Габидова
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
АРНЕБИЯ
В.А. Галынкин, В.И. Кочеровец, А.Э. Габидова
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ
МИКРОБИОЛОГИЯ
Москва, Арнебия
2015
ББК 52.81я73
УДК 615.281:579(075.8)
Г15
Галынкин В.А., Кочеровец В.И., Габидова А.Э. Фармацевтическая микробиология. М.: Арнебия. 2 издание,
дополненное и переработанное. 2015. — 240 с., 83 рис., 62 табл
ISBN 978-5-9244-0082-2
Все права защищены. Никакая часть данной книги не может быть воспроизведена в какой бы то ни было форме
и какими бы то ни было средствами без письменного разрешения обладателей авторских прав.
Оглавление
Глава 2. ГРИБЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.1 Положение грибов в системе живой природы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.2 Морфология и ультраструктура грибов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.3 Организация клеточного цикла дрожжей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.4 Особенности деления ядра . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.5 Ультраструктура грибной клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.6 Экологические группы грибов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.7 Использование грибов в промышленности . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.8 Грибы — возбудители болезней человека и животных . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
Глава 5. ВИРУСЫ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.1 Структура вирусов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
5.2 Взаимодействие вируса с клеткой хозяина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
5.3 Культивирование вирусов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
5.4 Действие химических и физических факторов на вирусы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
5.5 Принципы создания антивирусных препаратов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
5.6 Устойчивость вирусов к химиотерапевтическим препаратам . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
5.7 Интерфероны.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
5.8 Возбудители вирусных болезней человека . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
Оглавление 3
5.8.1 ДНК-содержащие вирусы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
5.8.2 РНК−содержащие вирусы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
5.8.3 Неклассифицированные вирусы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
5.9 Вирусы — возбудители болезней растений. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
5.9.1 Строение и размножение вирусов.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
5.9.2 Симптомы вирусных болезней растений . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
5.9.3 Способы распространения фитопатогенных вирусов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
5.9.4 Защита растений от вирусных болезней . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
5.9.5 Вироиды — возбудители болезней растений . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
5.10 Прионы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
Глава 6. ПРОСТЕЙШИЕ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
6.1 Споровики . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
6.2 Саркодовые . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
6.3 Жгутиконосцы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
6.4 Инфузории . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4 Оглавление
10.6.1 Плазмиды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
10.6.2 Векторы на основе бактериофага λ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98
10.6.3 Космиды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
10.6.4 Фазмиды . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
10.6.5 Векторы на основе бактериофагов, содержащих одноцепочечную ДНК . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
10.6.6 Клетка-реципиент . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
10.7 Введение молекул ДНК в клетки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
10.8 Методы идентификации клонов, содержащих рекомбинантные молекулы. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100
10.9 Клеточная инженерия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101
Оглавление 5
Глава 14. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ
ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
14.1 Ингибиторы биосинтеза компонентов клеточной стенки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
14.1.1 Биосинтез пептидогликана . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 116
14.1.2 Ингибиторами биосинтеза пептидогликана . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
14.2 Ингибиторы синтеза миколовых кислот и арабиногалактана у микобактерий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
14.3 Ингибиторы синтеза белка . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117
14.4 Препараты, нарушающие функции хромосомы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
14.5 Антагонисты фолатов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118
14.6 Антимикробные агенты, воздействующие на цитоплазматическую мембрану . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
14.6.1 Мембраны бактерий . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
14.6.2 Полиены . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
14.6.3 Имидазолы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
14.6.4 Катионные пептиды. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120
6 Оглавление
Глава 18. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ДЕЗИНФЕКТАНТОВ
И АНТИСЕПТИКОВ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
18.1 Действие антисептиков на микробную клетку . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
18.2 Резистентность микроорганизмов к антисептикам и дезинфектантам . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142
18.3 Проницаемость клеточных оболочек и резистентность . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143
Оглавление 7
21.8 Дисбактериоз (дисбиоз) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168
21.9 Микробиота окружающей среды. Санитарно-показательные микроорганизмы. . . . . . . . . . . . . . . . . . 169
21.9.1 Основные требования, предъявляемые
к санитарно-показательным микроорганизмам . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
21.9.2 Принципы и методы проведения санитарно-микробиологических исследований . . . . . . . . . . . 170
21.10 Характеристика основных групп СПМ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 170
21.10.1 Колиформные бактерии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
21.10.2 Энтерококки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
21.10.3 Клостридии . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 171
21.10.4 Стрептококки и стафилококки . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
21.10.5 Бактериофаги . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
21.11 Санитарная микробиология воды. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172
21.12 Санитарная микробиология почвы . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173
21.13 Санитарная микробиология воздуха . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 174
8 Оглавление
23.10.2 Жидкости для промывания фильтров . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
23.11 Метод наиболее вероятных чисел (НВЧ). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 190
23.12 Определение отдельных видов микроорганизмов, недопустимых и ограниченных
количественно в лекарственных средствах . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
23.12.1 Испытание на отсутствие энтеробактерий, устойчивых к желчи . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
23.12.2 Количественное определение энтеробактерий, устойчивых к желчи . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 191
23.12.3 Испытание на отсутствие бактерий E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
23.12.4 Количественное определение бактерий E. coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
23.12.5 Испытание на отсутствие бактерий рода Salmonella . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192
23.12.6 Испытание на отсутствие бактерий Pseudomonas aeruginosa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
23.12.7 Испытание на отсутствие бактерий Staphylococcus aureus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
23.12.8 Испытание на отсутствие грибов Candida albicans . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 193
23.13 Морфологические и тинкториальные свойства микроорганизмов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
23.13.1 Повторение испытания . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
23.14 Возбудители бактериальных заболеваний человека. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 194
Литература . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216
Оглавление 9
Предисловие ко второму изданию тована существенными изменениями в сфере от-
ечественного лекарственного обращения. Произо-
Прошло 15 лет с момента, когда у нас возник- шло усиление правовой базы. В июле 2015г. вступил
ла идея написать первое отечественное целевое в силу Федеральный закон Российской Федерации от
издание по фармацевтической микробиологии. 22 декабря 2014 г. N 429-ФЗ «О внесении изменений
Инициатива была обусловлена тем, что в учебной в Федеральный закон «Об обращении лекарствен-
литературе для студентов фармацевтических вузов, ных средств»». Активно реализуются этапы «Стра-
рекомендованной Минздравом России, материал по тегии развития фармацевтической промышленно-
фармацевтической микробиологии был представлен сти Российской Федерации на период до 2020 года»
только разделом «Микрофлора растительного лекар- и «Стратегии лекарственного обеспечения населе-
ственного сырья, фитопатогенные микроорганиз- ния Российской Федерации до 2025 года».
мы, микробиологический контроль лекарственных Заметно повысился уровень профессионального
средств». Объем раздела составлял 5 страниц. Этого образования специалистов фармацевтической от-
было недостаточно, чтобы раскрыть практические расли. Стартовал процесс гармонизации российских
цели и задачи фармацевтической микробиологии как стандартов по разработке и производству лекар-
одного из прогрессивных прикладных направлений ственных средств с международными требованиями.
микробиологии, имеющего отношение к различным Значительное число европейских фармацевтических
аспектам современной фармации. компаний организовали промышленный выпуск ле-
Многолетний опыт преподавания в медицинских карственных препаратов в Российской Федерации.
и фармацевтических ВУЗах убедил нас в необходи- Все это было учтено при подготовке второго изда-
мости самостоятельного позиционирования фарма- ния книги «Фармацевтическая микробиология».
цевтической микробиологии и актуализации всех ее В связи с завершением издательского проекта
разделов. Однако творческий энтузиазм авторов — со- считаем своим долгом поблагодарить профессора
трудников Первого Московского государственного ме- Н.А. Заикину и доцента Т.С. Потехину за активное
дицинского университета им. И.М. Сеченова и Санкт- участие в написании первой книги и других со-
Петербургской химико-фармацевтической академии вместных тематических изданий. Мы признательны
существенно сдерживался отсутствием самостоятель- профессорам Бунятян Н.Д., Одеговой Т.Ф. и докт.
ной учебной программы по фармацевтической ми- фарм. наук Гунар О.В. за консультативную помощь
кробиологии, необходимой для выпуска бюджетной и профессиональную поддержку. Выражаем искрен-
учебной литературы. Процедура утверждения феде- нюю благодарность издателям в лице Рабиновича
ральных и отраслевых учебников является многолет- С.А. и Серебрякова С.О. за экспертизу и содействие
ним и не всегда успешным для авторов процессом. в реализации проекта.
В этих условиях мы приняли решение инициативно и Задача настоящей книги — познакомить сту-
за короткий срок выполнить эту работу. дентов фармацевтических, медицинских и биотех-
В 2003 г. издательство «Арнебия» (Москва) вы- нологических ВУЗов и специалистов, работающих
пустило в свет первый вариант книги «Фармацевти- в сфере лекарственного обращения, с современным
ческая микробиология» тиражом в 1000 экз. В из- уровнем развития и практического применения фар-
дании были представлены современные материалы мацевтической микробиологии в Российской Феде-
по наиболее известным сферам применения фарма- рации.
цевтической микробиологии - разработке, производ- Мы надеемся, что второе издание «Фармацев-
ству и контролю качества лекарственных средств. тической микробиологии» удовлетворит запросы не
Со временем книга стала заглавной в тематической только студентов, но и станет доступным материа-
серии изданий, так как была дополнена словарем лом на постдипломном этапе образования аптечных
терминов, руководством по методам исследования, провизоров, технологов фармацевтических предпри-
справочником по питательным средам и учебными ятий и микробиологов контрольных лабораторий.
пособиями. Эти источники оперативно актуализиро-
вали базовое издание на протяжении десяти лет.
Инициатива подготовить второе издание книги профессор Галынкин В.А.
«Фармацевтическая микробиология» была продик- профессор Кочеровец В.И.
Введение 11
ЧАСТЬ I
БИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ
Глава I. ПРОКАРИОТЫ (БАКТЕРИИ)
Глава I 15
Рис. 2. Модель организа-
ции эукариотиче-
ской клетки [1].
организма. Их можно обнаружить даже в горячих ис- Систематика включает в себя три самостоятельные
точниках, где они живут при температуре около 60°С составные части: классификацию, идентификацию
или выше. Численность бактерий трудно определить: и номенклатуру. Классификация, как уже упомина-
в 1 г плодородной почвы может находиться до 100 млн., лось, — это распределение организмов на таксономи-
а в 1 см 3 парного молока — 3000 бактерий. Жизнеде- ческие группы.
ятельность микроорганизмов имеет важное значение И д е н т и ф и к а ц и я — это определение при-
для всех остальных живых существ, т. к. бактерии надлежности изучаемого организма к тому или иному
и грибы разрушают органическое вещество и уча- таксону (классу, порядку, семейству, роду, виду и пр.).
ствуют в круговороте веществ в природе. К тому же Н о м е н к л а т у р а — это свод правил присвое-
бактерии приобретают все большее значение в жизни ния названий таксонам и список этих названий. Но-
людей, и не потому, что они вызывают различные за- менклатура — это заключительный этап систематики
болевания, а потому, что их можно использовать для после классификации, выполняет функции «информа-
получения многих необходимых продуктов. ционного языка» и до некоторой степени независима
Прокариотические клетки устроены проще, чем от классификации.
эукариотические клетки. В них нет четкой границы До второй половины XIX в. классификация ос-
между ядром и цитоплазмой, отсутствует ядерная новывалась на внешних проявлениях организма —
мембрана; ДНК не образует структур, похожих на хро- ф е н о т и п а х (морфология, подвижность, окраска
мосомы эукариот, поэтому у прокариот происходят по Граму, наличие капсулы, способность образова-
только процессы митоза. У большинства прокариот ния эндоспор, культурально-биохимические свойства
отсутствуют внутриклеточные органеллы, ограничен- и некоторые другие признаки), так как наследственная
ные мембранами, а также митохондрии и хлоропла- структура организмов — г е н о т и п ы — была еще
сты; рибосомы свободно лежат в цитоплазме. недоступна для исследования.
К прокариотическим организмам отнесены сине- Следовательно, традиционная, или
зеленые водоросли, бактерии, риккетсии, актиномице- к л а с с и ч е с к а я , с и с т е м а т и к а , основанная
ты и микоплазмы [2, 3]. на изучении внешних, проявляющихся в процессе
В настоящее время описано более 3,5 тыс. видов жизнедеятельности признаков, — целиком ф е н о -
бактерий, но их число постоянно возрастает. Разо- типическая систематика (феносисте-
браться в этом поразительном многообразии воз- м а т и к а ) . Расширение доступной исследователю
можно благодаря систематике. С и с т е м а т и к а информации о фенотипе и использование вычисли-
(от греч. systema — целое, составленное из частей; тельной техники для ее обработки привело к появле-
systematicus — упорядоченный) — наука о классифи- нию нового направления — ч и с л е н н о й ( ч и с л о -
кации организмов, их эволюционном родстве и взаи- во й , и л и н ум е р и ч е с ко й ) т а кс о н ом и и .
моотношениях друг с другом. Возникновение (в 50-х гг. XX в.) и успешное раз-
К л а с с и ф и к а ц и я (от лат. classis — разряд, витие молекулярной биологии способствовали ста-
группа) — это распределение множества организмов новлению нового направления в систематике, назван-
на основе учета их общих признаков на классы, груп- ного отечественными учеными геносистематикой.
пы (таксоны); составная часть систематики. Г е н о с и с т е м а т и к а , в отличие от феносистема-
Т а к с о н о м и я (от греч. taxis — расположение тики, занимающейся изучением множества призна-
по порядку, закон) — теория классификации, система- ков, базируется на исследовании только одного ве-
тизации живой природы. щества — наследственного материала (ДНК) клетки,
Термины «систематика» и «таксономия» часто в котором запрограммировано индивидуальное разви-
употребляют как синонимы, однако систематика пред- тие организма. Иначе говоря, геносистематика — это
ставляет собой более широкое понятие. раздел систематики, предметом исследования которого
16 Глава I
являются генотипы, или генетические программы, соз- питательной среде в условиях лаборатории. Культуру
данные в процессе биологической эволюции на Земле. микроорганизмов состоящую из особей одного вида
Разница между феносистематикой и геносистематикой называют чистой культурой. Смешанной культурой
заключается в том, что они принципиально отличают- называют смесь неоднородных организмов, вырос-
ся объектами исследования. ших в питательной среде при посеве исследуемого
В классификации родственных микроорганизмов материала (молока, почвы, воды, патологического
используют следующие таксономические категории: материала) или при попадании в питательную среду,
царство (regnum), отдел (divisio), секция (section), засеянную одним видом микроба, еще и другого вида
класс (classis), порядок или отряд (ordo), семейство микроба из внешней среды. Клон — это культура, по-
(familia), род (genus), вид (species). Название микро- лученная из одной популяции клетки определенного
организмам присваивают в соответствии с правилами вида микроба. Штамм — чистая культура опреде-
Международного кодекса номенклатуры бактерий. ленного вида микроба, выделенная из того или ино-
В микробиологии, как и в биологии, для обозна- го объекта и отличающаяся от эталонного штамма
чения видов бактерий принята двойная (бинарная) незначительными изменениями свойств (например,
номенклатура, предложенная еще в XVIII в. К. Лин- чувствительностью к антибиотикам, ферментацией
неем. Согласно номенклатуре название рода пишется углеводов и др.).
латинскими буквами с прописной: первое слово обо- Следовательно, прокариоты составляют отдель-
значает родовую принадлежность микроба (какой- ную классификационную группу микроорганизмов,
либо морфологический признак, фамилию ученого, они существенно отличаются от эукариотных микро-
открывшего этот микроб, и др.); второе слово — на- организмов, к которым принадлежат грибы, растения,
звание вида — пишется со строчной буквы. Видовое животные и человек (табл. 2). В литературе тради-
название микроорганизма, как правило, представляет ционно принято называть представителей прокари-
собой производное от существительного, дающего от «бактериями» [4]. В зависимости от особенностей
описание либо цвета колонии, либо источника оби- клеточной оболочки бактерии подразделяют на четы-
тания микроорганизма, вызываемого им процесса ре основные категории: (1) грамотрицательные бакте-
или болезни и других отличительных признаков. На- рии, (2) грамположительные бактерии, (3) бактерии,
пример, Escherichia coli указывает, что микроб от- лишенные клеточных стенок, (4) архебактерии. Пер-
крыл Эшерих, coli — обитатель кишечника; Bacillus вые две группы имеют ригидные клеточные стенки,
anthracis — микроб образует спору, anthracis — возбу- жесткий каркас которых составляет пептидогликан
дитель сибирской язвы; Azotobacter — микроорганизм, муреин, содержащий мурамовую кислоту. К ним от-
фиксирующий атмосферный азот. носится большинство возбудителей инфекционных
Основной номенклатурной единицей служит вид. заболеваний и сапротрофных микроорганизмов. Бак-
В. Д. Тимаков (1973) дает ему следующее определе- терии, лишенные ригидной клеточной стенки и поэто-
ние: «Вид — это совокупность микроорганизмов, му не имеющие постоянной формы клеток, называют
имеющих единое происхождение и генотип, сходных микоплазмами. Среди них имеются виды, патогенные
по морфологическим и биологическим свойствам, для человека (Mycoplasma pneumoniae, M. hominis,
обладающих наследственно закрепленной способ- M. fermentans), животных и растений.
ностью вызывать в среде естественного обитания ка- Архебактерии не содержат муреина в клеточной
чественно определенные специфические процессы». стенке, что делает их устойчивыми к β-лактамным
Вид подразделяют на подвиды или варианты. Если антибиотикам. По особенностям молекулярного стро-
при изучении выделенных бактерий обнаруживают ения они значительно отличаются от других прока-
отклонение от типичных видовых свойств, то такую риот. Преимущественно это почвенные или водные
культуру рассматривают как подвид. Существуют микроорганизмы, обитающие в экстремальных усло-
также и инфраподвидовые подразделения, обуслов- виях (в среде с высоким содержанием солей, сильно-
ленные отклонением какого-либо небольшого на- кислой, при высокой температуре). Кроме того, среди
следственного признака: антигенного — серовар, них имеются симбионты в пищеварительном тракте
биохимического — биовар, отношения к фагам — теплокровных.
фаговар, патогенности — патовар и др. Введение
в слова общей части «вар» (вариант) рекомендовано 1.2 Морфология
во избежание возможных недоразумений, ранее при-
менявшийся термин «тип» использован для обозначе- Прокариоты — это одноклеточные микроорга-
ния номенклатурного типа. низмы, диаметр клеток которых обычно составляет
В микробиологии используют следующие тер- от 0,2 до 2 мкм (рис. 1). По форме клеток их подраз-
мины: «чистая и смешанная культура», «клон» деляют на три основные группы: сферические (кокки),
и «штамм». Под термином «культура» понимают ми- цилиндрические (бактерии, бациллы) и спиралевид-
кроорганизмы, выращенные на плотной или в жидкой ные (спириллы, спирохеты) (рис. 3).
Глава I 17
Морфология прокариотов и эукариотов
Таблица 2.
Признак Прокариоты Эукариоты
1. Цитологические свойства
Нуклеоид (нуклеоплазма, генофор) отделен от цитоплазмы мембраной — +
Диаметр клетки:
обычно 0,2-2 мкм + —
обычно > 2 мкм — +
Митохондрии - +
Хлоропласты (у фототрофов) - +
Вакуоли, если присутствуют, окружены мембраной - +
Аппарат Гольджи - D
Лизосомы - D
Эндоплазматический ретикулум - +
Локализация рибосом:
рассеяны в цитоплазме + —
прикреплены к эндоплазматическому ретикулуму — +
Ток цитоплазмы, эндоцитоз, экзоцитоз - D
Диаметр жгутиков (если присутствуют):
0,01-0,02 мкм + —
около 0,2 мкм — +
Эндоспоры D -
2. Химические признаки
Полигидроксибутират как запасное вещество в виде включений в цитоплазму D —
Тейхоевые кислоты в клеточной стенке D -
Полиненасыщенные жирные кислоты в составе мембран Редко Обычно
Стеролы в составе мембран D Обычно
Диаминопимелиновая кислота в составе клеточных стенок D -
Пептидогликан, содержащий мурамовую кислоту, в составе клеточных стенок D -
3. Метаболические свойства + D
Клетка поглощает питательные вещества в виде малых молекул Крупные молекулы или
частицы должны быть предварительно гидролизованы внеклеточными ферментами
Компоненты систем дыхания и фотосинтеза (у фототрофов) локализованы + -
в цитоплазматической мембране или ее инвагинантах
Хемолитотрофный тип метаболизма D -
Фиксация N2 D -
Способность к диссимиляционному восстановлению N03 до N20 или N2 D -
Метаногенез D -
Аноксигенный фотосинтез D -
Особенности размножения
Деление клеток без образования системы веретена + —
Деление клеток путем митоза с участием системы веретена - +
Мейоз - D
Молекулярно-биологические свойства
Число хромосом в одном нуклеоиде или ядре Обычно 1 Обычно>1
Хромосомы кольцевые + -
Хромосомы линейные Рибосомы:
70 S + —
80 S — +
Рибосомальные РНК:
16 S, 23 S, 5 S + —
18 S, 28 S, 5,85 S, 5 S — +
По форме клеток их подразделяют на три основ- диплококки, стрептококки, тетракокки, сардины, ста-
ные группы: сферические (кокки), цилиндрические филококки.
(бактерии, бациллы) и спиралевидные (спириллы, Микрококки (micrococcus) характеризуются оди-
спирохеты) (рис. 4). Кокки по своей форме могут быть ночным, парным или беспорядочным расположением
сферическими, эллипсовидными, бобовидными и лан- клеток. Род включает условно-патогенные (M. luteus)
цетовидными. По расположению клеток различают и сапротрофные виды.
18 Глава I
А
1 2 3
4 5 6
B
Streptococcus
C D
a b c
E
Escherichia coli
Рис. 4. Морфология бактерий. А. Сферические
клетки, располагающиеся группами (1 —
Staphylococcus), парами (2, 3 — Neisseria),
цепочками (4 — Streptococcus), тетрадами
(5 — Micrococcus), кубическими пакетами (6 —
Sarcina). В. Цилиндрические (палочковидные)
клетки. С. Вибрионы. D. Спириллы. Е. Спиро-
хета — схема строения: а — наружная мем-
брана, b — протоплазматический цилиндр,
с — периплазматические жгутики [2].
Pseudomonas
fluorescens Диплококки образуют пары. К ним относятся воз-
будители менингита и гонореи.
Стрептококки (streptos — извитой) располагают-
ся цепочками. Среди них имеются патогенные виды
(S. pyogenes).
Тетракокки располагаются по четыре, сарцины
(sarcio — соединяю) образуют пакеты по 8, 16 и более
клеток. В основном это сапротрофные виды.
Стафилококки (staphylos — гроздь) образуют ско-
пления в виде виноградной грозди. Среди них имеют-
ся патогенные (S. aureus) виды.
Proteus mirabilis Цилиндрические (палочковидные) формы микро-
организмов включают бактерии (палочки, не образу-
ющие споры), бациллы и клостридии (спорообразу-
ющие формы). Они различаются по размерам, форме
и расположению клеток. Среди них имеются предста-
вители нормальной микробиоты человека (Escherichia
coli) и патогенные виды (возбудители кишечных ин-
фекций, столбняка, сибирской язвы, анаэробной ин-
фекции и др.
Спиралевидные формы включают спириллы, име-
ющие жесткую клеточную стенку, и спирохеты, кле-
Bacillus anthracis точная стенка которых эластична и обеспечивает их
подвижность. Spirillum minor — возбудитель содо-
Рис. 3. Представители мира прокариот.
Глава I 19
ку — болезни, передающейся через укус грызунов. служить источником биологически активных веществ
Спирохеты — возбудители многих инфекционных за- (фикоцианин) или употребляться как пищевая добавка
болеваний (см. ниже). (Spirulina maxima).
Кроме указанных основных форм, среди прока- В микробиологии существуют два различных
риот имеются виды, отличающиеся более сложным подхода к систематике, обусловливающие два вида
строением. Это актиномицеты, к которым относится классификации. В основе первого лежит идея созда-
большинство продуцентов антибиотиков и некоторые ния естественной (филогенетической) классификации
патогенные виды. прокариот, т. е. построения единой системы, объек-
тивно отражающей родственные отношения между
1.3 Актиномицеты разными группами микробов и историю их эволюци-
онного развития. Второй подход к систематике пресле-
Актиномицетов относят к грамположительным дует практические цели и служит для идентификации,
бактериям. С бактериями их сближает отсутствие на- т. е. установления принадлежности микроорганизма
стоящего ядра (прокариоты), их относят к мицели- к определенному виду. Это искусственная классифи-
альным прокариотам. Однако по морфологическим, кация (традиционная). Современные системы клас-
физиологическим, биологическим и экологическим сификации микроорганизмов, по существу, все ис-
признакам актиномицеты составляют самостоятель- кусственные. На их основе созданы определители
ную группу. Вегетативное тело актиномицетов (мице- для идентификации того или иного микроорганизма:
лий) представлено очень тонкими (в 5-7 раз тоньше, «Определитель бактерий и актиномицетов» Н. А. Кра-
чем грибные, ветвящимися гифами (рис. 5). сильникова (1949).
20 Глава I
Enterobacteriaceae имеет 14 родов (Escherichia, Отдел III. Tenericutes. Объединены грамотрица-
Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, тельные прокариоты без клеточной стенки, но име-
Erwinia, Shigella, Proteus, Yersinia и др.). Семей- ющие цитоплазматическую мембрану. В отделе
ство Vibrionaceae имеет два рода. В род Vibrio вклю- десятая секция — микоплазмы, класса Mollicutes
чены патогенные микроорганизмы. Семейство (от лат. molli — мягкий, cutes — покров, кожа).
Pasteurellaceae имеет три основных рода: Pasteurella, В классе один порядок — Mycoplasmatales — и три
Haemophilus и Actinobacillus. Содержат патогенные семейства: Mycoplasmataceae, Acholeplasmataceae,
виды микроорганизмов. Spiroplasmataceae. В основном патогенные микоплаз-
С е к ц и я 6. Строгие анаэробы. Изогнутые мы включены в семейство Mycoplasmataceae.
грамотрицательные палочки. Одно семейство — С е к ц и я 11. Эндосимбионты.
Bacteroidaceae, в котором 13 родов, среди которых Отдел IV. Mendosicutes. Прокариоты, среди ко-
имеются патогенные. торых нет патогенных бактерий; метанобразующие,
С е к ц и я 7. Диссимилирующие и разлагающие сероокисляющие, галофилы, микоплазмоподобные,
сульфат бактерии. Семь непатогенных родов. термоацидофильные и другие наиболее древние
С е к ц и я 8. Анаэробные грамотрицательные кок- по происхождению бактерии (архебактерии).
ки. Одно семейство — Vellonellaceae, в котором три
рода. 1.5 Строение клетки
С е к ц и я 9. Риккетсии и хламидии. Два поряд-
ка: Rickettsiales и Chlamydiales. Порядок Rickettsiales Клеточная стенка обеспечивает поддержание
имеет три семейства: Rickettsiaceae, Bartonellaceae жесткости структуры клетки, постоянства ее фор-
и Anaplasmataceae. Семейство Rickettsiaceae имеет три мы и механической прочности. Кроме того, она яв-
трибы, в которые внесено восемь родов. Семейство ляется осмотическим барьером, имеющим зоны из-
Bartonellaceae содержит два рода, a Anaplasmataceae — бирательной проницаемости для веществ различной
четыре. Порядок Chlamydiales имеет одно семейство химической природы. В качестве опорного каркаса
Chlamydiaceae и один род — Chlamydia. Все семейства она содержит пептидогликан муреин. Основу муреи-
содержат патогенные микроорганизмы. на (рис. 6) составляют цепи чередующихся остатков
Отдел II. Firmicutes (от лат. firmis — крепкий, N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты,
cutes — кожа). В отдел включены главным образом соединенные β-1,4-гликозидными связями. Остатки
грамположительные бактерии. мурамовой кислоты соединены полипептидными це-
С е к ц и я 12. Грамположительные кокки. Два почками, в состав которых входят α-аланин, D-аланин,
семейства: Micrococcaceae и Deinococcaceae. Семей- лизин, D-глутаминовая и мезодиаминопимелиновая
ство Micrococcaceae имеет четыре рода: Micrococcus, кислоты.
Stomatococcus, Planococcus, Staphylococcus. Аминокислоты D-ряда и мурамовая кислота уни-
В секцию кроме указанных двух семейств вне- кальны для прокариот, своеобразие структуры клеточ-
сены десять самостоятельных родов: Streptococcus, ной стенки служит основой избирательного действия
Leuconostos, Pedicoccus, Sarcina и др. некоторых антибиотиков, например пенициллина
С е к ц и я 13. Спорообразующие грамположи- и других β-лактамов. Клеточные стенки грамположи-
тельные палочки и кокки. Шесть родов: Bacillus, тельных и грамотрицательных бактерий существенно
Clostridium, Sporolactobacillus, Sporosarcina и др. Пер- различаются по своей структуре.
вые два рода имеют патогенные виды. А В
С е к ц и я 14. Неспорообразующие грамположи-
тельные палочки. Семь родов: Lactobacillus, Listeria,
Erysipelotrix и др. Имеются патогенные.
С е к ц и я 15. Неспорообразующие внутри-
клеточные грамположительные палочки. 21 род:
Corynebacterium, Micobacterium, Propionibacterium,
Eubacterium, Asotobacterium, Bifidobacterium,
Actinomices и др.
С е к ц и я 16. Микобактерии. Одно семей-
ство Mycobacterioсеае. Семейство имеет один род
Mycobacterium, в котором 49 видов: Мус. tuberculosis,
D-ala D-ala D-ala
Мус. bovis, Мус. avium, Мус. paratuberculosis, Мус. Рис. 6. Пептидогликан E. coli: A-N-ацетилмурамовая
lepra и др. кислота; B-N-ацетил- глюкозамин; ala — ала-
С е к ц и я 17. Nocardioforms. Девять родов: нин; glu — глутаминовая кислота; DAP — диа-
Nocardia, Pseudococcus, Pseudonocardia и др. минопимелиновая кислота.
Глава I 21
У грамотрицательных бактерий муреиновая сеть У грамположительных бактерий внешняя мембра-
однослойная, иногда двуслойная и составляет не бо- на отсутствует, а муреиновая сеть составляет 30-70%
лее 10% сухой массы клеточной стенки. На ней рас- сухой массы клеточной стенки и достигает 40 слоев.
полагаются белки, липопротеиды, липополисахариды Характерно наличие тейхоевых и тейхуроновых кис-
и фосфолипиды, входящие в состав внешней мем- лот (рис. 8), обеспечивающих отрицательный заряд
браны (рис. 7). Стабилизация этих компонентов обе- клетки и способствующих сорбции катионов из окру-
спечивается ионами Са 2+ и Mg 2+. Существенное зна- жающей среды. У некоторых микроорганизмов могут
чение для структуры и функции внешней мембраны присутствовать добавочные компоненты — липиды,
имеет липид А. Его скелет содержит дисахарид, со- воска, миколовые кислоты, протеины, полисахариды.
стоящий из остатков D-глюкозамина, соединенных β
-1,6-связью, имеющих в положении 1 и 4 фосфатные
группы. Скелет этерифицирован жирными кисло-
тами С12, С14 и С16. Липид А имеет уникальную кон-
формацию — компактную и высокоупорядоченную,
благодаря чему создает в мембране вязкую структуру,
которая затрудняет диффузию желчных кислот, детер-
гентов и некоторых антибиотиков. Липид А обеспечи-
вает токсичность и пирогенность липополисахарида.
Антигенная специфичность грамотрицательных бак-
терий, главным образом, определяется углеводами
О-замещенных боковых цепей, выступающих наружу
с поверхности клетки. Внешняя мембрана определяет
высокую устойчивость грамотрицательных бактерий
по сравнению с грамположительными к антимикроб-
ным агентам.
Рис. 8. Модель строения цитоплазматической мем-
браны Гр+ бактерий. А — глицеролтейхоевая
кислота; В — рибитолтейхоевая кислота G —
гликозил, Ala — аланил.
22 Глава I
капсульные штаммы. У патогенных микроорганизмов При этом микобактерии теряют характерную кислото-
капсула обеспечивает защиту от фагоцитоза, повышая устойчивость, что затрудняет их выявление и диагно-
вирулентность штамма (у пневмококков). У микробов, стику заболевания. Для таких клеток характерны не-
обитающих в почве и на растениях, капсула защищает правильные формы, иногда нитевидные, способные
клетки от высыхания, солнечной радиации, биоцидов. проходить через поры бактериальных фильтров. Лабиль-
Капсулы и слизь создают для микробных клеток ос- ные L-формы способны ревертировать в нормальные
мотические условия, благоприятствующие сорбции клетки. Стабильные формы не образуют клеточной стен-
питательных веществ из субстрата, способствуют ад- ки, поскольку ее утрата связана с изменением генотипа
гезии клеток между собой и субстратом. Многие эк- (мутацией).
зоферменты локализуются в капсуле, где происходят Периплазматическое пространство располагается
превращения веществ, поступающих в клетку (рис. 9). между слоем муреина и цитоплазматической мембра-
ной. В нем находятся ферменты гидролазы, расщепля-
ющие вещества, поступающие в клетку, и полимеразы,
участвующие в синтезе клеточной стенки и капсулы,
а также белки, принимающие участие в транспорте
субстратов в цитоплазму, и белки — рецепторы хемо-
таксических стимулов.
Цитоплазматическая мембрана располагается под
клеточной стенкой и отделяет от внешней среды ци-
топлазму. Имеет толщину 6-8 нм и составляет 8-15%
сухого вещества клетки. Ее структура соответствует
общему принципу организации мембран про- и эука-
риотических клеток. Она состоит из двух слоев моле-
кул липидов, у которых гидрофобные цепочки жирных
кислот ориентированы перпендикулярно ее плоскости,
а гидрофильные полярные части молекул соединены
с молекулами белков за счет полярного, электростати-
ческого и гидрофобного взаимодействия. Молекулы
Рис. 9. Капсулы вокруг клеток Clostridium. липидов и белков не сохраняют фиксированной ори-
ентации, но находятся в постоянном движении внутри
У большинства бактерий капсулы и слизь имеют остова данной мембраны (рис. 10)
полисахаридную природу. У некоторых бацилл это по- Структура грамположительной клеточной стенки.
липептиды в основном D- и L-глутаминовой кислоты. Клеточная стенка содержит до 40 слоев пептидогли-
Капсульные полисахариды обладают антигенной кана. Молекулы тейхоевых кислот ковалентно связа-
специфичностью и используются для изготовления ны с пептидогликаном (ПГ). Липотейхоевые кислоты
вакцин (у пневмококков, менингококков), для иден- (ЛТК) содержат липидные «хвостики», закрепленные
тификации и классификации (у сальмонелл). Рас- в гидрофобной области ЦПМ. Клеточные стенки могут
творимые слизи (декстран Leuconostoc dextranicum, иметь белковые слои на поверхности. Белковые струк-
L. mesenteroides, ксантан Xanthomonas campestris) туры располагаются или островками (как показано
получают в промышленных масштабах и широко ис- на схеме), или тесно упаковываются, образуя S-слой.
пользуют в фармации и других областях. Структура грамотрицательной клеточной стенки.
Протопласты и сферопласты — это структуры, Тонкий слой пептидогликана сверху покрыт внешней
полностью (протопласты) или частично (сферопла- мембраной (ВМ), прикрепленной к нему липопроте-
сты) утратившие клеточную стенку, например, под идами (ЛП). Между двумя мембранами — периплаз-
действием лизоцима или пенициллина. Это осмотиче- матическое пространство со слоем пептидогликана
ски лабильные элементы, которые могут существовать (ПГ) внутри него. Внешняя мембрана на внутренней
только в гипертонических растворах. Они сохраняют поверхности содержит фосфолипиды, на внешней —
биологическую активность и способны в специаль- липополисахариды (ЛПС). ЛПС состоят из липидной
ных условиях ревертировать в нормальные клетки. части, обращенной внутрь внешней мембраны, фор-
Используются в клеточной инженерии для получения мируя ее гидрофобную область, и полисахаридной ча-
гибридных форм микроорганизмов. сти, обращенной во внешнюю среду.
L-формы, получившие свое название в честь инсти- Липиды, в основном, полярные фосфолипиды, со-
тута Листера в Лондоне, образуются в условиях, приво- ставляют около 40% массы мембраны. Они выполня-
дящих к нарушению синтеза клеточной стенки; напри- ют структурные функции и обеспечивают конформа-
мер, у больного туберкулезом возбудитель под влиянием ционные изменения молекул ферментов, необходимые
лекарственных веществ может превратиться в L-форму. для проявления их активности.
Глава I 23
ме. Мембранные структуры, располагающиеся в цито-
плазме, наиболее развиты в клетках эукариот, у бактерий
имеются их аналоги (мезосомы, вакуоли, лизосомы).
Жгутики предназначены для передвижения бак-
терии (рис. 11).
Перемещаться без жгутиков способны цианобак-
терии, скользящие бактерии и спирохеты. Число жгу-
тиков и их расположение на клетке — таксономиче-
ский признак, характерный для определенных видов.
Монотрихи — бактерии с одним жгутиком на кон-
це (Vibrio cholerae); амфитрихи имеют полярно распо-
ложенные жгутики на двух концах (Spirillum volutans);
лофотрихи — пучок жгутиков на одном конце
(Alcaligenes faecalis); у перитрихов жгутики располо-
жены по всей поверхности клетки (E. coli, Salmonella
spp.) (рис. 12).
24 Глава I
из центрального стержня и двух пар (у грамотрица- не образуются. Спорообразование восстанавливает-
тельных бактерий) и одной пары (у грамположитель- ся, если к такой культуре добавить фильтрат поздней
ных) дисков. Жгутики вращаются благодаря тому, экспоненциальной фазы культуры, в которой клетки
что через диски проходит поток заряженных частиц начали спорулировать (см. чувство кворума). Обра-
(Н+, ОН–, Na+) за счет разности потенциалов внутри зование спор требует синтеза ДНК: блокада реплика-
и вне клетки. Жгутики находятся под контролем си- ции прекращает экспрессию ранее индуцированных
стемы, воспринимающей информацию о состоянии генов споруляции. Образование споры начинается
окружающей среды. Поэтому они позволяют клет- с накопления белкового материала, при этом расходу-
кам перемещаться в область с оптимальными ус- ются запасные питательные вещества. Белки споры
ловиями (таксис). Существует около 35 генов, уча- содержат значительно больше цистина, чем вегета-
ствующих в сборке и функционировании базального тивные клетки. Предполагают, что многочисленные
тельца и еще более 20 генов, определяющих направ- дисульфидные связи в белке обеспечивают высокую
ление движения в ответ на внешние стимулы. Вся механическую прочность оболочек спор. На ранней
система находится под контролем главного оперона, стадии споруляции образуются особые белки, кото-
который регулируется системой цАМФ — белок-ак- рые связываются с ДНК, слегка раскручивая ее, что
тиватор. изменяет геометрию пиримидиновых оснований
и повышает их устойчивость к ультрафиолетовому
излучению. В период споруляции образуется спец-
ифическое вещество — дипиколиновая (пиридин-
2,6-дикарбоновая) кислота, которая в виде соли каль-
ция входит в состав оболочки споры.
Морфологические изменения клетки в процессе
споруляции (рис. 13) начинаются с образования асим-
метрично расположенной септы. Подобно обычной
септе, образующейся при делении клеток, она состоит
Рис. 12. Основные типы расположения жгутиков из двух мембран с тонким слоем пептидогликана меж-
бактерий [4] ду ними. Большая часть клетки является материнской,
а меньшая — проспорой, содержащей нуклеоид. Далее
Фимбрии (пили или волоски) располагаются септа деградирует, а мембрана материнской клетки об-
на поверхности клеток многих бактерий. Их чис- волакивает проспору, которая таким образом получает
ло на клетке может доходить до 10 000. Их диаметр двойную мембрану. Между этими мембранами распо-
3-25 нм, длина около 12 мкм. Они обеспечивают сце- лагается слой пептидогликана, формирующий кортекс
пление клеток, например при конъюгации, их адгезию споры. На следующей стадии спорообразования про-
к субстрату. Белки фимбрий служат рецепторами, обе- исходит сборка белковых элементов оболочки споры.
спечивающими биологическое узнавание. Некоторые По окончании созревания споры материнская клетка
фимбрии являются капиллярами, связанными с мезо- лизируется. Зрелая спора содержит минимальное ко-
сомами, и участвуют в водно-солевом обмене. личество свободной воды и повышенное по сравнению
F-волоски (F-пили) по структуре напоминают с вегетативной клеткой количество липидов. На долю
фимбрии, однако на клетке их не более одного-двух. ее оболочки приходится до 50% сухой массы. Все эти
Они находятся лишь у клеток, способных к передаче особенности обеспечивают ее устойчивость к факто-
генетического материала при конъюгации, и принима- рам внешней среды.
ют участие в этом процессе как рецепторы и связыва- Спорообразование присуще преимущественно па-
ющие структуры. Кроме того, они являются рецепто- лочковидным микроорганизмам (бациллам, клостри-
рами специфических фагов. диям). К ним относятся возбудители сибирской язвы,
Споры прокариот — это особая структура, пред- столбняка, анаэробной инфекции, ботулизма и неко-
назначенная для сохранения в неблагоприятных усло- торые сапротрофные виды. Помимо этого споры об-
виях. Споры по сравнению с вегетативными клетками разуют виды родов Thermoactinomyces, Sporosarcina,
намного устойчивее к воздействию высокой темпера- Sporomusa. Все они за исключением последнего
туры, радиации, химических агентов. Споры образу- по Граму окрашиваются положительно.
ются внутри бактериальной клетки обычно при исто- Спора — это покоящаяся форма. В благоприятных
щении в культуральной среде питательных веществ условиях споры прорастают. При этом спора набухает,
и накоплении продуктов обмена. Биохимическим поглощая воду, возрастает ее метаболическая актив-
сигналом для спорообразования служит снижение ность, выделяется дипиколиновая кислота, спора утра-
концентрации в клетке гуаниловых нуклеотидов — чивает свою устойчивость. Наконец, оболочка споры
ГТФ и ГДФ. Спорообразование зависит от плотности разрывается, и из нее выходит вегетативная клетка
популяции: при малой концентрации клеток споры (рис. 13).
Глава I 25
роко распространены в природе, и в последние годы
их считают внутриклеточными паразитами или симби-
онтами, устроенными еще проще, чем вирусы. Вопрос
о том, можно ли вирусы считать живыми организма-
ми, будет подробно рассмотрен далее. Что касается
плазмид, то здесь дело обстоит еще сложнее — ведь
они представляют собой только молекулы ДНК. Плаз-
миды контролируют свою репликацию и число копий
в клетке, которое у разных плазмид может колебаться
от 1 до 100. Для плазмид характерно явление несо-
вместимости, т. е. неспособности близкородственных
плазмид существовать в одной клетке; на этом осно-
вана их классификация. Основная таксономическая
единица у плазмид — Inc-группа (incompatibility —
Рис. 13. Цикл развития Bacillus subtilis: 1 — вегетатив-
ная клетка; 2 — образование септы споруля-
несовместимость). Плазмиды, относящиеся к одной
ции; 3-4 — образование двойной мембраны 1 пс-группе, обладают многими общими свойствами:
споры; 5 — формирование кортекса (а); 6 — сходной молекулярной массой, высокой степенью го-
формирование белковой оболочки (б); 7 — мологии ДНК — и контролируют сходные фенотипи-
зрелая спора; 8 — прорастание споры [2]. ческие признаки.
