A continuación se hace un gradiente de disolvente para pasar progresivamente de esta fase a la fase

eluyente y, de la misma forma, dejar que la columna se equilibre a razón de 0,2 ml/min durante 1 noche
o de 1 ml/min durante 3 horas.

Inyectar 10 veces 20 µl de la solución de prueba.

Caso de una columna previamente activada

Después de una serie de análisis, la columna se almacena en agua/metanol (50/50).

Nunca dejar en la fase eluyente.

Hacer un gradiente de disolvente para pasar progresivamente de esta fase de almacenamiento a la fase
eluyente y dejar que la columna se equilibre a razón de 0,2 ml/min durante 1 noche o de 1 ml/min
durante 3 horas.

Inyectar 3 veces 20 µl de la solución de prueba.

Con el fin de asegurar la estabilización de la columna, esta prueba se debe efectuar cada vez que se
inicia una nueva serie de análisis, cada vez que se modifique la temperatura del horno de columna o
cuando se cambie de fase eluyente.

7.2 Prueba de aptitud

La solución de la prueba de aptitud corresponde a 0,1% (masa/volumen) de vinorelbina, 0,001%

(masa/volumen) de 4-0-diacetilvinorelbina y de SD6 en medio acuoso. La misma cumple con las
especificaciones estipuladas en la publicación PM259TRC/31PF03 (edición en curso).

La solución de la prueba de aptitud se debe conservar congelada a -15ºC. Después de la

descongelación, permanece estable 1 semana a 5ºC ± 3ºC y 1 día a temperatura ambiente.

Después de haber estabilizado las condiciones cromatográficas, se efectúan los ensayos de la siguiente
forma:

Inyectar 20 µl de la solución de la prueba de aptitud. Si es necesario, se ajusta la temperatura de la

columna para que el pico principal (vinorelbina) esté comprendido entre los 12,5 y 14,5 min.

Inyectar 20 µl de la solución de la prueba de aptitud 3 veces.

Resultados:

Los cromatogramas deben presentar 3 picos en el siguiente orden: SD6 – vinorelbina y

diacetilvinorelbina
− El coeficiente de variación del tiempo de retención en las 3 inyecciones debe ser inferior o
igual a 1% e inferior o igual a 1,5% para las 10 inyecciones para los 2 picos (Vinorelbina y
diacetilvinorelbina)
− El coeficiente de variación del área del pico de vinorelbina debe ser inferior o igual a 1% sin
importar el número de inyecciones
 − El factor de separación, expresado como la relación del factor de capacidad de la
diacetilvinorelbina y el factor de capacidad de la vinorelbina, entre la diacetilvinorelbina y
la vinorelbina debe ser superior o igual a 1,1 con factor de capacidad:

tr - t0
k' = ---------
t0

Donde tr = el tiempo de retención calculado a partir de la inyección hasta el máximo de los picos
t0 = el tiempo de retención de un producto no retenido en la columna (como los disolventes)

7.3 Soluciones de referencia

7.3.1 Estándar de referencia

El tartrato de vinorelbina estándar de referencia cumple con las especificaciones de las

publicaciones de la Pharmacopée Européenne (Farmacopea Europea) y de la USP (Farmacopea de
Estados Unidos).

El estándar de referencia se almacenó congelado a -15ºC.

7.3.2 Soluciones de referencia

Preparar 2 soluciones de referencia independientes: disolver 70 mg de vinorelbina
tartrato estándar de referencia (correspondientes a 50 mg de base pura) pesados exactamente en 25 ml
de API en un matraz aforado de 50 ml. Llenar hasta los 50 ml con API. A continuación, diluir 10 ml de
esta solución en un matraz de 100 ml. Completar con API.

Se obtiene una solución de referencia que contiene 0,100 mg/ml de vinorelbina base.

Inyectar 16, 18, 20, 22 y 24 µl de las soluciones de referencia para obtener la calibración correcta.

7.4 Dosificación

a) Soluciones de ENSAYO

Diluir 1,0 ml de NAVELBINE inyectable en 100 ml de API. Preparar 3 soluciones independientes

por lote.

b) Procedimiento

Inyectar 20 µl de las soluciones de ENSAYO y registrar el cromatograma en 20 minutos.

Intercalar soluciones de referencia y soluciones de ENSAYO.

c) Resultados

Identificación del tartrato de Vinorelbina

El tiempo de retención y el espectro UV del pico principal del cromatograma del ensayo obtenido
con el detector UV de fotodiodos corresponden al tiempo de retención y al espectro UV del pico
principal del cromatograma del estándar de referencia.
 Cálculo del contenido en Vinorelbina

Utilizando el factor de dilución, la recta de regresión obtenida mediante el método de mínimos

cuadrados aplicado a las áreas de los picos de Vinorelbina y de los contenidos corregidos de la
sustancia de referencia, calcular el contenido promedio resultante de los valores de las tres
diluciones independientes.

