absidia и Apophysomyces.
Аппрессорий Уплощенный гифальный орган, который служит для
проникновения в растение-хозяина, как у некоторых видов Colletotrichum.
Может наблюдаться в культуре.
Артроконидия Конидия, образуемая в результате расчленения
клеток специализированных гиф и высвобождаемая в результате
разделения или лизиса и разрыва промежуточных клеток (клеток-
дизъюнкторов).
Асинхронное образование конидий Неодновременное образование
конидий, как у Hormonema dematioides.
Аскокарп Спороносная структура у аскомицетов, содержащая сумки
и аскоспоры. Для нее употребляется также название аскома. Примерами

80
этих структур могут быть клейстотеции и перитеции.
Аскоспора Спора полового размножения у аскомицетов. Обычно
аскоспоры образуются в числе от 4 до 8 в сумках.
Базидиоспора Спора полового размножения, образуемая в верхней
части базидии у базидиомицетов.
Базипетальная цепочка конидий Цепочка, в которой самая молодая
конидия находится у основания, а самая старая у вершины.
Баллистоконидия Конидия, образуемая на шиловидном выросте
клетки и с силой отделяемая с помощью особого механизма с образованием
капельки.
Бластический конидиогенез Конидиогенез по механизму
отпочковывания, или «выдувания», при котором конидия образуется до
того, как возникнет отделяющая ее септа. Примером бластического
конидиогенеза служат образование фиалоконидий и аннелоконидий, а
также дрожжевидное почкование, или образование бластоконидий.
Бластоконидия Голобластическая конидия, образуемая при
бластическом конидиогенезе.
Бугорчатый Покрытый бугорками или небольшими
бородавковидными выростами, как бугорчатые макроконидии Histoplasma
capsulatum.
Бутылевидный В форме бутыли. Этот термин часто используется
при описании фиалид у грибов рода Penicillium.
Вздутие Раздутая вершина конидиеносца у грибов рода Aspergillus
или раздутая вершина спорангиеносца у грибов рода Syncephalastrum.
Воздушные гифы Гифы, образующиеся над поверхностью
агаризованной питательной среды. У видов Fusarium образуемые на
воздушных гифах макроконидии более вариабельны и менее характерны,
чем образуемые в спородохиях. Так, в случае Fusarium semitectum
макроконидии на переплетенных гифах воздушного мицелия прямые, тогда
как образуемые в спородохиях/пионнотах — изогнутые.
Геофильный Растущий в почве. Этот термин часто используют в
связи с дерматофитами.
Гетероталличный вид Вид грибов, у которого для полового
размножения необходимо наличие двух совместимых скрещивающихся
штаммов.
Гимнотеций Обычно округлый, лишенный выводного отверстия
аскокарп, у которого гифы перидия расположены очень рыхло, а сумки
беспорядочно распределены между ними, как у представителей родов
Auxarthron, Gymnoascus и Myxotrichum.
Гифа Единичная нить мицелиального гриба.
Голобластическое образование конидий Образование конидий с

81
участием всех слоев клеточной стенки.
Голоморфа Гриб в совокупности его разных форм.
Гомоталличный вид Вид грибов, обладающий способностью к
половому размножению в пределах одного штамма.
Гриб Эукариотический организм, лишенный хлорофилла,
питающийся путем поглощения молекул и ионов, гетеротрофный,
размножающийся как половым, так и бесполым путем, с одноклеточным
или многоклеточным (мицелий) вегетативным телом и клеточной стенкой,
содержащей хитин, целлюлозу или другие сложные полисахариды.
Двухмутовчатый Термин, применяемый для описания грибов рода
Penicillium, у которых конидиеносец имеет два или изредка три узла
ветвления между концом фиалиды и основной осью.
Двухъярусный Термин, используемый при описании конидиогенных
структур у грибов рода Aspergillus, когда фиалиды не прикреплены
непосредственно к вздутию, а расположены на стерильных клетках —
метулах (профиалидах).
Демациевые грибы Название грибов, окрашенных в цвета от бурого
до черного за счет содержания в клеточных стенках меланина. У многих
демациевых грибов в начале роста окраска бледная, а по мере созревания
все более темная.
Дерматофиты Грибы из родов Microsporum, Trichophyton и
Epidermophyton, способные поражать кожу, волосы и ногти.
Диморфные грибы Грибы, способные расти в разных формах в
зависимости от температуры, субстрата, вида организма-хозяина и других
условий. Чаще всего (но не исключительно) этот термин относится к
патогенным грибам, вызывающим системные поражения.
Дистосептированная конидия Многоклеточная конидия, в которой
клетки не разделены септами, а расположены как горошины в бобе;
клеточные стенки в участках контакта между клетками составляют ложные
(дисто-) септы (пример — род Bipolaris).
Долипоровая септа Встречающаяся у базидиомицетов перегородка с
расширенными или раздутыми стенками порового канала.
Зигоспора Покоящаяся зигота у зигомицетов, возникающая в
результате слияния двух, обычно сходных, концов гиф.
Зубчик Небольшой вырост, несущий конидии, как у представителей
Ochroconis и Scolecobasidium.
Интеркалярный Расположенный внутри гифального элемента; этот
термин часто используется для случая, когда конидия образуется от
конидиогенного локуса непосредственно на гифе (интеркалярная конидия).
Кисточка Разветвленная часть конидиеносца у видов Penicillium.
Клетка-ножка Базальная клетка у макроконидий (виды Fusarium).