Механизм несовместимости состоит в угнетении
Способность микроорганизмов к спорообразо- репликации проникшей в клетку плазмиды специфиче-
ванию учитывают при выборе методов дезинфекции ским белком или РНК, вырабатываемым под контролем
и стерилизации, имея в виду высокую устойчивость плазмиды, имеющейся в клетке. Кроме того, под кон-
спор к биоцидным агентам. Наиболее устойчивые виды тролем последней на поверхности клетки синтезирует-
используют в качестве тест-культур для оценки эффек- ся специфический белок или липопротеин, препятству-
тивности стерилизации: Bac. stearothermophilus — па- ющий вхождению в клетку родственной плазмиды.
ром под давлением, некоторые виды Вас. subtilis — су- Плазмиды придают своим клеткам-хозяевам це-
хим паром, Bac. pumilus — радиационной. лый ряд особых свойств. Некоторые плазмиды явля-
Клетки прокариот (от греч. pro — до, karion — ются «факторами резистенции» (R-плазмиды, или
ядро) не имеют оформленного ядра. Иными словами, R-факторы: от англ. R = resistance — устойчивость),
генетический материал (ДНК) прокариот находится т. е. факторами, придающими устойчивость к антибио-
прямо в цитоплазме и не окружен ядерной мембраной. тикам. Примером может служить пенициллиназная
плазмида стафилококков, которая трансдуцируется
1.6 Генетический аппарат различными бактериофагами. В этой плазмиде содер-
жится ген, кодирующий фермент пенициллиназу, кото-
Бактериальная хромосома представляет собой рая разрушает пенициллин и, таким образом, придает
замкнутую кольцевую ДНК длиной около 1,3 м. устойчивость к пенициллину. Передача и распростра-
ДНК бактерий представлена одиночными кольце- нение таких факторов среди бактерий (в результате
выми молекулами длиной около 1 мм. Каждая такая полового размножения) очень мешают врачам. Другие
молекула состоит примерно из 5×10 6 пар нуклеотидов. плазмидные гены определяют устойчивость к дезин-
Суммарное содержание ДНК (геном) в бактериальной фицирующим средствам, способствуют таким забо-
клетке намного меньше, чем в эукариотической, а сле- леваниям, как стафилококковая импетиго; помогают
довательно, меньше и объем закодированной в ней ин- молочнокислым бактериям превращать молоко в сыр;
формации. В среднем, такая ДНК содержит несколь- придают способность усваивать такие сложные веще-
ко тысяч генов, что примерно в 500 раз меньше, чем ства, как углеводороды, что можно использовать для
в клетке человека. борьбы с загрязнениями океана или для получения
Плазмиды и эписомы кормового белка из нефти.
Плазмиды и эписомы — это небольшие фрагменты
ДНК, отличающейся от основной массы ДНК. Они ча- 1.7 Индивидуальный рост и бесполое
сто реплицируются вместе с ДНК хозяина, но не нуж- размножение клеток
ны для выживания его клетки.
Сначала было принято различать эписомы и плаз- Отношение поверхность/объем у бактериальных
миды: эписомы внедряются в ДНК хозяина, а плазми- клеток очень велико. Это способствует быстрому по-
ды — нет. К эписомам относятся F-факторы и так назы- глощению питательных веществ из окружающей сре-
ваемые умеренные фаги. Сейчас обе группы называют ды за счет диффузии и активного транспорта. В бла-
одним общим термином «плазмиды». Плазмиды ши- гоприятных условиях бактерии растут очень быстро.
26 Глава I
Рост прежде всего зависит от температуры и рН среды, Если время генерации изменяется до 50 мин.
доступности питательных веществ и концентрации (рис. 14), то инициация репликации ДНК для дочер-
ионов. Облигатным аэробам обязательно нужен еще них клеток происходит за 60 мин. до их разделения,
и кислород, а облигатным анаэробам, наоборот, нуж- т. е. за 10 мин. до деления, приводящего к образованию
но, чтобы его совсем не было. родительской клетки. Таким образом, мы видим, что
Достигнув определенных размеров, бактерии репликация ДНК может инициироваться в любой мо-
переходят к бесполому размножению (бинарному де- мент клеточного цикла, но этот момент для любого за-
лению), т. е. начинают делиться с образованием двух данного времени генерации будет фиксирован. Клетка
дочерних клеток. Переход к делению диктуется от- в своей жизни проходит разные состояния: фазу роста
ношением объема ядра к объему цитоплазмы. Перед и фазы подготовки к делению и деления. Клеточный
клеточным делением происходит репликация ДНК, цикл — переход от деления к синтезу веществ, со-
во время которой мезосомы удерживают геном в опре- ставляющих клетку, а затем опять к делению — можно
деленном положении (см. рис. Строение клетки). Ме- представить на схеме в виде цикла, в котором выделя-
зосомы могут прикрепляться и к новым перегородкам ют несколько фаз (рис. 15).
между дочерними клетками и каким-то образом уча- После деления клетка вступает в фазу синтеза бел-
ствовать в синтезе веществ клеточной стенки. У самых ков и роста, эту фазу называют G1.
быстрорастущих бактерий деление происходит через
каждые 20 мин.; интервал между делениями называет-
ся временем генерации.
Образование перегородки (рис. 14) начинается по-
сле прекращения репликации ДНК, а затем до само-
го деления проходит время 20 мин (так называемый
D-период). Нормальный период времени, необходи- М-фаза
деление
мый для полной репликации хромосом, составляет
около 40 мин. независимо от скорости роста. Эти ве-
личины определяют момент инициации репликации
ДНК в клетках, растущих с любой данной скоростью. Интерфаза
Например, если время удвоения клетки равно 30 мин., рост клетки
Глава I 27
центраций белков циклинов, как это показано на ри- рые различаются по внешнему виду. Одни колонии —
сунке 16. шероховатые (R — от англ. rough — шероховатый),
другие — гладкие (S — от англ. smooth — гладкий,
ровный). R-штаммы не патогенны и не образуют кап-
сулы; S-штаммы патогенны, и у них имеются тол-
стые капсулы. Гриффит обнаружил, что если мышам
ввести живые R-клетки и мертвые (убитые нагрева-
нием) S-клетки, то мыши погибают через несколь-
ко дней, а в крови у них можно обнаружить живые
S-клетки. На этом основании Гриффит сделал вывод,
что из мертвых S-клеток высвобождается какой-то
фактор, который придает R-клеткам способность об-
разовывать капсулу и предохраняет их от разрушения
в организме животного-хозяина. Оказалось, что такая
«трансформация» наследуется. Поскольку молекулы
«наследственности» в то время еще не были известны
(хотя, правда, и предполагали, что это белки), очень
много усилий было потрачено на то, чтобы идентифи-
цировать трансформирующий фактор.
Рис. 16. Жизненный цикл клетки регулируется белками
В заключение следует сказать, что половое раз-
циклинами, концентрация которых меняется множение (в любой форме) — довольно редкое собы-
на разных фазах цикла. Толщина цветных сек- тие у бактерий. Но поскольку число бактерий в каждой
торов соответствует концентрации циклинов. колонии огромно, половое размножение наблюдается
сравнительно часто. Такое размножение более прими-
1.8 Половое размножение тивно, чем у эукариот; полный обмен геномами (сум-
или генетическая рекомбинация марной ДНК) происходит только при конъюгации, что
действительно встречается лишь изредка. Половое
У бактерий наблюдается и половое размножение, размножение бактерий имеет особое значение пото-
но в самой примитивной форме. Половое размножение му, что именно таким путем передается устойчивость
бактерий отличается от полового размножения эукари- к антибиотикам и дезинфицирующим средствам. В се-
от тем, что у бактерий не образуются гаметы и не про- редине двадцатого века был описан половой процесс
исходит слияния клеток. Однако главнейшее событие у бактерий. Это процесс, при котором бактерии обме-
полового размножения, а именно обмен генетическим ниваются своей генетической информацией. На ри-
материалом, происходит и в этом случае. Этот про- сунке 17 представлена схема этого процесса. Он назы-
цесс называется генетической рекомбинацией. Часть вается конъюгацией. Во время конъюгации образуется
ДНК (очень редко вся ДНК) клетки-донора перено- цитоплазматический мостик, по которому происходит
сится в клетку-реципиент, ДНК которой генетически перенос молекулы ДНК из одной клетки в другую.
отличается от ДНК донора. При этом перенесенная У кишечной палочки имеется молекула ДНК, которая
ДНК замещает часть ДНК реципиента. В процессе за- называется F-фактор (fertility factor — фактор плодо-
мещения ДНК участвуют ферменты, расщепляющие витости). Молекула F-фактора способна встроиться
и вновь соединяющие цепи ДНК. При этом образует- в геномную ДНК. В F-факторе кодируется специаль-
ся ДНК, которая содержит гены обеих родительских ный белок, который образует половые ворсинки, они
клеток. Такую ДНК называют рекомбинантной. У по- называются F-пили. Эти самые ворсинки прикрепля-
томства, или рекомбинантов, наблюдается заметное ются к другой клетке, которые F-фактор не содержат,
разнообразие признаков, вызванное смешением генов. и F-фактор инициирует репликацию. В процессе ре-
Такое разнообразие признаков очень важно для эволю- пликации образуется две копии молекулы ДНК, при-
ции и является главным преимуществом полового раз- чем одна копия остается в исходной клетке, а вторая
множения. копия переносится в другую клетку. То есть, генетиче-
Известны три способа получения рекомбинан- ская информация из одной клетки попадает в другую.
тов. Это — в порядке их открытия — трансформация, Донорная хромосома содержит такие же гены, как
конъюгация и трансдукция. и тот кусок ДНК, который был перенесен в клетку.
При трансформации клетки донора и реципиен- Однако варианты генов в исходной, донорной клетке,
та не контактируют друг с другом. Этот процесс от- и в клетке-реципиенте могут отличаться. Например,
крыл в 1928 г. Гриффит (Griffith), работая с пневмо- в исходной клетке ген кодировал синтез фермента лак-
кокками — бактериями, вызывающими пневмонию. тазы (расщепляет молочный сахар лактозу), а в реце-
У пневмококков имеются колонии двух типов, кото- пиенте такой же ген испорчен, то есть лактазу не ко-
28 Глава I
дирует из-за какой-то мутации. При этом бактерия нут. За это время успевает перейти не вся хромосома,
не способна использовать сахар лактозу в среде. а только ее кусочек. Чем дольше длится конъюгация,
тем больший кусочек успевает перейти из одной клет-
ки в другую. Этот процесс позволяет определить ка-
кие маркеры поступили в клетку, если исходно клетки
различались по нескольким генам. F-фактор способен
встраиваться в разные участки хромосомы, и когда на-
чинается передача, разные маркеры попадают в дру-
гую клетку. После конъюгации клетки встряхивали,
и мостики между ними разрывались. Это встряхива-
ние проводили через 2, 3, 5 минут, и смотрели, какие
маркеры (и, соответственно, какой фрагмент хромо-
сомы) за это время войдут. По этим данным строили
генетическую карту (расположение друг относительно
друга генетических маркеров). Генетическая карта ки-
«Мale» «Female» шечной палочки была построена в 60-х годах. На этой
E. Coli E. Coli карте были гены-маркеры, расположенные по всей
кольцевой хромосоме, а координаты генов на карте
Схематическое изображение
обозначались в минутах. Итоговая карта, построен-
конъюгации у E. Coli
ная в 60-х годах, имела координаты в промежутке
Рис. 17. Половой процесс у бактерий (Бидл и Тейтум, от 0 до 90 минут. Поэтому один известный микробио-
1946; У. Хейс, 1952) лог шутил, что кишечная палочка — это удивительный
организм, у которой жизнь длится 20 минут, а половой
ДНК реципиента и хозяйская ДНК обменивают- процесс — 90 минут.
ся гомологичными (то есть содержащими одинаковые При трансдукции небольшой двухцепочечный
гены) кусками. Образуется новое сочетание генов в хо- фрагмент ДНК попадает из клетки-донора в клетку-
зяйской клетки. Среди ее старых генов оказывается реципиент вместе с бактериофагом (одна из групп ви-
встроен кусок с новым геном, прибывшим из клетки- русов). Возможный механизм трансдукции изображен
донора. Этот процесс обмена кусками ДНК называется на рисунке 18 ниже:
рекомбинацией. Та ДНК, которая в процессе рекомби- Некоторые вирусы способны встраивать свою
нации оказалась не включенной в хромосому, дегради- ДНК в ДНК бактерий; такая встроенная ДНК репли-
рует и исчезает. Новый ген проявляет себя — клетка цируется одновременно с ДНК хозяина и передается
оказывается способной расщеплять тот сахар, который от одного поколения бактерий к другому. Время от вре-
раньше использовать не могла. В такой ситуации ген мени такая ДНК активируется и начинает кодировать
лактазы называют генетическим «маркером», он мар- образование новых вирусов. ДНК хозяина (бактерии)
кирует участок хромосомы, связанный с определен- разрывается, а высвобожденные фрагменты иногда за-
ным свойством бактерии (способностью расщеплять хватываются внутрь новых вирусных частиц, порой
сахар, которую может детектировать исследователь). даже вытесняя ДНК самого вируса. Такие новые «ви-
Процесс репликации у кишечной палочки продолжа- русы», или трансдуцирующие частицы, затем перено-
ется 20 минут, а процесс конъюгации длится 3-5 ми- сят ДНК в клетки других бактерий.
Глава I 29
Глава 2. ГРИБЫ
30 Глава 2
Классы грибов [10].
Таблица 3.
Клеточная стенка
(Г + Ц) Биосинтез Ядерная
Порядок Класс Хитин, Маннан, Ана-морфа Телео-морфа
% триптофана фаза
% %
Покоящаяся спора,
Chytridio- Chytridio- Гаплоидная или Зооспорангий
44 — 46 Ia >5 <5 первичный спорангий
miycota mycetes гаплодиплоидная с зооспорами
Спорангий Зигоспора,
Zygo-
Zygomycota 28 — 54 Ib >5 <5 Гаплоидная со споран- первичный спорангий
mycetes
гиоспорами
Гаплоидная,
Endo- диплоидная или Почкующиеся Сумка с эндогенными
Ascomycota 26 — 54 II <5 >5
mycetes гаплодиплоидная клетки, конидии аскоспорами
Гаплоидная
Asco- или гаплоидно-
46 — 60 Ia >5 <5 Конидии
mycetes дикариотическая
Промицелий
Basidio- Ustomy- Гаплоидно- Почкующиеся
48 — 70 Ib >5 <5 с экзогенными
mycota cetes дикариотическая клетки
споридиями
Конидии, Базидии
Basidio-
44 — 65 Ia, Ib, Ic >5 >5 почкующиеся с экзогенными
mycetes
клетки базидиоспорами
Глава 2 31
гетерогенная группа организмов, часть из которых ти- эндогенные и экзогенные споры бесполого размно-
пичные аскомицеты, другие — базидиомицеты, тре- жения. Эндогенные подвижные споры, зооспоры, раз-
тьи — дейтеромицеты. виваются в зооспорангиях разной формы. Это голые
Это крупные сферические или палочковидные клетки, снабженные жгутиками, число, расположение
клетки размером 3…7 мкм; удлиненные формы могут и строение которых различно в разных систематиче-
быть более 20 мкм. ских группах грибов. Зооспоры разного строения ха-
В специальной литературе часто встречается со- рактерны для представителей отделов оомикота, гифо-
бирательный термин «плесени» («плесневые грибы»). хитридиомикота и хитридиомикота, т. е. в основном для
Это нитчатые, микроскопические грибы разных клас- водных и реже наземных грибов. Для осуществления
сов, способные образовывать субстратный и воздуш- размножения с помощью зооспор нужна вода, хотя бы
ный мицелий, например мукор, аспергиллы, пеницил- в виде отдельных капель на поверхности почвы или
лы и др. растений, в которой зооспоры могут передвигаться
Клетки микроскопических грибов разнообразны с помощью жгутиков. Эндогенные неподвижные спо-
по форме, размерам, но имеют общие структурные ры, спорангиоспоры, одеты оболочкой и образуются
элементы. Клетка всех грибов состоит из клеточной внутри спорангиев, развивающихся на специализиро-
стенки, цитоплазмы с цитоплазматической мембраной ванных гифах, спорангиеносцах, обычно поднимаю-
и эндоплазматической сетью, митохондриями, рибосо- щихся над субстратом. Спорангиоспорами осущест-
мами, включениями, вакуолями, ядром или нескольки- вляется бесполое размножение у зигомикот.
ми ядрами (рис. 2).
32 Глава 2
некоторую часть интерфазы — период, называемый рых антибиотиков и переход к споруляции совпадает
S-фазой клеточного цикла. Между концом М-фазы и на- по времени). Наконец, морфологически дифференци-
чалом синтеза ДНК имеется интервал, известный как рованые клетки могут войти в клеточный цикл в этом
фаза G1 (от англ, gap — промежуток). Другой интервал, статусе. В этом случае наблюдается рост не отдельных
называемый фазой G2, отделяет конец синтеза ДНК клеток, а в виде мицелия, что также приводит к средне-
от начала М-фазы. Таким образом, интерфаза состоит му увеличению времени деления клеток. По существу,
из последовательности фаз: G1, S, G2 и обычно занимает из GO состояния клетки либо возвращаются в клеточ-
не меньше 90% всего времени клеточного цикла. В кле- ный цикл (иногда в новом морфологическом статусе),
точном цикле выделяют три особых критических точки: либо переходят к программированной клеточной гибе-
в фазе G1, в фазе S и в фазах G2+M (G2/M -точка), ко- ли (автолизная программа).
торые контролируются внутриклеточными процессами. Для дрожжей Saccharomyces cerevisiae (рис. 21)
Продолжительность фаз клеточного цикла неодинакова; один из генов, контролирующих прохождение точ-
в среднем фаза G1 составляет 30-40% от всей продол- ки старта, был выявлен и назван cdc28 (аналог cdc2).
жительности клеточного цикла, фаза S — 30-50%, фаза Белок CDC28, кодируемый этим геном, представляет
G2 — 10-20% и фаза М 5-10%. Эти параметры могут собой протеинкиназу, но для функционирования это-
достаточно сильно варьироваться в зависимости от био- го белка требуется наличие другого белка, названного
логического вида, но достаточно неизменны для кон- циклином. Именно циклин и является тем белком, ко-
кретного типа клеток. Существует особая критическая торый периодически синтезируется в ходе клеточного
точка в фазе G1 названная точкой старта (Start). При цикла и исчезает к его окончанию (Э. У. Мюрей, 1991).
прохождении этой точки (для высших эукариотов — Дальнейшие исследования показали, что уместно
точка рестрикции) в клетке происходят изменения, по- говорить не об одном циклине, а о целом семействе
сле которых она должна уже пройти все последующие циклинов. Были найдены три группы циклинов: ци-
этапы клеточного цикла. Такое детерминирование кле- клины фазы Gi (GI cyclins), контролирующие вхож-
точного цикла предполагает внутриклеточный контроль дение в цикл (точка старта); циклины фазы S (S-phase
завершения каждой из фаз клеточного цикла (Hartwell cyclins), контролирующие прохождение фазы S; ци-
L.H., 1974). Иными словами, после точки старта клетка клины фазы М (M-phase cyclins), контролирующие
детерминирована в завершении цикла и выходы из него завершение цикла. Причем циклины, ответственые
невозможны (но не остановки) в любой другой фазе за каждую из фаз цикла, синтезируются в своей фазе,
(S, G2, М). Такое детерминирование клеточного цикла а затем ферментативно деградируют (распадаются)
предполагает внутриклеточный контроль завершения (Dirick L. 1995, Nasmyth К., 1996). Было показано, что
каждой из фаз клеточного цикла. События, происходя- фазы цикла инициируются растворимыми цитоплазма-
щие, например, в фазе G2, не могут разворачиваться при тическими факторами. Активатор М-фазы был назван
прохождении фазы S, и наоборот. М-стимулирующим фактором (М-phase-
Если после окончания клеточного цикла не имеет- promoting factor, MPF), а активатор S-фазы назван
ся условий для вхождения в новый цикл, клетки пере- S-стимулирующим фактором (S-phase-promoting
ходят в состояние GO. По своему определению это со- factor). MPF имеет универсальное значение для эукари-
стояние просто характеризует клетки, не включенные отических клеток и в эволюции высококонсервативен.
в клеточный цикл. В этом состоянии могут находить- Механизм регуляции цикла построенный на ак-
ся клетки, которые подготавливаются к входу в кле- тивации циклинзависимых протеинкиназ (cyclin-
точный цикл (например, увеличивают свой размер dependent kinases — CDK), выполняется для всех
до критического, необходимого для прохождения точ- эукариотов, но его детали сильно различаются для
ки Старта), в этом случае тестируется (как бы) времен- конкретного типа эукариотической клетки.
ное увеличение фазы G1. Иногда, такими добавочными На рисунке 22 показано бесполое размножение
условиями для вхождения в клеточный цикл, является дрожжей Saccharomyces cerevisiae с одновременным
синтез не конституционных ферментных систем, не- прохождением биохимических процессов и изменени-
обходимых для специфического субстрата (например, ем генетического статуса клетки.
для роста дрожжей на н-алканах необходима индукция Половое размножение у грибов, связанный с ним
системы Р-450 (Галынкин В. А. и др., 1990)). С другой процесс смены ядерных фаз, строение половых орга-
стороны, в состоянии GO находятся и клетки, осущест- нов — всё это отличается у разных групп грибов. Су-
вляющие синтез целевого продукта (например, био- щественнейшие моменты полового процесса у грибов:
синтез антибиотиков), в этом случае мы имеем дело плазмогамия, кариогамия и мейоз. Соответственно,
с физиологической дифференцировкой. В состоянии гриб может находиться в гаплоидной или диплоидной
GO находятся клетки, осуществляющие морфологиче- стадиях. Плазмогамия и кариогамия у сумчатых и ба-
скую дифференцировку (например, образование спор). зидиальных грибов не совпадают во времени, в резуль-
В некоторых случаях морфологическая и физиологи- тате чего после плазмогамии у них возникает особая
ческая дифференцировка совпадают (синтез некото- стадия дикариотичного мицелия, когда гаплоидные
Глава 2 33
ядра попарно ассоциированы, сближены, но не сли- Типы полового процесса у грибов. Половое раз-
лись и образуют дикарион. Ядра дикариона обычно множение у грибов известно у всех групп, за исключе-
синхронно делятся с параллельным расположением нием анаморфных, или несовершенных, грибов. Поло-
осей веретен деления. В определенный момент цикла вой процесс у грибов разнообразен и его особенности
развития они сливаются, образуя диплоидное ядро, ко- лежат в основе выделения классов. У грибов известно
торое затем делится редукционно. Смена ядерных фаз три основных типа полового процесса: гаметогамия,
будет подробно рассмотрена при описании отделов гаметангиогамия и соматогамия (рис. 23).
и классов грибов. Гаметогамия — слияние гамет, образующихся в га-
метангиях. Различают изогамию — слияние подвижных
морфологически сходных гамет и гетерогамию — сли-
яние подвижных, отличающихся по размерам и часто
по степени подвижности гамет. Эти два типа гаметога-
мии характерны для хитридиевых и гифохитридиевых
грибов. При оогамии крупные, неподвижные яйцеклет-
ки, формирующиеся в специальных оогониях, оплодот-
воряются мелкими, подвижными сперматозоидами,
развивающимися в специализированных антеридиях.
У многих грибов с этим типом полового процесса спер-
матозоиды не образуются, а яйцеклетка оплодотворяется
недифференцированным на сперматозоиды содержимым
выростов многоядерного антеридия. Такой тип оогамии
характерен для всех представителей отдела оомикота.
Второй тип полового процесса, гаметангиогамия,
состоит в слиянии двух обычно многоядерных специ-
ализированных структур, содержимое которых не диф-
ференцировано на гаметы. Гаметангиогамия характер-
на для зиго- и аскомикот. Гаметангиогамия у зигомикот
носит название зигогамии. Она заключается в слиянии
в основном многоядерных клеток, гаметангиев, хорошо
отличимых от вегетативного мицелия, на котором они
Рис. 21. Показаны четыре фазы: G1, S, G2, M и выход формируются, но недифференцированных морфологи-
из клеточного цикла состояние Go Показаны чески по половому знаку на мужской и женский. Из об-
соответствующие фазо-стимулирующие разовавшейся в результате их слияния зиготы форми-
факторы (phase-promoting factor), представ- руется одетая толстостенной окрашенной оболочкой
ляющие комлекс циклина (cyclin) — кружок зигоспора, которая прорастает после периода покоя
и циклин зависимой протеинкиназы (cydin-
в особый зародышевый спорангий (рис. 23, 24).
dependent kinases — CDK) — квадрат. После
прохождения фазы цикла показана деграда-
У аскомикот при гаметангиогамии также слива-
ция циклинов. На рисунке также представ- ются два многоядерных гаметангия, но у них, в отли-
лен стимулирующий комплекс анафазы чие от зигомикот, половые органы дифференцирова-
(anaphase-promoting complex — АРС), необхо- ны на женский — аскогон и мужской — антеридий.
димый для прохождения одной из стадий ми- Аскогон состоит из двух клеток: крупной многоядер-
тоза — анафазы (расхождение хромосом). ной, или собственно аскогона, и тонкой нитевидной —
трихогины, помещающейся на его вершине, через
В результате полового процесса образуются гапло- которую в аскогон переливается содержимое много-
идные, неоднородные в генетическом отношении спо- ядерного антеридия. При этом происходит только
ры, что принципиально отличает их от спор бесполого плазмогамия, а ядра ассоциируются в пары, образуя
размножения грибов. Эти гаплоидные споры распола- дикарион. Из оплодотворенного аскогона без периода
гаются или на мицелии или, чаще, на поверхности или покоя вырастают аскогенные дикариотичные гифы.
внутри плодовых тел различного строения, которые В их клетках происходит слияние ядер дикариона
называются телеоморфами. Таким образом, размно- и образование диплоидного ядра, которое в дальней-
жение с помощью спор, возникших половым путем, шем делится мейотически. В результате этого процес-
даёт начало формам с новой комбинацией генетиче- са на аскогенных гифах достаточно сложным путем
ского материала, что является основой дальнейшей формируются особые образования — сумки, или аски,
эволюции форм, а размножение спорами, возникшими внутри которых после митотического деления пост-
бесполым путем, способствует распространению и со- мейотических ядер формируются восемь эндогенных
хранению данной формы. гаплоидных аскоспор (рис. 25).
34 Глава 2
— Начало образования почки. G1 Cdc28
— Локализация и морфогенети-
ческие изменения в месте обра-
зования почки.
ФАЗА G1:
— Локализация актинового пят-
на секреторных элементов в ме-
сте возникновения почки.
— Начало образования веретена.
— Синтез белков РНК, образова-
ния кольца и микрофиламентов.
Cdc28
START
ФАЗА S: S Cln 1,2
— Рост почки (1/3 размера клет-
ки).
— Локализация SPA-2, актино-
вого пятна и секреторных вези-
кул в почке.
Cdc28
— SPB веретено в почке.
Clb 5,6
G2
ФАЗА G2:
— Увеличение размера почки до
2/3 размера материнской клетки.
— Начало ядерной миграции.
Cdc28
Clb 1,2
M
ФАЗА M:
— Миграция новых SPB в до- Cdc28
чернюю клетку.
— Конденсация хромасом.
— Локализация SPA-2 и актина
в новом месте.
— Образование перегородки.
— Цитокинез и отделение клетки.
Глава 2 35
оны и образуется дикариотический (состоящий из дву-
ядерных клеток) мицелий. Это наиболее длительная
стадия в цикле развития базидиальных грибов. Затем
на этом дикариотическом мицелии формируются осо-
бые клетки, базидии, в которых происходит слияние
ядер дикариона и мейотическое деление диплоидного
ядра, после чего на базидии формируются экзогенные
гаплоидные базидиоспоры (рис. 26).
36 Глава 2
мо комбинирующихся. В случае биполярного опре-
деления пола все гифы, выросшие из спор одного
плодового тела, распадаются на две группы, и при
соединении мицелиев из этих двух разных групп
происходит половой процесс. В случае тетрапо-
лярного определения пола гифы, выросшие из спор
одного плодового тела, распадаются на четыре по-
ловые группы. При этом группа I сливается только
с группой II, и группа III только с группой IV. Чис-
ленные соотношения этих групп для шляпочных
грибов (базидиомицетов), у которых тетраполяр-
ный гетероталлизм распространён очень широко,
соответствует отношению 1:1:1:1 (рис. 27).
Рис. 26. Типы базидий: 1 — холобазидия; 2-4 — гетеро- Рис. 27. Схема распределения пола у грибов.
базидии; 5 — телио- (фрагмо-) базидия [9].
У несовершенных (анаморфных) грибов половой
По характеру половой дифференцировки у гри- процесс отсутствует, и жизненный цикл эти грибы
бов различают гомоталличные (обоеполые) и гете- проводят в гаплоидном состоянии. В определённой
роталличные (раздельнополые) формы. У гомотал- степени отсутствие полового процесса в этой груп-
личных грибов к слиянию способны клетки одного пе компенсируется гетерокариозом и происходящим
и того же мицелия. На одном и том же мицелии на его основе парасексуальным процессом. Гетеро-
формируются и мужской и женский половые ор- кариоз, или разноядерность, — это наличие в клет-
ганы (например, оогонии и антеридии у оомикот). ках мицелия генетически разных ядер. Гетерокариоз
У гетероталличных грибов на мицелии, выросшем характерен для многих групп грибов и обеспечивает
из одной споры, половые органы не закладываются адаптацию грибов к изменяющимся условиям среды.
и, соответственно, зиготы не образуются. Они раз- В таком мицелии ядра иногда могут сливаться, образуя
виваются лишь при встрече двух мицелиев, отлича- диплоидное гетерозиготное ядро. Такое ядро делится
ющихся друг от друга по половому знаку (+ и -, или митотически, при этом происходит митотическая ре-
мужской и женский). Понятие гетероталлизма от- комбинация и затем вегетативная гаплоидизация этих
носится к гаплоидной стадии, так как определение диплоидных ядер путем потери ими части хромосом.
пола у грибов происходит в основном генотипиче- Этот сложный процесс, включающий в качестве суще-
ски. Гетероталлизм, или раздельнополость, у гри- ственнейшего момента митотическую рекомбинацию,
бов может быть двух типов: биполярный, когда пол получил название парасексуального процесса. Он
определяется одной парой аллелей, и тетраполяр- известен у разных групп грибов, и имеет особое значе-
ный, когда пол определяется двумя парами аллелей, ние для несовершенных грибов, лишённых настояще-
локализованных в разных хромосомах и независи- го полового процесса.
Глава 2 37
2.4 Особенности деления ядра Функциональная и морфологическая
дифференцировка таллома
Митоз и мейоз у грибов отличаются рядом спец- Таблица 5.
ифических особенностей. У большинства видов грибов Фаза цикла Функция Морфологическая
деление ядра происходит по закрытому типу, то есть развития структура
с сохранением ядерной оболочки. Центриоли имеются Вегетативная Прорастание Проростковые гифы,
почкующиеся клетки
лишь у псевдогрибов и некоторых грибов, имеющих
Разрастание Столоны, мицелий,
жгутиковые стадии, у остальных видов веретено де-
по субстрату ризоморфы, тяжи
ления формируется более просто устроенными белко-
Поселение Апрессории, гифоподии,
выми структурами — полярными тельцами веретена на хозяине инфекционные
(ПТВ). Фазы митоза чередуются быстро, а хромосомы и перфорационные
имеют небольшие размеры; в сочетании эти факторы гифы, гаустории, ловчие
затрудняют микроскопическое исследование, поэтому гифы
ранее считалось, что деление ядер у грибов происходит Перенесение Хламидоспоры,
неблагоприятных склероции
амитотически. Телофаза митоза происходит несинхрон- условий
но, в результате чего могут образовываться гетеропло- Репродукцион- Размножение Спорангиеносцы
идные дочерние ядра, то есть содержащие неравное ная бесполая и распространение (спорангиофоры),
число хромосом. Чаще всего при гетероплоидии на- спорангиеспоры,
блюдается различное число B-хромосом. Митоз и об- конидиеносцы
разование новых клеток (цитокинез) у мицелиальных (конидиофоры),
конидии, зооспоры
(не дрожжевых) грибов происходят независимо друг
Гаметы, гаметангии,
от друга — ядра перемещаются в дочернюю клетку оогонии, аскогонии,
уже после отделения её перегородкой (септой) от мате- антеридии, трихогины,
ринской (у грибов с неклеточным мицелием цитокинез ооспоры, зигоспоры,
вообще наблюдается редко, при регенерации повреж- аски (сумки), аскоспоры,
базидии, базидиоспоры,
дённых участков и при образовании репродуктивных плодовые тела
органов).
Репродукционное бесполое размножение проис-
2.5 Ультраструктура грибной клетки
ходит с помощью особых клеток — спор (рис. 22, 28),
образующихся без участия полового акта. Репродук- Клеточная стенка
ционное половое размножение включает обмен гене- Клеточная стенка (рис. 2, 29) обеспечивает меха-
тическим материалом при слиянии ядер (кариогамии) ническую прочность клетки, постоянство ее формы,
и редукционное деление (мейоз), связанные с образо- служит барьером проницаемости и защищает клетку
ванием определенных морфологических структур. от внешних воздействий. Характерная черта клеточ-
ной стенки — способность к росту и интенсивной пе-
рестройке в течение развития грибов (в их онтогенезе).
Компоненты клеточной стенки можно подразде-
лить на две группы: структурные компоненты (сеть
микрофибрилл) и соединения, заполняющие про-
странство между ними (матрикс). Первые представле-
ны полисахаридами, включающими полиаминосахара
(хитин и хитозан) и глюканами, имеющими β- (1, 3),
β- (1,4), β- (1, 6) связи. Вторые являются маннопро-
Рис. 28. Рисунок двух базидий (показаны красным цве- теинами, галактоманнопротеинами, глюкуронман-
том) с базидиоспорами (показаны зелёным) нопротеинами, ксиломаннопротеинами и α- (1, 3)
глюканами. У мицелиальных и дрожжевых грибов
Бесполые репродуктивные структуры называют имеются существенные различия в химическом со-
анаморфами, а половые — телеоморфами. Грибы, ставе и структуре клеточной стенки. Так содержание
имеющие половую стадию развития, называют совер- хитина составляет у мицелиальных грибов 0,2-26,2%
шенными. Грибы, в жизненном цикле которых отсут- от сухой массы клеточных стенок, а у дрожжевых
ствует половое размножение, называют несовершен- 1-4%. Помимо полисахаридов в клеточной стен-
ными, дейтеромицетами или митоспоровыми грибами. ке присутствуют белки и липиды. Некоторые белки
Анаморфы и телеоморфы строго приурочены являются ферментами. Липиды клеточной стенки
к определенной фазе жизненного цикла гриба, обра- определяют ее гидрофобность и принимают участие
зуются при наличии особых условий внешней среды в синтезе компонентов клеточной стенки, активируя
и выполняют дифференцированные функции (табл. 5). хитинсинтетазу.
38 Глава 2
У многих грибов, особенно дрожжевых, внешняя поверхности раздела в цитоплазме, на его мембранах
часть клеточной стенки образует капсулу — сильно могут располагаться рибосомы.
оводненный слизистый слой полисахаридной приро- Аппарат Гольджи представляет собой систему
ды. В капсуле локализованы многие ферменты, она вакуолек, он обеспечивает экскрецию (выведение)
принимает участие в поглощении питательных ве- по типу обратного пиноцитоза с помощью пузырьков,
ществ из субстрата, участвует в адгезии клеток между аккумулирующих выводимые продукты, и транспорт
собой и субстратом, защищает клетку от внешних воз- веществ, синтезированных в ЭР, к другим органоидам.
действий (высушивания, радиации и т. п.). Кроме того аппарат Гольджи — место синтеза новых
Различия в размере капсулы в одной и той же куль- мембран и образования лизосом.
туре связаны с возрастным и физиологическим состо- Лизосомы содержат около сотни ферментов, пре-
янием клеток. имущественно гидролаз, осуществляющих функцию
Органеллы грибной клетки пищеварения.
Органеллы грибной клетки характерны для боль- Вакуоли образуются из ЭР и выполняют многооб-
шинства эукариот. В ней имеется ядро, содержащее разные функции. В них могут накапливаться вредные
наследственную информацию в виде ДНК, оформ- продукты метаболизма, они участвуют в компартмен-
ленной в хромосомы. Ядро заполнено нуклеоплазмой, тализации веществ в клетке (их разделении и концен-
имеет ядрышко — место синтеза прорибосом, окруже- трации), в них накапливаются необходимые клетке ме-
но двойной оболочкой (ядерной мембраной). Ядерная таболиты (полифосфаты, аминокислоты, пуриновые
мембрана имеет поры, которые связывают нуклеоплаз- и пиримидиновые основания). Вакуоли обеспечивают
му с цитоплазмой. тургор клеток.
Новообразование мембран ЭР и Гольджи происхо-
дит на матрице ядерной мембраны. Цитоплазма содер-
жит включения, которые служат запасными питатель-
ными веществами: гликоген, волютин (полифосфат),
липиды.
Цитоскелет наряду с мембранными структурами
обеспечивает внутриклеточную организацию и высо-
кую биологическую упорядоченность всех метаболи-
ческих процессов, протекающих в клетке. Цитоскелет
представляет собой развитую сеть белковых нитей
(филаментов), из которых наиболее важная роль при-
надлежит микрофиламентам и микротрубочкам. Те
Рис. 29. Модель цитоскелета дрожжевой клетки [12]. и другие состоят из глобулярных белковых субъеди-
ниц, которые в клетке могут легко соединяться меж-
Митохондрии содержат ферменты дыхательной ду собой и разъединяться. Помимо этого существу-
цепи и окислительного фосфорилирования, а также ют вспомогательные белки, которые либо связывают
цикла трикарбоновых кислот, обеспечивая энергети- филаменты друг с другом или с другими клеточными
ческие потребности клетки. структурами, либо влияют на скорость и степень по-
Рибосомы 80 S — это органеллы синтеза белка. лимеризации филаментов. Цитоскелет связан с дви-
Часть рибосом располагается в цитоплазме беспоря- жением органоидов клетки и амебоидным движением,
дочно, однако большинство их прикреплено к мембра- присущим некоторым грибам.
нам эндоплазматического ретикулума, митохондриям Другие подвижные клетки грибов (зооспоры,
и другим органеллам. планогаметы) передвигаются с помощью жгутиков.
Одним из основных компонентов клеточных ор- Жгутики грибов по строению отличаются от жгути-
ганоидов являются мембраны. С ними связано боль- ков бактерий, но сходны с аналогичными органелла-
шинство метаболических процессов. Они составляют ми простейших и многих подвижных гамет растений
от 40 до 90% общей массы клеток. и животных.
Цитоплазматическая мембрана служит осмоти-
ческим барьером, в ней локализуется система актив- 2.6 Экологические группы грибов
ного транспорта, она способна к пиноцитозу и фаго-
цитозу. Грибы широко распространены в природе на са-
Эндоплазматический ретикулум (ЭР) распо- мых различных субстратах. Они предпочитают водные
ложен в цитоплазме в виде сети канальцев, цистерн или влажные местообитания, но встречаются и в отно-
и трубочек, не имеющих фиксированной ориента- сительно сухих средах. Грибы являются гетеротрофа-
ции, выполняет транспортную функцию, связывает ми, потребляют органические соединения углерода.
цитоплазматическую мембрану с ядерной, образует Азот, фосфор, сера, ионы металлов могут поглощаться
Глава 2 39
в неорганической форме. Питательные вещества гри- кислот и др. В табл. 6 приведены антибиотики и другие
бы получают, принимая участие в разложении органи- БАВ, выпускаемые промышленностью для медицины
ческого вещества или паразитируя на животных и рас- и сельского хозяйства; в табл. 7 — сведения о практи-
тениях. ческом применении ферментов грибов; в табл. 8 при-
Многие грибы переносят значительные изменения ведены органические кислоты, которые получаются
температуры, мезофильные грибы предпочтительно с помощью грибов. Некоторые дрожжевые грибы ис-
развиваются в пределах 24-30°С. Термофильные — пользуют для получения кормового белка на непище-
в диапазоне 33-55°С, психрофильные — от –2°С вом сырье. Многие грибы из класса базидиомицетов
до +20°С. Свет, особенно в коротковолновой области, (макромицеты, образующие крупные плодовые тела)
может влиять на спороношение грибов. обладают целебными свойствами, их культивируют
Экологические группы грибов сформировались поверхностным и глубинным (в ферментерах) спо-
в процессе эволюции. Сапротрофные грибы принима- собами и используют как лекарственные препараты
ют участие в минерализации органических веществ, и пищевые добавки (табл. 9).
образовании гумуса, ксилотрофные грибы разлагают
древесину, кератинофилы способны жить на волосах, 2.8 Грибы — возбудители болезней
перьях, рогах павших животных. Симбиотрофные гри- человека и животных
бы образуют микоризу, имеющую огромное значение
для жизни многих растений. Лишайники — это ста- Грибы могут наносить вред человеку и живот-
бильные симбиотические ассоциации гриба с водорос- ным путем отравления их метаболитами, вызывая со-
лями или цианобактериями. Грибы-паразиты растений стояние повышенной чувствительности к различным
и животных описаны ниже. веществам, входящим в состав их клеток или проду-
Грибы, как и другие организмы, способны суще- цируемыми ими (микогенная аллергия), и вызывая ин-
ствовать в относительно узком диапазоне температур, фекционные заболевания (микозы).
влажности, почвенных условий и других факторов Отравление может происходить при поедании
среды. Эти условия определяют их географическое ядовитых или испорченных грибов, при неправильном
распространение. Распространению популяций пре- приготовлении и хранении шляпочных грибов. Их ток-
пятствуют географические преграды (океаны, пусты- сины действуют на пищеварительную, нервную систе-
ни, горные цепи) и способствуют агенты, действую- мы и на другие ткани тела.
щие как средства переноса: воздух, вода, животные Другая группа заболеваний, вызванных отравле-
и человек. нием метаболитами грибов (микотоксикозы), связана
Для некоторых грибов характерна способность с тем, что токсинообразующие грибы заселяют рас-
находиться длительное время в неизменных и огра- тения, продуцируя при этом или во время хранения
ниченных зонах — эндемических областях (оча- урожая ядовитые вещества, действующие и после пе-
гах). К таким грибам относятся возбудители глубо- реработки растительных продуктов в корма или про-
ких микозов Coccidioides immitis и Paracoccidioides довольствие.
brasiliensis, которые встречаются в зонах с опреде- Микогенные аллергии возникают у чувстви-
ленными климатическими условиями (Центральная тельных людей в ответ на антигенные вещества гри-
Америка для первого гриба и Южная Америка для бов. Они проявляются в виде кожной сыпи, насмор-
второго). Дерматофиты Trichophyton soudanense об- ка, конъюктивита, диарреи, астматических явлений
наруживается только в Африке, а T. concentricum — и т. п. Аллергенами могут быть клетки мицелия, споры
в Южной Океании. Многие грибы, в том числе возбу- гриба и продукты их обмена или распада. Эти забо-
дители многих микозов человека и фитопатогенные левания могут возникать и развиваться у персонала
грибы, являются космополитами, их можно обнару- биотехнологических предприятий, использующих
жить в любой местности, где условия для них ока- грибы как продуценты БАВ, и у населения близлежа-
жутся благоприятными. щих районов за счет загрязнения воздуха при плохой
очистке заводских выбросов. Меры предупреждения
2.7 Использование грибов состоят в строгом соблюдении величины санитарной
в промышленности зоны у предприятия, техники безопасности (защитная
одежда, маски, респираторы, герметизация оборудова-
С древних времен человек использует дрожжи ния), тщательной очистки воздуха, контактировавшего
Saccharomyces cerevisiae для изготовления хлеба, пива, с микроорганизмами.
