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MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
ELABORACIÓN:
Bióloga Silvia Vega Chirinos
Doctor César Náquira Velarde
CAPÍTULO I
Trypanosoma cruzi ................................................................................... 11
CAPÍTULO II
Diagnóstico de laboratorio ....................................................................... 21
CAPÍTULO III
Obtención de la muestra sanguínea ....................................................... 29
CAPÍTULO IV
Examen de la sangre: en fresco, gota gruesa, frotis .............................. 33
CAPÍTULO V
Técnicas de concentración: microconcentración, concentración
de Strout .................................................................................................... 37
CAPÍTULO VI
Hemocultivo .............................................................................................. 41
CAPÍTULO VII
Xenodiagnóstico ....................................................................................... 47
CAPÍTULO VIII
Hemaglutinación indirecta (HAI) .............................................................. 51
CAPÍTULO IX
ELISA ......................................................................................................... 57
CAPÍTULO X
Inmunofluorescencia indirecta (IFI) ......................................................... 63
CAPÍTULO XI
Control de calidad .................................................................................... 69
CAPÍTULO XII
Bioseguridad ............................................................................................. 73
PRESENTACIÓN
El comité de redacción
INTRODUCCIÓN
CAPÍTULO I
Trypanosoma cruzi
Figura 1
Figura 2
a) VECTORIAL
El principal mecanismo de transmisión se produce por contacto de la
piel abierta o mucosas con las heces de los triatominos infectados.
Generalmente esto ocurre en forma mecánica al rascarse después de la
picadura del insecto. El período de incubación es aproximadamente de
4 a 15 días.
En el Perú todas las regiones naturales registran especies de
triatominos (figura 3). De las 19 especies descritas hasta el momento,
Triatoma infestans, Pastrongylus herreri (figura 4), Rhodnius
ecuadorensis, Triatoma carrioni y Pastrongylus chinai, serían los más
importantes que han sido hallados infectados naturalmente (figura 5).
b) NO VECTORIAL
Otras formas de adquirir la infección son:
• Transfusión sanguínea.
• Transmisión transplacentaria.
• Transplante de órganos.
• Accidentes en el laboratorio.
A B
Forma aguda
Se hace evidente después de las primeras semanas de ocurrida la adqui-
sición del parásito, con un cuadro febril y presencia o no del chagoma de
inoculación como nódulo o úlcera, generalmente en cara o miembros su-
periores. Ocasionalmente se observa el signo de Romaña, que consiste
en edema bipalpebral unilateral y ganglio preauricular aumentado en volu-
men (Figura 6).
Forma crónica
Se hace evidente después de meses o años de ocurrido el ingreso del
parásito. Las manifestaciones más frecuentes son de naturaleza cardíaca
(insuficiencia cardíaca), nerviosa y digestiva (megaesófago, megacolon).
En estas formas son escasos los trypomastigotes en sangre y amastigotes
en tejidos.
Forma congénita
Corresponde a niños que nacen infectados por pasaje del parásito a tra-
vés de la placenta de la madre. Se trata de niños prematuros que presen-
tan generalmente hepatoesplenomegalia con gran cantidad de
trypomastigotes en sangre y amastigotes en tejidos.
CAPÍTULO II
DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO
ANTECEDENTE EPIDEMIOLÓGICO
SÍ
ASINTOMÁTICO
SINTOMÁTICO
( PORTADOR)
SOSPECHA
XENODIAGNÓSTICO SEGUIMIENTO
NEGATIVO
PCR CLÍNICO
POSITIVO
DIAGNÓSTICO
POSITIVO
CONFIRMADO
Figura 8
GOTA FRESCA + - +
GOTA GRUESA ++ - ++
MICROCONCENTRACIÓN +++ - +++
CONCENTRACIÓN
DE STROUT
+++ - +++
- : No útil
+/- : Utilidad relativa
+ : Util
Ac : Anticuerpos
COMPONENTE PARASITOLÓGICO
MICROCONCENTRACIÓN , CONCENTRACIÓN DE STROUT,
HEMOCULTIVO
HAI, ELISA, IFI , INMUNOBLOT
CARACTERIZACIÓN BIOLÓGICA Y MOLECULAR DE T. cruzi
DESARROLO DE TÉCNICAS BIOMOLECULARES: PCR
COMPONENTE ENTOMOLÓGICO
XENODIAGNÓSTICO
CONFIRMACIÓN TAXONÓMICA DE LOS VECTORES
INVESTIGACIÓN DE INFECCIÓN NATURAL DE TRIATOMINOS
SUSCEPTIBILIDAD DE LOS TRIATOMINOS A LOS INSECTICIDAS
TÉCNICAS ALTERNATIVAS DE CONTROL VECTORIAL
INFORMACIÓN Y MUESTRAS
RESULTADOS
CAPACITACIÓN CONTROL DE CALIDAD
DE
CONCENTRACIÓN DE STROUT , MICROCONCENTRACIÓN
HEMOCULTIVO
HAI, ELISA, IFI
ENVIO
DE
COMPONENTE ENTOMOLÓGICO
IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA, INVESTIGACIÓN DE INFECCIÓN
NATURAL DEL TRIATOMINO
ENVIO
26
REACTIVO (HAI o IB)
SEPARA EL
SUERO O
PLASMA
- - Resultado
Resultado
Envía muestra I
Envía muestra
+ +
REPORTA REPORTA
REACTIVO REACTIVO
- : No reactivo
+: Reactivo
+ y +: Reactivo en ELISA y reactivo en IFI
I NSTITUTO N ACIONAL
+ y -: Reactivo en ELISA y no reactivo en IFI
DE
Figura 11. Las muestras con resultado indeterminado, se vuelve a examinar. Si persiste el resultado se solicita y se examina una
nueva muestra.
