Guía: Observación de microorganismos y uso de tinciones

ESCUELA DE SALUD

GUÍA
OBSERVACIÓN DE
MICROORGANISMOS Y USO DE
TINCIONES

DIRIGIDO A ALUMNOS DE:

Técnico de laboratorio Clínico y Banco de Sangre

Técnico de Enfermería
Técnico de Radiodiagnóstico y Radioterapia
Informática Biomédica

PRE-REQUISITO:
No tiene

Autores: TM Soledad Caimanque

E.U. Eliana Escudero
DuocUC
 Guía: Observación de microorganismos y uso de tinciones

INTRODUCCIÓN

Los microorganismos son demasiado pequeños para observarse a simple vista:

Protozoos, algas, hongos, bacterias y virus.
Estos microorganismos difieren en características tales como forma de
nutrición, estructura, tamaño, composición, entre otros aspectos; es por ello
que se emplea el estudio microscópico el que facilita notablemente la
observación; principalmente de las bacterias al tratarlas con colorantes los
cuales a la vez facilitan la observación de ciertas estructuras celulares.
En este taller vamos a distinguir la estructura celular de algunos
microorganismos, como por Ej.: Staphylococcus, Streptocococcus, bacilos etc.

OBJETIVOS:

Al finalizar el taller el alumno será capaz de:

 Observar al microscopio distintas tinciones
 Diferenciar las características generales de los microorganismos según
su tinción.
 Trabajar en forma ordenada y limpia
 Trabajar con un lenguaje científico, de uso muy habitual.

REALIZADO POR:
Tecnólogo Médico, Bioquímico de laboratorio clínico, Medico laboratorista,
Biólogo.

DURACIÓN:
90 minutos

NUMERO DE ALUMNOS POR DOCENTE

Máximo 20 alumnos

Autores: TM Soledad Caimanque

E.U. Eliana Escudero
DuocUC
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MARCO TEÓRICO
El termino gram positivo y gram negativo son parte de un lenguaje común en
salud y muchas veces solo se tendrá esta identificación de la bacteria antes de
iniciar un tratamiento. Es también por esto habitual, que al tomar un cultivo de
una muestra para su análisis microbiológico, se realice un extendido que se
conoce como gram y está relacionado con estas técnicas que serán para
algunos alumnos motivo de mayor estudio en sus ramos posteriores.

Microorganismos Gram. Positivos

Las eubacterias Gram. positivas son células con una gruesa pared celular de
peptidoglicano.
Estás células poseen una membrana citoplasmática con fosfolípidos y
proteínas. Por fuera de la membrana citoplasmática se encuentra la pared
celular que está compuesta por una ancha capa de peptidoglicano. A su vez,
estas cadenas se encuentran unidas entre sí mediante péptidos, que son
pequeñas cadenas de aminoácidos que se entrecruzan. Estos puentes
peptídico son característicos de las distintas bacterias y presentan mayor
rigidez cuanto más completo sea el entrecruzamiento.

El peptidoglicano es una malla porosa que otorga forma y rigidez a la célula, y

evita que la célula estalle en medios hipotónicos. Al ser porosa permite el paso
de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catalíticas y
productos de secreción hacia el exterior de la célula.

Esquema de las Envolturas de una Eubacteria Gram. Positiva

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Microorganismos Gram Negativos

Las eubacterias Gram. Negativas son células con una delgada capa de
peptidoglicano y una segunda envoltura denominada membrana externa.
Las células se encuentran envueltas por una membrana citoplasmática
formada por una bicapa fosfolipídica y proteínas. Por encima de esta
membrana se encuentra una fina capa de peptidoglicano que se halla unida a
unas lipoproteínas de anclaje que fijan la membrana externa.

Esquema de las envolturas de una eubacteria Gram. Negativa

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Bacilos Ácido-Alcohol Resistentes

Los microorganismos pertenecientes al género Mycobacterium se
caracterizan por tener una pared celular completamente diferente a las
restantes eubacterias. La pared de las Mycobacterias posee un alto contenido
de lípidos que la hace impermeable a los agentes hidrofílicos, por lo tanto estos
microorganismos no se tiñen adecuadamente con los reactivos utilizados en la
coloración de Gram. y no pueden ser clasificados como Gram positivos o
negativos. Las Mycobacterias son teñidas adecuadamente por el método de
Ziehl-Neelsen (Tinción Ácido-Rápida o Acid-Fast Stain) que utiliza como
solución decolorante una mezcla de etanol y ácido clorhídrico. Estos
microorganismos una vez coloreados son resistentes a la decoloración ácido-
alcohólica y por eso se denominan Bacilos Ácido Alcohol Resistentes
(BAAR).