вина. Современная промышленная микробиология ис- Опасна также работа в складских помещениях, где
пользует грибы для получения разнообразных про- плесневые грибы могут развиваться при неправильном
дуктов: антибиотиков, алкалоидов, белков, витаминов, хранении сырья в условиях высокой влажности, обра-
гербицидов, ферментов, коферментов, ингибиторов зовании конденсата на поверхностях и т. д. Такие по-
ферментов, полисахаридов, липидов, органических мещения должны быть снабжены приточно-вытяжной
40 Глава 2
Биологически активные вещества грибов, выпускаемые промышленностью
Таблица 6.
Применение Вторичный метаболит Продуцент Действие
Медицина Пенициллины Penicillium chrysogenum Антибактериальное
Цефалоспорины Cephalosporium acremonium Антибактериальное
Гризеофульвин P. griseofulvum Антигрибное
Фузидин Fusidium coccineum Антибактериальное
Циклоспорин Trichoderma polysporum Иммунодепрессивное
Эргоалкалоиды Claviceps purpurea Нейротропное
Сельское хозяйство Зеараленон Gibberella zeae Стимулятор роста крупного рогатого скота
Гибберелины G. fujikuroi Регуляторы роста растений
Глава 2 41
Лечебные свойства базидиомицетов [13]
Таблица 9.
Вид гриба Биологически активные вещества
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Agaricus blasei *
A. bisporus + * *
Agrocybe aegerita + + + +
Armillariella mellea + * * *
Auricularia auricula-judae * * * *
Dendropolyporus umbellatus * * * * *
Flammulina velutipes + * * + *
Fomes fomentarius + +
Fomitopsis pinicola + + + +
Ganoderma lucidum * * * * * * * * * * * *
G. applanatum + + + +
Grifola frondosa + * * * * * * + +
Hericium erinaceus + * * *
Hypsizygus marmoreus *
Inonotus obliquus * * * * *
Laetiporus sulphureus + +
Lentinula edodes * * * * * * * * * * *
Lenzites betulina + +
Marasmius androsaceus * *
Oudemansiella mucida *
Piptoporus betulinus + + +
Pleurotus ostreatus + + + * *
P. pulmonarius + + +
Schizophillum commune * * * * *
Trametes versicolor * * * * *
Tremella fuciformis + + + + + + *
T. mesenterica + +
Volvariella volvacea + + + +
42 Глава 2
вентиляцией, а температуру необходимо поддерживать Микозы ног можно предупредить, соблюдая лич-
постоянной, чтобы предотвратить появление конден- ную гигиену. При работе в запыленных помещениях
сата. следует пользоваться респиратором.
Микозы человека. В последние десятилетия Предрасполагающим фактором к развитию кан-
наиболее часто встречаются оппортунистические дидоза является дисбактериоз и авитаминоз. Поэтому
микозы, возникающие при ослабленном иммуни- для его предупреждения используют препараты — эу-
тете и вызываемые условно-патогенными гриба- биотики, содержащие полезные молочнокислые бакте-
ми, которые встречаются среди представителей рии и витамины.
родов Penicillium, Aspergillus, Mucor, Alernaria, Методы терапии зависят от характера заболе-
Cladosporium, Fusarium, Candida, Geotrichum, вания. При поверхностных микозах используют
Saccharomyces, Rhodotorula, Sporobomyces, местные средства (производные имидазола, ундеци-
Trichosporon (табл. 10). Они могут входить в состав леновой кислоты, нитрофенола и др.). При диссеми-
нормальной микробиоты человека и животных и ак- нированных и генерализованных формах применяют
тивируют свои паразитарные свойства под влиянием антибиотики гризеофульвин, нистатин, амфотерицин
нерациональной антибиотической и кортикостеро- В и др.
идной терапии, при использовании иммунодепрес- Производные имидазола (амиказол, изоконазол,
сантов и при ослаблении реактивности организма кетоконазол, клотримазол, миконазол, сулькона-
в связи с предшествующим заболеванием. зол, тиоконазол, эконазол) и триазола (итраконазол,
Наряду с этим существуют и микозы, вызванные флуконазол) активны против мицелиальных грибов
патогенными грибами. К ним относятся дерматомико- и дрожжей. Их часто применяют для лечения канди-
зы и глубокие микозы (кокцидиоидоз, паракокцидио- дозов.
идоз, бластомикоз, гистоплазмоз). Всего патогенных При лечении микозов, вызванных видами Candida
грибов насчитывают около 100 видов, тогда как гри- и Cryptococcus, используют 5-фторцитозин, первона-
бов-оппортунистов — несколько сотен видов. чально предлагаемый как противоопухолевый препа-
В таблице 10 приведены наиболее важные воз- рат.
будители (этиологические агенты) микозов человека. Производные аллиламина (батрафен, ламизил)
Этиологический агент — либо один паразитический эффективны в отношении дерматофитов, Candida
вид, либо группа близких микроорганизмов. Клини- albicans, но применяются, в основном, при лечении
ческая картина микоза сильно варьирует в зависимо- онихомикоза (грибковое поражение ногтей).
сти от фонового заболевания, локализации очага или При диссеминированных и генерализованных
тяжести поражения. Например, аспергиллы могут вы- формах применяют противогрибковые антибиоти-
зывать поражение кожи, подкожных тканей, легких; ки, среди которых наибольшее распространение полу-
грибы рода Candida — слизистых оболочек рта и по- чили полиеновые (амфотерицин В, нистатин, пимари-
ловых органов, кожи, ногтей, бронхов, легких и других цин, леворин, фунгизон и др.) и гризеофульвин.
органов. Амфотерицин В эффективен при лечении за-
Большинство возбудителей микозов — космопо- болеваний, вызванных видами Candida, Aspergillus,
литы. Заражение может происходить контактным пу- Blastomyces, Coccidioides, Histoplasma. Другие полие-
тем, через одежду, обувь (дерматомикозы), от боль- новые антибиотики (нистатин, пимарицин) имеют ана-
ных животных (микроспория, трихофития). Микозы логичный амфотерицину В спектр действия, но они
стоп, от которых страдают примерно пятая часть на- более токсичны для млекопитающих.
селения Земли, передаются при хождении босыми Гризеофульвин является антибиотиком узкого
ногами в банях, бассейнах и т. п. Некоторые микозы спектра действия, он эффективен против дерматофи-
представляют собой раневые инфекции (мицетомы, тов, но не против дрожжевых грибов, в частности,
споротрихоз, хромиомикоз, лобомикоз). Большин- рода Candida. Гризеофульвин вмешивается в митоти-
ство глубоких микозов — респираторные инфекции ческий процесс при размножении грибов, воздействуя
(гистоплазмоз, бластомикоз, кокцидиоидоз, «плесне- на синтез белка микротрубочек веретена.
вые» микозы). Все эти средства применяются под контролем
Профилактика и терапия врача после установления диагноза заболевания. Диа-
Грибы, в том числе патогенные, окружают нас гностика заболевания требует установления его мико-
постоянно. Поэтому самый надежный способ профи- тической природы методами микроскопии, а если это
лактики — это здоровый образ жизни, способствую- возможно — выделения чистой культуры возбудителя.
щий укреплению иммунной системы, защищающей Полезными оказываются и иммунологические методы
человека от чужеродных агентов. Сюда относит- (серодиагностика, кожные пробы). Данные лаборатор-
ся правильное питание, занятие спортом, прогулки ных исследований должны соответствовать клиниче-
на свежем воздухе, отказ от вредных привычек (ку- ской картине заболевания, хотя симптомы микозов ча-
рение, алкоголь). сто бывают неспецифичными.
Глава 2 43
Микозы животных У грызунов выявлены системные заболевания
Домашние животные часто страдают от дерма- кокцидиоидозом, криптококкозом, гистоплазмозом
тофитии, вызываемой грибами родов Trichophyton и споротрихозом.
и Microsporum, которые способны передаваться человеку. Некоторые грибы поражают только живот-
Среди возбудителей генерализованных микозов наиболее ных и неизвестны у человека. Так Histoplasma
распространена Candida albicans, которая вызывает ощу- farciminosum вызывает глубокий микоз у лошадей,
тимые потери в животноводстве и птицеводстве, особен- мулов и ослов, а Pityrosporum pachydermatis — дер-
но среди молодняка. Развитию кандидоза способствует матомикоз у собак, коров, лошадей, свиней и носо-
применение антибиотиков в качестве профилактического рогов. Грибы рода Saprolegnia (Oomycetes) парази-
средства для предупреждения бактериальных инфекций. тируют на рыбах.
44 Глава 2
Глава 3. МИКРОФЛОРА РАСТИТЕЛЬНОГО
ЛЕКАРСТВЕННОГО СЫРЬЯ,
ФИТОПАТОГЕННЫЕ
МИКРООРГАНИЗМЫ
Медицинские растения содержат широкий спектр ется более 200 видов лекарственных растений. Микро-
микроорганизмов с различными отдельными свой- организмы поселяются и ведут активный образ жиз-
ствами и со значительными различиями относительно ни, как на поверхности, так и внутри зеленых частей
качественных аспектов [14]. В принципе, микробный растений, их корней, семян, плодов. Были собраны
груз растений — результат ряда влияний, вызванных микробиологические данные о лекарственных расте-
источниками живой и неживой природы, и микробны- ниях представленных: в табл. 12 — общее количество
ми загрязнителями легко передаваемыми через воздух аэробных мезофильных бактерий, в табл. 13 — энте-
и с почвой. Растения, как показано на рис. 30, имеют робактерий.
субстратную (корни) и надземную часть, что необхо-
димо учитывать при анализе их микробной обсеме-
ненности. Субстратная (почвенная) часть находится
в почве и непрерывно контактирует с почвенными
микроорганизмами (грибы, актиномицеты, бактерии),
вирусами и фагами, которые могут проникать в корни
или колонизировать поверхность корней. Надземная
часть растений постоянно контактирует с микроор-
ганизмами и они могут оседать с пылью и водными
каплями. Состав воздушной микрофлоры может пе-
риодически изменяться при изменении ветра, а так же
зависит от наличия промышленных предприятий. При
производстве лекарственных средств из растительно-
го сырья важную роль играет не только контроль ис-
ходных материалов, условий хранения и переработ-
ки, но и его происхождение (предыстория). Важными
факторами, влияющими на качество растительного
сырья, и соответственно, определяющими дальнейшее
качество и эффективность при применении, являются Рис. 30. Микробная обсемененность растений.
агрофитопоказатели (агрофон), выбор культуры, усло-
вия выращивания, сбора и сушки. Эти факторы могут Факторы, определяющие микробиологическое
оказать влияние на микробную обсемененность расте- качество растений.
ний. Таблица 11.
Свойства постоянства и неизменности микрофло- Внутренние факторы Внешние факторы
ры растений определены так же внешними факторами, Природа растения Климат
и природные барьеры (температура, влажность и т.д.)
которые происходят из-за естественных, сельскохозяй-
Структура растения Сбор урожая
ственных, экологических и технологических влияний
Состав растения Физическое состояние
(табл. 11). (антибактериальные
Микроорганизмы являются постоянными спутни- составы и агенты)
ками не только человека и животных, но и, в равной Внутриклеточные Технологическая обработка
степени, высших растений, в том числе используемых микробные загрязнения
в качестве лекарственного сырья. В России использу- Упаковка и условия хранения
Глава 3 45
Видовой состав микофлоры, выделенной из НЛС и сырья
Таблица 12.
Категория ЛС Виды грибов-контаминантов ЛС
1. Препараты из A. flavus, A. candidus, A. lanosum, A. flavipes, A. ventii, P. P. chermesium, P. herqei, P. wakzmanii,
сырья P. verruсosum, Rhodotorula sp., Pichia sp., Cryptococcus laurentii, Aureobasidium pullulans,
природного Alternaria consortiall, Mucor sp., M. strictus, M. racemosus, Rhizopus sp., Botrytis cinerea
происхождения
2. Лекарственное растительное сырье A. orysae, A. niger, A. fumigatus, A. candidus, A. chevalieri, A. ustus, A. flavus, P. roseo-purpureum,
P. verrucosum, P. meleagrinum, P. asperosporum, P. raciborskii, P. frequentans, P. steckii,
P. decumbens, P. diversum, Trichoderma sp., T. hamatum, Mucor sp., M racemosus, Al. consortial,
Rhizopus sp., Cladosporium transchelii
3. Вспомогательные материалы A. flavus, A. ochraceus, P. ochrochoron, P. verrucosum, P. frequentans, P. citrinum, P. asperosporum,
P. raciborskii, Al. alternata, Al. solani, Mucor sp., M. racemosus, M. abundans, M. hiemalis,
Rhizopus sp., Rh. nigricans, T. harzianum, Fusarium sp., Rhodotorula sp.,
Geotrichum sp., Acremonium charticola, Cladosporium cladosporioides
В этих таблицах перечислено большое количество нии фекального загрязнения. Вместе с группой коли-
растений с их соответствующими диапазонами жизне- формных бактерий, они могут служить индикатором
деятельности. Весьма очевидно, что явные различия плохих условий гигиены. О присутствии патогенных
в ОЧБ (табл. 13) отражают оригинальные и экологи- микроорганизмов на лекарственных растениях су-
ческие критерии, описанные выше. Например, относи- ществует относительно ограниченное число сообще-
тельно низко бактериальный рост найденный у неко- ний, но загрязнения патогенными микроорганизмами
торых растений (например, плоды Миртилли), может не могут быть исключены Недавно, Czech et al. и др.
произойти из-за естественных антибактериальных ве- [15] провел испытания на широкий спектр патогенов,
ществ, тогда как высокое микробное число (например, как индикатор микроорганизмов. Было показано, что
Herba urticae) может указать на менее благоприятные эти микроорганизмы обнаруживаются относительно
гигиенические условия. Кроме того, такие факторы редко, за исключениями Bacillus cereus и Clostridium
как расстояние растения от почвы и отношения между perfringens. В 1980-х Leimbeck [14] обнаружил E. coli
размером поверхности растения и весом образца мо- и Pseudomonas aeruginosa во многих образцах и по-
гут играть определенную роль. Хотя энтеробактерии этому предложил обрабатывать лекарства кипящей
присутствуют повсеместно в природе, наличие пред- водой для дезактивации микроорганизмов. В настоя-
ставителей этого семейства свидетельствует о попада- щее время показано, что при микробно-растительных
46 Глава 3
взаимодействиях существуют бактерии — стимулято- приблизительно 1400 трав и специй могут обладать
ры роста растений (plant growth-promoting bacteria — антибактериальными агентами различной химической
PGPB). Это, например, некоторые штаммы бакте- природы, такие как масла, пептиды, жидкие и органи-
рий рода Pseudomonas, которые защищают растения ческие извлечения.
от заморозков, предотвращая кристаллообразование Некоторые из этих биологических действий были
на надземных частях растения при кратковременном апробированы для определенного терапевтического
резком понижении температуры. Представители родов использования и внедрены в практическую медицину.
Bacillus, Agrobacterium и Pseudomonas являются «по- Кроме того, вполне ожидаемо, что некоторые антиок-
ставщиками» биоконтролирующих агентов [14]. сиданты, естественно присутствующие в растениях,
Бактерии вызывают свыше 200 болезней расте- могут ограничивать некоторые микробы.
ний. Большой ущерб причиняют бактериозы овощ- Микориза — наиболее широко распространен-
ным, плодовым и техническим культурам. Длина бак- ный тип растительно-микробного симбиоза (РМС),
териальной клетки составляет 0,5-4,1 мкм, диаметр который растения формируют с грибами, колонизиру-
от 0,3-0,8 мкм. Преобладающая форма грамотрица- ющими корни и другие подземные органы, и при кото-
тельных фитопатогенных бактерий палочковидная ром часть микобионта (грибного партнера) находится
(исключение Streptomyces, которые имеют нитчатое внутри растения, а другая часть — в почве. Разделение
строение). Большинство фитопатогенных бактерий микобионта на внутри- и внекорневую части отражает
подвижны за счет жгутиков [неподвижных форм не- его ключевую функцию посредника между растением
много]. У большинства подвижных фитопатогенных и почвой. В природных фитоценозах, где происходит
бактерий жгутики полярные, реже — перитрихиаль- жесткая конкуренция за почвенное питание, самосто-
ное их расположение. ятельное выживание растений сильно затруднено, что
Так как, широко распространенные лекарственные позволяет рассматривать зависимость большинства
растения, несут значительное количество грибов (пле- растений от микоризных грибов как экологически об-
сень) с микотоксинами, продукты, получаемые маце- лигатную. Эта функция имеет глобальное экологи-
рацией в холодной воде должны особенно тщательно ческое значение, так как лишь некоторые растения
контролироваться. Hitokoto и др. показали, что такие (например, эфемерные и водные формы) могут само-
формы, как Пеницилл, Aspergillus, Rhizopus, Mucor, стоятельно удовлетворять свои потребности в мине-
Cladosporium и Aureobasidium spp. могут часто обна- ральном питании и воде. При искусственной подаче
руживаться в ассоциации с лекарственными расти- полного минерального питания (например, в условиях
тельными препаратами, но продуцирующие микоток- гидропоники) большинство растений способно про-
син встречались лишь у 2%. Напротив, Kumar и Roy ходить полный цикл развития без микоризы. У орхид-
[16] обнаружили большие уровни риска афлатоксинов ных растений (Orchidaceae) эта зависимость является
в нескольких образцах лекарственных растений раз- еще более глубокой, так как они не могут проходить
личных таксонов. Учитывая эти результаты видно, что нормальное развитие без грибов, необходимых для
условия окружающей среды (климат, влажность, гиги- прорастания семян, эмбриогенеза и питания лишен-
ена и т. д.) в значительной степени способствуют при- ных хлорофилла проростков (Finlay, 2008).
сутствию микотоксинов. Будучи многоклеточными эукариотами, мико-
Хотя бактериальные эндоспоры и грибковые спо- ризные [14] грибы претерпевают специфичный для
ры могут быть расценены как две доминирующие симбиоза морфогенез и образуют структуры, которые
группы загрязнителей, связанных с лекарственными не развиваются без взаимодействия с хозяином. Осно-
растениями, на растении и внутри него может нахо- вываясь на строении внутрикорневой части микобион-
диться широкое разнообразие бактериальных, гриб- та, микоризные симбиозы разделяют на эндомикоризы
ковых клеток и вирусов. Среди этих микроорганизмов (гриб проникает в растительные клетки, внутри кото-
могут также присутствовать патогенные микроорга- рых образуются особые структуры, обеспечивающие
низмы, и этот факт особенно ограничивает использо- максимально тесные клеточные контакты партнеров)
вание этих растений, помимо снижения качества, вы- и эктомикоризы (распространение гриба в ограни-
званного порчей. Кроме того, по аналогии со специями ченом межклеточном пространстве). Универсальной
и травами, используемыми в пище, не может быть ис- формой эндомикоризы является арбускулярная мико-
ключен факт присутствия в некоторых препаратах за- риза (AM), формируемая подавляющим большинством
грязнений от грызунов, насекомых и неорганических (80-90% видов) наземных растений. Эктомикоризы
источников (например, камни). (ЭМ) ограничены деревянистыми и кустарниковыми
Определенные растения (например, аир, мелис- формами цветковых.
са, тимьян, базилик, сладкий укроп и т. д.) содержат Вклад растения-хозяина в построение структур
естественные барьеры и антибактериальные вещества, микоризы не так велик, как его вклад в построение
которые проявляют типичные ингибиторные эффекты клубеньков: он ограничен организацией тесных кле-
на микробный рост и стабильность. Считается, что точных контактов с микобионтами (AM), либо моди-
Глава 3 47
фикацией архитектуры корней (ЭМ). Наиболее выра- тения может нести на себе бактериальные клетки, их
женное симбиотическое развитие претерпевают корни эндоспоры или цисты, конидиоспоры и/или обрывки
орхидных, которые могут быть сильно редуцированы гиф актиномицетов, обрывки мицелия грибов и/или
или реорганизованы в структуры, лишенные ассими- их конидиоспоры, цисты простейших, а также, воз-
ляторной функции и специализированы для поддержа- можно, яйца нематод и вирусы. Численность разных
ния и питания микобионтов. групп микроорганизмов варьирует и зависит от мно-
Микроорганизмы, развивающиеся в норме на по- гих факторов — размера, формы, родовой и видовой
верхности растений, относятся к эпифитам (греч. принадлежности растения, наличия или отсутствия
Ері — над, phyton — растение). Они не наносят вреда, специфических покровов, местообитания растения,
являются антагонистами некоторых фитопатогенных т. е. географических и климатических факторов и др.
микроорганизмов, растут за счет обычных выделе- Обилие и разнообразие микроорганизмов, колонизи-
ний растений и органических загрязнений поверхно- рующих поверхность семени, в существенной степени
сти растений. Эпифитная микрофлора препятствует определяются и биологией самих микроорганизмов.
проникновению фитопатогенных микроорганизмов Важную роль в контаминации поверхности семян,
в растительные ткани, усиливая тем самым имму- способности удерживаться на их поверхности играют
нитет растений. Наибольшее количество эпифитной такие характеристики микроорганизмов, как размеры
микрофлоры составляют грамотрицательные бакте- и морфология, структура поверхности клетки, способ-
рии Erwinia herbicola, образующие на мясопептон- ность к длительному выживанию в условиях низкой
ном агаре золотисто-желтые колонии. Эти бактерии влажности (обезвоживании), при воздействии света
являются антагонистами возбудителя мягкой гнили и т. д. В связи с этим фактически невозможно предска-
овощей. Обнаруживают в норме и другие бактерии — зать, сколько на поверхности здорового семени может
Pseudomonas fluorescens, реже Bacillus mesentericus быть бактерий, тем более грибов.
и небольшое количество грибов. На поверхности и в покровах, а в некоторых слу-
Болезни, вызываемые бактериями, называют бакте- чаях и в тканях разных семян можно обнаружить
риозами. Среди возбудителей бактериозов встречаются бактерии, принадлежащие к родам Agrobacterium,
псевдомонады, микобактерии, эрвинии, коринебакте- Arthrobacter, Bacillus, Burkholderia, Clavibacter,
рии, агробактерии и др. К бактериозам относятся различ- Clostridium, Curtobacterium, Erwinia, Pseudomonas,
ные виды гнилей, некрозы тканей, увядание растений, Rhizobacter, Rhizomonas, Streptomyces, Xanthomonas
развитие опухолей и др. Различают общие и местные и др.;
бактериозы. Общие бактериозы вызывают гибель всего грибы родов: Acremonium, Alternaria,
растения или его отдельных частей. Они могут прояв- Aureobasidium, Aspergillus, Botrytis, Cephalosporidium,
ляться на корнях (корневые гнили) или в сосудистой си- Cfaviceps, Drechslera, Fusarium, Gibberella,
стеме растений. Местные бактериозы ограничиваются Helminthosporium, Humicola, Penicillium, Perenospora,
поражением отдельных участков растений, проявляясь Phoma, Phytophthora, Plasmopara, Puccinia, Pythium,
на паренхимных тканях. Род Erwinia включает виды, Rhizoctonia, Septoria, Trichothecium, Ustilago,
вызывающие болезни типа ожога, увядания, мокрой Verticillium и др. Среди перечисленных родов бактерий
или водянистой гнили, например E. amylovora — воз- и грибов много истинных фитопатогенов.
будитель ожога яблонь и груш, Е. carotovora — возбуди- В семенах растений, даже находящихся в состоя-
тель мокрой бактериальной гнили. К роду Pseudomonas нии глубокого покоя, протекают процессы метаболиз-
относят различные виды, в частности, вызывающие ма и, следовательно, происходят обменные процес-
бактериальную пятнистость (P. syringae и др.), при этом сы с окружающей средой. Многие семена растений
на листьях образуются пятна разной окраски и разме- обладают специфическим, характерным для соот-
ров в зависимости от видов растений. ветствующего вида запахом за счет синтеза летучих
органических веществ. Эти вещества являются потен-
3.1 Микробно-растительные циальными субстратами для микроорганизмов. Есте-
взаимодействия при росте и развитии ственно, что микроорганизмы — обитатели поверхно-
растений сти семян и растений в меньшей или большей степени,
но постоянно ощущают на себе воздействия этих об-
В качестве точки отсчета взаимодействия микро- менных процессов.
организмов и растений логично избрать прорастание При попадании в благоприятные условия влажно-
семени в почве. Однако семена растений, попадающие сти и температуры семя растения набухает и прорас-
в почву, уже заселены микроорганизмами, т. е. ми- тает (рис. 31). При набухании, а тем более прорастании
кробно-растительные отношения начинаются гораздо в семени происходят соответствующие молекулярно-
раньше. Довольно часто, и особенно это характерно генетические и физиолого-биохимические процессы.
для фитопатогенов, микроорганизмы уже находятся Те же факторы — влажность и температура — ока-
внутри созревшего семени. Потенциально семя рас- зывают соответствующее действие и на микроорга-
48 Глава 3
низмы, находящиеся на поверхности семени. Однако для микробиологии особый интерес представляет ее ор-
основное действие на микробное сообщество поверх- ганическое вещество — гумус, состоящий из остатков
ности семян оказывает «выброс» органических ве- животных и растительных организмов и обитающих
ществ из набухающего и прорастающего семени. в почве микробов. Поверхностный слой почвы беднее
Концентрация и состав таких веществ каждого вида микробами, так как на них вредно воздействуют фак-
специфичны. Например, при прорастании семян пше- торы внешней среды: высушивание, ультрафиолетовые
ницы обнаруживаются углеводы (главным образом, лучи, солнечный свет, повышенная температура и др.
глюкоза и фруктоза, а в целом — до 10 компонентов), Наибольшее количество микроорганизмов находится
органические кислоты (в большинстве своем — сук- на глубине 5-15 см, меньше их на глубине 20-30 и еще
цинат, фумарат и малат) и до 16 аминокислот, среди меньше на глубине 30-40 см. Наиболее богаты микро-
которых доминируют аспарагиновая и глутаминовая. флорой возделываемые (культурные) почвы; бедны —
Помимо нелетучих веществ, как при прорастании песчаные, горные, а также почвы, лишенные раститель-
семени, так и активации метаболизма поверхностных ности; содержание их в почве увеличивается с севера
микроорганизмов имеет место «выброс» и летучих ор- на юг.
ганических веществ (ЛОВ). Взаимовлияния веществ К типичным почвенным бактериям относятся Вас.
на макро- и микроорганизмы в настоящее время актив- subtilis, Вас. mycoides, Вас. mesentericus, Вас. megatherium,
но исследуются. Cl. tetani, Cl. perfringens, Cl. oedomaticus, Cl. histolyticus,
Cl. botulinum, Cl. chauvoeij а также термофильные, пиг-
ментные, непигментные и другие микроорганизмы, со-
ставляющие иногда 80-90% всей микрофлоры почвы.
Пространство и почву, окружающие формирующийся
корень, называют ризосферой. Считается, что первое
определение понятия ризосферы было дано Хилтнером
в 1904 г. В настоящее время под ризосферой понимают
пространство вокруг корня от 0 до 2-8 мм в диаметре,
в котором имеет место более обильное развитие микро-
организмов из-за стимулирования их роста корневыми
экссудатами (выделениями), а в более широком смыс-
ле — корневыми депозитами. Пространство ризосферы
иногда называют еще эндоризосферой, включая в это по-
нятие и ткани самого корня в противовес ризоплане, под
которой подразумевают только то, что находится непо-
средственно на поверхности корня и прикреплено к кор-
ню. Корневые экссудаты представляют собой низкомоле-
кулярные органические вещества, продукты фотосинтеза
Рис. 31. Прорастающее и развивающееся из семени и метаболизма растения. К ним относятся сахара, органи-
в почве растение [21]. ческие кислоты и аминокислоты, спирты, гормоны, вита-
мины и др. Эти вещества «утекают» из зоны вблизи кон-
Прорастающее и развивающееся из семени в почве чика корня, точнее зоны «растяжения» корня в процессе
растение (рис. 31) сталкивается с различными микроско- его роста и развития. Корневые ризодепозиты — более
пическими биологическими объектами: микроскопиче- широкое понятие. Они включают не только экссудаты,
скими животными, простейшими, грибами, бактериями но и все другие вещества — высокополимерные слизи
и вирусами. Будущее растение контактирует с этими полисахаридной и белковой природы, ферменты, отми-
объектами как формирующейся корневой системой, так рающие и слущивающиеся поверхностные клетки с их
и будущей надпочвенной частью — стеблем, пока про- содержимым, куски тканей, в частности кортекс верхних
ростком. Корень контактирует с неспецифическими для стареющих участков корня, корневой чехлик, корневые
него микроорганизмами, т. е. такими, контакт с которы- волоски, летучие органические вещества и др. Считают,
ми не приводит к его инфицированию, и со специфи- что в виде ризодепозитов растение теряет более 30-40%
ческими, инфицирующими корень микроорганизмами. продуктов фотосинтеза.
Среди инфицирующих имеются непатогенные и типич- Помимо химического воздействия на почву и на-
ные патогены. К непатогенным относятся, например, ходящихся в ней микроорганизмов, в том числе через
клубеньковые бактерии, а из грибов — микоризные, изменение pH и Eh имеет место и чисто механическое
эндо- и эктомикоризные. Однако имеется и другая точка воздействие растущего корня на окружающую его эко-
зрения, когда взаимодействие с растениями упомянутых нишу. Феномен более высокой плотности микроорга-
бактерий и грибов в более широком контексте рассма- низмов вокруг корня за счет потребления экссудатов
тривается как патогенез. Из структурных частей почвы и ризодепозитов называется ризосферным эффектом.
Глава 3 49
В сравнительных экспериментах с выращиванием сте- ди поверхности или на грамм, чем растения влажных
рильных растений в стерильной и нестерильной почве тропических лесов.
показано, что в ризосфере микробно-растительные Как упоминалось выше, возле корней растений в по-
взаимодействия выражаются, в частности, и в стиму- чве находится большое количество ризосферных микро-
ляции экссудирования растений. Численность микро- организмов. Здесь встречаются псевдомонады, микобак-
организмов в ризосфере может превышать их числен- терии (неспорообразующие палочки), актиномицеты,
ность в окружающей почве от нескольких процентов а также спорообразующие бактерии и грибы. Эти микро-
до десятков процентов и даже на порядок. организмы переводят различные сложные вещества в со-
Общую численность микроорганизмов в ризос- единения, доступные для растений, синтезируют биоло-
фере назвать очень трудно. Она зависит от типа по- гически активные соединения (витамины, антибиотики
чвы, растения и других факторов и может колебаться и др.), вступают в симбиотические взаимоотношения
от миллионов до сотен миллиардов клеток на грамм с растениями, обладают антагонистическими свойства-
сухой почвы. ми по отношению к фитопатогенным микробам. Состав
Оказалось, что пространственно-временная орга- ризосферы специфичен для каждого вида растений. Рас-
низация микробного сообщества ризосферы не просто тения культурных почв в большей степени загрязнены
отражает зоны экссудации корня, а имеет свою спец- микроорганизмами, чем растения лугов и лесов. Осо-
ифическую структуру. Микробное сообщество раз- бенно много микробов содержится в нижней части рас-
вивается вдоль растущего корня волнообразно, т. е. тений, что связано с их попаданием из почвы. В большом
зоны с более высокой плотностью микроорганизмов количестве обнаруживаются микроорганизмы на расте-
чередуются с зонами низкой плотности. При этом ниях, растущих на свалках, вблизи навоза, в местах выпа-
пики разной плотности микроорганизмов смещаются са скота. При этом на растениях могут быть обнаружены
во времени вдоль корня и, следовательно, можно го- и патогенные микроорганизмы.
ворить о форме «движущейся волны» развивающегося Микробная обсеменённость растительного лекар-
микробного сообщества ризосферы. Волнообразное ственного сырья зависит от исходной загрязненности,
развитие микробных популяций наблюдали и в ризо- но может повышаться на этапах первичной обработ-
плане, и в перпендикулярном корню направлении, т. е. ки, измельчения, приведения в стандартное состояние.
явление волнообразного роста микроорганизмов в ри- Порча сырья происходит в основном при повышенной
зосфере представляет собой всеобщую форму разви- влажности, способствующей размножению гнилостных
тия микробного сообщества ризосферы. микроорганизмов. Наиболее обильно микроорганизмы
Пространство, окружающее надпочвенную по- представлены в почве, особенно в прикорневой зоне.
верхность растения, включая ткани этого растения, В её состав входят различные микобактерии, псевдомо-
называют филлосферой, а поверхность растения — нады, спорообразующие, азотфиксирующие и нитри-
филлопланой. Микроорганизмы, колонизирующие фицирующие бактерии, актиномицеты и грибы. Вокруг
надземные поверхности растений, называют эпи- корней растений находится зона интенсивного роста
фитными микроорганизмами (от греч. epi — вокруг; и повышенной активности микробов. Поверхность кор-
phytos — растение). Количество эпифитных микроор- невой системы колонизируют преимущественно псев-
ганизмов, обнаруживаемых на поверхности листьев, домонады и грибы. Последние вступают в симбиоти-
иногда может достигать 10 8 клеток на грамм свежих ческие отношения с растениями и образуют микоризу
листьев, или 10 6 на 1 см 2, что вполне сопоставимо (грибокорень), стимулирующую рост обоих партнёров.
с численностью микроорганизмов в грамме почвы.
Численность и разнообразие микроорганизмов, на- 3.2 Фитопатогенные грибы
пример тех же бактерий, существенно зависят от вида
растения и его местообитания, климата, погодных ус- К фитопатогенным микроорганизмам относят бак-
ловий и некоторых других обстоятельств. Некоторые терии, вирусы и грибы. Фитопатогенные грибы вызы-
из них уже были упомянуты при обсуждении наличия вают микофитозы [20].
микроорганизмов на семенах растений. Это опять же Грибы, вызывающие заболевания лесных пород
сапротрофные и фитопатогенные представители ро- и культурных растений, наносят огромный ущерб.
дов Pseudomonas (Р. syringae, P. fluores- cens и др.), Массовые заболевания растений (эпифитотии) могут
Erwinia (Е. carotovora, Е. amylovora), Xanthomonas быть причиной голода населения целых стран. Болез-
(X. сатpestris), Agrobacterium (A. tumefaciens), родов ни снижают потенциальный урожай на 10—20% и бо-
Beijerinckia, Enterobacter, Klebsiella, Methylobacterium лее. В Центральной Европе насчитывают до 162 се-
и многих других. Имеются различия в микробном рьезных заболеваний сельскохозяйственных культур.
сообществе верхней стороны листа и нижней. Суще- Из них 135 (83%) вызываются грибами, остальные —
ственную роль в этом играют свет и температура. Есте- бактериями и вирусами. Поражая лекарственные рас-
ственно, что растения пустынь, суккуленты, содержат тения, грибы, как и другие микроорганизмы, делают
гораздо меньше микроорганизмов на единицу площа- их непригодными для использования в качестве сырья
50 Глава 3
в фармацевтической промышленности (описание фи- фитопатогенными бактериями называют бактериоза-
топатогенных грибов и бактерий приводятся в главе 3). ми. По локализации процесса выделяют общие и мест-
Паразитические грибы подразделяют на экто- ные поражения. Первые вызывают гибель всего рас-
и эндопаразиты. Эктопаразиты распространяются пре- тения или отдельных его частей, вторые — отдельных
имущественно по листьям, внедряясь в клетки хозяина участков растения. По механизму поражения бактери-
только специализированными органами (например, га- озы разделяют на паренхиматозные заболевания, сосу-
усториями), и спороносят на его поверхности. К ним дистые поражения и опухоли.
относятся возбудители мучнистой росы злаков, тык- Паренхиматозные заболевания развиваются при
венных, табака, картофеля. Эндопаразиты развивают попадании бактерий в ткани растений через различ-
свой таллом внутри хозяина, при спороношении они ные анатомические отверстия (устьица, чечевички,
выходят наружу. нектарники) и повреждения покровных тканей. Возбу-
В зависимости от типа взаимоотношения гриба дители выделяют ферменты и токсины, облегчающие
и растения-хозяина различают облигатные и факуль- их распространение по межклеточным пространствам.
тативные паразиты. Первые поражают только живые Проникновение бактерий вглубь вызывает массовую
ткани и не растут на обычных питательных средах. гибель клеток. К ним относят гнили (основные воз-
К таким грибам относятся важнейшие для экономики будители — бактерии родов Pseudomonas и Erwinia),
фитопатогенные грибы, например Puccinia graminias ожоги (основные возбудители — виды Erwinia
(черная ржавчина злаков) и Peronospora tabacina (лож- и Corynebacterium) и пятнистости (основные возбуди-
ная мучнистая роса табака). тели — виды Pseudomonas и Xanthomonas).
Факультативные паразиты также поражают живые Сосудистые поражения развиваются при распро-
ткани растения, но после его отмирания не погибают, странении бактерий по сосудам растений. Основные
они могут расти на лабораторных питательных средах. возбудители — виды Corynebacterium (C. fascians,
К ним относятся многочисленные грибы, разрушаю- С. insidiosum, С. michiganense). Бактерии размножают-
щие древесину. Они вызывают практический интерес ся в сосудах, вызывая их закупорку за счёт поврежде-
в связи с проблемой утилизации отходов сельского ния стенок, что приводит к увяданию растения.
и лесного хозяйства. Микробы, обитающие на лекарственном расти-
Фитопатогенные грибы различаются по специфич- тельном сырье могут включать представителей нор-
ности выбора растения-хозяина. Например, среди воз- мальной эпифитной и фитопатогенной микрофлоры.
будителей мучнистой росы Erisiphales имеются как Состав нормальной микрофлоры растений зависит
виды, поражающие только определенные расы хозя- от вида, возраста растений, типа почвы, температу-
ина, так и грибы, которые поражают растения из раз- ры, влажности окружающей среды, от других условий
ных порядков. Ржавчинные грибы Puccinia graminis произрастания, от времени проверки растений, их вы-
в гаплофазе развивается на барбарисе, а в дикариоти- соты и целостности. В норме на поверхности живых
ческой — на злаках. Некоторые паразитические грибы растений (на листьях, стеблях, плодах, семенах) оби-
предпочитают отдельные органы растений. Например, тают микроорганизмы (эпифитная микрофлора). Они
пурпурная спорынья Claviceps purpurea инфицирует питаются выделениями растений и органическими
только завязи злаков, Ustilago violacea (возбудитель го- загрязнениями на поверхности растений. Эпифитная
ловни злаков) — только тычинки. Грибы рода Verticillium микрофлора не наносит вреда и препятствует проник-
развиваются в сосудах растения, нарушая движение со- новению фитопатогенных микробов в растительные
ков, что приводит к его увяданию и гибели. ткани (антагонистическое действие). К эпифитной
Гриб проникает в ткань растения через устьица микрофлоре относятся: Г– бактерии Erwinia herbicola
или через раны на его поверхности; они способны про- (на МПА образует золотисто-желтые колонии), грам«-
рывать поверхностные структуры своими инфекцион- » полиморфная палочка Pseudomonas fluorescens
ными гифами. Далее гриб распространяется по расте- (на МПА — прозрачные колонии с флюоресценцией),
нию, что сопровождается появлением симптомов его Бактерии образуют зелёный пигмент пиовердин, вы-
заболевания. На следующей стадии инфекционного зывающий флуоресценцию колоний при коротковол-
процесса гриб развивает органы спороношения, а ре- новом УФ-облучении. Пиовердин обладает свойством
акция растения зависит от количества и качества воз- бактериоцина, действующего на грамположительные
будителя заболевания. и грамотрицательные бактерии, а также проявляет
умеренную фунгицидную активность. К эпифитной
3.3 Бактерии — возбудители болезней микрофлоре относятся Г+ спорообразующие бакте-
растений рии — Bacillus mesentericus, Bacillus vulgatus, бесспо-
ровые бактерии — Bacterium putidam, E. сoli, а также
Способностью вызывать болезни растений обла- небольшое количество грибов. Осенью на листьях
дают различные вирусы, бактерии и грибы (фитопато- обнаруживается больше микробов, чем ранней вес-
генная микрофлора) [15, 20]. Поражения, вызываемые ной. При повышении влажности воздуха повышается
Глава 3 51
количество микробов на поверхности растений (эпи- водящим пучкам и прилегающим к ним тканям. При
фитные микрофлора). На поврежденных растениях на- этом нарушается процесс поступления в растение
капливается большое количество пыли, а, следователь- воды, и оно увядает. Увядание — основной симптом
но, и микроорганизмов. системных бактериозов. Симптомы некоторых бакте-
Поверхность некоторых фитопатогенных бакте- риозов представлены на рис. 32. Под увяданием по-
рий покрыта слизистым слоем — капсулой. Она имеет нимают патологические изменения тканей отдельных
большое значение для выживания бактерий в небла- органов или всего растения, связанные с потерей ими
гоприятных условиях: они становятся устойчивыми тургора. По мере размножения бактерий сначала заку-
к действию солнечных лучей, химических веществ пориваются сосудистые пучки отдельных органов, а за-
и других факторов. Во влажную погоду бактериальные тем — всего растения, и растение увядает. Например,
клетки накапливаются на поверхности пораженных бактериальное увядание томата сначала проявляется
органов в виде скопления слизи — экссудата. По ха- лишь на отдельных листьях, позже — на некоторых
рактеру питания фитопатогенные бактерии — гете- побегах, и, наконец, растение увядает полностью под
ротрофы, способные расти на питательных средах. воздействием возбудителя этой болезни — Clavibacter
На твердых питательных средах бактерии образуют michiganensis subsр. michiganensis.
колонии, окраска, форма, поверхность которых типич- Бактериальные болезни растений — болезни рас-
на для данного штамма. тений, вызываемые бактериями Pseudomonas, Erwinia.
Фитопатогенные бактерии относят к тем же родам Причиняют большой вред многим видам растений.
и видам, что и сапротрофные формы. Поражения могут быть общими, вызывающими гибель
Симптомы заболевания и типы бактериозов всего растения или отдельных его частей, проявляться
По воздействию бактерий на растение и степени на корнях (корневые гнили), в сосудистой системе (со-
поражения тканей бактериозы делят на два типа: диф- судистые болезни); местными, ограничивающимися
фузные или системные, и местные или локальные. заболеванием отдельных частей или органов растения,
а также проявляться на паренхимных тканях (парен-
химатозные болезни — гнили, пятнистости, ожоги);
а могут носить смешанный характер. Особое место за-
нимают бактериозы, связанные с появлением новооб-
разований (опухолей).