S ALUD
DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA
MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA TRYPANOSOMIOSIS AMERICANA
BIOLÓGICA Y
HEMOCULTIVO
MOLECULAR DE
TRYPANOSOMAS
GOTA GRUESA
MICROCONCENTRACIÓN
CONCENTRACIÓN STROUT
NO
- Resultado
+
SE CONFIRMA Resultado
EL CASO Envía muestra Envía cultivo
de sangre (5mL) +
Una prueba +
CASO AISLAMIENTO
CONFIRMADO DEL PARÁSITO
GESTANTE
CHAGÁSICA
RECIÉN NACIDO
+
MICROCONCENTRACIÓN ELISA e IFI
PCR
- Titulación de suero
+
DIAGNÓSTICO
CONFIRMADO Control serológico a
(Tratamiento) los 3, 6 y 9 meses
ELISA e IFI
Titulación de suero
DIAGNÓSTICO
CONFIRMADO
(Tratamiento)
Figura 13. Se considera gestante chagásica cuando presenta serología reactiva en dos técnicas
de principios diferente o cuando es positiva a alguna de las técnicas que demuestren la presencia
del parásito.
CAPÍTULO III
3.1.2. Procedimiento
a) Sostener la mano izquierda del paciente con la palma hacia abajo y
seleccionar el dedo medio, hacer que el paciente extienda y flexione
los demás (en niños pequeños usar el dedo pulgar del pie o talón).
b) Limpiar el dedo con una torunda de algodón ligeramente humedecida en
alcohol para desinfectar, retirar la suciedad y la grasa de la yema del dedo.
c) Pinchar directamente la yema del dedo con una lanceta estéril. Hacer-
lo con un movimiento rápido.
3.2.1. Materiales
• Jeringas y agujas descartables 21 1/2 G
• Tubos de ensayo o tubos al vacío sin anticoagulante (serología).
• Tubos de ensayo o tubos al vacío con /EDTA (hemocultivo).
• Ligadura de jebe 2,5 mm de diámetro.
• Algodón.
• Alcohol.
• Guantes.
• Lejía al 3-5%.
• Depósito de metal o vidrio para descarte de agujas y jeringas.
• Plumón indeleble.
3.2.2. Procedimiento
a) Solicitar al paciente que se siente y coloque el brazo sobre la mesa de
trabajo, con la palma de la mano hacia arriba.
b) Colocar la ligadura dos dedos por encima de la flexión del codo, ajustar-
la lo suficiente para aminorar la corriente sanguínea y dilatar las venas,
sin apretarla tanto, de modo que reduzca el paso de sangre por las
arterias.
c) Pedir al paciente que abra y cierre la mano varias veces, para favorecer
la dilatación de las venas.
d) Con el dedo índice de la mano izquierda palpe la vena en la que intro-
ducirá la aguja.
e) Desinfectar la zona de la piel donde se realizará la punción con un
pedazo de algodón embebido en alcohol.
CAPÍTULO IV
4.1.1. Materiales
• Guantes.
• Lanceta estéril.
• Algodón.
• Alcohol corriente.
• Láminas portaobjetos limpias y desengrasadas.
• Laminillas cubreobjetos.
• Cámara húmeda (Anexo 1).
4.1.2. Procedimiento
a) Rotular tres láminas portaobjetos.
b) Obtener la muestra de sangre capilar en lámina, según 3.1.
c) Colocar una gota de sangre sobre cada lámina portaobjeto rotulada.
d) Cubrir la muestra con una laminilla.
e) Conservar las preparaciones en cámara húmeda hasta su lectura.
