1. Каллусная ткань: определение, получение, использование.

Каллусная ткань – это неорганизованная пролиферирующая ткань,

состоящая из дедифференцированных клеток. В дальнейшем они
специализируются как каллусные, т.е становятся особым образом
дифференцированными.
Каллус может образовывать как на изолированных кусочках ткани in vitro,
так и на растении при поранении. Обязательным условием дедифференцировки
растительной клетки и превращения ее в каллусную является присутствие в
питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и
цитокининов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки,
подготавливающий ее к делению, а цитокинины — пролиферацию (деление)
дедифференцированных клеток (рис. 1).

Рис. 1. Получение культуры каллусной ткани из различных эксплантов:

фрагментов стебля, корня, листа, лепестков, тычинок
 Если в питательную среду без гормонов поместить кусочек стебля, листа,
корня (без верхушки) или любой другой растительный эксплант, состоящий из
специализированных (дифференцированных) клеток, то деления клеток не
произойдет и каллусная ткань не образуется. Это связано с неспособностью
дифференцированных клеток к делению. Каждая клетка проходит три фазы роста:
1) деление; 2) растяжение; 3) дифференцировку. Характерной чертой
заключительной фазы роста является утолщение вторичной клеточной оболочки и
потеря клеткой способности к делению. Для того чтобы дифференцированные
клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла
их дедифференцировка, т. е. клетки как бы возвратились в меристематическое
состояние. Размножение дедифференцированных клеток приводит к
анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная
ткань. Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную
связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла в
процессе дифференцировки.
Количество и соотношение гормонов подбирается эмпирически для каждого
вида.
Каллусные клетки in vitro сохраняют многие физиолого-биохимические
свойства, присущие нормальным клеткам, входящим в состав растительного
организма. Каллусные клетки сохраняют способность к синтезу вторичных
метаболитов. Морозостойкость и способность к закаливанию присущи
каллусным клеткам, полученным от морозостойких растений. Этим свойством не
обладают каллусные ткани, полученные от тропических и субтропических
культур. Таким образом, устойчивость к низким температурам сохраняется при
переходе клетки к каллусному росту. Каллусным тканям свойственна и
фотопериодическая реакция, что связано с сохранением активности фитохрома.
Из этих особенностей вытекают основные направления использования
каллусных культур:
 изучение процессов клеточной дифференцировки и морфогенеза;
 исследования физиологии и биохимии растений;
  изучение процессов образования опухолей;
 регенерация растений, получение новых форм растений;
 получение клеточной суспензии;
 сохранение коллекций разных видов растений.

2. Суспензии растительных клеток: методы получения, использование.

Суспензию клеток можно получить из каллуса, поместив его в жидкую
питательную среду с автоматическим перемешиванием. Используя фермент,
например, пектиназу, получаем суспензионную культуру непосредственно из
ткани экспланта (лист, стебель, корень и т. д.). Вначале на поверхности экспланта
образуется каллусная ткань, а затем уже от нее отделяются клетки и клеточные
агрегаты, в результате чего получается клеточная суспензия. Для получения 100
мл клеточной суспензии необходимо 2—3 г свежей каллусной ткани.
Необходимым условием культивирования клеточных суспензий является
постоянное перемешивание или встряхивание среды. Если клеточная суспензия
находится в неподвижном состоянии, то деление суспензионных клеток приводит
к образованию каллусной ткани. Деление суспензионных клеток поддерживается
при наличии ауксинов и цитокининов, т. е. тех гормонов, которые необходимы
для индукции и роста каллусных клеток. Таким образом, суспензионные
культуры представлены типичными каллусными клетками, обладающими всеми
свойствами, характерными для клеток такого рода.
Суспензии лучше образуются из рыхлого каллуса, получаемого на средах с
2,4-Д. Исключение из питательной среды ионов кальция облегчает
суспендирование. Еще более облегчает этот процесс добавление в среду фермента
пектиназы, который разрушает пектат кальция, склеивающий отдельные клетки.
Клеточные суспензии в биотехнологии используют для получения вторичных
метаболитов, многие из которых являются ценными лекарственными
препаратами, для промышленного выращивания клеточной биомассы и для
клеточной селекции. Наряду с этим суспензии клеток можно применять в
качестве исходного материала для получения изолированных протопластов.
 3. Морфогенез в каллусной ткани растений: классификация,
механизмы индукции.
Морфогенезом называют возникновение организованных структур из
неорганизованной массы клеток
Существует несколько путей, по которым может идти развитие клетки
после ее дедифференцировки. Первый путь — это вторичная регенерация целого
растения, возможна дифференцировка на уровне клеток, тканей, органов. Второй
путь — это утрата клеткой способности к вторичной дифференцировке и
регенерации растения, стойкая дедифференцировка, приобретение способности
расти на среде без гормонов, т. е. превращение в опухолевую. Такими свойствами
часто характеризуются клетки старых пересадочных культур. Третий путь — это
нормальный цикл развития каллусной клетки, заканчивающийся ее старением и
гибелью. В этом случае клетка претерпевает вторичную дифференцировку и
прекращает делиться (стационарная фаза роста). Однако такая дифференцировка
не ведет к морфогенезу, а закрепляет за ней свойства старой каллусной клетки
Существуют два основных типа морфогенеза (Рис. 2): органогенез и
соматический эмбриогенез.
1. Органогенез – (образования монополярной структуры, т. е. отдельных
органов) – стеблевой, корневой, листовой или флоральный.
2. Соматический эмбриогенез – образование биполярных
зародышеподобных структур из соматических клеток.
В случае органогенеза сначала регенерируют отдельные органы, а затем уже
из них — целые растения, исключение составляет корневой органогенез
 Рис. 2. Типы морфогенеза в культуре каллусной ткани