52 Глава 3
вить развитие болезни. Как отмечалось ранее бактерии также и зеленые растения, в которых бактерии хорошо
проникают в растения через различные повреждения сохраняются и переносятся в новые районы страны
и естественные ходы; например, возбудители различ- вместе с зараженными растениями (черенки, окули-
ных пятнистостей — через устьица листьев, ожога ровочные материалы — глазки). Одним из основных
плодовых деревьев — через нектарники цветков, со- источников заражения бактериозами являются остат-
судистых бактериозов крестоцветных — через водяные ки больных растений. Особенно долго и хорошо фи-
поры в листьях. Развитию бактериоза способствуют топатогенные бактерии сохраняются в деревянистых
кроме повышенной влажности и температуры воздуха частях растений.
наличие на растениях капелек воды, а также недостаток Почва как источник инфекции не представляет
фосфора и калия, высокий рН почвы. большой опасности. Многочисленные исследования
показали, что фитопатогенные бактерии, попадая в по-
3.4 Бактериальная пятнистость, чву, быстро погибают под воздействием микробов-ан-
бактериальный ожог, сосудистый тагонистов (происходит как бы самоочищение почвы).
бактериоз Некоторые виды насекомых также могут являть-
ся источником первичной инфекции. Большую опас-
Болезнь чаще поражает молодые листья и побеги. ность в распространении бактериозов представляют
Бактериальные пятнистости в зависимости от вида па- капельки дождя с мелкими частицами остатков боль-
тогена имеют различные симптомы. Наиболее харак- ных растений, которые ветром и воздушными тече-
терная картина, когда на поверхности листа или стебля ниями разносятся на далекие расстояния (воздух сам
сначала образуются мелкие водянистые пятна, кото- по себе не играет роли в непосредственной передаче
рые постепенно приобретают чёрный цвет. Чаще всего заболеваний). Переносить фитопатогенные бактерии
пятна имеют неправильно-угловатую форму, и огра- может также и вода — поливная, вода рек и других
ничены желтой или светло-зеленой каймой. Бактерия источников. И наконец, в природе в распространении
распространяется чаще всего вдоль жилок. Пятна ра- бактериозов немаловажную роль играют нематоды.
стут, сливаются, чернеет весь лист. В конечном итоге Местные бактериозы проявляются в поражении
растение погибает. паренхимной ткани отдельных органов растений. Ос-
Оптимальные условия для развития бактерий — новные их симптомы — это некрозы, хлорозы, гни-
это температура 25-30°C и высокая влажность возду- ли и опухоли. Местный тип гнили наблюдается, на-
ха. Гибель бактерий наступает только при температуре пример, при поражении плодов абрикоса (побурение
выше 56°C. Бактерии рода Xanthomonas устойчивы плодов). Гниль локализуется около косточки плода;
к высушиванию и долгое время может переносить по- болезнь вызывается почвенной спорообразующей бак-
ниженную температуру. терией Bacillus mesentericus (рис. 33).
Вариантом бактериальной пятнистости является
так называемые бактериальный ожог, который вызыва-
ют бактерии рода Pseudomonas. В этом случае на расте-
ния появляются не пятна, а довольно большие бесфор-
менные области почернения, которые затем усыхают.
Выглядит так, как будто этот участок листа подгорел.
Если болезни сопутствуют благоприятные условия,
то развивается она, очень быстро вызывая отмирание
отдельных частей и гибель всего растения. Начинается
бактериальный ожог чаще с молодых листьев, побегов
и цветков. Бактерии проникают в растения через устьи-
ца или ранки, начинают размножаться в межклетниках Рис. 33. Местный бактериоз.
паренхимы листьев. Инкубационный период развития
заболевания 3-6 дней в зависимости от температуры. Для некоторых бактериозов характерно появление
Бактерии сохраняются в почве и на семенах. бактериального экссудата. Его выделяют возбудители:
Источник бактериального ожога плодовых (Erwinia amylovora),
Одним из важнейших источников заражения яв- угловатой пятнистости огурца (Ps. syringae pv.
ляются семена. При прорастании семян они могут за- lachrymans), бактериоза фасоли (Х. phaseoli) и другие
ражать всходы, а затем по проводящим сосудам пере- бактерии преимущественно при высокой влажности
двигаться в растения и заражать взрослые растения воздуха.
в период вегетации. Кроме того, больные семена мо- Меры борьбы и профилактики [16]
гут служить источником распространения инфекции, Некоторые болезни передаются семенами, по-
причиной появления бактериозов в таких районах, где этому важным мероприятием оказывается обеззара-
раньше их не было. Инфекцию могут распространять живание семян. Одним из источников инфекции яв-
Глава 3 53
ляются опавшие на поверхность почвы пораженные заболеваний). Переносить фитопатогенные бактерии
растительные остатки. Поэтому эффективна глубокая может также и вода — поливная, вода рек и других
зяблевая вспашка, способствующая перемещению источников. И наконец, в природе в распространении
паразитов вглубь почвы, где они погибают под анта- бактериозов немаловажную роль играют нематоды.
гонистическим воздействием бактерий и актиномице-
тов или поедаются простейшими животными. Важное 3.5 Микоплазмы (фитоплазмы)
значение имеет сбор и уничтожение опавших листьев,
плодов, ветвей, правильный севооборот, препятствую- Фитоплазмы относят к прокариотам, т. е. организ-
щий накоплению в почве заразного начала. мы, не имеющие настоящего ядра. Ядерный аппарат
Широко используются меры химической защиты у этих организмов называют обычно нуклеотидом.
растений. Большое значение имеет правильная обра- Микоплазмы давно известны в качестве возбуди-
ботка почвы и внесение удобрений, что повышает со- телей болезней человека и животных. Микоплазмы
противляемость культурных растений. Весьма важны (фитоплазмы) — возбудители болезней растений от-
выведение и подбор устойчивых к заболеваниям со- крыты лишь в 1967 г. Их обнаружили японские ученые
ртов, интересны также сверхчувствительные сорта, бы- при помощи электронного микроскопа во флоэме рас-
страя гибель которых ведет к прекращению развития тений шелковицы, пораженных карликовостью. Эти
паразитического гриба. Для предупреждения переноса микоплазмоподобные организмы (МПО) оказались
возбудителей из одной страны в другую существуют фитопатогенными. Было установлено, что они переда-
специальные карантинные службы, осуществляющие ются от растения к растению цикадками, листоблош-
специальные мероприятия. ками (ксиллидами) и повиликой и вызывают болезни,
Растение можно спасти, если бактериоз еще не по- подобные «ведьминым метлам» и желтухам (рис. 34).
разил всю сосудистую систему или носит местный ха- По свойствам МПО напоминали организмы, входящие
рактер (например, гниль началась с кончика листа). в группу микоплазм. Однако в отличие от микоплазм
Если сгнили корни, то еще можно попробовать укоре- животных, обнаруживаемых обычно вне клеток, фито-
нить верхушку (если данное растение укореняется че- плазмы были выявлены внутри клеток.
ренками). Если гниение поразило только часть корней,
а надземная часть выглядит живой, можно попытаться а б
спасти растение — для этого нужно освободить кор-
ни от земли, срезать все гнилые, пересадить в сухую
подготовленную почву, полить и опрыскать бордоской
жидкостью (или медьсодержащими препаратами). За-
раза не перекинется на другое растение стоящее ря-
дом, но весь рабочий инструмент и горшки необходи-
мо тщательно дезинфицировать.
При прорастании семян они могут заражать всхо-
ды, а затем по проводящим сосудам передвигаться
в растения и заражать взрослые растения в период ве-
гетации. Кроме того, больные семена могут служить
источником распространения инфекции, причиной
в
появления бактериозов в таких районах, где раньше
их не было. Инфекцию могут распространять также Рис. 34. Симптомы фитоплазмозов: а — столбур то-
и зеленые растения, в которых бактерии хорошо сохра- мата; б — «ведьмины метлы» картофеля; в —
няются и переносятся в новые районы страны вместе позеленение цветков (филлоидия) клевера.
с зараженными растениями (черенки, окулировочные
материалы — глазки). Одним из основных источников Фитоплазмы — специфическая группа фитопа-
заражения бактериозами являются остатки больных тогенных организмов, занимающих промежуточное
растений. Особенно долго и хорошо фитопатогенные положение между бактериями и вирусами. Клетки их,
бактерии сохраняются в деревянистых частях расте- как правило, округлы, но некоторые имеют удлинен-
ний. ную или гантелеобразную форму. Диаметр клеток —
Некоторые виды насекомых также могут являть- 0,1-1 мкм.
ся источником первичной инфекции. Большую опас- Фитоплазмы не имеют настоящей клеточной стен-
ность в распространении бактериозов представляют ки, и поэтому не имеют постоянной формы, окружены
капельки дождя с мелкими частицами остатков боль- трехслойной элементарной мембраной, чем и отлича-
ных растений, которые ветром и воздушными тече- ются от бактерий.
ниями разносятся на далекие расстояния (воздух сам По сравнению с вирусами для них характерны
по себе не играет роли в непосредственной передаче клеточное строение и способность размножаться
54 Глава 3
на искусственных питательных средах. На плотных позвоночных и беспозвоночных животных, получив-
средах они образуют мелкие специфические колонии, шие название риккетсиеподобные организмы.
по виду напоминающие «яичницу-глазунью». В от- Основные возбудители опухолей растений —
личие от вирусных частиц, в клетках фитоплазм при- бактерии рода Agrobacterium (наиболее часто A.
сутствуют два типа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) tumoralis). Агробактерии содержат онкогенные плаз-
и рибосомы, по размерам близкие к рибосомам бакте- миды. После их переноса в растительных клетках
рий. Фитоплазмы, в отличие от бактерий, устойчивы развиваются специфические опухоли — корончатые
к пенициллину, но по сравнению с вирусами чувстви- галлы. Возбудители микофитозов также вызывают
тельны к тетрациклину. паренхиматозные и сосудистые поражения растений.
Переносчиками фитоплазм служат в основном Использование сырья, обсеменённого грибами, в каче-
цикадки, листоблошки, светоноски. Фитоплазмы стве пищевых продуктов может вызвать тяжёлые за-
могут сохраняться только в живых тканях растения: болевания — микотоксикозы. Фитопатогенные вирусы
клубнях, корневищах, луковицах, корневищах много- вызывают мозаичные болезни, желтуху, карликовость.
летних сорняков. В насекомых — переносчиках фи- Их характерная особенность — появление слабоокра-
топлазмы могут длительное время сохраняться и раз- шенных пятен или целых участков, а также задержка
множаться. роста растений. Помимо вирусов, к фитопатогенам от-
Риккетсии. В 1972 г. во флоэмной части растений носят и вироиды.
клевера с деформированными листьями были обнару- Почти все фитопатогенные бактерии грамотрица-
жены организмы, морфологически сходные с риккет- тельные; лишь виды родов Clavibacter и Streptomyces
сиями — облигатными внутриклеточными паразитами дают положительную реакцию.
Глава 3 55
Глава 4. НАДЛЕЖАЩАЯ ПРАКТИКА
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СБОРА
ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ
(GACP)
Правила культивирования и сбора растений со- высокой влажности воздуха. Если же приходится уби-
держат следующие главы: введение, общая часть, обе- рать урожай при перечисленных выше условиях, не-
спечение качества, персонал и квалификация, здания обходимо предпринять меры против повреждения уро-
и производственная зона, оборудование, документа- жая за счет влажности и задокументировать этот факт.
ция, семена и рассада, культивирование, сбор, убор- Уборочные машины должны быть отрегулированы та-
ка урожая, первичная обработка, упаковка, хранение ким образом, чтобы контаминация от почвы была све-
и дистрибьюция [22]. дена к минимуму. Растения не должны (или минималь-
Применение правил гарантирует, что лекарствен- но) контактировать с почвой; их следует в ускоренном
ное растительное сырье: порядке доставить к месту первичной переработке при
1) произведено в гигиенических условиях с мини- соблюдении необходимых условий (чистота, сухость).
мальной микробиологической обсемененностью; В ходе уборки урожая необходимо обеспечить, чтобы
2) обработано и хранилось таким образом, чтобы в массу лекарственного растительного сырья не попа-
не было снижено качество последнего. дали примеси других растений, особенно ядовитых.
Требования к посадочному материалу. Семена Контейнеры, используемые при уборке урожая,
и рассада должны быть получены от растений, у ко- должны быть очищены от предыдущего сбора. Кон-
торых четко идентифицированы следующие признаки: тейнеры, которые не используются, должны храниться
род, вид, сорт, культурная разновидность, хемотип, в сухом месте, незагрязненном от вредителей, гры-
происхождение. Использование генетически модифи- зунов, хозяйственных и домашних животных. Необ-
цированных растений или семян должно соответство- ходимо предотвратить возможность механического
вать положениям местных законодательных актов. повреждения и утрамбовки (слеживания) сырья, т. е.
Следует учитывать принципы эффективности мешки заполнять сырьем следует в соответствии с раз-
сельского хозяйства, в том числе и соответствующий работанными нормами по максимально допустимой
севооборот. Лекарственные растения не следует куль- массе одной единицы упаковки сырья. Свежесобран-
тивировать на почве, контаминированной шламами, ное сырье необходимо как можно скорее доставить
тяжелыми металлами, отходами, продуктами защиты на место первичной переработки сырья, с целью пре-
растений и другими химикатами. Химикаты для улуч- дотвращения теплового разложения.
шения роста и защиты следует применять в минималь- Первичная обработка растений может включать
ном объеме. Вода для полива должна соответствовать в себя следующие этапы: мойку ЛРС; отделение не-
стандартам качества. По возможности следует избе- обходимой части растения (или нарезку перед сушкой,
гать применения пестицидов и гербицидов. Если же например, в случае корней); фумигацию; заморажива-
их применение необходимо, то только в соответствии ние; дистилляцию и сушку.
с рекомендациями производителя, силами квалифи- В случае сушки на открытом воздухе сырье необ-
цированного персонала и с помощью утвержденного ходимо распределить тонким слоем. Для обеспечения
оборудования. циркуляции воздуха полки сушилки следует распо-
Требования к заготовке ЛРС. Сбор (заготовка) ложить на достаточном расстоянии от земли. Сушка
должен проходить в соответствии с положениями нор- на земле или под прямым солнечным светом допуска-
мативных документов по защите видов растений. Ме- ется только в тех случаях, когда она не повлияет на ка-
тоды сбора не должны наносить вред среде места про- чество сырья. Каждую серию лекарственного расти-
израстания и должны оставлять оптимальные условия тельного сырья необходимо проверять по числовым
для регенерации собираемых растений. показателям и, если это необходимо, просеивать через
Уборка урожая должна проводиться при наилуч- сито. Сита следует поддерживать в чистом и работо-
ших условиях, когда нет: влажной почвы, росы, дождя, способном состоянии. Необходимо наличие промар-
56 Глава 4
кированных емкостей для отходов, которые ежедневно Одним из подходов по обеспечению микробиоло-
опорожняются и очищаются. Для защиты продукта гической безопасности растительного сырья и фито-
и уменьшения риска поражения вредителями рекомен- препаратов на его основе может являться разработка
дуется своевременная упаковка. анализа микробиологического риска (АМР) [15, 17].
Упаковка продукта должна проводиться при теку- Он служит новым средством научно-обоснованной
щем контроле в чистые, лучше всего, в новые пакеты, оценки как факторов риска, связанных с пищей, так
мешки или ящики. Маркировка должна быть четкой, и мер, которые будут предприниматься для их мини-
устойчивой и нетоксичной. мизации или ликвидации.
Спецификации на исходное сырье Производители лекарственных растительных пре-
Однако лекарственные растения первоначально паратов должны убедиться в том, что они используют
не свободны от микробов, и таким образом, в обычном только то исходное сырье растительного происхожде-
контроле необходимо рассмотреть несколько параме- ния, которое произведено в соответствии с GACP. Сле-
тров гигиены, особенно когда растение применяется дует иметь в наличии исчерпывающую документацию
в медицинских целях. После этой фундаментальной касательно аудитов поставщиков исходного сырья рас-
потребности оценка микробного загрязнения все бо- тительного происхождения, проведенных либо самим
лее и более стала неотъемлемой частью HACCP [23]. производителем лекарственного растительного пре-
В этом контексте микробный риск, свойственный ле- парата, либо по его поручению. Результаты аудитов
карственным растениям, может изменяться относи- в отношении растительного сырья являются осново-
тельно различных стадий производства, и это должно полагающими для качества исходного сырья. Произво-
быть учтено в систематической стратегии проверки дитель должен убедиться в том, что поставщики рас-
качества (табл. 14). Даже в высушенных растительных тительного сырья/препарата работают в соответствии
продуктах, некоторые микроорганизмы, в особенно- с правилами надлежащего выращивания и сбора рас-
сти их споры, могут переживать периоды длительного тений (GACP).
хранения.
4.1 Микробиологический контроль
Оценка риска микробиологического загрязнения лекарственных средств
на различных стадиях производства лекарственных
растительных препаратов Растительное лекарственное сырье может обсеме-
и пищевых продуктов няться микроорганизмами в процессе его получения:
Таблица 14.
инфицирование происходит через воду, нестерильную
Уровень риска
аптечную посуду, воздух производственных помеще-
Предварительное культивирование (+)
ний и руки персонала [12].
Полевое культивирование ++
Сбор урожая ++
Обсеменение лекарственного сырья возможно
Промежуточное хранение + на всех этапах его заготовки и при хранении. Актив-
Транспортировка (+) ному размножению микроорганизмов способствует
Обработка (очистка, резка, сушка, упаковка) + увлажнение растений и растительного сырья. Раз-
Конечный продукт (упакованный, на хранении) - множившиеся микроорганизмы вызывают изменение
фармакологических свойств препаратов, полученных
Объяснение символов: «–» отсутствие риска, (+) из лекарственных растений. Микроорганизмы мо-
низкий риск, «+» средний риск, «++» высокий риск. гут также попадать из окружающей среды, от людей
В медико-экологических исследованиях можно и обсеменять лекарственные препараты в процессе
выделить, как минимум, два типа риска: их изготовления из растительного сырья. Для со-
— Реальный риск — количественное выражение блюдения санитарного режима изготовления лекар-
ущерба общественному здоровью, связанного с загряз- ственных препаратов проводят санитарно-микробио-
нением среды обитания, в величинах дополнительных логический контроль объектов окружающей среды
случаев заболеваний, смерти и др. предприятия и каждой серии выпускаемой лекар-
— Потенциальный риск — возможность небла- ственной формы. Лекарственные средства для парен-
гоприятного для человека эффекта, определяемый терального введения в виде инъекций, глазные капли,
как вероятность возникновения этого эффекта при за- мази, пленки и др., в отношении которых имеются
данных условиях. Выражается в процентах или долях соответствующие указания в нормативно-техниче-
единицы. При изучении вероятности возникновения ской документации, должны быть стерильными. Кон-
инфекционных заболеваний или пищевых токсикоин- троль стерильности лекарственных средств проводят
фекций, можно говорить о потенциальном риске ин- путем посева на тиогликолевую среду для выявления
фекционных заболеваний. Инфекционная опасность различных бактерий, в том числе анаэробов; при по-
во многом определяется степенью обсемененности севе на среду Сабуро выявляют грибы, главным об-
продукта (КОЕ/г). разом рода Candida. Стерильность лекарственных
Глава 4 57
средств с антимикробным действием определяют пу- рий, синегнойная палочка, золотистый стафилококк),
тем мембранной фильтрации: фильтр после фильтра- которые не должны присутствовать в нестерильных
ции исследуемого препарата делят на части и вносят лекарственных средствах. В 1 г или 1 мл лекарствен-
для подращивания задержанных микроорганизмов ного сырья для приема внутрь должно быть не более
в жидкие питательные среды. При отсутствии ро- 1000 бактерий и 100 дрожжевых и плесневых грибов.
ста препарат считается стерильным. Лекарственные В случаях местного применения (полость уха, носа,
средства, не требующие стерилизации, обычно со- интравагинальное использование) количество микро-
держат микроорганизмы, поэтому их испытывают организмов не должно превышать 100 (суммарно)
на микробиологическую чистоту: проводят количе- микробных клеток на 1 г или 1 мл препарата. В та-
ственное определение жизнеспособных бактерий блетированных препаратах не должно быть патоген-
и грибов в 1 г или 1 мл препарата, а также выявляют ной микрофлоры, а общая обсемененность не должна
микроорганизмы (бактерии семейства энтеро-бакте- превышать 10 тыс. микробных клеток на таблетку.
58 Глава 4
Глава 5. ВИРУСЫ
Глава 5 59
Рис. 36. Размеры и морфология основных возбудителей вирусных инфекций человека.
60 Глава 5
5.2 Взаимодействие вируса с клеткой этого происходит репликация вирусной ДНК, синтез
хозяина поздней иРНК и белков, необходимых для построения
фаговых частиц (капсомеров головки и элементов хво-
Вирус проникает в клетку хозяина и использует ста) и лизоцима. Вновь синтезированные структурные
ее метаболические системы для своего воспроизвод- единицы путем самосборки образуют зрелые фаговые
ства и сохранения [4]. Этапы этих процессов различ- частицы, покидающие клетку, оболочка которой раз-
ны у разных групп вирусов и окончательный результат рушена лизоцимом. В одной микробной клетке мо-
может быть одним из следующих: жет быть синтезировано до 100 фаговых частиц через
1. Размножение вируса и гибель клетки хозяина. 25 мин после инфекции.
2. Размножение вируса и выход его из клетки без Литическую активность вирулентного фага можно
значительного повреждения последней. выявить в эксперименте, путем посева смеси суспен-
3. Сохранение вируса в клетке в латентном состо- зии фага и чувствительной к нему культуры на пита-
янии, обычно в виде вирусной НК. тельный агар в чашке Петри. На газоне бактериальной
4. Внедрение вирусной НК в геном хозяина, в ре- культуры появятся зоны лизиса в результате гибели
зультате чего происходит мутация, например, возник- части клеток под действием фага. Поскольку каждая
новение раковых клеток. зона лизиса (колония фага) инициирована одной фаго-
Бактериофаги (фаги) — это вирусы бактерий вой частицей, метод позволяет определить их количе-
(прокариот). Их генетический материал содержит- ство в исходной суспензии (метод титрования фага).
ся в головке, имеющей белковую оболочку (рис. 37). Лизогенными называют культуры, несущие уме-
Хвостовые нити и зубцы предназначены для распоз- ренный фаг. Чтобы обнаружить явление лизогении, т. е.
навания рецепторов на поверхности бактериальной выход фага из клеток, требуется индикаторная культу-
клетки и адсорбции на ней. Распознавание специфич- ра, для которой данный фаг вирулентен. Лизогенную
но не только для вида бактерии, но и для штамма, культуру смешивают с избытком бактерии-индикатора
что служит основой для фаготипирования бактерий и высевают газоном на чашку. Наблюдают зоны лизиса
(см. ниже). У некоторых фагов хвост имеет чехол, по- индикаторной культуры под действием фага. В центре
крывающий стержень. После адсорбции фага на клет- такой зоны находятся клетки лизогенной культуры.
ке чехол сокращается, проталкивая стержень внутрь. Основные стадии развития умеренных и вирулентных
Через стержень фаговая НК проникает внутрь клет- фагов представлены на рис. 38.
ки. Процесс облегчается благодаря местному по- Интеграция фаговой НК с бактериальной хромо-
вреждению клеточной стенки фаговым лизоцимом. сомой обеспечивает ее передачу дочерним клеткам.
Таким сложным органом инфицирования обладают Лизогенные бактерии невосприимчивы к заражению
лишь некоторые фаги грамотрицательных бактерий. теми фагами, которыми они лизогенизированы, а так-
На клеточной стенке грамположительных бактерий же близкородственными фагами. Эта невосприимчи-
имеются рецепторные участки, которые способствуют вость связана с образованием особого репрессора, пре-
проникновению в клетку крупных молекул и бактери- пятствующего размножению фага. Этот же репрессор
офагов. Чувствительное место для атаки — это пили, препятствует переходу профага в активное состояние
к которым фаги могут прикрепляться. Некоторые фаги и синтезу фаговых белков.
впрыскивают в клетку свою НК, другие проникают ин- Спонтанно лизогенные бактерии лизируются
тактными. По типу взаимодействия с бактериальной редко (10–2-10–5 в одной генерации). Частота лизиса
клеткой фаги подразделяют на вирулентные и уме- зависит от внешних условий, например, состава пи-
ренные. Вирулентные фаги размножаются внутри тательной среды. Мутагены (ультрафиолетовые лучи,
клетки. Созревшие частицы фага изнутри разрушают Н2 О2, митомицин С и др.) могут индуцировать массо-
клеточную стенку и выходят наружу, клетка при этом вое развитие зрелых фаговых частиц в клетках лизо-
погибает. Умеренные фаги также способны лизировать генной культуры, связанное с нарушением механизма
бактерии, однако, в большинстве клеток популяции репрессии. Мутации также могут быть причиной пере-
они существуют в клетке в виде профага — фаговой хода умеренного фага в вирулентное состояние. Такие
НК, которая подобно плазмидам может интегрировать мутанты оказываются устойчивыми к репрессору или
с хромосомой. утрачивают способность вызывать синтез репрессора
Литический цикл жизни вирулентного ДНК- в клетке.
геномного фага начинается с проникновения его ДНК Обычно лизогения — это весьма стабильное со-
в клетку и синтеза ранней иРНК (ранними называют- стояние, однако, некоторые клетки способны утрачи-
ся молекулы, образующиеся до репликации вирус- вать фаг и вместе с этим резистентность к данному
ной НК). На матрице вирусной иРНК синтезируются типу фага.
ранние белки. Последние выключают синтез белков Лизогения — чрезвычайно распространенное яв-
клетки хозяина, разрушают бактериальную ДНК и на- ление: большая часть штаммов бактерий несет в себе
чинают синтез компонентов вирусной ДНК. После НК одного или нескольких фагов, которая определяет
Глава 5 61
Рис. 38. Схема развития вирулентного (А) и умеренного (В) бактериофагов.
62 Глава 5
У РНК-геномных вирусов, содержащих +РНК, по- 5.3 Культивирование вирусов
следняя транслируется на рибосомах клетки хозяина.
Вирусная –РНК используется как матрица для постро- Культивирование вирусов в лабораторных услови-
ения с помощью РНК-зависимой РНК-полимеразы ях является необходимым этапом диагностики многих
комплиментарной копии +РНК, которая функциониру- вирусных болезней, кроме того, оно необходимо для
ет как информационная. получения вакцинных препаратов. Поскольку виру-
Необходимым этапом жизненного цикла ретро- сы являются облигатными паразитамми, они способ-
вирусов является интеграция его генома в форме ны размножаться только в живых клетках, например,
ДНК-провируса в хромосому хозяина. Синтез ДНК- в культуре ткани (клетках тканей человека или жи-
провируса на матрице вирусной +РНК происходит вотных, растущих на питательном субстрате, обыч-
с участием РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обрат- но в виде монослоя на плоской поверхности сосуда).
ной транскриптазы). Интегрированная в одну из хро- Присутствие вирусов можно обнаружить по цитопа-
мосом хозяина вирусная ДНК транскрибируется тическому эффекту (ЦПЭ), т. е. разрушению монослоя
клеточной РНК-полимеразой. Ретровирусы часто яв- клеток. Метод позволяет идентифицировать вирус,
ляются онкогенными, поскольку включение их ДНК например, в клиническом материале, с помощью им-
в геном клетки-хозяина вызывает ее перерождение. мунной сыворотки. Специфическая сыворотка нейтра-
По этой же причине онкогенными могут быть и ДНК- лизует вирус, и ЦПЭ в ее присутствии не будет про-
геномные вирусы. являться.
Самосборка вириона — это физико-химический Вирусы выращивают также путем заражения ла-
процесс, в результате которого формируется капсид бораторных животных или эмбрионов птиц.
с встроенной в него НК. У вирусов, имеющих наруж-
ную оболочку, формирование вирионов происходит 5.4 Действие химических и физических
на клеточной мембране, компоненты которой входят факторов на вирусы
в состав оболочки вируса (рис. 39).
Нагревание — наиболее эффективный способ
уничтожения вирусов. Большинство вирусов, пато-
генных для человека, погибает при 60°C в течение
30 минут; однако вирус гепатита В выдерживает эту
температуру в течение 4 часов. Вирусы выдерживают
глубокое охлаждение и могут храниться при темпе-
ратуре от –40°C до –70°C. Высушивание губительно
для некоторых вирусов, на других оно не действует.
Ультрафиолетовое облучение инактивирует вирусы,
повреждая их НК, что может быть использовано при
изготовлении вирусных вакцин.
Вирусы, имеющие липидную оболочку, инакти-
вируются органическими растворителями (хлорофор-
мом, эфиром); это явление используют при классифи-
кации вирусов. Многие химические дезинфектанты,
используемые против бактерий (фенолы, спирты, ЧАС)
малоэффективны против вирусов. Наиболее активны
против вирусов: хлор, гипохлориты, йод, альдегиды
и оксид этилена.
Глава 5 63
бактериальных осложнений) и симптоматические действуют с белком М2 вируса, что приводит к блока-
(купирующие соответствующую симптоматику, на- де слияния оболочки клетки и вируса и проникновения
пример, головную боль, кашель). Симптоматическую нуклеокапсида в цитоплазму. Кроме того, они блоки-
и патогенетическую терапию проводят практически руют первичную транскрипцию и активацию гемаг-
в 100% случаев, тогда как этиотропные химиотера- глютинина. Препараты проявляют профилактическое
певтические средства применяют ограниченно. При- действие при приеме до заражения и на ранних стади-
чиной этого являются трудности создания препаратов, ях инфекции.
избирательно подавляющих репродукцию возбудителя Видарабин (аденинарабинозид) — наименее ток-
и не затрагивающих процессы жизнедеятельности ор- сичный и наиболее эффективный из аналогов пуринов,
ганизма хозяина. Большинство ингибиторов вирусспе- блокирует сборку ДНК, его интермедиат ингибирует
цифических процессов, тесно связанных с клеточным вирусную ДНК-полимеразу. Применяют при лечении
метаболизмом, оказываются токсичными. герпетических инфекций.
Тем не менее, определены этапы жизненного цик- Цитозинарабинозид — аналог видарабина более
ла некоторых вирусов, подавление которых мало вли- токсичный, с меньшей избирательностью действия.
яет на клетки хозяина. Прежде всего, это адсорбция Применяют при химиотерапии опухолей.
и проникновение вируса в клетку, депротеинизация Галогенизированные производные дезоксиуриди-
НК и некоторые процессы, связанные с синтезом НК, на — йодоксиуридин, трифторидин (трифторти-
трансляцией и сборкой вириона. мидин) фосфорилизуются вирусной тимидинкиназой
Антивирусные химиотерапевтические веще- и встраиваются в ДНК вируса, что приводит к обра-
ства отличаются узким спектром активности (в пре- зованию дефектных вирусных белков. Применяются
делах одного вида или семейства), число их ограни- местно при герпетических кератитах.
ченно (табл. 15). Аналоги нуклеозидов, избирательно активируе-
мые вирусспецифической тимидинкиназой — ацикло-
Спектр активности противовирусных препаратов, вир, фамцикловир, ганцикловир обладают избиратель-
зарегистрированных в РФ ным действием на инфицированные вирусами клетки.
Таблица 15. Для активации необходимо их превращение в макро-
Препараты Показания к применению эргический трифосфат, который ингибирует вирус-
Адапромин Грипп А и В ную ДНК-полимеразу. Первый этап фосфорилирова-
Азидотимидин Вич-инфекция, СПИД ния индуцирует вирусспецифическая тимидинкиназа.
Амантадин Грипп А Нативная форма препаратов неактивна, поэтому они
Амбен не влияют на синтез ДНК в незараженных клетках.
Аминокапроновая Грипп А и В, респираторная вирусная Применяют при герпетических инфекциях, назначают
кислота инфекция
внутрь, внутривенно и в виде глазной мази.
Арбидол
Ацикловир
Ингибиторы обратной транскриптазы активны
Герпес, опоясывающий лишай против ретровирусов, включая ВИЧ.
Видарабин
Ганцикловир Герпес, цитомегилия Зидовудин (азидотимидин), зальцитабин (дидезок-
Дейтифорин Грипп А, респираторная вирусная инфекция сицитидин), диденозин (дидезоксиинозин), ставудин
Идоксиуридин Герпес (дидегидродезокситимидин) действуют как конку-
Марборан Оспа рентные ингибиторы фермента, кроме того, прекраща-
Оксолин Грипп, герпес, риновирусные инфекции ют элонгацию при синтезе белка на рибосомах. Обла-
Пандовир Герпес дают значительной токсичностью.
Ремантадин Грипп А Ингибиторы протеаз — негидролизующиеся
Рибавирин Респираторная вирусная инфекция, гепатит синтетические пептиды сакцинавир, ратонавир, ин-
С, лихорадка Ласса
динавир конкурентно взаимодействуют с протеазами
Теброфен
Трифторидин
Герпес, аденовирусные поражения глаз ВИЧ, в результате чего в ВИЧ-инфицированных клет-
Тромантадин Герпес ках накапливаются нерасщепленные предшественни-
Флюреналь Герпетические и аденовирусные поражения ки gag-полипротеина, проявляющие цитотоксическое
глаз действие. Используют в сочетании с ингибиторами об-
Фоскарнет Герпес, цитомегалия, гепатит В, ВИЧ- ратной транскриптазы у ВИЧ-инфицированных боль-
инфекция ных.
Хельпин Герпес, ветряная оспа Нуклеозидные аналоги широкого спектра
Цитарабин Цитомегалия
Р и б а в и р и н — аналог гуанозина, действует
на РНК- и ДНК-геномные вирусы. Разрешен для лече-
Амантадин, ремантадин — трициклические сим-
ния тяжелых респираторных инфекций у детей и дру-
метричные адамантамины активны против вирусов
гих заболеваний. Вызывает побочные эффекты, вклю-
гриппа А и коревой краснухи. Эти вещества взаимо-
чая подавление иммунитета.
64 Глава 5
Ф о с к а р н е т (тринатриевая соль фосфорному- Ацикловир. Выделены устойчивые штаммы гер-
равьиной кислоты) ингибирует активность обратной песвирусов, опасные для больных с иммунодефи-
транскриптазы и всех ДНК-полимераз герпесвирусов цитами. Резистентность обусловлена отсутствием
и возбудителя гепатита В. Применяют для лечения гер- тимидинкиназы или модификацией ее структуры,
петических инфекций. кроме того, мутацией генов, кодирующих ДНК-
N1-метилизатин-β-тиосемикарбазон (метизазон, полимеразу, что делает ее устойчивой к действию
марборан) угнетает синтез поздних иРНК и поздних ингибиторов.
полисом у поксвирусов. Применяется для лечения Ганцикловир. Устойчивость связана с изменени-
оспы. ем структуры вирусной фосфотрансферазы и ДНК-
полимеразы, приводящими к снижению уровня фос-
5.6 Устойчивость вирусов форилирования препарата.
к химиотерапевтическим препаратам Зидовудин и невирапин. Устойчивость ВИЧ об-
условлена мутацией генов, кодирующих обратную
Вирусам, как и всем живым существам, присуща транскриптазу, что приводит к снижению аффинитета
способность адаптироваться к изменяющимся услови- фермента к ингибитору.
ям внешней среды, в том числе и к действию биоци- К цитозинарабинозиду и рибавирину устойчи-
дов (рис. 40). Адаптация происходит как в результате вые штаммы не выявлены, что предположительно
селекции устойчивых штаммов, сформировавшихся связано со способностью этих препаратов воздей-
в ходе предшествующей эволюции, так и в результате ствовать на определенные этапы клеточного метабо-
селективного отбора вновь возникающих штаммов. лизма, что объясняет причину широкого спектра их
Преодоление развития резистентности в условиях действия.
клиники возможно при комбинированном примене-
нии препаратов с различными механизмами действия 5.7 Интерфероны.
и при использовании препаратов, воздействующих
на ранние этапы репродукции вируса. В настоящее Интерфероны (ИФН, см. гл. 19) обладают уни-
время наблюдаются случаи развития резистентности версально широким спектром антивирусной актив-
к следующим препаратам. ности, поскольку действуют не на вирионы или их
НК, а индуцируют антивирусное состояние клетки,
стимулируя образование комплекса белков, блокиру-
ющих транскрипцию вирусной иРНК. ИФН не про-
никают в клетки, а взаимодействуют с мембранны-
ми рецепторами, индуцируя образование цАМФ,
передающего сигнал на соответствующий оперон
ДНК. Кроме того, ИФН активируют гены, кодиру-
ющие продукты с прямым антивирусным действи-
ем — протеинкиназы, нарушающие сборку белковой
молекулы, и аденилатсинтетазы, продукт которых
активирует эндонуклеазу, разрушающую вирусные
иРНК. Гамма-ИФН активирует цитотоксические
лимфоциты, естественные киллеры, моноциты, ма-
крофаги, гранулоциты, способствующие уничтоже-
нию инфицированных клеток.
Медицинские препараты ИФН делятся на природ-
ные и рекомбинантные, их эффективность при различ-
ных заболеваниях указана в табл. 16.
Индукторы ИФН — это весьма разнородная
по составу группа природных и синтетических со-
единений, способных вызывать в организме обра-
зование собственного (эндогенного) ИФН. Подобно
ИФН они обладают универсально широким спек-
тром противовирусной активности (табл. 17), а так-
же иммуномодулирующим действием, которое опре-
деляет их эффективность при многих невирусных
заболеваниях.
Рис. 40. Этапы продукции вирусов — мишени для ос-
новных противовирусных препаратов.
Глава 5 65
Противовирусная активность препаратов ИФН
Таблица 16.
Типы ИФН Препараты Эффективны при заболеваниях
Природные:
α-ИФН Лейкоцитарный ИФН человека, эгиферон, Гепатиты В, С и Д, папилломавирусные заболевания,
(альфа-фероны) виллферон, лейкинферон ВИЧ-инфекция, СПИД
β-ИФН Фибробластный ИФН человека, ферон Гепатит С, герпес, папилломавирусные заболевания,
(бета-фероны) ВИЧ-инфекция, СПИД, рассеянный склероз
γ-ИФН Иммунный ИФН человека (γ-ИФН) Гепатит В, папилломавирусные заболевания
(гаммафероны)
Рекомбинантные:
α2 А Реаферон, роферон, виферон, Гепатиты В, С и Д, герпес, опоясывающий лишай,
реальферон папилломавирусные заболевания, ВИЧ-инфекция, СПИД
α2 В Интрон, инрек Гепатиты С и Д, герпес, папилломавирусные заболевания,
ВИЧ-инфекция, СПИД
α2 С Берофор Гепатит В, опоясывающий лишай, папилломавирусные
заболевания
β Рекомбинантные β-ИФН (бетафероны) Рассеянный склероз
5.8 Возбудители вирусных болезней двухнитевая ДНК, в состав вириона входят прайме-
человека ный белок и ДНК-полимераза. Для репликации необ-
ходим синтез вирус-индуцированной обратной транс-
5.8.1 ДНК-содержащие вирусы криптазы, т. к. вирусная ДНК образуется на матрице
Герпесвирусы — икосаэдральный капсид, двух- РНК; в динамике процесса вирусная ДНК интегрирует
слойная внешняя оболочка, гликопротеиновые шипы, в хромосому. Вызывают гепатит В.
двухнитевая линейная ДНК. Вызывают острые и ла-
тентные инфекции (рецидивирующий герпес, ветряная 5.8.2 РНК−содержащие вирусы
оспа, опоясывающий лишай, инфекционный монону- Ортомиксовирусы — сферический вирион со-
клеоз, кератит, энцефалит и др.); обладают онкоген- держит однонитевую сегментированную РНК. Вызы-
ным потенциалом. вают грипп. У вирусов гриппа А и В геном содержит
Паповавирусы — голый икосаэдральный капсид, 13588 нуклеотидов и состоит из 8 сегментов, каждый
двухнитевая циклическая ДНК. Вызывают папилломы из которых кодирует свой протеин. Основной белок
и полиомы (бородавки, кондиломы, локальные гипер- вириона−М−протеин, локализуется на внутренней по-
плазии эпителия, карцинома гортани и шейки матки). верхности двухслойной липидной оболочки, с которой
Аденовирусы — голый икосаэдральный капсид, ассоциированы поверхностные гликопротеины − ге-
двухнитевая линейная ДНК. Вызывают фарингоконъ- магглютинин и нейраминидаза, образующие шипы.
юнктивиты, эпидемический кератоконъюнктивит, га- Эти гликопротеины обладают антигенной специфич-
строэнтериты. ностью, которая способна варьировать часто в дина-
Поксвирусы — вирион кирпичеобразной формы, мике одной эпидемической вспышки, что затрудняет
двухнитевая ДНК. Вызывают натуральную оспу, оспу вакцинопрофилактику гриппа.
коров, оспу обезьян и др. Парамиксовирусы — сферический вирион, ли-
Парвовирусы — голый икосаэдральный капсид, попротеиновая оболочка содержит М-протеин, фор-
однонитевая ДНК. Вызывают апластический криз мирующий его внутренний слой, и поверхностные
у детей. гемагглютинин, нейраминидазу и гликопротеид F, про-
Гепаднавирусы — икосаэдральный капсид с обо- являющий гемолитическую цитотоксическую актив-
лочкой, неполная (с разрывом одной цепи) кольцевая ность и ответственный за слияние с клеткой; геном
66 Глава 5
представлен линейной несегментированной молеку- злокачественные заболевания; HTLV−1−T−клеточные
лой РНК, связанный с мажорным белком. Вирион со- лимфомы и миелопатии; ВИЧ−1 и ВИЧ−2 — синдром
держит РНК−зависимую РНК−полимеразу. Вызывают приобретенного иммунодефицита (СПИД).
парагрипп, корь, эпидемический паротит и подострый
склерозирующий панэнцефалит. 5.8.3 Неклассифицированные вирусы
Пикорнавирусы — голые икосаэдрические вири- Вирус гепатита D — дефектный (неспособный
оны, несегментированная молекула +РНК. Вызывают к самостоятельному размножению, нуждающийся
бессимптомные инфекции, менингиты, паралич (по- в вирусах-помощниках), выделяемый только от паци-
лиомиелит), миоперикардит, острые респираторные ентов, инфицированных вирусом гепатита В (ВГВ),
инфекции. его геном — однонитевая РНК не имеет гомологии
Рабдовирусы — вирион пулевидной формы со спи- с ДНК ВГВ, но оболочка включает антигены ВГВ.
ральной симметрией, двухслойная липидная оболочка, Астровирусы — сферические вирионы, геном −
включающая внешние гликопротеиновые структуры; однонитевая РНК. Вызывают диарейные инфекции
нуклеокапсид содержит однонитевую РНК, протеины у детей.
сердцевины и транскриптазу. Вызывают бешенство,
везикулярный стоматит и др. 5.9 Вирусы — возбудители болезней
Тогавирусы — икосаэдральный капсид, липидная растений
оболочка с гликопротеиновыми шипами, содержащи-
ми гемагглютинин, однонитевая молекула +РНК. Вы- Вирусы — мельчайшие (субмикроскопические)
зывают энцефалиты, желтую лихорадку, лихорадку возбудители болезней растений, животных и человека,
Денге, карельскую лихорадку, гепатит С, краснуху. не имеющие клеточного строения и способные раз-
Буньявирусы — сферический вирион с тремя ну- множаться только в живых клетках растения хозяина
клеокапсидами, каждый из которых содержит три от- [20]. Зарегистрировано примерно 600 фитопатогенных
дельных линейных сегмента −РНК и РНК-зависимую вирусов; точное число указать трудно, так как некото-
РНК-полимеразу. Оболочка липопротеиновая с глико- рые вирусы представлены многими штаммами, иногда
протеиновыми шипами, содержащими гемагглютинин. описываемыми как самостоятельные виды.
