Вы находитесь на странице: 1из 6

НОВЫЕ ТЕХНОЛОГИИ Патогенез. - 2013. - Т.11, №1. - С.

7 4 -7 9

Способ определения
циркулирующих иммунных комплексов
Шойбонов Б.Б.1,2,3, Баронец В.Ю.2’3, Панченко Л .Ф .1,2, Кубатиев А.А.1

1 — Ф е д е р а л ь н о е го с у д а р с т в е н н о е б ю д ж е т н о е уч р е ж д е н и е
« Н а у ч н о -и с с л е д о в а те л ь с ки й и н с ти ту т о б щ е й п а то л о ги и и п а то ф и зи о л о ги и »
Р о с с и й с ко й а ка д е м и и м е д и ц и н с ки х наук, 1 2 5 31 5 , М о скв а , ул. Б а л ти й ска я , 8
2 — Ф е д е р а л ь н о е го с у д а р с т в е н н о е б ю д ж е т н о е у ч р е ж д е н и е «Н ацио на л ьны й научны й ц е н тр н а р ко л о ги и »
М и н и с те р с тв а зд р а в о о х р а н е н и я Р о с с и й с ко й Ф е д е р а ц и и , 119 00 2 , г. М о скв а , М. М о ги л ь ц е в с ки й п е р ., 3
3 — Ф е д е р а л ь н о е го с у д а р с т в е н н о е б ю д ж е т н о е уч р е ж д е н и е
« Н а у ч н о -и с с л е д о в а те л ь с ки й и н с ти ту т н о р м а л ьн о й ф и з и о л о ги и им. П .К . А нохина»
Р о с с и й с ко й а ка д е м и и м е д и ц и н с ки х наук, 1 2 5 31 5 , М о скв а , ул. Б а л ти й ска я , 8

Разработан простой сп осо б определения циркулирующ их иммунных комплексов (ЦИК), основанный на


их преципитации из сыворотки крови человека в специальном буфере, содержащ ем 10% полиэтиленгли-
коль с мол. м ассой 3350 (ПЭГ-3350). К сыворотке крови человека добавляют равный объем буфера, с о ­
держащ его 10% ПЭГ-3350, инкубируют в течение 10 м ин при комнатной температуре. Агрегированные
Ц И К отделяют центрифугированием, растворяют в буфере без ПЭ Г-3350 и определяют содерж ание общ е­
го уровня Ц И К л ибо спектрофотометрически при длинах волн 280 нм и 260 нм, л иб о определение белка в
преципитате проводят по методу Лоури. С пособ позволяет повысить точность количественного определе­
ния как общ их (ЦИКобщ), так и комплемент-связывающих (Ц И К-1) и несвязывающ их (Ц И К-2) циркулирую ­
щих иммунных комплексов в сыворотке крови человека. Патогенность Ц И К расчитывают как отношение
Ц И К -1 к ЦИК-2.
Ключевые слова: циркулирующ ие иммунные комплексы, полиэтиленгликоль 3350, система комплем ен­
та, патогенность Ц И К