Способность отдельной соматической клетки полностью реализовывать

свою программу развития и давать начало целому растительному организму
называют тотипотентностью растительной клетки. Любая растительная клетка
обладает одинаковыми потенциальными возможностями, так как содержит весь
набор генов и, следовательно, клетки сохраняют свойственную зиготе программу
развития. Однако свойство тотипотентности не всегда реализуется, так как
потенциальные возможности клеток разных типов проявляются неодинаково. В
некоторых из них гены в сильной степени репрессированы, в связи с чем
проявление тотипотентности становится ограниченным.
Клеточную основу морфогенеза составляет цитодифференцировка.
Регенерация растения начинается со вторичной дифференцировки клеток. При
этом дедифференцированные клетки вновь приобретают структуру и функции
специализированных. Вторичная дифференцировка каллусных клеток не всегда
заканчивается морфогенезом и регенерацией растения. Иногда она приводит
только к образованию тканей (гистодифференцировка). Таким путем каллусная
клетка может превращаться во флоэмные или ксилемные элементы. Другим
примером вторичной дифференцировки может служить превращение
дедифференцированной активно пролиферирующей клетки в старую
неделящуюся каллусную клетку.
 В основе дифференцировки и морфогенеза лежит последовательное
включение различных генов, т. е. дифференцировка клеток определяется
дифференциальной активностью генов. Изменение активности структурных генов
может быть связано с их дерепрессией, репрессией или амплификацией
(умножение). Большую роль в этом процессе играют фитогормоны.
Морфогенезом можно управлять. На способность к морфогенезу влияют
внешние и внутренние факторы. К внутренним факторам относятся: вид растения;
орган, из которого взят эксплант; возраст экспланта. К внешним: состав
питательной среды; температура, свет и т.д. Наиболее сильный фактор –
изменение соотношения между ауксинами и цитокининами в питательной среде.
При Ц>А часто начинается стеблевой органогенез, при Ц<А – корневой. При
образовании корней они не регенерируют затем в целое растение. Стебель же
укореняется при переносе в среду с преобладанием ауксинов. Соматический
эмбриогенез же не зависит от экзогенных фитогормонов и часто происходит на
той же среде, где был получен каллус. Также для перехода к морфогенезу клетка
должна быть готовой к этому, то есть «компетентной». Компетентность – событие
случайное и довольно редкое (1 клетка из 400-1000).
Морфогенез в каллусной ткани начинается с того, что под влиянием
соответствующих условий детерминированная клетка обособляется от
окружающих ее каллусных клеток, образуя утолщенную клеточную стенку.
Клетка-инициаль при соматическом эмбриогенезе дает начало зиготе, а при
органогенезе — меристематическому очагу. От недетерминированных каллусных
клеток инициальная отличается более крупным ядром и меньшими размерами
вакуолей. Ядро обычно занимает центральное положение. В инициальных клетках
содержатся большие количества запасных веществ: крахмала, иногда — липидов