82
Коленчатый конидиеносец Зигзаговидный конидиеносец, то есть
изогнутый наподобие колена, обычно вследствие симподиального
развития.
Колонка Куполообразная структура на конце конидиеносца,
вдающаяся внутрь спорангия.
Кольцевой валик (на алеуроконидии) Небольшой неровный
остаток материала стенки несущей клетки, на котором алеуроконидия
держалась до своего высвобождения.
Кольцо Кольцо из наружного материала клеточной стенки,
остающееся у вершины аннелиды в результате высвобождения
аннелоконидии.
Конидиогенная клетка Клетка, образующая конидии, такая как
фиалида и аннелида.
Конидиогенный локус Любая часть гифы или специальной клетки,
от которой образуется конидия.
Конидиома Структура бесполого (конидиального) спороношения,
такая как пикнида, ложе, спородохий или синнема.
Конидия Экзогенная спора бесполого размножения.
Ложе Блюдцевидное бесполое плодовое тело у некоторых
Coelomycetes.
Локула Вторичная полость внутри плодового тела.
Мультилокулярные пикниды (пикниды со многими локулами) имеются у
Nattrassia mangiferae.
Макроконидии Более крупные из конидий двух типов, возникающих
одинаковым путем. Обычно образуются у грибов рода Fusarium и у
некоторых дерматофитов.
Макронемный гриб Гриб, у которого конидиеносцы четко
отличаются от вегетативных гиф.
Мероспорангий Цилиндрический спорангий со спорангиоспорами,
расположенными в ряд, как у грибов рода Syncephalastrum.
Метула Стерильная клетка, несущая фиалиды, у грибов Aspergillus и
Penicillium (в роде Aspergillus ее называют также профиалида).
Микроконидии Меньшие из конидий двух типов, возникающих
одинаковым путем. Обычно образуются у грибов рода Fusarium и у
некоторых дерматофитов.
Микронемный гриб Гриб, у которого конидиеносцы
морфологически сходны с вегетативными гифами.
Митоспоровые грибы То же — несовершенные грибы (Fungi
imperfecti), дейтеромицеты, анаморфные грибы, конидиальные грибы. Для
значительной части митоспоровых грибов не установлено связи с
мейотическими (половыми) стадиями. Митоспоровые грибы, для которых

83
установлена связь с телеоморфами, относящимися к аскомицетам и
базидиомицетам, могут называться анаморфами, или анаморфными
стадиями соответствующих представителей этих групп.
Монилиевые Термин относится к гифомицетам, образующим
колонии от бесцветных до светлоокрашенных, но не серые, черные или
бурые.
Монилиоидный Имеющий вздутия, перетяжки; структура наподобие
бус. Часто так выглядят гифы демациевых грибов в ткани. Сходным
образом могут выглядеть конидиогенные клетки — отсюда видовой эпитет
"moniliae" у Exophiala moniliae.
Монофиалида Фиалида с одним отверстием (конидиогенным
локусом). Термин для описания конидиогенных клеток, в частности у
представителей рода Fusarium. Противоположное понятие — полифиалида,
фиалида с двумя отверстиями.
Муральная спора Спора (аскоспора или конидия), имеющая
вертикальные и горизонтальные септы.
Мутовка Мутовка конидиогенных клеток, расположенных
радиально, подобно спицам колеса, как у редставителей рода Verticillium.
Одноярусный Термин, используемый для описания конидиогенных
структур у грибов рода Aspergillus, когда фиалиды располагаются
непосредственно на вздутии, а не на стерильных метулах.
Оидий (устаревший термин) То же, что артроконидия.
Опорная клетка Основание конидиеносца (место прикрепления к
вегетативной гифе у видов Aspergillus).
Перитеций Бутылевидный аскокарп с выводным отверстием.
Перкуррентный конидиогенез Тип конидиогенеза, при котором
новые вершины пролиферируют через конец конидиогенной клетки, как у
грибов рода Stemphylium.
Пикнида (пикнидий) Структура бесполого спороношения, по форме
обычно от округлой до бутылевидной, с выводным отверстием; внутри
пикниды формируются конидии.
Пионнота Плоская масса макроконидий у грибов рода Fusarium,
имеющая слизистую или желеобразную консистенцию.
Плесневый гриб Мицелиальный гриб.
Плодовое тело Крупная, сложная структура, дающая начало спорам
полового размножения или конидиям.
Полифиалида Фиалида с двумя отверстиями (конидиогенными
локусами), не ограниченная септой.
Полосатый Имеющий линии или маленькие бороздки, как
спорангиоспоры у грибов рода Rhizopus.
Пороконидия Голобластическая конидия, образующаяся через пору

84
или канал в клеточной стенке конидиеносца или конидиогенной клетки,
как у представителей рода Bipolaris.
Простой Неветвящийся (например, конидиеносец).
Прототеций Недоразвитый аскокарп, не содержащий аскоспор.
Пунктированный С мелкими точками.
Ростковая щель Тонкостенное углубление в конидии или в споре
полового размножения, через которое происходит прорастание.
Рубчик Рубец у основания конидии, служившего местом
прикрепления к конидиогенной клетке.
Септа Поперечная или продольная перегородка в гифе, споре
полового размножения или конидии.
Септированная структура Структура (например, гифа, конидия),
имеющая поперечные перегородки, или септы.
Сидячий Не имеющий несущей структуры, а прикрепленный
непосредственно к гифам.
Симподиальная конидиогенная клетка Конидиогенная клетка,
продолжающая расти после того, как на ее вершине образуются конидии, и
образующая серию окончаний, каждое из которых возникает ниже и сбоку
от предыдущего.
Синанаморфа Другая анаморфа данного гриба.
Синнема Компактная удлиненная группа прямостоячих
конидиеносцев, прижатых друг к другу и образующих конидии на
верхушке, боковой поверхности или в обоих этих участках.
Синхронное образование конидий Одновременное образование
множества конидий, как у грибов рода Aureobasidium.
Склероций Твердая масса клеток — покоящаяся стадия при
неблагоприятных условиях внешней среды; обычно склероций не удается
раздавить покровным стеклом.
Спора Любая репродуктивная пропагула; могут быть споры
бесполого размножения (возникающие без предшествующего полового
процесса) и споры полового размножения (образованию которых
предшествует половой процесс), например аскоспоры и базидиоспоры).
Спорангиеносец Специализированная гифа, дающая начало
спорангию.
Спорангий Мешковидная структура, внутреннее содержимое
которой постепенно распадается на бесполые репродуктивные пропагулы.
Спорангиола Небольшой спорангий, образующий малое число
спорангиоспор, как у Cokeromyces recurvatus.
Спорангиоспора Спора бесполого размножения, образующаяся
внутри спорангия.
Спородохий Подушковидное сплетение гиф, покрытое