4.1.3. Lectura
Observar al microscopio con objetivo de 10X y 40X reduciendo la abertura
del condensador. Buscar formas móviles (trypomastigotes) del parásito. Si
4.2.1. Procedimiento
Obtener la muestra de acuerdo con lo indicado en 4.1
a) Colocar una gota de sangre sobre la superficie limpia de una lámina
portaobjetos.
b) Empleando la esquina de otra lámina, realizamos movimientos circula-
res, desde el centro de la gota, de modo que la sangre se distribuya
uniformemente (en un área de 1cm2).
c) Dejar secar a temperatura ambiente.
d) Colorear con Giemsa.
4.2.2.1. Materiales
• Solución Giemsa stock (Anexo 1).
• Solución amortiguadora (Anexo 1).
• Probeta 10 mL.
• Varilla de coloración.
4.2.2.2. Procedimiento
a) Colocar las láminas sobre la varilla de coloración.
b) Preparar el volumen necesario de solución Giemsa diluida, aproxima-
damente 2 mL por lámina.
Figura 14. La coloración Giemsa, facilita la identificación del parásito en base a sus
características morfológicas tintoriales.
4.3. FROTIS
El frotis es el extendido de una gota de sangre en una lámina portaobjetos
seguida de la fijación de la muestra y posterior tinción con Giemsa (Figura 15).
4.3.1. Procedimiento
Obtener la muestra de acuerdo con lo descrito en el ítem 3.1.
a) Colocar una gota de sangre en el extremo de la superficie de una
lámina portaobjetos limpia.
b) Acercar a la muestra el borde de otra lámina portaobjetos,
posesionándola de tal manera que formen un ángulo de 45º y dejar
que la muestra se distribuya en el borde de la lámina.
c) Conservando el ángulo de 45º, deslizar la lámina auxiliar sobre la su-
perficie de la lámina con la muestra. El extendido de sangre o frotis
debe ser una película fina.
d) Dejar secar a temperatura ambiente.
Resultado
Informar la presencia o ausencia de formas trypomastigotes de
Trypanosoma cruzi.
CAPÍTULO V
TÉCNICAS DE CONCENTRACIÓN
5.1. MICROCONCENTRACIÓN
La técnica consiste en concentrar los parásitos de una muestra de sangre
colectada en tubos capilares heparinizados por centrifugación. Los ele-
mentos de la sangre se separan por gradiente de densidad, concentrán-
dose los glóbulos rojos en la parte inferior del capilar, sobre ella se ubica
un anillo blanquecino de 1 mm de altura conformado por los glóbulos
blancos y en la parte superior líquida transparente constituida por el plas-
ma. Los tripanosomas presentes en la muestra se ubicarán entre los gló-
bulos blancos y el plasma.
5.1.2. Procedimiento
a) Obtener la sangre en los capilares heparinizados según ítem 3.1.2.
b) Centrifugar la muestra durante un minuto a 5000 rpm.
5.1.3. Lectura
Observar directamente en el microscopio la zona del plasma aproximada-
mente a 10 mm de los glóbulos blancos. Focalizar inicialmente con el
objetivo de 10X de aumento y luego buscar las formas trypomastigotes
móviles del parásito con el objetivo de 40X (Figura 17).
5.1.4. Resultado
Positivo: Se observan formas flageladas móviles de trypomastigotes de
Trypanosoma cruzi.
Negativo: No se observan formas de trypomastigotes de Trypanosoma cruzi.
5.2.2. Procedimiento
a) Extraer 5-10 mL de sangre venosa en un tubo sin anticoagulante, se-
gún ítem 3.3.
b) Dejar a temperatura ambiente hasta que se coagule.
c) Separar el suero.
d) Centrifugar este suero a 160g (800 rpm) durante dos minutos para
descartar los glóbulos rojos.
e) Centrifugar nuevamente el sobrenadante a 300-600 g (2000-2500 rpm),
durante diez minutos.
f) Separar el sobrenadante (suero) y conservarlo a 4 ºC para el análisis
serológico.
5.2.3. Lectura
Observar en el microscopio la presencia de trypomastigotes móviles de
Trypanosoma cruzi, con objetivos de 10X ó 40X de aumento.
Es aconsejable observar cuidadosamente varias preparaciones en busca
de formas móviles del parásito.
CAPÍTULO VI
HEMOCULTIVO
6.1. EQUIPO
- Estufa 28 – 30°C.
- Centrífuga.
- Microscopio óptico 10x, 40x, 100x de aumento y ocular 10x.
- Cabina de flujo laminar o cubículo.
- Balanza.
- Refrigerador.
- Micropipeta 5 – 50 uL, 50 – 1000 uL.
