Вы находитесь на странице: 1из 23

На правах рукописи

Гребенюк Екатерина Сергеевна

КОШАПЕРОН БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА – МАРКЕР АДАПТАЦИИ


ВЫСОКОКВАЛИФИЦИРОВАННЫХ СПОРТСМЕНОВ К ФИЗИЧЕСКОЙ
НАГРУЗКЕ

14.00.51 - восстановительная медицина, лечебная физкультура и спортивная


медицина, курортология и физиотерапия

А ВТОРЕФЕРА Т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук

Москва – 2010
2

Работа выполнена в лаборатории молекулярной физиологии Федерального


Государственного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт
физической культуры и спорта

Научный руководитель:

доктор биологических наук, член-


корреспондент РАН
Тоневицкий Александр Григорьевич

Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Абрамова Тамара Федоровна

кандидат биологических наук


Трофимов Дмитрий Юрьевич

Ведущая организация:

Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии Департамента


здравоохранения г.Москвы

Защита диссертации состоится « » 2010 в на заседании диссертационного


совета Д.311.002.01 при Федеральном Государственном учреждении Всероссийский
научно-исследовательский институт физической культуры и спорта по адресу: 105005,
Москва, Елизаветинский пер., 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального Государственного


учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт физической культуры
и спорта

Автореферат разослан « » ____________ 2010 г.

Ученый секретарь
Диссертационного совета Пономарева А. Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Важнейшими составляющими спортивной успешности,
являются физическая подготовленность и адаптация спортсменов к мышечным
нагрузкам на всех этапах спортивной деятельности. Современный спорт требует
невероятно высоких результатов на грани физических возможностей человека,
вследствие чего организм подвергается большому количеству стрессовых факторов:
гипоксия, гипертермия, оксидативный стресс, воспаление и повреждение, изменение
концентрации кальция и аденозинтрифосфата (Benjamin I.J., 1998; Whithman M., 2008),
поэтому так необходим индивидуальный подход к тренировочному процессу и более
детальный мониторинг спортсменов, как в тренировочный, так и в восстановительный
период.
Физические нагрузки являются сигналом для активации семейства белков
теплового шока (БТШ). Они ответственны за сворачивание синтезированных
полипептидов, предотвращение денатурации белков, их агрегацию и необходимы
клетке для обеспечения механизмов адаптации и предотвращения апоптоза (Soufi F.G.,
2008).
Наиболее изученным является белок с молекулярным весом 70кДа (БТШ70). Он
является внутриклеточным белком, но в ответ на оксидативный стресс, повышение
температуры, воспаление или физиологический стресс, его концентрация стремительно
возрастает и в крови (Сахаров Д.А., 2009). БТШ70 – АТФ-связывающий белок,
обладающий АТФазной активностью. АТФ- связывающая форма белка имеет низкое
сродство к денатурированному белку, в то время как АДФ форма наоборот прочно
связывается с поврежденным белком. Поэтому изменение АТФазной активности может
оказывать влияние на защитную функцию БТШ70.
Недавно был обнаружен БТШ70-связывающий белок - СБ1. Он является
кошапероном БТШ70 и фактором нуклеотидного обмена. Взаимодействие СБ1 с
АТФазным доменом БТШ70, влечет за собой конформационные изменения последнего,
в результате чего происходит инактивация БТШ70-зависимого фолдинга белков
(Raynes D.A., 1998). Также было показано, что после запуска механизма секреции
внеклеточных белков, шаперона БТШ70 и его кошаперона СБ1, происходит активация
рецептора ЭФР (эпидермальный фактор роста), который регулирует рост и
пролиферацию клеток. Возможно данная СБ1/БТШ70 зависимая активация рецептора
может служить защитным механизмом для клеток в стрессовых условиях (Medvedeva
M.A., 2009).
4

Известно, что физическая нагрузка приводит к увеличению концентрации


БТШ70 (Locke M., 2002). Но как происходит дальнейшая регуляция СБ1/БТШ70 в
организме спортсменов и взаимосвязь адаптационной реакции с концентрацией белка
СБ1 в крови в период тренировочного процесса не известно.
Все вышеизложенное актуализирует разработку новых специфических
критериев адаптационных реакций и изучение связи между подготовленностью
спортсмена и изменением концентрации стрессорных белков СБ1/БТШ70 в сыворотке
в периоды интенсивных нагрузок.
Гипотеза. Предполагается, что во время физических нагрузок в организме
активируется ауторегуляторный механизма секреции БТШ70. Изменение экспрессии
мРНК и концентрации БТШ70 в крови, ведет к увеличению концентрации его
кошаперона СБ1. Вероятно, СБ1 может быть одним из белков, регулирующих активные
формы БТШ70, циркулирующих в сыворотке крови. Таким образом, он является
специфичным маркером адаптационных реакций организма. Исследование новых
белков-маркеров стресса и изучение их регуляции иммунохимически и на уровне
транскрипции позволит приблизиться к пониманию механизмов адаптации
спортсменов к физическим нагрузкам.
Цель исследования. Изучение изменения экспрессии мРНК СБ1 и БТШ70, и
концентраций этих белков в сыворотке у высококвалифицированных спортсменов в
процессе адаптации к физическим нагрузкам.
Задачи исследования:
1. Получить моноклональные и аффинные поликлональные антитела
против человеческого рекомбинантного белка СБ1;
2. Разработать тест-систему определения концентрации СБ1 в сыворотке
крови человека;
3. Проанализировать экспрессию мРНК гена СБ1 в лейкоцитах крови
спортсменов;
4. Провести оценку уровня концентраций СБ1 и БТШ70 в крови, во
время тренировочного периода;
5. Разработать тест-систему, позволяющую определять уровень
аутоантител к СБ1 в сыворотке человека. Определить уровень
аутоиммунных антител против СБ1 и БТШ70 в сыворотке
спортсменов.
Объект исследования. Процессы молекулярно-биохимической адаптации
организма спортсменов во время тренировочного периода.
5

