А ВТОРЕФЕРА Т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2010
2
Научный руководитель:
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Абрамова Тамара Федоровна
Ведущая организация:
Ученый секретарь
Диссертационного совета Пономарева А. Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Важнейшими составляющими спортивной успешности,
являются физическая подготовленность и адаптация спортсменов к мышечным
нагрузкам на всех этапах спортивной деятельности. Современный спорт требует
невероятно высоких результатов на грани физических возможностей человека,
вследствие чего организм подвергается большому количеству стрессовых факторов:
гипоксия, гипертермия, оксидативный стресс, воспаление и повреждение, изменение
концентрации кальция и аденозинтрифосфата (Benjamin I.J., 1998; Whithman M., 2008),
поэтому так необходим индивидуальный подход к тренировочному процессу и более
детальный мониторинг спортсменов, как в тренировочный, так и в восстановительный
период.
Физические нагрузки являются сигналом для активации семейства белков
теплового шока (БТШ). Они ответственны за сворачивание синтезированных
полипептидов, предотвращение денатурации белков, их агрегацию и необходимы
клетке для обеспечения механизмов адаптации и предотвращения апоптоза (Soufi F.G.,
2008).
Наиболее изученным является белок с молекулярным весом 70кДа (БТШ70). Он
является внутриклеточным белком, но в ответ на оксидативный стресс, повышение
температуры, воспаление или физиологический стресс, его концентрация стремительно
возрастает и в крови (Сахаров Д.А., 2009). БТШ70 – АТФ-связывающий белок,
обладающий АТФазной активностью. АТФ- связывающая форма белка имеет низкое
сродство к денатурированному белку, в то время как АДФ форма наоборот прочно
связывается с поврежденным белком. Поэтому изменение АТФазной активности может
оказывать влияние на защитную функцию БТШ70.
Недавно был обнаружен БТШ70-связывающий белок - СБ1. Он является
кошапероном БТШ70 и фактором нуклеотидного обмена. Взаимодействие СБ1 с
АТФазным доменом БТШ70, влечет за собой конформационные изменения последнего,
в результате чего происходит инактивация БТШ70-зависимого фолдинга белков
(Raynes D.A., 1998). Также было показано, что после запуска механизма секреции
внеклеточных белков, шаперона БТШ70 и его кошаперона СБ1, происходит активация
рецептора ЭФР (эпидермальный фактор роста), который регулирует рост и
пролиферацию клеток. Возможно данная СБ1/БТШ70 зависимая активация рецептора
может служить защитным механизмом для клеток в стрессовых условиях (Medvedeva
M.A., 2009).
4
Организация исследования
На первом этапе работы была задача получить аффинные поликлональные
антитела кролик и моноклональные антитела мыши направленные против
рекомбинантного белка СБ1 человека.
На втором этапе была разработана иммунохимическая тест-система,
позволяющая определять уровень СБ1 в сыворотке человека.
На третьем этапе были определены концентраций СБ1/БТШ70 и проведен
анализ экспрессии мРНК СБ1/БТШ70 в лейкоцитах крови спортсменов до и после
нагрузочного тестирования со ступенчато повышающейся мощностью.
На четвертом этапе проводили оценку концентраций СБ1 и БТШ70 в
сыворотке спортсменов в подготовительный период и исследовали уровень
аутоиммунных антител к изучаемым белкам в сыворотке спортсменов.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение антител, направленных против рекомбинантного человеческого
белка СБ1
Рекомбинантный человеческий белок СБ1, были любезно предоставлен
проф. Л.П. Сащенко (Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена,
Москва, Россия). Рекомбинантный человеческий белок БТШ70 был любезно
9
Уникальность этой методики в том, что она позволяет наносить на гель весь
сконцентрированный белок без потерь.
Далее образцы из геля переносили на мембрану из поливиниледенфторида
(ПВДФ) методом полусухого переноса. Иммуноблоттинг проводили с
моноклональными и аффинно-очищенными поликлональными антителами к
рекомбинантному белку СБ1.
Моноклональные антитела в иммуноблоттинге как с рекомбинантным белком,
так и с нативным, содержащимся в сыворотке, дают слабый специфический сигнал.
Возможно, это объясняется тем, что моноклональные антитела имеют
конформационный эпитоп, который при денатуриции белка в иммуноблоттинге
деформируется, тем самым влияет на аффинность антител.
