Transfección de Gametos-Transferencia Génica Con Transposones-Fusionado

UNIVERSIDAD POLITECNICA SALESINA
INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA RR.NN.

BIOTECNOLOGIA ANIMAL
Integrantes:
Díaz Fernanda, Quilachamin Joselyn, Tituaña Jordy, Dayana Moscoso, Cynthia Chango,
Franco Socasi
Noveno G1
TRANSFECCIÓN DE GAMETOS
Consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante

plásmidos u otras herramientas para la transferencia. En un sentido más reducido,
frecuentemente se usa solo para referirse a la introducción de material genético en células
animales, prefiriéndose otros términos para otras células (Esponda, 2005)
Se comenta la producción de animales transgénicos (TA) utilizando espermatozoides u

óvulos transfectados. Se han empleado diferentes métodos para introducir transgenes en los
gametos de varios vertebrados e invertebrados. Los métodos para la transfección de gametos
han empleado ADN desnudo, vectores virales, complejos ADN / liposoma, electroporación
o microproyectiles de alta velocidad (Esponda, 2005).
Los primeros procedimientos de transfección se produjeron a principios de la década de 1960

y ahora se han generalizado los experimentos con diferentes tipos de células y tejidos. Se han
empleado diferentes métodos de transfección:
• El procedimiento in vitro cuando se introducen genes extraños en células o tejidos

cultivados.
• El método in vivo, cuando los genes se introducen directamente en el tejido (por
inyección, aerosol, etc.)
• El sistema ex vivo, en el que las células se transfectan in vitro y luego se introducen
en un organismo vivo (Esponda, 2005)
Vectores:
Para la transferencia de genes a animales se pueden utilizar varias técnicas. Difieren en su

idoneidad para distintas clases de animales, su eficacia de transformación y sus repercusiones
para la evaluación del riesgo (Houdebine, 2003)
La utilización del método de transferencia de genes depende del conocimiento de un gen

codificador de un producto que confiera un rasgo de interés. El gen que se debe transferir se
incorpora a un vector de expresión que también contiene elementos genéticos para controlar
su expresión. El uso de distintos tipos de vectores de expresión ofrece ventajas metodológicas
para distintas clases de animales y también afecta a la probabilidad de que se materialicen
peligros genéticos o inmunológicos posteriores. (Segura-Correa, 2001) Los biotecnólogos
pueden transferir deliberadamente a un huésped un:
• Gen de fusión: Un gen que codifica un producto de interés con un elemento que
regulará su expresión en el huésped.
• Transposón: Un elemento de ADN capaz de escindirse de un lugar del genoma e
insertarse en otro lugar, que se ha modificado para contener el gen de fusión.
• Retrovirus: Un virus que se puede integrar en el genoma y expresarse por medio de
los procesos de replicación de la célula huésped y que se ha modificado para contener
el gen de fusión (Segura-Correa, 2001)
La construcción KO contiene:
• Gen neoR
• Flanqueado por 2 segmentos de gen objetivo
• El gen HSVtk
Puede inactivar gene para monitorizar el efecto en crecimiento o para desarrollar tratamientos
Mutagénesis dirigida en ratón a.
Los pasos en crear ratones KOs son:
1. Un gen se inactiva al eliminar una parte del gen e insertar un gene de resistencia a
antibiótico en su lugar. DNA homólogo donde la recombinación va a ocurrir flanquea
ambos lados del marcador. El DNA insertado también lleva un gen que produce la
piel negra
2. El gen se transfiere a células madre embrionarias. Las células contendrán dos copias
del gen de interés y dos copias de el gen de piel negra (en homocigosis).
3. Las células se criban con antibióticos para determinar la correcta inserción del DNA
4. Las células madre embrionarias e se transfieren a embriones de ratón tempranos.
5. Los embriones se implantas en madres se permite su nacimiento.
6. La descendencia tendrá piel blanca y negra, siendo la piel negra un marcador para el
gen eliminado. Esto se llama una quimera, ósea un ratón con células normales y
células modificadas.
7. La descendencia se cruza con un ratón blanco y cualquier ratón completamente negro
será un ratón KO, conteniendo el gen inactivado en cada célula. Esto muestra que el
gen inactivado está presente en todas las células
8. Para confirmar el gen KO se realiza con la diana por PCR
Técnicas
Muchos vectores de expresión contienen genes marcadores. Algunos genes marcadores son
simplemente informadores para la transferencia eficaz de un gen, mientras que otros
codifican productos génicos, de manera que se pueden seleccionar individuos transgénicos,
por ejemplo, mediante la aplicación de antibióticos. (Rodríguez Yunta, 2012)
Los métodos habituales para la introducción de un vector de expresión en el huésped son los
siguientes:
• Microinyección: Inyección directa del vector de expresión en óvulos fecundados o

células huésped utilizando una aguja fina de vidrio.
• Electroporación: Introducción del vector de expresión en óvulos fecundados o células
huésped mediante la aplicación de impulsos eléctricos para inducir poros transitorios
en la membrana de las células huésped.
• Bombardeo de partículas: Fijación del vector de expresión sobre partículas de oro e
introducción en las células huésped mediante el bombardeo con las partículas.
• Transformación celular, seguida de clonación: Dado que es más sencillo añadir genes
a células cultivadas o inactivarlos en ellas que con los óvulos fecundados, los núcleos
de las células transformadas con éxito se pueden transferir a óvulos enucleados e
implantarlos en hembras receptoras para generar animales clonados de células
somáticas, que también son transgénicos.
• Transformación de gametos: Se pueden introducir genes en oocitos o espermatocitos
y utilizar los gametos transformados para la fecundación, generando un animal
completo (Rodríguez Yunta, 2012)
La aplicación de cualquiera de estos métodos dará lugar a la transformación eficaz de un

pequeño porcentaje de los animales así producidos. Luego se pueden identificar los
individuos transgénicos y reproducirlos para obtener una línea transgénica.
TRANSFERENCIA GÉNICA CON TRANSPOSONES
Los transposones se definen como elementos transponibles que contienen genes adicionales
a parte de los necesarios para la transposición y están dentro de secuencias repetidas. Dentro
de esta categoría se encuentran los transposones compuestos de procariotas, familia Tn3,
elemento P de Drosophila, secuencias Alu de mamíferos, retrotransposones. (Narbón, 2008)
Los transposones son secuencias de material genómico que tienen la capacidad del saltar
fuera y dentro del genoma. Son capaces de autorreplicarse e integrarse aleatoriamente en
nuevos sitios dentro del genoma (trasponerse o “saltar”). Pueden entrar en plásmidos y ser
propagados por ellos. Estas propiedades les confieren la capacidad de ser transferidos
exitosamente en células y genomas extraños. La ingeniería genética puede manipular estos
transposones para llevar a cabo transferencia horizontal de genes. La transferencia horizontal
de genes es la transferencia de material genético entre células y genomas que pertenecen a
especies no relacionadas, por procesos distintos a la reproducción. Un ejemplo de ello es el
uso de los transposones de salmónidos para la transferencia génica en vertebrados. Los
transposones de vertebrados de la familia Tc1/mariner contienen como mínimo un gen único
que codifica la enzima transposasa flanqueada por dos repeticiones terminales invertidas (tir).
Cada una de las tir posee uno o varios sitios de 20-30 p.b. de interacción con la transposasa.
(Narbón, 2008)
La transposasa interacciona con estos sitios para cortar el transposón, luego interacciona con
secuencias presentes en el genoma en otro locus y pega el transposón en el nuevo locus. En
vertebrados todos los transposones que se han detectado están inactivados por mutaciones.
Sin embargo, recientemente se ha obtenido un transposón activo de salmónidos mediante
múltiple mutagénesis dirigida. Dicho transposón denominado “Bella durmiente” o “Sleeping
beauty” (SB) se puede usar en todos los vertebrados analizados hasta el momento como
vehículo de incorporación de nuevos genes y para inactivar genes en el genoma por inserción.
(Narbón, 2008).
Los transposones son secuencias móviles del genoma capaces de transportarse ellos mismos
a otras localizaciones dentro del genoma. Se encuentran tanto en procariontes como en
eucariontes.
Localización de los transposones en el genoma de los vertebrados
El experimento clásico de cinética de renaturalización de genomas desnaturalizados confirma

que sólo contienen aproximadamente un 10 % de secuencias únicas o genes (Colosimo et al.,
2000). El resto del genoma está formado por un 50 % de secuencias repetidas unas 1.000
veces (aquí se encuentran entre otros los transposones, los rRNA y los tRNA), un 20 % de
secuencias repetidas unas 100.000 veces (DNA estructural o satélite que forma los
centrómeros y los telómeros de los cromosomas) y un 20 % de secuencias palindrómicas
(Crollius et al., 2000; Izsvak et al., 2000).
Los transposones o elementos móviles forman parte de las secuencias que se encuentran
repetidas unas 1.000 veces por genoma. Existen varias familias de transposones con
características moleculares diferentes, pero en este trabajo nos centraremos únicamente en el
transposón SB de la familia Tc1/Mariner (Coll, 2001).
Los transposones inactivos de vertebrados
Nunca se ha aislado un transposón de vertebrados activo debido a que, aunque están

presentes, contienen muchas mutaciones que los inactivan, lo cual es lógico, ya que la
presencia de transposones activos tendría consecuencias funestas para la estabilidad de los
genomas. Hasta ahora se han detectado varias familias de elementos móviles o transposones
tales como el Tc1/Mariner, el mermaid, los elementos DANA, los Tol2 (Ac-like), los Tdr2 ,
Tc3, etc (Coll, 2001).
Se han caracterizado varios transposones semejantes al Tc1/Mariner en pez cebra (Danio

rerio), trucha y salmón. Es muy posible que con el tiempo se vayan descubriendo y
caracterizando muchos más. Los genes de las transposasas presentes en los transposones
detectados, varían de longitud, por ejemplo, Himar1 (1291 bp), Tc1 (1612 bp), Tc3 (2335
bp), SB (1639 bp), Bari 1 (1639 bp), Pogo (2417 bp), etc. Las repeticiones terminales
invertidas (tir) también varían en el tamaño y en los sitios de unión a la transposasa. Por
ejemplo: Himar 1 (31 pb con un sitio de ligamiento de transposasa de 28 pb), Tc1 (54 pb con
un sitio de ligamiento de transposasa de 28 pb), Tc3 (462 pb con 2 sitios de ligamiento de
transposasa de 33 pb), SB (225 pb con 2 sitios de ligamiento de transposasa de 30 pb), Bari
1 (26 pb con 1 sitio de ligamiento de transposasa), Pogo (26 bp con 1 sitio de ligamiento de
transposasa de 12 pb), etc (Coll, 2001) .Los transposones de la familia Tc1/Mariner,
contienen el gen de la enzima transposasa de unos 1.500-2400 pb flanqueada por secuencias
con repeticiones terminales invertidas de 200-250 pb con sitios de unión para la transposasa
de 20-30 pb (Fig. 1). Estructuras muy similares están presentes en transposones de la misma
familia estudiados en insectos, peces y otros vertebrados, sin embargo, no hay conservación
de sus secuencias DNA (Coll, 2001).
Fig1: Esquema de un transposón SB