Предмет исследования. Система регуляции белка теплового шока и его


кошаперона.
Научная новизна. Новизна работы состоит в исследовании изменения
концентраций маркера адаптации СБ1 под влиянием физических нагрузок.
Разработана иммуноаффинная методика определения кошаперона СБ1 в
сыворотке человека. С использованием разработанной тест-системы, впервые были
получены данные о динамике изменения концентрации СБ1 у спортсменов в начале и в
конце подготовительного периода. Впервые было показано, что кратковременный
высокоинтенсивный стресс не вызывает изменения экспрессии и концентрации СБ1 в
сыворотке на фоне увеличения экспрессии и концентрации БТШ70. Обнаружена
корреляция между кошапероном СБ1 и его аутоантителами. Впервые было показано,
что при увеличении концентрации СБ1, концентрация БТШ70 в сыворотке
уменьшается и установлена взаимосвязь концентраций этих белков в сыворотке с
подготовленностью спортсменов. У более подготовленных спортсменов к
предсоревновательному периоду уровень БТШ70 снижается и выходит на базальный
уровень, в то время как уровень СБ1 повышается, что вероятно говорит об адаптации
организма к стрессовым нагрузкам.
Научно-практическая значимость. Данные исследования направлены на
изучение фундаментальных основ процессов жизнедеятельности и восстановления
организма на молекулярном уровне, изучение белков-маркеров стресса и изменений,
происходящих под воздействием стрессовых условий. Материалы исследования могут
быть использованы в научно-исследовательских центрах медико-биологического
профиля, в высших учебных заведениях.
Разработанная иммуноаффинная методика позволит определять концентрацию
кошаперона СБ1 в сыворотке. Установлена связь между концентрацией СБ1, БТШ70 и
функциональными параметрами спортсменов, что позволит оценивать их
подготовленность и адаптацию к физическим нагрузкам.
Полученные результаты могут быть использованы для разработки новых
подходов к мониторингу реакции организма на стресс. Можно оценивать состояние, в
котором спортсмен подошел к началу предсоревновательного периода, и, учитывая
полученные данные, возможно построение тренировочного процесса, который будет
способствовать эффективному протеканию адаптационных процессов.
Исследование новых белков-маркеров стресса и изучение их регуляции позволит
приблизиться к пониманию механизмов адаптации возникающих в стрессовых
условиях и дальнейшего восстановления организма.
6

Результаты диссертации внедрены в работу кафедры физического воспитания и


спорта МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры спортивной медицины ФГУ
РГУФКСиТ, что подтверждено актами внедрения.
Основные положения выносимые на защиту:
1. Работа максимальной аэробной мощности не влияет на изменение экспрессии и
концентрации СБ1 в крови на фоне увеличении экспрессии и концентрации
БТШ70;
2. В процессе подготовительного периода у спортсменов в сыворотке крови
наблюдается изменение уровня кошаперона СБ1, что может служить маркером
адаптации к стрессу;
3. У более подготовленных спортсменов к предсоревновательному периоду
уровень СБ1 повышается, в то время как уровень БТШ70 снижается и выходит
на базальный уровень, эти изменения в соотношениях белков могут являться
критерием оценки работы адаптационных механизмов.
Структура и обьем диссертации. Диссертационная работа изложена на 119
страницах и состоит из введения, обзора литературы, методической части,
результатов исследования, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов
и списка литературы. Работа проиллюстрирована 35 рисунками; список литературы
включает 130 источников.

МЕТОДЫ И ОРГАНИЗАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ


Методы исследования
В исследовании принимали участие 10 юношей, занимающихся академической
гребле и 10 юношей, занимающихся лыжными гонками. Исследование проводили на
протяжении подготовительного периода, который составил 28 дней.
Все спортсмены проходили осмотр кардиологом и давали письменное согласие
на участие в экспериментах и использование полученных данных. Исследования были
одобрены этическим комитетом ФГУ ВНИИФК.
За три дня до начала подготовительного цикла спортсмены проходили
нагрузочное тестирование со ступенчато повышающейся мощностью на беговой
дорожке Venus (начальная скорость ленты 3.5 м/с, угол наклона – 1 градус,
длительность ступени - 3 мин, прибавка скорости – 0.5 м/с.) и на гребном эргометре
Concept II (стартовая мощность 100 Вт с шагом 50 Вт, длительность каждой ступени
составляла 3 минуты). Работу выполняли до невозможности поддерживать заданную
мощность. В процессе теста измеряли показатели газообмена на приборе Oxycon Pro
7

