OBTENTION D’UNE SÉRIE DÉFINIE DE

DILUTIONS A PARTIR D’UNE SUSPENSION DE

GERMES FONGIQUES
J. Le Bars

To cite this version:

J. Le Bars. OBTENTION D’UNE SÉRIE DÉFINIE DE DILUTIONS A PARTIR D’UNE SUSPEN-
SION DE GERMES FONGIQUES. Annales de Recherches Vétérinaires, INRA Editions, 1972, 3 (3),
pp.435-447. �hal-00900719�

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 OBTENTION D’UNE SÉRIE DÉFINIE DE DILUTIONS
A PARTIR D’UNE SUSPENSION DE GERMES FONGIQUES

J. LE BARS

Station de Pharmacologie-Toxicologie, I. N. R. A.,

.,

180, Chemin de Tournefeuille

31 - Toulouse

RÉSUMÉ

L’auteur se préoccupe de la contamination des fourrages par des Micromycètes. Ne pouvant obtenir
des suspensions homogènes et des dilutions reproductibles, il a recherché une technique adéquate.
Dans un premier temps, il a comparé divers dispersants non germicides, contenant des billes
de verre, eau salée (8 p. i ooo), eau gélosée (i p. i ooo), eau peptonée (i p. i ooo), Tween 8 0
(r p. i ooo), DMSO (i p. r ooo), vis-à-vis de microorganismes présentant une résistance crois-
sante à la dispersion, E. coli, B. cereus, Sta. albus, M. circinelloides, A. oryzae ; les agents
mouillants, Tween 8 0 et DMSO, permettent d’obtenir une dispersion au hasard de tous les micro-
organismes considérés. Dans une seconde étape, à l’aide du liquide ayant donné les résultats
les plus proches de ceux d’une suspension idéale et du champignon le plus difficile à disperser,
des dilutions sont réalisées après homogénéisation effectuée à l’aide d’un agitateur de type
Vortex ; les numérations sont faites soit à la cellule hématimétrique, soit en milieu gélosé ; les
résultats obtenus à chaque dilution ne diffèrent pas significativement de ceux attendus théo-
riquement, dans la mesure où l’homogénéisation est réalisée à l’agitateur. Enfin, la technique
retenue a été éprouvée avec succès par l’analyse mycologique quantitative de fourrage broyé,
stérilisé, monocontaminé par l’A. oryzae, humidifié de façon variable et incubé ou non; cette
dernière opération correspond d’une part au contrôle du nombre de spores ensemencées dans
un substrat stérilisé et, d’autre part à l’a»alyse mycologique d’échantillons naturellement
contaminés où il y a non seulement des spores mais aussi des hyphes végétatives.

INTRODUCTION

Toute étude quantitative en microbiologie exige une technique fidèle d’homo-

généisation et de numération des germes, que celle-ci soit destinée à une étude écolo-
gique, à la recherche d’un procédé d’analyse des échantillons ou au contrôle du nombre
de spores ensemencées dans un substrat donné.
Dans le cadre de l’étude de la contamination des fourrages par des Micromycètes,
de leur croissance et de la production éventuelle de métabolites toxiques dans ces
substrats peu hydratés, la première difficulté que nous avons rencontrée a été d’ob-
tenir des suspensions homogènes et des dilutions reproductibles, à la fois pour l’iso-
lement des espèces fongiques sur des milieux gélosés et pour la connaissance de la
densité de l’ensemencement en spores lors d’essais de monocontamination de four-
rages. Or la technique d’homogénéisation et de dilution dans de l’eau physiologique,
utilisée couramment en analyse bactériologique et fréquemment en analyse mycolo-
gique du sol (BRI!RI,!Y et G IL., I
27
g ; AN,
AKSM 1944 ; MO
W TRGUT, I
N g6o ; POCHON et
ARDIEUX 2
T
, g,
I
) 6 ne semble pas, dans le cas présent, convenir ; G REGORY et L ACEY
g,
I
(
)
3 6 dans leurs travaux sur des foins moisis, l’ont abandonnée en raison de son
manque de reproductibilité.
Pour résoudre cette difficulté, nous avons procédé en trois étapes. Nous avons
d’abord recherché un liquide de suspension assurant une dispersion au hasard, contrô-
lée à l’hématimètre, des éléments dissociés d’espèces microbiennes très différentes
par leur organisation, leur structure et leurs propriétés de surface. Puis, à l’aide du
dispersant le plus efficace et d’un champignon rebelle à cette opération, nous avons
testé, par des comptages d’éléments fongiques à l’hématimètre et de germes viables
par numération des thalles en plaque gélosée, la « cohérence » des 1 dilutions ( et
)
l’homogénéité des suspensions obtenues par deux techniques d’agitation. Enfin,
nous avons vérifié que la technique retenue était applicable aux problèmes pratiques
à résoudre, à savoir, d’une part le contrôle du nombre des spores viables ensemencées
dans un substrat pulvérulent peu hydraté, d’autre part la préparation de suspen-
sions pour l’isolement et la numération de germes fongiques viables après croissance
dans ce type de substrat.