Введение Наиболее распространенным способом определения


ЦИК является метод преципитации раствором
Проблема определения уровня Ц И К в сыворотке кро­
ПЭГ-6000, который является одним из веществ, исполь­
ви человека остается в настоящее время актуальной в свя­
зуемых для избирательной преципитации гликопротеи­
зи с тем, что в лабораторной диагностике отсутствуют до­
нов из водных растворов [1]. Он также был использован
ступные, точные тест-системы для рутинных исследова­
для преципитации антител и искусственных антиген-ан­
ний, которые необходимы как для диагностики аутоим­
титело комплексов из сыворотки [7]. Эти работы позво­
мунных, онкологических заболеваний, так и для контроля
лили использовать ПЭГ-6000 в тестах для определения
эффективности терапии.
Ц И К в сыворотках больных, страдающих различными
Тесты определения Ц И К, используемые в клиниче­ заболеваниями [8]. Наличие Ц И К в ПЭГ-преципитатах
ской практике, основаны на: было показано определением общего белка, радиальной
1) преципитации Ц И К полиэтиленгликолем 6000 иммунодиффузией IgG [5], IgM, IgA, C lq [22], C l [15],
(ПЭГ-6000) [2]; C3 [13] или C4 [8 ], C lq с использованием радиоиммуно-
2) взаимодействии Ц И К с комплементом (C lq -тест) го анализа [ 10 , 16], а также измерением антикомплемен-
[9]; тной активности [6 , 11].
3) определении Ц И К , связанных с СЗЬ (Raji-клеточ­ Эти различные тесты отличаются экспериментальны­
ный тест, конглютининовая проба) [20 ]; ми условиями: сыворотка использовалась в области от 2 %
4) связывании Ц И К с аутоантителами, такими, как мо­ [15] до 83% [5, 13]; концентрация ПЭГ — от 2,5% [10] до
ноклональный ревматоидный фактор (m RF-тест) [21]. 10% [7]. Большинство авторов предварительно инкубиро­
В сравнительных исследованиях ВОЗ [14] было пока­ вали преципитационную пробу до центрифугирования от
зано, что не все тесты обладают достаточной чувствитель­ 1 часа [13] до 18 ч [7]. Также различались условия центри­
ностью и воспроизводимостью. Поэтому для более точно­ фугирования, а именно: 20 мин при 1000g и 4°С [7];
го определения Ц И К ВОЗ рекомендует использовать не 10 мин при 1750g и 4°С [11]; 20 мин при 20000g и 4°С [13];
менее двух тестов, основанных на различных иммуноло­ 15 мин при 15000g при 21°С [17].
гических свойствах иммунных комплексов. Комбиниро­ Недостатками данных методов являются как противо­
ванное применение C lq - и m R F -тестов позволяет опреде­ речивость результатов, получаемых, в частности, при
лять как комплемент фиксирующие, так и не связываю­ аутоиммунных заболеваниях [ 12], так и потребность в до­
щие комплемент иммунные комплексы различных разме­ рогостоящем оборудовании.
ров [21 ]. Целью настоящей работы является разработка просто­
Коммерческие иммуноферментные тесты используют го, доступного способа количественного определения
факторы комплемента или моноклональные антитела к уровня Ц И К (общих, связывающих и не связывающих
ним (C lq, m aC lq, C3d, maC3d), что делает их малодос­ комплемент Ц И К) в сыворотке крови человека для ру­
тупными для рутинных исследований. тинных исследований [3].
74 ПАТОГЕНЕЗ
Материалы и методы ляли равный объем 1% суспензии ЕАч, тщательно переме­
В работе исследовали сыворотки крови 15 здоровых шивали и инкубировали в течение 1 ч при комнатной тем­
доноров и 15 больных ишемической болезнью сердца. За­ пературе. После инкубации определяли конечное разве­
бор крови осуществляли из локтевой вены после 14-часо­ дение антител барана, при котором наблюдается полная
вого голодания. Содержание общего холестерина (ОХС), гемагглютинация. Данное разведение антисыворотки
триацилгицеридов (ТАГ) и общего белка в ПЭГ-преципи- принимали за 1 гемагглютинирующую единицу (ГАЕ).
тате сыворотки крови определяли с помощью наборов В нашем случае 1 гемагглютинирующей единицей было
ЗАО «ЭКОлаб» (г.Электрогорск, МО, Россия). разведение 1:32400. Для реакции торможения гемагглю-
тинации (РТГА) использовали препарат антител барана
В работе использовали веронал и мединал — фирмы
против IgG человека в разведении 1:8100 (4 ГАЕ).
«Serva» (Германия), Трис — «Merck» (Германия), поли-
Определение преципитации гетерофильных антител
этиленгликоль 3350 (ПЭГ-3350) «Sigma» (США), компле­
(ГА) из сыворотки крови человека при возрастающих кон­
мент морской свинки, консервированные эритроциты ба­
центрациях ПЭГ-3350. Реакцию гемагглютинации (РГА)
рана — ЗАО «ЭКОлаб», (г.Электрогорск, МО, Россия),
ставили в стандартных пластиковых 96-луночных микро­
остальные реактивы квалификации не ниже ч.д.а. — оте­
плашках с круглодонными лунками. Во все лунки вноси­
чественного производства.
ли по 40 мкл 0Д5М раствора N aCl и готовили серии дву­
Приготовление нативных эритроцитов барана, эрит­
кратных разведений ПЭГ-преципитатов. Затем вносили
роцитов барана, сенсибилизированных антителами кро­
по 40 мкл стандартизированной суспензии эритроцитов
лика (ЕА), изотонического вероналового буфера, pH 7,4
барана (1,5x10s кл/мл) и перемешивали содержимое лу­
(VBS), буфера, содержащего ионы Са2+ и Mg2+ (VBS2+)
нок путем осторожного встряхивания панели в горизон­
описано в работе [19].
тальной плоскости. Панель, прикрытую сверху стеклян­
Буфер-1 для преципитации циркулирующих иммун­ ной пластинкой, выдерживали 60 мин при 37°С. Результа­
ных комплексов (ЦИК) содержал: 10% полиэтиленгли- ты реакции учитывали визуально, определяли последнее
коль с молекулярной массой 3350 (ПЭГ-3350) в 0,01М разведение ПЭГ-преципитата, в котором еще произошла
Трис-НС1-буфере, pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl. Бу­ гемагглютинация. Контроль эритроцитов не содержал
фер-2 для растворения преципитата ЦИК: 0,01М ПЭГ-преципитата.
Трис-НС1-буфер, pH 7,4, содержащий 0,15 М NaCl.
Приготовление преципитата сыворотки крови при воз­
растающих концентрациях ПЭГ-3350. К 50 мкл пулиро-
ванной сыворотки крови здоровых доноров добавляли от Результаты и обсуждение
25 до 200 мкл буфера-1, тщательно перемешивали и инку­ Определение холестерина, триглицеридов и общих белков
бировали 10 мин при комнатной температуре (50 мкл бу­ в ПЭГ-преципитатах, приготовленных при разных концен­
ф ера-1 соответствуют 5% ПЭГ-3350). Образовавшиеся аг­ трациях ПЭГ-3350. В ПЭГ-преципитатах, приготовлен­
регаты Ц И К осаждали центрифугированием в течение ных как описано в материалах и методах, после растворе­
5 мин при 3100g. Супернатант декантировали и осадок ния в 50 мкл буфера-2 определяли содержание холестери­
(ПЭГ-преципитат) растворяли в объеме буфера-2, равном на, триглицеридов, общего белка с использованием набо­
исходному объему буфера-1 (в случае 5% ПЭГ-3350 объем ров реагентов фирмы ЗАО «ЭКОлаб» (г. Электрогорск,
равен 50 мкл). МО, Россия), а также содержание белка определяли спек­
Приготовление преципитата из сыворотки крови при трофотометрически при длинах волн 280 нм и 260 нм и
условиях 5% ПЭГ-3350. К 50 мкл сыворотки крови боль­ рассчитывали по формуле:
ных И БС или здоровых доноров добавляли 50 мкл буфе- Концентрация белка (мг/мл) = l , 55A 2so — 0,76А2бо-
p a - 1, тщательно перемешивали и инкубировали 10 мин Общий белок в ПЭГ-преципитате представлял собой
при комнатной температуре. Образовавшийся преципи­ общий пул циркулирующих иммунных комплексов
тат осаждали центрифугированием в течение 5 мин при (ЦИКобщ), включающий как комплемент связывающие
3100g. Супернатант тщательно декантировали и осадок (Ц И К-1), так и не связывающие (ЦИ К-2) иммунные
(ПЭГ-преципитат) растворяли в 50 мкл буфера-2. комплексы. Полученные результаты представлены в
Приготовление эритроцитов барана, сенсибилизирован­ табл. 1.
ных гетерофильными антителами человека (ЕАч). Предва­ Определение содержания комплемент связывающих цир­
рительно определяли титр гетерофильных антител в сыво­ кулирующих иммунных комплексов (ЦИК-1) в ПЭГ-преци-
ротках крови человека. Использовали инактивированную питатах. К 10 мкл растворов ПЭГ-преципитатов, разбав­
прогреванием при 56°С в течение 20 мин сыворотку крови ленных в соотношении 1:99 буфером VBS2+, добавляли
человека с титром гетерофильных антител 1:512 для полу­ 20 мкл раствора разбавленного комплемента морской
чения иммунного комплекса (эритроциты барана-антите- свинки. Общий объем доводили до 0,3 мл буфером VBS2+
ла человека (ЕАЧ) в субагглютинирующей дозе). После и инкубировали 20 мин при 37°С. После инкубации до­
30 мин инкубации сформированный комплекс ЕАЧ отде­ бавляли 200 мкл ЕА и повторно инкубировали 30 мин при
ляли центрифугированием, осадок 3 раза промывали 37°С. Реакцию останавливали добавлением 2,5 мл холод­
0,15 М раствором NaCl при центрифугировании и готови­ ного раствора 0,15 М NaCl, центрифугировали и опреде­
ли 1% взвесь ЕАц. ляли величину лизиса эритроцитов по выходу гемоглоби­
Определение гемагглютинирующего титра антител ба­ на в супернатант. Контрольная проба не содержала
рана к гетерофильным антителам в составе иммунного ПЭГ-преципитата. П ониженный гемолиз в опытных про­
комплекса (EA,J. Предварительно проводили титрование бах по сравнению с контролем свидетельствовал о нали­
препарата антител барана к IgG человека в 96-луночных чии связывания комплемента. Степень лизиса эритроци­
круглодонных иммунологических плашках, затем добав­ тов (У) определяли по формуле:
№ 1-2013 75
У (%) = [(X -R )/(H -R ) х 100], нации. Расчеты проводили с использованием данных по
торможению гемагглютинации стандартным раствором IgG
где Н, R и X — величины оптической плотности А412 в ге­
человека. Полученные данные представлены в табл. 1.
молитических системах контрольной пробы, в контроле
спонтанного лизиса ЕА и в опытной пробе соответствен­ Из данных, представленных в табл. 1, следует, что
но. Степень связывания комплемента (ССК) определяли РТГА выявляет IgG во всех пробах ПЭГ-преципитатов,
по формуле: причем наблюдается осаждение IgG в зависимости от
концентрации ПЭГ-3350 в системе. Отсутствие роста
С С К (%) = 100 - У. комплемент связывающей активности ПЭГ-преципита-
Содержание ЦИК-1 в ПЭГ-преципитатах определяли тов при концентрации 6,7% ПЭГ-3350 в пробе свидетель­
по калибровочному графику, как описано в работе [4] и ствует об осаждении нативных (свободных, не связанных
представлены в табл. 1. с антигеном) молекул IgG, которые не связывают компле­
Определение ЦИК, не связывающих комплемент мент морской свинки. Возрастание комплемент связыва­
(ЦИК-2). Ц И К -2 рассчитывали как разность между со­ ющей активности ПЭГ-преципитата, приготовленного в
держанием белка в ПЭГ-преципитате (ЦИКобгц) и условиях от 5% до 6,7% ПЭГ-3350 в системе, возможно,
ЦИК-1. Полученные результаты представлены в табл 1. связано с преципитацией иммунных комплексов, содер­
Из данных, представленных в табл. 1, видно, что при жащих множественно модифицированные липопротеины
концентрации ПЭГ-3350 до 5,0% в системе не наблюдает­ низкой плотности, о чем свидетельствуют холестерин и
ся агрегация и преципитация липопротеинов низкой триглицериды в ПЭГ-преципитатах.
(ЛПНП) и очень низкой плотности (ЛПОНП). Показате­ Для исключения преципитации нативных IgG в
лями преципитации Л П Н П и ЛП О Н П в пробах являются ПЭГ-преципитате, приготовленном в 5% ПЭГ-3350, про­
наличие холестерина и триглицеридов в ПЭГ-преципита- водили тест на гетерофильные антитела (ГА) по гемагглю­
тах, полученных при концентрациях ПЭГ-3350 свыше 5% тинации эритроцитов барана. Данные по выявлению ГА в
в пробе. ПЭГ-преципитатах представлены в табл. 1.
Таким образом, при концентрации 5% ПЭГ-3350 из
К ак видно из этих данных, нативные IgG (гетерофиль­
пулированной сыворотки здоровых доноров наблюдается
ные антитела) начинают преципитировать при концент­
избирательная преципитация циркулирующих иммунных
рации ПЭГ-3350 от 6 % и выше в пробе.
комплексов.
Определение содержания IgG в ПЭГ-преципитате, при­ Определение Ц И К в 5% ПЭГ-преципитатах, приготов­
готовленном в 5% ПЭГ-3350. Приготовление эритроцитов ленных из сыворотки больных И БС и здоровых доноров.
барана, сенсибилизированных гетерофильными антите­ В ПЭГ-преципитатах, приготовленных, как описано в м а­
лами человека (ЕА^) и пределение титра антител барана к териалах и методах, после растворения в 50 мкл буфера-2
IgG человека с использованием, приготовленного иммун­ определяли содержание общего белка с использованием
ного комплекса (ЕАЧ) подробно описано в материалах и набора «Общий белок» фирмы ЗАО «ЭКОлаб» (г.Элект­
методах. Для реакции торможения гемагглютинации рогорск, МО, Россия), а также белок определяли в
(РТГА) использовали разведение 1:8100 (4 ГАЕ) препара­ ПЭГ-преципитате спектрофотометрически при длинах
та антител барана против IgG человека. волн 280 нм и 260 нм и рассчитывали по формуле, опи­
Проведение РТГА. Предварительно титровали преципи­ санной выше. Общий белок в ПЭГ-преципитате пред­
таты иммунных комплексов, разведенных 1:99, на 12 лунок ставлял пул циркулирующих иммунных комплексов
в 96-луночных круглодонных иммунологических плашках. (ЦИКздщ), включающие как комплемент-связывающие
В качестве стандарта использовали препарат IgG с исходной (Ц И К-1), так и не связывающие (Ц ИК-2) иммунные
концентрацией 1 мг/мл. После титрования преципитатов и комплексы. Полученные результаты представлены в
стандартного препарата IgG добавляли равный объем раз­ табл. 2 .
бавленного раствора антител против IgG человека, содержа­ Определение комплемент-связывающих циркулирующих
щего 4 ГАЕ. Тщательно перемешивали и добавляли равный иммунных комплексов (ЦИК-1) в ПЭГ-преципитатах. Ком-
объем 1% суспензии иммунных комплексов (ЕАч), повтор­ племент-связывающие циркулирующие иммунные комп­
но перемешивали и инкубировали в течение 1 ч при ком­ лексы определяли в тесте связывания комплемента, как
натной температуре. После инкубации определяли для каж­ описано выше. Данные содержания ЦИК-1 представлены
дой пробы лунку, где наблюдается торможение гемагглюти­ в табл. 2 .