(Viasis). Венозную кровь отбирали до и после тестирования. ЧСС регистрировали с


помощью монитора сердечного ритма Polar S610 (Polar). Концентрацию лактата
определяли с использованием автоматического анализатора глюкозы и лактата C_Line
(Biosen). Концентрацию биомаркеров в сыворотке (КФК, АЛТ, АСТ и др.) определяли
на автоматическом биохимическом анализаторе HumaStar 300 (Human). Уровень
БТШ70 в сыворотке крови спортсменов измеряли с помощью системы на основе ИФА,
разработанной ранее в лаборатории молекулярной физиологии ФГУ ВНИИФК
(Сахаров Д.А., 2009.).
Для выделения мРНК венозную кровь собирали в пробирки PAXgene Blood RNA
Tube (PreAnalytiX). мРНК выделяли согласно протоколу производителя с
использованием набора PAXgene Blood RNA Kit (PreAnalytiX). Для исключения отжига
праймеров на геномной ДНК образцы обрабатывали ДНКазой. Качество выделенной
мРНК – RIN (RNA Integrity Number) оценивали на биоанализаторе Agilent 2100
Bioanalyzer. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора для
обратной транскрипции (ЗАО «НПФ ДНК–Технология»).
В работе для получения моноклональных антител использовали: самок мышей
линии Balb/с; полный и неполный адъюванты Фрейнда (ПАФ и НАФ). Гибридомы
получали слиянием спленоцитов иммунных мышей с миеломой Sp2/0 в ПЭГ.
Миеломные клетки sp2/0 и полученные гибридомные клетки культивировали на среде
RPMI1640 (Sigma). МоноАТ выделяли из асцитных жидкостей с помощью
преципитации сульфатом аммония и дальнейшей ионообменной хроматографии на
колонке «Mono Q» (Pharmacia Fine Chemicals).
Для получения поликлональных антител после четырехкратной иммунизации
кроликов белком у них отбирали венозную кровь и получали сыворотку. Для создания
аффинных сорбентов и выделяли специфические поликлональные антитела
использовали активированную сефарозу (Thermo). Связавшиеся специфические
антитела элюировали 0,1М глицином с pH 2,5 и 1М трис(гидроксиметил)аминометаном
pH 9, затем доводили до нейтрального pH.
В методе иммуноферментного анализа (ИФА) использовали: поликлональные
антитела против рекомбинантного СБ1, места неспецифического связывания
блокировали раствором 3% сухого молока, конъюгат стрептавидин-пероксидазы или
конъюгат антител козы против иммуноглобулинов кролика (Sigma),
тетраметилбензидина в буфере, содержащем цитрат натрия, фосфата натрия, раствор
H2SO4. Детекцию оптической плотности осуществляли на ИФА спектрофотометре
xMark (Bio-Rad) при 450 нм.
8

Электрофоретическое разделение белков проводилось по системе Лэммли в


денатурирующих условиях на приборе Mini-Protein Tetra Cell (Bio-Rad). Образцы из
полиакриламидного геля переносили на мембрану из поливиниледенфторида (ПВДФ)
Immobilon-P (Millipore) полусухим методом с использованием прибора Semi Dry Trans-
Blot Cell (Bio-Rad). Конечную реакцию хемилюминисценции проводили с помощью
набора SuperSignal WestPico (Pierce, США), детектировали прибором ChemiDoc XRS
(Bio-Rad, США). Полученные результаты обрабатывали с помощью программного
пакета Quantity One (Bio-Rad, США).
Уровень специфических аутоиммунных антител в сыворотке спортсменов так же
оценивали с помощью ИФА. Использовали рекомбинантные белки СБ1 и БТШ70,
конъюгат антител козы против иммуноглобулинов человека с пераксидазой хрена
(«IMTEK»).
Данные, полученные в работе, обрабатывались с применением статистической
программы STATISTICA7 (StatSoft). Для определения достоверности использовали U
критерий Манна-Уитни (p <0,05).

Организация исследования
На первом этапе работы была задача получить аффинные поликлональные
антитела кролик и моноклональные антитела мыши направленные против
рекомбинантного белка СБ1 человека.
На втором этапе была разработана иммунохимическая тест-система,
позволяющая определять уровень СБ1 в сыворотке человека.
На третьем этапе были определены концентраций СБ1/БТШ70 и проведен
анализ экспрессии мРНК СБ1/БТШ70 в лейкоцитах крови спортсменов до и после
нагрузочного тестирования со ступенчато повышающейся мощностью.
На четвертом этапе проводили оценку концентраций СБ1 и БТШ70 в
сыворотке спортсменов в подготовительный период и исследовали уровень
аутоиммунных антител к изучаемым белкам в сыворотке спортсменов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Получение антител, направленных против рекомбинантного человеческого
белка СБ1
Рекомбинантный человеческий белок СБ1, были любезно предоставлен
проф. Л.П. Сащенко (Учреждение Российской академии наук Институт биологии гена,
Москва, Россия). Рекомбинантный человеческий белок БТШ70 был любезно
9

предоставлен проф. А.Г. Габибовым (Институт биоорганической химии им.


