A /INTRODUCTION AU LABORATOIRE

La première condition, avant toute analyse bactériologique, c’est la structure

du laboratoire de microbiologie qui est une structure autre que les autres
laboratoires.

1. La réception

1.1. L’accueil du prélèvement

Cette partie du laboratoire est destinée à l’accueil des patients et leur

prélèvement au niveau de la réception.

- L’enregistrement des ordonnances (nom ; prénom ; âge, sexe ; nature du

prélèvement, numéro…Puis ce dernier sera acheminé par la réceptionniste au
niveau de la salle de travail.

1.2. Techniques et étapes de l’analyse.

Le déroulement de l’examen bactériologique se décompose en un certains

nombre d’étapes, et chacune d’entre elles doit apporter au diagnostic des
éléments qui seront pris en compte pour l’élaboration du résultat final.

1.2.1 Examen macroscopique

Certains prélèvements nécessitent des observations directes à l’œil nues :

- noter :

-la couleur ;

-la viscosité ;

-la consistance ;

-L’odeur ;

1.2.2. Examen microscopique

L’examen direct à l’état frais permet d’apprécier la morphologie des bactéries,

leurs groupements ;
- leur abondance ;

- observer leur mobilité.

Consiste à mettre entre lame et lamelle une goutte du produit pathologique ou

autre liquides microbiologiques nécessitant une observation microscopique.

On distingue deux études :

-a étude quantitative 

Elle consiste à dénombrer les éléments figurés présents dans un liquide

biologique, et exprimer leur nombre par unité de volume, soit, selon les cas :

Le millimètre cube ou le millimètre, pour ce dénombrement en utilise des

cellules, cette utilisation dépend le plus souvent des habitudes de l’utilisateur.
Cellule de malassez, cellule de nageotte,

-Cellules de malassez : longueur----2.5mm ; largeur : 2mm ; hauteur ---0.2mm ;

volume----1mm3.

-Cellule de nageotte : Longueur--- 10mm, Largeur----10mm

Profondeur---0.5mm

Volume----50mm3

b-Etude qualitative

La numération en cellule, ne permet pas de différencier les éléments nucléés

les uns des autres, avec une précision suffisante, pour cela la réalisation d’un
frottis sanguin est très indispensable, avec une coloration de gram, de bleue,
est surtout la coloration de May Grunwald- giemsa.

- Coloration qui à pour but d’étudier les différentes cellules blanches en

réaction immunitaire.

2-MISE EN CULTURE DES BACTERIES

C’est une étape très importante dans l’identification bactérienne.

Elle consiste à l’ensemencement du produit pathologique, avec une anse de
platine, ou avec une pipette pasteur, sur des milieux ordinaires ou enrichis,
éventuellement sur des milieux sélectifs lorsqu’on suspecte un germe donné.

Parfois un enrichissement est indiquer sur des bouillions liquides

(BGT.BHIB.BN…).

2.1. Etape de l’identification bactérienne.

a) ldentification et Interprétation

- Lecture des boites de cultures 24h ou 48h d’incubation à 37°C.

-noter l’aspect des colonies ;

-noter l’aspect de l’hémolyse ;

- voir la présence ou l’absence des pigments ;

- remarquer la présence ou l’absence d’odeur;…

b) réalisation d’autres tests complémentaires

-Cette étape consiste à la réalisation des tests qui représentent l’étape

seconde de l’identification.
-afin de classer le germe isolé de la culture dans une famille bien
déterminé. Cette étape comprend :
- coloration de Gram ou Bleu de Méthylène.
- Mise en évidence une catalase.
- Recherche de l’oxydase.
- Etude des rapports avec l’oxygène.
- Etude des modes d’attaque du glucose.
- Mise en évidence d’une nitrate réductase.
- Etude du métabolisme protéique.

Toutes les réactions biochimiques possibles.

 NB/Pour certaines souches l’identification morphologiques,
biochimiques suffisent, pour poser le diagnostic. Mais pour certaines
l’identification antigénique est obligatoire.

1ERE FICHE TECHNIQUE

EXAMEN CYTOBACTERIOLOGIQUE DES URINES.

I Prélèvement.

Recommandation : SUJET ADULTE OU COOPERATIF

Expliquer au patient les conditions du prélèvement, avec précision.

-vider la vessie avant de dormir.

- Au réveil avant la miction, se laver au savon, sans essuiyé, jeter le 1er
jet, recueillir les urines dans le flacon stérile ; aussitôt fermer le flacon.

Chez la femme

Après une toilette intime soigneuse, la femme passe une compresse imbibée
de dakin, d’avant en arrière, puis s’essuie avec une compresse sterille (avant
vers l’arrière). Elle écarte d’une main les grandes lèvres, élimine le premier jet,
et recueille les urines du milieu dans un récipient stérile, à large diamètre.

ACHIMINEMENT DU PRELEVEMENT.

Les urines doivent êtres acheminées dans les 2 heures qui suivent le
prélèvement.
Dans le cas contraire les urines doivent êtres conservées au frigidaire à
4°C pendant 1h puis il faut les acheminées laboratoire.
Sujet non coopératif.
CHEZ L’ENFANT /
Les recommandations doivent êtres données au tuteur.
Sont pratiquement les mêmes.

CHEZ LE NOURRISON.
Après une bonne toilette au savon qui consiste :

- Laver avec une eau savonneuse, puis tamponnée avec une

compresse stérile, puis nettoyer avec du dakin, aussitôt mettre de
l’eau physiologique et sécher avec une compresse stérile, placer le
collecteur à urine et attendre 20à30mn, et refaire l’opération au
cas où il y a pas eu l’urine.