Un transposón SB consta de un único gen que codifica la enzima transposasa, flanqueado por
dos secuencias diez veces más cortas y con repeticiones terminales invertidas (tir).
Uso de los Transposones como Vectores: «Sleeping Beauty» (SB)
Los transposones bacterianos son bien conocidos desde hace tiempo e incluso se han
comercializado kits que utilizan el transposón EZ: Tn. Estos kits permiten realizar in vitro
inserciones del transposón en plásmidos diana. Para ello se incuba el plásmido diana con un
transposón que contiene el gen de interés en el lugar de la transposasa y con la enzima
transposasa. También se pueden utilizar para generar (Golpes-salida) por inserción en el
genoma de células vivas transfiriendo el transposón completo por electroporación a células
in vitro. (Coll, 2001)
Los transposones han sido también muy útiles como vectores transgénicos y como mutágenos
por inserción en la mosca Drosophila y el gusano Caenorhabditis donde se conocen versiones
activas de transposones endógenos. (Coll, 2001)
Sin embargo, para vertebrados, hasta ahora sólo se han podido utilizar los retrovirus como
vectores o mutágenos. En concreto se están usando retrovirus (pseudotipan) que contienen la
glicoproteína G del rhabdovirus VSV para mutagénesis insercional como vectores.
Existen algunas dificultades para utilizar retrovirus como vectores.
a) Es necesario que estén a concentraciones muy altas.

b) Sólo puede acomodar una longitud limitada de DNA.
c) Pueden infectar al experimentador, por lo que hay que manejarlos en condiciones de
alta seguridad. (Mancebo, 2009)
Es por todo ello que el uso de transposones como vectores en vertebrados ofrecería una
alternativa con algunas ventajas sobre los retrovirus. Para ser útiles como vectores en
vertebrados, los transposones deberían ser capaces de incorporar segmentos de DNA de
varias Kb para poder contener genes enteros y además retener la capacidad de poder ser
movilizados por la transposasa.
Otros requerimientos que necesita un vector transposón son:

a) Incorporación de una mayor longitud de material genético (mínimo un gen)
b) Que puedan ser movilizados por la transposasa
c) Que tengan un uso fácil y un amplio rango de huéspedes
d) Que su integración en los cromosomas sea eficiente
e) Debe mantenerse estable durante posteriores generaciones
(Mancebo, 2009)
Sin embargo, todos los transposones de vertebrados que se conocen hasta ahora se encuentran
inactivados, tal y como hemos mencionado anteriormente. La inhibición de las
transposiciones puede deberse a factores celulares externos o a factores intrínsecos al
transposón (mutaciones en la transposasa o en las tir). Para obtener un transposón activo
habría que reparar sus mutaciones. Ahora bien, si, por ejemplo, se reparan las mutaciones del
transposón y este se introduce en un genoma, debido a que los transposones y sus secuencias
tir están presentes en miles de copias en el genoma, se causaría una transposición masiva lo
que conllevaría a una inestabilidad genética y por lo tanto a una interferencia con los
objetivos experimentales.
Una solución a este problema es el diseñar un sistema disociado de transposones, es decir

separar el gen de la transposasa de las tir y heterólogo, en el que la intervención del huésped
sea mínima. Para solucionar el problema de la inactivación de los transposones de
vertebrados, se ha procedido a repararlos. Comparando secuencias de transposones
filogenéticamente semejantes y utilizando mutagénesis dirigida se ha reconstruido un
transposón activo a partir de elementos móviles inactivos aislados del salmón. A este
transposón reparado se le ha denominado «bella durmiente» o «sleeping beauty» (SB). Se ha
demostrado que SB es funcional en líneas celulares tanto de peces como de ratones y
humanos y que es capaz de integración estable y expresión a largo plazo en ratones. Además,
se ha demostrado que SB es capaz de transferir genes. En principio, se podría también utilizar
en vertebrados para técnicas de mutagénesis por inserción, para mapeo de genes y para
atrapamiento de promotores. (Coll, 2001)
SB es el único transposón basado en DNA de origen vertebrado que puede usarse por ahora
para la manipulación experimental. Este transposón se ha utilizado como un instrumento para
investigar los requerimientos en cis y en trans para la movilización de estos elementos y los
mecanismos que regulan la transposición en las especies de vertebrados. Es por ello y a modo
de ejemplo que se va a describir a continuación su proceso de transposición en detalle. (Coll,
2001)
Mecanismos de Transposición en SB
La transposición del transposón SB requiere, al menos dos sitios de ligamiento dentro de las
tir tal y como demuestran la mutación o la deleción de dichas secuencias. La transposasa
reconoce y se une a las tir para cortar el elemento móvil y pegarlo en otro lugar del genoma
(cortar y pegar). El corte ocurre en las dos cadenas de DNA y en las 2 tir, de tal forma, que
al cortar las dos cadenas dejan una huella en el genoma de 2-3 bases. Por ejemplo, la mayoría
de los transposones Tc1/mariner se integran en la secuencia TA reconociendo las secuencias
y quizá la estructura del DNA que flanquea estas secuencias. Durante la integración del
transposón cortado ocurren otros dos cortes que dejan secuencias AT y TA en cada una de
las cadenas del sitio de integración. Al incorporarse el transposón a continuación de estas
secuencias se producen dos sitios AT flanqueando el elemento móvil transpuesto.
Se han podido identificar tres dominios funcionales en la transposasa del SB. Existe una
región con señales de localización nuclear (nuclear localization signal, NLS) en los aa 105-
120 y regiones de hélices (leucine-zipper) en las zonas de unión al DNA en los aa 8-110. Un
tercer dominio es el catalítico o motivo DDE (aa 146-290) que se encuentra en todas las
transposasas y recombinasas. En cuanto a la regulación de su actividad, no parece que el
aumento de expresión de la transposasa de SB inhiba su transposición tal y como ocurre en
otros transposones (Gcontrec, 2006).
Usando distintos ensayos se han podido detectar hasta 10.000 inserciones independientes por
célula en un experimento de transfección, pero la cantidad de transposición que estimula la
transposasa SB varía entre diferentes líneas celulares. Puesto que en estos ensayos el nivel
de transposición es proporcional a la cantidad de transposasa, esta variación puede deberse a
la variación de la eficiencia de transfección tanto para los plásmidos con transposasa como
para los plásmidos con los genes insertos y con las tir (Fig. 2). Puede haber también
diferencias en la transcripción-traducción del gen de la transposasa que determinen su
concentración final. Además, pueden existir factores celulares que afecten la transposición.
El límite de tamaño del gen inserto entre las tir no parece ser tan crítico como en los
retrovirus. Eso sí, se ha observado que cuanto más grandes son los elementos móviles, menor
es su frecuencia de transposición, aunque esto podría ser también una ventaja para su
estabilidad una vez insertados. Con cada Kb de aumento de tamaño del gen inserto en el
transposón SB (entre 2.2 a 10.3 Kb), se obtiene una disminución exponencial del 30 % en la
eficiencia de transposición (Gcontrec, 2006).
Futuro
Aunque todavía existen algunos problemas con el sistema SB, es indudable que ofrece un
método de introducción de DNA que puede dirigirse a localizaciones concretas dentro del
genoma. La identificación del locus de integración del gen inserto después de una
transposición puede hacerse fácilmente mediante PCR usando oligonucleótidos diseñados a
partir de las secuencias de las tir e hibridando después las secuencias amplificadas con sondas
del gen del inserto. Conforme se vayan descubriendo más elementos móviles potencialmente
escondidos en ese casi 50 % del genoma que contiene secuencias repetidas, se tendrán más
instrumentos del tipo SB o quizá otros con nuevas propiedades que los hagan más útiles como
herramientas de diseño. Además, la identificación y estudio de los mecanismos de
movilización de estos elementos repetidos pueden hacer avanzar nuestros conocimientos
sobre la evolución y cambios en los genomas (Gcontrec, 2006).
BIBLIOGRAFÍA
Coll, J. (2001). El Transposón SB de salmónidos como vector para transferencia de genes en
vertebrados. . Obtenido de http://www.inia.es/GCONTREC/pub/coll_1161095917875.pdf
Colosimo A., Goncz K.K., Holmes A.R., Kunzelmann K., Novelli G., Malone R.W., Bennett M.J.,
Gruenert D.C., (2000). Transfer and expression of foreign genes in mammalian cells.
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Crollius H.R., Jaillon O., Dasilva C., Ozouf C.C., Fizames C., Fisher C., Bouneau L., Billault A.,
Quetier F., Saurin W., Bernot A., Weissenbach J. (2000). Characterization and repeat analysis
of the compact genome of the freshwater pufferfish Tetraodon nigroviridis. Genome
Research 10, 939-949
Gcontrec. (2006). Inia. Obtenido de http://www.inia.es/GCONTREC/pub/coll_1161095917875.pdf
Esponda, P. (2005). Transfection of Gametes: A Method to Generate Transgenic Animals. SCIELO,

281-284.
Houdebine, L. M. (2003). Animal transgenesis and cloning. John Wiley & Sons
Mancebo, M. (2009). USO DE TRANSPOSONES COMO VECTORES EN LA INGENIERÍA
GENÉTICA. Obtenido de Universidad Autònoma de Barcelona:
https://ddd.uab.cat/pub/tfg/2014/119228/TFG_miguelangelmancebofernandez.pdf
Narbón, P. (14 de Junio de 2008). Tranferenia Génica en Animales . Obtenido de UNED:

http://www.uned.es/experto-biotecnologia-alimentos/TrabajosSelecc/PatriciaNarbon.pdf
Sherratt D.J., (1995). Mobile genetic elements. Frontiers in Molecular Biology. Eds. B.D. Hames y
D.M. Glover. Oxford Univ. Press, N.Y. 179 p.
Rodríguez Yunta, E. (2012). Desafíos éticos de la manipulación genética y la investigación con

animales. . Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública, 29, 535-540.
Segura-Correa, J. C.-P. (2001). Razones y estrategias para la conservación de los recursos genéticos
animales. . Revista Biomédica, 12(3), 196-206.
Ingeniería en Biotecnología de los RR. NN
Biotecnología Animal
Docente: Nancy Bonifaz Nivel: 9no G1
Integrantes: Alquinga Jeannette, Cevallos César, Rosas Jhamine, Veloz Alejandra
TRANSFERENCIA DE DNA EXÓGENO MEDIADA POR ESPERMA DURANTE

