Lección 1. Enzimas de restricción.

Un par de
cuestións traballando cos datos das bases de datos
moleculares.

1. Localiza as secuencias palíndromicas de corte das enzimas EcoRI

(GAATTC/CTTAAG), HindIII (AAGCTT/TTCGAA) e PstI
(CTGCAG/GACGTC). Cantos fragmentos se espera que produzan os
ataques sobre o xenoma completo do fago lambda con cada un
deses enzimas?

Para el enzima E.cori se fragmenta en 6 trozos, para el enzima Hindill se

fragmentará en 7 trozos la cadena de ADN, para el enzima Psti se
fragmentará en 29 trozos.

2. Cantos pares de bases ten cada un deses fragmentos? Se non es

quen de resolver esta pregunta na páxina do NCBI, podes usar o
geneboy (http://www.dnai.org/geneboy/) para resolver esta
cuestión.

Para E. cori:
En el primer fragmento hay 21226 pares de bases nitrogenadas
En el segundo fragmento hay 4878 pares de bases nitrogenadas
En el tercer fragmento hay 5643 pares de bases nitrogenadas
En el cuarto fragmento hay 7421 pares de bases nitrogenadas
En el quinto fragmento hay 5804 pares de bases nitrogenadas
En el sexto fragmento hay 3550 pares de bases nitrogenadas

Para Hidll:
En el primer fragmento hay 23130 nucleótidos
En el segundo fragmento hay 2027 nucleótidos
En el tercer fragmento hay 2322 pares de bases
En el cuarto fragmento hay 9416 nucleótidos
En el quinto fragmento hay 564 nucleótidos
En el sexto fragmento hay 6682 nucleótidos
En el séptimo fragmento hay 4361 nucleótidos

Para el Psti:
En el primer fragmento: 2560 nucleótidos.
En el segundo fragmento: 264 nucleótidos.
En el tercer fragmento: 805 nucleótidos.
En el cuarto fragmento: 15 nucleótidos.
En el quinto fragmento: 216 nucleótidos.
En el sexto fragmento: 514 nucleótidos.
En el séptimo fragmento: 339 nucleótidos.
En el octavo fragmento: 200 nucleótidos.
En el noveno fragmento: 211 nucleótidos.
En el décimo fragmento: 94 nucleótidos.
En el undécimo fragmento: 468 nucleótidos.
En el duodécimo tercer fragmento: 2838 nucleótidos.
 En el décimo tercero fragmento: 1093 nucleótidos.
En el décimo cuarto fragmento: 164 nucleótidos.
En el décimo quinto fragmento: 1986 nucleótidos.
En el décimo sexto fragmento: 72 nucleótidos.
En el décimo séptimo fragmento: 2459 nucleótidos.
En el décimo octavo fragmento: 95 nucleótidos.
En el décimo noveno fragmento: 1705 nucleótidos.
En el vigésimo fragmento: 155 nucleótidos.
En el vigésimo primero fragmento: 1159 nucleótidos.
En el vigésimo segundo fragmento: 2443 nucleótidos.
En el vigésimo tercero fragmento: 448 nucleótidos.
En el vigésimo cuarto fragmento: 2140 nucleótidos.
En el vigésimo quinto fragmento: 4507 nucleótidos.
En el vigésimo sexto fragmento: 5077 nucleótidos.
En el vigésimo séptimo fragmento: 247 nucleótidos.
En el vigésimo octavo fragmento: 4749 nucleótidos.
En el vigésimo noveno fragmento: 11497 nucleótidos.

Cuestiones sobre el trabajo realizado en el laboratorio:

1. Describe o aspecto macroscópico do ADN en disolución. É visible

o ADN? (Podes tomar como referencia para comparar o que viches
na práctica “xenética a domicilio”). Se pensas que hai algunha
diferencia entre as dúas observacións, a que se pode deber?

No pudimos apreciar el ADN porque primeramente una característica

de él es que en disolución acuosa no se puede ver y tampoco
utilizamos cantidades con las que pudiéramos ver, del orden del
micro litros y en comparación con la genética a domicilio en la cual si
podríamos apreciar la interfase (con ayuda del alcohol) se aprecia
mucho mejor, al eliminar las membranas fosfolipídicas.

2. Enche a táboa seguinte cos volumes usados na práctica.

Tubo Lambda Tampon Psti (µL) Ecori (µL) Hidll (µL)

(µL) (µL)
L 4 6
P 4 5 1
E 4 5 1
H 4 5 1

3. En que tubo pensas que non vai a haber cambios, que non se van
a producir fragmentos de restricción do ADN?

En este caso, el tuvo amarillo (no presenta enzima de restricción) va a

mostrar una banda de ADN, al no tener enzima no se va fragmentar.
4. Compara o tubo P e o tubo L, qué pensas que pasará no tubo P
comparado co tubo L?
Xustifica a resposta.

La diferencia entre el tubo P (con enzima psti) y el L es que en el tuvo L no

hay presencia de enzima de restricción su recorrido por el gel será en
forma de banda ancha y no como fragmentos.

5. Se o ADN aparecese fragmentado ó final da reacción no tubo L,

que teríamos que concluir?

Concluiríamos que nos hemos equivocado al rotular los tubos o que hay
presencia de algún tipo de contaminación.

Lección 2: electrofóresis en gel de agarosa

1. Indica cal será o ordenamento relativo dos fragmentos de

ADN segundo o seu tamaño,dentro do xel de agarosa. Indica
cal é a causa de ese ordenamento.

La velocidad de separación aplicando la técnica de la electroforesis depende

de la concentración del gel y el voltaje aplicado a la misma (intensidad de
corriente). La agarosa actúa como un filtro en el que los fragmentos de
menor tamaño migran más que los de mayor tamaño.
Si aumentamos la concentración de agarosa, dificultamos el movimiento de
los fragmentos a lo largo del gel, aunque esto implicaría una mayor
resolución.
El incremento del voltaje aumenta proporcionalmente la velocidad de
migración de los fragmentos en el gel.

2. Supoñendo que tiveramos 500 pequenos anacos de cada un

dos catro fragmentos logo dun tratamento con enzimas de
restricción, cantas bandas aparecerían no xel de agarosa?

Cuatro bandas (fragmentos) con quinientos trozos de ADN cada uno

3. Enche a seguinte táboa cos datos obtidos na práctica:

Utilizando la serie S como referencia:

 M M L L Pst Pstl Eco EcoRI HindI HindI
l RI II II
mm pb m pb mm pb mm pb mm pb
m
Band 16 2313 16 962 23. 494 16 9624 19.8 7049
a1 0 4 5 0
Band 17 9416 - - 26. 352 22.6 5422 23.5 4940
a2 4 3
Band 20 6557 - - 29. 229 23.5 4940 28.2 2719
a3 2 5
Band 23. 4361 - - 31 156 25 3987 31.1 1527
a4 5 6
Band 29 2322 - - 33 804 33.9 476.2 33.9 476
a5 3
Band 31 2027 - - 34. 157 - - 34.8 149
a6 8

La gráfica resultante:
 Lección 3. Cómo se fai para converter en visible o
ADN migrado nun xel de agarosa.

1. Indica a utilidade do tampón de carga e da tinción Fast Blast.

El tampón hace que en el gel de agarosa se pueda ver durante el

recorrido de ADN, gracias a la tinción del tampón con el Faste blast
(que tiñe el tampón) así no se salen del carril por donde se van a
crear las bandas de ADN.