М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Москва, Россия).
Молекулярный вес рекомбинантных белков больше на 0,9 кДа, так как на конце
они содержат сопроводительную гексагистидиновую аминокислотную
последовательность.
Для получения моноклональных антител проводили анализ иммуногенности
белка СБ1. С помощью программы AAPPred (Давыдов Я.И., 2009), позволяющей
предсказывать В-клеточные эпитопы на основе частоты аминокислотных пар и метода
опорных векторов, было произведено биоинформатическое предсказание
иммуногенности белка СБ1. Этот анализ показал, что белок имеет три наиболее
иммуногенные области, к которым преимущественно вырабатываются антитела
(Табл.1).
Таблица 1. Иммуногенные области белка СБ1

Номера а.к. Последовательность


14-21 LPPASQGC
52-59 ITAGSEEP
231-238 FSVLMRAM

Эти данные позволяют предположить, что полученные далее моноклональные


антитела против белка СБ1 могут иметь разные эпитопы.
Для иммунизации мышей использовали рекомбинантный человеческий белок
СБ1. Проводили пятикратную иммунизацию, при первой и второй иммунизации для
усиления иммунного ответа использовали полный и неполный адьюванты Фрейнда.
Качество иммунизаций проверяли по титру антител в сыворотках с помощью
иммуноферментного анализа (ИФА). После четвертой иммунизации титр антител в
сыворотках, против соответствующего антигена, составлял не менее 1:100000.
В ходе слияния было получено 5 наиболее активных гибридом, стабильно
продуцирующих моноклональные антитела против рекомбинантного СБ1 человека.
Активность полученных и очищенных моноклональных антител из асцита проверяли в
ИФА.
Для получения поликлональной сыворотки, кролики иммунизировались
рекомбинантным белком СБ1. Для выделения специфических антител из сыворотки
был создан аффинный сорбент, содержащий ковалентно иммобилизированный
рекомбинантный белок СБ1 с концентрацией 1мг/мл. Сыворотки кроликов после
10

иммунизации объединяли и инкубировали с аффинным сорбентом. Связавшиеся


антитела элюировали и фракции проверяли в ИФА с антигеном на плате.
Далее фракции, содержащие аффинные антитела, с помощью диализа
переводили в фосфатносолевой буфер. Концентрацию и чистоту антител определяли с
помощью спектрофотометра по поглощению при 280 нм и электрофоретического
разделения белков.

Разработка иммунохимической системы определения СБ1 в сыворотке


Методики определения СБ1 в сыворотке крови мало изучены, для
количественной оценки этого белка использовали два иммунохимических подхода:
сэндвич-ИФА и иммунноблотинг.
Наиболее распространенной методикой определения концентраций белков в
гетерогенных образцах является сэндвич-ИФА. Для разработки тест-системы с
помощью выбранной методики ИФА использовали рекомбинантный кошаперон и в
разных комбинациях моноклональные антитела, а также поликлональные аффинно-
очищенные антитела.

В первой системе сэндвич-ИФА исследовали в разных комбинациях 5


полученных моноклональных антител, так как они могут иметь разные эпитопы на
белке. Результаты экспериментов показали, что связывания реагентов и образования
тройного сэндвич-комплекса антител с белком СБ1 не происходило. Вероятно это
связанно с тем, что все специфические антигенные эпитопы на белке СБ1 уже были
блокированы антителами, иммобилизированными на плате. Полученные результаты
свидетельствуют о том, что все антитела направлены к одному или перекрывающимся
эпитопам на белке СБ1.
Во второй системе сэндвич-ИФА исследовали взаимодействие белка СБ1 с
комбинациями разных антител.
Варианты комбинации систем:
1. На иммунологическую плату сорбировали поликлональные кроличьи антитела.
Вторыми вносили моноклональные мышиные антитела. В данной комбинации
антител специфического сигнала не наблюдается, вероятно из-за того, что
поликлональные антитела взаимодействуя с белком СБ1, связываются со всеми
доступными эпитопами, и тем самым закрывают доступ к эпитопу на белке для
моноклональных антител.
11

2. На иммунологическую плату сорбировали поликлональные кроличьи антитела.


Вторыми вносили поликлональные кроличьи антитела меченые биотином. В
данной комбинации антител наблюдался высокий специфический сигнал.
3. На иммунологическую плату сорбировали моноклональные мышиные антитела.
Вторыми вносили поликлональные кроличьи антитела. Взаимодействие антител
с антигеном в представленном третьем варианте также сопровождалось высоким
специфическим сигналом.
Однако при сравнении второго и третьего вариантов комбинаций было показано,
что третий вариант, где моноклональные антитела сорбированны на плате и
поликлональные антитела в растворе, наблюдается самый высокий специфический
сигнал. Таким образом, была подобрана наиболее специфичная комбинация антител
для белка СБ1.
Для определения СБ1 в сыворотке человека сэндвич-ИФА проводили
следующим образом: на иммунологическую плату сорбировали моноклональные
антитела против рекомбинантного белка СБ1 в концентрации 3 мкг/мл. Исследуемые
сыворотки наносили, разведенные в два раза и калибровку рекомбинантного белка СБ1
в концентрациях от 0 нг/мл до 90 нг/мл. После вносили поликлональные антитела, в
концентрации 1мкг/мл.
Разработанная тест-система позволяет определять рекомбинантный СБ1 в
диапазоне концентраций от 5 до 90 нг/мл. Но при исследовании экспериментальных
образцов сыворотки оказалось, что полученная система является недостаточно
чувствительной (предел чувствительности 5 нг/мл). Содержание СБ1 в сыворотке
колеблется в диапазоне от 0,7 до 4 нг/мл. Поэтому необходимо концентрирование
белка.
Для концентрирования нативного СБ1 из сыворотки человека получали
аффинные сорбенты, содержащие ковалентно иммобилизированные очищенные
поликлональные антитела к рекомбинантному белку с концентрацией 0,5 мг/мл.
Первоначально на одну точку измерения отбирали 50 мкл аффинного сорбента, что
соответствует 25мкг антител, и 5 мл исследуемого образца сыворотки. Так как
известно, что концентрация белка СБ1 может достигать 4 нг/мл, то в 5 мл сыворотки
может содержаться 20нг белка. Поэтому аффинного сорбента, с ковалентно
пришитыми антителами, для связывания всего белка в сыворотке, брали в избытке.
Стандарты для калибровки использовали в диапазоне концентраций от 0,5 нг/мл до 20
нг/мл. После всех инкубаций к сорбенту со связавшимся белком добавляли
элюирующий буфер, и весь образец наносили на электрофоретический гель.
12