Este resultado se valida con un coeficiente de correlación igual o mayor a 0,995 y un coeficiente
de variación en los tres valores inferior a 1%.

8. IMPUREZAS

Se miden por cromatografía de líquidos bajo las condiciones descritas en la sección 7 y de acuerdo con
la prueba de aptitud descrita en la sección 7.2.

8.1 Muestra sobrecargada

Solución de muestra sobrecargada: corresponde a una solución que contiene 0,1%
(masa/volumen) de tartrato de vinorelbina en agua y 0,0001% (masa/volumen) de las siguientes
impurezas alcaloides: 18'-epi-vinorelbina, leurosina, C'-norleurosina, 3',4'-anhidrovinblastina, 17-
bromovinorelbina, 6'-N-oxivinorelbina, 6'-N-metilvinorelbina, 23-0-dimetilvinorelbina, S/D6 y 4-0-
diacetilvinorelbina de acuerdo con las especificaciones de la publicación acerca de la solución de
muestra sobrecargada (código: PM259COC-31MM04: edición en curso).

Se conservará esta solución congelada a -15ºC. Permanece estable 1 semana a 5ºC ± 3ºC y 1 día a
temperatura ambiente después de la descongelación.

8.2 Solución de referencia

Diluir 1 ml de solución estándar de referencia descrita en la sección 7.3 que corresponde a 0,1 mg de
vinorelbina base en 50 ml de API y después diluir 1 ml de esta solución en 10 ml de fase móvil. Se
obtiene una solución con 0,2 µg/ml de vinorelbina base. Esta solución se utiliza para verificar el límite
de detección y establece el área mínima para descartar.

8.3 Ensayos

Diluir 1 ml de NAVELBINE en 10 ml de fase móvil. Preparar 2 soluciones independientes por lote.

8.4 Procedimiento

Inyectar 20 µl de la solución de referencia y verificar que la altura del pico de vinorelbina es tres veces
superior a la del ruido de fondo (eventualmente ajustar el volumen inyectado).

Inyectar 20 µl de la solución de muestra sobrecargada.

Inyectar 20 µl de las soluciones de ensayo.

Registrar los cromatogramas durante 35 minutos y comenzar con la integración inmediatamente

después de la perturbación del disolvente.
8.5 Resultados

Informar los resultados expresados en porcentaje relativo de área o:

− se anota el tiempo de retención relativo por cada sustancia afín inyectada,

− el pico de Vinorelbina es superior al 97,5% del área total del cromatograma.

Área de Vinorelbina
Pico de Vinorelbina % = ------------------------------------
Área total

El pico de cada sustancia afín está expresado en porcentaje relativo en relación con el área total.

Área de la sustancia afín individual

Pico de la sustancia afín % = -------------------------------------------------------
Área total

Los cálculos se presentarán en tablas idénticas a las presentadas en este anexo.

9. OBSERVACIONES SOBRE LAS CONDICIONES OPERATIVAS

Sugerencias de modificaciones de las condiciones instrumentales que permiten encontrarse entre los
límites requeridos para la prueba de aptitud del sistema: la molaridad del contra-ion no debe estar por
debajo de 0,005 M para asegurar una buena separación entre la 4-0-diacetilvinorelbina y la vinorelbina.
Esta separación se puede mejorar disminuyendo la temperatura de la columna.

Las muestras de NAVELBINE inyectable se deben almacenar a 5ºC ± 3ºC, protegidas de la luz.

Las soluciones de referencia y de ensayo permanecen estables 4 días a 5ºC ± 3ºC y 1 día a temperatura
ambiente protegidas de la luz.

Se lavarán y almacenarán las columnas en fase de lavado.

10. MODIFICACIONES

§ 3: eliminar “y/o sub-lote”.

§ 5: pH a 25ºC ± 2ºC en lugar de 20ºC.
Adjuntar un anexo.
 Página 14

VOLÚMENES EXTRAÍBLES

NAVELBINE

Nº DE LOTE:....................

1. DENSIDAD

Masa picnómetro: ….........

Masa picnómetro + NAVELBINE: …......... Tiquete de pesada
Masa picnómetro + agua: …..........

Densidad relativa = ….......................................

Densidad absoluta =

2- VOLÚMENES EXTRAÍBLES

Tiquete de pesada
Nº FRASCO MASA EXTRAÍBLE (g) VOLUMEN EXTRAÍBLE (ml)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

VOLUMEN EXTRAÍBLE PROMEDIO= ….............................

CV = ...…..........................
 página 15

Conteo de partículas(según la (788-SVI) de la USP, edición en curso)

Producto: …......................................................
Fecha del análisis: …........................................
Número de lote: …...........................................
Número de control: ….....................................
Cantidad: …....................................................

Blanco

5 conteos
Suma de los 5 conteos

Partículas Resultados Norma Conclusión

≥ 10 μ ….............. ≤25 ….......................