LA FERTILIZACIÓN (SMGT, “SPERMMEDIATED GENE TRANSFER”)
Desde hace aproximadamente dos décadas, el uso de los espermatozoides como vectores
de ADN exógeno (transgénesis mediada por espermatozoides: SMGT), ha llamado la
atención de numerosos investigadores en un continuo debate sobre la transgénesis animal.
En 1989 se demostró la capacidad que tenían los espermatozoides de ratón, de transportar
ADN exógeno y transferir estas moléculas al interior del ovocito en el proceso de la
fecundación, dando lugar a animales genéticamente modificados (García et al., 2010, p.
83).
Esta técnica se basa en la habilidad intrínseca de las células espermáticas para unir e
interiorizar ADN exógenos y permitir su transferencia al interior de los ovocitos tras la
fecundación, e integrarse en el genoma del nuevo embrión.
Para la obtención del eyaculado, los animales seleccionados deben estar alojados en
habitáculos individuales mantenidos a temperatura controlada (25 °C) y bajo condiciones
naturales de luz y humedad.
Recogida de semen mediante el método manual. La primera fracción del eyaculado
(concentración baja de espermatozoides) debe ser eliminada, y la fracción rica en
espermatozoides se recogerá en un termo estéril precalentado a 37 ºC (para evitar el
choque térmico) y se filtrará mediante gasas estériles para descartar las secreciones de la
glándula de Cowper. Inmediatamente tras la recolección del eyaculado, el semen será
diluido 1:1 en medio SFM sin BSA, precalentado a 37 ºC. Tras la recogida de la fracción
rica del eyaculado y la dilución del semen 1:1 en medio SFM sin BSA, se trasladará al
laboratorio en un termo eléctrico a 37 ºC. Una vez en el laboratorio, se debe diluir de
nuevo en medio SFM (37 ºC) en una proporción de 1:10 (5 ml semen 1:1 + 45 ml medio)
en tubos Falcon®, y se centrifugará a 800 g durante 10 min a 25 ºC. Seguidamente, se
eliminará el sobrenadante y se resuspenderá de nuevo en SFM (en este caso con BSA) a
25 ºC, de nuevo se centrifugará a 800 g durante 10 min a 25 ºC; se debe descartar el
sobrenadante y se añadirá 1 ml del medio con BSA a 25 ºC. Una vez acabado el procesado
de los espermatozoides se debe valorar la motilidad mediante la observación en
microscopio de campo claro con objetivo 10X, depositando 10 μl de la muestra sobre un
portaobjetos precalentado en una placa térmica atemperada a 38 ºC. Se valorará el
porcentaje de espermatozoides con movimiento (0-100) y el tipo de movimiento
rectilíneo, progresivo y rápido en una escala de 0 a 5. Para su uso en los experimentos
deberá alcanzar una motilidad superior al 65% y una motilidad progresiva no inferior a
2,5. Se debe calcular la concentración final mediante un sistema espectrofotométrico.
Finalmente, se debe ajustar la concentración de la suspensión espermática a 108 células
espermáticas/ml, a los que se les debe añadir 5 μg del plásmido EGFP/ml (solución stock
del plásmido EGFP 200 ng/μl) (García et al., 2009, p. 136).
Conversión de los espermatozoides del eyaculado en células transgénicas mediante la
incubación conjunta del esperma con el plásmido que contiene el DNA de interés.
En este proceso se suceden las siguientes etapas:
a) la unión del DNA exógeno a la superficie del espermatozoide;
b) seguida de la internalización de este DNA en el espermatozoide
c) y, posteriormente, la integración del transgén en el genoma del espermatozoide (hecho

que se ha demostrado que no ocurre al azar, sino en lugares concretos del genoma).
Inseminación artificial, con el esperma transgénico, de hembras previamente
sincronizadas, o se realiza inyección intracitoplasmática de esperma transgénico en
ovocitos para generar embriones que posteriormente sean transferidos a hembras
sincronizadas para gestarlos.
De allí se obtienen las camadas, seguido del estudio de la eficiencia de la transgénesis en
ellas, seleccionando los animales transgénicos fundadores que serán capaces de transmitir
el transgén a las sucesivas generaciones.
Obtención de las camadas
Seguida del estudio de la eficiencia de la transgénesis en ellas, seleccionando los animales
transgénicos fundadores que serán capaces de transmitir el transgén a las sucesivas
generaciones (Peñaranda.M & Asensio.F, 2010)
Diversas son las técnicas reproductivas que se ha llevado a cabo para la obtención de
embriones y animales transgénicos mediante SMGT. Entre ellas encontramos la
fecundación in vitro (FIV), inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI),
inseminación artificial (IA), inseminación quirúrgica, laparoscopía, transferencia de
embriones, etc. A continuación, se describen algunas de dichas técnicas y las aplicaciones
que se han llevado a cabo en el ámbito de la transgénesis con especial hincapié en el
método de SMGT.
Se evaluará la eficiencia de la transgénesis: El Estado anatómico-fisiológico.
• Expresión del gen: Visualización directa de la EGFP (Proteína verde fluorescente)
mediante una lámpara de fluorescencia UV.
• Integración del gen: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
En cambio para tener constancia de la interiorización del ADN exógeno en el núcleo
espermático es necesario realizar un análisis autorradiográfico bajo el microscopio
electrónico (Zani et al. 1995)
Ejemplos de aplicación de SMGT
Transferencia espermatozoide-ADN exógeno en espermatozoides porcinos eyaculados y
epididimarios
MATERIAL Y MÉTODOS
1. PASO 1. SELECCIÓN DE MUESTRA DE LOS ANIMALES
El semen utilizado de verracos de fertilidad probada pertenecientes al centro de

inseminación artificial de la granja “Lo Navarro” S.A. (Murcia, España). Los animales
estuvieron alojados en habitáculos individuales mantenidos a temperatura controlada (25º
C) y bajo condiciones naturales de luz y humedad. Los programas sanitarios y
nutricionales, aplicados a los verracos, fueron los utilizados sistemáticamente en la granja

(Vazquez.F, 2007).
2. MEDIO UTILIZADO PARA EL PROCESADO ESPERMÁTICO
El medio utilizado para la dilución y lavado de los espermatozoides fue el Swine

Fertilisation Medium (SFM) descrito previamente por Lavitrano y col (2002). Este medio
está compuesto por glucosa (11,25 g/l), citrato sódico (10 g/l), EDTA (4,7 g/l), ácido
cítrico (3,25 g/l), Trizma (6,5 g/l). Posteriormente fue suplementado con 6 mg/ml de
Albúmina Sérica Bovina (BSA) para inducir el proceso de capacitación temprano ya que
según Lavitrano y col (2003) es el momento óptimo donde se produce la unión entre el
espermatozoide y el ADN exógeno. El pH final del medio fue ajustado a 6,8.
3. PLÁSMIDO EGFP
El plásmido EGFP, que hemos utilizado en este trabajo, contiene el promotor temprano
CMV (citomegalovirus) humano y fue obtenido de Clontech (pEGFP-N1, 5.7 Kpb,
Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, EE.UU.). El plásmido se hizo lineal mediante
el uso de AflII. Finalmente el plásmido lineal fue marcado con fluoresceína-12-dUTP
(Roche®, Alemania). La incorporación del nucleótido marcado en el ADN sintetizado
disminuye su movilidad electroforética con respecto al ADN no marcado (Gutiérrez-
Adán y Pintado 2000)
4. RECOGIDA DEL SEMEN Y PROCESADO DE ESPERMATOZOIDES
Espermatozoides eyaculados. La recogida de semen se realizó mediante el método

manual (King y Macpherson 1973). La primera fracción del eyaculado (concentración
baja de espermatozoides) fue eliminada, y la fracción rica en espermatozoides fue
recogida en un termo estéril precalentado a 37º C (para evitar el choque térmico) y filtrada
mediante gasas estériles para descartar las secreciones de la glándula de Cowper.
Inmediatamente tras la recolección del eyaculado, el semen fue diluido 1:1 en medio SFM
sin BSA, precalentado a 37º C.
El semen fue preparado por el método descrito por Lavitrano y col (2002). Tras la
recogida de la fracción rica del eyaculado y la dilución del semen 1:1 en medio SFM sin
BSA, fue trasladado al laboratorio en un termo eléctrico a 37º C. Una vez en el
laboratorio, se diluyó de nuevo en medio SFM (37º C) en una proporción de 1:10 (5 ml
semen 1:1 + 45 ml medio) en tubos Falcon®, y se centrifugó a 800 g durante 10 min a 25º
C.
5. EVALUACIÓN DE LA UNIÓN ESPERMATOZOIDE-ADN Y VIABILIDAD

ESPERMÁTICA MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO
El análisis de la unión espermatozoide-ADN y viabilidad espermática fue realizado

mediante un citómetro Coulter Epics XL (Beckman Coulter Inc., Miami, Florida. USA).
Los datos medidos por el citómetro fueron analizados usando el programa Expo32ADC
(Beckman Coulter Inc.).
6. INSEMINACIÓN INTRAUTERINA QUIRÚRGICA.
En la ampolla oviductal de cada cuerno uterino se aplicó una dosis de inseminación que
contenía 1,5x108 espermatozoides y 75 µL ADN (solución stock de EGFP 200 ng/µL),
en un volumen final de 1,5 mL [9]. Estas muestras espermáticas estuvieron incubadas
previamente durante 2 h a 16°C y cada 20 minutos y de forma repetida se inclinaron los
tubos para evitar la sedimentación.
A continuación, se localizó el oviducto donde se realizó una incisión utilizando una aguja
roma para acceder a la ampolla oviductal (FIG. 1a), donde fueron depositados los
espermatozoides (37°C) (Vazquez.F, 2007)
Bibliografía
Arias, M., Delgado, A., Sánzhez, R. y Felmer, R. (2015). Transfección de

espermatozoides bovinos para su posterior utilización en transgénesis mediada
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mediada por espermatozoides en la especie porcina: efecto de la presencia de
ADN exógeno sobre la calidad seminal y evaluación de la producción in vivo de
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porcina: efecto de la presencia de ADN exógeno sobre la calidad seminal y
evaluación de la producción in vivo de embriones transgénicos, 81-88. En:
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LA ESPECIE PORCINA (SMGT): FACTORES QUE AFECTAN A LA
EFICIENCIA DE LA TÉCNICA. Recuperado el 2021, de
http://www.tdx.cat/bitstream/10803/10853/1/GarciaVazquez.pdf
TRANSFERENCIA DE DNA EXÓGENO
MEDIADA POR ESPERMA DURANTE LA
FERTILIZACIÓN (SMGT “SPERM
MEDIATED GENE TRANSFER”)
Integrantes
Alquinga Jeannette
Cevallos César
Rosas Jhamine
Veloz Alejandra
Dos
SMGT
décadas
Continuo Ha llamado
debate la atención
Breve historia
Capacidad de
En 1989 espermatozoi
des de ratón
Transferir
moléculas al Transportar
interior del ADN exógeno
ovocito
Animales
genéticamente
modificados (García et al., 2010, p. 83)
Interiorizar Genoma
Habilidad Células Transferencia
espermáticas ADN ovocitos del nuevo
intrínseca
exógenos embrión
Habitáculos individuales (García et al., 2009, p. 136) Método manual