Уникальность этой методики в том, что она позволяет наносить на гель весь
сконцентрированный белок без потерь.
Далее образцы из геля переносили на мембрану из поливиниледенфторида
(ПВДФ) методом полусухого переноса. Иммуноблоттинг проводили с
моноклональными и аффинно-очищенными поликлональными антителами к
рекомбинантному белку СБ1.
Моноклональные антитела в иммуноблоттинге как с рекомбинантным белком,
так и с нативным, содержащимся в сыворотке, дают слабый специфический сигнал.
Возможно, это объясняется тем, что моноклональные антитела имеют
конформационный эпитоп, который при денатуриции белка в иммуноблоттинге
деформируется, тем самым влияет на аффинность антител.
Взаимодействие поликлональных антител с человеческим белком СБ1 (Рис.1).
1 2 3 4

А)

Б)
Рис. 1. Определение СБ1 в сыворотке крови человека. А) 1 - взаимодействие
поликлональных антитела с сывороточным белком СБ1; 2-4- взаимодействие
поликлональных антител с рекомбинантным белком, калибровка: 0,5 нг/мл, 5нг/мл, 20
нг/мл. Б) Калибровочный график после оцифровки.

Из полученных результатов видно, что в сыворотке присутствует четкий,


специфический сигнал соответствующий уровню миграции белка СБ1- 40кДа. Это
13

подтверждает, что поликлональные аффинно-очищенные антитела, специфичны к


сывороточному белку СБ1 человека.
Таким образом, можно заключить, что нами были получены специфичные,
поликлональные антитела, взаимодействующие с человеческим белком СБ1. Удалось
разработать иммуноаффинную методику детекции СБ1 в сыворотке крови человека на
основе очищенных поликлональных антител кролика. Чувствительность разработанной
системы позволяет детектировать 0,5 нг/мл белка СБ1.

Определение уровня концентраций СБ1 и БТШ70 после нагрузочного


тестирования со ступенчато повышающейся мощностью
В исследовании принимали участие 10 юношей, систематически занимающихся
академической гребле и 10 юношей, систематически занимающихся лыжными гонками,
более шести лет, квалификации не ниже КМС, относящихся к одной возрастной группе
и имеющих свойственные специализации размеры тела (Табл.2.)
Таблица 2. Антропометрические данные участников исследования
Участники Возраст, Вес, Рост,
исследования Лет Кг См
Академическая гребля 18,5±0,7 90,9±11,2 191,9±4,3
Лыжные гонки 18,7±2,1 69,9±7,8 174,9±6,9

По результатам теста со ступенчато повышающейся мощностью спортсменов


разбили на две группы. У гребцов и лыжников в первую группу вошли спортсмены
показавшие время t > 21 минуты, а во вторую группу t < 21 минуты. Значение
максимального потребления кислорода (МПК) были полученным по данным
газоанализа (Табл.3).

Таблица 3. Исследуемые группы спортсменов

Участники Время работы, мин МПК/кг


Вид спорта
исследования (p <0,02) (p <0,02)

Академическая Группа 1 23:56 ±1:44 54,1±4,7


гребля Группа 2 19:24±1:33 47,5±1,9
Группа 1 22:05±1:18 72±6,5
Лыжные гонки
Группа 2 19:19±1:39 65±1,1
14

В сыворотке крови всех спортсменов до и после кратковременной


высокоинтенсивной нагрузки определяли: креатининфосфокиназу (КФК),
аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ).
Активность АЛТ, АСТ и КФК до начала и после окончания тестирования
находилась в пределах среднефизиологических показателей, что говорит об отсутствии
повреждений гепатоцитов, кардиомиоцитов и скелетной мускулатуры. Существенных
отличий между спортсменами выявлено не было.
Далее в сыворотках спортсменов с помощью разработанной иммуноаффинной
методики определяли концентрацию СБ1, а также уровень БТШ70 (Рис.2). Результаты
исследования показали, что в первых группах, показавших лучшее время в тесте, до
кратковременной высокоинтенсивной нагрузки БТШ70 составил 15,5±5,6 нг/мл, после
нагрузки 16,6±5,8 нг/мл. Во вторых группах 13,6±3,3 нг/мл и 16,0±3,4 нг/мл,
соответственно. Концентрация БТШ70 между группами отличается не значительно.
Наблюдается тенденция к увеличению концентрации БТШ70 после нагрузки, однако
эти изменения являются статистически недостоверным.

24 2 ,2

22 2 ,0
20 1 ,8
Концентрация БТШ70, нг/мл

Концентрация СБ1, нг/мл

18
1 ,6
16
1 ,4
14 до до
1 ,2
12 после после
1 ,0
10
0 ,8
8
0 ,6
6

4 0 ,4

2 0 ,2

0 0 ,0
А) Б)

Рис.2. Концентрации А) БТШ70 и Б) СБ1 до и после кратковременной


высокоинтенсивной нагрузки.