85
конидиеносцами. У грибов рода Fusarium на нем возникают макроконидии.
Стекловидные клетки Светопреломляющие толстостенные клетки
различной формы у некоторых видов Aspergillus.
Столон Отпрыск («ус») или горизонтальная гифа, от которой
возникают новые гифы, ризоиды, спорангиеносцы или любые комбинации
этих структур.
Строма Компактная вегетативная структура, на которой или внутри
которой развиваются плодовые тела.
Сумка Клетка, в которой после кариогамии и мейоза образуются
аскоспоры.
Телеоморфа Половая стадия развития гриба, связанная с мейозом.
Усеченная спора Спора, как бы срезанная с одного или обоих
концов — например, конидия Scopulariopsis brevicaulis.
Фиалида Конидиогенная клетка, у которой первая конидия
голобластическая, а все последующие — энтеробластические. Конец
фиалиды может быть в виде четкого «воротничка», как у грибов рода
Phialophora. Фиалиды сохраняют те же размеры и форму при образовании
каждой новой конидии.
Хламидоспора Расширенная толстостенная бесполая покоящаяся
клетка.
Чередующиеся артроконидии Артроконидии, разделенные
промежуточной клеткой (клетка-дизъюнктор) и высвобождаемые в
результате ее разрыва, как, например, у Coccidioides immitis.
Черные дрожжи Демациевые грибы, которые дают одноклеточную
почкующуюся форму, образуя при этом черные, пастообразные, иногда
слизистые колонии; примеры — роды Exophiala и Rhinocladiella.
Шнур Извитая слизистая масса конидий, выталкиваемая из пикниды
или перитеция наподобие зубной пасты из тюбика.
Щетинка Игловидный вырост из плодового тела.
Экссудат Капли жидкости (часто интенсивно окрашенные),
образующиеся на поверхности культур, особенно часто у грибов рода
Penicillium.
Эндоспора Спора, образующаяся внутри сферулы у Coccidioides
immitis.
Энтеробластический конидиогенез Образование конидий, в
котором участвует только внутренний слой, (или слои) клеточной стенки.

86
Приложение 2
СРЕДЫ ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

В микологической лаборатории можно использовать разнообразные


среды, как готовые, так и приготовленные на месте. Промышленно
производимые, готовые среды (Г) приводятся с указанием объекта
применения (Д — дрожжи, М — мицелиальные грибы). Каждую новую
партию сред следует проверять на стерильность и соответствие стандарту
внешнего вида, рН и состава; хранить при температуре 2—8 0С. Срок
сохранности сред в чашках Петри, перевернутых и помещенных в
закрытую пластиковую упаковку, составляет 3 месяца, а сред в пробирках -
6 месяцев.
Среда YpSs
Дрожжевой экстракт 4,0г
Растворимый крахмал 15,0г
K2HPO4 1,0г
MgSO4 0,5г
Агар 20,0г
Морская вода 1 л или ¾ водопроводной и ¼ дистиллированной.
Агар с беномилом, 10 мкг/мл (Д, М) Полезен для предварительной
идентификации базидиальных грибов.
Декстрозный агар Сабуро (ДАС) 16,25г
Денонсированная вода 250мл
Беномил (системный фунгицид) 11,08мг
Деионизированная вода 27,7мл
Приготовление: Количество препарата беномила дано из расчета, что
он содержит 25% действующего вещества. При другой концентрации
действующею вещества в препарате необходимо сделать пересчет. Де-
кстрозный агар Сабуро вносят в деионизированную воду (250 мл) и
нагревают смесь до кипения, чтобы агар полностью растворился.
Стерилизуют среду при 121°С в течение 15 мин и охлаждают до 500С в
холодной воде. Вносят навеску беномила в деионизированную воду (27,7
мл; раствор может быть мутным из-за присутствия в препарате
наполнителей) и добавляют этот раствор к охлажденному ДАС. Разливают
среду по чашкам Петри или пробиркам. Плесневые грибы, чувствительные
к циклогексимиду, но быстро растущие в виде стерильного белого мицелия
на средах с беномилом, могут относиться к базидиомицетам.
Среда Билай
Сахароза 80,0г
КН2РО4 1,0г
КNО3 8,0г

87
КСl 0,5г
Железо сернокислое закисное 0,01г
MgSO4 0,5г
Вода дистиллированная 1л
рН 5,0…5,2.
Среда для быстрого роста и обнаружения плесневых грибов
Из 1г яблок готовят фарш, добавляют к нему 1% желатины, 1%
сахарозы и 0,25% профильтрованного красителя «C-fluolite» для
окрашивания и распознавания колоний. Среду автоклавируют 10 минут
при 151° С. Конечный рН 3,2…3,8.
Среда Ваксмана (для подсчета почвенных грибов)
Глюкоза 10,0г
Пептон 5,0г
KH2PO4 1,0г
MgSO4•7 H2O 0,5г
Агар 25г
Вода 1л
рН среды доводят до 4,0 серной или фосфорной кислотой.
Среда Ван-Итерсона для грибов, использующих целлюлозу
Двойной кружок фильтровальной бумаги сворачивают в виде конуса и
ставят острием вверх в колбу Эрленмейера емкостью 100 мл с 50 мл
водопроводной воды, содержащей 0,75 г/л KH2PO4 и 0,1 г/л MgSO4.
Устанавливают рН 7,0-7,4 и стерилизуют при 1,0 ати.
Водный агар, 2% (М) или голодный Иногда полезен для создания
голодания, стимулирующих образование конидий плесневых грибов.
Агар 20г
Водопроводная вода 1л
Приготовление: Смешивают ингредиенты, для растворения доводят
смесь при постоянном помешивании стеклянной палочкой до кипения и
затем стерилизуют автоклавированием при 121°С 15 мин. Разливают в
пробирки или чашки Петри. Для выделения и исследования морских
грибов вместо дистиллированной воды берут морскую.
Среда Гетчинсона
целлюлоза 10,0г
NaN03 2,5г
К2НР04 (КН2Р04) 1,0г
MgS04•7Н20 0,3г
NaCI 0,1г
FeCl3 0,01г
агар 20,0г
вода дистиллированная 1л.