(García et al., 2009, p. 136)
Para optimizar la técnica de SMGT existen
parámetros importantes a tener en consideración
La viabilidad y motilidad progresiva Se sabe que la unión de ADN exógeno

del semen
disminuye la viabilidad de los
espermatozoides y que los
espermatozoides vivos con ADN unido son
inmóviles, probablemente como
La capacidad de los espermatozoides
de unir e internalizar el ADN exógeno
consecuencia de la activación de
endonucleasas que fragmentan el ADN y
posterior muerte celular, esta último podría
corresponder a una protección natural que
Para maximizar la unión entre ADN
exógeno y espermatozoides la calidad evita la transmisión de ADN exógeno a la
inicial del semen y la eliminación del
plasma seminal deben estar descendencia.
garantizadas, ya que ambos son
factores gravitantes
MÉTODOS
Integración mediada por enzimas de
restricción (REMI)
Electroporación
La transfección de esperma se logra con

liposomas que contienen moléculas de plásmido Es un procedimiento que se ha introducido en
linealizadas que tienen extremos cohesivos y la SMGT para mejorar el número de moléculas
enzima de restricción utilizada para la de ADN absorbidas por los espermatozoides
linealización.
Lo que impulsa la integración en el La electroporación permite que los

procedimiento SMGT es la maquinaria 'natural' espermatozoides absorban más moléculas de
que ya está presente en los núcleos de las ADN que los espermatozoides no
células, mientras que en los experimentos REMI electroporados, pero no produce un porcentaje
es una enzima exógena que media los más alto de células 'transfectadas'
reordenamientos genómicos significativos
Transfección con Medio: sp-TL
complejo: 2 µl de suplementado con
Semen congelado
Supefect y 3 µl de 0,2 mM de
(fertilidad probada)
piruvato y 0,1% de
TurboFec PVA
Transfección con
Selección de complejo: 0,5µg
espermatozoides ADN exógeno, 3µL
móviles
lipofectamina
Diseño plásmido
Incubación de
pNunc-HcRed fracciones de
marcado con espermatozoides
sotiocinato de 30min – 0,5µg de
fluoresceína (FITC)
ADN exógeno
Las moléculas de ADN se unen a la cabeza Las moléculas de ADN
espermática en la región postacrosomal son capturadas
La unión e interiorización de ADN se da por

interacciones iónicas
El ADN exógeno interactúa con proteínas de MCH II (Complejo mayor

30-35 KDa, presentes en la superficie de las de histocompatibilidad II)
células espermáticas Moléculas CD4
El ADN foráneo se une a las proteínas
Las secuencias de ADN exógeno se situadas en la superficie de la
unen fuertemente al núcleo espermático membrana espermática (DPBs: DNA
y la integración del ADN exógeno binding proteins, en azul),
ocurre preferentemente intercalándose desprovistas del factor inhibidor (IF-
con elementos nucleares tipo I 1, rojo)
El transgén es
interiorizado y
ensamblado en la
cromatina espermática
La presencia de la secuencia de la
topoisomerasa II al principio y al final
de la secuencia de integración del gen
La unión de las moléculas de
ADN activa el
mecanismo de interiorización,
representado por la
asociación de las moléculas
CD4 (verde) con el complejo
ADN/DPB.
Penetra en el núcleo y se
disocia a nivel de la matriz
nuclear (amarilla), dejando el
transgén en contacto cercano
con el ADN cromosómico del
espermatozoide (azul claro). El
complejo proteico DPB/CD4 es
reciclado hacia la superficie
espermática
Espermatozoides
tratados con 2,4 mM
de yoduro de propidio
Análisis bajo Depositando

citometría de flujo:
alícuota de 2 µL de
espermatozoides
espermatozoides en
vivos transfectados y
muertos transfectados portaobjetos D4C16
Evaluación de motilidad
Medición de ADN espermática por sistema
captado medido por de análisis espermático
intensidad de asistido por computador
fluorescencia
(ISAS®. Proiser)
Obtención de las camadas
Seguida del estudio de la eficiencia de la transgénesis en ellas, seleccionando los animales

transgénicos fundadores que serán capaces de transmitir el transgén a las sucesivas
generaciones
SE EVALUARÁ : El Estado anatómico-fisiológico.

• Expresión del gen: Visualización directa de la EGFP(Proteína
verde fluorescente)
mediante una lámpara de fluorescencia UV.
• Integración del gen: Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR).
(Peñaranda.M & Asensio.F, 2010)

Ejemplo de Aplicación
Transferencia espermatozoide-ADN exógeno en espermatozoides porcinos eyaculados y

epididimarios.
PASO 1. SELECCIÓN DE MUESTRA DE LOS ANIMALES

El semen utilizado de verracos de fertilidad probada pertenecientes al centro de inseminación artificial de la granja “Lo Navarro” S.A. (Murcia,
España).
Los animales estuvieron alojados en habitáculos individuales mantenidos a temperatura controlada (25º C) y bajo condiciones naturales de
luz y humedad.
(Vazquez.F, 2007)
Paso 2 : MEDIO UTILIZADO PARA EL PROCESADO ESPERMÁTICO
● El medio utilizado para la dilución y lavado de los espermatozoides fue el Swine

Fertilisation Medium (SFM)
● Este medio está compuesto
Glucosa (11,25 g/l)
Citrato sódico (10 g/l)
EDTA (4,7 g/l)
ácido cítrico (3,25 g/l)
Trizma (6,5 g/l)
• Posteriormente fue suplementado con 6 mg/ml de Albúmina Sérica Bovina

(BSA) para inducir el proceso de capacitación temprano el momento óptimo
donde se produce la unión entre el espermatozoide y el ADN exógeno.
(Lavitrano.E &col,2002).
3 Paso: PLÁSMIDO EGFP
El plásmido EGFP utilizado en este trabajo, contiene el promotor temprano CMV

(citomegalovirus) humano y fue obtenido de Clontech
(Gutiérrez.A &Pintado,2000)
PASO 4 RECOGIDA DEL SEMEN Y PROCESADO DE ESPERMATOZOIDES
Espermatozoides eyaculados. La recogida de semen se realizó

mediante el método manual.
La primera fracción del eyaculado (concentración baja de
espermatozoides) fue eliminada, y la fracción rica en
espermatozoides fue recogida en un termo estéril precalentado a 37º
C (para evitar el choque térmico) y filtrada mediante gasas estériles
para descartar las secreciones de la glándula de Cowper.
En el laboratorio: Se diluyó de nuevo en medio SFM (37º C) en

una proporción de 1:10 (5 ml semen 1:1 + 45 ml medio) en tubos
Falcon®, y se centrifugó a 800 g durante 10 min a 25º C.
PASO 5:EVALUACIÓN DE LA UNIÓN ESPERMATOZOIDE-ADN Y VIABILIDAD ESPERMÁTICA MEDIANTE
CITOMETRÍA DE FLUJO
● El análisis de la unión espermatozoide-ADN y viabilidad espermática fue realizado mediante

un citómetro Coulter Epics XL
Los datos medidos por el citómetro

fueron analizados usando el
programa Expo32ADC
(Beckman Coulter Inc.2003)

PASO 6: Inseminación intrauterina quirúrgica.
● En la ampolla oviductal de cada cuerno uterino se aplicó una dosis de inseminación que
contenía 1,5x108 espermatozoides y 75 µL ADN
● Se localizó el oviducto donde se realizó una incisión utilizando una aguja roma para
acceder a la ampolla oviductal (figura c), donde fueron depositados los espermatozoides
(37°C).
(Vazquez.F, 2007)
DATO CURIOSO
La SMGT ha demostrado ser de gran aplicabilidad en numerosas

especies animales incluyendo mamíferos, aves, peces e insectos.
Es notorio que el éxito es mayor en las especies acuáticas, pudiendo
convertirse en un futuro no muy lejano la técnica de elección de
transgénesis en este tipo de especies. La Transgénesis mediante SMGT
es una técnica de muy bajo coste, sobre todo, al combinarla con
técnicas como la inseminación artificial (IA) o en medios naturales en el
caso de especies acuáticas.
(Vazquez.F, 2007)
Universidad Politécnica Salesiana
Nombre: Sthephanie Chimbo, Ana González, Sangurima Miguel, Carolina Sarango,

Michael Villacis, Myrian Yungán.
Tema: Principios Bioéticos de la clonación, transgénesis y Técnicas de clonación.
Introducción
La clonación constituye un tipo de reproducción asexual mediante la cual el producto o

descendencia conserva el mismo genoma que el individuo parental. Evolutivamente la
reproducción asexual es anterior a la reproducción sexual. Efectivamente, aquella es la
condición primitiva de los organismos vivos. Sin embargo, la predominancia evolutiva
de la sexualidad sobre la asexualidad, a pesar del "costo biológico" de esta nueva forma
de reproducción, se explica por sus enormes ventajas adaptativas para individuos y
especies (Garcia, 2008).
De acuerdo con su aspecto reproductivo, clonar es aislar y multiplicar un segmento del

genoma, sin embargo, en un contexto más amplio, significa obtener uno o varios
individuos a partir de una célula de otro individuo, de modo que las especies clonadas
son idénticas o idénticas al original (Garcia, 2008).
Principios Bioéticos
Autonomía: Es la capacidad de las personas de deliberar sobre sus finalidades

personales y de actuar bajo la dirección de las decisiones que pueda tomar. Todos los
individuos deben ser tratados como seres autónomos y las personas que tienen la
autonomía mermada tienen derecho a la protección.
Beneficencia: “Hacer el bien”, la obligación moral de actuar en beneficio de los demás.

Curar el daño y promover el bien o el bienestar. Es un principio de ámbito privado y su
no-cumplimiento no está penado legalmente.
No-maleficencia: Es No producir daño y prevenirlo. Incluye no matar, no provocar

dolor ni sufrimiento, no producir incapacidades. No hacer daño. Es un principio de
ámbito público y su incumplimiento está penado por la ley.
Justicia: Equidad en la distribución de cargas y beneficios. El criterio para saber si una
actuación es o no ética, desde el punto de vista de la justicia, es valorar si la actuación es
equitativa. Debe ser posible para todos aquellos que la necesiten. Incluye el rechazo a la
discriminación por cualquier motivo. Es también un principio de carácter público y
legislado.
Comités de Bioética
• Comité de Bioética sobre Investigación en Animales (CBA)