Вызывают лихорадки и энцефалиты. Все фитопатогенные вирусы объединены
Аденовирусы — округлые или полиморфные вири- в 20 групп.
оны, однонитевая сегментированная молекула −РНК; В настоящее время полагают, что вирусы — это
вирионы содержат несколько типов как вирусных, так самые простейшие формы жизни, не имеющие клеточ-
и заимствованных у хозяина рибонуклеопротеинов, ную структуру и активизирующиеся при попадании
выполняющих роль рибосом. Вызывают тяжелые ге- в клетки восприимчивых организмов. Вирусы расте-
моррагические лихорадки, гриппоподобные заболева- ний характеризуются следующими особенностями:
ния, менингиты. 1. Размножаются только в организме хозяина или
Филовирусы — палочковидные ветвящиеся вири- переносчика; на искусственных питательных средах
оны, спиральный нуклеокапсид, −РНК. Вызывают тя- не растут. Имеют своеобразный механизм размноже-
желые геморрагические лихорадки. ния.
Коронавирусы — округлые или овальные вирио- 2. Клеточного строения не имеют: состоят
ны, гликолипопротеиновая оболочка с характерными из РНК — рибонуклеиновой кислоты (одно или двух-
выростами (короной), нуклеокапсид спиральный, не- цепочечной) или ДНК — дезоксирибонуклеиновой
сегментированная +РНК. Вызывают острые гастроэн- кислоты, окруженной обычно (но не всегда) белковой
териты и респираторные инфекции. оболочкой.
Калицивирусы — голый икосаэдральный капсид, 3. Геном вирусов представлен только нуклеиновой
несегментированная +РНК. Вызывают гастроэнтери- кислотой, репродуцирующейся за счет ферментатив-
ты и гепатит Е. ной системы хозяина.
Реовирусы — голый вирион, капсид квазисфери- 4. Нуклеиновая кислота ответственна за инфек-
ческий с икосаэдральной симметрией, геном фрагмен- ционность, а белок осуществляет в основном защиту
тарный, образован двухнитевой РНК, состоящей из РНК.
10-11 сегментов. Ортореовирусы вызывают лихорадки Вирусы имеют палочковидную (ВТМ), нитевид-
(колорадская, кемеровская и др.); ротавирусы − острые ную (Х-вирус картофеля, тристеза цитрусовых), сфе-
энтериты у детей. рическую (некроз табака) и бацилловидную (штри-
Ретровирусы — сферический вирион, одетый ли- ховатая мозаика пшеницы) формы. Размер вирусов
пидной оболочкой, с гликопротеиновыми шипами, ге- составляет от 25 нанометров (нм) у вируса некроза
ном образован +РНК, состоящей из двух идентичных табака, и до 2500 нм у тристезы цитрусовых 1-нм (на-
субъединиц. Характерная особенность − наличие в ви- нометр) равен 10–9 = 0,001 мкм). По характеру воздей-
рионе РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Вызывают ствия на пораженный организм вирусы делят на две
Глава 5 67
большие группы — вирусы мозаичного типа (мозаика) ными в спираль. Лишь немногие вирусы растений
и вирусы желтушного типа (желтуха). (вирус мозаики цветной капусты) имеют в своем со-
В результате заражения мозаичными вирусами из- ставе ДНК.
меняется окраска листьев, наблюдается чередование Механизм размножения вирусов отличается
светло- и темно-зеленых, желтых, зеленых участков от способов размножения других микроорганизмов.
листьев, появление некротических пятен, штрихов, ко- Фитопатогенные вирусы попадают в растительную
лец и др. клетку, например, при проколе ткани ротовыми ор-
Источниками инфекции мозаичных вирусов мо- ганами насекомых-переносчиков или через мелкие
гут быть сухие растительные остатки, семена, клубни, ранки (без грубых повреждений клеток) при меха-
сорняки, почва и др. нической передаче. В клетках зараженного растения
Вредоносность вирусных заболеваний прояв- вирус репродуцируется путем синтеза отдельных
ляется, главным образом, в снижении урожайности молекул нуклеиновых кислот и белка и последую-
растений и ухудшении качества продукции. Особый щей сборки из них вирионов. Попав в клетку рас-
вред вирусы наносят при выращивании семенного тений, нуклеиновая кислота вируса освобождается
и посадочного материала. Поражение вирусами от- от белковой оболочки и, становясь матрицей, на-
рицательно влияет на пищевую и кормовую ценность чинает управлять синтезом ферментов клетки рас-
продукции, пригодность её к промышленной пере- тения в направлении, необходимом вирусу. Проис-
работке. Вирусы вызывают у растений стерильность ходит её накопление за счет репликации цепочек
и несовместимость, что отрицательно сказывается нуклеиновых кислот из имеющихся в клетке, а за-
на работе селекционеров. У цветочных культур те- тем синтезируемых клеткой нуклеотидов. Вирусный
ряется декоративность, что наносит значительный белок синтезируется на рибосомах клетки-хозяина.
экономический ущерб. Под действием вирусов те- Впоследствии происходит объединение нуклеино-
ряются сортовая чистота, холодостойкость, зимо- вой кислоты и структурного белка с образованием
стойкость, снижается всхожесть семян. В среднем вирионов.
размер убытков от развития вирусных болезней Нередко вирионы агрегатируют друг с другом, об-
составляет примерно 20% общего экономического разуя вирусные включения — кристаллы различной
ущерба, обусловленного деятельностью всех групп формы (кристаллы Ивановского), или, если вирионы
возбудителей болезней и вредителей сельскохозяй- соединяются с уплотнениями цитоплазмы, образуются
ственных культур. включения в виде аморфных тел.
При вирусной инфекции имеет место облигатный
5.9.1 Строение и размножение вирусов. тип паразитизма, причем его абсолютная форма. Па-
тоген внедряется в генетический аппарат растений,
К вирусам неприменимы традиционные микро-
изменяя его в сторону, необходимую для синтеза
биологические методы исследования, поэтому долгое
собственной ферментативной энергетической систе-
время об их строении, способах размножения, сохра-
мы и впоследствии — соответствующих вирусных
нения ничего не было известно. Только в 1935 г. амери-
структур.
канский вирусолог У. Стенли выделил из зараженных
вирусом табачной мозаики (ВТМ) листьев табака бел- 5.9.2 Симптомы вирусных болезней
ковый компонент, получив чистый кристаллический растений
белок вируса. В 1937 г. англичане Ф. Боуден и Н. Пири
установили, что кроме белка в состав вируса входит По характеру проявления симптомы вирусных бо-
нуклеиновая кислота. Вирус табачной мозаики состо- лезней можно разделить на 5 основных типов: 1. Уг-
ит из белка (95%) и нуклеиновой кислоты (5%). нетение роста; 2. Изменение окраски листьев, которые
Говоря о размере и строении вирусов, имеют приобретают мозаичную расцветку; 3. Деформация
в виду вирионы, или вирусные частицы. Размеры вири- органов; 4. Локальные некрозы; 5. Нарушение репро-
онов в большинстве случаев составляют 100…200 нм. дуктивных функций растений.
Форма вириона определяется способом ориенти- При одном и том же вирусном заболевании
рования в пространстве нуклеиновой кислоты и стро- на растении обычно проявляется несколько типов
ения белковой оболочки. Белок играет защитную симптомов. Симптомы вирусных заболеваний могут
роль, а также обеспечивает проникновение вируса изменяться по мере развития патологического про-
в ткани растения-хозяина. Нуклеиновая кислота яв- цесса.
ляется носителем инфекционности и наследственных
признаков. 5.9.3 Способы распространения
Большинство вирусов растений содержит одно- фитопатогенных вирусов
цепочечную линейную РНК, реже встречаются виру- Вирусы, вызывающие болезни растений, мо-
сы с двух цепочечными молекулами РНК, закручен- гут распространяться различными путями. Многие
68 Глава 5
вирусы распространяются переносчиками (векто- 5.9.5 Вироиды — возбудители болезней
рами), которые питаются или паразитируют на рас- растений
тении. Это главным образом насекомые, клещи,
Вироиды как новый класс патогенов был открыт
нематоды, грибы и паразитические цветковые рас-
Т. Динером в 70-х годах XX в. К этой группе фитопато-
тения (повилика). Лишь сравнительно небольшое
генов относят вирусоподобные инфекционные агенты,
количество фитопатогенных вирусов передается на-
которые не образуют характерных для вирусов нукле-
секомыми с грызущим ротовым аппаратом — такая
опротеидных частиц. Они представляют собой только
передача малоспецифична и имеет значение только
низкомолекулярную одноцепочную РНК, являющу-
для вирусов, способных сохраняться в соке больно-
юся носителем инфекционности и использующую
го растения.
для своей репликации биосинтетическую систему
В зависимости от особенностей передачи насе-
клетки растения-хозяина. Они характеризуются тем,
комыми вирусы делят на персистентные и неперси-
что имеют только ковалентно замкнутую кольцевую
стентные. Персистентные вирусы сохраняются свою
РНК, имеющую крайне низкую молекулярную массу
инфекционность в организме переносчика в течение
(2,5×10 4 — 15×10 4). Белковая оболочка отсутствует.
нескольких дней, а иногда в течение всей жизни век-
Наиболее характерные симптомы вироидозов: уг-
тора. Неперсистентные вирусы могут быть переданы
нетение роста, уменьшение размеров растения и от-
переносчиками в течение ограниченного промежутка
дельных его органов (листьев, цветков, плодов), осла-
времени, часто не более часа.
бление интенсивности окраски, хлороз листьев.
Вирусы могут передаваться контактно-механиче-
Вироиды распространяются с посадочным мате-
ским путем, т. е. при взаимоповреждающем контакте
риалом, с семенами, передаются от растения к рас-
частей здорового и больного растения. Это происхо-
тению механическим путем. Так, вироид экзокортиса
дит при соприкосновении надземных или подземных
цитрусовых быстро распространяется при привив-
частей растений. Часть вирусов (около 20%) способна
ках. Вироиды характеризуются высокой инфекцион-
передаваться через семена. Некоторые вирусы плодо-
ностью, термостабильностью, стойкостью к воздей-
вых и ягодных культур могут передаваться через пыль-
ствию различных химических соединений.
цу. У вегетативно размножаемых культур (картофель,
Основные симптомы вироидных болезней: угне-
земляника, тюльпан и др.) вирусы распространяются
тение роста растений или его отдельных органов, из-
в основном с посадочным материалом. При различ-
менение окраски (хлороз, антоцианоз), деформация
ного рода прививках (трансплантации) происходит
различных органов. Вироиды отличаются высокой ин-
распространение вирусных болезней. Этим методом
фекционностью, стойкостью к химическим и термиче-
передаются все известные фитопатогенные вирусы.
ским воздействиям. Они распространяются с посадоч-
Единичные вирусы (вирус мозаики табака, вирус не-
ным материалом, семенами, контактно-механическим
кроза табака) могут передаваться с растительными
путем. К основным методам диагностики вироидов
остатками, с почвой, с гидропонными растворами.
относят визуальную диагностику, метод растений-ин-
Небольшое значение (для вирусов кормовых бобовых
дикаторов, электронную микроскопию, метод гель-
трав) имеет место распространения вирусов через
электрофореза, метод ДНК-зондов. Защита растений
стебли повилики.
от вироидных болезней сходна с защитой их от вирус-
ных патогенов.
5.9.4 Защита растений от вирусных
Именно благодаря высокой обоюдной организации
болезней
грибов и растений их взаимодействия носят широкий
1. Карантин растений — это система государ- характер. По разным оценкам, известно от 120 тыс.
ственных мероприятий, направленных на предотвра- до 250 тыс. видов грибов, и среди них свыше 8 000 ви-
щение заноса с территории других стран карантинных дов фитопатогенных, тогда как среди бактерий извест-
возбудителей болезней растений (внешний карантин), но только около 200 фитопатогенных видов.
а в случае проникновения — на локализацию их оча- Агробактерии способствуют развитию различ-
гов (внутренний карантин). ных опухолей у растений. Образование опухолей вы-
2. Использование и получение оздоровленного зывается онкогенной плазмидой, передающейся аг-
от вирусов семенного и посадочного материала. робактериями в растительные клетки. Эти бактерии
3. Селекционный метод — при этом стремятся вызывают у растений образование корончатых гал-
вывести новые сорта, устойчивые не только к вирусу, лов опухолей. После развития опухоли агробактерии
но и к его переносчику. в тканях обычно отсутствуют. Передача возбудителей
4. Организационно-хозяйственные мероприя- бактериозов происходит через зараженные семена,
тия — дезинфекция орудий труда в растворе форма- остатки больных растений, почву, воду, воздух, пу-
лина, перманганата калия, спирта, тепловая обработка. тем переноса насекомыми, моллюсками, нематодами.
Регулярное визуальное обследование растений. Бактерии проникают в растения через устьица, не-
Глава 5 69
ктарники и другие части растений, а также даже че- Штреуссера-Шейннера, семейная смертельная бессон-
рез небольшие повреждения. ница, куру, скрепи овец и коз, трансмиссивная губча-
тая энцефалопатия коров и др. Источником инфекции
5.10 Прионы являются ткани больного организма. Заражение че-
ловека возможно алиментарным путем, а также при
использовании лекарственных препаратов, получен-
Прионы как инфекционные агенты ных из тканей больных животных, или недостаточно
Прионы — это гликопротеины, которые способ- обезвреженных медицинских инструментов. У коров
ны индуцировать в нормальном клеточном белке кон- и овец инфекционные агенты передаются через корма,
формационный переход в конформер с инфекционной содержащие ткани погибших животных.
активностью (рис. 41) [26]. Источником нормального Для заболеваний, вызванных прионами, характе-
белка является сама клетка, в которой постоянная экс- рен очень длительный инкубационный период. Раз-
прессия гена PRNP создает пул белка PrPc — нормаль- витие инфекции тесно связано с функциями генома
ного компонента клеточных мембран. Контакт с ин- и жизнедеятельностью клеток, обеспечивающих на-
фекционным прионом PrPsc (sc — скрепи) вызывает копление белка PrPsc и постепенное прогрессирую-
переход нормального белка в конформационное со- щее развитие симптомов, которое может затягиваться
стояние PrPsc. Этот переход осуществляется в период на месяцы и годы.
посттрансляционного процессинга предобразованного Для прионных заболеваний характерно практи-
нормального клеточного белка. чески полное отсутствие иммунного ответа в связи
Нормальный белок PrPc локализуется в цитоплаз- с высокой консервативностью первичной структуры
матической мембране и участвует в функционирова- белка; эти инфекции не реагируют на иммуномодули-
нии сигнальных систем клеток, в частности нейронов, рующую терапию, хотя делаются попытки получить
и предположительно в биогенезе и развитии нервной иммунопрепараты, воздействующие на отдельные эта-
системы. Его конформационная модификация вызы- пы формирования конформированных белков.
вает нарушение этих процессов. Кроме того, конфор- Прионы в фармацевтической практике
меры индуцируют апоптоз инфицированных клеток Прионы представляют собой индивидуальные
и генерируют нейротоксические полипептиды, пред- белки с молекулярной массой от 20 до 30 кДа при дли-
положительно образующие поры в нейронах и свя- не полипептидной цепи около 254 аминокислотных
зывающие нуклеиновые кислоты, а также блокируют остатков. Они фильтруются через фильтры с диаме-
репликацию митохондрий, вызывая их дегенерацию. тром пор 25-50 нм.
Последнее лежит в основе многих неврологических Прионы стабильны при температуре 90 °С в те-
заболеваний. чение 30 мин., инактивируются только при авто-
клавировании при 135°С в течение 30 мин. Однако
описаны случаи инфицирования при применении ав-
токлавированного медицинского инструмента (сто-
матологического, отоларингологического, нейрохи-
рургического). Прионы резистентны к воздействию
химических агентов (глутаровый альдегид, формаль-
дегид, β-пропиолактон, этанол, толуол, ксилол), нукле-
азам, УФ и ионизирующей радиации. Менее резистент-
ны к ацетону, натрия гидроксиду, ионным детергентам
типа натрия додецилсульфата, фенолу, хлороформу,
сильным окислителям, этиленоксиду, протеазам.
Прионы имеют ограниченный спектр хозяев,
но способны адаптироваться к новому хозяину, т. е.
преодолевать межвидовые барьеры.
Опасность распространения прионных заболева-
Рис. 41. Схема заражения прионами, диссеминация ний представляет серьезную проблему для фармацев-
прионов в организме и стадии инфекционно- тической деятельности, включая контроль поставщи-
го процесса в центральной нервной системе ков животного сырья (недопущение получения сырья
(В — В-лимфоциты; ФДК — фолликулярные из регионов, где наблюдались случаи трансмиссивной
дендритные клетки [7]. губчатой энцефалопатии крупного рогатого скота)
и выбор способа стерилизации. Для термостабильного
Заболевания, вызываемые прионами, характери- медицинского оборудования, загрязненного матери-
зуются поражением центральной нервной системы: алом, содержащим прионы, ВОЗ рекомендует погру-
болезнь Крейцфельда-Якоба, синдром Гертсманна- жение в раствор натрия гидроксида (1 н) или натрия
70 Глава 5
гипохлорита (20000 ppm активного хлора) на 1 час синтезирует ДНК-провирус, интегрирующий в геном
с последующим автоклавированием, очисткой и обыч- клетки и вызывающий ее перерождение.
ной стерилизацией. Внешняя оболочка вируса — капсид состоит
Методы контроля полноты инактивации прионов из белковых субъединиц — капсомеров.
трудоемки, длительны и дорогостоящи, они пред- Вирулентные бактериофаги вызывают лизис кле-
усматривают заражение животных инфицированной ток, умеренные фаги существуют в клетке в виде про-
тканью, подвергнутой воздействию биоцида, и мате- фага — фаговой НК, которая входит в состав генома
матический расчет концентрации биоцида и време- бактериальной клетки.
ни, необходимых для инактивации приона. Поэтому Вирусы выращивают в культуре ткани или путем
на практике необходимо строго соблюдать регламен- заражения животных или эмбрионов птиц.
тированный режим обработки, гарантирующий каче- Создание противовирусных препаратов направле-
ство стерилизации. но на подавление этапов жизненного цикла вирусов,
не затрагивающих клетки хозяина: адсорбция, проник-
Заключение новение вирусов в клетку, функционирование вирус-
Вирусы отличаются от других форм жизни по сле- ной НК.
дующим признакам: Интерфероны — это белки, которые обладают
— размеры от 28 до 250 нм; универсально широким спектром противовирусной
— наличие одного типа НК — ДНК или РНК; активности.
— облигатный паразитизм. Прионы — инфекционные гликопротеины, вы-
Вирусы паразитируют на клетках бактерий (бак- зывают поражение ЦНС, передаются алиментарным
териофаги), растений, животных и человека, вызывая путем или через инфицированные материалы и ин-
различные заболевания. Ретровирусы содержат +РНК, струменты. Прионы исключительно устойчивы к сте-
на матрице которой фермент обратная транскриптаза рилизующим агентам.
Глава 5 71
Глава 6. ПРОСТЕЙШИЕ
72 Глава 6
ним хроматиновым зерном, и формы с псевдоваку- зируют в клетки организма (подвержены любые ядро-
олью, внешне напоминающие кольцо или перстень. содержащие клетки).
Трофозоиты позднее увеличиваются и образуют Большинство случаев токсоплазмоза протекает
многоядерные шизонты (делящиеся формы). Шизон- бессимптомно, однако у людей с иммунодефицитами
ты образуют новое поколение мерозоитов, инфици- он приобретает тяжелый, преимущественно фаталь-
рующих другие эритроциты. Каждый шизонт может ный характер.
образовать от 6 до 24 дочерних мерозоитов. Выход Род Sarcocystis представлен кокцидиями, близ-
мерозоитов из эритроцитов сопровождается их раз- кими к токсоплазмам, также имеющими несколько
рушением. Лихорадка наблюдается в момент выхода хозяев. Человек заражается, поедая термически не-
мерозоитов из разрушенных эритроцитов. Цикл раз- достаточно обработанную говядину или свинину, со-
вития для P. malariae составляет 72 часа, для других держащую саркоцисты, при этом может развиваться
видов — 48 час. С завершением цикла размножение кишечный или мышечный саркоцистоз.
P. malariae и P. falciparum в печени прекращается, Род Babesia включает виды, патогенные для жи-
тогда как у P. vivax и P. ovale часть спорозоитов (гип- вотных и человека, вызывающие бабезиозы — маля-
нозоиты) остается в гепатоцитах, образуя дремлю- риеподобные заболевания, особенно часто у сплен эк-
щие очаги, дающие отдаленные рецидивы. томированных пациентов.
В некоторых эритроцитах развиваются женские Род Cryptosporidium объединяет виды, паразити-
и мужские гамонты, завершающие свое развитие толь- рующие в эпителиальных клетках кишечника тепло-
ко в организме комара в течение 7-45 сут. (в зависимо- кровных. Заражение происходит с загрязненной водой
сти от температуры воздуха). и пищей. У пациентов с иммунодефицитами вызывают
Toxoplasma gondii — внутриклеточный паразит, хронические поражения желудочно-кишечного тракта.
морфологически напоминающий вытянутую дольку
апельсина, длина 4-7 мкм, один конец закруглен. Рас- 6.2 Саркодовые
пространен повсеместно, вызывает токсоплазмоз. За-
ражение человека происходит алиментарным путем Саркодовые включены в тип Sarcomastigophora,
при проникновении ооцист и тканевых цист (при упо- класс Lobosea, отряд Amoebia. Это наиболее прими-
треблении полусырых мясных продуктов, с немытыми тивные организмы, в большинстве свободноживущие,
овощами и фруктами), через кожу и трансплацентар- но некоторые обитают в кишечнике человека и живот-
но. Инфицированность населения разных стран со- ных. Среди патогенных амеб наиболее распространена
ставляет от 4 до 68%; возбудитель выделен практиче- Entamoeba hictolytica.
ски от всех млекопитающих и многих птиц. Род Entamoeba включает единственный патоген-
Жизненный цикл включает стадии полового и бес- ный для человека вид — E. hictolytica, вызывающий
полого размножения. Первичные и основные хозя- амебиаз (амебную дизентерию). Возбудитель суще-
ева — домашние кошки и другие представители се- ствует в виде различных форм.
мейства кошачьих, в организме которых происходит Большая вегетативная форма — крупная (20-
половое размножение возбудителя. Первичное за- 60 мкм) клетка. От прочих амеб отличается толчкоо-
ражение кошек происходит при поедании грызунов, бразным поступательным движением, при котором
содержащих ооцисты, из которых выходят парази- образует псевдоподии. Выделяется с испражнениями
ты — спорозоиты, проникающие в клетки кишечника при остром амебиазе.
и превращающиеся в трофозоиты, размножающиеся Тканевая форма — мелкая (20-25 мкм) патогенная
делением (шизогония). Половое размножение также форма инвазирует стенку толстой кишки с развитием
происходит в клетках слизистой оболочки кишечника. специфических поражений.
Образовавшиеся в результате шизогонии мерозоиты Просветная форма — основная форма существо-
трансформируются в гаметоциты. Слияние разнопо- вания, образует цисты.
лых гаметоцитов приводит к образованию зиготы (оо- Цисты — неподвижные круглые (8-15 мкм) про-
цисты). Ооцисты — округлые образования с плотной зрачные образования, иногда содержат хроматоидные
оболочкой размером 9-14 мкм, выделяются с испраж- тельца (скопления РНК и протеинов). При окрашива-
нениями, длительно сохраняются в почве. нии раствором Люголя видны 4 ядра в виде колец.
В организме человека происходит бесполый цикл Жизненный цикл. Основной хозяин — человек.
размножения. Из ооцист выходят спорозоиты, активно Просветные формы амебы обитают в верхнем отделе
поглощаемые макрофагами (незавершенный фагоци- толстой кишки, питаясь бактериями и клеточным де-
тоз). С макрофагами они диссеминируют по лимфа- тритом. Пассивно передвигаясь с кишечным содержи-
тическим сосудам. В макрофагах происходит процесс мым, проникают в дистальные отделы кишечника и при
шизогонии, на поздней стадии которой макрофаги по- определенных условиях (обезвоживание, нарушение
гибают, а освободившиеся паразиты (тахизоиты) инва- микробного ценоза, изменение рН) образуют цисты.
Глава 6 73
Из кишечника цисты попадают в воду, на руки, Цисты неподвижные овальные, длина 10-14 мкм,
в пищу (переносятся мухами) и проникают в организм имеют 4 ядра и присасывательный диск, выделяются
человека. В тонкой кишке оболочка цисты растворяет- с испражнениями.
ся, каждое ядро делится, образуя 8 дочерних особей. Вызывают гиардиоз (лямблиоз), протекающий
Амебы проникают в подслизистую оболочку ки- в виде латентного паразитоносительства, проявляется
шечника, нарушая межклеточные взаимодействия, преимущественно в виде дисфункций кишечника.
образуют некротоксин, разрушающий эпителиальные Род Leishmania. Все виды этого рода — облигат-
клетки и вызывающие некроз прилежащих тканей. ные внутриклеточные паразиты млекопитающих, у че-
Амебы проникают в кровеносные и лимфатические ловека некоторые виды вызывают лейшманиозы. Вы-
сосуды, а из них и в другие органы. деляют 4 группы возбудителей.
Менее распространены другие патогенные 1. Группа L. tropica — возбудители кожного лейш-
виды саркодовых: Naegleria fowleri вызывает амеб- маниоза Старого Света (Африка, Азия).
ный менингоэнцефалит; амебы родов Acanthamoeba 2. Группа L. mexicana — возбудители кожных
и Hartmarella — возбудители спорадических заболе- и диффузных кожных лейшманиозов Нового Света
ваний, проявляющихся некротическими поражениями (Америка).
кожи, роговицы и внутренних органов, наиболее часто 3. Группа L. brasiliensis — возбудители кожно-
у ослабленных лиц или у пациентов с иммунодефици- слизистых лейшманиозов Нового Света.
тами. Они обитают в воде, колонизируют увлажните- 4. Группа L. donovani — возбудители висцераль-
ли кондиционеров, что может приводить к попаданию ного лейшманиоза Старого Света.
амеб в воздух. Жизненный цикл. Лейшмании проходят две стадии
развития: безжгутиковую и жгутиковую. Жгутиковые
6.3 Жгутиконосцы формы (промастиготы) подвижные развиваются в теле
насекомого переносчика (москита). Тело веретеноо-
Отличительной чертой представителей этого клас- бразное длиной 10-20 мкм. Размножаются продоль-
са является наличие жгутиков, обеспечивающих их ным делением.
движение. У некоторых видов эту функцию выполняет Безжгутиковые формы (амастиготы) паразитиру-
ундулирующая мембрана — тонкая перепонка, обра- ют в клетках млекопитающих. Клетки овальные дли-
зованная продольным соединением одного из жгути- ной 2-6 мкм. Размножаются простым делением.
ков с телом простейшего. Жгутиконосцы включают Переносчиком заболевания служат москиты ро-
большое количество видов, паразитирующих в орга- дов Phlebotomus и Lutzomyia, которые заражаются при
низме человека, однако патогенными признаны лишь кровососании на больных людях и животных. В пер-
некоторые из них. вые же сутки заглоченные амастиготы в кишечнике
Trichomonas vaginalis имеет грушевидное тело москита превращаются в промастиготы, размножают-
14-30 мкм длиной, удлиненное ядро, смещенное ся и через 6-8 сут. скапливаются в глотке москита. При
в передний конец и вакуолизированную цитоплазму. укусе человека или животного возбудитель внедряется
На переднем концу имеется 4 жгутика и ундулирую- в клетки кожи или внутренних органов (в зависимости
щая мембрана, доходящая до середины тела. Сквозь от вида лейшманий), где промастиготы превращаются
все тело проходит осевая нить — аксостиль, выступа- в амастиготы.
ющая на заднем конце в виде шипика. Род Trypanosoma. Все виды патогенны для мле-
Вызывает трихомоноз (трихомониаз), передаю- копитающих, у человека вызывают трипаносомозы,
щийся половым путем. инфекции, весьма напоминающие лейшманиозы. Жиз-
В организме человека обитают и другие трихо- ненный цикл возбудителя проходит в организме чело-
монады: T. tenax — комменсал ротовой полости и T. века и животных, у которых трипаносомы вызывают
hominis — комменсал толстой кишки. тяжелые, часто смертельные заболевания.
Giardia lamblia (Lamblia intestinalis) имеет гру- Тело трипаносом продолговатое, узкое, имеет
шевидное тело 5-15×9-21 мкм, толщина 2-4 мкм, су- жгутики и ундулирующую мембрану. Размножаются
ществует в виде вегетативной формы — трофозоита, исключительно бесполым путем — продольным либо
образует цисты. множественным делением (шизогония).
Трофозоиты имеют 2 ядра, 4 пары жгутиков, рас- Цикл развития связан с полиморфизмом и пере-
положенных сверху, снизу, сзади и на боковых поверх- меной хозяев. В кишечнике насекомых-переносчиков
ностях. В верхнепереднем отделе расположен при- трипаносомы существуют в форме эпимастигот — вы-
сасывательный диск, окруженный фибриллами, для тянутых клеток, у которых жгутик начинается в перед-
прикрепления к клеточному эпителию. Пищу всасыва- ней части тела, ундулирующая мембрана не выражена.
ют всей поверхностью тела. Размножаются продольным В крови человека и животных циркулируют трипома-
делением. Обитают в верхних отделах тонкой кишки. стиготы — удлиненные клетки, жгутик которых начи-
74 Глава 6
нается в задней части, ундулирующая мембрана выра- Balantidium coli, вызывающим балантидиаз (инфузор-
жена четко. ную дизентерию).
Выделяют африканские и американский трипа- Вегетативная форма представляет собой рес-
носомозы. Африканские трипаносомозы вызывает ничную инфузорию, тело вытянутое, яйцеобразное,
T. brucei (подвиды rhodosiense и gambiense). Перенос- 30−100 х 30−150 мкм. Питается бактериями, грибами
чиком является муха цеце (Glossina spp.). При крово- и другими пищевыми частицами, для заглатывания ко-
сосании трипомастиготы проникают в организм мухи, торых служит цитостом (клеточный рот), окруженный
превращаются в эпимастиготы и размножаются в ки- ресничками. Ядерный аппарат представлен большим
шечнике и слюнных железах. Через несколько недель и малым ядром.
в организме насекомого скапливаются дочерние попу- Цисты округлые с тонкой оболочкой, в окружаю-
ляции возбудителя, и оно становится способным пере- щей среде могут сохраняться несколько недель. B. coli
носить трипаносомы на млекопитающих. обитает в кишечнике свиней, для которых малопато-
Возбудителем американского трипаносомоза яв- генна. Цисты выделяются с испражнениями. Источник
ляется T. cruzi, переносчиками − клопы-хищники рода заражения — загрязненные вода и пища.
Triatoma. Жизненный цикл T. cruzi напоминает цикл Больных и носителей не следует рассматривать
прочих трипаносом, однако этот вид не образует три- как источник заражения, т. к. в организме человека
помастиготы, в клетках теплокровных размножение цисты образуются редко, а заражение вегетативными
происходит в форме амастигот. формами практически невозможно.
Dientamoeba fragilis длительное время считали
непатогенной амебой, позднее была установлена его Лечение протозойных инфекций
принадлежность к жгутиконосцам. Вызывает диареи. Метаболизм простейших как эукариотических
В кишечнике человека присутствует в амебовидной организмов близок к метаболизму высших животных,
безжгутиковой форме. Наличие цист не установлено, что уменьшает количество мишеней для фармакологи-
но доказан факт передачи заболевания от человека че- ческого воздействия, и делает простейших нечувстви-
ловеку. тельными к большинству антибактериальных препа-
ратов. Способность к формированию резистентности
6.4 Инфузории у простейших, особенно у малярийных плазмодиев,
выражена более чем у бактерий.
Из всех видов инфузорий, обитающих в кишечни- Основные препараты для лечения протозойных
ке человека, безусловно патогенным видом является инфекций приведены в таблице 18.
Глава 6 75
Глава 7. ОСНОВЫ ПАТОГЕННОСТИ
МИКРООРГАНИЗМОВ.
ИНФЕКЦИОННЫЕ БОЛЕЗНИ
76 Глава 7
эндотоксинов. Корд-фактор (липид, димиколат тре- ки, чаще — внешней мембраны грамотрицательных
гользы) обеспечивает склеивание клеток, их кислото- бактерий. Важную роль в токсичности этих веществ
устойчивость. Fc-рецепторные белки, неспецифиче- играет липид А. Их токсичность проявляется значи-
ски связывающие иммуноглобулин, защищают клетку тельно в более высоких концентрациях, чем экзоток-
от действия специфических антител, подавляют фаго- синов. Эндотоксины обладают пирогенным действи-
цитоз и иммунный ответ, инактивируют систему ком- ем, на чем основан метод их определения, например,
племента. в инъекционных растворах. Эндотоксины способны
• Ворсинки (пили) обеспечивают адгезию клеток активировать систему комплемента, систему сверты-
и образование микроколоний. Адгезия происходит вания крови, влияют на ферментные системы организ-
за счет особых белков или гликопротеинов, назван- ма, нарушая углеводный обмен, функции печени и др.
ных адгезинами, которые расположены на клеточной Рецепторы эндотоксинов присутствуют на мембранах
поверхности, часто на пилях, и взаимодействуют с эу- тромбоцитов, макрофагов, лимфоцитов, эндотелия ка-
кариотической клеткой по типу лектинов, осущест- пилляров. Действие эндотоксинов зависит от их кон-
вляющих углевод-белковое узнавание. Такое взаи- центрации: в малых дозах они способны активировать
модействие является лиганд-рецепторным, где роль фагоцитоз и другие защитные реакции организма,
лиганда выполняет адгезин, а рецептора — соответ- с чем связано применение некоторых из них в качестве
ствующая структура углеводной природы на клетке иммуномодуляторов (пирогенал).
хозяина. Механизм биологического узнавания лежит Ферменты патогенности катализируют реак-
в основе специфичности как процесса поражения тка- ции, ведущие к образованию токсичных продуктов
ни микробом, так и функционирования защитных сил или разрушению клеток и тканей организма.
организма. Лецитиназа С (фосфолипаза) Clostridium
• Подвижность является существенным фактором perfringens гидролизует лецитин (фосфолипид) кле-
инвазии, она обеспечивает проникновение микроорга- точных мембран, повреждая эритроциты, и другие
низмов в клетки и ткани. клетки, вызывая некроз тканей.
Токсины. По локализации различают экзо- и эндо- Нейраминидаза холерного вибриона, возбуди-
токсины. Экзотоксины синтезируются возбудителями телей анаэробной инфекции, стрептококков, вируса
столбняка, ботулизма, анаэробной инфекции, дифте- гриппа и др. гидролизует соединения, содержащие
рии, коклюша, холеры, чумы, а также некоторыми ви- сиаловые кислоты. Эти вещества обусловливают вяз-
дами шигелл, стафилококков, стрептококков, псевдо- кость органических жидкостей, участвуют в агрегации
монад и др. Это протеины, которые вырабатываются клеток, процессах биологического узнавания, внутри-
клеткой в виде неактивных предшественников, их акти- клеточного транспорта и др., поэтому действие нейра-
вация проходит по типу ограниченного протеолиза под минидазы может привести к нарушению разнообраз-
действием ферментов микробной клетки или хозяина. ных функций организма.
В результате активации токсины приобретают фермен- Фибринолизин и гиалуронидаза стрептокок-
тативную активность АДФ-рибозилтрансферазы, ко- ков и других микроорганизмов являются фактора-
торая запускает каскад реакций, ведущих к нарушению ми распространения, облегчая микробным клеткам
синтеза циклического АМФ, следовательно, к наруше- проникновение в ткани организма. Гиалуронидаза
нию регуляции синтеза белка в клетке хозяина. Мно- гидролизует гиалуроновую кислоту — сложный муко-
гие экзотоксины обладают избирательным действием полисахарид, придающий вязкость межклеточному ве-
на органы и ткани: дифтерийный токсин повреждает ществу. Поэтому фермент может быть использован для
надпочечники и мышцу сердца, столбнячный — дви- совместного введения с лекарственными препаратами
гательные нервные клетки. Экзотоксины действуют для ускорения их проникновения в ткани, для ликви-
на восприимчивый организм в малых дозах, например, дации рубцов и т. п.
в 1 мл дифтерийного токсина содержится 10000 Dlm Гемолизины и лейкоцидины стафилококков
для морской свинки (Dlm токсина — его минимальная и стрептококков разрушают эритроциты и лейкоциты.
доза, которая убивает подопытное животное). Некото- Плазмокоагулаза стафилококков и других микроор-
рые из них термоустойчивы, не разрушаются под вли- ганизмов — пептидаза, активирующая систему сверты-
янием пищеварительных ферментов (ботулинический, вания крови путем каталитического превращения про-
стафилококковый). Воздействие формалина, блокиру- тромбина в тромбин, обеспечивает создание защитного
ющего аминогруппы активного центра, приводит к по- фибринового чехла вокруг микробных клеток.
тере токсичности, что используется для приготовления Уреаза пневмококков, клебсиелл, иерсиний гидро-
вакциных препаратов — анатоксинов. лизует амиды с образованием токсичного иона аммо-
Эндотоксины прочно связаны с клеткой и мо- ния.
гут выделяться в среду только после ее разрушения. Декарбоксилазы возбудителей анаэробной инфек-
Обычно это гликоконъюгаты (липополисахариды, ции и других микроорганизмов катализируют реакции
гликопротеины, гликолипопротеины) клеточной стен- с образованием токсичных аминов.
Глава 7 77
7.3 Инфекционные болезни акций хозяина. При установлении равновесия между
факторами агрессии возбудителя и защитными силами
Инфекционные болезни — это группа заболе- организма болезнь может протекать без явных призна-
ваний, вызываемых патогенными микроорганизма- ков (латентно) или вообще не проявляться. В условиях,
ми — вирусами, бактериями, простейшими. Общим снижающих резистентность (стресс, переохлаждение,
признаком для большинства инфекционных болезней нарушение питания и т. п.) микроорганизмы приобре-
является возможность передачи возбудителя от больно- тают возможность оказывать патогенное действие.
го здоровому и возможность их массового (эпидемиче- Период предвестников болезни — продромальный
ского) распространения. В результате взаимодействия характеризуется проявлением самых начальных не-
с возбудителем в организме развивается совокупность специфических признаков болезни (недомогание, лег-
физиологических (адаптационных) и патологических кая лихорадка).
процессов, сопровождающихся нарушением гомеоста- В стационарном периоде проявляются основные
за. Симбиотические взаимоотношения, наносящие хо- симптомы, характерные для данного заболевания.
зяину вред, называют антагонистическим симбиозом, Иногда болезнь может протекать атипично, например,
крайним проявлением которого является паразитизм. при интенсивном лечении антибиотиками.
Облигатными внутриклеточными паразитами являют- В период угасания болезни наблюдается снижение
ся вирусы, риккетсии и хламидии. интенсивности патологических процессов, исчезно-
Источником инфекции является среда, в которой вение ее клинических признаков. Период угасания
возбудитель заболевания может обитать и размножать- болезни заканчивается выздоровлением или перехо-
ся в естественных условиях. Заболевания, основным дом в хроническое состояние. После выздоровления
источником возбудителя которого является человек, человек может оставаться носителем инфекционного
называются антропонозами; заболевания, передаю- агента.
щиеся от животных — зоонозам; заболевания, вы- Тактика лечения строится в зависимости от пери-
званные микроорганизмами, обитающими в воде, по- ода инфекционной болезни. Большое значение имеют
чве и других объектах внешней среды — сапронозы. профилактические мероприятия: соблюдение правил
Возможны случаи заражения из разных источников санитарии и гигиены, здоровый образ жизни, закали-
(от человека или животного и от зараженных объек- вание организма, а также профилактическая вакцина-
тов внешней среды, благоприятных для размножения ция.
возбудителя): почва может служить источником возбу- Формы инфекционных заболеваний
дителей сальмонеллезов, дизентерии, сибирской язвы, По источнику инфекционного агента различают
столбняка, анаэробной инфекции; вода — кишечных экзогенную инфекцию (при внесении возбудителя из-
инфекций, туляремии, гепатита А; пищевые продук- вне) и эндогенную, которая возникает в результате ак-
ты — кишечных инфекций, туберкулеза, бруцеллеза, тивации собственной микробиоты при нарушении от-
скарлатины, дифтерии, пищевых токсикоинфекций. носительного постоянства ее состава (дисбактериоз)
Пути проникновения инфекционного агента и воздействия внешних факторов, снижающих рези-
в организм определяются его природой. Возбудите- стентность. К эндогенным инфекциям относятся анги-
ли кишечных инфекций проникают через рот с водой на, аппендицит, холецистит, остеомиелит, гнойничко-
и пищей; респираторных — через дыхательные пути; вые заболевания кожи и др.
через кровь (укусы насекомых, загрязненные инстру- По локализации в организме инфекционные бо-
менты, инъекционные растворы) передаются маля- лезни подразделяют на очаговые (местные) и генера-
рия, риккетсиозы, энцефалит, СПИД, гепатит В и др.; лизованные (общие). В неблагоприятных для больного
через кожу и слизистые оболочки — дерматомикозы, условиях местная инфекция может перейти в генера-
венерические болезни. Возбудители чумы, сибирской лизованную, например, при фурункулезе, туберкулезе,
язвы, туберкулеза, дифтерии, скарлатины способны сифилисе, кандидозе и др.
проникать в организм любым из перечисленных пу- При распространении микробов или их токсинов
тей. Некоторые заболевания способны передаваться по всему организму говорят о бактериемии, вирусе-
от матери плоду, т. е. вертикально. Передача возбудите- мии, септицемии, токсинемии.
ля (сифилиса, гонореи, брюшного и возвратного тифа, По типу инфицирующих агентов различают мо-
токсоплазмоза, стафилококков и др.) может осущест- ноинфекцию и смешанную инфекцию. Последние от-
вляться через плаценту или при прохождении через личаются качественно иным течением по сравнению
родовые пути. с моноинфекциями, а взаимоотношения возбудителей
Периоды развития инфекционной болезни. Пе- достаточно вариабельны. Наиболее неблагоприятны
риод от момента заражения до появления первых при- для больного симбиотические отношения, например,
знаков заболевания называется инкубационным. В этот между трихомонадами и гонококками, когда бактерии
период происходит размножение возбудителя, синтез поселяются в клетках простейших, осложняя лечение
микробных токсинов, а также развитие защитных ре- заболевания.
78 Глава 7
Повторные проявления заболевания характеризу- ствие характерных признаков заболевания затруд-
ются как вторичная инфекция при осложнении после няет диагностику, а, следовательно, выбор средств
первого заболевания, например, бактериальная пнев- лечения и организацию противоэпидемических ме-
мония после гриппа или кори; реинфекция — повтор- роприятий.