4. Фитогормоны и регуляторы роста растений: классификация, принцип

действия, представители, использование. (стадии соматического
эмбриогенеза)
Гормоны, образующиеся в растениях, называют эндогенными (фитогормоны,)
применяемые человеком для обработки растений — экзогенными (регуляторы
роста).
Фитогормоны
Фитогормоны являются посредниками в физиологических процессах,
преобразуют специфические сигналы окружающей среды в биохимическую
информацию.
Потребность растения в фитогормонах составляет 10-13⋅10-5 моль/л, в
большинстве случаев синтезируются в достаточных количествах самим
растением. Синтезируются в отдельных частях растения, но распространяются по
всему организму. Под их действием происходит регулирование обмена веществ.
Гормоны проявляют физиологическое действие на:
 ферменты и ферментные системы;
 обмен белков, липидов, нуклеиновых кислот;
 информационные и транспортные рибонуклеиновые кислоты;
 дезоксирибонуклеиновую кислоту.
Эффект действия гормонов в одних случаях сводится к временному изменению
интенсивности биохимических реакций, в других — проявляется в устойчивом
отклонении процессов, в-третьих — в морфологических изменениях,
затрагивающих соматическую сферу организма, в-четвёртых — в наследственных
морфологических изменениях.
К числу наиболее активным и изученным соединениям гормонального действия
растительного происхождения относятся ауксины, гиббереллины, цитокинины,
абсцизовая кислота, этилен и брассиностероиды.
Ауксины (2,4-Д, ИУК, ИМК, НУК)
Ауксины, или соединения индолилуксусной кислоты (ИУК), образуются в зонах с
высокой меристематической активностью: в апексах стеблей, в формирующихся
семенах, откуда они перемещаются в базипетальном направлении, попадая в
боковые побеги и листья.
Ауксины инициируют деление клеток и влияют на скорость их растяжения,
регулируют формирование проводящих пучков, обусловливают явления фото- и
геотропизма растений, связанные с несимметричностью их распределения.
Активация растяжения клеток происходит при стимулировании ауксином
секреции протонов в клеточную стенку. Возникающая при этом повышенная
концентрация ионов водорода приводит к более активному ферментативному
расщеплению поперечных связей, соединяющих между собой целлюлозные
микрофибриллы.
Другими свойствами ауксинов являются способность вызывать партенокарпию,
задерживать опадание листьев и завязей, активировать корнеобразование у
черенков. Ткани, обогащенные ауксином, обладают аттрагирующим действием,
то есть способны притягивать питательные вещества. Ауксин обеспечивает
корреляционное взаимодействие между органами растущего растения.
Гиббереллины (ГК1, …, ГК9)
*поскольку большинство гиббереллинов — кислоты, их принято обозначать
буквами ГК (англ. АО) с определенным номером (ГК1, ГК2, ГК3 и т.д. в
историческом порядке их обнаружения).
Гиббереллины — фитогормоны, производные флуоренового ряда. Стимулируют
деление и растяжение клеток апикальных и интеркалярных меристем. Под
действием гиббереллинов удлиняются листья, цветки и соцветия. Гиббереллины
усиливают рост стеблей сильнее, чем ауксины. В то же время гиббереллины
практически не влияют на рост корней. Участвуют в процессах прорастания
семян и перехода длиннодневных растений к цветению. Способствуют
образованию партенокарпических плодов.
Гиббереллины способны смещать пол растений в мужскую сторону. Влияние на
метаболизм растения связано с их участием в нуклеиновом обмене: под их
действием индуцируется синтез матричных РНК, которые кодируют образование
гидролитических ферментов, прежде всего амилаз.
Гиббереллины синтезируются в основном в листьях и оттуда перемещаются вверх
и вниз по стеблю.
Цитокинины (Зеатин, Изопентениладенин (IPA), 6-Бензиладенин, Транс-зеатин,
Дигидрозеатин)
Цитокинины — фитогормоны, производные пуринов, стимулируют цитогенез,
прорастание семян, способствуют дифференциации почек. Обладают
способностью задерживать процессы старения растительных организмов и
поддерживать нормальный обмен веществ у пожелтевших листьев, вызывать их
вторичное позеленение.
Цитокинины участвуют в мобилизации-притягивании питательных веществ к
местам локализации: плодам, семенам, клубням. Освобождают боковые почки от
апикального доминирования, вызываемого ауксином, стимулируют их рост. На
молекулярном уровне цитокинины в комплексе со специфическим белковым
рецептором увеличивают активность РНК-полимеразы и матричную активность
хроматина, при этом повышается количество полирибосом и синтез белков.
Цитокинины участвуют в синтезе фермента нитратредуктазы и транспорте ионов
Н+, K+, Са2+.
Образуются в корнях, откуда передвигаются вверх по стеблю в акропетальном
направлении.
Абсцизины (Абсцизовая кислота АБК)
Абсцизины — естественные ингибиторы терпеноидной природы. Задерживают
рост в фазе деления и растяжения клеток, не проявляют токсического действия
даже в высоких концентрациях. Индуцируют наступление состояния покоя у
растений, ускоряют опадание листьев и плодов (абсцизия), тормозят рост
колеоптилей, задерживают прорастание семян.
Сдерживая избыточный рост стебля, абсцизины направляют метаболиты на
формирование фотосинтетического аппарата, то есть координируют ростовой
процесс. Участвуют в механизмах стресса, регулируя устьичные движения.
Абсцизовая кислота быстро накапливается в тканях при действии на растения
неблагоприятных факторов внешней среды, прежде всего при водном дефиците,
вызывая закрытие устьиц, снижая транспирацию и сокращая энергетические
затраты. На молекулярном уровне абсцизины ингибируют синтез ДНК, РНК и
белков. Могут снижать функциональную активность Н+-помпы.
Абсцизовая кислота синтезируются в листьях, транспортируются вверх и вниз по
стеблю. Кроме того, образуется в корневом чехлике.
Этилен
Этилен — специфический гормон, синтезируется во всех органах растения из
метионина. Вносит вклад в регуляцию роста и развития растений (гармон
старения). Участвует в поддержании апикального изгиба у выращенных в темноте
проростков, вызывает эпинастию, то есть быстрый рост верхней стороны органа,
в результате которого лист или лепесток изгибается книзу. По этой причине его
используют для ускорения раскрывания цветков. Опускание листьев под
действием этилена сокращает транспирацию.
Этилен отвечает за контролируемое ауксином подавление роста латеральных
почек, обнаруживающих апикальное доминирование. Тормозит деление клеток и
удлинение проростков, изменяет направление роста клеток с продольного на
поперечное, уменьшая длину и утолщая стебель. Способствуя старению тканей,
этилен ускоряет опадание листьев, увядание цветков и ускоряет созревание
плодов.
В большинстве случаев увеличивает период покоя семян и клубней, способствует
смещению пола растений в женскую сторону, играет роль медиатора
гормонального комплекса в процессах корреляционных взаимодействий в
растении. Тормозит полярный транспорт ауксина и способствует образованию его
конъюгатов. Этилен регулирует реакцию стресса в растениях. На молекулярном
уровне повышает проницаемость клеточных мембран и скорость синтеза белка.
Брассиностероиды (Брассинолид, Долихолид, Кастастерон, Теастерон)
Все новые гормоны, имеющие стероидную природу, были названы
брассиностероидами (БС). Они входят в класс терпеноидов, к которым относятся
гиббереллины и абсцизовая кислота. Кроме пыльцы, брассиностероиды
присутствуют в листьях, стеблях, незрелых семенах, галлах. В настоящее время
эти гормоны обнаружены не только у цветковых растений, но и у зеленых
водорослей, сосновых.
Брассиностероиды играют ключевую роль в регуляции развития, роста:
активируют деление и растяжение клеток, в результате стебель удлиняется и
утолщается; стимулируют разворачивание листьев, дифференцировку ксилемы.
Как и ауксины, усиливают растяжение проростков, но реакция более медленная.
По-видимому, ауксины запускают процесс, а брассиностероиды нужны для его
большей продолжительности. Брассиностероиды регулируют дифференцировку
тканей листа. При их недостатке плохо формируется столбчатый мезофилл и
образуется меньше проводящих пучков в листовой пластинке.
Брассиностероиды ингибируют образование корней. После обработки ими
этиолированные растения приобретают нормальный вид. Они увеличивают
количество полиненасыщенных жирных кислот в мембранах. При недостатке
брассиностероидов у растений наблюдается мужская стерильность — не
формируется фертильная пыльца. При недостатке БС тычиночные нити коротки,
не дорастают до рыльца, и у самоопыляющихся растений не может произойти
самоопыление. Если же пыльца попадает на рыльце пестика, то пыльцевая трубка