• Comisión de Normas Sanitarias para los Animales Terrestres de la Organización
Mundial de Sanidad Animal (OIE)
Dentro de los principios bioéticos tenemos:
• La clonación en animales sólo debe realizarse cuando resulte compatible con el

respeto debido a la naturaleza y a los equilibrios ecológicos y no suponga una
agresión para los seres humanos.
• Se considera que el uso de la clonación en animales puede resultar moralmente
justificable en ciertos casos concretos, como son el rescate de especies
extinguidas o en peligro de extinción, la mejora genética de algunas de ellas
mediante la selección de genomas especiales o la producción de proteínas
humanas en animales confines alimentarlos o terapéuticos, mediante técnicas de
ingeniería genética unidas a las de clonación.
• Deben evitarse las expresiones de absoluto rechazo y condena o de absoluta
aprobación de todo tipo de clonación, tanto en animales como en seres humanos.
La clonación es el resultado del uso de unas técnicas que, en sí, son neutras y
que reciben su moralidad, fundamentalmente, de los fines a los que se destinen.
Si el fin perseguido en el caso del ser humano es su degradación, o cualquier
otro que suponga una agresión grave a su dignidad, la aplicación de esas técnicas
deberá ser considerada moralmente negativa, pero no siempre en caso contrario.
• En el análisis ético de la clonación, el Comité cree necesario distinguir dos
niveles morales, el exhortativo y el prohibitivo. En el nivel exhortativo, todos los
consultados están de acuerdo en que el respeto a la naturaleza debe ser máximo,
especialmente en el caso de la naturaleza humana. La naturaleza merece respeto
porque es nuestra casa, nuestra morada; es decir, porque de algún modo somos
nosotros mismos.
Límites de la clonación y transgénesis
El ser humano siempre ha utilizado a los animales como recursos renovables que, desde
un calculo instrumental, benefician a los seres humanos en diferentes áreas. Esta
explotación a la que son sometidos los animales se relaciona a una valoración
económica de los mismos, ya que viven y mueren por los fines impuestos por los
humanos, dejando un amplio margen de ganancias a costes reducidos.
Entendiendo que los animales son seres sintientes, únicos en su complejidad genética,
fisiológica, psicológica y psíquica, no es ético clonarlos, bajo ningún punto de vista.
Esto debido a que se utilizan y sacrifican muchos animales buscando la eficacia de la
técnica.
La clonación en animales solo debe realizarse cuando resulte compatible con el respeto
debido a la naturaleza y a los equilibrios ecológicos y no suponga una agresión para los
seres humanos, la búsqueda de beneficios particulares resulta muchas veces
incompatible con el respeto a la naturaleza y la perduración de la vida en condiciones de
suficiente calidad.
Se puede considerar justificable la clonación en animales en ciertos casos concretos,

como son el rescate de especies extinguidas o en peligro de extinción o la producción de
proteínas humanas en animales con fines alimentarios o terapéuticos a través de técnicas
de ingeniería genética. El potencial benéfico de las técnicas de clonación en animales
es muy elevado para perfeccionar las técnicas de producción de alimentos y fármacos.
Consecuencias de la clonación
- La clonación atenta contra la biodiversidad y las variabilidades genéticas de las

especies
- Influye negativamente sobre el equilibrio ecológico
- Desarrolla modelos para estudiar mecanismos bioquímicos y fisiológicos en el
desarrollo de enfermedades genéticas y no genéticas
- Abre la puerta para estudios científicos importantes para el campo de la
medicina
- Facilita el uso de esta técnica para satisfacer caprichos como perpetuar a una
mascota, por ejemplo
- La introducción de animales clonados con animales comunes puede afectar la
biodiversidad futura
TÉCNICAS DE CLONACIÓN.
En contraste con la llamada clonación natural, las técnicas seguidas para la clonación
celular artificial, requieren un proceso de elaboración o de manipulación que permite
obtener copias idénticas o casi idénticas de las células madre o progenitoras utilizadas.
Si el producto o embrión se transfiere a un útero, se produce la implantación en el
endometrio y se desarrolla un nuevo ser (clonación reproductiva). Pero si se transfiere a
un medio de cultivo, el embrión dará origen a células madre embrionarias con la
potencialidad para diferenciarse hacia cualquier tipo de célula adulta (clonación
terapéutica) (Chuaire, Sánchez, & Franco, 2004).
Proceso de clonación:
El proceso de clonación se da de la siguiente forma: Se toma un trozo de piel del caballo

que quiere ser clonado, estas células se extraen por biopsia y se cultivan 24h en la
incubadora. De esta manera está el patrimonio genético en estas células, a partir de esto
se obtiene el embrión con los genes del caballo de origen; se ponen las células en un
ovulo equino cualquiera del cual se ha retirado el núcleo por un impulso eléctrico; de 20
embriones solo de 6 a 7 son viables; el caballo al que se le ha clonado tiene el 100% de
capacidad reproductiva (EQUISAN, 2010).
• Enucleación: Mediante técnicas de micro manipulación se extrae el núcleo del

óvulo, que se visualiza mediante un colorante que tienen afinidad por el ADN.
El óvulo queda “vacío” de material genético, lo que le permite recibir a la célula
del animal a clonar.
• Transferencia de la célula al espacio perivitelino: La célula del animal a
clonar se transfiere al espacio perivitelino del óvulo ¨vacío¨, entre la membrana
plasmática y la zona pelúcida.
• Desarrollo embrionario: Durante 6-7 días los embriones se cultivan en una
estufa con medios y condiciones especiales que permiten su desarrollo.
• Transferencia embrionaria: Los embriones desarrollados en cultivo se
transfieren a hembras receptoras que llevan a cabo la gestación, la preñez se
confirma por ecografía
Métodos de clonación
1. Partición. En esta técnica se utilizan embriones octocelulares, en estado de

preimplantación. A partir del embrión seleccionado, se toman mitades o
secciones que posteriormente se introducen dentro de zonas pelúcidas naturales
o artificiales. A continuación, se efectúa la implantación del producto en el
endometrio. El número máximo de células del embrión, no puede ser superior a
8, porque a partir de este momento, se inicia la expresión del genoma
embrionario. Los individuos obtenidos son prácticamente idénticos entre sí,
aunque diferentes a los progenitores, por lo cual se considera que son el
equivalente de los gemelos monocigóticos (Gindoff , 1998). Los individuos
obtenidos son prácticamente idénticos entre sí, aunque diferentes a los
progenitores, por lo cual se considera que son el equivalente de los gemelos
monocigóticos. Esta técnica se ha seguido ampliamente para la clonación de
animales de granja. Como ejemplos de esta técnica están las ovejas Megan y
Morag, del Roslin Institute (Wilmut , Campbell , & Tudge, 2000).
2. Paraclonación: Consiste en inyectar núcleos de células madre embrionarias en
cultivo, dentro de oocitos enucleados y, a veces, de cigotos enucleados. Los
blastómeros se obtienen a partir de varias fuentes como la masa celular interna o
el trofoectodermo de embriones preimplantados y sus núcleos son transferidos
dentro de oocitos enucleados (Wilmut , Campbell , & Tudge, 2000) . Los
individuos obtenidos son casi idénticos entre sí, aunque diferentes a los padres
del embrión que aportó el núcleo transferido57. Se ha demostrado que la
supervivencia de los clones formados a partir de células madre embrionarias en
el instante del nacimiento o hasta la edad adulta, es 10 a 20 veces mayor que en
los derivados de células somáticas (Li, Li, Jouneau , Zhou, & Renard, 2003). Por
otra parte, los clones derivados de células madre embrionarias tienen mejores
posibilidades de reactivar completamente genes claves para el desarrollo
embrionario -tales como oct4 y 10oct4- y así constituir una población de células
verdaderamente totipotenciales (Li, Li, Jouneau , Zhou, & Renard, 2003). Sin
embargo, las células madre embrionarias, aunque requieren un menor grado de
reprogramación que las células somáticas, presentan una elevada inestabilidad
epigenética en cultivos in vitro. La inestabilidad se refleja en una expresión
aberrante de la huella genética, de modo que, cuando estas células se utilizan
como donantes para la clonación reproductiva, el fenotipo fetal y placentario de
los clones, exhibe graves patrones de anormalidad. Sin embargo, cuando se
emplean como fuente de núcleos para la clonación terapéutica, en apariencia no
ocurre este error, pues, durante la reprogramación, se seleccionan tan sólo las
células competentes (Chuaire, Sánchez, & Franco, 2004).
Ejemplos de métodos de clonación
1. Clonación reproductiva hecha a mano (HMC) de búfalo de agua (Bubalus

bubalis)
La clonación hecha a mano (HMC) es la versión más esperada, simple y sin
micromanipuladores de la transferencia nuclear de células somáticas (SCNT). En esta
técnica se elimina el requisito de costosos micromanipuladores y experiencia
especializada, lo que la demuestra como una revolución importante en el campo de la
embriología. Durante los últimos años, se han incorporado muchas modificaciones a
esta técnica para potenciar su eficacia. Este enfoque alternativo a la clonación
tradicional (TC) basada en micromanipuladores funciona de maravilla para generar
tasas de natalidad comparables o incluso más altas, además de reducir drásticamente los
costos y permitir la criopreservación. Esta técnica no solo es aplicable a la transferencia
nuclear entre especies, sino también a la transferencia nuclear entre especies (iSCNT),
lo que permite la conservación de especies en peligro de extinción. También ofrece
posibilidades únicas para la automatización de SCNT que tiene como objetivo la
producción de animales transgénicos que pueden curar ciertas enfermedades humanas
mediante la producción de productos terapéuticos, proporcionando un futuro más
saludable para el bienestar de los humanos (Saini y otros, 2018).
• Procedimiento para la clonación hecha a mano (HMC)
(1) Preparación del citoplasto mediante la eliminación de la capa de cúmulos de

ovocitos maduros in vitro (2) la eliminación de la zona pelúcida del ovocito mediante
digestión con pronasa (3) la bisección manual de los ovocitos sin zona con una cuchilla,
de ahí el nombre clonación hecha a mano, para obtener un citoplasto (4) seleccionar un
citoplasto con estereomicroscopio (5) reconstruir un embrión fusionando una célula
somática de un donante con un citoplasto generando un embrión demi-clon que
nuevamente se fusiona con la segunda mitad del citoplasto (generado por el mismo
procedimiento que el primero citoplasto) para obtener un embrión clon de tamaño
completo que se activa e implanta en la etapa de blastocisto en el animal receptor (Saini
y otros, 2018).
2. Producción de gatos clonados utilizando citoplasma complementario

adicional
La transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) es una técnica importante para

producir animales clonados. Sin embargo, es ineficaz cuando se utiliza SCNT para la
producción animal clonada. La tecnología de clonación por inyección de citoplasma
(CICT) se desarrolló para superar las ineficiencias del uso de SCNT para este propósito.
El uso de CICT implica la fusión de citoplasma adicional con ovocitos enucleados para
restaurar el volumen citoplásmico, mejorando así la competencia de desarrollo in vitro y
la calidad de los embriones clonados (Song, y otros, 2019).
• Procedimiento para la tecnología de clonación por inyección de citoplasma