88
У большинства сумчатых грибов на этой среде вегетативная грибница
развивается слабо, ввиду чего, особенно у представителей рода
Chaetomium, можно хорошо рассмотреть строение отростков плодовых тел,
имеющих важное значение для идентификации грибов.
Глюкозо-пептонный агар
Глюкоза 40г
Пептон 10г
Агар 20г
Вода дистиллированная 1л
После стерилизации подкисляют HCl до рН=4,5. Часто используют для
мукоровых и дрожжевых грибов.
Глюкозо-минеральная среда Используется для учета и
выделения дрожжевых грибов.
Глюкоза 20,0г
(NH 4) 2SO 4 5,0г
KH2PO4 0,85г
K 2 HPO4 0,15г
MgSO4 0,5г
NaCl 0,1г
Агар 20,0г
рН - 4,5.
Капустный агар
Капуста 30г
Глюкоза 20г
Пептон 10г
Агар 20г
Вода водопроводная 1л
30г капусты варится в 1л воды, затем капусту отфильтровывают, а
отвар доводят водой до первоначального объема.
Картофельный агар 1 (КА) (агар из картофельных хлопьев) (Г, М)
Полезен как исходная среда для выделения и быстрой идентификации
плесневых грибов. Эту среду можно сделать селективной путем добавления
антибиотиков, например циклогексимида. Данная среда на растительной
основе отлично обеспечивает развитие полового/бесполого спороношения
у разнообразных плесневых грибов.
Обезвоженные картофельные хлопья любого сорта 20г
Глюкоза 10г
Агар 15г
Деионизированная вода 1л
Приготовление: Смешивают ингредиенты и доводят смесь до кипения
при постоянном помешивании. Стерилизуют среду при 121°С 15 мин,

89
после чего разливают в чашки Петри или пробирки. Картофельные хлопья
оседают на дно, но среду не нужно взбалтывать.
Картофельный агар 2
Картофельный экстракт 0,23л
Глюкоза 20г
Водопроводная вода 0,77л
Агар 15г
Приготовление картофельного экстракта: 200г мелко нарезанного
очищенного картофеля залить 1л водопроводной воды, кипятить 30 мин,
профильтровать, довести до 1 литра водопроводной водой. Стерилизовать 1
час при 1 атм или 30 мин при 1,5 атм.
Картофельно-глюкозный агар
Картофель тертый 200г
Глюкоза 20г
Агар 20г
Вода водопроводная 1л
Картофель варят 1 час в 1л воды, фильтруют через марлю, доливают
водой до первоначального объема, добавляют глюкозу и агар.
Стерилизация при 1050С 30 мин.
Картофельно-декстрозный агар Часто используют для мукоровых
грибов и морских грибов.
Картофель 200г
Декстроза 10г
Агар 12г
Вода дистиллированая 1л
Среда картофельно-морковная
Картофель (немолодой) 20г
Морковь 20г
Агар 20г
Вода 1л
Измельченные и вымытые клубни кипятят в течение часа и протирают
через сито. К жидкой части добавляют агар, расплавляют и стерилизуют 20
минут при 121° С.
Среда Конна (для подсчета почвенных грибов)
Глюкоза 1,0г
Аспарагинат Na 1,0г
MgSO4•7 H2O 0,2г
NaH2PO4 1,5г
КСl 0,1г
CaCl2 0.1г
FeCl3 следы

90
Вода водопр. или дистил. 1л
Среда крахмальная
Крахмал растворимый 40г
Дрожжевой экстракт 5г
Агар 20г
Вода 1л
рН 6,5…7,0. Стерилизуют при необходимости.
Кукурузный агар 1 (Г, Д, М) Идентификация дрожжей (в чашках Пе-
три, засеянных по методу Дальмау). Этот метод полезен также для
различения Aureobasidium pullulans и Hormonema demalioides.
20г кукурузной муки заливают 1л воды, кипятят 1 час на медленном
огне, затем добавляют 15-20г агара и кипятят до растворения, затем
фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разливают в пробирки.
Стерилизуют при 0,5 атм 15 мин. При добавлении 20г глюкозы и 20г
пептона усиливается рост мицелия.
Кукурузный агар 2
40г кукурузной муки (можно взять любую муку) заливают 1л воды,
подогревают на водяной бане при 600 С, добавляют 15г агара, кипятят до
растворения, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют при 1
атм 20 мин.
Среда Мартина
Глюкоза 10,0г
KH2PO4 5,0г
MgSO4 0,5г
Пептон 5,0г
Агар 20,0г
Водопроводная вода 1л
рН – 5,5. Среду стерилизуют при 0,5 ати 20-30 мин.
Микозель/микобиотический агар (Г, Д, М) Применение:
Используется как селективная среда для первоначального выделения
дерматофитов, а также для дифференциации дрожжей и многих
родов/видов плесневых грибов. Эта среда поступает в продажу и под
другими товарными наименованиями. Активный ингредиент —
циклогексимид.
Среда с глюкозой и соевым пептоном (Mycological agar)
Глюкоза 10г
Соевый пептон 10г
Агар 15г
Вода 1л
Агар с мочевиной (среда Кристенсена) (Г, Д, М) Идентификация
дрожжей и плесневых грибов. Незасеянная среда имеет желто-оранжевый