I. -
CHOIX D’UNE PHASE DE DISPERSION

I,’incohérence des résultats à différentes concentrations vient principalement du

fait que, pour la plupart des Micromycètes se développant sur des substrats peu
hydratés, les spores sont hydrofuges (D OBBS et , INSON 19
H ) ; en conséquence, elles
0
6
ont tendance à s’agglomérer et à se rassembler aux interfaces liquide-solide ou liquide-
air. La dispersion de ces microorganismes est favorisée par l’agitation en présence
de sable de quartz ou bien de graviers stériles (C SEN, Ig
N
TE
HRIS 6 ; JA
4 ES, 8
M 94
I ;
PI 3
S
,
R
E
H
C g6
I
) ; l’emploi de billes de verre de 3 mm de diamètre donne des résultats
équivalents tout en évitant l’obstruction des pipettes (POISSON et r,soT,
UI 1957
G ).
On peut aussi améliorer la dispersion en utilisant un agent mouillant, comme le
montrent les travaux de Jor,Y 6 19 sur l’évaluation du taux de sporulation par
(
)
0
la technique hématimétrique ; mais si le bromure de lauryl-diméthyl-carbéthoxy-
méthyl-ammonium (JoLY, 19 ) et le Teepol (MOREAU et al., 19
0
6 66) conviennent
pour une numération à la cellule, il paraît préférable de les éviter dans les cas où
les suspensions obtenues doivent être mises en culture ; de par leur nature chimique,
on peut, en effet, les suspecter de certaines propriétés germicides. Pour améliorer

l’homogénéité des suspensions destinées à l’ensemencement, certains auteurs utilisent

des solutions faiblement peptonées (SPICFI!R, 19 63 ; POISSON, 1965) ou gélosées (PE
-
L
HATE, 19) ;
7
6 mais le pouvoir dispersant de ces solutions n’ayant pas été testé à
) On dit que des dilutions sont cohérentes lorsque le nombre de germes observés dans
1
( chaque dilution
reflète bien la raison suivant laquelle la série de dilutions a été effectuée.
 notre connaissance, nous nous sommes proposé de l’éprouver comparativement à
celui de solutions d’agents mouillants non germicides, Tween 8
0 et diméthylsul-
foxide (DMSO) (Svx!s, 195
8 ; TE
OU zg67 ;
B
,
T EAN
Bet al., ig6g).
Dans le cas des champignons, il faut convenir que le problème est particulière-
ment délicat ; en effet, ces derniers présentent en suspension une grande hétérogénéité
de formes ayant des structures et des rapports surface sur volume différents ; or,
l’homogénéité d’une dispersion tient, au premier chef, à la part respective représentée
par chacun de ces éléments dans l’ensemble de la population soumise à la dispersion.
Ceci nous a incité à tester l’efficacité de ces agents mouillants tout d’abord sur des
populations dont les unités sont pratiquement toutes identiques ; c’est la raison pour
laquelle nous nous sommes adressé, au préalable, à des bactéries.

. I
I . -

Matériel et méthodes
i. ii. Principe du test.

Si l’on
place dans une cellule hématimétrique une goutte de suspension homogène, l’analyse
statistique montre que les particules sont distribuées dans les différentes mailles de la cellule
selon une loi de Poisson. Si, au lieu de cette suspension idéale, on veut tester une suspension
obtenue par la mise en ceuvre de techniques variées, deux cas peuvent se présenter ; ou bien la
répartition des particules suivra la loi de Poisson, ce qui signifiera que ces dernières se sont déga-
gées de leur interaction mutuelle ; ou bien la répartition ne suit pas la loi de Poisson, et on pourra
considérer que la technique mise en oeuvre est imparfaite (L ELLOUCH et , AZAR i
L 68). L’analyse
9
a de préciser dans lequel de ces deux cas on se
statistique permet, par l’application d’un test de
X
trouve.
Pour cette raison, la de numération en plaque gélosée a été écartée dans ce test
technique
puisqu’elle ne de rendre compte d’une manière univoque du nombre exact de parti-
permet pas
cules, dans la mesure où une thalle peut dériver éventuellement d’un agrégat particulaire ; d’autre
part la technique hématimétrique évite la constitution de séries de dilutions, et donc l’interven-
tion d’un facteur de variation supplémentaire.