Таблица 1
Содержание, холестерина, ТАГ, Ц И К 0бщ, ЦИК-1 и Ц И К -2, IgG и гетерофильных антител (ГА)
в ПЭГ-преципитатах, приготовленных из пулированной сыворотки крови здоровых доноров
в зависимости от концентрации ПЭГ-3350
К о н ц е н т р а ц и я П Э Г -3 3 5 0 , % 3 ,3 5,0 6,0 6 ,7 7,1 7 ,5 8,0
Х о л е с те р и н , м г/д л 0 0 3 6 21 42 60
ТАГ, м г/д л 0 0 6 15 31 52 76
Ц И К, м г/м л 0,3 0,5 2,0 4 ,0 5,0 6,0 8,0
Ц И К -1 , м г/м л 0 ,1 3 0 ,3 6 1,23 3 ,5 2 3 ,8 6 3 ,8 6 3 ,8 9
Ц И К -2 , м г/м л 0 ,1 7 0 ,1 4 0 ,7 7 0 ,4 8 1,14 2 ,1 4 4,11
IgG м г/м л 0 ,0 6 0 ,1 2 0 ,2 4 0 ,4 8 0 ,9 6 1,92 3 ,8 4
Т и тр ГА (1 :...) 0 0 4 8 16 32 64