(CICT)
a) Preparación de células de donantes: Las células somáticas del donante se derivaron

del tejido cutáneo de gatos domésticos.
b) Recolección de ovocitos y maduración in vitro (MIV)
c) Transferencia nuclear
d) Cultivo in vitro de embriones de transferencia nuclear
e) Sincronización de la etapa del ciclo estral de las hembras receptoras y transferencia
de embriones (Song, y otros, 2019).
Bibliografía
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Wilmut , I., Campbell , K., & Tudge, C. (2000). La segunda creación. Sine Qua Non,
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CUESTIONARIO
1. Señale el principio de bioética incorrecto
a) Autonomía
b) Beneficencia
c) No-maleficencia
d) Eficiencia
2. A qué principio bioético corresponde el siguiente enunciado: “Equidad en la

distribución de cargas y beneficios”
a) Autonomía
b) Beneficencia
c) No-maleficencia
d) Justicia
3. Señale el proceso de clonación incorrecto

a) Enucleación
b) Transferencia del embrión al espacio perivitelino
c) Desarrollo embrionario
d) Transferencia embrionaria
4. Indique los métodos de clonación
a) Partición.
b) Preimplantación
c) Preclonación
d) Enucleación
5. Indique cuál de los siguientes enunciados no pertenece a las técnicas de
clonación:
a) Clonación hecha a mano
b) Transferencia nuclear de células somáticas
c) Clonación por inyección de citoplasma
d) Paraclonación
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA
INGENIERIA EN BIOTECNOLOGÍA DELOS RECURSOS NATURALES
BIOTECNOLOGÍA ANIMAL
ANIMALES TRASGÉNICOS
Desde el principio de los tiempos, el hombre ha intentado modificar las características de los
animales domésticos intentando incrementar aquellas que mejoraban sus condiciones como
animales de compañía, de producción, de trabajo o de abasto, mediante la selección de los más
aptos y el cruzamiento de los ejemplares que presentaban mejores características: mayor
producción de leche o carne o más fuerza y resistencia. Se seleccionaban aquellos ejemplares con
características deseables, apareándolos entre sí y con su descendencia, para perpetuar los rasgos
de interés, recurriendo al mestizaje cuando se advertía la aparición de características fenotípicas
indeseadas debido a la consanguinidad (Basrur & King, 2005).
Hoy en día, gracias a la reproducción asistida y a la biotecnología, se planifican y dirigen los

procesos reproductivos, se transmiten los rasgos deseados y se acelera la mejora genética. El
intervalo intergeneracional puede reducirse sensiblemente gracias a la combinación de la
inseminación artificial, que es la más antigua y utilizada de las técnicas de reproducción asistida,
con las técnicas más recientes como son: el estro sincronizado, la superovulación, la extracción
de óvulos de hembras sexualmente inmaduras aun fuera de la época de cría, o la producción de
embriones “in vitro” y la transferencia de embriones (Park, 2007). Además, es posible seleccionar
el sexo de la progenie con semen sexado para la inseminación; se puede realizar la selección
genética de individuos mediante marcadores moleculares asociados a caracteres de interés.
También se puede modificar el genoma de los organismos: introduciendo genes de interés
(organismos transgénicos); modificando los genes (organismos transgénicos “knockins”); o
eliminando o silenciando genes concretos (organismos transgénicos “knockouts”). Y se puede
llevar a cabo la clonación de animales por transferencia nuclear de células somáticas, germinales
o embrionarias (Smith & Heald, 2014).
HISTORIA
A partir de las experiencias de Gordon, Ruddle y colaboradores iniciadas en 1980 en las que
inyectaron ADN de ratón en uno de los pronúcleos de un cigoto de la misma especie, se inició
una nueva era en la manipulación genética de embriones de mamíferos. Al año siguiente,
demostraban la integración y transmisión estable a través de la línea germinal de genes inyectados
en pronúcleos de cigotos de ratón obtenidos por fecundación in vitro (Gordon & Ruddle, 1981).
Eran los primeros ratones transgénicos. El paso siguiente consistió en probar que también se
podían obtener ratones transgénicos que incorporaran en su genoma un gen (transgén) de otra
especie. Así, obtuvieron ratones transgénicos gigantes al inyectar en el pronúcleo de un cigoto el
gen de la rata que codifica para la hormona del crecimiernto. Incluso, se obtuvieron también
ratones transgénicos gigantes cuando el transgén introducido era el gen humano que codifica para
la hormona de crecimiento (Palmiter & Brinster, 1982).
El ratón transgénico, que lleva incorporado el gen de la hormona de crecimiento de la rata, tiene
un aumento de tamaño del 80% en comparación con un ratón normal. Como era de esperar, a los
ratones transgénicos siguieron los conejos, ovejas y cerdos transgénicos a los que se les había
introducido por microinyección en uno de los pronúcleos del cigoto el ADN del gen humano que
codifica para la hormona de crecimiento, en un intento de aumentar el tamaño de tales animales
(Gordon & Ruddle, 1981)Sin embargo, este avance científico no tuvo aplicación zootécnica
porque la presencia del transgén modifica la fisiología del animal transgénico, produciendo
efectos colaterales perjudiciales para su desarrollo. De cualquier manera, la era de la trangénesis
animal había comenzado como una realidad imparable.
Cerdo transgénico que lleva incorporado el gen humano de la hormona del crecimiento. Su
desarrollo presentaba trastornos fisiológicos importantes (Cummings, 1995).
AÑO EVENTO
1938 Experimento de transferencia nuclear
1949 Embriones de ratón en cultivo in vitro
1961 Ratones quiméricos agregando embriones
1966 Técnica de microinyección de embriones de ratón
Primeros ratones transgénicos por microinyección de ADN en
1980
el pronúcleo de cigotos de ratón
Animales de granja transgénicos (conejos, ovejas, cerdos) con
1985
el transgén de la hormona del crecimiento humano
Ovejas transgénicas con el gen humano del factor IX de
1989 coagulación de la sangre mediante microinyección de ADN en
el pronúcleo del cigoto
1993 Ratones quiméricos por co-cultivo de embriones
Ovejas clónicas por transferencia nuclear de células
1997
diferenciadas fetales y adultas en cultivo
1999 Cabras transgénicas por transferencia nuclear
USOS
APLICACIONES EN BIOMEDICINA
Desarrollo de modelos animales para el estudio de enfermedades humanas
La aplicación de la tecnología transgénica ha sido particularmente útil para el examen de la

importancia de la expresión de determinados genes en la etiopatogenia de gran número de
enfermedades (Melo, Cavanavessi, Franco, & Rumpf, 2007).
Utilización de animales modificados genéticamente como donantes de órganos para

humanos: xenotrasplantes.
La posibilidad de recurrir a especies animales como donantes de órganos se planteó hace ya

muchos años. De hecho, entre los años 1964 y 1995, se realizaron 32 xenotrasplantes de riñón,
corazón, hígado y médula ósea procedentes mayoritariamente de chimpancé y mandril, con un
resultado negativo en todos los casos (Bacci, 2007).
Utilización de animales transgénicos en terapia génica
Los experimentos de terapia génica que utilizan animales tienen tres objetivos generales:
conocer la fiabilidad y seguridad de los vectores, estudiar la eficacia de la transferencia de los
genes problema y ensayar nuevas terapias para curar la enfermedad (Niemann & Kues, 2007).
APLICACIONES EN INDUSTRIA FARMACÉUTICA

Realización de ensayos farmacológicos y toxicológicos utilizando animales modificados
genéticamente
Se han diseñado roedores transgénicos sensibles a toxinas medioambientales que son capaces de
evaluar la seguridad de medicamentos, productos o materiales mucho más rápidamente que los
ancestros de los que provienen. Este tipo de pruebas pueden realizarse con un número mucho
menor de animales porque la presencia del transgén mejora la eficacia (Wheeler, Walters, &
Clark, 2003).
APLICACIONES EN ZOOTECNIA
Cambios en la composición de la leche
Los avances en la tecnología del DNA recombinante han permitido cambiar la composición de la
leche introduciendo proteínas totalmente nuevas. Estos cambios pueden aumentar las
posibilidades de utilización de la leche e incrementar su valor (Bacci, 2007).
Modificación de los índices de crecimiento y de la composición de la canal
En cerdos se han realizado esfuerzos para mejorar su crecimiento y variar la composición de su

carne mediante la adición de transgenes: un estudio de expresión en músculo de un gen factor de
crecimiento “insulina-like” exógeno demostró una significativa reducción de la grasa y un
incremento del músculo magro; en otro estudio, un gen exógeno de la hormona del crecimiento
produjo un incremento de la ganancia de peso, mejoró la eficiencia en la alimentación y redujo el
grosor de la grasa dorsal (Wheeler, Walters, & Clark, 2003).
Animales resistentes a enfermedades
La aplicación de la transgénesis para regular aspectos definidos del sistema inmunológico puede
proporcionar oportunidades para diseñar, por ingeniería genética, ganado con mayor resistencia a
las enfermedades (Melo, Cavanavessi, Franco, & Rumpf, 2007).
TÉCNICAS DE OBTENCIÓN DE ANIMALES TRASGÉNICOS
Para la obtención de animales transgénicos se han llevado a cabo varios métodos, entre los cuales
se pueden citar:
1. MICROINYECCIÓN DE ADN EN PRONÚCLEO O EN CITOPLASMA DE

CIGOTO (ÓVULO FECUNDADO)
En esta técnica, la introducción del transgén se realiza mediante la microinyección de esta

construcción de DNA en el pronúcleo de un ovocito fertilizado. El procedimiento sería el
siguiente (Peñaranda & Asensio, 2014):
1. Se extraen óvulos de hembras en las que se ha inducido una superovulación y han sido
fertilizadas “in vivo”, o bien se fertilizan posteriormente “in vitro”.
2. Utilizando un microscopio, con una micropipeta, se inmoviliza el óvulo fecundado y se
inyecta en uno de sus pronúcleos una solución que contiene muchas copias del transgén.
3. Posteriormente, estos óvulos fecundados y microinyectados se introducen en madres
receptoras, previamente sincronizadas hormonalmente, para gestarlos, aplicando la
técnica de la transferencia de embriones.
4. Finalmente, los recién nacidos son examinados para ver si en ellos se ha producido la
incorporación del transgén.
La microinyección es un método para generar animales transgénicos muy ineficiente, debido a
que conlleva la integración aleatoria del gen foráneo en el genoma receptor con las siguientes
consecuencias (Peñaranda & Asensio, 2014):
• El transgén se introduce en el genoma receptor de forma aleatoria, por lo que sólo en un

pequeño porcentaje se sitúa en el lugar adecuado para conseguir una buena expresión en
el animal transgénico.
• No todos los animales que nacen han incorporado a su genoma el transgén (no son
transgénicos, por tanto).
• El gen exógeno puede insertarse en un lugar erróneo, por ejemplo en medio de un gen del
genoma receptor, interrumpiéndolo y causando su mutación y, con ello, la muerte del
embrión o alteraciones en el animal transgénico nacido.
• Se produce un patrón variable de expresión del gen exógeno en la progenie transgénica,
a menudo en mosaico.
2. MICROINYECCIÓN DEL ADN EN CÉLULAS EMBRIONARIAS
Esta técnica requiere de infraestructura, equipamiento y personal debidamente entrenado para su