растет очень медленно.
Регуляторы роста
Регуляторы роста растений - это химические вещества, которые синтезируются
человеком для регулирования роста и развития растений. Эти вещества действуют
как натуральные растительные гормоны. Следовательно, они также известны как
экзогенные растительные гормоны. Регуляторы роста растений используются в
сельском хозяйстве, садоводстве и цветоводстве. Они применяются в низких
концентрациях и не опасны для человека или животных. Тем не менее,
регуляторы роста растений должны применяться в правильных концентрациях, и
неправильное использование может создать неблагоприятные последствия для
продуктивности и качества урожая.
Ключевое различие между гормонами растений и регуляторами роста растений
заключается в том, что гормоны растений являются естественными, тогда как
регуляторы роста растений являются искусственными и применяются к растениям
людьми. Регуляторы роста растений имитируют функцию природных гормонов
растений.
Регуляторы роста растений обычно применяются в виде лиственных
опрыскивателей или жидкостей для увлажнения почвы. В отличие от природных
гормонов растений, действие регуляторов роста растений является
кратковременным и требует повторного применения для достижения желаемого
эффекта.
Стимуляторы роста корней (ауксины).
Гетероауксин. Один из самых распространенных препаратов. Обработка саженцев
раствором гетероауксина улучшает их приживаемость. Замачивание семян и
луковиц повышает их всхожесть. При пересадке растений применение раствора
препарата позволяет культуре комфортнее укорениться на новом месте. Для
саженцев и рассады нужно приготовить раствор. Для этого развести две таблетки
препарата в десяти литрах воды и оставить посадочный материал в полученном
растворе на 20 часов.
Корневин. Схожий по воздействию на растения с гетероауксином. Также
применяется в виде раствора, но может использоваться в сухом виде, т.к.
производится в виде порошка. Достаточно просто присыпать корневую систему
саженца перед посадкой.
Этамон. В отличие от других стимуляторов корнеобразования вносится методом
внекорневой подкормки. Применим как в открытом грунте, так и в теплицах.
Улучшает деятельность корневой системы на уровне клеток растения. Более
эффективен в сочетании с комплексными минеральными удобрениями.
Циркон. Препарат кроме благоприятного воздействия на корни растения,
оказывает еще и защитные функции. Повышает устойчивость к серой плесени,
мучнистой росе, грибковым вирусам. Циркон применяется самостоятельно, так
как является сильнодействующим средством и его сочетание с другими
препаратами может негативно сказаться на развитии растения.
Стимуляторы цветения, плодоношения и прорастания семян
(гиббереллины).
Завязь. Препарат с говорящим названием. Им обрабатываются растения в период
цветения для лучшего плодообразования.
Бутон. Аналог препарата «Завязь». Такими средствами можно еще ускорять
период цветения культур для более быстрого получения урожая.
Томатон. Узкоспециализированное средство, предназначенное для стимуляции
цветения и плодоношения пасленовых культур: томатов, перца, баклажанов.
Гибберсиб. Универсальный препарат, применяемый для стимуляции развития
различных культур: огурцов, картофеля, винограда, капусты и др.
Стимуляторы деления клеток и роста почек (цитокинины).
Цитокининовая паста. Средство применяется для растений, находящихся в
условиях, созданных искусственно, отличающиеся от естественного места и
времени произрастания. Широко применяется при выращивании экзотических
растений (орхидеи, цитрусовые и др.) и для стимуляции развития овощей,
произрастающих в зимних теплицах. Обработке подвергаются только взрослые
растения, для молодых побегов цитокининовая паста может быть губительна.
Очень важно при работе с этим препаратом соблюдать дозировку.
Цитекс. Этот препарат на основе цитокининов, в отличие от предыдущего,
применим для молодых растений. Средство способно «разбудить» росток и
простимулировать его к дальнейшему развитию. Например, рассада,
выращиваемая зимой для высадки весной в открытый грунт, отлично реагирует на
воздействие фитогормонов - цитокининов.
Антистрессовые биорегуляторы (брассиностероиды).
Самое эффективное и популярное средство на основе брассинистероидных
фитогормонов это - «Эпин». «Эпин» обладает огромным спектром благоприятных
воздействий на любые растения. Прежде всего препарат повышает устойчивость
насаждений к стрессовым обстоятельствам (заморозки, засуха, пересадка и т.д.).
«Эпин» укрепляет иммунную систему растений, что позволяет сопротивляться
инфекциям и грибковым вирусам. Средство используется и для обработки (путем
замачивания) саженцев, клубней, луковиц, семян перед посадкой. «Эпином»
можно обрабатывать подряд все культуры на участке, ничего, кроме пользы, эта
подпитка им не принесёт.
5. Растения in vitro как продуценты ценных вторичных метаболитов.
Установлено, что каллусные клетки, культивируемые in vitro, так же, как и
клетки интактного растения, могут синтезировать вторичные метаболиты. Причем
по качественному и количественному составу они могут быть схожи. Так, в
Институте физиологии растений РАН в отделе биологии клетки и биотехнологии
собрана большая коллекция клеточных культур растений из различных семейств,
синтезирующих вторичные метаболиты, широко используемые в
промышленности. К ним относятся: женьшень дальневосточный — источник
диосгенина, диоскорея дельтовидная — стероидные гликозиды, равольфия
змеиная — продуцент антиаритмического алкалоида аймалина, стевия —
стевиозид и т. д. В последние годы особый интерес представляют исследования
по культивированию в биореакторах изолированных клеток тиса ягодного.
Установлено, что клетки данного растения синтезируют вещество — таксон,
которое является антираковым препаратом.
Экспериментально доказано, что прирост клеточной биомассы в условиях in
vitro и in vivo может проходить с разной скоростью. Например, за год прирост
корня женьшеня в тайге составляет 1 г, на плантации — 3 г. При выращивании
клеток корневого происхождения на агаре (in vitro) можно получать 0,4 г сухой
массы на литр среды в день. Биомасса клеток женьшеня в суспензии при
выращивании в 50-литровом ферментере увеличивается на 2,0 г в литре среды за
сутки. Что гораздо быстрее, а учитывая его высокую стоимость, это крайне
привлекательно.
Для получения вторичный метаболитов в биотехнологии используют
клеточные суспензии. Применяют закрытые или открытые системы ферментов в
периодическом или проточном режимах выращивания клеток. В закрытой
системе клеточная система лишена притока свежей питательной среды до конца
выращивания, а в случае непрерывного режима выращивания в открытой системе
питательная среда меняется на свежую.
Для промышленного получения продуктов вторичного синтеза из больших
клеточных масс используют ферментеры большой емкости (от 20000 и более
литров), в которых проводят непрерывное культивирование клеток. Наиболее
распространенный режим глубинного культивирования клеток – закрытая
периодическая система. Для аэрации и перемешивания суспензий используют
качалки, роллеры, ферментеры с механическими и магнитными мешалками или
ферментеры, где аэрация и перемешивание осуществляется воздушным потоком.
Суспензионные культуры могут быть источником ценных вторичных
метаболитов, и в них могут быть новые необычные соединения, например
камптотецин, харрингтонин и другие антиканцерогены, пептиды (ингибитор
протеаз, ингибитор фитовирусов) и др.
Следует отметить, что деление клеток, приводящее к увеличению клеточной
биомассы, и синтез вторичных метаболитов разобщены во времени. Синтез
вторичных метаболитов достигает максимума в стационарной фазе роста.
Важной характеристикой клеток популяции является ее стабильность в
отношении синтеза, транспорта и депонирования метаболитов. Стабильность
может сохраняться в течение всего времени существования популяции, медленно
снижаться за счет постепенного увеличения числа клеток со сниженным синтезом
метаболитов и быть нестабильной в случае быстрой потери способности клеток
синтезировать вторичные метаболиты.
Исследования показали, что, как правило, синтез вторичных метаболитов
происходит во внутриклеточных органеллах: пластидах, хлоропластах,
митохондриях, ЭПР, лейкопластах; транспорт в соседние клетки или питательную
среду не происходит, а вакуоли и свободное пространство клетки часто
используются для накопления (депонирования) метаболитов.
Количественный и качественный состав вторичных веществ возможно
менять за счет изменения состава питательной среды при выращивании клеток in