76 ПАТОГЕНЕЗ
Определение Ц И К не связывающих комплемент пулированной сыворотки больных И БС при возрастающих
(ЦИК-2). Ц И К -2 рассчитывали как разность между концентрациях ПЭГ-3350. Эксперименты проводили ана­
ЦИКобщ и Ц И К-1. Полученные результаты представлены логично с контрольной группой, как описано выше. Ре­
в табл. 2. зультаты анализа представлены в табл. 3.
Как видно из табл. 2, в группе здоровых доноров сред­ Из пулированной сыворотки больных ИБС при кон ­
ний уровень ЦИКзбщ составил 0,80+0,12 мг белка в мл центрации 5% ПЭГ-3350 начинают преципитировать мо­
(Биуретовый метод) и 0,72+0,13 мг/мл (спектрофотомет­ дифицированные липопротеины низкой плотности, обла­
рическое определение A2S0/ 260K колебания составили от дающие комплемент-связывающими свойствами. Увели­
0,53 до 1,04 мг/мл. Разница между двумя методами соста­ чение концентрации ПЭГ-3350 выше 5% приводит к пре­
вила 10%. Средний уровень Ц И К ^щ У больных ИБС со­ ципитации преимущественно нативных липопротеинов
ставил 2,13+0,68 мг/мл и 2,14+0,76 мг/мл, соответствен­ низкой плотности. Об этом свидетельствует постоянный
но, при колебаниях от 1,4 до 3,54 мг/мл. Разница между уровень ЦИК-1 с 6% и выше ПЭГ-3350 при возрастании
средними уровнями Ц И К0бт У больных И БС и здоровых уровня холестерина и триглицеридов в преципитате. При
доноров в зависимости от метода определения белка в концентрации 5% ПЭГ-3350 в системе из сыворотки бо­
ПЭГ-преципитате составила 2,7 раза. Более существен­ льных И БС преципитируют циркулирующие иммунные
ные сдвиги наблюдаются, если сравнивать отношение комплексы, содержащие множественно модифицирован­
ЦИК-1 к Ц И К -2 у больных И БС и здоровых доноров, ко­ ные липопротеины, которые связывают систему компле­
торые составили 3,84 и 0,39 соответственно (разница в мента морской свинки.
9,8 раза). Увеличение доли ЦИК-1 в общем пуле ЦИКобщ В представленной работе с целью преципитации Ц И К
у больных И БС свидетельствует о высокой патогенности использован нами впервые ПЭГ-3350 и показано, что
иммунных комплексов. Для выявления природы патоген­ полная агрегация Ц И К наблюдается в условиях 5% ПЭГ в
ности иммунных комплексов у больных И БС был прове­ преципитационной пробе в течение 10 мин и 23°С. Д аль­
ден их анализ. нейшая инкубация преципитационной пробы в течение
Определение холестерина, триглицеридов, ЦИК0дщ, 18 ч при 23°С практически не влияет на уровень определе­
ЦИК-1, Ц ИК-2 в ПЭГ-преципитатах, приготовленных из ния ЦИК. Полученные данные о влиянии хранения сыво­