: 12.
z Microorganismes.
Nous nous sommes adressé à des microorganismes présentant, du fait de leur structure et
de leur organisation, une résistance croissante à la dispersion :

des Bactéries - Esehe

ichia coli,
y coccobacille Gram-négatif, sans mode de groupement
particulier ;
Bacillus cereus, bacille Gram-positif, en état de sporulation avancée ;
-

Stapkylococcus albus, coccus Gram-positif, groupement en grappes ;

-

un représentant des Actinomycètes, fréquents dans les foins (G

GORY et ,
É
R ACEY 19
L )
3
6
Streptomyces rimosus,
-

des ckampignons :.’

Mucor ES
-
Yd
2
C
i
O
2YLell C VAN , EGHEM Siphomycète, spores lisses, mouillables ;
I
T
Aspergillus LM
-

LHE Septomycète, spores échinulées, non mouillables,

I
aeW
OZYZ
,
de taille irrégulière.

Les conditions de culture de ces microorganismes sont résumées dans le tableau i.

.
1 .
13 Milieux de dispersion et mise en suspension.
Nous avons comparé de l’eau salée (8 p. i ooo), de l’eau peptonée (i p. i ooo), de l’eau gélo-
sée (i p. i ooo), une solution de Tween 80 (i p. i ooo) et une solution de DMSO ( 1 p. 1 ooo). 20 ml
de dispersant et des billes de verre de 3 mm de diamètre occupant un volume de 3 ml sont ajoutées
aux tubes contenant la culture sur milieu gélosé ; la mise en suspension est réalisée
par agitation
manuelle normalisée, selon un arc horizontal de 30 cm, à raison de i 2o périodes par minute (B -
R
E
RI
EY et al., 1927
L ) pendant minutes ;
10 cette suspension et les billes sont transférées dans un autre
tube à vis et, après un premier examen à l’hématimètre, son volume est ajusté de telle façon que
le nombre moyen de particules par case de l’hématimètre soit environ de cinq pour les bactéries
et de deux pour les champignons ; ces densités limitent les erreurs de comptage et permettent
une mise en évidence plus nette des agglomérats de germes. Après une nouvelle agitation manuelle,
(io mouvements horizontaux de va-et-vient), le prélèvement est effectué immédiatement, toujours
avec la même pipette (J, 19
OLY ) pour emplir la cavité de la cellule de Thoma. Pour chaque
0
6
examen, on constitue un tableau de fréquence des cases contenant un nombre déterminé de par-
ticules, le nombre total de cases observées étant de 200 environ ; est compté comme particule
tout élément individualisé, qu’il soit isolé ou aggloméré, bactérie, spore, débris d’hyphes. Puis
I de comparaison entre la distribution observée et la distribution théorique obéis-
on calcule le X
sant à une loi de Poisson.

. 2
1 . -

Résultats
L’ensemble des résultats des comparaisons des distributions observées à celles
obéissant à une loi de Poisson figure dans le tableau 2, le nombre de degrés de liberté
est indiqué entre parenthèses. Les seuls liquides de dispersion ayant permis d’obte-
nir, pour tous les microorganismes considérés, une distribution ne différant pas
significativement (oc )05 de celle de Poisson, sont les solutions
,
0
= de Tween 8 0
et de DMSO.
i. 3. -
Discussion