ное заражение тем же видом микроорганизма после По степени распространения среди населения ин-
выздоровления, например, при венерических заболе- фекционные заболевания могут быть спорадически-
ваниях; рецидив — возобновление болезни после кли- ми (появление отдельных случаев) и эпидемическими
нического выздоровления, вызванное персистирую- (превышающими средний уровень спорадической за-
щими возбудителями. болеваемости). Последнюю форму заболеваний среди
По продолжительности пребывания инфекцион- животных называют эпизоотией. Когда эпидемия до-
ного агента в организме различают острые, хрони- стигает чрезвычайно больших размеров и охватывает
ческие, персистирующие инфекции и микробоноси- страны и континенты, говорят о пандемии. Эндемиче-
тельство. Персистенция (persistence — постоянство) скими называют инфекции, возбудитель которых дли-
характеризуется длительным сохранением микро- тельное время сохраняется в какой-либо местности
организмов в организме хозяина. Наблюдается при (клещевой энцефалит, туляремия, малярия и др.).
гепатите В, герпесе, краснухе, туберкулезе, малярии, Эпидемиология инфекционных заболеваний.
токсоплазмозе и др. Бактерии могут персистировать Инфекционные заболевания могут распростра-
в виде L-форм и интактных клеток в тканях и клетках няться вертикально (от одного поколения к другому)
организма, в том числе в макрофагах. Способность и горизонтально (среди неродственных членов попу-
персистировать в макрофагах присуща всем неспороо- ляции). В последнем случае заражение может проис-
бразующим микроорганизмам — возбудителям антро- ходить из какого-то общего источника (вода, пищевые
понозных инфекций, являясь одним из факторов их продукты) или от человека к человеку, когда каждый
выживания и сохранения вида. Персистенции способ- индивидуум служит источником инфекции для других.
ствуют такие механизмы защиты и агрессии микро- При заражении из общего источника наблюдается
организма, как молекулярная мимикрия, способность резкий скачок заболеваемости, сходные инкубацион-
инактивировать лизоцим, комплемент, иммуноглобу- ный период и течение инфекционной болезни у всех
лины и другие важные белковые молекулы с помощью больных. При передаче инфекционного агента от боль-
внеклеточных протеаз. ного здоровому происходит постепенное нарастание
Микробоносительство — одна из форм взаимо- числа заболевших, а инкубационный период и течение
отношений между микро- и макроорганизмом при болезни зависят от индивидуальной чувствительности
которой не наблюдается явных признаков болезни. индивидуума.
Оно связано с относительной невосприимчивостью Факторы, определяющие возникновение эпиде-
организма или с низким уровнем иммунитета (толе- мии, это
рантностью), характерно для кишечных инфекций, а) инфекциозность возбудителя (способность
скарлатины, менингита, малярии, полиомиелита и др.; к быстрому распространению и преодолению защит-
возникает у переболевших или у здоровых, бывших ных сил организма);
в контакте с больными. б) плотность популяции в данном регионе;
Все носители являются эпидемически опасными. в) число чувствительных индивидуумов в данной
Лечение, как персистирующих инфекций, так и микро- популяции.
боносительства направлено на стимуляцию иммунной Изменение хотя бы одного из этих факторов вли-
системы организма. яет на возможность возникновения эпидемии. Напри-
По проявлению признаков различают явные мер, эпидемические вспышки кори, ветряной оспы
и скрытые (латентные, бессимптомные) заболева- в начале осени среди детей, возвращающихся в школу
ния. При неблагоприятных для человека условиях после каникул, связаны с концентрацией чувствитель-
скрытая инфекция может перейти в явную. Бессим- ных индивидуумов в одном месте. Возможность воз-
птомные или атипичные инфекционные заболевания никновения эпидемии снижают или предотвращают
появляются при лечении антибиотиками и другими профилактические прививки (снижение числа людей,
активными антимикробными препаратами. Отсут- чувствительных к данному заболеванию).
Глава 7 79
ЧАСТЬ II
АНТИМИКРОБНЫЕ АГЕНТЫ
Глава 8. АНТИБИОТИКИ И СИНТЕТИЧЕСКИЕ
ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ
ПРЕПАРАТЫ
Глава 8 83
Пенициллины
Таблица 19.
Устойчив к β-лактамазе Активен против
Эффективен при
Пенициллин St. aureus Г− бактерий Г− бактерий, кроме Pseudomonas
оральном применении
P. aeruginosa aeruginosa
Бензилпенициллин − − − − −
Феноксиметилпеници-ллин + − − − −
Метициллин − + + − −
Оксациллин + + + − −
Клоксациллин + + + − −
Флуклоксациллин + + + − −
Ампициллин + − − + −
Амоксициллин + − − + −
Карбенициллин − − + + +
Тикарциллин − − + + +
Карфециллин 1∗ + − + + +
Инданил карбенициллин∗ + − + + +
Пивампициллин 2∗∗ + − − + −
Талампициллин∗∗ + − − + −
Бакампициллин∗∗ + − − + −
Пиперациллин 3∗∗∗ − − − + +
Азлоциллин∗∗∗ − − − + +
Мезлоциллин∗∗∗ − − − + +
Мециллинам 4∗∗∗∗ − •• − + −
Пивлюциллинам∗∗∗∗ + •• − + −
∗
− эфиры карбенициллина;
∗∗
− эфиры ампициллина;
∗∗∗
− замещенные ампициллины;
∗∗∗∗
− 6-β-амидинопенициллины;
••
− не действуют на Г+ бактерии.
спектр антибактериальной активности не действуют В клинической практике используют аугментин —
на грамположительные микроорганизмы, как класси- комбинированный препарат клавулановой кислоты
ческие пенициллины, а лишь на грамотрицательные. с амоксициллином − полусинтетическим пеницил-
лином, обладающим широким спектром действия,
8.1.2 Цефалоспорины но чувствительным к β-лактамазе.
Цефалоспорины (цефемы), подобно пенициллинам,
относят к группе β-лактамных антибиотиков. Они имеют
более широкий спектр действия по сравнению с пеницил-
линами и более устойчивы к β-лактамазам. Люди, страда-
ющие аллергией к пенициллину, обычно не чувствитель-
ны к цефемам. Продуцентом природного антибиотика
цефалоспорина С является гриб Acremonium chrysogenum,
первоначально названный Cephalosporium acremonium.
На основе природного цефалоспорина получены много-
численные полусинтетические препараты (рис. 44).
Клавамы отличаются от пенициллинов (рис. 45)
замещением серы в тиазолидиновом кольце пеницил-
лина на кислород в оксазолидиновом кольце клавама
и отсутствием боковой цепи в 6-м положении. Кла-
вулановая кислота (рис. 45, А), продуцентом которой
является Streptomyces clavuligerus, обладает низкой
антибактериальной активностью, но является силь-
ным ингибитором стафилококковой β-лактамазы
и большинства типов β-лактамаз, продуцируемых гра-
мотрицательными бактериями, особенно с «пеницил-
линазной», но не «цефалоспориназной» активностью. Рис. 44. Структура цефалоспоринов.
84 Глава 8
А B Другие β-лактамы. Производные пенициллановой
кислоты, например, сульфон- и бромопенициллановые
кислоты (рис. 46, С, D, Е) являются ингибиторами не-
которых типов β-лактамаз.
D
E
C 8.1.3 Тетрациклины
Тетрациклины продуцируются некоторыми ви-
дами стрептомицетов, а также получаются как полу-
Рис. 45. Клавамы: А — клавулановая кислота; В — ла- синтетические препараты (рис. 47). Так хлортетра-
тамоксеф; С — карбапенемы; D — оливано- циклин образуется при ферментации S. aureofaciens,
вые кислоты; Е — тиенамицин. из него путем каталитического гидрогенизирования
получают тетрациклин и кломоциклин. Химическая
В 1-оксацефемах атом серы в дигидротиазиновом модификация тетрациклина дает миноциклин. Окси-
кольце цефалоспорина замещен кислородом. Такая тетрациклин продуцируется S. rimosus, из него по-
молекула чувствительна к β-лактамазам, однако, вве- лучают метациклин, гидрогенизация которого дает
дение 7-α-метоксигруппы (как у цефокситина), делает доксициклин. Мутант Str. aureofaciens продуцирует
соединение более стабильным. К этой же группе при- метилхлортетрациклин. Тиатетрациклины, напри-
надлежит латамоксеф (рис. 45, В) − антибиотик широ- мер, тиациклин, содержат атом серы в 6-м положе-
кого спектра, устойчивый к β-лактамазам. нии молекулы, активны против бактерий, устойчивых
Карбапенемы (рис. 45, С) являются аналогами к тетрациклину. В настоящее время природные тетра-
пенициллинов или клавамов, у которых атом серы циклины практически не применяются, их вытеснили
(пенициллинов) или кислорода (клавамов) замещен полусинтетические препараты (доксициклин и мино-
углеродом. К ним принадлежат оливановые кислоты циклин).
(рис. 45, D), продуцируемые Streptomyces olivaceus −
антибиотики широкого спектра, сильные ингибиторы
β-лактамаз, а также тиенамицин (рис. 45, Е), облада-
ющий такими же свойствами, но нестабильный. Его
производные N-формимидоилтиенамицин лишен это-
го недостатка.
Нокардицины (А — Д) продуцируются Nocardia
sp., наиболее активен антибиотик широкого спектра
нокардицин А (рис. 46, А).
B C
D Рис. 47. Тетрациклины: 1 — окситетрациклин; 2 —
хлортетрациклин; 3 — тетрациклин; 4 — де-
Рис. 46. А — Нокардицин А; В — азтреонам; С — суль- метилхлортетрациклин; 5 — доксициклин;
фонпенициллановая кислота (Na соль); D — 6 — метациклин; 7 — кломоциклин; 8 — мино-
бромопенициллановая кислота (Na соль). циклин; 9 — тиациклин.
Глава 8 85
8.1.4 Рифапицины лолеандомицин и спирамицин. Эритромицин (рис. 50),
продуцентом которого является Streptomyces erythreus,
Рифапицины в виде комплекса антибиотиков про-
активен против грамположительных бактерий, нейссе-
дуцирует Streptomyces mediterranei, из них наиболее
рий, Haemophilus influenzae и Legionella pneumophila,
перспективен рифампицин В, на основе которого соз-
но не действует на энтеробактерии. Его активность
дан полусинтетический аналог рифампицин (рис. 48).
увеличивается с повышением рН до 8,5, тиоцианит
эритромицина более стабилен, чем свободное основа-
ние в кислой среде желудка и применяется орально,
он длительно сохраняется в крови и более эффективно
проникает в ткани, чем другие формы; in vivo гидроли-
зуется до свободного основания.
86 Глава 8
8.1.7 Полипептидные антибиотики 8.1.8 Другие антибактериальные
антибиотики
Полипептидные антибиотики представляют до-
вольно разнообразную группу соединений, син- Описанные ниже антибиотики (рис. 51) не могут
тезируемых бациллами и актиномицетами. Они быть отнесены ни к одной рассмотренной ранее группе.
включают бацитрацин, активный против грамполо-
жительных и грамотрицательных кокков, но не бак- A B
терий; полимиксины, активные против многих грамо-
трицательных бактерий, исключая Serratia marcescens
и Protеus spp.; капреомицин и виомицин, действующие
на Mycobacterium tulerculosis.
Бацитрацин из-за высокой токсичности разрешен
к применению только в случаях крайней необходимо-
сти.
C D
Полимиксины обладают нефротоксичностью,
в меньшей степени токсичны полимиксины В и Е (ко-
листин). Для парентерального введения используют
сульфометат натрия колистина. Натрия сульфомик-
син — смесь сульфометилированного полимиксина
В и натрия бисульфита менее токсичен, чем полимик-
сина В сульфат при сохранении его активности.
Катионные пептиды — новый класс антибиоти-
ков, получаемых как из природных источников, так
и химическим синтезом. В природе они присутствуют Альтернативная форма
повсюду — у бактерий, грибов, растений, животных
C D
и человека.
У человека катионные пептиды (дефенси-
ны) представлены группой пептидов, содержащих
от 23 до 35 аминокислот; присутствуют в лейкоцитах
и других тканях, активны против бактерий, простей-
ших, грибов и вирусов, обладают хемотаксической ак-
тивностью. Рис. 51. Антибиотики: А — хлорамфеникол; В — фузи-
У растений это тионины, которые образуются диевая кислота; С — линкомицин; Д — клин-
в ответ на инфекцию, активны против некоторых бак- дамицин.
терий и грибов.
У бактерий они выполняют функции бактерио- Хлорамфеникол (левомицетин), синтезируемый S.
цинов: колицин E. coli, низин Lactococcus lactis, суб- venezuelae, антибиотик широкого спектра, оказывает
тиллин B. subtilis и др. Они менее активны по срав- только бактериостатическое действие, активен против
нению с другими антибиотиками, однако, действуют спирохет, риккетсий, хламидий. У части пациентов вы-
на устойчивые к другим антибиотикам штаммы, вызы- зывает апластическую анемию, поэтому рекомендован
вают быструю гибель микроорганизмов, индуцируют к применению только при отсутствии альтернативных
развитие резистентности. средств. Его фторированные производные активны
Катионные пептиды нейтрализуют отрицатель- против резистентных микроорганизмов.
ный заряд липополисахаридов бактерий, связываются Фузидиевая кислота, выделяется из культуры
с ними, препятствуя их взаимодействию с клетками гриба Fusidium coccineum, используемая в форме на-
организма, предотвращая таким образом развитие эн- триевой соли, активна против грамположительных
дотоксического шока у пациентов. бактерий, особенно стафилококков, хотя стрептокок-
Катионные пептиды слабоиммуногенны, так как ки относительно устойчивы. Действует на полирези-
имеют общие антигены с макроорганизмом. Разруша- стентные штаммы стафилококков, однако, и к этому
ются пептидазами кишечника, поэтому не попадают препарату могут появляться устойчивые формы бак-
в окружающую среду. терий.
Низин получают при ферментации L. lactis или Линкомицины. Линкомицин (продуцент S.
рекомбинантного штамма B. subtilis, используют для lincolniensis) и его синтетический аналог клиндамицин
консервации пищевых продуктов, для лечения мастита по спектру активности сходны с макролидами, однако,
у коров. не эффективны в отношении E. coli. Применение клин-
Глава 8 87
дамицина сопряжено в риском чрезмерного размноже- циклических липопептидов, различающихся боковы-
ния в кишечнике Clostridium difficile — возбудителя ми радикалами (остатками жирных кислот) у гекса-
диарейной инфекции. Возможна перекрестная рези- пептидного кольца. Считают, что в ближайшем буду-
стентность между линкомицинами и эритромицином. щем они найдут клиническое применение.
C Сульфаниламид Сульфадимидин
Сульфадиазин Сульфаметоксазол
Рис. 52. Антифунгальные антибиотики: А — гризео-
фульвин; В — нистатин; С — амфотерицин
В (R=Н) и его метиловый эфир (R=СН3).
Рис. 53. Сульфонамиды.
Гризеофульвин продуцируется Penicillium
Сульфонамиды различаются по способности вса-
griseofulvum, активен против дерматофитов, не дей-
сываться из желудочно-кишечного тракта, например,
ствует на Candida spp. и бактерии. Применяется ораль-
сульфадимидин и сульфадиазин всасываются быстро,
но в форме таблеток. Проникает в глубокие слои кожи
тогда как сукцинилсульфатиазон и фталилсульфатиа-
и кератин волос, поэтому эффективен при терапии
зол − очень плохо.
дерматомикозов.
Их используют при лечении различных инфекци-
Полиены. Полиеновые антибиотики продуциру-
онных заболеваний, вызванных грамположительными
ются стрептомицетами, характеризуются наличием
и грамотрицательными микроорганизмами.
в своей структуре большого лактонного кольца и ги-
Производные диаминопиримидина (рис. 54)
дрофобной области, состоящей из последовательности
составляют группу веществ с противоопухолевой
от 4 до 7 конъюгированных двойных связей. Наиболее
(метотрексат), антипротозойной (пириметамин)
важные из них — амфотерицин В и нистатин.
и антибактериальной (триметоприм, тетроксоприм)
Нистатин активен против Candida spp. и при-
активностью. Последние обладают широким спектром
меняется при кандидозе ротовой полости и желудоч-
действия, однако, к ним появляются резистентные
но-кишечного тракта, поскольку плохо всасывается
формы бактерий.
из кишечника и неэффективен при других формах кан-
дидоза.
Амфотерицин В эффективен при системных ми- Триметоприм Тетроксоприм
козах. Плохо всасывается из кишечника, поэтому его
вводят внутривенно под строгим медицинским кон-
тролем, учитывая его нефротоксичность. Метиловый
эфир амфотерицина менее токсичен с сохранением
антифунгальной активности. Рис. 54. Диаминобензилпиримидины.
Эхинокандины — новый класс антибиотиков,
представленный многочисленными продуктами фер- Производные изоникотиновой кислоты (изо-
ментации Aspergillus nidulans и A. rugulosus и их полу- ниазид, этионамид, протионамид) как и параамино-
синтетическими аналогами. Активны против грибов салициловая кислота (рис. 55) эффективны против
рода Candida, Aspergillus, Pneumocystis. Это семейство микобактерий, применяются при туберкулезе. Этиона-
88 Глава 8
мид менее активен, чем изониазид, однако действует Налидиксовая кислота действует только на гра-
на устойчивые к изониазиду штаммы бактерий. Про- мотрицательные бактерии, тогда как новые про-
тионамид по активности не отличается от этионамида, изводные активны также против стафилококков,
но лучше переносится больными. но не стрептококков. Норфлоксацин обладает широ-
ким спектром действия, концентрируется в моче при
оральном применении, что делает его перспективным
средством при лечении инфекций мочевыводящей
системы.
Производные имидазола (рис. 57). Метронида-
зол угнетает рост патогенных простейших, напри-
А B C D E
мер, Trichomonas vaginalis и Entamoebа histolyticum.
Рис. 55. Парааминосалициловая кислота (А); произво- При оральном применении высокоэффективен при
дные изоникотиновой кислоты: изониазид (В), урогенитальных инфекциях, вызванных T. vaginalis.
этионамид (С), протионамид (Д) и пиразина- Эффективен против анаэробных бактерий и факуль-
мид (Е). тативных анаэробов в анаэробных, но не аэробных
условиях. Вводится орально или в форме суппозито-
Пиразинкарбоновой кислоты амид − пиразина- риев.
мид (рис. 55) действует на туберкулезные бактерии,
устойчивые к другим противотуберкулезным препара-
там.
Соединения нитрафурана. Синтезировано не-
сколько сотен соединений нитрофурана, однако, те-
рапевтическими свойствами обладают лишь немно-
гие из них. При этом важное значение имеет наличие
группы ―СН═N― у С−2 и нитрогруппы у С−5, менее А B C
существенно наличие ―СН═СН― у С−2. Биологиче-
ская активность утрачивается, если (а) редуцировано
нитрокольцо, (б) гидролизована связь ―СН═N― или
(в) окислена связь ―СН═СН―.
Нитрофураны действуют на широкий спектр
микроорганизмов. Фуразолидон высокоэффективен
против энтеробактерий и применяется при лечении
диареи и желудочно-кишечных расстройств бактери- D E
альной этиологии. Нитрофурантион используют при
инфекции мочевыводящих путей, поскольку препарат
концентрируется в моче. Он наиболее активен при
кислом значении рН. Нитрофуразон в основном ис- Рис. 57. Производные имидазола: А — метронидазол,
В — клотриазол, С — миконазол, Д — экона-
пользуют местно при обработке ран и ожогов, а также
зол, Е — кетоконазол.
некоторых типов заболеваний уха.
Хинолоны. Налидиксовая кислота применялась
Клотримазол, миконазол, эконазол, кетоконазол
некоторое время для лечения инфекций мочевого трак-
активны против патогенных грибов и некоторых бак-
та. В дальнейшем были синтезированы другие, более
терий, применяются местно. Не отмечено развития ре-
активные производные 4-хинолона: ципрофлоксацин,
зистентности in vitro или in vivo.
норфлоксацин, оксолиновая кислота, офлоксацин, ци-
5-фторцитозин (рис. 58) с наибольшей актив-
ноксацин и др. (рис. 56).
ностью действует на дрожжевые грибы — Candida
и Cryptococcus.
А B C
Рис. 56. Хинолоны: А — норфлоксацин, В — налидик-
совая кислота, С — циноксацин. Рис. 58. 5-фторцитозин.
Глава 8 89
Глава 9. ПРОИЗВОДСТВО
ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ
ПРЕПАРАТОВ
90 Глава 9
гигиене и другие условия производства. Регламент яв- в которых содержание исходной субстанции снижено
ляется законом производства, отступление от него не- до ничтожных значений.
допустимо. За соблюдением регламента следит отдел Для современной фармацевтической промышлен-
технического контроля. ности характерно непрерывное совершенствование
В фармацевтическом производстве технологиче- и комплексное применение новых технологических
ские процессы подразделяются на химические, связан- подходов, основанных на понимании механизма дей-
ные с химическим синтезом лекарственных веществ ствия и фармакологического эффекта лекарственного
и физические. К последним относятся механические, вещества и направленных к общей цели — созданию
связанные с обработкой твердых материалов (из- более эффективных и безопасных медицинских пре-
мельчение, просеивание, смешивание, дозирование, паратов.
прессование), гидромеханические (перемешивание Современное фармацевтическое производство
жидкостей, эмульгирование, фильтрование), тепловые требует от персонала понимания смысла и значения
(испарение, конденсация, плавление), массообменные каждой ступени технологического процесса и строгого
(растворение, кристаллизация, сушка, экстракция, рек- контроля выполнения требований регламента. В связи
тификация). Все эти процессы требуют соответству- с этим центральное место в общем направлении раз-
ющего аппаратурного оформления, т. е. выполняются вития фармацевтической технологии наряду с химией
с использованием специальных машин и аппаратов. и биотехнологией принадлежит микробиологии, науч-
Основным исходным материалом для изготовле- ный поиск и развитие этих направлений определяют
ния лекарственных препаратов являются активные успех развития всей отрасли.
фармацевтические субстанции, которые могут быть Существенная часть требований к качеству фар-
получены путем химического или биологического мацевтической продукции и к условиям производства
синтеза, а также путем переработки лекарственного контролируется микробиологом: стерильность, ми-
растительного сырья или тканей и органов животных. кробная контаминация сырья и нестерильных лекар-
Лекарственные препараты имеют определенную ственных средств, соблюдение правил производствен-
лекарственную форму, т. е. удобное для применения ной гигиены, предусмотренных GMP. Эти требования
состояние. Существуют твердые (порошки, таблет- должны быть хорошо известны всем участникам про-
ки, гранулы), жидкие (растворы, суспензии, эмуль- изводственного процесса и неукоснительно соблю-
сии) и мягкие (мази, суппозитории) лекарственные даться с сознанием важности тщательного выполне-
формы. Этапы химического синтеза определенного ния каждого из них.
лекарственного вещества могут включать процессы С появлением фармацевтических препаратов, по-
смешивания ингредиентов реакции, их термической лучаемых с использованием методов генетической ин-
обработки, экстракционного или хроматографическо- женерии, более 80% стерильных лекарственных форм
го разделения продуктов реакции, упаривания, кри- готовят асептично, поскольку эти вещества лабильны
сталлизации, сушки и т. п. и не могут быть простерилизованы в готовом виде.
Основные этапы микробиологического синтеза Лекарственные препараты, приготовленные с исполь-
антибиотиков, ферментов, органических кислот и т. п. зованием асептичной технологии, превосходят по сво-
показаны на схеме (рис. 59). ему качеству препараты, производимые ранее.
Из лекарственного растительного сырья готовят Техникой работы в асептичных условиях должны
сборы, порошки, настойки, экстракты, а также полу- владеть не только микробиологи, но и химики, а также
чают максимально очищенные экстракционные препа- весь персонал, от которого зависит выпуск микробио-
раты или препараты индивидуальных веществ. логически безопасной продукции.
Из животного сырья получают гормоны, фермен-
ты и препараты неспецифического действия. Они мо- 9.2 Производство антибиотиков
гут представлять собой высушенные, обезжиренные
и измельченные ткани или экстракты (максимально Получение препаратов антибиотиков − сложный
очищенные или препараты индивидуальных веществ). и многоступенчатый процесс. Он слагается из ком-
В основу гомеопатической фармации положен плекса последовательных исследований, которые мож-
принцип потенцирования (динамизации) — особая но свести в основном к следующим этапам:
технология приготовления гомеопатических лекарств. 1) изыскание микроорганизмов-антагонистов
Сущность этого принципа состоит в том, что процесс в природе и выделение их в чистую культуру;
включает в себя поэтапное снижение концентрации 2) изучение спектра действия и определение ан-
исходного гомеопатического вещества в носителе тибиотической активности выделенных культур анта-
(растворе или порошке) в 10 или 100 раз на каждом гонистов;
этапе путем интенсивного встряхивания, растирания 3) подбор условий культивирования продуцентов
и перемешивания. В результате получают препараты, антибиотиков;
Глава 9 91
4) первичная идентификация антибиотика на ран- в) культивирование идиотрофа на среде, содержа-
них этапах изучения; щей мутасинтон. При этом идиотроф включает мута-
5) выделение и химическая очистка активно синтон в молекулу продуцируемого им антибиотика.
действующего начала из культуральной жидкости В результате получаются новые (мутасинтетические)
и клеток, а также сравнение полученного антибио- структуры.
тика по биологическим и химическим показателям 5) Получение гибридных антибиотиков, т. е. ве-
с уже известными препаратами для выявления новых ществ, продуцируемых генетическими гибридами; ги-
свойств полученных веществ; бридный антибиотик может содержать структуры двух
6) изучение механизма действия и испытание ток- различных метаболитов. От антибиотиков, получаемых
сических и лечебных качеств антибиотиков на живот- перечисленными выше методами, они отличаются тем,
ных; что представляют собой продукт комбинации генов.
7) разработка технологии получения антибиотика Основные этапы получения гибридных антибио-
в лаборатории и внедрение ее в промышленное произ- тиков:
водство; а) выбор продуцента, образующего известный
8) получение из исходных штаммов новых гено- антибиотик;
типов микроорганизмов, обладающих повышенной б) изыскание нового микроорганизма для гибри-
активностью, путем мутаций и рекомбинаций метода- дизации;
ми генетической и клеточной инженерии (рис. 60). в) исследование биохимических путей синтеза
Для получения новых антибиотиков помимо изы- антибиотика, интермедиатов и ферментов;
скания новых или генетически измененных продуцен- г) определение генов, контролирующих образова-
тов используют следующие методические подходы: ние ферментов биосинтеза и его регуляторов;
1) получение из исходного антибиотика препара- д) получение рекомбинантной ДНК, содержащей
та с новыми свойствами путем химической или био- комбинацию генов, благоприятную для процесса био-
химической модификации его молекулы; синтеза;
2) направленный биосинтез путем биохимиче- е) клонирование новой генетической структуры
ской модификации структуры, полученной химиче- в культуре реципиента;
ским методом; ж) химическое, микробиологическое и фармако-
3) химический синтез с использованием природ- логическое исследование нового антибиотика.
ных структур в качестве шаблонов; Природные антибиотики получают путем культи-
4) мутасинтез. Этот метод включает следующие вирования микроорганизма — продуцента с использо-
этапы: ванием методов биотехнологии. По объему выпускае-
а) получение мутантов — идиотрофов, требу- мых антибиотиков антибиотическая промышленность
ющих для образования антибиотика определенный является самым крупным биотехнологическим произ-
фрагмент его молекулы (предшественник); водством.
б) получение химическими методами аналога Цель любой биотехнологии — на базе понимания
этого предшественника (мутасинтона); физиологических и генетических свойств продуцента
92 Глава 9
получить максимальный выход конечного продукта. В антибиотической промышленности пре-
Необходимые для этого биотехнологические мани- имущественно применяют биореакторы объемом
пуляции реализуются в соответствующей аппаратуре от 30 до 200 м 3 с механической мешалкой, снабжен-
(рис. 60). Управление процессами метаболизма про- ные системой автоматического контроля и управления
дуцента может осуществляться следующими спосо- процессом ферментации. Температуру ферментации
бами: (обычно 24-26°C) обеспечивает система охлаждения.
1) изменением состава питательной среды; После ферментации биомассу отделяют, антибиотик
2) изменением условий внешней среды (темпера- выделяют из фильтрата (для некоторых антибиоти-
тура, рН, аэрация); ков — из клеток продуцента) путем экстракции, ио-
3) конструкцией биореактора (ферментера); нообмена, ультрафильтрации, осаждения и кристал-
4) регламентированием введения дополнительно- лизации. Процесс подготовки посевного материала,
го субстрата; ферментации и многие из дальнейших операций про-
5) фиксацией физиологического состояния куль- водят в асептических условиях.
туры применением метода непрерывного культивиро- Культура продуцента. Исходный штамм микро-
вания; организма, продуцирующего антибиотик или другие
6) использованием генетически модифицирован- БАВ, выделяют из природных источников (почва, рас-
ных штаммов продуцента. тительные субстраты и др.) специальными методами
Реализация этих способов требует специальных скрининга; природный (дикий) штамм обладает низ-
инженерно-технологических подходов, обеспечиваю- кой активностью, поэтому требуется длительная ге-
щих биохимическую регуляцию биосинтеза при со- нетико-селекционная работа, обычно с применением
хранении свойств популяции продуцента (отсутствие мутагенов для повышения его активности. Получен-
повреждений клеток, автолиза, инфекции и др.). ный производственный штамм хранится в состоянии
Ферментация антибиотиков (рис. 61), как правило, анабиоза (например, при низкой температуре в лиофи-
аэробный процесс, требующий подачи воздуха в фер- лизированном состоянии). Такая культура может быть
ментационную среду и перемешивания. возвращена в активное состояние путем посева на со-
ответствующую питательную среду и использована
для приготовления посевного материала.
Приготовление посевного материала. Культуру
с поверхности скошенного агара асептично перено-
сят в колбу с посевной средой. При работе с грибами
и актиномицетами используют споровый посевной
материал (500-5000 спор на 1 л среды). Колбы инку-
бируют в термостате на качалке. Материал из колб
переносят в инокулятор объемом 0,5-1 м3 (0,1% по-
севного материала от объема среды) и выращивают
1-4 суток. Далее посевной материал асептично пере-
носят в посевной ферментатор объемом 5-20 м3 (10-
12% инокулята от объема питательной среды, время
культивирования от 1 суток.). Постоянно отбирают
пробы для микробиологического и биохимического ана-
лизов. Посевной материал для главной ферментации
готовят в количестве 5-10% от объема питательной
среды. Ступенчатая подготовка посевного материа-
ла позволяет получить его в количестве, необходимом
для обеспечения быстрого и продуктивного роста
в биореакторе, и поддерживает культуру в фазе лога-
рифмического роста.
Питательная среда конструируется, таким обра-
зом, чтобы обеспечить быстрый рост микроорганизма
в начальной стадии и максимальный выход продукта
в конце ферментации. Среду стерилизуют паром под
давлением при 120-140°C непосредственно в фермен-
Рис. 61. Ферментатор. 1 — мешалка одноярусная; 2 — таторе или в специальной установке непрерывной сте-
отражательная перегородка; 3 — рубашка; рилизации.
4 — привод мешалки; 5 — крышка; 6 — труба Ферментация. Схема промышленного периоди-
для подачи воздуха (барботер); 7 — корпус. ческого процесса показана на рис. 61. Ферментер и си-
Глава 9 93
стему трубопроводов перед заполнением средой моют, до 20-30 кПа (0,2-0,3 кгс/см 3). При необходимости вво-
проверяют на герметичность и стерилизуют острым дят химические пеногасители.
паром. Для обеспечения стерильности часто применя- Во время ферментации автоматически регулиру-
ют предварительную обработку ферментера химиче- ются температура и рН среды, по специальной про-
скими дезинфицирующими веществами. грамме вводятся добавочные компоненты питатель-
Количество стерильной охлажденной питательной ной среды. Систематически берут контрольные пробы
среды в ферментере не должно превышать 70% от его жидкости из ферментатора, в которых определяют
объема. Через линию посевного материала с помощью необходимые физико-химические показатели, актив-
стерильного воздуха в ферментатор вводят посевной ность и отсутствие посторонних микроорганизмов.
материал. Температура и рН питательной среды до по- Ферментацию прекращают, когда в среде накапли-
дачи посевного материала должны быть доведены вается максимальное количество полезного продукта.
до оптимальных значений для данной культуры. По окончании ферментации культуральную жидкость
Ферментацию проводят при аэрации (аэробный охлаждают до 10-25°C и перекачивают в резервуары,
процесс) путем подачи стерильного воздуха или без из которых она подается на дальнейшую обработку.
подачи воздуха (анаэробный процесс) и перемеши- Способы выделения и очистки антибиотиков ин-
вании, которое способствует растворению кислорода дивидуальны и определяются его физико-химическими
в жидкой среде и полному контакту клеток с питатель- характеристиками. Например, пенициллин выделяют
ными веществами. Для предотвращения попадания из культуральной жидкости экстракционным методом
нестерильного атмосферного воздуха в аппарат дав- (бутилацетатная экстракция), стрептомицин и тетраци-
ление воздуха над поверхностью жидкости повышают клин — методом ионообменной хроматографии.
94 Глава 9
Глава 10. ПОЛУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ МЕТОДАМИ
ГЕНЕТИЧЕСКОЙ И КЛЕТОЧНОЙ
ИНЖЕНЕРИИ
Глава 10 95
жиг — это процесс реассоциации ДНК с образованием
водородных связей между парами оснований. После
обработки обратной транскриптазой мРНК удаляют
щелочным гидролизом. Образовавшаяся кДНК име-
ет на 3′-конце шпилечную структуру, которая может
служить затравкой при построении второй нити ДНК
с помощью ДНК-полимеразы. Для удаления олиго-dT
и однонитевой петли используют S1-нуклеазу, расще-
пляющую однонитевую ДНК.
сайт EcoRI
сайт EcoRI
ДНК
плазмы
чужеродная
расщепление ДНК
расщепление
рестриктазой
рестриктазой
EcoRI
EcoRI
Рис. 63. Схема синтеза двуцепочечной кДНК на мРНК.
96 Глава 10
Рестриктазы, используемые в генной инженерии. менты, способные соединять полностью двунитевые
Таблица 21. фрагменты, однако эта реакция протекает лишь при
Обознечение Последова- Обозначение Последова- высоких концентрациях ДНК и лигазы [27].
рестриктазы тельность, рестриктазы тельность, При объединении ДНК донора и вектора при от-
узнаваемая узнаваемая
рестриктазой рестриктазой
жиге и лигировании образуются не только гибридные
1 2 3 4 молекулы, но и исходные векторы, что затрудняет даль-
EcoRI G AATTC Xho l C TCGAG нейшую работу по клонированию ДНК донора. Поэто-
CTTAA G GAGCT C му разработаны специальные методы, позволяющие
Hind III A AGCTT Hind II GPyC GPuC направить процесс преимущественно на получение
TTCGA A CPuG CpyG гибридных молекул. Один из них основан на ращепле-
1 2 3 4 нии ДНК вектора несколькими рестриктазами, чтобы
уменьшить вероятность самосборки вектора. Другой
В настоящее время выделено более 500 рестриктаз эффективный метод заключается в отщеплении конце-
класса II, однако среди них имеются ферменты, кото- вых фосфатных групп от линейной ДНК вектора при
рые узнают в ДНК одни и те же последовательности. действии щелочной фосфатазы. Образование лигазой
Такие группы называют изошизомерами. Различают ис- кольцевых молекул ДНК в этом случае возможно толь-
тинную изошизомерию, когда ферменты узнают одну ко в присутствии фрагментов донорной ДНК, имею-
и ту же последовательность нуклеотидов и разрывают щих неповрежденные 5′-фосфатные группы. (рис. 64)
ДНК в одних и тех же точках, и ложную, когда фермен-
ты, узнавая один и тот же сайт на ДНК, производят раз-
рывы в разных точках в пределах того же сайта.
Если предположить, что участки распознавания
расположены в цепи ДНК случайно, то мишень для
ферментов, узнающих сайт из четырех нуклеотидов,
должна встречаться в среднем один раз через каждые
256 по (пар оснований), а для ферментов, узнающих
лишь шесть нуклеотидов — через 4096 по. Очевидно,
что если сайт рестрикции окажется внутри гена, об-
работка рестриктазой приведет к его инактивации. Ве-
роятность такого события очень велика при использо-
вании мелкощепящих рестриктаз и значительна — при
употреблении крупнощепящих (узнающих шестерки
нуклеотидов). Поэтому для получения неповрежден-
ного гена проводят обработку поочередно нескольки-
ми крупнощепящими рестриктазами, либо применяют
прием недорестрикции, т. е. обработку в таких услови-
ях, когда происходит расщепление лишь в одном сайте
из нескольких возможных.
Особую ценность представляют рестриктазы, под
действием которых образуются фрагменты с самоком-
плементарными липкими концами: они эффективно
используются при конструировании рекомбинантных
молекул.
Рис. 64. Схема использования линкерных молекул для
10.5 Методы воссоединения конструирования гибридных ДНК. [27].
фрагментов ДНК
Идентичные взаимокомплементарные концы двух
Для соединения фрагментов ДНК, полученных молекул ДНК, подлежащих объединению, могут быть
после обработки рестриктазой, используют отжиг, получены при гидролизе этих молекул одной и той же
в результате которого образуются водородные связи рестриктазой. Однако часто возникает необходимость
между комплементарными основаниями липких кон- клонировать фрагменты ДНК, полученные расщепле-
цов, с последующей обработкой ДНК-лигазой. Лига- нием одной рестриктазой, в векторе, имеющем сайт
за катализирует образование фосфодиэфирной связи расщепления для другой рестриктазы. Для этого су-
между соседними нуклеотидами. Наличие липких ществует метод, позволяющий рекомбинировать прак-
концов не является обязательным условием для вос- тически любые фрагменты ДНК. Он предусматривает
соединения фрагментов ДНК-лигазой. Имеются фер- использование линкеров — коротких синтетических
Глава 10 97
двухцепочечных олигонуклеотидов, имеющих сайты плазмиды, бактериофаг λ, космиды, фазмиды и бакте-
узнавания для определенной рестриктазы. Линкеры риофаг М13.
пришивают с помощью лигазы по концам молекулы Созданы векторы и для других микроорганизмов,
ДНК, подлежащей клонированию, и обрабатывают в том числе важных для промышленности (Bacillus,
рестриктазой, в результате чего образуются липкие Pseudomonas, Streptomyces и др.). Особенно удобны
концы. Этой же рестриктазой гидролизуют молекулу двурепликонные (челночные) гибридные векторы, си-
вектора. В результате отжига и обработки лигазой по- стемы репликации которых принадлежат плазмидам,
лучают рекомбинантные молекулы ДНК. Линкерная имеющим разных хозяев. Они способны реплициро-
молекула может иметь больше, чем один сайт узнава- ваться в различных клетках, например, в E. coli, дрож-
ния рестриктазой. Тогда ее называют полилинкером жей или животных. Это позволяет все предваритель-
или адаптером. Применение таких молекул делает ре- ные операции по клонированию проводить в E. coli
стриктазно-лигазный метод рекомбинации ДНК уни- с последующим перенесением рекомбинантной ДНК
версальным, поскольку исходные фрагменты можно в нужный объект.
получить самыми различными способами.
Коннекторный метод воссоединения фрагмен- 10.6.1 Плазмиды
тов основан на свойстве фермента — терминальной Плазмиды — это внехромосомные генетические
дезоксирибонуклеотидилтрансферазы — достра- элементы, которые существуют обычно в виде зам-
ивать нуклеотидные последовательности к 3′-ОН- кнутых кольцевых суперспиральных молекул ДНК
концам фрагментов ДНК. К концам одного из соеди- (рис. 62). В качестве векторов используют чаще всего
няемых фрагментов ДНК присоединяют однонитевой небольшие плазмиды размером 2-10 тпн. Плазмида со-
полинуклеотид, например, поли-А (dA), а к кон- держит специальный участок инициации репликации
цам другого — комплементарный ему, например, (ori).
поли-T (dT). Достроенные таким образом фрагменты В качестве маркеров плазмида может содержать
смешивают и отжигают. Возможные бреши ликвиди- гены, определяющие устойчивость бактерии к анти-
руют обработкой ДНК-полимеразой и лигазой, в ре- биотикам. Вставка чужеродного (донорного) гена
зультате чего получают ковалентно замкнутые коль- в маркерный ген приводит к инактивации последнего.
цевые молекулы. Это позволяет отличить трансформированные клетки,
получившие векторную плазмиду (утратившие устой-
10.6 Векторы чивость к антибиотику), от клеток, получивших реком-
бинантную молекулу (сохранившие устойчивость).
Векторами называют молекулы ДНК, способные
Этот прием называется инактивацией маркера в ре-
переносить в клетку-реципиент чужеродную ДНК
зультате вставки.
и обеспечить ее экспрессию. В векторные молеку-
Созданы векторы, позволяющие производить пря-
лы с помощью ферментов встраивают определенные
мой отбор клонов, несущих гибридные молекулы. Для
гены. Такие молекулярные гибриды называются хи-
этого используют гены, ответственные за гибель кле-
мерами или рекомбинантными молекулами ДНК. Их
ток в определенных условиях или кодирующие синтез
вводят в реципиентные клетки, в результате чего про-
фермента, определяющего окраску колонии на селек-
исходит разделение молекул. Каждый из выделенных
тивной среде. Клонирование чужеродной ДНК в та-
клонов содержит индивидуальную рекомбинантную
ком гене приводит к его инактивации, что проявляется
ДНК. Эта процедура называется клонированием ре-
в фенотипе.
комбинантных молекул ДНК (клонированием генов).
Недостатком многих плазмид является снижение
Чтобы стабильно существовать в клетке, вектор
выхода рекомбинантов с ростом молекулярной массы
должен быть репликоном (автономно реплицировать-
вставки. Поэтому клонирование в плазмидах фрагмен-
ся в клетке). Вектор должен иметь один или несколько
тов ДНК, превышающих 10 тпо малоэффективно.
маркеров, позволяющих фенотипически определять
Плазмиды вводят в бактериальные клетки мето-
его присутствие в клетке-реципиенте. Для обеспе-
дом трансформации. В трансформации участвует одна
чения воссоединения с ДНК донора в векторной мо-
из 1000-10000 молекул ДНК.
лекуле необходимо присутствие сайтов расщепле-
ния рестриктазами, которые должны локализоваться
10.6.2 Векторы на основе бактериофага λ
в области, не существенной для репликации вектора.
Кроме того важно, чтобы вектор допускал вставку до- Геном фага λ представлен двуцепочечной ДНК,
норной ДНК различной молекулярной массы и давал размером 48,5 тпн, которая упакована в головку фага
большое число копий на клетку, что облегчает выде- в виде линейной молекулы с липкими концами длиной
ление и очистку рекомбинантной ДНК. Лучше всего 12 по. В клетке хозяина (E. coli) липкие концы объ-
разработана система векторов для E. coli в качестве единяются и ДНК замыкается в кольцо. Возможность
реципиента. Она включает следующие типы векторов: создания векторов на основе фага λ связана с тем, что
98 Глава 10
гены центральной части несущественны для литиче- клетку, а лишь замедляет ее развитие. Частицы зрелого
ского развития и могут быть замещены фрагментами фага непрерывно выделяются в среду и их титр может
чужеродной ДНК. Рекомбинантная ДНК может быть достигать 10 12 в 1 мл.