Chez les porteurs de sonde à demeure. : On clampe le tuyau d’évacuation

pendant 10mn afin de laisser l’urine s’accumuler en amont, puis on ponction la
tubulure après désinfection à l’alcool iodé. Il ne faut pas déconnecter le
système de drainage qui doit rester fermé.

La ponction sus-pubiennes. Elle présente les garanties idéales de prélèvement

dans des conditions aseptiques totales. Elle doit être utilisée dans tous les cas
ou le recueil de l’urine du milieu du jet est impossible.

Au laboratoire

Une fois le prélèvement, est acheminé au laboratoire, le prélèvement est

enregistré au niveau de la réception ou il sera pris en charge.

B- TECHNIQUE DE REALISATION DE L’ECBU

A la couleur

Normalement l’urine est jaune claire.

Peut être : -Jaune orangée : maladie fébriles aigues.

- Rouge : présence du sang ou absorption de certains aliments.

- Brune –verdâtre : dans le cas de maladie hépatovésiculaire.
- Noire : Tumeur maligne.
- Brune : en cas de putréfaction intestinale.

B- l’odeur

A cétonique : chez les diabétiques.

Parfois certaines odeurs peuvent apparaitre avec certains médicaments.

C- La transparence
Une urine fraichement émise est limpide, si elle présente un trouble
spontanément en refroidissant, il y a présence d’urates d’acide urique, une
urine trouble à l’émission peut faire penser à la présence de pus.

D- la viscosité

Légèrement supérieure a celle de l’eau et dépend probablement de sa teneur

en urée, pouvant être modifie par la présence de pus.

E- Examen direct / Examen qualitatif : Consiste à l’observation entre lame et

lamelle d’une goutte du culot de l’urine de centrifugation, il permet de voir les
éléments normaux, et anormaux

a - éléments normaux.

On peut retrouver :

- Des cellules épithéliales.

-Des cellules rondes.

-Une flore non riche (insignifiante).

b- élément anormaux.

-Leucocytes.

- Hématies.

- Trichomonas.

- œuf de bilharzie.

- Cylindres, purulent ou granuleux (renferme des leucocytes), hématiques,

hyalin.

- Cristaux. (D’urates, d’oxalate de calcium, d’acide-urique, cystine, lysine ;

phosphates ammoniaques magnésium…) signe de maladie.

- levures.

NB/Certains éléments est un signe de contamination : spermatozoïdes dans les

deux cas (femme et homme), présence de la flore dodérlein dans l’urines de la
femme. Présence d’une flore seule dans l’urine. Dans ces cas il faut refaire
l’ECBU.

Examen quantitatif

Consiste a dénombrer les leucocytes et les hématies, présentes dans l’urine et

a exprimer leur nombre par unité de volume (mm3et ml).

On utilise les cellules malassez , nageotte …

COMPTE D’ADDIS

IL est effectué dans la surveillance des néphropathies interstitielles.

On demande au patient de vider sa vessie, puis lui faire boire un grand verre
d’eau ou autres boisson (jus, thé…), le faire allonge ou asseoir.

Recueillir les urines pendant 3heures qui suive dans un flacon propre

Soit v = volume de la diurèse en ml. Pendant 3h.

A = le nombre d’éléments par ml.

Compte d’addis= a x v/180 éléments/min.

Normalement, il y a de 500 à 1000 leuc/min, et moins de 500 hématies/min.

F-MISE EN CULTURE

Une coloration de gram, nous permet de compléter le choix des milieux si

nécessaire.

La gélose nutritive ; et le milieu de base, qui sert à la fois d’isolement et de

dénombrement de germe.

1-Techniques d’ensemencements.

A-Méthode de kass consiste à faire des dilutions en série de 10 en 10 ; puis

ensemencer un volume connu de chacune de ces dilutions sur GN. La
bactériurie est calculée à partir du nombre de colonies présentes sur la boite
en tenant compte de la quantité d’urine ensemencée et de la dilution.
B-Méthode des stries

03 stries parallèles de 3.5cm de long séparées par des intervalles de 15cm sont
tracées à l’aide d’un marqueur.

A l’aide d’une anse calibrée 0.1µl ; la goutte d’urine est déposée sur l’extrémité
de la 1er ligne, est en seul trait la goutte est étalée sur tout le long de la strie.

Sans replonger l’anse dans l’urine ; en refait le procédure dans la 2eme et la 3eme
stries.

Lecture : Absence de colonie = culture stérile.

Culture sur la 1er et la 2eme ; numération inferieure ou égale 104bactéries/ml.

Culture sur les 3 stries : Numération supérieure ou égale à 105 bactéries/ml.

2-Technique de la lame gélosée

La lame composée de deux milieux de cultures gélosée permettant de

déterminer la bactériurie par simple trempage dans l’urine.

Cette lame est aussi composée, d’une verte (CLED) cystine lactose électrolyte
déficient. Croissance de toutes les bactéries, permettant ainsi la détermination
du nombre total des bactéries présentes dans l’urine.

Colonies lactose+/ couleur jaune.

La deuxième face rouge --- Mac conkey/ inhibe la croissance des bactéries
Gram positif.

Colonies lactose (+) ---- sont de couleur rouge brique.

Colonies lactose(-) ----- sont de incolore.