On peut remarquer tout d’abord que même pour certaines bactéries (Sta!hylo-
coccus albus, dans le cas présent), la mise en suspension dans de l’eau salée ou peptonée
n’assure pas une bonne dissociation des grappes. Les valeurs obtenues avec le M. cir-
cinelloides, en l’absence d’agent mouillant, sont plus faibles qu’avec l’A. oryzae ;
ceci correspond bien à leur affinité respective vis-à-vis de l’eau. L’A. oryzae est, parmi
les microorganismes utilisés dans cette étude, le plus difficile à disperser ; ceci tient
au fait que ses spores sont d’une part hydrofuges, et, d’autre part, de taille variable
et irrégulièrement échinulées (RAPER et FE , tg65), caractères qui favorisent un
L
E
NN
accroissement du coefficient de variation des comptages à l’hématimètre (Jo!,y, ig6o).
I,es solutions de DMSO et de Tween 8 0 permettant d’obtenir des distributions
ne s’écartant pas significativement d’une loi de Poisson, on peut dire que les par-

ticules y sont réparties au hasard et, en conséquence, que la dispersion est bonne.
Ces agents mouillants ne sont pas germicides aux concentrations utilisées (S ,
YKES
8 ; TET,
195 OU 19
B 7
6 ; B EANet al., ig6g et peuvent même accroître la production
d’alcaloïdes en fermenteurs (K, ig6g). Pour la suite, nous avons retenu le
ELLEHER
Tween 8 , malgré production d’un peu de mousse, car, d’une part le DMSO peut
0 la
inhiber la formation de pigments caractéristiques par certains champignons (C URTIS
, ig6
et BE
AN 7 ;Y ARLE
C et al., 19
67 ; BEAN et al., ig6g) et, d’autre part les suspensions
obtenues avec le premier présentent les plus faibles différences par rapport à une
suspension idéale.
Il est certain que chaque élément compté à la cellule de Thoma n’engendrerait
pas de thalle en milieu de culture, notamment des débris de sporocystes de M. circi-
nelloides et les spores immatures ; mais, ayant obtenu une distribution au hasard
pour l’ensemble des particules viables et non viables, nous avons de bonnes raisons
de penser que les premières suivent aussi les lois du hasard.
En conclusion, dans la poursuite de ce travail, nous avons retenu comme liquide
de dispersion le Tween 80 à i p. i ooo et, comme microorganisme, l’A. oryzae.

II. -

COHÉRENCE DES RESULTATS

ENTRE DES DILUTIONS SUCCESSIVES

Nous avons vu précédemment que le Tween 8 , en tube contenant des billes

0
de verre et agité vigoureusement à la main, entraîne une bonne dissociation des
éléments microbiens. Il convient à présent de savoir, d’une part si la suspension est
homogène à l’intérieur d’un tube et, d’autre part si les différentes manipulations
effectuées pour la constitution de séries de dilution et de distribution en plaques
gélosées permettent d’obtenir des densités en particules et en thalles correspondant
à la raison de la dilution.
Expérimentalement, nous avons regroupé ces deux aspects en un seul ; en effet,
dans la mesure où, à partir d’une suspension, les résultats aux différentes concentra-
tions sont cohérents et que ceci est réalisé avec des suspensions plus ou moins denses
du même microorganisme, on peut admettre que la répartition des particules aux
différents niveaux d’un même tube est homogène.

. 1
2 . -

Matériel et méthode
. II
2 . Principe du test.
A partir d’une convenablement dispersée, dont la richesse en particules est con-
suspension
nue, on réalise des dilutions suivant une raison définie. Chaque dilution fait
l’objet d’une numé-
ration soit en cellule hématimétrique, soit en plaque gélosée ; on compare alors les chiffres obtenus
à ceux que l’on est en droit d’attendre en théorie ; on utilise pour cette comparaison le test du X2
ELLOUCH et ,
(L AZAR 19
L 68).

. 12
2 . Suspensions, dilutions.

Nous avons retenu pour cet essai le dispersant ayant donné les meilleurs résultats précédem-
ment, le Tween 8 0 à l p. I ooo, et le champignon se prêtant le moins à cette opération, l’A. oryzae.
A partir de huit tubes de culture, huit suspensions-mères sont effectuées comme ci-dessus. Les
séries de dilution sont réalisées à l’aide de pipettes à extrémité large (diamètre intérieur à l’ex-
trémité 2 mm), en progression géométrique de raisonq et de raison 2 , en tubes à vis étanches
contenant des billes de verre de 3 mm de diamètre occupant un volume de 3 ml. Avant chaque
prise d’essai, les tubes sont homogénéisés pendant 30 secondes, soit par rotation rapide du tube
entre les mains, soit à l’aide d’un agitateur de type Vortex, à une vitesse telle que la suspension
et les billes se répartissent au maximum le long des parois du tube.