упакована в капсид in vitro, поэтому ее вводят в клет- Основное преимущество фага М13 как вектора
ку хозяина методом инфекции (трансдукции), что на- заключается в том, что выделяемые клеткой частицы
много эффективнее трансформации (инфекционной бактериофага содержат одноцепочечную ДНК, го-
становится каждая десятая молекула ДНК). В капсид мологичную одной из двух комплементарных цепей
пакуется ДНК определенного размера — не выше клонируемой ДНК. Такая ДНК может быть непосред-
53 и не ниже 38 тпо, поэтому фаговые векторы име- ственно использована для определения последователь-
ют верхний и нижний пределы размеров клонируемых ности оснований ДНК (секвенирование).
фрагментов ДНК.
Векторы на основе фага λ удобны для создания 10.6.6 Клетка-реципиент
клонотек (банка генов), но не для тонких манипуляций
Клетка-хозяин — это та среда, в которой может
с фрагментами ДНК. Для детального изучения и пре-
функционировать рекомбинантная молекула ДНК.
образования фрагменты ДНК переклонируют в плаз-
В качестве реципиента рекомбинантной ДНК часто ис-
миды.
пользуют E. coli — микроорганизм, хорошо изученный
и применяющийся в разнообразных исследованиях
10.6.3 Космиды
в области генетики и молекулярной биологии. Но для
Космиды — это плазмиды, несущие cos-участок целей биотехнологии E. coli не представляется иде-
(комплементарные липкие концы) ДНК фага λ. Нали- альным продуцентом по следующим причинам. E. coli
чие cos-участка позволяет производить упаковку ДНК входит в состав нормальной микробиоты человека, по-
в головку фага in vitro, поэтому они могут быть вве- этому опасно заражение обслуживающего персонала
дены в клетку путем инфекции, а не трансформации. рекомбинантным штаммом с нежелательными для че-
В космидных векторах можно клонировать фрагменты ловека свойствами. Помимо этого E. coli чувствитель-
чужеродной ДНК размером от 33 до 49 тпо. Косми- на к фагам, образует пирогены и не выделяет продукты
ды — векторы с наибольшей емкостью, поэтому они биосинтеза в культуральную среду, что затрудняет их
специально предназначены для клонирования боль- очистку. Поэтому перспективны другие микроорганиз-
ших фрагментов эукариотической ДНК и создания мы — бациллы (Bac. subtilis, Bac. stearothermophilus,
клонотек геномов. Bac. brevis), стрептомицеты, дрожжи (Saccharomyces
cerevisiae). Используют также культуры клеток мле-
10.6.4 Фазмиды копитающих, которые дают продукты, аналогичные
природным, что полезно при получении препаратов
Фазмидами называют гибриды между фагами
человеческого белка. Однако широкому применению
и плазмидами, способные развиваться как фаг и как
подобных реципиентов препятствуют трудности их
плазмида. По клонирующей емкости фазмиды сравни-
культивирования (медленный рост, высокая стоимость
мы с векторами на основе фага λ и значительно уступа-
питательных сред, опасность бактериальной и вирус-
ют космидам. Однако регулируемая возможность раз-
ной контаминации).
вития по фаговому или плазмидному пути дает им ряд
преимуществ, главное из которых — относительная
простота комплементационного анализа и реоргани- 10.7 Введение молекул ДНК в клетки
зации фрагментов ДНК. Фазмиды дают возможность
Система клонирования состоит из двух компонен-
отказаться от переклонирования генов из фаговых
тов — вектора и реципиентных клеток. Реципиентные
в плазмидные векторы.
клетки служат для выделения из смеси нужного типа
рекомбинантных молекул, для последующей иденти-
10.6.5 Векторы на основе бактериофагов,
фикации клонируемых генов и получения генов или
содержащих одноцепочечную ДНК
их продуктов. В качестве реципиентных используют
Лучшие векторы такого типа разработаны на ос- пермиссивные клетки, т. е. клетки, обеспечивающие
нове фага М13. Фаговая частица содержит одно- репликацию рекомбинантной ДНК.
цепочечную ДНК длиной 6500 нуклеотидов. После Способ введения ДНК в клетки определяется при-
проникновения в клетку хозяина ДНК превращается родой вектора. Плазмидные векторы вводят путем
в двухцепочечную репликативную форму (РФ), ко- трансформации, фаговые — путем трансфекции или
торую выделяют из клеток и используют как вектор. трансдукции. Возможна также передача ДНК путем
В инфицированной клетке накапливается 100-200 ко- конъюгации.
пий РФ ДНК. После этого синтез становится асимме- Трансфекция — это процесс, при котором фаговая
тричным и синтезируется лишь одна нить ДНК, кото- ДНК поступает в бактериальные клетки с последую-
рая входит в состав зрелого фага. Фаг М13 не убивает щим образованием вирусного потомства. Вирусные
Глава 10 99
клоны, полученные в результате трансфекции называ- содержащие рекомбинантные молекулы ДНК. Напри-
ются трансфектантами. Их выделяют из негативных мер, при использовании фазмид, дают урожай исклю-
колоний после высева реципиентных клеток на газон чительно фаговые частицы, в головки которых паку-
культуры, чувствительной к данному фагу. ются рекомбинантные молекулы. При применении
Трансформация — это процесс генетической ре- плазмид отбирают клоны с рекомбинантными ДНК
комбинации, при котором чужеродная ДНК поступает по инактивации одного из маркеров вектора и т. д. Сле-
в клетку-реципиент. Генетически трансформированные дующая, более трудная задача состоит в том, чтобы
клетки называют трансформантами. Клетки, способные найти среди рекомбинантов клон, несущий нужный
адсорбировать и поглощать ДНК, называются компе- исследователю ген.
тентными. Количество компетентных клеток в попу- Методы скрининга рекомбинантных клонов мо-
ляции зависит от видовой принадлежности микроорга- гут быть основаны на изменении фенотипа клет-
низма, условий его культивирования, стадии развития ки под влиянием вновь синтезированного продукта
и т. п. Компетентные клетки отличаются изменением рекомбинантного гена, либо на свойствах самого
свойств клеточной оболочки, у них снижен поверхност- продукта. Одним из таких приемов является тест
ный заряд, повышена чувствительность к осмотическо- на комплементацию, который применяется в том слу-
му шоку. Последнее связано с тем, что у компетентных чае, когда клонируемый ген обеспечивает комплемен-
клеток частично обнажены участки цитоплазматиче- тацию мутаций генома клетки, например, ее переход
ской мембраны, которая принимает непосредственное из ауксотрофного в прототрофное состояние. При
участие в адсорбции и поглощении ДНК. Особая роль этом гибрид может быть обнаружен простым отбо-
в этих процессах принадлежит мезосомам и трансфор- ром на селективной среде.
масомам — производным цитоплазматической мембра- Если продукт гена, т. е. белок, вырабатывается
ны, участвующим в переносе ДНК в цитоплазму. в достаточных количествах, возможен отбор нужного
Компетентность можно повысить или индуци- клона иммунологическим методом. Метод прямой ра-
ровать ее у микроорганизмов, лишенных естествен- диоиммунологической детекции колоний заключается
ной компетентности, путем специальной обработки в следующем. Колонии клеток лизируют на поверх-
клеток. Широко применяется метод индукции компе- ности агара, затем отпечатывают на поливиниловую
тентности у E. coli с помощью ионов кальция. Клетки пластинку, на которой адсорбированы антитела к бел-
выдерживают в присутствии 50 мМ Са 2+ при 0°С с по- ку искомого гена. Далее эту пластинку обрабатывают
следующим кратковременным тепловым воздействием антителами, меченными I125. Так образуется комплекс
при 37 или 42°С. В этих условиях возникает состояние белка-антигена с двумя молекулами антител, одна
общей компетентности и возможность трансформации из которых присоединена к пластинке, а другая мече-
и трансфекции. Эффективно также совместное воздей- на йодом. Образование комплекса тестируется радио-
ствие ионов Са 2+ с Мg 2 +, Mn 2+ и Rb+, индуцирующее автографически. Метод очень чувствителен и дает по-
компетентность у многих грамотрицательных и грам- ложительный ответ при наличии в клетке всего одной
положительных бактерий. Клетки дрожжей и мице- или нескольких молекул белка.
лиальных грибов становятся компетентными после При отсутствии экспрессии гена в клетках реци-
обработки их солями лития. К физическим методам пиента клоны могут быть идентифицированы по пер-
индукции компетентности относятся их глубокое за- вичной структуре ДНК или по характеру белка, синте-
мораживание (–196°С) и оттаивание (+42°С), а также зированного в подходящей системе (ооциты лягушки,
электропорация. Суть последнего метода заключается бесклеточные экстракты). Тестирование первичной
в том, что кратковременное воздействие (5-20 мс) элек- структуры ДНК осуществляется гибридизацией с ме-
трического поля высокой напряженности (1-15 кВ/см) ченой мРНК.
на клеточную мембрану приводит к образованию в ней Используя метод гибридизационной селекции,
пор (электропробой), достаточных для проникновения денатурируют плавлением клонированную ДНК, им-
ДНК в клетку. мобилизуют ее на твердой поверхности и гибриди-
Эффективно использование для трансформации зуют с мРНК. Дуплекс ДНК — РНК нагревают для
и трансфекции протопластов и сферопластов. освобождения мРНК, которую затем добавляют в бес-
клеточную белок синтезирующую систему или вводят
10.8 Методы идентификации клонов, в ооциты лягушки для трансляции. Продукты транс-
содержащих рекомбинантные ляции идентифицируют по биологической активности
молекулы или иммунологическим методам.
Если известна первичная структура гена или ко-
В большинстве экспериментов по молекулярному дируемого им белка, для скрининга клонов можно ис-
клонированию в результате действия рестриктаз полу- пользовать синтетические олигонуклеотиды — зон-
чается сложная смесь фрагментов ДНК. Существуют ды, комплементарные искомому гену. Зонды имеют
специальные приемы, позволяющие отобрать клоны, радиоактивную метку, которая позволяет обнаружить
100 Глава 10
их присутствие при связывании с искомым фрагмен- шающие образование муреина: пенициллин, фосфо-
том ДНК. мицин, высокие концентрации аминокислот глицина,
метионина, треонина и др.; для дрожжей — 2-дезокси-
10.9 Клеточная инженерия глюкозу, аналог глюкозы, препятствующий образова-
нию у них клеточной стенки.
Клеточная инженерия — это важный раздел но- Вторая группа методов включает ферментатив-
вой биотехнологии, объектами манипулирования ко- ный лизис клеточной стенки. Лизоцим, гидролизую-
торой являются культуры клеток растений, животных, щий муреин, используют для получения протопластов
человека, а также клетки микроорганизмов. Культуры у бактерий, часто в сочетании с другими ферментами
клеток высших организмов могут быть использованы (протеазами, липазами) и ЭDТА (этилендиаминтетра-
для производства вакцин, моноклональных антител ацетатом). Для протопластирования мицелиальных
и других иммунологических препаратов, регуляторов грибов и дрожжей применяют литические ферменты
роста при выведении новых сортов растений. Полу- из актиномицетов, грибов или пищеварительный сок
чение протопластов дает возможность конструировать виноградной улитки — (геликазу), который содержит
генетически новые объекты путем клеточной гибри- несколько десятков различных ферментов. Использу-
дизации или вводить в них чужеродный генетический ют также смеси, состоящие из геликазы, целлюлазы,
материал. хитиназы, пектиназы и других ферментов.
Протопласты — это структуры, которые обра- Можно подвергать ферментной обработке клетки,
зуются после полного удаления клеточной стенки. выращенные на среде с ингибитором синтеза клеточ-
Неполное удаление клеточной стенки приводит к об- ной стенки.
разованию сферопластов. В клеточной инженерии ис- Протопласты являются осмотически хрупкими
пользуют как протопласты, так и сферопласты. Однако структурами. Поэтому всю работу с протопластами
в ряде случаев эксперименты со сферопластами ока- проводят в гипертонических растворах с осмотиче-
зываются менее эффективными, чем с протопластами. скими стабилизаторами в концентрации 0,2-0,5 моль.
Трансформация протопластов является универ- Осмотическими стабилизаторами могут служить ми-
сальным способом введения молекул ДНК в клетки неральные соли (KCl, NaCl, NH4 Cl, NaNO3), соли ор-
бактерий, актиномицетов, дрожжей и грибов. ганических кислот (сукцинат натрия), многоатомные
С помощью слияния протопластов можно полу- спирты (маннитол, сорбитол), углеводы (сахароза,
чать генетические рекомбинанты у тех видов микро- рамноза, ксилоза и др.).
организмов, которые в естественных условиях никогда Образование и сохранение протопластов зависят
не скрещиваются между собой. Таким образом воз- от температуры, рН среды, концентрации литическо-
можно получение гибридных форм у микроорганиз- го фермента и времени инкубирования с ним, возраста
мов, имеющих важное значение для микробиологиче- и фазы роста протопластируемой культуры.
ской промышленности, что создает предпосылки для В генетическом аппарате протопластов содержит-
их генетического изучения и расширяет возможность ся вся информация, необходимая для восстановления
для селекционной работы. Метод слияния протопла- (регенерации) клеточной стенки и для возвращения
стов позволяет объединить в одном геноме мутации, их (реверсии) к клеточной форме с характерной мор-
положительно влияющие на продуктивность и полу- фологией. Процесс реверсии также зависит от соста-
ченные в разных селекционных линиях, в том числе ва среды, температуры, рН, присутствия витаминов,
и такие, которые трудно или даже невозможно инду- микроэлементов, белков-протекторов (желатин, белки
цировать в одной и той же клетке, а также избавляться сыворотки крови). Для регенерации клеточной стенки
от вредных мутаций. необходим контакт протопластов с каким-либо под-
Метод слияния протопластов как способ генетиче- держивающим каркасом, поэтому регенерацию прово-
ского обмена отличается от конъюгации, трансдукции дят не в жидких средах, а на питательном агаре.
и трансформации, при которых в реципиентную клет- Эффективным индуктором слияния протопластов
ку попадает лишь часть ДНК донора, тем, что при сли- является полиэтиленгликоль (ПЭГ). Поверхность кле-
янии протопластов объединяются целые геномы и все ток и протопластов заряжена отрицательно и окруже-
компоненты цитоплазмы родительских клеток. Кроме на водным слоем. Действие ПЭГ заключается в сни-
того в акте слияния могут участвовать более двух про- жении поверхностного заряда и удалении воды, что
топластов разных штаммов и в результате сразу полу- создает условия для тесного контакта и слипания мем-
чаются рекомбинанты, несущие признаки всех роди- бран. В местах слипания происходит разрыв мембран
телей. и содержимое двух соседних протопластов объединя-
Для получения протопластов у микроорганизмов ется. ПЭГ — универсальный агент, вызывающий сли-
(протопластирования) используют несколько методов. яние протопластов различных видов микроорганизмов
Одни из них основаны на подавлении синтеза клеточ- и обеспечивающий их трансформацию и трансфек-
ной стенки. Для бактерий используют вещества, нару- цию. Чаще всего применяют полимер со средней моле-
Глава 10 101
кулярной массой 1000-600 Да в концентрации 30-50% В опыты по слиянию протопластов берут генети-
(масса/объем). При этом осмотические стабилизато- чески маркированные штаммы, часто несущие мута-
ры можно не использовать, поскольку их функцию ции ауксотрофности и устойчивости к антибиотикам.
выполняет сам ПЭГ. Слияние подавляется высокими Продукты слияния — фузанты (от англ. fusion — слия-
концентрациями ионов Na+, K+, Cl–, NO3– и небольши- ние) отбирают на селективных средах.
ми примесями EDTA. Слияние протопластов идет уже Протопластирование и регенерация протопла-
при 4°С и эффективность его увеличивается при по- стов могут приводить к утрате плазмид, хромосомным
вышении температуры до 30°С. Центрифугирование перестройкам и мутациям, среди которых могут быть
повышает частоту слияния. и полезные.
102 Глава 10
Глава 11. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ
МИКРООРГАНИЗМОВ
В ПРОИЗВОДСТВЕ МЕДИЦИНСКИХ
ПРЕПАРАТОВ И В ЛАБОРАТОРНЫХ
ИССЛЕДОВАНИЯХ
Глава 11 103
Некоторые БАВ, продуцируемые
микроорганизмами
Таблица 22.
БАВ Продуцент
1 2
Витамины
Рибофлавин (В2) Eremothecium ashbyii
Aschbya gossypii
Bacillus subtilis (мутантный штамм)
Цианкобаламин (В12) Propionibacterium freudenreichii
P. shermanii
Brevibacterium flavum
Pseudomonas denitrificans
Streptomyces olivaceus
Micromonospora spp.
Аскорбиновая кислота (С) Acetobacter xylinum (-)
A. suboxydans (превращение
D- сорбита в L-сорбозу)
Каротиноиды Blakeslea trispora
Choanephora cucurbitarum Рис. 65. Структура десферроксамина и его хелатного
Аминокислоты
комплекса.
Глутаминовая кислота Corynebacterium glutamicum
Глутамин, пролин Десферроксамин (десферол) — активный антидот,
L-аланин, L-валин который применяется при остром отравлении железом.
Лизин Corynebacterium spp. Последнее может возникать, например, у детей при ис-
Brevibacterium spp. пользовании железа сульфата для лечения неосложнен-
L-изолейцин Brevibacterium flavum
ного дефицита этого элемента. Десферол имеет высо-
L-орнитин Arthrobacter spp.
Brevibacterium spp. кое сродство к железу (константа связывания порядка
Corynebacterium spp. 10 30), его комплекс с металлом водорастворим и хорошо
L-гистидин, мутанты C. glutamicum выводится из организма. При гемолитической анемии,
L-аргинин B. flavum, Bacillus subtilis например, талассемии десферол используют совместно
L-треонин, L-триптофан рекомбинантные штаммы с переливанием крови, чтобы поддержать нормальный
Escherichia coli
уровень железа и гемоглобина в крови. Десферол вы-
L-цитрулин Ауксотрофные мутанты
C. glutamicum, Bacillus subtilis
пускают в форме стерильного порошка, вводят путем
Органические кислоты инъекций или орально при остром отравлении железом,
Молочная Lactobacillus delbrueckii чтобы удалить его из кишечника.
L. bulgaricum, L. brevis Сидерофоры перспективны при лечении зло-
Rhizopus oryzae качественных и вирусных заболеваний. Paracoccus
Глюконовая Gluconobacter suboxydans denitrificans продуцирует сидерофоры, угнетающие
Aspergillus niger
рост опухолевых клеток и репликацию РНК вирусов.
Масляная Clostridium butiricum
Это действие связано с тем, что в среде создается де-
Пропионовая Propionibacterium shermanii
P. freudenreichii фицит железа, необходимого для этих процессов.
Койевая Aspergillus oryzae
2-кетоглюконовая Pseudomonas fluorescens 11.4 Ферменты
5-кетоглюконовая Gluconobacter suboxydans
Винная то же Микроорганизмы продуцируют ферменты, кото-
Пировиноградная Pseudomonas aeruginosa рые используются как терапевтические вещества или
Уксусная Acetobacter spp. в диагностических целях. Последние будут рассмотре-
Лимонная Aspergillus niger ны ниже.
Стрептокиназа, продуцируемая стрептококками,
11.3 Железохелирующие агенты способна трансформировать плазминоген в плазмин −
протеазу, вызывающую растворение сгустков крови.
При росте на среде с дефицитом железа многие Ее применяют при лечении глубоких венозных острых
микроорганизмы продуцируют вещества, способные артериальных тромбозов и острой легочной эмболии.
связывать железо, обычно это феноляты или гидрок- Возможно применение этого фермента при инфаркте
саматы, которые называют сидерофорами. Активный миокарда.
продуцент сидерофора десферроксамина (рис. 65) — Стрептодорназа, также вырабатываемая стреп-
Streptomyces pilosus. тококками, способствует разжижению гноя. Это де-
104 Глава 11
зоксирибонуклеаза, гидролизующая дезоксирибону- Rhizopus nigricans. Иммобилизованные клетки исполь-
клеопротеин и ДНК, обусловливающие вязкость гноя. зуют для биотрансформации стероидов, антибиотиков,
Совместное применение стрептокиназы и стрептодор- для получения антивирусного препарата аденинараби-
назы эффективно при заболеваниях грудной полости, нозида. Процесс включает трансгликолизирования.
сопровождающихся образованием сгустков крови
и гноя, и при лечении гнойных ран.
Оба фермента получают при культивировании не- R. nigricans
патогенных штаммов стрептококков на среде с избыт-
ком глюкозы. Ферменты выделяют из культуральной
жидкости и выпускают в инъекционной форме.
L-аспарагиназу продуцируют E. coli и Erwinia
carotovora. Фермент используют при химиотерапии Прогестрон 11α-гидроксипрогестрон
некоторых форм лейкемии. L-аспарагиназа отщепля-
ет одну аминогруппу от аспарагина, превращая его Рис. 66. Трансформация прогестерона ферментной
в аспарагиновую кислоту. Избирательность действия системой Rhizopus nigricans
фермента определяется потребностью некоторых
форм опухолевых клеток в аспарагине, тогда как нор- Найдены штаммы микроорганизмов, способные
мальные клетки в аспарагине не нуждаются. превращать гидрокортизон и кортизон соответственно
Нейраминидазу получают при культивирова- в преднизолон и преднизон путем дегидрогенирования
нии Vibrio cholera. Фермент отщепляет остатки и т. д.
N-ацетилнейраминовой кислоты, входящей в мембра- В процессах биотрансформации могут быть ис-
ну некоторых опухолевых клеток, повышая таким об- пользованы иммобилизованные в полимерном геле-
разом их антигенную активность. Может быть исполь- вом матриксе клетки, а также мембранные системы,
зован при лечении некоторых форм лейкемии. которые позволяют вести процесс непрерывно и упро-
β-лактамазы, инактивирующие пенициллины щают очистку продукта. Иммобилизованные клетки
и цефалоспорины, используются при определении используют для биотрансформации стероидов, анти-
стерильности этих антибиотиков (см. ниже) или при биотиков, для получения антивирусного препарата
микробиологическом анализе клинического матери- аденинарабинозида. Процесс получения последнего
ала от больных, получающих эти антибиотики. В те- вещества включает реакцию трансгликозилирования
рапевтических целях их используют в случае тяжелой (урациларабинозид + аденин → аденинарабинозид),
аллергической реакции на β-лактамные антибиотики. которую осуществляют клетки Enterobacter aerogenes,
Фермент вводят внутримышечно или внутривенно со- иммобилизованные в полиуретане.
вместно с другими препаратами (адреналин, антиги- В производстве антибиотиков необходимой ста-
стаминные средства). дией получения некоторых пенициллинов является
гидролиз бензилпенициллина до 6-аминопеницил-
11.5 Микробная трансформация лановой кислоты с помощью микробной пеницил-
лекарственных веществ. линацилазы. При этом хорошие результаты дает ис-
пользование рекомбинантных штаммов с высокой
11.5.1 Микробная трансформация ферментативной активностью. Иммобилизация клеток
Ферментные системы микроорганизмов позволя- увеличивает их стабильность и повышает выход про-
ют осуществлять химические превращения биологи- дукта.
чески активных веществ с целью получения лекар-
ственных препаратов. Подобные реакции в условиях 11.5.2 Инсектициды
химического синтеза проходят обычно в жестких усло- Энтомопатогенные бактерии, вирусы и грибы мо-
виях температуры и рН и являются многостадийными. гут быть использованы для борьбы с вредными насе-
Микробная трансформация осуществляется в физио- комыми. Методы биологической защиты от насекомых
логических условиях, что позволяет сохранить актив- экологически более безопасны, чем методы химиче-
ность продукта, и обычно проходит в одну стадию. ской защиты. Однако, к микроорганизмам, предлагае-
Впервые преимущества микробной трансформа- мым для этой цели предъявляются строгие требования
ции были обнаружены при получении стероидных пре- их безопасности для млекопитающих и растений.
паратов. Одной из необходимых стадий этого процесса Наиболее изучены токсины Bacillus thuringiensis.
является гидроксилирование молекулы предшествен- Токсин δ — это протеин, который содержится в спорах
ника в определенном положении. Этой способностью в форме кристаллических включений, активен против
обладают многие микроорганизмы. На рис. 66 пока- личинок Lepidopterae (молей, бабочек). Активация
зан пример биологической трансформации с участием токсина происходит при его ограниченном гидролизе
Глава 11 105
в кишечнике личинок, после чего стенки кишечника на засеянную среду в чашках Петри. При положитель-
разрушаются, что сопровождается гибелью насеко- ном результате отмечают зоны роста микроорганизма
мых. Инсектицидный препарат выпускают в форме вокруг дисков. Диаметр зон пропорционален содержа-
порошка, содержащего споры и кристаллы токсина. нию исследуемых веществ, количество которых опре-
Он не токсичен для человека и животных и применя- деляют по стандартной кривой.
ется для защиты урожая от гусениц. Найден новый
штамм B. thuringiensis, δ-токсин которого имеет более 11.6.3 Определение канцерогенов
широкий спектр действия и активен против Coleoptera и мутагенов
(жуков) в большей степени, чем Lepidoptera и Diptera
Все химиотерапевтические препараты должны
(мух и комаров).
проходить проверку на мутагенную, потенциально
Второй токсин B. thuringiensis — β-токсин дей-
канцерогенную активность. Для этой цели предложен
ствует на все перечисленные семейства насекомых,
быстрый метод с использованием мутантных штаммов
это адениннуклеотид, возможно, аналог АТФ, кото-
Salmonella typhimurium. Эти штаммы имеют мутации
рый конкурентно ингибирует ферменты, участвующие
в гистидиновом опероне и не могут синтезировать ги-
в гидролизе АТФ. Он токсичен для млекопитающих,
стидин. Две дополнительные мутации увеличивают
поэтому в производстве инсектицида используют
чувствительность тест-системы. Первая определяет
штамм B. thuringiensis, который продуцирует только
нарушение структуры липополисахарида клеточной
δ-токсин.
стенки, в результате которого повышается ее прони-
цаемость для больших гидрофобных молекул. Вторая
11.6 Использование микроорганизмов мутация нарушает систему репарации ДНК, в резуль-
и их продуктов в лабораторных тате чего невозможно восстановление структуры ДНК
исследованиях после воздействия мутагена.
Тест-культуру смешивают с испытуемым веще-
ством в расплавленной (45°C) агаризованной среде
11.6.1 Определение витаминов минимального состава и выливают на чашку Петри.
и аминокислот Поверх наносят слой агаризованной среды, содержа-
В качестве тест-культур используют ауксотрофные щей следы гистидина и позволяющей клеткам пройти
штаммы микроорганизмов, т. е. такие, для которых опре- несколько циклов деления, что необходимо для выяв-
деляемое вещество является необходимым фактором ления действия некоторых мутагенов. После 48-часо-
роста. Питательная среда должна содержать все необ- вой инкубации при 37°C подсчитывают колонии-ре-
ходимые для тест-организма вещества, помимо опреде- вертанты и сравнивают их количество с результатами
ляемого. Последнее вносят в лунки агаризованной сре- посева на контрольной чашке, не содержащей мутаге-
ды в чашках Петри. В определенных границах диаметр на. Колония-ревертант — это потомство клетки, мути-
зоны роста культуры вокруг лунки будет пропроциона- ровавшей к дикому типу и способной синтезировать
лен концентрации фактора роста, которую определяют гистидин (расти на минимальной среде).
с помощью стандартной кривой. Этот метод в основном
используют при анализе витаминов т. к. аминокислоты 11.6.4 Использование микробных
обычно определяют химическими методами. ферментов при определении
стерильности
11.6.2 Фенилкетонурия При испытании эффективности стерилизации
Это врожденное нарушение метаболизма, при в составе тест-систем используют спорообразующие
котором организм не способен к конверсии избытка микроорганизмы. При определении стерильности пре-
фенилаланина (ФА) в тирозин, необходимый для био- паратов антибиотиков применяют микробные фер-
синтеза тироксина, адреналина и норадреналина. Диа- менты, инактивирующие эти вещества. Мембранная
гностическим признаком заболевания является при- фильтрация, которую также используют для этой цели,
сутствие фенилпировиноградной кислоты (ФПВК) имеет такие недостатки, как возможность случайного
в моче и повышенный уровень ФА и ФПВК в крови. микробного загрязнения фильтров и адсорбция анти-
Больному назначают диету с низким содержанием биотика на фильтре с последующим попаданием его
ФА. Без принятия необходимых мер развивается сла- в питательную среду. Применение инактивирующих
боумие. Для диагностики фенилкетонурии предложе- ферментов является более надежным методом. Для
но использовать Bacillus subtilis, рост которой на ми- инактивации пенициллинов и цефалоспоринов пред-
нимальной среде подавляется β-2-тиенилаланином ложено использовать соответствующие β-лактамазы.
(thyenil), но восстанавливается в присутствии ФА или Хлорамфеникол возможно инактивировать ацетил-
ФПВК. Исследуемые образцы крови или мочи наносят трансферазой. Аминогликозиды — путем фермент-
на диски фильтровальной бумаги, которые помещают ного фосфорилирования, ацетилирования или адени-
106 Глава 11
лирования. Фармакопея рекомендует использовать числе исследуют пути их метаболизма в организме
только β-лактамазы, остальные методы пока не нашли млекопитающих: возможные химические превраще-
широкого применения. ния, распределение в органах и тканях, скорость вы-
ведения из организма и т. д. Эти испытания проводят
11.6.5 Применение иммобилизованных на животных, в меньшей степени используют микро-
ферментов сомальные системы, культуры тканей, перфузирован-
ные органы. Предложено использовать микробные
Применение иммобилизованных ферментов пред-
клетки как модель метаболизма in vitro, поскольку
ставляется перспективным для создания тест-систем
имеется сходство между некоторыми ферментными
для клинического анализа. Например, глюкозоокси-
системами микроорганизмов и печени человека. Боль-
дазу, применяемую при определении глюкозы в кро-
шое преимущество таких моделей — их относительно
ви, получают при культивировании Aspergillus niger.
низкая стоимость и возможность получать метаболиты
Предложен способ иммобилизации этого фермента
в количествах, достаточных для анализа. Для создания
на платиновом электроде, который может измерять по-
модельных систем проводят скрининг большого коли-
требление кислорода при окислении глюкозы. Однако,
чества микроорганизмов на их способность метаболи-
эта система имеет ряд недостатков, которые предстоит
зировать данное вещество. Выбранный штамм выра-
устранить до внедрения ее в практику.
щивают в колбах на качалках, куда вносят исследуемое
вещество и через определенные промежутки времени
11.6.6 Использование микроорганизмов
отбирают пробы, определяя в них присутствие метабо-
как модельных систем при исследовании
литов лекарственного вещества. При необходимости
метаболизма лекарственных веществ
процесс масштабируют с целью получения большого
Лекарственные вещества проходят тщательные количества метаболитов для изучения их структуры
испытания их эффективности и токсичности, в том и биологической активности.
Глава 11 107
Глава 12. ПРИМЕНЕНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ
ПРЕПАРАТОВ
108 Глава 12
12.3 Фармакологический фактор фекции, если только сначала не будет установлено,
что культура, выделенная от больного, чувствитель-
Химиотерапевтические препараты эффективны на к пенициллину.
только в том случае, если они присутствуют в очаге ин- Распространенность устойчивости к антибиоти-
фекции в концентрации, обеспечивающей подавление ку для данной бактериальной популяции не остается
роста микроорганизма. Дозы и интервалы между при- постоянной, а изменяется в зависимости от того, на-
емами подбираются на основании тщательного фарма- сколько широко используется антибиотик в данном
кологического и клинического исследования и долж- регионе: частота устойчивых штаммов увеличивается
ны гарантировать выполнение этого условия. Низкие при увеличении интенсивности использования анти-
дозы препарата и большие интервалы между его вве- биотика.
дениями делают лечение неэффективным и приводят Частота штаммов с трансмиссивной устойчиво-
к развитию микробной резистентности. стью зависит от плотности микробной популяции,
Продолжительность лечения определяется кли- поэтому наибольшая частота резистентных и полире-
ническим опытом. Недостаточная продолжительность зистентных штаммов наблюдается в больницах (го-
лечения может привести к рецидивам заболевания, спитальные штаммы), где больше всего используются
развитию его осложнений. антимикробные препараты, а плотность микробной
популяции максимальна.
12.4 Токсикологический фактор
и побочное действие 12.6 Профилактическое
использование химиотерапевтических
Химиотерапевтические препараты в применяе-
препаратов
мых дозах малотоксичны и нетоксичны, хотя некото-
рые из них вызывают побочные действия, например, Учитывая возможность развития нежелательных
ототоксическое у аминогликозидов или фотосенсиби- побочных реакций (см. выше), профилактическое при-
лизирующее у тетрациклинов. Основным побочным менение антибиотиков можно считать целесообраз-
действием антибиотиков является дисбактериоз в ре- ным только в том случае, если выполняются следую-
зультате подавления нормальной микробиоты, в ос- щие положения.
новном, кишечника. Результатом этого может явиться 1. Наличие условий, в которых действительно
авитаминоз и вторичная инфекция, например, канди- можно ожидать развития данного заболевания. Приме-
доз. Поэтому антибактериальные антибиотики часто рами могут служить:
назначают совместно с противогрибковыми (ниста- а) обширные ожоги (заражение Staphylococcus
тин) и витаминами. aureus или Pseudomonas aeruginosa);
Кроме того, все лекарственные препараты могут б) такие хирургические операции, как ампу-
вызывать иммунный ответ с появлением аллергиче- тация нижней конечности (анаэробная инфекция,
ских реакций. Частота и интенсивность таких реакций вызываемая Clostridium perfringens), операции
зависит как от вида антибиотика, так и от индивиду- на сердце (эндокардиты, вызываемые S. aureus), сто-
альной чувствительности пациента. Больному, у кото- матологические операции у больных с протезом кла-
рого хоть раз отмечалась аллергическая реакция к дан- пана сердца;
ному антибиотику, никогда нельзя назначать повторно в) стрептококковые инфекции горла, инфекции
этот препарат или препараты той же химической груп- почек, ревматоидный полиартрит;
пы, но это не служит противопоказанием к примене- г) наличие менингококков
нию препаратов других групп. и Haemophilus influenzae у здоровых носителей. Этот
список далеко не полон, можно привести множество
12.5 Эпидемиологический фактор других примеров.
и резистентность 2. Правильный выбор препарата с учетом чув-
ствительности к нему возбудителя заболевания. Воз-
Проблемы возникновения резистентных и по- можно как системное, так и местное применение (при
лирезистентных штаммов микроорганизмов рас- ожогах, при хирургических операциях).
сматриваются в главе 13. Врач должен быть в кур- 3. Правильное время введения, обеспечивающее
се самых последних данных о распространенности нахождение антимикробного препарата в очаге инфек-
бактерий, устойчивых к разным антибиотикам, ции именно в то время, когда она может начаться. Если
в том географическом регионе, где он работает. Если это время трудно предсказать, например, момент на-
врач знает, что 80% популяции стафилококков в его ступления рецидива при ревматоидном полиартрите,
регионе устойчивы к пенициллину, он не назначит лекарственный препарат следует применять длитель-
этот антибиотик для лечения стафилококковой ин- ное время.
Глава 12 109
12.7 Комбинированное применение вать как новый лекарственный препарат и исследовать
химиотерапевтических препаратов его токсикологию и фармакокинетику.
Одновременное применение двух или более хими- 12.8 Применение антибиотиков для
отерапевтических препаратов можно считать целесоо- лечения инфекционных заболеваний
бразным по следующим причинам.
1. Снижение частоты появления резистентных Антибиотики по спектру своего действия подраз-
штаммов. Для достижения этой цели следует при- деляются на антибактериальные, антифунгальные, ан-
менять препараты с разными механизмами действия типротозойные и противовирусные. В данном разделе
(имеющие разные мишени в микробной клетке), ина- представлены материалы о терапевтическом примене-
че мутации, обусловливающие устойчивость к одному нии антибактериальных антибиотиков, т. к. средства
препарату, приведут к развитию устойчивости к друго- для лечения других инфекционных заболеваний рас-
му препарату с аналогичным механизмом действия. смотрены в соответствующих разделах (часть I).
2. Расширение антибактериального спектра при Существует несколько поколений антибиотиче-
лечении смешанных инфекций или тяжелых инфек- ских препаратов, различающихся по спектру своего
ций неизвестной этиологии. В этом случае препараты действия, способности воздействовать на резистент-
должны иметь различающиеся антибактериальные ные штаммы микроорганизмов и фармакологическим
спектры действия, чтобы суммарный спектр был до- свойствам. В соответствии с этим их рекомендуют
статочно широким. применять при определенных инфекционных заболе-
3. Снижение дозы компонентов в смеси может ваниях (рис. 43, 44, 45).
быть достигнуто при их синергидном эффекте, тогда Большинство антибиотиков оказывает бактери-
возможно уменьшение дозы потенциально токсичного цидное действие (табл. 19), но применяют и антибио-
препарата. тики, оказывающие бактериостатическое действие
4. Увеличение терапевтической эффективности. (левомицетин, тетрациклины, макролиды), поскольку
При совместном применении антимикробных препа- защитные силы организма способствуют уничтоже-
ратов могут наблюдаться эффекты трех типов: синер- нию возбудителя, размножение которого подавлено
гизм, аддитивность и антагонизм. При синергизме ре- химиотерапевтическим агентом.
зультат совместного действия препаратов превосходит
суммарный результат действия каждого из них в от- 12.9 Применение синтетических
дельности. Аддитивность означает, что эффект ком- химиотерапевтических препаратов.
бинации равен сумме эффектов компонентов. В слу-
чае антагонизма один из компонентов смеси снижает Синтетические химиотерапевтические препараты
эффективность другого. Биохимические основы этих подобно антибиотикам отличаются избирательностью
явлений можно определить, зная механизм действия своего действия, которая зависит от наличия спец-
антимикробных агентов. Например, антагонизм меж- ифической мишени в клетках инфекционного агента,
ду пенициллином и тетрациклином связан с тем, что определяющей спектр антимикробного действия пре-
пенициллин действует только на растущие бактерии. парата и его терапевтическое применение (табл. 24)
Тетрациклин блокирует рост, поддерживая бактерии [25]. В таблице указаны только основные антибакте-
в физиологической фазе, когда они нечувствительны риальные препараты; вещества с антивирусной, анти-
к пенициллину. фунгальной и антипротозойной активностью рассма-
Типичным примером синергизма является ком- триваются в соответствующихразделах.
бинация двух антиметаболитов — сульфонамидов
и триметоприма, когда синергизм обусловлен двой- 12.10 Применение антибиотиков
ным метаболическим блоком (см. гл. 10). При наличии в сельском хозяйстве
синергизма концентрация каждого препарата в смеси,
необходимая для подавления роста микроорганизмов, В ветеринарии антибиотики используют как для
меньше, чем подавляющая рост концентрация каж- индивидуального лечения, так и для массовой обра-
дого из них в отдельности. Однако необходимо, что- ботки животных.
бы фармакокинетические свойства двух компонентов Индивидуальное применение практикуется при
обеспечивали сохранение в очаге инфекции таких кон- лечении как мелких (кошек, собак и т. п.), так и круп-
центраций каждого из них, при которых наблюдается ных домашних животных (коров, лошадей, овец и т. п.),
синергизм. Кроме того, комбинации препаратов могут страдающих от инфекционных заболеваний (пневмо-
отличаться по характеру токсичности от компонентов, нии, бронхиты, маститы, кишечные инфекции и т. д.).
используемых раздельно, а присутствие одного препа- При лечении мелких животных применяются
рата может влиять на фармакокинетику другого. По- те же принципы, что и в химиотерапии инфекци-
этому каждую новую комбинацию следует рассматри- онных заболеваний человека и используются те же
110 Глава 12
Применение антибактериальных синтетических
химиотерапевтических препаратов
Таблица 24.
Препарат Спектр действия Заболевание
ХИНОЛОНЫ грамотрицательные бактерии
налидиксовая кислота
оксолиниевая кислота широкий спектр действия Инфекции, вызванные видами Pseudomonas
промидиевая кислота и Proteus
циноксацин
милоксацин
ФТОРХИНОЛОНЫ Действуют на грамотрицательные Инфекции мочевых путей, осложненные
ломефлоксацин бактерии; большинство анаэробов инфекции дыхательных путей; болезни,
норфлоксацин резистентно или умеренно вызванные сальмонеллами, шигеллами,
пефлоксацин чувствительно Pseudomonas spp.
офлоксацин
ципрофлоксацин
НИТРОИМИДАЗОЛА Анаэробы и простейшие Анаэробные инфекции, трихомоноз
ПРОИЗВОДНЫЕ
метронидазол
СУЛЬФАНИЛАМИДЫ Виды Streptococcus, Actinomyces, Инфекции, вызванные грамположительными
(СУЛЬФОНАМИДЫ) Nocardia, и грамотрицательными бактериями, хламидиями;
Bacillus anthracis, малярия, токсоплазмоз
Haemophilus influenzae, Escherichia coli,
Shigella spp., Yersinea enterocolytica,
Proteus mirabilis, Chlamydia trachomatis
ПАРААМИНОСАЛИЦИ-ЛОВАЯ КИСЛОТА Микобактерии Различные микобактериозы
ДИАМИНОПИРИМИДИНЫ Широкий спектр действия Инфекции мочеполовой системы и ЖКТ;
триметоприм в профилактика бактериальных инфекций
комбинации с у пациентов с иммунодефицитами
сульфаметоксазолом
бисептол
септрин
НИТРОФУРАНЫ Диареи, желудочно- кишечные расстройства,
фуразолидон инфекции мочевыводящих путей
нитрофурантион
лекарственные препараты. При лечении крупных шечника. Предполагают, что антибиотики подавляют
животных тоже используются принципы химиотера- образование токсинов кишечными бактериями, по-
пии человека, но если животное служит источником давляют рост потенциально патогенных бактерий
пищевых продуктов, необходимо отменять анти- и микроорганизмов, разрушающих и потребляющих
биотики заранее перед убоем, чтобы они не попали важные компоненты пищи животных, и стимулируют
в пищу. При большинстве заболеваний животных рост бактерий, синтезирующих витамины и другие по-
применяют как ветеринарные (гризин, бацитрацин), лезные вещества, что приводит к изменению физиоло-
так и медицинские (стрептомицин, пенициллины, гии животных. В России в качестве кормовых добавок
левомицетин, тетрациклины) антибиотики и другие используют гризин и бацитрацин.
химиотерапевтические препараты (сульфонамиды, Однако массовое использование антибиотиков
нитрофураны). в животноводстве может привести к последствиям,
Профилактическая массовая обработка может опасным для здоровья человека и животных. Бак-
проводиться для всех животных в данном хозяйстве, териологические последствия связаны с отбором
тогда как массовое лечение только на ферме, где появи- и распространением полирезистентных штаммов ми-
лось инфекционное заболевание. При этом антибиоти- кроорганизмов; фармакологические последствия —
ки дают с кормом или питьевой водой. с накоплением в продуктах животноводства антибио-
Массовая обработка позволяет прервать инфекци- тиков, способных вызывать аллергические или другие
онный цикл, уничтожить очаг инфекции, бороться как отрицательные реакции у человека.
с активной формой заболевания, так и с бессимптом- Некоторые антибиотики используют для защи-
ными инфекциями. ты растений от заболеваний, вызванных фитопато-
Антибиотики широко используются в качестве генными бактериями (стрептомицин против Erwinia,
добавок к корму для увеличения скорости роста жи- Xanthomonas, Pseudomonas) и грибами (циклогекси-
вотных, связанной с их влиянием на микробиоту ки- мид, касугамицин, ауреофунгин).
