Versão do FarmaBio

HPLC

High Performance Liquid

Chromatography
CLAE
Cromatografia a Líquida de Alta
Eficiência
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Conteúdo

Parte I: FUNDAMENTOS DE HPLC

1. Introdução
2. Histórico
3. Áreas de aplicação / vantagens
4. Modos de separação / tipos de HPLC
5. Características cromatograma /
eficiência coluna
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Conteúdo (cont.)

Parte II: INSTRUMENTAÇÃO /

FUNCIONAMENTO HPLC
1. Colunas
2. Bombas / fase móvel
3. Injeção da amostra
4. Detectores
5. Tratamento dados
6. Dicas de manutenção

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Conteúdo (cont.)

Parte III: APLICAÇÕES

1. Desenvolvimento de metodologias
2. Validação de metodologias
2. Aplicações

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Parte I

FUNDAMENTOS

HPLC

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Introdução
CROMATOGRAFIA = método físico de
separação no qual os constituintes de
uma amostra a serem separados são
distribuídos entre 2 fases:

• estacionária:
estacionária geralmente de grande área,
sólida ou líquida
• móvel: um fluido insolúvel que percola
através da primeira

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FASE MÓVEL

Fase
estacionária
injeção separação eluição

DETECTOR

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FASE MÓVEL:

• Líquido ⇒ HPLC

• Gás ⇒ GC

• Gás em condições supercríticas ⇒ SFC

(Cromatografia a fluido supercrítico)

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CROMATOGRAFIA

SFC LC GC
Cromatografia a Cromatografia a Cromatografia a
Fluido Supercrítico Líquido Gás

LC LC
Planar Coluna

CCD Coluna "Open

Cromatografia Coluna
Cromatografia Tubular" Capilar
Papel Empacotada
Camada Delgada dc < 350 um

Coluna Capilar Coluna Coluna Coluna

empacotada Microbore "Analítica" Preparativa
dc <= 350 um 350 um < dc < 1 mm 1 mm < dc < 8 mm dc >= 8 mm

FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.

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Histórico

• 1903 - TSWETT, botânico russo: separação e isolamento de

pigmentos de plantas em colunas de sílica gel (cromatografia =
color writing)
• 1931 - LEDERER & KUHN: trabalhos utilizando cromatografia na
separação de carotenóides
• 1938 - ISMAILOV & SHRAIBER: CCD
• 1941 - MARTIN & SYNGE: cromatografia partição
• 1944 - CONSDEN, GORDON & MARTIN: cromatografia papel
• 1949 - SPEEDING & TOMPKINS: cromatografia troca iônica
• 1952 - MARTIN & JAMES: GC
• 1957 - GOLAY: colunas capilares para GC
• 1959 - PORATH & FLODIN: cromatografia exclusão tamanho
• 1965-1969 - HALASZ; HORVATH; KIRKLAND; PRETORIUS;
SCOTT; SNYDER; etc: HPLC moderna*

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 Cromatografia Líquida
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Clássica

Fluxo por gravidade

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HPLC Moderna*

• Partículas da fase estacionária

extremamente pequenas (diâmetro < 10 µ
m) ⇒ bombas para operações a altas
pressões (até 500 atm) e baixas vazões
(0,01 a 2-3 mL / min) ........High Pressure
LC

• Solventes especiais e ultra-puros

• Detectores seletivos e super-sensíveis, com

tamanho de célula de detecção < 10 µL
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HPLC Moderna* Reservatórios para

Injetor os solventes

Precoluna

Bomba HPLC

Coluna Analitica

Sistema de Tratamento
Detector
de Dados
Filtro em linha Scavenger

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Áreas aplicação / vantagens

HPLC x GC

Analitos
Técnica
Pré-requisito Interação
GC Voláteis e termicamente Fase estacionária
estáveis (nas consições de
operação)
HPLC Solúveis na fase móvel Fase estacionária e
fase móvel

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Substâncias não analisáveis por GC:

• compostos iônicos
• sais inorgânicos e orgânicos
• aminoácidos puros
• compostos polares de alto PM
• polímeros
• compostos termicamente instáveis
• corantes salinos

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Aplicações HPLC
Substâncias químicas

• Proteínas • Compostos iônicos

• Ácidos nucleicos • Íons metálicos
• Aminoácidos • Cátions e ânions
• Corantes • Lipídeos polares
• Polissacarídeos • Complexos metais
• Pigmentos plantas pesados
• Metabólitos plantas • Explosivos
• Produtos • Polímeros
farmacêuticos sintéticos

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Versão do FarmaBio Aplicações HPLC
Áreas

PESQUISA QUÍMICA/BIOQUÍMICA (Universidade e Indústria)

• Análise de misturas complexas
• Purificação de compostos químicos
• Desenvolvimento de processos de síntese de compostos
químicos
• Isolamento de produtos naturais com características biológicas
benéficas

CONTROLE QUALIDADE
• Garantia pureza de materiais brutos
• Teste in process para controle e otimização de processos de
produção
• Ensaios quantitativos de produtos finais (garantia
especificações)
• Avaliação estabilidade de produto e monitorização degradação