vitro.
6.Тотипотентность растительных клеток и плюрипотентность животных
клеток
Тотипотентность – это свойство соматических клеток растений воссоздавать
целое растений в определенных условиях.
Тотипотентность у растений реализуется при заживлении ран. В этом случае на
раневой поверхности растения в результате неорганизованной пролиферации
клеток происходит развитие каллуса. Образование каллуса можно наблюдать при
прививках в местах срастания привоя и подвоя. Каллус первоначально состоит из
недифференцированных клеток. Впоследствии в нем может иметь место
вторичная дифференциация с образованием специализированных тканей и
органов. Однако в природных условиях растения ряда систематических групп
тотипотентность не проявляют. Ввиду высокой специализации клеток многие
однодольные растения утратили способность к раневой реакции и вегетативному
размножению.
Между тем в экспериментальных условиях in vitro при выращивании фрагментов
тканей, органов или клеток на искусственных питательных средах возможна
реализация тотипотентности. Говоря о значении тотипотентности, следует
подчеркнуть, что тотипотентность, как очень ценная особенность растительной
клетки, позволяет моделировать уникальные дифференцировки и
экспериментально исследовать феномен эпигенетической наследственности, а
также открывает огромные возможности для генетической инженерии растений и
биотехнологии
Это свойство клеток обусловлено тем, что, все клетки растений обладают одной и
той же генетической информацией и сохраняют программу развития зиготы. Сама
идея о тотипотенстности была выдвинута Хаберландом в 1902 году.
В 60-е гг. была экспериментально доказана идея Хаберландта о тотипотентности
растительной клетки. Так, в 1965 г. Вэсил и Хильдебрандт впервые
продемонстрировали возможность получения из изолированной клетки табака
нормально развивающегося и достигшего цветения растения.