Esquema de las envolturas de una eubacteria Ácido-Alcohol Resistente

La observación microscópica puede realizarse a partir de una muestra (examen

directo) o bien a partir de cultivos y según como se haga la preparación se
pueden clasificar en:
1.- Examen al Fresco. (Microorganismos vivos)
Se utiliza normalmente para ver movilidad de las bacterias.
En el caso de hongos y protozoos, permite determinar además características
morfológicas.

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2.- Frotis Fijado (microorganismos muertos) Este método permite observar con
mayor precisión detalles morfológicos y de agrupación de los microorganismos.

INSUMOS Y EQUIPOS NECESARIOS PARA EL TALLER

 Laboratorio de ciencias básicas (mecheros y lavamanos).
 Microscopios ópticos (mínimo 1 cada 2 alumnos)
 Xilol
 Aceite de inmersión
 Papel filtro
 Papel tisúes o papel suave
 Porta objetos (3 por alumno)
 Cubre Objetos (2 por alumno)
 Asas de punta (20 unidades)
 Pipetas pasteur estériles y taponadas (3 por alumno)
 Pinzas metálicas (una por alumno)
 Cultivos de microorganismos (Placas de Agar Sangre sembradas en
Taller de “Realización de cultivos”)
 Set de tinción de Gram.
 Muestras Fijadas con BAAR. Positivos. ( solo para demostración)
 Jabón liquido.
 Clinic
 Cajas de bioseguridad
 Guantes (un par por alumno)

DESCRIPCIÓN DEL PROCEDIMIENTO

Actividad 1:
El docente realiza y explica los tres procedimientos.

Actividad 2:
Los alumnos los divide en grupo y hace repetir uno de los procedimientos

Actividad 3:
Los alumnos rotan observando cada actividad.

Procedimiento examen al fresco:

A.-realizar una preparación húmeda entre portaobjeto y cubre objeto
Si es de una colonia (material sólido) se debe suspender en pequeñas gotas
de suero fisiológico.

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Si es de un caldo de cultivo (material líquido) se deposita directamente una

gota sobre el portaobjeto y se cubre con un portaobjeto.
B.-se puede agregar una pequeña cantidad de colorante vital como: Azul de
Metileno, que facilita la observación.

Procedimiento Frotis fijado:

A.- colocar una pequeña gota de agua en el centro del portaobjeto limpio.
B.- flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones asépticas, una pequeña
cantidad del cultivo bacteriano en medio sólido y transferirlo a la gota de agua.
C.- remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensión
homogénea que quede bastante extendida para facilitar el secado.
D.-Si la muestra se toma de un cultivo en medio líquido, no es necesario
realizar los dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota
de la suspensión bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente
sobre el portaobjetos.
E.- Esperar hasta que el líquido se evapore o acelerar su evaporación
acercando el portaobjetos a la llama del mechero. En este caso hay que tener
mucha precaución de no calentar demasiado el portaobjeto pues las células
pueden deformarse o romperse.

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Tinción del frotis bacteriano

Tinción de Gram:

1.- Cubrir la preparación con cristal violeta o violeta de genciana durante 1

minuto.
2.- Decantar el colorante y lavar suavemente con agua
3.- Cubrir con Lugol por 1 minuto lavar suavemente con agua
4.- Decolorar con alcohol-acetona. Hasta que la preparación deje de perder
color (30 segundos).
5.- Cubrir con fuccina o safranina por 30 segundos.
6.- Remover suavemente el exceso con agua corriente.
7.- Drenar el frotis y secarlo al aire en posición vertical o subvente con papel
filtro.
8.- Limpiar el reverso.
9.- Examinar al microscopio

BIBLIOGRAFÍA
Procedimiento y técnicas de laboratorio, instituto de salud publica.
Microbiología médica, José Ángel García-Rodríguez
Enciclopedia Encarta 2004

METODOLOGÍA DE EVALUACIÓN:
El taller será evaluado mediante la realización de preguntas referente a lo
observado y con tema revisado en clase anterior. Y de una pauta de
evaluación
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1.- ¿Cuántos tipos de colonias observa en su muestra . Descríbalas.

2.- Describa la morfología encontrada en cada una de ellas. EJ. Cocaceas,

bacilos etc.

3.- Que importancia le da usted al lavado de manos una vez que ha observado
al microscopio.

Nombre del alumno:

Fecha:
Puntaje: Nota:

Observación de microorganismos y uso C MC NC

de tinciones
1.Cumple con una correcta presentación
personal:
-delantal
-pelo tomado
-uñas cortas y limpias
2. Describe las colonias
3. Describe la morfología
4. Fundamenta el lavado de manos
5. Ordena y limpia su unidad al finalizar el taller

C: Competente

MC: Medianamente Competente

NC: No Competente

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