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Aplicações HPLC
Áreas
CONTROLE AMBIENTAL
• Análise de poluentes do ar e água
• Monitorização materiais perigosos - Saúde ocupacional
• Monitorização níveis agrotóxicos no ambiente

AGÊNCIAS REGULAMENTAÇÃO (Federais e

Estaduais)
• Vigilância de medicamentos / alimentos
• Identificação narcóticos confiscados
• Conformidade - reclamações etiquetas

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FONTE: BIDLINGMEYER, 1993.
 Vantagens da HPLC
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• Sensível a diversas amostras, incluindo orgânicas,

biomoléculas e íons - Pode-se analisar > 60% de
todos os componentes contra uns 15% para GC
• Alta resolução
– resolve (separa) centenas de componentes em
amostras complexas
• Detecção de alta sensibilidade
– detecta nos limites de pg - ng
• Análises rápidas e precisas
– análises de 1 - 60 min
– Análises automatizadas
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Modos de Separação

• Cromatografia de adsorção (sólido-

líquido)

• Cromatografia de partição (líquido-

líquido)

• Cromatografia de troca iônica

• Cromatografia por exclusão de tamanho

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Cromatografia de adsorção (sólido-
líquido)

• ADSORÇÃO = tendência de acúmulo de uma

substância sobre a superfície de outra, quando 2
fases imiscíveis são colocadas em contato

FASE MÓVEL

FASE ESTACIONÁRIA
(sólida)

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Adsorção

• QUÍMICA = formação de ligações químicas

• FÍSICA = envolve interações como pontes de
hidrogênio, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo
induzido, etc

* ↑ temperatura : adsorção física ⇒ adsorção

química

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Fase Estacionária

• Sólida
• Apresenta na superfície cargas iônicas
ou polares.

Exemplos:
– Sílica gel
– Alumina
– Florisil
– Carvão
– Carbonato de cálcio
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Fase Móvel

• Hexano
• Isooctano
• Cloreto de butila
• Clorofórmio
• Diclorometano
• Tetraidrofurano
• Acetonitrila
• Iso e n-propanol
• Metanol
• Água
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Cromatografia de partição
(líquido- líquido)
• PARTIÇÃO = distribuição de uma substância entre
2 fases heterogêneas fluidas, imiscíveis entre si.
Por exemplo: um gás e um líquido, ou 2 líquidos
imiscíveis

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Cromatografia de partição
clássica
FASE ESTACIONÁRIA
• Fina camada de líquido que cobre as partículas de
um suporte sólido
• Este líquido pode ser:
– polar: polietilenoglicol, ODPN (β, β
´-oxidipropionitrila)
– apolar: hexano

FASE MÓVEL
• Sempre de polaridade contrária
• Baixa
Disponível emestabilidade
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Cromatografia de partição com

fases quimicamente ligadas

FASE ESTACIONÁRIA
• Líquido é quimicamente ligado ao suporte
sólido.

FASE MÓVEL
• Sempre de polaridade contrária
• Alta estabilidade

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Aplicações

• Hidrocarbonetos aromáticos, óleos,

esteróides, plásticos, polímeros,
alcalóides (C18)

• Ácidos urinários, ácidos

carboxílicos, sulfonamidas,
hormônios tireóide, azocorantes
(C8)
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Cromatografia Fase Normal (NPC)
x
Cromatografia Fase Reversa (RPC)

• Classificação baseada na Natureza da

Fase Móvel
• NPC
– Fase móvel Apolar ⇒ hexano, isooctano
– Fase estacionária Polar ⇒ sílica, alumina
• RPC
– Fase móvel Polar ⇒ metanol, água
– Fase estacionária Apolar ⇒ C8, C18
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Portanto..........

GERALMENTE:

• NPC ⇒ Cromatografia Adsorção

• RPC ⇒ Cromatografia Partição

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Cromatografia de troca iônica

• FASE ESTACIONÁRIA = grupos iônicos

quimicamente ligados a um suporte (sílica ou
polímeros de alto PM).

• FASE MÓVEL = soluções tampões (controle pH).

Por exemplo: ácido cítrico, fosfato amônia,
acetato sódio, borato sódio.

• APLICAÇÕES = compostos iônicos, aminoácidos,

proteínas/peptídeos, etc

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 Cromatografia
Versão do FarmaBio por exclusão de
tamanho

• A separação é baseada no tamanho da molécula

e não em fenômenos de interações físicas ou
químicas

• FASE ESTACIONÁRIA = partículas com diâmetro

médio de poro fabricado sob medida. Assim,
algumas moléculas (menores) podem entrar nos
poros pequenos, outras nos poros médios, ou
seja, são permeadas seletivamente. As
moléculas grandes são excluídas → exclusão
tamanho.
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Cromatografia por exclusão de
tamanho
FLUXO

Gel

Poro

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Aplicações

• Controle qualidade de polímeros de alto

PM (assegurar propriedades físicas)