realización, lo cual aumenta significativamente los costos. La microinyección de embriones de
especies de mamíferos, anfibios y peces se ha constituido en una forma útil de probar
construcciones genéticas directamente en los embriones y en algunas estirpes celulares derivadas
de ellos (Universidad Nacional Abierta y a Distancia, 2015).
El organismo adulto será una quimera ya que no todas las células incorporan el nuevo gen.
Entonces, se utilizarán solo los animales que tengan el gen en sus gametas y por lo tanto lo
transmitan a su descendencia. Esta técnica es más fácil y eficiente que la anterior a pesar de que
se descarten animales (PQBio, 2007).
El gen que se inserta está dentro del plásmido de una bacteria E. coli, se introduce todo el plásmido
(con el gen de interés y con otras secuencias del plásmido) y una vez dentro del núcleo de la célula
el ADN se integra al material genético del animal (PQBio, 2007).
3. ELECTROPORACIÓN DE CIGOTO
La electroporación es una técnica que se basa en la aplicación de un elevado voltaje a las células
durante un periodo de tiempo muy corto. Durante ese tiempo las células (en este caso los cigotos)
despolarizan sus membranas y se forman pequeños orificios por los que penetran las moléculas
de ADN que se encuentran alrededor. La ventaja de esta técnica es que se aplica a varios cigotos
a la vez y habitualmente se obtienen eficiencias de entrada del ADN del 100%. Es una técnica
que requiere su ajuste fino para cada tipo celular, a fin de determinar las condiciones óptimas de
duración y potencia del pulso. Se busca siempre el mejor equilibrio entre las condiciones que
aseguran la entrada en la célula y las que maximizan la viabilidad celular. La eficiencia de la
transfección por electroporación esta mediada por una serie de factores como la magnitud del
campo eléctrico aplicado, la duración del pulso eléctrico, la temperatura, la concentración, el tipo
de ADN y la composición iónica del medio (Universidad Nacional Abierta y a Distancia, 2015).
La electroporación se ha usado para transferir ADN foráneo a espermatozoides bovinos para su

uso en transgénesis mediante inseminación artificial. A partir de 1986, la electroporación se ha
empleado como el método de elección para la transfección de células embrionarias totipotentes
(embryonic stem cells ES) tanto en experimentos de gene knock-out, como de reemplazamiento
alélico y recombinación de homólogos (Universidad Nacional Abierta y a Distancia, 2015).
En términos generales la mayor desventaja de la electroporación es su costo, ya que la mayoría
de los equipos comercialmente disponibles (electroporadores) y los accesorios como cubetas y
adaptadores tienen un precio elevado (Universidad Nacional Abierta y a Distancia, 2015).
4. TRANSFECCIÓN DE CÉLULAS TOTIPOTENTES
Las células Totipotentes son aquellas células no germinales pero con capacidad de desarrollarse
en determinadas condiciones, pudiendo dar lugar a la formación de quimeras, integrando órganos
y tejidos del embrión y del individuo adulto. Hasta hace poco el factor limitante de esta estrategia
era la necesidad de contar con una línea celular para cada especie cuyo genoma se quisiera
manipular.
La gran ventaja de las células totipotentes, es que, como en cualquier línea celular, la introducción
de un gen es más sencilla, así como el saber si el gen se expresa y en qué proporción.
El transgen puede ser incorporado a la célula por microinyección, por electroporación o por
transfección, estos dos últimos sistemas son algo menos costosas. En todos los casos es posible
aislar a aquellas células transformadas utilizando marcadores de resistencia a algún agente
exógeno llegando a obtener una línea celular transformada y capaz de expresar la nueva
información genética.
La inclusión de células de esta línea en el blastosisto se hace por microinyección en el blastocele

de las células aisladas del cultivo, dirigiendo la aguja hacia la masa celular interna del embrión.
Es preciso remarcar que el individuo nacido de un blastocisto microinyectado con células
totipotentes no es transgénico, es una quimera, su descendencia sólo será transgénica si alguna de
las células microinyectadas, al colonizar la masa celular interna del embrión fue capaz de formar
la línea germinal (Muñoz, 2009).
5. TRANSFERENCIA DE DNA EXÓGENO MEDIADA POR ESPERMA

DURANTE LA FERTILIZACIÓN (SMGT, “SPERMMEDIATED GENE
TRANSFER”).
Desde hace casi dos décadas, el uso de los espermatozoides como vectores de ADN exógeno
(transgénesis mediada por espermatozoides: SMGT) ha centrado la atención de numerosos
investigadores en un continuo debate sobre la transgénesis animal.
En 1989 se demostró la capacidad que tenían los espermatozoides de ratón, de transportar ADN
exógeno y transferir estas moléculas al interior del ovocito en el proceso de la fecundación, dando
lugar a animales modificados genéticamente. De tal manera, la transgénesis mediada por
espermatozoides, debido a su relativa sencillez y bajo costo, podría ser ampliamente utilizada para
la producción de animales de granja modificados genéticamente, representando una potente
herramienta para la biomedicina. Dicha metodología mejora notablemente la eficiencia que se
alcanza al emplear la microinyección pronuclear (0,5-4% de eficiencia), ya que se han obtenido
resultados muy esperanzadores próximos a un 80% de animales transgénicos obtenidos.
Sin embargo, las dificultades en la repetitividad y la baja eficiencia en la integración de los

transgenes en el genoma del animal obtenida con esta tecnología, resultó en una considerable
controversia sobre dicho trabajo durante numerosos años. No obstante, son varios los estudios
que han sido publicados recientemente en los que se confirma que, los espermatozoides de
múltiples especies pueden ser usados como vectores para introducir transgenes dentro del genoma
del animal.
En la especie porcina (Sus scrofa) doméstica, se ha utilizado con éxito esta técnica para producir
cerdos transgénicos mediante el uso de la inseminación artificial (IA), o mediante el uso de
transferencia de embriones producidos mediante la inyección intracitoplásmica de
espermatozoides (ICSI). La aplicación de IA intrauterina permite el uso de un número reducido
de espermatozoides al depositar los espermatozoides próximos al lugar de fecundación y evitar el
proceso de transporte espermático que se produce a través del tracto reproductor femenino cuando
se realiza una IA convencional. La calidad seminal de la muestra determina la capacidad de
fecundar los ovocitos y producir embriones viables, por tanto es necesario asegurar, como paso
previo, que la incubación de los espermatozoides en presencia de ADN no afecte sustancialmente
la calidad seminal.
Pasos para obtener el transgénico:
• Seleccionar al donador de semen de fertilidad probada

• Mantenerlo en habitáculos con temperatura controlada (25°) y bajo condiciones naturales
de luz y humedad
• Diluir y lavar los espermatozoides con SFM (Swine Fertilization Medium) y posterior
evaluación de la calidad seminal
• Selección y construcción del gen de interés a ser transferido
• Transferencia del gen al los espermatozoides
• Inseminación intrauterina a la hembra
6. VECTORES VIRALES
Un método alternativo es la transgénesis viral: el uso de virus recombinantes para introducir genes
en el embrión. Los vectores retrovirales han sido estudiados extensamente para terapia génica
humana. Estos vectores han demostrado transferir eficientemente genes en embriones murinos,
bovinos y porcinos. Sin embargo, los retrovirus están sometidos a modificación epigenética y la
expresión retroviral se corta durante la embriogénesis o es breve después del nacimiento.
En animales de granja, la eficiencia de la transgénesis con vectores lentivirales es 50 veces

superior a la que se consigue con la microinyección pronuclear de DNA. Su mayor limitación es
que no pueden transportar transgenes con más de 8-9 kb de DNA y, además, los sitios en los que
se produce su integración de forma preferente son regiones codificantes de los genes de las células
que infectan.
El procedimiento podría ser así: embriones pre-implantación son expuestos “in vitro” a soluciones
concentradas de virus recombinantes (virus a los que previamente se les ha introducido el gen de
interés), o son incubados sobre una monocapa de células infectadas con estos virus. A
continuación de la exposición a los virus, los embriones infectados “in vitro” son transferidos a
hembras receptoras para completar la gestación (Narbón, 2008).
Las partículas virales silvestres no se pueden emplear directamente como vectores de expresión,
es necesario convertirlos en virus deficientes en su replicación dentro de la célula diana. De esta
forma, el vector viral sólo se podrá multiplicar en las células de empaquetamiento, que son líneas
celulares modificadas que tienen la propiedad de ensamblar a los virus y producir partículas
virales que poseen los genes que codifican para las proteínas virales y para el gen de interés. Los
virus recombinantes son estructuras capaces de transferir material genético a una célula diana.
El uso de la tecnología del ADN recombinante junto con el conocimiento del genoma viral, ha
permitido generar viriones con capacidad de infectar y transferir su material genético (transfectar),
pero incapaces de replicarse bajo condiciones especificas. Los virus recombinantes son la
herramienta más eficiente en la transgénesis, permiten sobre expresar proteínas en células
humanas y como consecuencia se pueden obtener proteínas recombinantes con un procesamiento
postraduccional adecuado. Entre los virus recombinantes con aplicaciones en transgénesis se
encuentran los adenovirus, los retrovirus, los virus adeno asociados, los lentivirus, además de
otros ADN o ARN virus (Narbón, 2008)
Proceso de transgénesis por vectores virales
• Seleccionar el virus recombinante

• Sustituir los genes que producen la muerte
• Genes importantes en el ciclo viral
• Extraer los embriones de la hembra de unos 2 días post-coito
• Cultivarlos en placas
• Incluir en las placas los virus recombinantes
• Transferir el embrión infectado a la hembra.
• La transmisión del transgén sólo es posible si el retrovirus se integra en algunas de las
células germinales
7. TRANSFERENCIA NUCLEAR
En la transferencia nuclear (NT) se utiliza el núcleo de una célula procedente del animal que
queremos clonar para introducirlo en un ovocito receptor previamente enucleado. Este ovocito se
activa eléctricamente, o por otros métodos, para que reprograme al núcleo y éste comience la
generación de un embrión que tendrá un 98-99% de la información genética procedente del núcleo
del animal a clonar y un 1-2% procedente del DNA contenido en las mitocondrias y otras
organelas presentes en el citoplasma del óvulo receptor. Consecuentemente, el organismo
resultante no será un clon exacto del animal donante del núcleo. (Peñaranda & Asensio, 2014)
Durante el desarrollo, el contenido genético de cada célula se mantiene, con unas pocas
excepciones, idéntico al que tenía el cigoto. Por lo tanto, las células diferenciadas (adultas) poseen
en su núcleo toda la información necesaria para generar un organismo completo. Esto es lo que
se conoce como totipotencia nuclear. En sus inicios, la transferencia nuclear (NT) se desarrolló
como un medio de comprobar, de forma experimental, este concepto de totipotencia, mediante la
clonación de animales a partir de células adultas. Los núcleos de estas células adultas se
reprograman con la información que hay en el citoplasma del ovocito, de manera que se silencian
algunos genes y comienzan a funcionar otros, produciéndose la parada de la fase adulta para
encenderse la embrionaria. Esta reprogramación permite que las células donantes de los núcleos
para la NT puedan ser fetales, embrionarias o somáticas. (Peñaranda & Asensio, 2014)
Como es posible obtener un número ilimitado de células somáticas a partir de un animal, la
clonación constituye una tecnología que puede ser utilizada para la producción de un gran número
de animales genéticamente idénticos entre sí (clonación reproductiva), aunque difieran en algo de
su progenitor donante del núcleo. Muchos animales de granja, tales como vacas, cerdos y ovejas,
han sido clonados de forma satisfactoria utilizando esta técnica. La oveja Dolly, en 1996, fue el
primer animal clonado a partir de una célula somática adulta (célula de la glándula mamaria de
una oveja de 6 años. (Peñaranda & Asensio, 2014)
Las líneas celulares obtenidas a partir de células somáticas permiten la manipulación de los
genomas de los animales de granja “in vitro”, lo cual permite crear células transgénicas de ovejas,
cerdos y vacas cuyos núcleos, posteriormente, pueden ser transferidos a un ovocito enucleado
para generar un animal transgénico mediante transferencia nuclear: clonación a partir de una
célula transgénica. Polly es la primera oveja transgénica producida por transferencia nuclear. Fue
generada a partir de fibroblastos fetales que fueron previamente modificados genéticamente
mediante la adición del gen humano que codifica el factor IX de coagulación, introducido en un
vector que portaba un promotor que dirigía la expresión a la glándula mamaria. Polly excretaba
el factor IX de coagulación humano en su leche.
Por otra parte, si un embrión obtenido por NT de células somáticas se detiene en fase de
blastocisto y de él se obtienen células ES, éstas pueden cultivarse “in vitro” para diferentes usos
potenciales (clonación terapéutica): terapias de reemplazo y regeneración celular; investigación
médica; e, incluso, se puede realizar la modificación genética de estas células ES para corregir un
defecto genético del individuo donante. (Peñaranda & Asensio, 2014)
8. TRANSFECCION DE GAMETOS
Se comentan algunos aspectos sobre la transfección de gametos y su empleo para la producción