91
цвет. Организмы, использующие мочевину, вызывают подщелочение этой
среды, на которое указывает ее ярко-розовое окрашивание.
Агар из муки или раздробленного зерна злаков
30г, например овсяной муки или 125г овсянки варится в 1л воды 30
минут, затем отфильтровывается через марлю и добавляется водой до
прежнего объема, затем прибавляется агар.
Модифицированная агаровая среда для теста на использование
нитрата (Д, М) Первоначально эта среда предназначалась для
идентификации дрожжей, но в равной степени она пригодна и для
определения плесневых грибов.
Азотнокислый калий 0,7г
Углеводный субстрат
для культивирования дрожжей 0,8г
Бромтимоловый синий 0,06г
Агар Нобеля 8,0г
Деионизированная вода 500мл
Приготовление: Смешивают компоненты и нагревают смесь при
постоянном помешивании до кипения, чтобы получить раствор. Среда
должна стать желтой. Доводят рН до 5,9-6,0, добавляя по капле 1н NaOH.
При этом значении рН среда должна стать зеленой, но необходимо также
проверить рН при помощи индикаторной бумаги или рН-метра.
Стерилизуют среду при 121°С в течение 15 мин и затем разливают по чаш-
кам Петри или пробиркам. На неспособность использовать нитрат
(отрицательный результат) указывает зеленовато-желтая окраска среды, на
положительный - голубая.
Овсяный агар 1
Овес (овсяные хлопья) 30г
Агар 15г
Вода водопроводная 1л
Овес выдерживать на водяной бане при 580С в течение 1 часа,
профильтровать через 2 слоя марли, довести до 1л, добавить 15г агара.
Стерилизация при 1210С 30 мин.
Овсяный агар 2
Овсяная мука (овсяные хлопья) 20г
Агар 20г
Вода водопроводная 1л
РН 7,2. Изготовление и стерилизация аналогичны предыдущей
среде. Можно добавить к этой среде 0,1% дрожжевого экстракта.
Овсяной агар по Эмерсону
Овсяная мука 50г
Агар 20г

92
Водопроводная вода 1л
Муку кипятят в 1л воды на водяной бане 1 час при 600С, фильтруют,
добавляют агар, стерилизуют при 1 атм.
Пептоно-декстозный агар Ваксмана Применяют и для выделения
морских грибов.
Глюкоза 10,0г
Пептон 5,0г
KH2PO4 1,0г
MgSO4 0,5г
Агар 15-20г
Вода водопроводная 1л
рН – 6,0
Почвенный агар
1. Почвенный экстракт 1л
Агар 15г
Приготовление почвенного экстракта
1кг почвы автоклавируется в 1 литре воды. Почвенная суспензия
фильтруется и доводится до 1 литра. Если фильтрат мутный в него
добавляют CaSO4 и фильтруют снова. Для приготовления среды в
почвенный экстракт можно добавить KH2PO4 – 0,02 % или глюкозы – 0,1
%.
2. 200г воздушно-сухой измельченной почвы заливают 1л воды (20%-ная
вытяжка), настаивают сутки периодически взбалтывая (можно 1 час на
качалке), затем кипятят 30 мин и фильтруют через 1—2 слоя
фильтровальной бумаги, после чего восстанавливают прежний объем
жидкости, добавляют агар-агар (15—20г), разливают в посуду и
стерилизуют.
Рисовая среда (М) Используется для дифференциации Microsporum
canis (хороший рост, желтый пигмент, обильное образование конидий) и
Microsporum audouinii (отсутствие роста или слабый рост, коричневатое
окрашивание).
Необогащенный белый рис 8г
Деионизированная вода 25мл
Приготовление: Вносят воду и рис в колбу Эрленмейера и
стерилизуют при 121 °С 15 мин.
Среда Ролэна
Сахароза 50,0г
NH4NO3 3,0г
KH2PO4 1,0г
MgSO4•7H2O 1,0г
CuSO4•5H2O 0,02г

93
Агар 20,0г
Дистиллированная вода 1л
Для диагностики Cladosporium добавляют:
(NH4)2SO4 1г
Сахароза 50г
Калийная селитра 80-250г
Для исследования морфологии гифомицетов добавляют
растворимого крахмала 2,5 %
глюкозы 0,5 %
Раствор Ролэна (для очищения от бактерий)
Сахароза 70,0г
Винная кислота 4,0г
NH4NO3 4,0г
(NH4)3 PO4 0,6г
K2 CO3 0,6г
MgCO3 0,6г
(NH4)2SO4 0,25г
ZnSO4 0,07г
Fe(SO4)3 0,07г
K2 SiO3 0,97г
Вода 1,5л
дистиллированная
Среда Ролэна-Тома (для фитопатогенных грибов)
Сахароза 40,0…60,0 г
Виннокислый аммоний 2,0г
MgSO4 0,2г
K2 SO4 0,2г
Раствор микроэлементов 1,0мл
Раствор микроэлементов, мг
MgSO4 8
CuSO4 40
ZnSO4 880
Со SO4 10
FeSO4 100
Н3 ВО3 6
СаСl2 100
Вода 1л
рН 5,0…5,5.
Агар с сердечно-мозговой вытяжкой и 5-10% дефибринированной
кровью барана (Г, Д, М) Применение: Обогащенная среда для
первоначального выделения и перевода диморфных грибов в дрожжевую