• Separação polímeros de baixo PM

(poliestireno, ftalatos)

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Escolha do sistema
cromatográfico

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Amostra

PM < 1.000

Insolúvel Solúvel
água água

Solúvel Solúvel
PM > 1.000 hexano metanol Não-iônica Iônica

Amostra Amostra
não-aquosa aquosa

NPC NPC RPC Cromatografia

RPC
(sílica) (fase ligada) "ion-pair" troca iônica

Biopolímeros
solúveis água

Condições
Polímeros Condições
desnaturantes
insolúveis água não-desnaturantes
(separação analítica)
Preparativa
Preparativa
Informação tamanho

Cromatografia Cromatografia Cromatografia

RPC
permeação gel filtração gel troca iônica

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Características cromatograma /
eficiência coluna

• Tempo de retenção (tr)

• Largura do pico (wb)
• Fator de Capacidade (k´)
• Seletividade (α)
• Resolução (Rs)
• Rendimento da coluna / número de
pratos teóricos
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Parte II

INSTRUMENTAÇÃO /
FUNCIONAMENTO HPLC

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Reservatórios para
Injetor os solventes

Precoluna

Bomba HPLC

Coluna Analitica

Sistema de Tratamento
Detector
de Dados
Filtro em linha Scavenger

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1. Colunas

• Sistema separação (adsorção, partição, etc)

• Comprimento (10-25 cm)
– cromatografia rápida → 3 cm
• Diâmetro interno*
• Tipo de suporte (sílica gel ou polímeros)
• Grupos quimicamente ligados (amino, ciano,
C8, C18, sulfonato)
• Tamanho da partícula (3-20 µm)
• Tamanho do poro (60-300 Å)
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2. Bombas / Fase Móvel

• Velocidade fluxo
– 0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas
– > 5,0 mL/min para colunas preparativas

• Pressão operação
– 500-2000 psi para colunas analíticas

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Eluição Isocrática /
Gradiente

• ISOCRÁTICA = a composição da fase

móvel não muda durante a corrida.

• GRADIENTE = a composição da fase

móvel varia de acordo com a polaridade
dos analitos. Bomba binária/quaternária.

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Eluição
Gradiente
Passo Solvente A Solvente B Tempo

1 30 % 70 % 3 min

2 50 % 50% 2 min

3 50 % 50 % 3 min

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Injeção da Amostra
• INJETOR MANUAL

Da
Da
bomba
bomba
Amostra
da seringa
Para
Para coluna
coluna

Descarte

Loop
Loop

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Injeção da Amostra
• AUTOSAMPLER
Corpo Solvente
da
Seringa
Amostragem
da Seringa

Válvula de
injeção

Vials na bandeja
Frasco de lavagem

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Detectores
• Equipamento com uma pequena célula
de fluxo conectado na saída da coluna e
que monitora a concentração dos
analitos.

• Detectores mais comuns:

– UV/Vis (absorvância)
– Fluorescência
– Índice de Refração
– Outros: Eletroquímico, Condutividade,
Infravermelho, etc.

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Detectores UV/Vis e Rede de Diodos
(DAD)

• PRINCÍPIO: quando vários grupos funcionais

são expostos à radiação, sofrem excitação
eletrônica a qual resulta na absorção de energia
em comprimentos de onda específicos para os
grupos.

• Comprimento onda: 210-380 nm → UV

• Comprimento onda: 380-800 nm → Visível

∀ ≈ 90% compostos orgânicos absorvem luz em

algum lugar da região UV-Vis
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Detectores

• SENSIBILIDADE
– Fluorescência: 1.000 vezes mais sensível
que UV-Vis
– UV-Vis: 1.000 vezes mais sensível que IR

• ESPECIFICIDADE
– Aumenta com a sensibilidade

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Tratamento dos Dados

• Integradores

• Software / Computador

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Analgésicos Comprimidos

Coluna: Pecosphere 3x3 C18 1

(3-µm, 33 x 4.6 mm i.d.)

Fase Móvel: 15% ACN em HAc a 0.1%

Fluxo: 2 mL/min

Detecção: UV a 240 nm

Identificação Picos

1.Acetaminofeno
2. Cafeína
3. Salicilamida
4. Ácido Acetilsalicílico

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LC Application Note LCPH-1.
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Teofilina

Coluna: Pecosphere 3x3 C18

(3-µm, 33 x 4.6 mm i.d.)
Fase Móvel: 11% ACN em água
Fluxo: 3 mL/min
Detecção: UV a 273 nm

Identificação Picos:

1. Teobromina
2. Teofilina
3. -OH-etilteofillina
4. Cafeína

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LC Application Note LCCL-7.
 Prednisona Comprimidos
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2.5 mg Standards
Deltasone
Coluna: Pecosphere 3 C18
(3-µm, 83 x 4.6 mm Tablet
i.d.)
Fase Móvel: 50% metanol em
água
Fluxo: 2.0 mL/min
Detecção: UV a 254 nm

Identificação Picos
1. Acetanilida
2. Prednisona

Application Note LCPH-

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