Уровень кошаперона до и после кратковременной высокоинтенсивной нагрузки


в группах не изменялся и составлял 1,2±0,2 нг/мл.
15

Вероятно, СБ1 не является белком, который участвует в срочной адаптации и не


успевает выйти в сыворотку за такой короткий промежуток времени, БТШ70 в свою
очередь выходить в сыворотку.

Экспрессия мРНК СБ1 после работы максимальной аэробной мощности


Известно, что в условиях физиологического стресса происходит увеличение
экспрессии мРНК БТШ70 (Khassaf M., 2001; Сахаров 2009), для мРНК СБ1
аналогичные данные не рассматривались.
Для изучения экспрессии СБ1 (ген HSPBP1) в ответ на максимальную аэробную
нагрузку у испытуемых отбирали кровь для выделения мРНК из лейкоцитов до и после
высокоинтенсивной нагрузки. В качестве положительного контроля,
свидетельствующего о том, что мы достигли физиологического стресса, определяли
экспрессию мРНК БТШ70 (ген HSPA1A). В качестве внутреннего контроля экспрессии
мРНК ПЦР проводили с использованием двух «housekeeping»генов – B2M, HPRT.
Относительное увеличение экспрессии оценивали по отношению значений до и после
тренировки, нормализованные на экспрессии генов B2M и HPRT. Качество выделенной
мРНК – RIN (RNA Integrity Number) оценивали на биоанализаторе Agilent 2100
Bioanalyzer. Для всех образцов РНК RIN был выше 8, говорящий о том, что исходная
РНК не фрагментирована. На Рис.3 представлены результаты анализа экспрессии генов
мРНК.

2 ,4

2 ,2
Кратность изменения экспрессии

2 ,0 Л ы ж н ы е го н ки
А ка д е м и ч е с ка я гр е б л я
1 ,8

1 ,6

1 ,4

1 ,2

1 ,0

0 ,8

0 ,6

0 ,4

0 ,2

0 ,0
HSPA1A HSPBP1

Рис.3. Различия в экспрессии мРНК генов.


16

В результате кратковременной высокоинтенсивной нагрузки происходит


статистически значимое (p <0,05) увеличение экспрессии мРНК БТШ70 в лейкоцитах,
которое свидетельствует о запуске в клетке адаптивных процессов в ответ на
физиологический стресс. На фоне изменения экспрессии БТШ70, экспрессии СБ1 не
изменяется. Характер изменения экспрессии мРНК СБ1 и БТШ70 в лейкоцитах
спортсменов занимающихся академической греблей и лыжными гонками одинаков.
Полученные данные подтверждают, СБ1 не вовлекается в процесс срочной
адаптации, вероятно, он участвует в более сложных и длительных адаптационных
реакциях в организме, на фоне БТШ70, который является индуцибельным белком,
экспрессия его мРНК возрастает в ответ на физические нагрузки.

Определение уровня концентраций СБ1 и БТШ70 в сыворотке спортсменов


в подготовительный период
На втором этапе, проводили исследование на протяжении подготовительного
периода, который составил 28 дней. У всех участников исследования измеряли в
сыворотке уровень БТШ70 и СБ1 в начале и в конце периода.
Оценка концентраций СБ1 и БТШ70 в сыворотках спортсменов занимающихся
академической греблей (Рис. 4-5).

3 ,0

2 ,5
Концентрация СБ1, нг/мл

2 ,0
1
2
1 ,5

1 ,0

0 ,5

0 ,0
А Б

Рис.4. Концентрация СБ1 в двух группах спортсменов. Академическая гребля А)


до и Б) после подготовительного периода.
17

30

25

Концентрация БТШ70, нг/мл


20
1
2
15

10

0
А Б

Рис.5. Концентрация БТШ70 в двух группах спортсменов. Академическая гребля


А) до и Б) после подготовительного периода.

После анализа на содержание СБ1 в группах было обнаружено, что его


базальный уровень в начале четырехнедельного подготовительного периода в обеих
группах достоверно не отличается: в первой группе 1,0±0,1 нг/мл, во второй группе
1,2±0,1 нг/мл. Однако к началу предсоревновательного периода у группы, показавшей
лучший результаты в тестировании, концентрация СБ1 увеличилась 2,5±0,4 нг/мл, а у
второй группы не изменилась 1,2±0,3 нг/мл (Рис.4).
В случае с БТШ70 (Рис.5) базальный уровень у групп вначале достоверно не
отличался, в первой группе 14,5±4,8 нг/мл, во второй группе 13,5±2,1 нг/мл. После
подготовительного периода концентрация БТШ70 у первой группы уменьшилась и
составила 8,0±2,0 нг/мл, а у второй группы увеличилась 16,5±3,5 нг/мл (p <0,02).
У спортсменов занимающихся лыжными гонками наблюдается похожая картина
изменения концентраций белков СБ1 и БТШ70. (Рис. 6-7).
18

3 ,0

2 ,5

Концентрация СБ1, нг/мл


2 ,0
1
2
1 ,5

1 ,0

0 ,5

0 ,0
А Б

Рис.6. Концентрация СБ1 в двух группах спортсменов. Лыжные гонки А) до и Б)


после подготовительного периода.
30

25
Концентрация БТШ70, нг/мл

20

1
2
15

10

0
А Б

Рис.7. Концентрация БТШ70 в двух группах спортсменов. Лыжные гонки А) до


и Б) после подготовительного периода.