2. 13. Numération.
Les numérations sont effectuées, soit à l’hématimètre pour la série de raison q, soit en boîtes
de Pétri pour la série de raison 2
, après incorporation de i ml de chaque dilution dans un tube de
milieu de Czapek gélosé en surfusion, qui est hémogénéisé, coulé en boîtes, la répartition y étant
assurée par 5 rotations dans un sens puis dans l’autre et enfin 5mouvements de va-et-vient. Après
incubation dans les mêmes conditions que précédemment, la lecture des plaques gélosées est effec-
tuée à la loupe binoculaire chaque jour entre le troisième et le septième jour d’incubation afin
de repérer les thalles avant qu’il y ait confluence et que la compétition soit importante ; comme,
d’autre part, nous sommes en présence d’une seule espèce fongique, nous n’avons conservé, pour
les calculs, que les concentrations ayant donné un nombre de thalles compris entre 4 et 10 par
6
boîte de Pétri.

.
2 -

Résuttats

Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau 3 . L’homogénéité des

suspensions-dilutions n’est pas réalisée par la simple agitation manuelle par rotation
rapide ; elle l’est, par contre, avec l’aide de l’agitateur de type Vortex.

2. 3! -

Discussion

La concordance entre les résultats obtenus par la technique hématimétrique

et par le comptage des thalles confirme l’hypothèse de la distribution au hasard
des particules viables. D’autre part, la distribution en milieu gélosé ne perturbe pas
la répartition des germes. En outre, le fait d’avoir tenu compte des résultats des
plaques gélosées où le nombre de thalles est nettement supérieur à 30 ou 5, habituel-
0
lement considéré comme optimal pour la numération d’une flore complexe (B RIERLEY
et al., i92! ; LHA
§ PE i
TE, 7
6
9 ; SPICH!R, 19 ) apparaît justifié. Comme seul l’emploi
3
6
de l’agitateur avant chaque pipetage a permis une bonne cohérence des résultats,
on peut penser que ces suspensions ont une stabilité précaire, notion qu’il convient
de ne pas oublier lors de l’application pratique.

II
I
. -

VÉRIFICATION DE LA TECHNIQUE RETENUE’1

NUMÉRATION DES GERMES FONGIQUES
DANS UN FOURRAGE MONO CONTAMINÉ

Il convient dès lors de vérifier que la technique résultant des essais précédents
est applicable aux problèmes pratiques posés, à savoir, d’une part le contrôle du
nombre de spores viables ensemencées dans un substrat pulvérulent et, d’autre
part la préparation de suspensions pour l’isolement ou la numération de germes
fongiques viables après croissance dans une denrée peu hydratée.

.
3 .
1 -

Matériel et méthodes
Le test utilisé est le même que dans le § 2 . i i. Du foin de luzerne broyé est réparti dans
15 fioles d’Erlenmeyer de 5 oo ml, à raison de 30 g dans chacune, auxquels sont ajoutées 5 billes
de verre de 5 mm de diamètre ; des spores d’A. oryzae y sont introduites et mélangées à sec ;
mis à part celui des lots témoins, le substrat, placé dans trois séries de trois fioles d’Erlenmeyer,
fait l’objet d’une pulvérisation d’eau stérile afin de réaliser une gamme croissante d’humidité.
L’ensemble est incubé pendant trois semaines à 22°C. Pour l’essai, chaque échantillon est homo-
généisé à sec ; deux grammes sont prélevés et mis dans un tube contenant 1 8 ml de Tween 80
(i p. ooo) et des billes de verre (comme dans le § z.i2) ; la dissociation danslasuspension-
i
mère est effectuée comme dans le § LI3 ; les dilutions et les comptages sont réalisés comme
.r, l’horrogénéisation étant effectuée à l’aide de l’agitateur.
dans le § 2
 3. 2, -
Résultats

1,a technique utilisée permet d’obtenir, pour l’ensemble des séries de dilutions,
des résultats cohérents, non seulement pour le fourrage contaminé par des spores,
mais aussi pour celui où ces spores ont germé et donné des hyphes végétatives dans
les séries humidifiées différemment et incubées (tabl. q.).