Ensayo

4 conteos
1ero no contado más el promedio de los 3
Fórmula de cálculo: …................................................................................

Partículas Conteo del ensayo Norma Conclusión

≥ 10 μ ….............. ≤ 6000/continente ….......................

≥ 25 μ ….............. ≤ 600/continente ….......................
 página 16

FASE ELUYENTE DE NAVELBINE

TAMPÓN pH 4,2 (….......................................litros)

…............................................g de sodio di-hidrogenofosfato

PROLABO ref. 28015294 lote...........................................

Se adicionan ….................................... ml de agua PI y se ajusta a un pH de 4,2 con

el ácido ortofosfórico diluido al 1/50 º (C..............................p .....................................)

Se completa hasta …............................. con el agua PI

Caducidad: ….....................................

FASE ELUYENTE (….............................. litros)

…........................................ g de ácido decano-1-sulfónico (sal sódica)

SIGMA ref. D3412 lote ….......................................

Se adicionan:

…................................. x 380 ml de tampón pH 4,2 y

…..................................x 620 ml de metanol
PROLABO ref. 20834325 lote …...............................

Caducidad: ….......................................
 página 17

IDENTIFICACIÓN Y DOSIFICACIÓN DEL TARTRATO DE VINORELBINA POR HPLC

1. MÉTODO

Cadena HPLC: …......................................................

Columna nº: …..........................................................
Temperatura del horno: …........................................
Presión: …................................................................
Fase eluyente: …......................................................

2. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES

Muestra 1:
mg de sustancia de referencia: …........................................
Tubo: …............................de ….......................................
Analizada el: ….................................................................
Título equivalente (tartrato/base): …....................................
Qsp 50 ml API después de la dilución = 10 ml de esta
solución qsp 100 ml de API

Muestra 2:
mg de sustancia de referencia: …........................................
Tubo: …............................de ….......................................
Analizada el: ….................................................................
Título equivalente (tartrato/base): …....................................
Qsp 50 ml API después de la dilución = 10 ml de esta
solución qsp 100 ml de API

ENSAYOS:
3 ensayos independientes mínimo por lote ó 1 ensayo por
sub-lote.

Cada ensayo se inyecta 1 vez ----> 1 ml de solución para

analizar qsp 100 ml de API.
 Página 18

3. CÁLCULOS DE CONCENTRACIONES

…............................................................
[T1] = ----------------------------------------------------- =
….............................................................

…............................................................
[T2] = ----------------------------------------------------- =
….............................................................

4. CALIBRACIÓN GAMMA

Volumen inyectado en μl 16 18 20 22 24
[T1] en mg/ml
[T2] en mg/ml

5. FACTOR DE DILUCIÓN

= 100

6. SOLUCIÓN DE PRUEBA

Nº de lote: …......................................................

UT. AV.: ….........................................................

 página 19

IDENTIFICACIÓN Y DOSIFICACIÓN DEL TARTRATO DE VINORELBINA POR HPLC

6. PRUEBA DE LA COLUMNA

VINORELBINA DIACETILVINORELBINA
tR (min) AUC tR (min)

Prueba 1
Prueba 2
Prueba 3
Promedio
CV ≤ 1 %

FACTORES DE CAPACIDAD

tR – t0
k' = ------------------
t0

Vinorelbina: k' V = ….................................................................

Diacetilvinorelbina: k' D = …......................................................

FACTOR DE SEPARACIÓN

K' D
DIACETILVINORELBINA/VINORELBINA = -------------------------- = …................................... ≥ 1,1
k' V
 página 20

IDENTIFICACIÓN Y DOSIFICACIÓN DEL TARTRATO DE VINORELBINA POR HPLC

6. PRUEBA DE LA NUEVA COLUMNA

VINORELBINA DIACETILVINORELBINA
tR (min) AUC tR (min)

Promedio

CV < 1% para AUC

CV < 1,5% para tR
 página 21

SUSTANCIAS AFINES

MUESTRA Tiempo de retención (min) % de área TRR

18'EPIVINORELBINA
SULFATO DE LEUROSINA
C'-NORLEUROSINA
ANHIDROVINBLASTINA
SD6
VINORELBINA
DIACETILVINORELBINA
17 BROMOVINORELBINA
 página 22

SUSTANCIAS AFINES

ENSAYO 1 ENSAYO 2
LOTE Nº T. de ret. (min) % de área TRR T. de ret. (min) % de área TRR
18'EPIVINORELBINA+6'-N-OXIDEVINORELBINA
LEUROSINA+6'-N-METILVINORELBINA
C-' NORLEUROSINA+23-0-DIMETILVINORELBINA
ANHIDROVINBLASTINA
SD6
VINORELBINA
DIACETILVINORELBINA
17 BROMOVINORELBINA

% de área de VINORELBINA
% de área de IMPUREZAS IDENTIFICADAS
% de área de IMPUREZAS NO IDENTIFICADAS
% de área de IMPUREZAS TOTALES