94
стадию. Можно добавлять в эту среду хлорамфеникол (50 мг/л) для
подавления роста бактерий.
Среда Сабуро
Пептон 10г
Глюкоза (мальтоза) 40г
Агар 20г
Вода дистиллированная 1л
рН 5,6…5,8.
Среда Сабуро с глицерином
Пептон 16,0г
Глюкоза 20,0г
Глицерин 5,0г
Агар 12,5г
Дистиллированная вода 1л
Среду применяют и для выделения морских грибов.
Среда Сабуро с медом
Пептон 10г
Мед 40-80г
Агар 18г
Дистиллированная вода 1л
Декстрозный агар Сабуро с 10% хлористым натрием (М): Полезен
для определения галофильных грибов.
Декстрозный агар Сабуро 65г
Хлористый натрий 100г
Деионизированная вода 1л
Приготовление: Смешивают ингредиенты и доводят смесь при
постоянном помешивании до кипения, после чего стерилизуют
автоклавированием при 1210С 15 мин. Разливают в пробирки или чашки
Петри.
Декстрозный агар Сабуро (ДАС) в модификации Эммонса, рН 7,0
(Г, М, Д) Среда служит для первоначального выделения дрожжей, а также
для идентификации дрожжей и дерматофитов. Для получения
полового/бесполового спороношения и идентификации других,
сапрофитных плесневых грибов не подходит.
Среда синтетическая (для выделения почвенных грибов)
Глюкоза 10,0г
Пептон 5,0г
MnSO4 0,5г
K2HPO4 1,0г
Агар 25,0г
Вода 1л

95
дистиллированная
После автоклавирования и охлаждения устанавливают рН 4,0 серной
кислотой.
Солодовый агар (сусло-агар) (Г, М) Полезен при идентификации
плесневых грибов, особенно родов Penicillium и Aspergillus.
Используют 3-4оБ сусло. В исходном сусле устанавливают рН,
разводят водопроводной водой до содержания сухого вещества 7%,
добавляют 2% агара и доводят до кипения. После этого смесь фильтруют
через марлю и вату, разливают в стерильную посуду и стерилизуют 20…30
минут при 112…117°С. Обычно рН сусло-агара 6,5…6,6, рН сусла должно
быть 5,6…6,0 (если рН ниже 5,5 солодовое сусло подщелачивают 10%-ным
раствором бикарбоната или гидроксида натрия). Для получения нужной
плотности исходное сусло обычно разводят примерно в 2 раза.
Агар на основе фруктов, листьев, сена
50г нужного материала варится 30 мин в 1л воды, отвар
отфильтровывается, добавляется вода до 1л литра, добавляется агар и
глюкоза и сахароза от 1 до 3 % (кроме сред, приготовленных из фруктов).
Среды можно использовать в жидком виде. Стерилизовать при 0,5 атм 20-
30 мин.
Целлюлозная среда
Чистую фильтровальную бумагу нарезают полосками, складывают и
сжимают «гармошкой» и закладывают в пробирки. В них наливают 2-3 мл
жидкой среды Чапека или Ролена без источника углерода. Полоски должны
быть погружены в среду основаниями. Стерилизуют пробирки при 1 атм 30
мин. Высев проб осуществляется на влажную бумагу.
Среда Чапека
Сахароза 30,0г
NaNO3 2,0г
K2HPO4 1,0г
MgSO4•7 H2O 0,5г
KCl 0,5г
FeSO4•7 H2O 0,01г
Агар 20,0г
Вода дистиллированная 1л
рН около 7. Стерилизовать при 0,5 атм 20-30 мин.
Модификация среды Чапека с крахмалом
Крахмал растворимый 20,0г
К2НРО4 0,5г
KNO3 1,0г
NaCl 0,2г
MgSO4•7H2O 0,3г

96
CaCO3 0,5г
FeSO4 0,001г
Агар 20,0г
Вода дистиллированная 1л
рН 7,2-7,4. Стерилизация 105 С 30 мин.
Среда Чапека с добавками микроэлементов и дрожжевого
экстракта
Сахара (глюкоза или сахароза) 30,0г
NaNO3 3,0г
KH3PO4 0,3г
MgSO4•7H2O 0,25г
KCl 0,25г
FeSO4 0,01г
ZnSO4 0,04г
CuSO4•5H2O 0,005г
Дрожжевой экстракт 50мл
Агар 20,0г
Вода дистиллированная 1л
Среду стерилизуют при 0,5 атм 20-30 мин.
Модификация среды Чапека с парафином
Варят стандартную среду Чапека, устанавливают рН-5,2. После
стерилизации в колбы добавляют отдельно перетопленный и измельченный
парафин до порошкообразного состояния (4 г на 500 мл среды). Парафин
вводят 2-мя порциями, во время посева и на 2-3 день культивирования.
Агар Чапека-Докса (Г, М) Наиболее распространенные виды
Aspergillus можно идентифицировать на картофельном агаре. Однако
стандартной справочной средой для выявления видов Aspergillus служит
агар Чапека—Докса, и иногда выращивание на нем необходимо для того,
чтобы признаки совпадали с оригинальным описанием.
Сахароза 30,0г
NaNO3 3,0г
K2HPO4 1,0г
MgSO4•7H2O 0,5г
KCl 0,5г
FeSO4•7H2O 0,01г
Агар 15,0г
Вода дистиллированная 1л
Среду стерилизуют при 0,5 атм 20-30 мин.
Среда Частухина, видоизмененная Захаровым
Целлюлоза 10,0г
(NH4)2SO4 0,75г