3. 3. -
Discussion
Il eût été pour que l’étude soit complète, de faire des comparaisons
nécessaire,
série ; mais ceci soulève deux autres problèmes
entre les trois échantillons d’une même
techniques qu’il convient de résoudre, l’humidification homogène du substrat et
l’ensemencement régulier de substrats pulvérulents ; le premier peut être facilement
résolu par équilibre hydrique en atmosphère contrôlée (So!,oMOrr, z 95
z ; TON
UL
M
et T, zg6& ;
ILBO
GU P!!,xnT!, ig6g) , le second est plus délicat, mais des comparaisons
valables pourront dorénavant être faites à ce sujet.
En éprouvant la technique retenue avec du fourrage monocontaminé par
l’!1. oryzae et humidifié de façon progressive, on se place dans des conditions voisines de
l’analyse mycologique d’un échantillon ; en effet, pour des teneurs en eau élevées du
substrat, nous sommes en présence non seulement de spores dans un fourrage mais
aussi de mycélium.

IV. -

DISCUSSION GÉNÉRALE ET CONCLUSION

Compte tenu des résultats antérieurs, il apparaît que la réalisation de dilutions

parfaitement définies pose, avec les champignons concernés (mycoflore des fourrages
secs), des difficultés qui ne semblent pas exister lors des contrôles quantitatifs de
la mycoflore du sol (BRI
Y
E
ERL et al., 1927 ; W xsnznN, 1944
A ; MONT!GUT, ig6o ;
PoCHON et , ARDIEUX ig62). S’agit-il de différence dans les propriétés de surface
T
des spores ? En effet, les spores de P. !alitans et P. nig
icans obtenues in vitro ne
y
sont pas mouillables, mais se comportent comme si elles l’étaient dans les suspen-
OBBS et Hrrrsorr, ig6o) en donnant des suspensions stables pendant
sions de sol (D
plusieurs heures. Ce phénomène serait dû, d’après ces auteurs, à une intervention
de la faune du sol, mais il semble aussi que le sable et les graviers puissent exercer
une action mécanique. S’il en est bien ainsi, on peut penser que, dans nos essais,
l’action érosive d’une agitation vigoureuse, en présence de billes de verre, est un fac-
teur non négligeable dans la réalisation de suspensions homogènes, qui demande
cependant à être associée à celle d’un mouillant.
Ici nous avons travaillé sur un substrat préalablement broyé ; mais l’analyse
d’échantillons non pulvérulents est susceptible de soulever d’autres difficultés.
La signification des numérations dépend du but poursuivi. Dans le cas d’une
étude expérimentale visant à contrôler l’ensemencement d’un substrat solide stérile,
elle est évidente. Par contre, dans les problèmes de conservation des denrées alimen-
taires, où ce ne sont pas uniquement les spores qui représentent un danger potentiel,
où la croissance végétative est susceptible de modifier la valeur nutritionnelle
des aliments et de les imprégner éventuellement de toxines, elle est plus équivoque.
En effet, par les techniques de dilution, les champignons sporulant beaucoup, tels que
des Aspergillus et des Penicillium, peuvent masquer, en milieu gélosé, la présence
d’autres Micromycètes sporulant peu mais dont la croissance végétative peut être
non négligeable dans le substrat naturel.

Quoi qu’il en soit, la technique proposée, dont le détail est donné en annexe I,
permet d’obtenir des dilutions cohérentes se prêtant bien à la numération des germes
fongiques, mais dont la signification reste assujettie au but poursuivi par l’expéri-
mentateur.

Reçu pour publication en mai 1972.