Глава 12 111
Глава 13. ПРИНЦИПЫ МЕТОДОВ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
АНТИБИОТИКОВ И ДРУГИХ
ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ
ВЕЩЕСТВ
112 Глава 13
ем жидкости был одинаков. Пробирка, не содержа- В чашки Петри разливают питательный агар,
щая антибиотика, является контрольной. После этого смешанный с тест-культурой. Количество послед-
во все пробирки, содержащие серийно разведенный ней берут из расчета 20 млн. клеток на 1 мл среды.
антибиотик, и в контрольную пробирку вносят одина- После застывания агара на его поверхность наносят
ковое количество взвеси тест-культуры. Штатив с про- цилиндры, в которые вносят по 0,1 мл испытуемого
бирками встряхивают и ставят в термостат при 37°C раствора антибиотика параллельно со стандартным
на 18-20 часов. раствором. Вместо цилиндров можно использовать
Взвесь тест-микроба готовят на изотоническом лунки, которые делают в агаре с помощью специаль-
(0,85%) растворе хлорида натрия при обязательном ного приспособления. После этого чашки помещают
сравнении со стандартами мутности. При титрова- в термостат при 37°C на 16-18 часов. По истечении
нии антибактериальных антибиотиков микробная на- этого времени измеряют размеры зон задержки роста
грузка обычно составляет 2,5×10 5 микробных клеток тест-микроба.
на 1 мл раствора антибиотика в питательном бульоне. Расчет активности антибиотика по размеру зон за-
При использовании в качестве тест-культуры дрожжей держки может быть произведен на основании расчет-
микробная нагрузка составляет 4×10 б клеток в 1 мл. ных таблиц В. С. Дмитриевой (ГФ) или по стандарт-
Метод серийных разведений в плотных средах от- ным кривым.
личается тем преимуществом, что микробы-загрязни- Определение чувствительности микробов к ан-
тели здесь легко выявляются и по существу не изменя- тибиотикам методом дисков проводят прежде всего
ют общих результатов титрования, тогда как на жидких для оценки эффективности антибиотиков в клиниче-
средах весь опыт может оказаться безрезультатным ских условиях. Клинический материал или микроб-
из-за попадания в пробирки хотя бы единичных кле- ную культуру, выделенную от больного, засевают
ток посторонних устойчивых микроорганизмов. Этот на поверхность питательного агара сплошным газо-
метод используют также при работе с микроорганиз- ном, накладывают бумажные диски, пропитанные
мами, которые не растут на обычных жидких средах, раствором антибиотика (используют коммерческие
например, микобактерии туберкулеза, которые выра- образцы, содержащие определенные концентрации).
щивают на среде, содержащей свернутую сыворотку. После инкубации при 37°C в течение времени, необ-
Вначале готовят ряд серийных разведений антибиоти- ходимого для роста выделенного возбудителя, опре-
ка, а затем вносят по 1 мл каждого разведения в про- деляют диаметр зоны торможения роста. Полученные
бирку, содержащую 4 мл расплавленной и охлажден- величины сравнивают с размерами зон задержки ро-
ной до 45-50° агаризованной среды. Затем пробирки ста, указанными в инструкциях, прилагаемых к дис-
скашивают до застывания агара, а на поверхность кам, после чего выделенные микроорганизмы отно-
плотной среды петлей засевают взвесь тест-микроба. сят к чувствительным, умеренно чувствительным или
Для выявления бактерицидного действия препара- резистентным. Прежде чем предложить к реализации
та делают высев на свежую питательную среду из всех любой антимикробный препарат, производитель обя-
пробирок, где визуально не отмечен рост микроорга- зан определить спектр его активности по отноше-
низма. Для стойких антимикробных веществ, которые нию к тысячам штаммов различных микроорганиз-
адсорбируются на микробных клетках и препятствуют мов, учитывая, что фармакокинетические свойства
их росту даже в свежей питательной среде, применяют соединения должны поддерживать концентрации
соответствующие нейтрализаторы. в сыворотке, в 2-4 раза превышающие минимальную
ингибирующую концентрацию. При выделении кон-
13.3 Определение активности кретных возбудителей используют определенные на-
антибиотиков методом диффузии боры дисков (табл. 25).
в агар
13.4 Ферментные методы
Этот метод точнее, чем метод серийных разведе-
ний, поэтому его чаще используют на практике. Однако 13.4.1 Ускоренный метод определения
методу диффузии присущи определенные недостатки. чувствительности микроорганизма
Критерии для оценки данных, полученных с быстро- к антибиотику
растущими микроорганизмами, не применимы к мед- В чашку Петри наливают 15 мл питательного ага-
леннорастущим штаммам. Поэтому если в качестве ра. После застывания агара на него наносят смесь 4 мл
тест-культуры необходимо использовать медленнора- такого же агара, 1 мл взвеси тест-культуры, приготов-
стущий микроорганизм, применяют метод разведений ленной по стандарту 1 млрд. клеток в 1 мл, и 1 мл 0,2%
или условия испытания отрабатывают в специальных водного раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола (pH
экспериментах. То же можно сказать и о медленно- 7,2-7,3). Вместо тест-культуры можно использовать
диффундирующих антибиотиках. клинический материал. Затем на застывший агар яр-
Глава 13 113
косинего цвета наносят диски, пропитанные антибио- 13.4.3 Определение способности
тиками, и чашки ставят в термостат при 37°C. Через микроорганизмов продуцировать
2-4 часа учитывают результаты по диаметру синих зон β-лактамазу
отсутствия роста. Резистентные к антибиотику микро-
Тест на уреазу
бы восстанавливают краситель, обесцвечивая его или
Аминогликозидные антибиотики, являясь ин-
трансформируя в желтый цвет.
гибиторами синтеза белка, угнетают образование
Данный краситель задерживает рост стафило-
уреазы Proteus mirabilis, используемого в качестве
кокков, поэтому при работе с этим микроорганизмом
тест-организма. Питательную среду, содержащую мо-
раствор индикатора наливают на поверхность чашки
чевину, вносят в два ряда пробирок. В один ряд добав-
в количестве 2-3 мл уже после выдерживания чашки
ляют стандартный раствор испытуемого антибиотика
с дисками в термостате. Избыток индикатора сливают
в определенных концентрациях, в другой ряд — испы-
через 5-7 мин. и учитывают результаты.
туемый раствор. Пробирки засевают Р. mirabilis и че-
Наборы дисков для определения чувствительности
рез 60-75 мин. инкубации измеряют pH с помощью по-
некоторых микроорганизмов тенциометра. Значения pH в пробирках, содержащих
Таблица 25. стандартный раствор, используют для построения
Бактерии Диски с XTB стандартной кривой, которая служит для определения
Enterobacteriaceae Амикацин, ампициллин, цефазолин, количества антибиотика в испытуемом растворе.
и Acinetobacter spp. цефалотоксин, цефотаксим, Тест на люциферазу
гентамицин, тобрамицин, триметоприм- Метод основан на способности аминогликозид-
сульфаметоксазол, норфлоксацин
ных антибиотиков угнетать образование АТФ микроб-
Pseudomonas spp. Амикацин, цефтазидим, гентамицин,
и Acinetobacter spp. мезлоциллин, тобрамицин, триметоприм-
ными клетками. Люминесцентный метод определения
сульфаметоксазол, норфлоксацин АТФ в присутствии люциферазы отличается высокой
Staphylococcus spp. Ампициллин, цефалотин, клиндамицин, чувствительностью. Бактериальную культуру вносят
эритромицин, гентамицин, оксациллин, в пробирки, содержащие стандартный или испытуе-
бензилпенициллин, ванкомицин, мый раствор антибиотика, инкубируют 90 мин., после
триметоприм-сульфаметоксазол,
норфлоксацин
чего определяют количество АТФ в специальном при-
Enterococcus spp. Бензилпенициллин, ампициллин, боре люминометре.
ванкомицин, стрептомицин и гентамицин
(синергидность действия), норфлоксацин 13.4.4 Хроматографические методы
Streptococcus spp. Бензилпенициллин, цефалотин,
левомицетин, эритромицин, ванкомицин, Высокоэффективная жидкостная хроматогра-
норфлоксацин фия (ВЭЖХ) Испытуемый раствор пропускают через
Haemophilus spp. Ампициллин, цефотаксим, цефуроксим, хроматографическую колонку, заполненную носите-
левомицетин, триметоприм-сульфаметок- лем, представляющим собой мелкодисперсный ги-
сазол
дрофобизированный сорбент. Гидрофобное покрытие
носителя варьируется в зависимости от молекулярной
13.4.2 Определение способности массы разделяемой смеси.
микроорганизмов продуцировать При нанесении микроколичества испытуемого
β-лактамазу раствора амфифильные вещества сорбируются на по-
Устойчивость микроорганизмов к пенициллину верхности частиц носителя и вытесняются с нее в гра-
может быть связана с их способностью продуцировать диенте апротонного растворителя (система вода —
фермент β лактамазу, инактивирующий этот антибио- ацетонитрил). Вещества разделяются в соответствии
тик. со своим сродством к сорбенту (гидрофобностью).
В чашку Петри вносят 0,5 мл суточной бульонной Эффективность анализа определяется микронны-
культуры стандартного штамма Staphyloccus aureus, ми размерами частиц носителя, так что время анализа
чувствительного к пенициллину, и 20 мл расплавлен- не превышает 5-10 мин.
ного и охлажденного до 45°C питательного агара. Бы- Раствор на выходе из колонки анализируется
стро перемешивают и оставляют до застывания агара. в проточном УФ-детекторе с одновременной записью.
После этого в центр чашки на поверхность среды по- Положение пика выходящего вещества является его
мещают бумажный диск, содержащий пенициллин. калибровочной характеристикой. Количество веще-
По радиусам к диску петлей подсевают исследуемые ства в нанесенной пробе определяется автоматиче-
культуры. Посевы инкубируют при 37°C 24 часа. ским интегратором.
О способности бактерий продуцировать β-лактамазу Преимуществами метода является высокая ско-
судят по наличию роста стандартного штамма стафи- рость определения, точность, специфичность и чув-
лококка вокруг исследуемой культуры. ствительность.
114 Глава 13
Количественное определение тетрациклина ме- ботанного таким же образом, как испытуемый пре-
тодом ВЭЖХ парат.
Готовят растворы испытуемого образца и стан- Содержание ампициллина в препарате в процен-
дартного препарата тетрациклина и хроматографи- тах (X) рассчитывают по формуле:
руют их попеременно на жидкостном хроматографе
с УФ-детектором, получая не менее 5 хроматограмм
каждого раствора в строго определенном режиме тем-
пературы и скорости подвижной фазы. Количество те-
трациклина в пробе вычисляют по формуле: D0 — величина оптической плотности испытуемо-
го раствора препарата;
DCT — величина оптической плотности раствора
стандартного образца;
а — навеска стандартного образца ампициллина,
X — количество тетрациклина в испытуемом об- в граммах;
разце, в граммах; b — содержание ампициллина в стандартном об-
Sобр — среднее значение площадей пиков тетраци- разце, в процентах.
клина, вычисленное из хроматограмм раствора испы-
туемого препарата; 13.4.6 Иммунологические методы
SСТ — среднее значение площадей пиков тетраци- Иммунологические методы основаны на исполь-
клина, вычисленное из хроматограмм стандартного зовании специфических антител, поэтому требуют
образца; длительной предварительной подготовки (получения
А — содержание тетрациклина в стандартном об- антител путем иммунизации животных определен-
разце, в граммах. ным антибиотиком). Вторым компонентом реакции
является меченый препарат, аналогичный определя-
13.4.5 Спектрофотометрические методы емому. Метка может быть радиоактивной, флуорес-
Количественное определение ампициллина спек- цирующей или ферментной, определяющей способ
трофотометрическим методом основано на том, что регистрации результатов анализа. Результат зависит
ампициллин при нагревании в растворе CuS04 обра- от конкурентного связывания с антителами испыту-
зует окрашенный комплекс. Точную навеску образца емого препарата и меченого аналога: чем больше ко-
антибиотика растворяют в буферном растворе суль- личество испытуемого препарата присутствует в сме-
фата меди и выдерживают на водяной бане при 80°C си, тем меньшее количество меченого аналога будет
30 мин., затем быстро охлаждают. Оптическую плот- связано с антителами. Антитела фиксируют в лунках
ность раствора измеряют на спектрофотометре при планшета, куда последовательно вносят испытуемый
длине волны 320 нм, используя в качестве раствора раствор и тест-систему (меченый аналог и необходи-
сравнения непрогретый буферный раствор препарата. мый реагент-детектор). Достоинством иммунологи-
Параллельно измеряют оптическую плотность ческих методов является их высокая специфичность
раствора стандартного образца ампициллина, обра- и чувствительность.
Глава 13 115
Глава 14. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ
ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ
ПРЕПАРАТОВ
Избирательность действия антимикробных пре- кислоту и два остатка D-аланина на С-конце пептида.
паратов связана со структурными и метаболическими Липидноситель — это высоколипофильный ундекапре-
различиями клеток микро- и макроорганизма. Химио- нилафосфат, который располагается в цитоплазматиче-
терапевтический препарат действует на определенный ской мембране и действует как акцептор предшествен-
участок системы метаболизма микробной клетки, ко- ников пептидогликана на ее внутренней поверхности.
торый является его мишенью. Такими мишенями мо- N-ацетилмурамилпентапептид и N-ацетилглюкозамин
гут быть отдельные участки синтеза клеточной стенки, последовательно переходят от своего УДФ-носителя
белка, нуклеиновых клеток и т. д. на липидноситель с освобождением уридинмонофос-
фата (УМФ) и УДФ, соответственно, и образовани-
14.1 Ингибиторы биосинтеза ем β-1,4-гликозидной связи. Дисахаридпентапептид
компонентов клеточной стенки присоединяется к липидоносителю пирофосфатной
связью. В этой форме он транслоцируется через цито-
14.1.1 Биосинтез пептидогликана плазматическую мембрану и присоединяется к суще-
Пептидогликан (муреин) является важнейшей ствующему пептидогликану клеточной стенки в зоне
структурой клеточной стенки бактерий, поэтому на- ее роста. Соответствующий генетический контроль
рушение его биосинтеза некоторыми антибиотиками обеспечивает сохранение характерной формы клетки
приводит к гибели микроорганизма или прекращению за счет присоединения вновь синтезированных эле-
размножения клеток. Структура, подобная пептидо- ментов в определенном локусе.
гликану, отсутствует в клетках млекопитающих, что Предполагают, что линейный гликан, присоеди-
обеспечивает избирательность действия антибиотика. ненный к другой молекуле липидоносителя, служит
Молекула пептидогликана состоит из линейных цепей в клеточной стенке местом связывания вновь транс-
чередующихся единиц N-ацетилмурамовой кисло- лоцированного дисахаридпентапептида. Линейный
ты и N-ацетилглюкозамина, связанных поперечными гликан соединяется с ним с образованием гликозидной
пептидными мостиками. Предшественники пепти- связи между остатком N-ацетилмурамовой кислоты
догликана синтезируются в цитоплазме, собираются гликана и N-ацетилглюкозамина вновь транслоциро-
на молекуле липида-носителя, на цитоплазматической ванного дисахаридпентапептида. Реакция трансглико-
мембране и на первом этапе включаются в клеточную зилирования приводит к увеличению линейного гли-
стенку, образуя цепи гликана без поперечных сшивок. кана на одну дисахаридную единицу и освобождению
На втором этапе эти цепи сшиваются с ранее образо- липида-носителя в форме пирофосфата. Носитель
ванным пептидогликаном с помощью фермента, лока- утрачивает одну молекулу фосфата под действием пи-
лизованного на внешней стороне цитоплазматической рофосфорилазы и возвращается в цикл транслокации
мембраны. Эти этапы биосинтеза пептидогликана дисахаридпентапептида из цитоплазмы к клеточной
существуют у всех грамположительных и грамотри- стенке.
цательных бактерий, межвидовые различия могут ка- В клеточной стенке происходит образование по-
саться некоторых деталей, в частности, состава амино- перечной сшивки. Вновь синтезированный линейный
кислот в пептидных мостиках. гликан присоединяется к пептидогликану стенки пу-
Подробно процесс изучен у Escherichia coli. Пред- тем образования пептидных связей. Эту функцию вы-
шественники пептидогликана — N-ацетилглюкозамин полняют транспептидазы (ТПазы), расположенные
и N-ацетилмурамилпентапептид синтезируются в ци- на внешней части цитоплазматической мембраны.
топлазме, каждый из них связан с молекулой носи- Вначале ТПазы связываются с остатком D-аланил-
теля — уридиндифосфата (УДФ), обеспечивающего D-аланина пентапептида в линейном гликане. Пеп-
энергией реакции синтеза. Пентапептид, соединенный тидаза отщепляет терминальный D-аланин, а ТПаза
с N-ацетилмурамовой кислотой, содержит L-аланин, соединяется с С-концом оставшегося D-аланина, об-
D-глутаминовую кислоту, мезо-диаминопимелиновую разуя активный интермедиат. Следующая стадия ре-
116 Глава 14
акции транспептидирования заключается в переносе молекулярной массы эти антибиотики не проникают
ацильной группы терминального остатка D-аланина в клетки грамотрицательных бактерий и действуют
к акцепторной аминогруппе диаминопимелиновой только на грамположительные микроорганизмы.
кислоты ближайшей цепи пептидогликана. Новая пеп- Д-циклосерин действует на стадии образова-
тидная связь образуется между карбоксильной груп- ния β-аланил-β-аланина, ингибируя активность двух
пой D-аланина вновь синтезированной цепи гликана ферментов: аланин-рацемазы, которая конвертирует
и аминогруппой диаминопимелиновой кислоты суще- L-аланин в β-аланин, и синтетазу, которая образует
ствующего пептидогликана, а ТПаза освобождается. дипептид. Циклосерин действует как конкурентный
Предполагается, что энергия, освобождающаяся при ингибитор этих ферментов, поскольку имеет струк-
разрыве связи D-аланил-D-аланин используется для турное сходство с одной из возможных конформаций
реакции образования пептидной сшивки. β-аланина.
Пептидогликан Е. coli и многих бацилл имеет Эхинокандины — новый класс антифунгальных
лишь 20-30% поперечных сшивок. Однако все свобод- антибиотиков, активных против Candida spp.; их полу-
ные пептиды, соединенные N-ацетилмурамовой кис- синтетические аналоги действуют также на аспергил-
лотой, являются тетрапептидами, благодаря действию лы и Pneumocystis carinii, являясь неконкурентными
D, D-Kapбокcиnenтидазы (КПазы), которая подобно ингибиторами (1,3)-p-β-глюкан синтазы — фермента,
ТПазе, отщепляет терминальный D-аланин без обра- участвующего в синтезе глюкана — основного компо-
зования поперечной сшивки. Помимо этих ферментов нента клеточной стенки грибов.
в синтезе пептидогликана участвует эндопептидаза,
которая расщепляет пептидные сшивки, возможно, 14.2 Ингибиторы синтеза миколовых
создавая локусы для присоединения новых цепей пеп- кислот и арабиногалактана
тидогликана; трансгликозилаза присоединяет к пепти- у микобактерий
догликану новые цепи гликана, которые затем сшива-
ются поперечными связями с помощью ТПазы. Клеточная стенка микобактерий содержит кова-
лентно связанные пептидогликан, арабиногалактан
14.1.2 Ингибиторы биосинтеза и миколовые кислоты (гидроксилированные жирные
пептидогликана кислоты). Нековалентно связанные липидные компо-
ненты представлены гликолипидами, фосфолипидами
Ингибиторами биосинтеза пептидогликана и восками. Липидные компоненты обеспечивают вы-
являются пенициллины, цефалоспорины и другие сокую устойчивость микобактерий к антимикробным
β-лактамы — цефокситин (цефамицин), латамоксеф агентам.
(оксацефем), имипенем (карбапенем), азтреонам (мо- Изониазид в клетках микобактерий активируется
нобактам), угнетающие образование поперечных свя- системой ферментов каталаза-пероксидаза. В активи-
зей. Такие антибиотики, как ванкомицин, тейхопланин рованной форме он ингибирует дегидрогеназу, которая
и циклосерин, ингибируют другие стадии биосинтеза. катализирует образование двойной связи при С24 мико-
β-лактамы, являясь структурными аналогами ловой кислоты.
β-аланил-β-аланина, конкурентно ингибируют ТПа- Этамбутол блокирует синтез арабиногалактана,
зы и КПазы путем образования ковалентных связей ингибируя арабинозилтрансферазу — фермент, обе-
с активными центрами этих ферментов с расщепле- спечивающий перенос декапрениларабинозы при син-
нием β-лактамной связи. Связь фермента с β лакта- тезе полисахарида.
мом значительно прочнее связи с его естественным
субстратом. Кроме того, эти антибиотики активируют 14.3 Ингибиторы синтеза белка
аутолитические ферменты, ответственные за удале-
ние деградирующих компонентов клеточной стенки Процессы синтеза белка у млекопитающих и бак-
и разъединение дочерних клеток после деления. терий во многом сходны, однако в них имеются не-
Под действием β-лактамов возникают морфоло- которые различия, обеспечивающие избирательность
гически измененные клетки и происходит их гибель. действия многочисленных антибиотиков, антимикроб-
Эффект зависит от концентрации антибиотика. ная активность которых связана с подавлением синте-
Ванкомицин и тейхопланин имеют сродство за белка. Многие антибиотики избирательно воздей-
к β-аланил-β-аланиновой части предшественников ствуют на субъединицы рибосом прокариот (30 S или
пептидогликана. Они связываются с этой областью 50 S).
и ингибируют перенос линейного гликана в клеточной Аминогликозиды избирательно взаимодействуют
стенке к дисахаридпентапептиду на его липидном но- с 30 S субъединицей рибосомы. Стрептомицин со-
сителе. единяется с одним из 21 белковых компонентов этой
Таким образом, сборка пептидогликана останавли- субъединицы, являющимся местом связывания фак-
вается до стадии транспептидирования. Из-за большой тора инициации IF-3, препятствуя началу синтеза бел-
Глава 14 117
ка. Стрептомицин также нарушает аминоацильный 14.4 Препараты, нарушающие функции
участок 30 S субъединицы, препятствуя размещению хромосомы
на нем аминоацил-тРНК. В результате происходит или
угнетение синтеза белка, или неправильное считыва- Репликация и транскрипция ДНК у бактерий
ние генетического кода. принципиально не отличаются от этих процессов
Другие аминогликозиды также соединяются у млекопитающих, однако существуют и важные раз-
с 30 S субъединицей рибосомы в локусе близком, личия, на которых основана селективная активность
но не идентичном локусу связывания со стрептомици- некоторых антибактериальных препаратов.
ном, и угнетают синтез белка. Эффективность амино- Хинолоны (синтетические производные налидик-
гликозидов возрастает в результате их активного по- совой кислоты), например, норфлоксацин и ципроф-
глощения бактериальной клеткой. Процесс начинается локсацин ингибируют ДНК-гиразу — фермент, уни-
с электростатического связывания антибиотика с от- кальный для бактерий, и таким образом блокируют
рицательно заряженной поверхностью клетки. При репликацию хромосомы, но не влияют на механизмы
этом аминогликозиды повреждают внешнюю мембра- репликации ДНК, которые не зависят от гиразы.
ну грамотрицательных бактерий, что сопровождает- Метронидазол и нитрофурантион. Предпола-
ся высвобождением некоторых липополисахаридов, гают, что действие этих веществ зависит от неста-
белков и фосфолипидов. Далее происходит активный бильных метаболитов, которые образуются путем
транспорт антибиотика через цитоплазматическую восстановления внутри бактериальной клетки. Эти
мембрану и его связывание с рибосомами. Анаэроб- неидентифицированные продукты вызывают разрыв
ные микроорганизмы не обладают системой активно- цепи ДНК. Метронидазол обладает специфической
го транспорта аминогликозидов, поэтому резистентны активностью против анаэробных бактерий, у которых
к этой группе антибиотиков. упомянутый метаболит образуется при низком уровне
Тетрациклины связываются с 30 S субъединицей редокс-потенциала. Резистентность к метронидазолу
рибосомы и препятствуют связыванию аминоацил- не описана.
тРНК с аминоацильным сайтом. 40 S субъединица Рифампицин связывается с одним из белков, со-
рибосом млекопитающих также связывается с тетра- ставляющих комплекс РНК-полимеразы, и блокирует
циклинами, селективное действие этих антибиотиков действие этого фермента на стадии инициации транс-
основано на избирательный проницаемости. Бактерии крипции. Антибиотик не останавливает уже начав-
активно поглощают тетрациклины, концентрация ко- шийся процесс транскрипции. Резистентные штаммы
торых в цитоплазме может в 50 раз превышать концен- появляются быстро в результате изменения строения
трацию во внешней среде, тогда как у млекопитающих молекулы РНК-полимеразы, которая более не связыва-
такая система активного транспорта отсутствует. ет рифампицин.
Хлорамфеникол избирательно угнетает синтез Флуцитозин (5-фторцитозин) — это антифунгаль-
белка, связывая аминоацильный сайт 50 S субъедини- ный агент, наиболее активный против видов Candida,
цы рибосомы и ингибируя ее пептидилтрансферазу. Cryptococcus, Torulopsis. Внутри клетки гриба флуци-
Этот фермент участвует в образовании новой пептид- тозин деаминируется до 5-фторурацила, который угне-
ной связи между растущим пептидом в пептидильном тает синтез РНК; сам 5-фторурацил плохо проникает
сайте рибосомы и аминокислотой на аминоацил-тРНК через клеточные барьеры. Candida albicans превраща-
в аминоацильном сайте. Хлорамфеникол проникает ет флуцитозин в 5-фтордезоксиуридинмонофосфат,
также и в клетки млекопитающих, но не связывается который угнетает синтез ДНК, ингибируя тимидилат-
с 80 S рибосомами. Способность проникать в клетки синтетазу.
обеспечивает эффективность его применения при ле-
чении заболеваний, вызванных внутриклеточными па- 14.5 Антагонисты фолатов
разитами, например, Salmonella typhi.
Эритромицин избирательно связывается с 50 S Существуют принципиальные различия в ме-
субъединицей рибосомы в сайте, близко расположенном таболизме фолатов у бактерий и млекопитающих.
к месту связывания хлорамфеникола, и угнетает процесс Бактерии не способны поглощать экзогенный фолат
транслокации. Эритромицин не препятствует выходу и должны синтезировать его сами. Процесс синтеза
пептидил-тРНК из аминоацильного сайта, но угнетает включает синтез дигидроптеровой кислоты из моле-
высвобождение тРНК из пептидильного сайта и препят- кул птеридина и n-аминобензойной кислоты. Затем
ствует перемещению туда пептидил-тРНК. из дигидроптеровой и глутаминовой кислот образу-
Линкомицин и клиндамицин связываются с 50 S ется дигидрофолат (ДГФ). ДГФ восстанавливается
субъединицей в области, близкой к области связыва- дигидрофолатредуктазой с участием НАДФН2 до те-
ния хлорамфеникола и эритромицина, и блокируют трагидрофолата (ТГФ). ТГФ является переносчиком
элонгацию полипептидной цепи, ингибируя пептидил- моноуглеродных радикалов (— СНО и — СН3) в био-
трансферазу. синтезе аденина, гуанина, тимина и метионина. Та-
118 Глава 14
ким образом, нарушение синтеза ТГФ влияет на спо- средства, а как дезинфектанты, антисептики и кон-
собность клетки синтезировать нуклеиновые кислоты серванты. Полимиксин — один из мембраноактивных
и белки и угнетает ее рост. Клетки млекопитающих агентов, который может быть использован как тера-
способны поглощать ДГФ из продуктов питания певтическое средство против инфекций, вызванных
и превращать его в ТГФ с помощью дигидрофолатре- Pseudomonas spp., однако токсичность этого препарата
дуктазы (ДГФР). Сульфонамиды и триметоприм се- ограничивает его применение. Полиены и имидазолы
лективно угнетают метаболизм фолатов у бактерий. являются важными антифунгальными средствами. Их
Первые ингибируют синтез дигидроптеровой кисло- селективное действие основано на тонких различиях
ты, который не происходит у млекопитающих; второй в составе и биосинтезе мембран грибов и млекопита-
обладает селективным сродством к бактериальной ющих.
ДГФР. Оба эти вещества активны только в отсутствие
в питательной среди аденина, гуанина, тимина и ме- 14.6.2 Полиены
тионина.
Сульфонамиды, являясь структурными аналогами Полиены, из которых наибольшее значение имеют
п-аминобензойной кислоты, конкурентно ингибируют амфотерицин В и нистатин, обладают сильным срод-
ее включение в реакцию образования ДГФ. ством к эргостеролу, что обеспечивает их селективное
Триметоприм — аналог ДГФ ингибирует дигидро- действие на клетки грибов. Гидрофобная область по-
фолатредуктазу; бактериальный фермент в несколько лиена связывается со стеролами мембраны, в резуль-
тысяч раз более чувствителен к нему, чем фермент тате чего гидроксилированная гидрофильная часть
млекопитающих, поэтому триметоприм не токсичен молекулы антибиотика втягивается внутрь мембраны.
в дозах, применяемых при лечении микробных ин- Таким образом в мембране возникают каналы, через
фекций. Часто триметоприм используют в комбина- которые цитоплазматическое содержимое (ионы К+,
ции с сульфонамидами, обычно с сульфаметоксазолом аминокислоты, нуклеотиды) выходит из клетки. По-
в форме котримоксазола. Обе стадии, нарушающие скольку резко снижается pH цитоплазмы, макромоле-
метаболизм фолатов, синергидны, таким образом, со- кулы разрушаются, и клетка погибает. Сродство поли-
четанное применение препаратов высокоэффективно, ентов к холестеролу ниже, чем к эргостеролу, поэтому
однако не предупреждает появление резистентных клетки млекопитающих повреждаются меньше, одна-
форм микроорганизмов. ко при внутривенном введении амфотерицина В при
лечении системных инфекций страдают почки.
14.6 Антимикробные
агенты, воздействующие 14.6.3 Имидазолы
на цитоплазматическую мембрану Имидазолы, из которых наиболее широко применя-
ются миконазол и кетоконазол, имеют широкий спектр
14.6.1 Мембраны бактерий активности и действуют на дерматофиты, диморфные
Мембраны бактерий существенно отличаются грибы, дрожжи, а также на грамположительные бак-
от мембран клеток грибов и млекопитающих: бакте- терии, хотя не используются при лечении бактериаль-
риальные мембраны не содержат стеролов, мембраны ных инфекций. Механизм их действия определяется
грибов содержат преимущественно эргостерол, а мле- повреждением мембран при связывании имидазолов
копитающих — холестерол. Но в основном мембра- с ненасыщенными жирными кислотами, присутству-
ны клеток про- и эукариот имеют сходную структуру. ющими в фосфолипидах мембран. Кроме того ими-
У бактерий двойной слой фосфолипидов (фосфатиди- дазолы угнетают биосинтез эргостерола, в частности,
лэтаноламин, фосфатидилглицерол, дифосфатидил- деметилирование 14-а-метильного радикала ланосте-
глицерол) составляет 20-30% массы мембраны. Про- рола, что сопровождается накоплением ланостерола,
теины (50-70% массы) располагаются по обе стороны оказывающего токсичное действие на клетку. Угне-
мембраны и проникают сквозь слой липидов. Проте- тается также синтез триглицеридов и фосфолипидов.
ины и фосфолипиды соединены ионными, гидрофоб- Наконец, кетокопазол ингибирует транспорт электро-
ными и водородными связями. нов в дыхательной цепи грибов в аэробных условиях
Большинство мембраноактивных агентов (спир- за счет угнетения сукцинат- и НАДН- оксидаз. Важ-
ты, фенолы, четвертичные аммониевые соединения, ность последнего эффекта подтверждается значи-
бисбигуаниды) повреждают целостность мембраны, тельно более низкой ингибирующей концентрацией
нарушая ее метаболические функции и вызывая утечку препарата в аэробных условиях по сравнению с ана-
содержимого цитоплазмы. Действие этих веществ сла- эробными.
бо селективно, т. е. подобный эффект они производят Производные аллиламина (батрафен, ламизил) ин-
и в отношении мембраны млекопитающих. Поэтому гибируют скваленэпоксидазу в клеточной мембране
они используются в основном не как терапевтические гриба, в результате подавляется биосинтез эргостерола
Глава 14 119
на раннем этапе, эффективны в отношении дермато- проникают в ее липидный слой и вызывают ее пере-
фитов, Candida spp. стройку с образованием каналов, нарушающих прони-
цаемость мембраны. Избирательность действия зави-
14.6.4 Катионные пептиды сит от липидного состава мембран микроорганизмов
Катионные пептиды характеризуются высоким и млекопитающих. Катионные пептиды могут также
содержанием основных и гидрофобных аминокислот, воздействовать на внешнюю мембрану грамотрица-
поэтому их молекула амфипатична, т. е. обладает по- тельных бактерий, конкурентно замещая в ней ионы
ложительно заряженной гидрофильной и гидрофоб- Са 2+ и Mg 2+, что приводит к нарушению ее структуры,
ной областями. Они взаимодействуют с цитоплазма- а также ковалентно связывать сульфгидрильные груп-
тической мембраной за счет электростатических сил, пы белков клеточной оболочки.
120 Глава 14
Глава 15. УСТОЙЧИВОСТЬ МИКРООРГАНИЗ-
МОВ К ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИМ
ВЕЩЕСТВАМ
Глава 15 121
Хлорамфеникол инактивируется резистентными белков или 23 S РНК, входящих в ее состав), что сни-
штаммами бактерий (Salmonella spp., Haemophilus жает аффинитет антибиотика к рибосоме.
influenzae и др.) путем ацетилирования (рис. 68). Аце- Триметоприм, который в клинике часто использу-
тилтрансфераза, осуществляющая эту реакцию, инду- ют в сочетании с сульфонамидом сульфаметаксозолом,
цибельна у грамположительных бактерий и конститу- является ингибитором бактериальной дигидрофолатре-
тивна у грамотрицательных. дуктазы — ключевого фермента метаболизма фолиевой
кислоты. Резистентные штаммы синтезируют дигидро-
фолатредуктазу, устойчивую к действию антибиотика.
Устойчивость к триметоприму часто сочетается
с устойчивостью к сульфонамидом, связанной с мо-
дификацией мишени последних — дигидроптероат
синтетазе (ДПС). Кроме того, некоторые резистентные
к этим препаратам микроорганизмы (Staphylococcus
aureus) продуцируют необычно большое количество
п-аминобензойной кислоты, которая конкурентно вы-
тесняет сульфонамид из активного центра ДПС.
Резистентность к рифамицину определяется мо-
дификацией мишени антибиотика — ДНК-зависимой
РНК-полимеразы, к налидиксовой кислоте — модифи-
кацией ДНК-гиразы.
122 Глава 15
Наиболее часто такая мозаичность обнаруживается сре- 2) ингибиторов ферментов, инактивирующих ан-
ди генов, определяющих факторы вирулентности, и ге- тибиотики;
нов устойчивости к лекарственным препаратам и связа- 3) веществ, подавляющих активный выброс ан-
на с существованием генных кассет. Кассеты с генами тибиотика из клетки патогена;
резистентности к антибиотикам являются самыми ма- 4) против новых мишеней, например, ферментов,
ленькими по размеру мобильными генетическими эле- участвующих в синтезе белка и пептидогликана;
ментами. Они содержат один ген и специфическую 5) новая техника скрининга “in vivo gene expressing
последовательность, выполняющую функцию реком- technology” против тех процессов микроорганизма,
бинационного сайта. Кассеты являются дискретными которые имеют место в организме больного, но не на-
генетическими элементами, объединенными в более блюдаются in vitro, например, синтез некоторых по-
крупную мобильную структуру — интегрон. Кассет- лисахаридов, факторов адгезии, ферментов патоген-
ный ген обычно не содержит промотора и его экспрес- ности и т. п. Для выявления генов, кодирующих эти
сия зависит от промотора интегрона. процессы, сравнивают РНК-транскрипты, образующи-
Гены, кодирующие резистентность, могут стабиль- еся in vivo и in vitro. С помощью обратной транскрип-
но существовать, будучи невостребованными, т. е. в от- тазы получают тотальную ДНК, которую исследуют
сутствие селективного давления, это подтверждается в реакции гибридизации с библиотекой генов данного
существованием устойчивых к биоцидам штаммов микроорганизма. Цель скрининга — идентификация
в природных субстратах, не содержащих ХТВ. Однако новых генов и поиск способов инактивации их экс-
не исключается возможность, что факторами отбора мо- прессии. Наиболее перспективные мишени, не имею-
гут быть и другие вещества, например, тяжелые метал- щие аналогов у эукариот — факторы вирулентности
лы, т. к. гены резистентности могут быть интегрированы и механизмы регуляции их экспрессии. Последние
в генные кассеты (кластеры), являющиеся оперонами, включают распознавание условий среды (рецепцию),
соединяющими гены устойчивости ко многим неблаго- передачу сигнала от рецептора геному и синтез соот-
приятным факторам. Сохранению генов резистентности ветствующего фактора вирулентности.
в природе благоприятствует широкий круг их хозяев, Перспективны также разработки по созданию пре-
способность к взаимодействию которых столь выраже- паратов, блокирующих адгезию, систему секреции,
на, что селекция, определяющая приспособляемость, и систему регуляции транскрипции. Один из универ-
должна была происходить задолго до эры антибиотиков, сальных регуляторов последней — механизм чувства
созданной человеком (например, в почвенном биоценозе, кворума у микроорганизмов. Его принцип — актива-
содержащем продуценты антибиотиков). ция транскрипции специфических генов при достиже-
Наряду с известными ранее способами горизон- нии порогового уровня связывания белка — активатора
тального переноса генов резистентности описан новый транскрипции с низкомолекулярным аутоиндуктором.
механизм передачи генов — ретранспорт, на первом Этот механизм обеспечивает быстрый рост культуры
этапе которого трансмиссивная плазмида донора про- при больших посевных дозах и участвует в экспрес-
никает в клетку-реципиент и интегрирует с мобилизу- сии факторов вирулентности. Ингибиторы детерми-
емой ею плазмидой; на втором этапе она возвращается нант вирулентности, вероятно, будут иметь низкую
в клетку донора, обогащенная новыми генами. Моби- активность in vitro и, что ценно, не будут действовать
лизуемыми элементами могут быть не только плазми- на микроорганизмы, лишенные факторов вирулентно-
ды, но и сегменты хромосомы, которые вырезаются сти, т. е. на нормальную микробиоту.
с участием конъюгативных транспозонов. В качестве химиотерапевтических веществ пред-
лагают использовать фрагменты белковых факторов
15.3 Пути и способы предотвращения врожденного иммунитета, причем видоспецифиче-
развития микробной резистентности ских, т. е. не являющихся чужеродными. Одним из та-
к ХТВ ких факторов может быть рекомбинантный фрагмент
белка нейтрофилов человека, нейтрализующий эндо-
Развитие микробной резистентности и широкое токсин грамотрицательных бактерий и обладающий
ее распространение требует постоянного поиска но- антимикробным действием.
вых антимикробных препаратов. Активные исследова- Поиск новых антимикробных средств предусма-
ния, проводимые с начала эры антибиотиков, привели тривает характеристику не только генома, но и про-
к тому, что скрининг с целью поиска нового продуцен- теома, т. е. всех без исключения белков клетки для
та часто заканчивается открытием “старого” антибио- определения ее состояния в любой момент. Проте-
тика. Поэтому в настоящее время разрабатываются но- омика характеризует фенотип клетки на любой ста-
вые направления поиска: дии клеточного цикла и в любых внешних условиях,
1) препаратов, воздействующих на мишени, ко- таким образом, дает необходимые знания для таргет-
торые претерпели модификацию под действием “ста- ного скрининга — поиска препаратов, направленных
рых” антибиотиков; на определенную мишень (target).
Глава 15 123
Глава 16. ДЕЗИНФЕКТАНТЫ, АНТИСЕПТИКИ
И КОНСЕРВАНТЫ
124 Глава 16
Антибактериальная активность некоторых химических веществ
Таблица 26.
Класс соединения Активность против Уровень антибактериальной
M. tuberculosis спор активности в рабочих
концентрациях
Фенолы
крезол + + высокий
хлороксифенол - - низкий
бисфенолы - - низкий
Спирты
этанол + - средний
изопропанол
Альдегиды
глутаральдегид + + высокий
формальдегид + + высокий
Галогены
гипохлорит + + высокий
Хлорамины
йод, йодофоры + + высокий
Бигуаниды
хлоргексидин - - средний
ЧАС
бензалкониума хлорид - - средний
цетримид - - средний
Соединения Hg
тиомерсал (мертиолат) - - низкий
снижая их концентрацию. Активность биоцидов [31] но уменьшается при разбавлении растворов и в при-
требует присутствия воды, обеспечивающей их про- сутствии органических веществ. Они более активны
никновение в клетку, и зависит от содержания в ней при кислых значениях pH. Их главный недостаток —
ионов. Некоторые факторы, влияющие на активность токсичность. Замещенные фенолы менее токсичны,
наиболее распространенных биоцидов, приведены но и менее активны, чем простые фенолы, особенно
в табл. 29, табл. 30. против грамотрицательных бактерий.
Фенол (карболовая кислота) в настоящее время
16.5 Группы химических соединений применяется ограниченно. Впервые он был предложен
дезинфектантов (рис. 69) Листером в 1867 г. как антисептик и используется как
стандарт при оценке других дезинфектантов в тесте
определения фенольного коэффициента.
16.5.1 Фенолы Синтетические фенолы. Модификация молеку-
Фенолы одни из первых нашли применение как лы фенола (рис. 70) позволяет получить производные
дезинфектанты и консерванты. Они быстро убива- с улучшенными свойствами. Например, хлорокрезол
ют бактерии, но не их споры. Их активность замет- используется в концентрации 0,1% для консервации
Глава 16 125
Антивирусная активность* некоторых дезинфектантов и антисептиков
Таблица 28.
Агент Оболочечные вирусы Безоболочечные энтеро-, ВИЧ, HTLV III Вирус гепатита В
оспо-вакцины, полиококсаки-, рино-,
герпеса, гриппа эковирусы
Изопропанол 30% ** 20-35% **
Этанол 40% 70-95% 20-35% (инструменты) 80%
Формальдегид 2% 8% 0,5% 2%
Глутаральдегид 2% 2% 1% 0,1-1%
Натрия гипохлорид 0,2% (акт. Cl2) 0,2% 0,05-0,2% (пол, мебель) 0,05% (чистая поверхность)
0,5% (кровь) 0,5% (кровь)
5% (сыворотка)
**
Фенолы 1% лизол ** 0,5%
5% фенол лизол **
Водород пероксид ** ** 0,3% 0,05% (чистая поверхность)
Йодофоры 0,2% 0,5% ** 0,5% (кровь)
*Гибель вирусов через 10-30 мин. контакта при 21-25°С, титр с.10
**Нет данных
Хлороксифенол сильное
Примечания: (++) — очень выражено; (+) — умеренно выражено; (+-) — слабо выражено; (-) — отсутствует.
126 Глава 16
Рис. 69. Классификация ДС
по химическому
составу [32, 33]