В начале подготовительного периода в обеих группах уровень СБ1 одинаковый:


в первой группе 1,2±0,2 нг/мл, во второй группе 1,2±0,3 нг/мл. К началу
предсоревновательного периода у первой группы СБ1 достоверно увеличился 2,3±0,7
нг/мл, а у второй группы не изменился 1,3±0,1 нг/мл (Рис.6).
19

В случае с БТШ70 (Рис.7) базальный уровень у групп вначале достоверно не


отличается, в первой группе 18,5±6,0 нг/мл, во второй группе 15,0±4,0 нг/мл. После
подготовительного периода концентрация БТШ70 у первой группы также уменьшилась
и составила13,2±5,4 нг/мл, а у второй группы увеличилась 23,8±4,0 нг/мл (p <0,02).
На основе полученных данных видно, что в группах более подготовленных
спортсменов в конце подготовительного периода уровень БТШ70 понижается и
выходит на базальный уровень (11,3±4,6 нг/мл) в то время как уровень СБ1 повышается
(2,5±0,6 нг/мл). Это свидетельствует в пользу того факта, что СБ1 возможно является
регулятором концентрации БТШ70 в сыворотке, при адаптации организма к
стрессовым нагрузкам. У спортсменов, входящих в группы с более низкой
подготовкой, концентрация БТШ70 увеличивается (19,2±5,6 нг/мл), а концентрация
СБ1 не изменяется (1,2±0,2 нг/мл), возможно, это говорит о менее активной реакции
адаптации в ответ на стрессовые нагрузки.
Также надо заметить, что характер изменения концентрации СБ1 у спортсменов,
занимающихся греблей и лыжными гонками одинакова, и в том и в другом случае. На
основании этого можно сделать предположение, что изменение концентрации СБ1
может являться маркером адаптивности спортсменов.
Вероятно, СБ1 может быть одним из белков регулирующих активные формы
БТШ70 циркулирующих в сыворотке крови, а динамика концентраций СБ1 и БТШ70
может быть рассмотрена, как критерий оценки способности организма к адаптации.

Исследование уровня аутоиммунных антител направленных к белкам


БТШ70 и его кошаперону СБ1 в сыворотке спортсменов
Регуляция СБ1/БТШ70 может осуществляться и их аутоиммунными антителами.
Выявленная активация СБ1 на продолжительные физические нагрузки, вероятно, при
определенных концентрациях влияет на аутоиммунный ответ, который является в свою
очередь маркером состояния организма.
Исследование аутоиммунного ответа на белки СБ1 и БТШ70 проводили с
образцами сывороток спортсменов в начале и конце тренировочного периода с
помощью ИФА. В качестве первых реагентов на планшет сорбировали
рекомбинантные белки СБ1 и БТШ70 в концентрации 5 мкг/мл. Иисследуемые
сыворотки наносили в разведении 1:5, 1:10, 1:50 и 1:100.
Результаты исследования показали, незначительное изменение уровня
аутоантител к СБ1 и БТШ70 в начале и в конце тренировочного периода.
20

Однако при исследовании концентраций СБ1 и его аутоантител после


тренировочного периода была обнаружена значимая корреляция между ними (p <0,02).
При более высокой концентрации СБ1 у спортсмена концентрация его аутоантител
также выше и наоборот (Рис.8).

1000

Концентрация аутоантител, нг/мл


800

600

400

200

0 ,8 1 ,0 1 ,2 1 ,4 1 ,6 1 ,8 2 ,0 2 ,2 2 ,4 2 ,6 2 ,8

К о н ц е н т р а ц и я С Б 1 , н г/м л
А)
1000
Концентрация аутоантител, нг/мл

800

600

400

200

0
0 ,8 1 ,0 1 ,2 1 ,4 1 ,6 1 ,8 2 ,0 2 ,2 2 ,4 2 ,6 2 ,8

К о н ц е н т р а ц и я С Б 1 , н г /м л
Б)
Рис. 8. Корреляция между базальной концентрацией СБ1 и его аутоантител в
сыворотке спортсменов. А – Лыжные гонки (r2= 0,62; p <0,02). Б – Академическая
гребля (r2= 0,80; p <0,002).

В начале тренировочного периода данной корреляции не наблюдали (r 2= 0,10; p


>0,05). Вероятно, появление корреляции является одним из способов приспособления
организма, который отвечает на изменения концентраций белка СБ1 под воздействием
физических нагрузок. Однако регуляция концентрации аутоантител является более
сложным и многокомпонентным механизмом.
21