Плюрипотентность клетки — это клетки которые способны

дифференцироваться во все типы клеток, а именно в производные клеток
первичных зародышевых листков (эктодермы, перидермы, мезодермы), кроме
клеток внезародышевых органов (плаценты и желточного мешка). В отличие от
тотипотеннтных клеток не способны образовать целый организм, но способны
образовывать много типов тканей. К ним можно отнести эмбриональные
стволовые клетки (ЭСК), получаемые из эмбрионов, возможна их длительная
культивация на питательных средах для дальнейшего изучения или применения в
заместительной клеточной терапии.
У животных они существуют короткое время во время эмбрионального развития,
а потом постепенно переходят в мультипотентные клетки, то есть те клетки,
которые способный образовывать много клеток, но которые функционально
связаны.
На сегодняшний день известно, что плюрипотентность животных клеток
обеспечивается сложной системой поверхностных белков клетки, которые
обеспечивают транскрипцию клеток мишеней, регуляторов плюрипотентности.
В настоящие время удалось перепрограммировать соматические клетки
животных для перехода в плюрипотентные клетки, их называют
индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (ИПСК).
ИПСК очень близки к ЭСК, которые получит из эмбрионов, в частности
ИПСК способны диффериенцироваться и образовывать эмбриональные тела
и даже формировать целый организм в определенных условиях (инъекция в
тетраплоидные бластоцисты).
7. Моноклональные и поликлональные антитела.
Моноклональные антитела (МАТ) — антитела, вырабатываемые В-
лимфоцитами, произошедшими из одной плазматической клетки-
предшественницы. Поэтому МАТ направлены только против определенного
эпитопа иммуногенного вещества (=«антигенная детерминанта»=часть молекулы
антигена).
Моноклональные антитела оказались исключительно удобным и широко
применяемым в настоящее время диагностическим средством. С их помощью
определяют маркеры клеточных популяций (фенотипирование клеток крови и в
частности лимфоцитов), гормоны, медиаторы, опухолевые маркеры и т.д. Области
применения моноклональных антител:
 идентификация субпопуляций лимфоцитов человека
 изучение динамики истощения клеточных популяций (например истощения
клеточных популяций врожденного и адаптивного иммунитета возникает
после интенсивной химиотерапии, затем происходит постепенное
восстановление иммунной системы)
 выделение клеток
 установление функций молекул клеточной поверхности
 определение группы крови (реакция агглютинации)
 диагностика опухолей и локализация опухолей
  иммунорадиометрический анализ (IRMA) (анализ, в котором используются
радиоактивно меченные антитела. Метод превращает неизвестный антиген
в отслеживаемый радиоактивный продукт. Это позволяет определять его
местоположение и количество)
 Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) - лабораторный
иммунологический метод качественного определения и количественного
измерения антигенов и антител. В основе ИФА лежит принцип
специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему
моноклональным антителом. Выявление образовавшегося комплекса
проводят с использованием так называемого конъюгата, который
представляет собой анти-антитело, соединённое с ферментной меткой
(обычно используют пероксидазу хрена)
 анализ сложных смесей антигенов
 анализ эмбрионального развития
 квадромы (клетки, образующиеся при слиянии двух гибридом. Они
синтезируют бифункциональные антитела, имеющие активные центры к
разным антигенам)
 анализ иммунного ответа

Преимущества:
 Высокоспецифичное распознавание только одного эпитопа антигена
 Бессмертные клеточные линии гибридомы способны продуцировать
неограниченное количество антител
 Минимальный фоновый шум и отсутствие неспецифики при различных
анализах
 Отлично подходит для аффинной очистки

Недостатки:
  Разработка моноклонального требует времени и высоких технических
навыков.
 Антитела могут быть слишком специфичными для обнаружения одних и
тех же антигенов у разных видов.
 Уязвимы к смене эпитопа. Даже небольшое изменение конформации может
привести к резкому снижению связывающей способности

Получение МАТ
Для получения МАТ изолируют лимфоциты из селезенки иммунизированной
мыши (1) и производят их слияние с опухолевыми клетками мыши (клетками
миеломы) (2). Это необходимо, так как жизнеспособность
антителопродуцирующих лимфоцитов в культуре ограничена лишь несколькими
неделями. При слиянии с опухолевой клеткой возникают гибридные клетки, так
называемые гибридомы, которые являются потенциально бессмертными.
Частоту слияния клеток (2) повышают с помощью полиэтиленгликоля (PEG).
Отбор продуктивных гибридных клеток проводится при длительной инкубации
первичной культуры в ГАТ-среде (НАТ-среде) (3), содержащей гипоксантин,
аминоптерин и тимидин. Аминоптерин, аналог дигидрофолиевой кислоты,
конкурентно ингибирует дигидрофолат-редуктазу и тем самым биосинтез дТМФ.
Поскольку дТМФ существенно необходим для синтеза ДНК, миеломные клетки
не могут выживать в присутствии аминоптерина. С другой стороны, клетки
селезенки могут преодолевать действие ингибитора, используя для синтеза ДНК
гипоксантин и тимидин, однако и они существуют в течение ограниченного
времени. Только гибридома выживает в виде культуры в среде ГАТ, так как эти
клетки обладают одновременно бессмертием миеломных клеток и способностью
клеток селезенки приспосабливаться к аминоптерину.

Такие клетки необходимо выделить и размножить клонированием (4). После

тестирования клонов на способность образовывать антитела отбираются
положительные культуры, которые снова клонируются и подвергаются
последующей селекции (5). В результате получают гибридому, продуцирующую
моноклональные антитела. Производство моноклональных антител этими
клетками осуществляют in vitro в биореакторе или in vivo в асцитной жидкости
(свободная жидкость в брюшной полости) мыши (6).
Существуют также:
 Конъюгированные моноклональные антитела. Моноклональные антитела,
присоединенные к химио- или к радио- препарату (препараты,
используемые в химио- и лучевой терапии рака), называются
конъюгированными моноклональными антителами. В данном случае
моноклональное антитело используется как «высокоточное» средство
доставки препарата, что уменьшает повреждение нормальных клеток
(таргетная терапия).
 Биспецифические (бифункциональные) моноклональные антитела. Такие
антитела синтезируются квадромами и имеют активные центры к разным
антигенам, что означает, что они могут одновременно прикрепляться к двум
различным белкам.

Поликлональные антитела — это антитела, которые секретируются

различными линиями B-лимфоцитов в организме. Они представляют собой набор
молекул иммуноглобулинов, которые реагируют на определенный антиген, но
каждая из этих молекул идентифицирует отдельный эпитоп.
Смесь антител, выделенную из сыворотки крови, называют поликлональным
препаратом. Поликлональные антитела ранее широко использовались в
иммунодиагностике, для их получения использовались иммунизированные
животные (обычно кролики). Использование поликлональных антител имеет два
недостатка, существенных для некоторых методов диагностики:
 содержание отдельных антител в поликлональном препарате может
варьировать от одной партии к другой;
 поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить
две подобные мишени, например, когда патогенная (мишень) и
непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной
детерминантой.