Взаимодействие поликлональных антител с человеческим белком СБ1 (Рис.1).
1 2 3 4
А)
Б)
Рис. 1. Определение СБ1 в сыворотке крови человека. А) 1 - взаимодействие
поликлональных антитела с сывороточным белком СБ1; 2-4- взаимодействие
поликлональных антител с рекомбинантным белком, калибровка: 0,5 нг/мл, 5нг/мл, 20
нг/мл. Б) Калибровочный график после оцифровки.
24 2 ,2
22 2 ,0
20 1 ,8
Концентрация БТШ70, нг/мл
18
1 ,6
16
1 ,4
14 до до
1 ,2
12 после после
1 ,0
10
0 ,8
8
0 ,6
6
4 0 ,4
2 0 ,2
0 0 ,0
А) Б)
2 ,4
2 ,2
Кратность изменения экспрессии
2 ,0 Л ы ж н ы е го н ки
А ка д е м и ч е с ка я гр е б л я
1 ,8
1 ,6
1 ,4
1 ,2
1 ,0
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0 ,0
HSPA1A HSPBP1
3 ,0
2 ,5
Концентрация СБ1, нг/мл
2 ,0
1
2
1 ,5
1 ,0
0 ,5
0 ,0
А Б
30
25
10
0
А Б
3 ,0
2 ,5
1 ,0
0 ,5
0 ,0
А Б
25
Концентрация БТШ70, нг/мл
20
1
2
15
10
0
А Б
1000
600
400
200
0 ,8 1 ,0 1 ,2 1 ,4 1 ,6 1 ,8 2 ,0 2 ,2 2 ,4 2 ,6 2 ,8
К о н ц е н т р а ц и я С Б 1 , н г/м л
А)
1000
Концентрация аутоантител, нг/мл
800
600
400
200
0
0 ,8 1 ,0 1 ,2 1 ,4 1 ,6 1 ,8 2 ,0 2 ,2 2 ,4 2 ,6 2 ,8
К о н ц е н т р а ц и я С Б 1 , н г /м л
Б)
Рис. 8. Корреляция между базальной концентрацией СБ1 и его аутоантител в
сыворотке спортсменов. А – Лыжные гонки (r2= 0,62; p <0,02). Б – Академическая
гребля (r2= 0,80; p <0,002).
ВЫВОДЫ
1. Получены поликлональные аффинно-очищенные антитела кролика против
рекомбинантного кошаперона СБ1 человека, специфично
взаимодействующие как в ИФА так и в иммуноблотинге.
2. Разработана иммунно-аффинная тест-система на основе поликлональных
антител, которая позволяет определять концентрацию СБ1 в сыворотке
человека и использовать для мониторинга функционального состояния
спортсмена.
3. Показано, что кратковременный высокоинтенсивный стресс не вызывает
изменения экспрессии мРНК СБ1 в лейкоцитах и концентрации СБ1 в
сыворотке.
4. Показано, что длительные физические нагрузки приводят к изменению
концентрации СБ1 и БТШ70, направленность изменений зависит от уровня
подготовленности спортсменов. У более подготовленных наблюдается
увеличение базальной концентрации СБ1 (2,5±0,6 нг/мл) и в тоже время
уменьшение концентрации БТШ70 (11,3±4,6 нг/мл), у менее подготовленных
концентрация СБ1 не изменяется (1,2±0,2 нг/мл), а концентрация БТШ70
увеличивается (19,2±5,6 нг/мл).
5. Разработана тест-система, позволяющая определять уровень аутоантител к
СБ1 в сыворотке человека. Показано, что в конце тренировочного периода
появляется корреляция между концентрацией СБ1 и его аутоантителами,
свидетельствующая о приспособлении организма к изменениям
концентрации белков в течение тренировочного периода.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. При оценке функционального состояния организма следует учитывать, что к
предсоревновательному периоду уровень СБ1 у более подготовленных
спортсменов должен быть выше 2 нг/мл, при концентрации БТШ70 ниже 15
нг/мл, у менее подготовленных концентрация СБ1 менее 1,5 нг/мл, а
концентрация БТШ70 более 15 нг/мл. Мониторинг этих показателей на
регулярной основе может быть рекомендован к применению в образовательных
учреждениях спортивного профиля и в медицинских центрах сборных команд
для оценки функциональных резервов спортсменов, активации молекулярных
23