Таблица 2
Содержания циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови доноров и больных ИБС
Д оноры Ц И К о6щ Ц ИКобщ Ц И К -1 , Ц И К -2 , Б ольные Ц И К (Б и у ­ ЦИК Ц И К -1 , Ц И К -2 ,
(Б и у р е ­ А 2 8 0 /2 6 0 , м г/м л м г/м л ИБС ре то вы й А 2 8 0 /2 6 0 , м г/м л м г/м л
то вы й м е ­ м г/м л м етод ), м г/м л
то д ), м г/м л м г/м л
1 0,6 6 0 ,7 0 4 0,2 0 ,5 0 4 1 2 ,2 8 2,1 2 1,5 0 ,6 2
2 0,8 3 0 ,7 0 4 0,21 0 ,4 9 3 2 1,58 2,01 1,24 0 ,7 7
3 0,8 3 0 ,8 2 5 0 ,1 3 0 ,6 9 5 3 1,58 2 1,62 0 ,3 8
4 1,04 0 ,8 8 7 0 ,1 9 0 ,6 9 7 4 1,4 1,12 0,99 0 ,1 3
5 0,91 823 0 ,1 2 0 ,6 0 3 5 1,87 1,85 1,62 0 ,2 3
6 0,7 5 0 ,7 0 4 0 ,2 2 0 ,4 8 4 6 3 ,5 4 2,3 8 1,58 0,8
7 0,7 5 0 ,5 2 9 0 ,1 4 0 ,3 8 9 7 1,83 1,95 1,65 0,3
8 0,91 0 ,8 8 2 0 ,4 6 0 ,4 2 2 8 2 ,5 2 2 ,7 7 1,8 0 ,9 7
9 0,7 9 0 ,7 0 7 0,1 0 ,6 0 7 9 1,91 1,65 1,44 0,21
10 0 ,8 7 0,8 8 0 ,5 4 0 ,3 4 10 2 ,9 6 3 ,3 7 2,53 0 ,7 4
11 0 ,8 7 0 ,7 0 9 0 ,1 7 0 ,5 3 9 11 1,83 1,59 1,57 0 ,0 2
12 0,7 2 0,7 0 ,2 4 0,4 6 12 1,83 2,01 1,62 0 ,3 9
13 0,5 3 0,4 2 0 ,1 2 0,3 13 1,5 1,24 1,04 0,2
14 0,7 2 0,6 5 0,1 0,5 5 14 3 ,4 5 4 ,0 3 3,8 0 ,2 3
15 0,8 0,6 8 0,11 0 ,5 7 15 1,91 1,96 1,42 0 ,5 4
М ±т 0 ,8 ± 0 ,1 2 0 ,7 2 ± 0 ,1 3 0 ,2 ± 0 ,1 3 0,51 ± 0 .12 М ±т 2 ,1 3 ± 0 ,6 8 2 ,1 4 ± 0 ,7 6 1 ,6 9 ±0 ,6 8 0 ,4 4 ± 0 ,2 9

Таблица 3
Содержание холестерина, ТАГ, Ц И К 0бщ, ЦИК-1 и Ц И К -2 в ПЭГ-преципитатах
пулированной сыворотки крови больных ИБС в зависимости от концентрации ПЭГ-3350
К о н ц е н тр а ц и я П Э Г -3 3 5 0 , % 3 ,3 5,0 6,0 6 ,7 7,1 7 ,5 8,0
Х о л е с те р и н , м г/д л 0 13,7 3 0 ,7 4 9 ,9 7 3 ,0 98 ,8 133,9
ТАГ, м г/д л 0 3 1 ,2 46,1 5 2 ,8 67,0 7 6 ,6 8 7 ,0
ЦИКобщ, м г/м л 2,5 3 ,2 10,6 12,2 12,6 12,9 12,9
Ц И К -1 , м г/м л 0 ,1 3 2 ,1 5 3 ,6 9 3 ,7 3 3 ,8 2 2,9 2 3 ,0
Ц И К -2 , м г/м л 1,37 1,05 6,91 8 ,4 7 8,78 9,9 8 9,9