Преимущества:
 Короткие сроки изготовления и невысокая стоимость.
 Высокая стабильность и устойчивость к изменениям pH или буферного
раствора.
 Высокая связываемость (афинность). Могут связываться с нужным белком
даже при низкой его концентрации. Это делает эти антитела идеальными
для иммунопреципитации (выделение белка из сложных смесей).
 Устойчивы к незначительным изменениям антигена. Поликлональные
антитела менее чувствительны к изменениям антигена, чем
моноклональные антитела.

Поликлональные антитела используются для тех же целей и в тех же анализах,

что и моноклональные, но проявляют себя хуже, если требуется высокая
специфичность.
8. Клеточная селекция на устойчивость к фитопатогенам
Клеточной селекцией называется отбор в культуре in vitro клеток с
заданными свойствами. Преимуществом отбора in vitro по сравнению с
традиционной селекцией является возможность манипулировать миллионами
генотипов в малом объеме. Если высадить в поле растения, по количеству
соответствующие числу клеток в одной колбе, они займут десятки гектаров.
Затраты на обработку такого поля и проведение селекционных мероприятий
будут гораздо больше, чем в случае применения клеточной селекции. Кроме того,
работы в лабораторных условиях не зависят от сезона и погоды. При
использовании клеточной селекции время, необходимое для создания нового
сорта, сокращается на 2—4 года.
Для проведения клеточной селекции используют следующие приемы:
- прямая (позитивная) селекция, при которой выживает лишь определенный
искомый мутантный тип клеток
- непрямая (негативная) селекция, основанная на избирательной гибели
делящихся клеток дикого типа и выживания метаболически неактивных клеток,
но требующая дополнительной идентификации у них мутационных изменений
- тотальная селекция, при которой индивидуально тестируются все
клеточные клоны
- визуальная селекция и неселктивный отбор, когда вариантная линия может
быть идентифицирована среди всей популяции клеток визуально или при
использовании биохимических методов (тонкослойная или жидкостная
хроматография, радиоиммунный анализ, микроспектрофотометрия и др.)
Из перечисленных выше приемов клеточной селекции прямая селекция
является наиболее распространенным методом и используется главным образом
для выделения растений-регенерантов, устойчивых, например, к гербицидам,
антибиотикам, токсинам, тяжелым металлам, солям и др. антиметаболитиам.
Для проведения работ по клеточной селекции растений в условиях in vitro в
качестве объекта исследования могут быть использованы каллусные,
суспензионные культуры или изолированные протопласты. Выбор объекта
зависит от наличия разработанных технологий применительно к различным видам
растений, а также от конечных целей исследования.
Каллусная ткань представляет собой легко доступный материал, который
наиболее часто используют для клеточной селекции. Как правило, работу
проводят на первичной или пересадочной каллусной ткани, которая не утрачивает
способности к регенерации на протяжении ряда субкультивирований. Однако при
работе с каллусными культурами многие исследователи отмечают существенные
недостатки данного объекта: медленный рост ткани, неравноценное для всех
клеток действие токсических веществ, которые применяются в качестве
селективного фактора, а также потеря регенерационной способности в процессе
культивирования каллусных клеток. Несомненно, проводить селекцию
целесообразно на уровне одиночных клеток (суспензионная культура,
протопласты). Однако для многих видов растений не разработаны эффективные
технологии и способы культивирования одиночных клеток. Поэтому, несмотря на
перечисленные выше недостатки использования каллусных культур, этот способ
селекции остается для некоторых видов растений пока единственным.
Получение стабильно устойчивых линий — процесс длительный. Как
правило, селекция начинается с получения достаточного количества каллусной
массы из изолированных растительных эксплантов, использующейся в
дальнейшем для определения концентрации селективного фактора (построение
дозовой кривой), при которой наблюдается одновременно рост каллусной ткани, и
в то же время часть каллусных колоний погибает. Выбранная концентрация
селективного фактора признается оптимальной и используется в дальнейших
экспериментах. Так как первично полученные на средах с селективными
факторами колонии клеток могли возникнуть вследствие физиологической
адаптации или определенного состояния дифференцировки клеток и не быть
генетически устойчивыми, то в течение последующих 4 —6 субкультивирований
на селективной среде проверяется стабильность устойчивости полученных
клонов. Затем их переносят на среду без селективного фактора и
субкультивируют еще 2—3 пассажа. И только после повторного возвращения в
селективные условия отбирают стабильные клоны, из которых пытаются
получить растения-регенеранты. Однако работы, проведенные с получением
растений, устойчивых к повышенным солям, а также к токсинам, выделенным из
грибов — возбудителей болезней, показали, что устойчивость клетки и растения к
исследуемому селективному фактору может совпадать и не совпадать. Прямая
корреляция между устойчивостью растений и клеток in vitro отмечена лишь для
низких температур, устойчивостью к гербицидам, высоким концентрациям
алюминия и другим факторам.
Все операции, связанные с проведением клеточной селекции, можно
разделить на несколько этапов (рис. 1).

1. Получение каллусной или суспензионной культуры.

Если предполагается, что в результате клеточной селекции будут получены
растения с новыми свойствами, необходимо получить культуру клеток,
способных к морфогенезу. Следует использовать типы эксплантов и условия
культивирования, способствующие образованию морфогенных тканей.