97
KH2PO4 0,5г
MgSO4•7H2O 0,25г
FeSO4 следы
MnSO4 следы
Агар 20,0г
Вода дистиллированная 1л

Среда Эшби
Сахароза (манит, сорбит, крахмал) 20,0г
KH2PO4 0,2г
K2HPO4 0,1г
MgSO4 0,2г
NaCl 0,2г
K2SO4 0,1г
Агар 20г
Стрептомицин сульфат 80мг/л
Среда Юргенсена и Даниелсона для выделения липомицетов
Глюкоза 5,0г
KH2PO4 1,0г
MgSO4•7H2O 0,5г
FeCl3 следы
Агар 20,0г
Азот – имидазол 0,25г
или тимин 0,48г
Циклогексимид 200мг/л
Стрептомицин сульфат 100мг/л
или ауреомицин 50мг/л
Дистиллированная вода 1л
рН 5,2

Среды для отдельных родов и групп грибов


Среда Aspergillus sp., Penicillium sp. (Агар с солодовым
экстрактом)
Солодовый экстракт 20г
Глюкоза 20г
Пептон 1г
Агар 20г
Вода дистиллированная 1л
Глюкоза добавляется непосредственно перед стерилизацией.
Среда для рода Chaetomium (Раствор Кноппа)
Ca (NO3)2 1,0г
98
K2HPO4 0,25г
MgSO4•7 H2O 0,25г
FeCl3 следы
Вода дистиллированная 1л
Среда для рода Fusarium (Среда Армстронга)
Сахароза (Глюкоза) 20,0г
MgSO4 0,4г
КСl 1,6г
КН2РО4 1,0г
Ca (NO3)2 5,9г
FeCl3 0,2мкг
MnSO4 0,2мкг
ZnSO4 0,2мкг
Вода дистиллированная 1л
Среда для выделения и учета в почве Fusarium oxysporum —
возбудителя фузариозного увядания и корневых гнилей растений (г/л):
NaN03 - 2,0; К2НР04 - 1,0; KC1 - 0,5; MgS04 - 0,5; FeS04 -0,01; галактоза —
20,0; агар — 20,0 и в качестве селектирующих агентов — медицинская
желчь — 15 мл/л, пентахлорбензол — 1 г/л, стрептомицин сульфат — 0,3
г/л. Производят посев 1 мл почвенной суспензии из разведения 10 -3
глубинным способом. Засеянные чашки инкубируют 7 — 10 сут на свету
0
при 26 — 28 С. По истечении этого времени на среде образуются
характерные колонии Fusarium oxysporum с пленчато-пушистым мицелием
телесно-розового цвета, хорошо дифференцирующиеся от других видов
грибов.
Среда для рода Mucor (Среда Кука)
Глюкоза 20,0г
K2HPO4 0,25г
MgSO4•7 H2O 0,25г
Пептон 10,0г
Агар 15,0г
Вода дистиллированная 1л
Среда для рода Trichoderma
Глюкоза 3,0г
MgSO4•7 H2O 0,25г
K2HPO4 0,9г
КСl 0,15г
NH4NO3 1,0г
Хлорамфеникол 0,25г
n-диметиламинобензодиазосульфонат Na 0,3г
Пентахлорнитробензол 0,2г

99
Розовый бенгальский 0,15г
Агар 20,0г
Вода дистиллированная 1л

При составлении питательных сред для выделения и культивирования


морских сумчатых и несовершенных грибов-сапрофитов в первую
очередь учитывают адаптацию представителей морской микофлоры к
высокой солености воды. Поэтому в состав сред в обязательном порядке
входит минеральная основа, эквивалентная по компонентам морской воде
(г/л):
NaCl 2,5
MgSO4•7Н2О 0,5
КС1 0,01
КН2РО4 0,1
СаСО3 0,02
В большинстве случаев среды для культивирования морских сумчатых
и несовершенных грибов-сапрофитов готовят на естественной морской
воде.

Раствор Виноградского для культивирования гумусоразлагающих


грибов
(пропитывают силикагелевые пластинки)
K2HPO4 1г
MgSO4•7Н2О 0,5г
NaCl 0,5г
FeSO4 0,01г
Mn2(SO4)3 0,01г
Дистил. вода 200мл
Методика приготовления гелевых пластинок. Концентрированную
соляную кислоту (с удельным весом 1,19) разбавляют водопроводной
водой до уд. веса 1,10 по ареометру. Жидкое стекло — кремнекислый
натрий (Nа2SiO3) — разбавляют до уд. веса 1,06—1,07 по ареометру. К 0,5л
соляной кислоты (уд. вес 1,10) при постоянном помешивании добавляют
0,5 жидкого стекла. Нельзя делать наоборот! Смесь разливают в чашки
Петри по 12—15 мл и оставляют их открытыми на 20—24 часа, пока не
образуется гель. Открытые чашки с гелем помещают в бачок, который
ставят в раковину; на водопроводный кран надевают резиновую трубку,
опускают ее на дно бачка и промывают чашки Петри проточной водой.
Через 2—3 суток чашки ополаскивают несколько раз дистиллированной
водой и проверяют полноту промывания, пользуясь пробой на хлор (AgN03
в присутствии HN03). Гелевые пластинки многократно промывают горячей

100
водой и стерилизуют ультрафиолетовыми лучами (открытые гелевые
пластинки в чашках Петри помещают на расстоянии 20см от источника
ультрафиолетового света и облучают в течение 30 мин). Перед посевом
поверхность кремневой пластинки пропитывают стерильной питательной
средой.

Для изоляции из почвы и зараженных нематод энтомопатогенного


гриба Paecylomyces lilacinus применяют среду следующего состава:
картофельно-декстрозный агар (фирма «Дифко») — 39г; NaCl — 10г;
фунгициды пентахлорбензол и беномил — по 50мг; вода денонсированная
— до 1л. Среду автоклавируют 15 мин при 121°С; охлаждают до 45 —
50°С; добавляют 100 мг сульфата стрептомицина; 50мг хлортетрациклина
монохлоргидрата; 1мл тергитола и разливают в чашки Петри.