№ 1-2013 77
ротки при 4°С в течение 7 суток свидетельствуют о незна­ 5. Barnett E.V., Chia D. Quantification of immunoglobulin G in
serum and immune complexes isolated in polyethylene glycol / / Ann.
чительном возрастании Ц И К за счет иммунных комплек­
Rheum. Dis. - 1977. - Vol. 365. - P. 26.
сов, содержащих множественно модифицированные 6. Brandslund I., Siersted H.C., Jensenius J.C., Svenag S.-E. D e­
Л П Н П (данные не приведены). tections and quantitation of immune complexes with a rapid polyethy-
С целью повышения чувствительности теста нами ис­ len glycol precipitation complement consumption method (PEG -CC)
пользована концентрация сыворотки, равная 50% в пре­ / / Methods in Enzymology. - 1981. - Vol. 74, Pt C. - P. 551-571.
7. Creighton W .D., Lambert P.H., Meischer P.A. Detection of an­
ципитационной пробе и для теста определения Ц И К ис­ tibodies and soluble antigen-antibody complexes by precipitation with
пользовали всего 50 мкл сыворотки крови человека. Для polyethylene glycol / / J. Immunol. — 1973. — Vol. 111. —
осаждения агрегированных Ц И К проводили центрифуги­ P. 1219-1227. '
рование в условиях 3100g и 23°С, т.е. при небольших обо­ 8. Digeon М., Laver М., Riza J., Bach J.F. Detection of circula­
ting immune complexes in hum an sera by simplified assays with poly­
ротах. На данном этапе обязательным условием является ethylene glycolet / / J. Immunol. Meth. — 1977. — Vol. 16. —
поддержание постоянной температуры при центрифуги­ P. 165-183.
ровании. 9. Glikmann G., Svehag S.E. Detection and quantitation of circula­
С целью анализа ПЭГ-преципитата были определены: ting immune complexes by the Clq-protein A binding assay (Clq-PA-
BA) / / Methods Enzymol. - 1981. - Vol. 74. - P. 571-587.
1) наличие IgG в ТТГА; 10. H achC .E ., Erenberg-BelmerA.J.M., Hannema A.J. etal. Poly­
2) отсутствие ЛП О Н П и Л П Н П в ПЭГ-преципитатах, ethylene glycol enhaces the binding of C lq to circulating immune com­
приготовленных из пулированной сыворотки крови здо­ plexes / / J. Immunol. Meth. - 1981. - Vol. 44. - P. 211-221.
ровых доноров; 11. H arkissG .D ., Brown D.L. Detection of immune complexes by
a new assay, the polyethylene glycol precipitation-complement con­
3) отсутствие свободных гетерофильных антител в тес­
sumption test (PEG -CC) / / Clin. Exp.Immunol. — 1979. — Vol. 36.
те гемагглютинации с эритроцитами барана; - P. 117-129.
4) уровень ЦИКобщ определяли двумя независимыми 12. Klein M, Simonovitch K. The significance and limitation of
тестами (Биуретовая реакция и спектрофотометрия current methods for detecting immune complexes / / J. Reumatol. —
1981. - Vol. 8. - 188-192.
A 2S0/ 260); 13. Krapf F., Renger D., Schedel et al. A PEG-precipitation laser
5) определение уровня Ц И К-1 в тесте связывания nephelometer technique for detection and characterization of circula­
комплемента морской свинки; ting immune complexes in h u m an sera / / J. Immunol. Meth. — 1980.
6 ) расчет Ц И К-2, как разность между ЦИКобщ и - V o l . 54. - P. 107-117.
ЦИК-1; 14. Lambert P.H., Dixon F.J., Zubler R.H. et al. A WHO collabo­
rative study for the evaluation of eighteen methods for detecting im ­
7) патогенность Ц И К расчитывали как отношение mune complexes in serum / / J. Clin. Lab. Immunol. — 1978. —
ЦИК-1 к ЦИК-2. P. 1-15.
Таким образом, способ позволяет повысить точность 15. Mod A., Fust G., Hollan S. Characterization of circulating im ­
количественного определения Ц И К в сыворотке крови. mune complexes by nephelometry in acute leukaemia / / Clin. Lab.
Haematol. - 1982. - Vol. 16, №4(2). - P. 139-147.
Доступность реагентов и простота теста определения па­ 16. Mooney N.A., Hay F.C., Poulton T.A. A comparative study of
тогенных Ц И К в лабораторной практике позволяет про­ complement components in polyethylene glycol precipitated immune
водить углубленное исследование патогенеза хронических complexes from patients with ovarian cancer and patiens with rheum a­
заболеваний, сопровождающихся повышенным уровнем toid arthritis / / Clin. Exp. Immunol. — 1983. — Vol. 52. —
P. 561-568.
Ц И К в крови. С другой стороны, определение уровней 17. Poison A., Potgieter G .H ., Largier J.F. et al. The fractionation
ЦИК-1 и Ц И К -2 позволит контролировать эффектив­ of protein mixtures by linear polymers of high molecular weight / / Bi­
ность проводимой терапии при аутоиммунных и опухоле­ ochim. Biophys. Acta. — 1964. — Vol. 82. — P. 463-472.
вых заболеваниях. 18. Report o f IU IS/W HO working group. Use and abuse of labo­
ratory tests in clinical immunology: critical considerations of eight wi­
dely used diagnostic procedures / / Clin. Exp. Immunol. — 1981. —
Vol. 46. - P. 662-674.
19. Shoibonov B.B., Osipov A.V., Kryukova E.V. et al. Oxiagin
from the Naja oxiaNa cobra venom is the first reprolysin inhibiting the
Список литературы classical pathway o f complement / / Mol. Immunol. — 2005. —
1. Меньшиков В.В., Делеторская JI.H., Золотницкая Р.П. и Vol. 42. - P. 1141-1153.
др. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник 20. Theofilopoulos A.N., Aduado M.T. Assays for the detection of
/ Под ред. В.В. Меньшикова. — М.: Медицина, 1987. — 368 с. complement-fixing immune complexes: Raji cells, conglutinin, and
2. Фримель Г. Иммунологические методы. — М.: Медицина, anti-C3 assays / / Rose N .R , Friedman H., Fahey J.L., Eds. Manual
1987. - С. 120-128. of clinical laboratory immunology. — Washington D.C: ASM, 1992. —
3. Ш ойбонов Б.Б., Борголов В.М., Баронец В.Ю. и др. P. 104-109.
Тест-система определения циркулирующих иммунных комплек­ 21. Vanham G., Bloemmen F.J., Ceuppens J.L., Stevens E.A.M.
сов / / Описание изобретения к патенту №2452962 от 10.06.2012 г. Influens of complex size and antigen-antibody ratio on immune com p­
Бюл.№16. lex detection with monoclomal rheumatoid factor and C lq / / J. Clin.
4. Ш ойбонов Б.Б., Борголов В.М., Сониев В.М. и др. Моди­ Lab. Immunol. - 1984. - Vol. 15. - P. 63-68.
фицированный метод определения Ц И К в тесте связывания 22. UCLA Conference Circulating immune complexes: their im-
комплемента ПЭГ-прецитатом / / Клиническая лабораторная munochemistry, detection and importance / / Ann. Int. Med. — 1979.
диагностика. — 2007. — №5. — С. 29-35. - Vol. 91. - P. 430-440.