Рис. 1. Схема клеточной селекции

2. Субкультивирование в течение 2—3 месяцев для увеличения количества

клеток и повышения генетического разнообразия.
В процессе субкультивирования отбираются клетки, способные к
регенерации растений. Иногда для повышения частоты мутаций клетки
обрабатывают химическими или физическими мутагенами.
3. Выбор вида и концентрации селективного фактора.
Вид селективного фактора зависит от поставленной цели. Чтобы выбрать
концентрацию селективного фактора или определить степень жесткости
селективных условий, определяют реакцию растений и культивируемых клеток на
стрессор в определенном диапазоне его концентраций. В качестве селективного
выбирают такое воздействие, при котором выживает и сохраняет способность к
морфогенезу 20—30% клеток.
4. Инкубация культивируемых тканей в селективных условиях, отбор
выживших клонов.
Селективные агенты добавляют в среду культивирования клеток.
Выжившие клетки вновь пересаживают на селективную питательную среду.
Такой отбор повторяют несколько раз.
5. Стабильно устойчивые клоны переносят на среду для регенерации
растений.
6. Проверка устойчивости растений-регенерантов.
Растения, полученные из устойчивых клонов, помещают в селективные
условия. При этом выбирается такая концентрация стрессора, которая в
значительной степени или полностью ингибирует рост исходных растений.
7. Размножение выживших растений.
8. Проверка устойчивости потомства растений-регенерантов.
Седьмой и восьмой этапы проводятся уже не в лабораторных, а в полевых
условиях. На этом заканчивается работа биотехнолога. Образцы, которые
продемонстрировали стабильное и наследуемое проявление улучшенных
признаков, передают селекционерам и включают в селекционный процесс. Таким
образом, методы биотехнологии не заменяют традиционную селекцию, а служат
для повышения ее эффективности и ускорения селекционного процесса.
Большим разнообразием характеризуются селективные системы,
используемые для получения растений, устойчивых к патогенам. В тех случаях,
когда поражающим фактором являются токсичные продукты
жизнедеятельности патогенных грибов или бактерий, для отбора устойчивых
клеток в питательную среду добавляют фильтрат культуральной жидкости
возбудителя или очищенный токсин. Путем селекции на средах с культуральным
фильтратом Fusarium или фузариевой кислотой получены растения люцерны,
томатов, картофеля и пшеницы с повышенной устойчивостью к фузариозу. Отбор
на средах с продуктами жизнедеятельности разных
видов Helminthosporium позволил выделить формы пшеницы, кукурузы, ячменя и
риса, невосприимчивые к гельминтоспорозу. Аналогичным образом получены
растения табака, устойчивые к Pseudomonas syringae, растения картофеля,
устойчивые к кольцевой гнили и другие невосприимчивые формы разных видов
культурных растений.
Однако выделяемые патогенами токсины не всегда являются единственным
или главным поражающим фактором. Поэтому устойчивость к токсинам может не
коррелировать с устойчивостью к возбудителям болезней. В этом случае для
отбора толерантных растений рекомендованы другие системы клеточной
селекции. Одним из способов является инокуляция клеток каллусных культур
спорами возбудителя болезни. После развития инфекции отбирают
непораженные сектора и регенерируют из этих клеток растения. Таким способом
были выделены растения риса, устойчивые к пирикуляриозу.
В связи с высокой скоростью мутирования патогенов, приводящей к
возникновению новых рас, специфическая устойчивость растений по принципу
«ген на ген» не может надолго их защитить. Поэтому большой интерес
представляют различные виды неспецифической устойчивости, обусловленные
характером взаимодействия паразита и хозяина. Например, для активного роста и
спороношения грибы родов Phytophthora и Pythium нуждаются в определенных
растительных стеринах. На растениях с нестандартным составом стеринов данные
грибы не способны паразитировать. Для отбора таких растений культивируемые
ткани картофеля подвергали действию полиеновых антибиотиков, в присутствии
которых выживали только клетки с измененным соотношением стероидных
соединений. Из резистентных к антибиотикам клеток были регенерированы
растения, среди которых удалось отобрать образцы, устойчивые к фитофторе.
Данная селективная система оказалась полезной и для создания растений,
устойчивых к насекомым- вредителям, которые также нуждаются в стероидных
соединениях растительного происхождения для осуществления линьки,
метаморфоза личинок и формирования репродуктивной системы.
 Другой подход к повышению устойчивости растений связан с
ограничением проникновения в них патогенов. Одним из первых этапов
заражения является разрушение клеточных стенок растений гидролитическими
ферментами, продуцируемыми возбудителем. Было высказано предположение,
что снижение чувствительности к пектиназе и целлюлазе повысит устойчивость к
патогенам. По крайней мере, по отношению к пектиназе это предположение
оказалось верным. Среди растений картофеля, регенерированных из каллусов на
среде с пектиназой в сублетальной концентрации, были формы с повышенной
устойчивостью к фитофторозу, черной ножке и кольцевой гнили. При этом до
15% регенерантов характеризовались невосприимчивостью одновременно к
нескольким патогенам.
Одним из механизмов защиты от патогенных грибов является выделение
растением различных ингибиторов. Большинство ингибиторов является
фенольными соединениями или их окисленными формами. Накопление
фенольных соединений и активация окисляющих их ферментов коррелирует с
устойчивостью к патогену. Предшественниками в биосинтезе фенольных
соединений являются фенилаланин и триптофан, поэтому обогащение клеток
этими аминокислотами может привести к повышенной продукции фенольных
соединений. Использование токсических аналогов аминокислот 5-метил-
триптофана и парафторфе- нилаланина действительно позволило выделить клоны
с суперпродукцией основной аминокислоты. У выделенных клонов активность
защитных реакций была намного больше уровня в контрольных клонах.