de animales transgénicos (AT). Para la transfección de gametos han sido empleados ADN
desnudo, vectores virales, complejos ADN-Liposomas, electroporación, o microproyectiles de
alta velocidad. En general, se han obtenido altos porcentajes de transfección (hasta del 80% en
espermatozoides) y se ha observado que los transgenes se localizan en el interior del núcleo. Se
ha constatado que los gametos están naturalmente protegidos frente a la entrada de genes extraños:
en espermatozoides esta función la cumplen diversas proteínas presentes en los fluidos seminales
o en su membrana plasmática; mientras que en los gametos femeninos son las envolturas del
huevo (zona pelúcida en mamíferos o membrana perivitelina en moluscos) las que desarrollan
esta labor. En muchos casos, los gametos transfectados se han utilizado en fecundaciones in vitro
o en inseminaciones a fin de crear AT. En algunos casos, los porcentajes de estos AT han sido
altos, como en el salmón (85%). Pero los AT, así creados, han sido en su mayoría quimeras y no
han sido capaces de producir líneas transgénicas. Se sugiere que los AT producidos por gametos
transfectados, son diferentes a los producidos por el método convencional de microinyección. Es
probable que los gametos posean mecanismos, aún no descritos, capaces de modificar la
integración/expresión de los transgenes, o que impedirían la integración de los transgenes en la
línea germinal. (Esponda, 2005)
El procedimiento habitual para transfectar un espermatozoide ha sido el método in vitro. Los

gametos se incuban durante períodos de tiempo cortos en una solución que contiene las
construcciones de genes y luego se comprueban para la transfección, esta técnica ha sido usada
para las inseminaciones o para procedimientos de fertilización in vitro. En varios casos el ADN
desnudo fue empleado con éxito, pero complejos ADN-liposoma o electroporación
procedimientos han sido también usados. El método in vivo emplea una inyección del transgen
en el conducto deferente del ratón y después de 6-12 horas los gametos son recogidos y
analizados. En el caso de las transfecciones in vitro de gametos femeninos se han usado liposomas
o retrovirus los cuales han sido aplicados con éxito. (Esponda, 2005)
La localización del gen foráneo en el espermatozoide se lo realiza mediante hibridación in situ

fluorescente, autorradiografía o inmunocitoquímica. Después de usar el procedimiento de
transfección in vitro o in vivo un alto porcentaje (80%) de espermatozoides aparecieron
transfectados. Generalmente, estos resultados mostraron que el gen extraño apareció en el núcleo
de los espermatozoides y procedimientos moleculares (secuencias de Slot-Blot, PCR, Southern
Blot) han demostrado la presencia del transgen en el ADN de los gametos. (Esponda, 2005)
9. TRANSFERENCIA GÉNICA CON TRANSPOSONES
Los transposones se definen como elementos transponibles que contienen genes adicionales a
parte de los necesarios para la transposición y están dentro de secuencias repetidas. Dentro de esta
categoría se encuentran los trasposones compuestos de procariotas, familia Tn3, elemento P de
Drosophila, secuencias Alu de mamíferos, retrotrasposones. (Narbón, 2008)
Los trasposones son secuencias de material genómico que tienen la capacidad del saltar fuera y
dentro del genoma. Son capaces de autorreplicarse e integrarse aleatoriamente en nuevos sitios
dentro del genoma (trasponerse o “saltar”). Pueden entrar en plásmidos y ser propagados por ellos.
Estas propiedades les confieren la capacidad de ser transferidos exitosamente en células y
genomas extraños. La ingeniería genética puede manipular estos trasposones para llevar a cabo
transferencia horizontal de genes. La transferencia horizontal de genes es la transferencia de
material genético entre células y genomas que pertenecen a especies no relacionadas, por procesos
distintos a la reproducción. Un ejemplo de ello es el uso de los trasposones de salmónidos para la
transferencia génica en vertebrados. Los trasposones de vertebrados de la familia Tc1/mariner
contienen como mínimo un gen único que codifica la enzima trasposasa flanqueada por dos
repeticiones terminales invertidas (tir). Cada una de las tir posee uno o varios sitios de 20-30 p.b.
de interacción con la trasposasa. (Narbón, 2008)
La trasposasa interacciona con estos sitios para cortar el trasposón, luego interacciona con
secuencias presentes en el genoma en otro locus y pega el trasposón en el nuevo locus. En
vertebrados todos los trasposones que se han detectado están inactivados por mutaciones. Sin
embargo recientemente se ha obtenido un trasposón activo de salmónidos mediante múltiple
mutagénesis dirigida. Dicho transposón denominado “Bella durmiente” o “Sleeping beauty” (SB)
se puede usar en todos los vertebrados analizados hasta el momento como vehículo de
incorporación de nuevos genes y para inactivar genes en el genoma por inserción. (Narbón, 2008)
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sig=2HmUGfJwf0ksfnQnLkoymlYGbL4&hl=es-
419&sa=X&ei=4qahVcy2K8jVoATgu4T4BA&ved=0CEcQ6AEwBw#v=onepage&q&
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Transfección de Gametos-Transferencia Génica Con Transposones-Fusionado

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Transfección de Gametos-Transferencia Génica Con Transposones-Fusionado

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UNIVERSIDAD POLITECNICA SALESINA

INGENIERIA EN BIOTECNOLOGIA RR.NN.

Consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante

Se comenta la producción de animales transgénicos (TA) utilizando espermatozoides u

Los primeros procedimientos de transfección se produjeron a principios de la década de 1960

• El procedimiento in vitro cuando se introducen genes extraños en células o tejidos

Para la transferencia de genes a animales se pueden utilizar varias técnicas. Difieren en su

La utilización del método de transferencia de genes depende del conocimiento de un gen

• Microinyección: Inyección directa del vector de expresión en óvulos fecundados o

La aplicación de cualquiera de estos métodos dará lugar a la transformación eficaz de un

TRANSFERENCIA GÉNICA CON TRANSPOSONES

Localización de los transposones en el genoma de los vertebrados

El experimento clásico de cinética de renaturalización de genomas desnaturalizados confirma

Nunca se ha aislado un transposón de vertebrados activo debido a que, aunque están

Se han caracterizado varios transposones semejantes al Tc1/Mariner en pez cebra (Danio

Fig1: Esquema de un transposón SB

Uso de los Transposones como Vectores: «Sleeping Beauty» (SB)

Existen algunas dificultades para utilizar retrovirus como vectores.

a) Es necesario que estén a concentraciones muy altas.

Otros requerimientos que necesita un vector transposón son:

Una solución a este problema es el diseñar un sistema disociado de transposones, es decir

Gcontrec. (2006). Inia. Obtenido de http://www.inia.es/GCONTREC/pub/coll_1161095917875.pdf

Esponda, P. (2005). Transfection of Gametes: A Method to Generate Transgenic Animals. SCIELO,

Narbón, P. (14 de Junio de 2008). Tranferenia Génica en Animales . Obtenido de UNED:

Rodríguez Yunta, E. (2012). Desafíos éticos de la manipulación genética y la investigación con

TRANSFERENCIA DE DNA EXÓGENO MEDIADA POR ESPERMA DURANTE

c) y, posteriormente, la integración del transgén en el genoma del espermatozoide (hecho

1. PASO 1. SELECCIÓN DE MUESTRA DE LOS ANIMALES

El semen utilizado de verracos de fertilidad probada pertenecientes al centro de

nutricionales, aplicados a los verracos, fueron los utilizados sistemáticamente en la granja

2. MEDIO UTILIZADO PARA EL PROCESADO ESPERMÁTICO

El medio utilizado para la dilución y lavado de los espermatozoides fue el Swine

4. RECOGIDA DEL SEMEN Y PROCESADO DE ESPERMATOZOIDES

Espermatozoides eyaculados. La recogida de semen se realizó mediante el método

5. EVALUACIÓN DE LA UNIÓN ESPERMATOZOIDE-ADN Y VIABILIDAD

El análisis de la unión espermatozoide-ADN y viabilidad espermática fue realizado

6. INSEMINACIÓN INTRAUTERINA QUIRÚRGICA.

Arias, M., Delgado, A., Sánzhez, R. y Felmer, R. (2015). Transfección de

Peñaranda.M, & Asensio.F. (2010). ANIMALES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE:

Habitáculos individuales (García et al., 2009, p. 136) Método manual

La viabilidad y motilidad progresiva Se sabe que la unión de ADN exógeno

La transfección de esperma se logra con

Lo que impulsa la integración en el La electroporación permite que los

La unión e interiorización de ADN se da por

El ADN exógeno interactúa con proteínas de MCH II (Complejo mayor

Análisis bajo Depositando

Seguida del estudio de la eficiencia de la transgénesis en ellas, seleccionando los animales

SE EVALUARÁ : El Estado anatómico-fisiológico.

(Peñaranda.M & Asensio.F, 2010)

Transferencia espermatozoide-ADN exógeno en espermatozoides porcinos eyaculados y

PASO 1. SELECCIÓN DE MUESTRA DE LOS ANIMALES

● El medio utilizado para la dilución y lavado de los espermatozoides fue el Swine

• Posteriormente fue suplementado con 6 mg/ml de Albúmina Sérica Bovina

El plásmido EGFP utilizado en este trabajo, contiene el promotor temprano CMV

Espermatozoides eyaculados. La recogida de semen se realizó

En el laboratorio: Se diluyó de nuevo en medio SFM (37º C) en

● El análisis de la unión espermatozoide-ADN y viabilidad espermática fue realizado mediante

Los datos medidos por el citómetro

(Beckman Coulter Inc.2003)

La SMGT ha demostrado ser de gran aplicabilidad en numerosas

Nombre: Sthephanie Chimbo, Ana González, Sangurima Miguel, Carolina Sarango,

Tema: Principios Bioéticos de la clonación, transgénesis y Técnicas de clonación.

La clonación constituye un tipo de reproducción asexual mediante la cual el producto o