78 ПАТОГЕНЕЗ
Method for determining circulating immune complexes
Shoibonov B.B.1’2’3, Baronets V.Yu.1’2, Panchenko L.F.1,2, Kubatiev A.A.1
1 - Institute of General Pathology and Pathophysiology RAMS, Russia, 125315, Moscow, Baltiiskaya str., 8
2 - National Research Center for Addictions Russian Ministry of Public Health, Moscow, Russia
3 - Anokhin Institute of Normal Physiology, RAMS, Moscow, Russia

There has been developed a sim ple m ethod fo r determ ining circulating im m une com plexes (CIC), based on
th e ir p recipitation from human serum in a special b u ffe r containing 10% polyethylene g lycol mol. w eight 3350
(PEG-3350). We add human serum to an equal volume o f b u ffe r containing 10% PEG-3350, incubated fo r 10 min
a t room tem perature. CIC aggregated by centrifugation, are dissolved in b u ffe r w ithout PEG-3350, and we d e te r­
m ine the total level o f the CIC o r by sp ectrophotom etry a t 280 nm and 260 nm, o r the determ ination o f protein in
the p re cip ita te is p erform ed according to the m ethod o f Lowry. The m ethod improves the accuracy o f the q uanti­
tative determ ination o f both general (CICtot) and com plem ent-binding (CIC-1) and non-binding (CIC-2) c irc u la t­
ing im m une com plexes in human serum. P athogenicity o f the CIC is calculated as the ratio o f the C IC -1 to CIC-2.
Key words: c irc u la tin g im m une com plexes, p olye th yle n e g ly c o l 3350, co m p le m e n t system , p a th o g e n ic ity
o f the CIC

№ 1-2013 79

Оценить