101
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Барсукова Т.Н., Белякова Г.А., Прохоров В.П., Тарасов К.Л. Малый
практикум по ботанике. Водоросли и грибы. – М.: Академия, 2005. –
240 с.
2. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. – М.: Изд. МГУ, 1989. - 336
с.
3. Бабьева И.П., Агре Н.С. Практическое руководство по биологии
почв. – М.: Изд. МГУ, 1971. – 140 с.
4. Билай В.И., Коваль Э.З. Аспергиллы. Определитель. Киев: Наукова
Думка, 1988. - 203 с.
5. Билай В.И., Курбацкая З.А. Определитель токсинобразующих
микромицетов. – Киев: Наук.думка, 1990. – 236 с.
6. Великанов Л.Л., Сидорова И.И., Успенская Г.Д. Полевая практика по
экологии грибов и лишайников. – М.: Изд. МГУ, 1980. – 112 с.
7. Гарибова Л.В., Лекомцева С.Н. Основы микологии: Морфология и
систематика грибов и грибоподобных организмов. – М.:
Товарищество научных изданий КМК, 2005. – 220 с.
8. Егорова Л.Н. Почвенные грибы Дальнего Востока. – Л.: Наука, 1986.
- 207 с.
9. Кириленко Т.С. Атлас родов почвенных грибов (Ascomycetes и
Deuteromycetes). Киев, Наукова Думка, 1977. - 126 с.
10. Кириленко Т.С. Определитель почвенных сумчатых грибов. – Киев:
Наук.думка, 1978. – 264 с.
11. Кураков А.В. Методы выделения и характеристики комплексов
микроскопических грибов наземных экосистем. – М.: МАКСПресс,
2001. – 92с.
12. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов.
Л.: Наука, 1967. - 303 с.
13. Методы экспериментальной микологии /Под. ред Билай В.И. – Киев:
Наук.думка, 1982. – 407 с.
14. Методы почвенной микробиологии и биохимии. / Под ред.
Звягинцева Д.Г. – М.: МГУ, 1991. – 304 с.
15. Милько А.А. Определитель мукоральных грибов. Киев: Наук. думка,
1974. - 302 с.
16. Мирчинк Т.Г. Почвенная микология. – М.: Изд. МГУ, 1988. – 219 с.
17. Пидопличко Н.М. Грибная флора грубых кормов. – Киев: Изд. АН
УССр, 1953. – 487 с.
18. Пидопличко Н.М. Пеницилии. - Киев: Наук. думка, 1972. - 150 с.
19. Практикум по микробиологии. /Под ред. Нетрусова А.И. – М.:
Академия, 2005. – 608 с.
20. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и

102
условно патогенных грибов. – М.: Мир, 2001. – 486 с.
21. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по
микробиологии. – М.: Дрофа, 2004. – 256 с.
22. Ainsworth J. and H. Bisby's Dictionary of the Fungi. 1971.
23. Ainsworth J. and H. Bisby's Dictionary of the Fungi. 1995. 8th ed. by D.L.
Hawksworth, P.M. Kirk, B. С Sutton and D.M. Pegler. Wallingford. U.K.:
CAB Internatinal. 616 p.
24. Ainsworth J. and H. Bisby's Dictionary of the Fungi. 2001. 9th ed. by P.M.
Kirk, P.F. Cannon, J.C. David and J.A. Stalpers. CABI Bioscience. 624 p.
25. Вarnett H.L. and B.B.Hunter. 1972. Illustrated genera of imperfect fungi.
USA, Minneapolis, Burgess Publ. Company, 240 p.
26. Barren G.L. 1968. The genera of Hyphomycetes from soil. USA,
Baltimore,The Williams a. Wilkins Co., 364 p.
27. Booth С 1977. Fusarium. Laboratory guide to the identification of the
major species. Commonwealth Mycological Inst. Kew, Surrey, 58 p.
28. Booth С 1971. The genus Fusarium. Commonwealth Mycological Inst.
Kew, Surrey, 237 p.
29. Dictionary of the Fungi, 1995
30. Dictionary of the Fungi, 2001
31. Domsch K.H., W.Gams and T.Anderson. 1993. Compendium of Soil
Fungi. Vols. 1. IHW-Verlag. 860 p.
32. Ellis M.B. Dematiaceous hyphomycetes. Commonwealth Mycological
Institute. Kew, Surrey, England. 1971. 608 p.
33. Gilman J.C. 1959. A manual of soil fungi. USA, Jowa State Univ.
34. Klich M., Pitt J.I. A laboratory guide to common Aspergillus species and
their teleomorphs. New South Wales. Australia. Commonwealth scientific
and industrial research organization. 1992. 116 p.
35. Pitt J. A laboratory guide to common Penicillium species. Commonwealth
scientific and industrial research organization. N.S.W. Australia.1991.187
p.
36. Raper K.B., Fennell D.J. 1965. The genus Aspergillus. USA, Baltimore,
Williams a. Wilkins Co., 686 p.
37. Raper K.B., Thom C., Fennel D.I. A manual of the Penicillia. Baltimore:
The Williams & Wilkins Company. 1949. 875 p.
38. Rifai M.A. 1962. A revision of the genus Trichoderma. Mycol. Paper. V.l
16, p.3-56.
39. Schipper M.A.A. 1976. Mucor circenelloides a. Mucor racemosus a.
related species. Studies in Mycology, №23.
40. Schipper M.A.A., Stalpers J.A. 1984. A revision of the genus Rhizopus.
Studies in Mycology. №25, 34 p.
41. Stolk A.C., Samson R.A. 1983. The ascomycete genus Penicillium and

103
related Penicillium anamorphs. Studies in Mycology, №23.
42. Sutton B.C. 1980. The Coelomycetes. CMI, Surrey, England, p.379-645.
43. Zycha H., Stepmann R., Linnemann G. Mucorales. Lenre, Verlag von
J.Cramer, 1969. 356p.

104