Таким образом кратковременный высокоинтенсивный стресс не вызывает


изменения экспрессии и концентрации СБ1 в сыворотке. Тогда как по завершению
четырехнедельного подготовительного периода наблюдается изменение концентрации
БТШ70 и СБ1. При уменьшении концентрации БТШ70, концентрация СБ1 в сыворотке
увеличивается. Установлена взаимосвязь концентраций этих белков в сыворотке с
подготовленностью спортсменов. У более подготовленных спортсменов в конце
подготовительного периода уровень СБ1 повышается, в то время как уровень БТШ70
снижается и выходит на базальный уровень, что говорит об адаптации организма к
стрессовым нагрузкам и выходе спортсменов на пик своей спортивной формы.
Полученные данные позволяют предположить, что длительные физические
нагрузки приводят к изменению концентрации кошаперона СБ1 в крови, а вследствие и
концентрации БТШ70, как проявление механизма регуляции концентрации последнего.
БТШ70 выходит в сыворотку, взаимодействуя с клетками иммунной системы,
ингибирует их активность. Взаимодействие же кошаперона с АТФазным доменом
БТШ70, влечет за собой конформационные изменения последнего, в результате чего
происходит инактивация БТШ70. Вероятно, СБ1 может быть одним из белков
регулирующих активные формы БТШ70 циркулирующих в сыворотке крови.
В данной работе было проведено комплексное исследование
высококвалифицированных спортсменов циклических видов спорта (академическая
гребля и лыжные гонки). Исследовались отличия двух групп спортсменов разных по
уровню подготовленности. Были рассмотрены механизмы регуляции СБ1/БТШ70 и
выявлены характерные изменения СБ1 и БТШ70 в зависимости от уровня
подготовленности спортсменов, что не было изучено раннее у Шкурников М.Ю.,
который изучал только взаимосвязь уровня БТШ70 от спортивной ориентации
спортсменов. Мониторинг же обоих белков СБ1 и БТШ70 в крови позволит наиболее
точно определять уровень подготовленности спортсменов.
В работе рассматривали многокомпонентную систему белков, также была
выявлена корреляция между концентрацией СБ1 и его аутоантителами, вероятно
свидетельствующая о приспособлении организма к изменениям концентрации белков в
течение тренировочного периода.
Исследование данной работы по изучению белков-маркеров стресса и изучение
их регуляции позволит дополнить полученные ранее данные о механизмов .
22

ВЫВОДЫ
1. Получены поликлональные аффинно-очищенные антитела кролика против
рекомбинантного кошаперона СБ1 человека, специфично
взаимодействующие как в ИФА так и в иммуноблотинге.
2. Разработана иммунно-аффинная тест-система на основе поликлональных
антител, которая позволяет определять концентрацию СБ1 в сыворотке
человека и использовать для мониторинга функционального состояния
спортсмена.
3. Показано, что кратковременный высокоинтенсивный стресс не вызывает
изменения экспрессии мРНК СБ1 в лейкоцитах и концентрации СБ1 в
сыворотке.
4. Показано, что длительные физические нагрузки приводят к изменению
концентрации СБ1 и БТШ70, направленность изменений зависит от уровня
подготовленности спортсменов. У более подготовленных наблюдается
увеличение базальной концентрации СБ1 (2,5±0,6 нг/мл) и в тоже время
уменьшение концентрации БТШ70 (11,3±4,6 нг/мл), у менее подготовленных
концентрация СБ1 не изменяется (1,2±0,2 нг/мл), а концентрация БТШ70
увеличивается (19,2±5,6 нг/мл).
5. Разработана тест-система, позволяющая определять уровень аутоантител к
СБ1 в сыворотке человека. Показано, что в конце тренировочного периода
появляется корреляция между концентрацией СБ1 и его аутоантителами,
свидетельствующая о приспособлении организма к изменениям
концентрации белков в течение тренировочного периода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
1. При оценке функционального состояния организма следует учитывать, что к
предсоревновательному периоду уровень СБ1 у более подготовленных
спортсменов должен быть выше 2 нг/мл, при концентрации БТШ70 ниже 15
нг/мл, у менее подготовленных концентрация СБ1 менее 1,5 нг/мл, а
концентрация БТШ70 более 15 нг/мл. Мониторинг этих показателей на
регулярной основе может быть рекомендован к применению в образовательных
учреждениях спортивного профиля и в медицинских центрах сборных команд
для оценки функциональных резервов спортсменов, активации молекулярных
23

механизмов реакции организма, а также индивидуальной коррекции


тренировочных курсов.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ


ДИССЕРТАЦИИ.
1. Гребенюк, Е.С. Влияние шестичасового ультрамарафона на уровень IL-6,
LIF и SCF / А.Е. Донников, М.Ю. Шкурников, Е.Б. Акимов, С.А. Хаустова, Е.М.
Шахматова, А.Г. Тоневицкий // Бюллетень экспериментальной биологии и
медицины. – 2009. – №147(11). – С. 573-575.
2. Гребенюк, Е.С. Работы по проведению проблемно-ориентированных
поисковых исследований и созданию научно-технического задела в области геномных
и постгеномных технологий создания лекарственных средств с участием научных
организаций Германии / Я.И. Давыдов, Е.В. Трушкин, Е.А. Гудим, А.Г. Тоневицкий //
Сборник тезисов “Живые системы”. – 2009. – С. 124-125.
3. Гребенюк, Е.С. Предсказание эпитопов в близкородственных белках с
помощью нового алгоритма / Я.И. Давыдов, С. Фидалго, С.А. Хаустова, В.Г.
Лелянова, Ю.А. Ушкарев, А.Г. Тоневицкий // Бюллетень экспериментальной
биологии и медицины. – 2009. – №148(12). – С.628-632.
4. Гребенюк, Е.С. Экспрессия ранних генов иммунного ответа при
физической нагрузке / В.А. Шлепцова, Е.В. Трушкин, О.А. Быстрых, Я.И.
Давыдов, Н.П. Образцова, А.Г. Тоневицкий // Бюллетень экспериментальной
биологии и медицины. – 2010. – №148(1). – С.97-100.

Оценить