SUMMARY

ON OBTAINING A DEFINED SERIES OF DILUTIONS FROM A SUSPENSION

OF FUNGAL GERMINAL ELEMENTS

The author is engaged on a study of fungal contamination of fodder. Being unable to obtain
homogeneous supensions and reproducible dilutions during mycological analyses, an attempt
has been made to resolve this problem.
I : Firstly, a suspension medium facilitating random distribution of spores has been sought.
The dispersants tested were saline (i p. i ooo), peptone water (I p. I ooo), agar water (i p. i ooo),
a solution of Tween 8 0 (i p. i ooo) and a solution of dimethyl sulphoxide (DMSO, i p. I ooo) ;
the micro-organisms were chosen so that taking into account their structure and organization they
would offer an increasingly difficult problem of dispersion (table i).
They were put into suspension starting with cultures on agar medium by moderately vigo-
rous manual agitation with glass beads of 3 mm diameter in the various solutions ; then their
distribution in the divisions of a haemocytometer was compared with their theoretical distribu-
tion (Poisson’s Law) by 2 OUCH and LAZA
a x test (L
ELL , 19
R 68). Only the Tween 8o and DMSO
solutions gave a dispersion not significantly different from the ideal (table 2
) ; the least variation
was obtained with Tween 8 0 which was finally selected.
 II : Secondly, using Aspergillus oryzae and Tween 8 0 serial dilutions were made ; homoge-
nization before each sampling was effected either by rotating the tube between the hands or by
using a Vortex mixer for 30 seconds. Counting was performed in an agar medium in a haema-
tocytometer. The comparison between the recorded numbers for each dilution and the expected
theoretical values were made using the2 test. The use of a Vortex mixer under these conditions
X
gave results which did not differ significantly from theoretical values (tablet).
III : Thirdly, the author tested the technique selected for its applicability to practical problems:
on one hand, the control of the number of viable spores seeded in a pulverulent substrate, and on
the other hand the preparation of suspensions for the isolation and enumeration of viable fungal
germinal elements after growth in this type of substrate.
Lucerne hay was pulverized, sterilized, seeded with spores of Aspergillus oryzae, humi-
dified in various ways and incubated (or not) for three weeks at 21 °C. Dispersion was effected as
in I and dilutions prepared as in II ; counting was performed in agar medium ; table 4 shows
that the technique used gave results which did not differ significantly from expected theoretical
values, not only in the case of hay inoculated with spores, but also where the spores had germina-
ted and produced vegetative hyphae.
The author therefore recommends that in the mycological analysis of slightly hydrated pul-
verulents, that the homogenization and preparation of dilutions be made using a one part per
thousand solution of Tween 8 , using vigorous agitation with glass beads to ensure adequate
0
dissociation of the elements, and then to homogenize the suspension using a Vortex mixer before
each sampling, both for dilution making and for inoculation.
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4

ANNEXE I

TECHNIQUE PROPOSÉE POUR LA CONSTITUTION DE DILUTIONS COHÉRENTES

A PARTIR D’UN ÉCHANTILLON DE FOURRAGE BROYÉ
EN VUE D’UNE ANALYSE MYCOLOGIQUE
I. -
Matériel et produits nécessaires

-
un mixer Waring Blendor LB
, à 2 vitesséquipé d’un
I bol Pyrex (i litre) ;
-
un agitateur de type Vortex à vitesse variable ;
-
des tubes munis de bouchons à vis :
-

(A) : capacité 55 ml, QJ z2 : 1 par série de dilution

-

(B) : capacité30 ml, 0 1 6 : i par dilution

-

des pipettes à écoulement total :

-
(C) : capacité 20 ml, QI extrémité 4 mm : I par échantillon
-

(D) : capactié 2 ml, 0 extrémité 2 mm : I par dilution

-
des billes de verre, 0 3 mm : 3 ml x nombre de dilutions
-

du Tween 8 .
0

Il. -

Préparation du matériel pour un échantillon

Faire une solution de Tween 8 0 à l p. l ooo dans de l’eau distillée;

-

mettre 8 1 ml dans un flacon et répartir 9 ml par tube (B) ;

0
-

adjoindre 3 ml de billes de verre dans ces tubes et dans le tube (A) ;

-
stériliser les tubes et les pipettes.

III. -

Mode opératoire
-
Mettre dans le bol du mixer 20 g d’échantillon et 1
0 ml de dispersant;
8
-

disperser au mixer, alternativement à petite vitesse (

1 2 t/mn) et à
ooo grande vitesse
20 tr/mn) pendant
(
o
00 2 mn au total ;
 -
dès l’arrêt, prélever, à l’aide de la pipette C, zo ml que l’on transfère aussit6t dans le
tube A (suspension mère) ;
-

disposer tout le matériel pour les dilutions de façon à pouvoir procéder rapidement afin
d’éviter les risques de sédimentation des grosses particules dans les tubes et les pipettes ;
-

homogénéiser la suspension-mère à l’agitateur Vortex ( 30 sec), de façon que la

suspension et les billes se répartissent au maximum le long des parois du tube ;
-

y prélever aussitôt i ml que l’on transfère dans le tube de dilution B,, sans en toucher
les bords ; mettre cette pipette dans un bac de désinfectant ;
-

homogénéiser la dilution B, à l’agitateur Vortex comme ci-dessus ;

-

puis opérer de la même manière pour les dilutions successives.

-
une fois la gamme de dilutions effectuées, il conviendra, juste avant le prélèvement dans
les tubes, de les agiter à nouveau pendant 5 s.