HEMOCULTIVO
SANGRE
OBTENCIÓN DE
MUESTRA
CONCENTRACIÓN POR
CENTRIFUGACIÓN
5 MIL rpm x 15minutos
CULTIVO
EN FRESCO
28 °C LECTURA
Observación al microscopio
7° DÍA 10 x ó 40 x
Formas móviles del parásito
15° DÍA
COLORACIÓN GIEMSA
Formas típicas, con citoplasma,
azul claro, núcleo y cinetoplasto
de color azul violeta
SUBCULTIVO
CADA 15 DIAS
28 °C LECTURA FINAL
60° DÍA
EN FRESCO
Observación al microscopio
10 x ó 40 x
Formas móviles del parásito
COLORACIÓN GIEMSA
Formas típicas, con citoplasma,
azul claro, núcleo y cinetoplasto
de color azul violeta
6.5. LECTURA
a) El movimiento característico de los epimastigotes (figuras 20 y 21) per-
mite detectarlos con facilidad, sin embargo, es necesario colorearlos
para confirmar su morfología.
b) Realizar un extendido con el asa de siembra, luego fijar con metanol
durante tres minutos y colorear con Giemsa.
c) Observar en el microscopio la forma típica, el núcleo de color azul viole-
ta y el cinetoplasto más denso y oscuro. Se les visualiza aislados o
agrupados a manera de rosetas.
d) Si no se observan formas móviles continuar la incubación a 28 °C y
repetir la lectura a los siete días.
e) Cada 15 días repicar 0,5 mL de los cultivos negativos en medio fresco.
(resiembra a ciegas).
f) El tiempo que se requiere para demostrar la positividad del cultivo,
depende de la densidad parasitaria de la muestra sembrada y de la
adaptabilidad del parásito al medio. Generalmente esto ocurre des-
pués de uno a dos meses.
g) Antes de realizar la lectura final, centrifugar el sobrenadante del cultivo
y observar en el sedimento, la presencia o ausencia del parásito.
6.6. RESULTADO
Cultivo positivo: Se observa la presencia de epimastigotes de Trypanosoma
cruzi.
Cultivo negativo: No se observa la presencia de epimastigotes de
Trypanosoma. cruzi.
CAPÍTULO VII
XENODIAGNÓSTICO
7.1. Equipos
Microscopio con objetivo de 20X de aumento.
7.3. Materiales
- Cajas de madera o plástico apropiadas (Figura 22).
- Tul.
- Bandas elásticas.
- Sujetadores de tela.
- Pollos para alimentación de triatominos.
- Pinzas punta fina.
- Láminas portaobjetos.
- Laminillas cubreobjetos.
7.4. Procedimiento
a) Colocar en cada caja de cinco a diez ninfas de triatominos del III y IV
estadio, los que deben estar en ayuno por lo menos 15 días.
b) Cubrir la caja con tul, asegurándolo con una banda elástica.
c) Rotular la caja con el número de muestra, nombre y fecha de aplicación.
d) Sujetar la caja sobre el brazo del sospechoso de infección mediante
una venda de tela, permitiendo que los triatominos se alimenten por
20 minutos o hasta observar que las ninfas hayan aumentado su volu-
men por la sangre ingerida (Figura 23).
e) Conservar la caja con los triatominos a temperatura del laboratorio
25º-30 ºC y 70% de humedad relativa.
f) Alimentarlos cada 15 días, sujetando las cajas con las ninfas sobre la
piel desnuda de un ave (pollo, paloma u otro).
g) A los 30 días, examinar en el microscopio una muestra de heces de
los triatominos. Obtener la muestra sobre una lámina portaobjetos por
presión del abdomen del insecto con una pinza.
h) Cubrir la muestra con una laminilla para examinarla en el microsco-
pio. Se puede realizar el examen individual de cada triatomino o una
alícuota del pool de las muestras fecales.
i) De ser negativo, examinar otra alícuota del contenido digestivo del
triatomino a los 60 días.
7.5. Lectura
Examinar la muestra en el microscopio (objetivo de 20X de aumento), bus-
cando formas móviles: epimastigotes o trypomastigotes metacíclicas del
parásito que son identificadas por el movimiento ondulante característico
(Figura 24).
Figura 24.
7.6. Resultado
Xenodiagnóstico positivo: Se observan formas trypomastigotes o
epimastigotes de Trypanosoma cruzi.
Xenodiagnóstico negativo: No se observan tripanosomas o epimastigotes.
De ser la prueba positiva, se puede realizar el aislamiento del parásito
sembrando la muestra en medios de cultivo o inoculando experimental-
mente en ratones (anexo 2) para posteriores estudios de caracterización e
identificación.
CAPÍTULO VIII
8.6. SENSIBILIZACIÓN
a) Tubo N.° 1: Colocar 5 mL de Antígeno (diluido 1/20 en buffer fosfato pH
6,4). Adicionar 5 mL de suspensión de glóbulos rojos tanados. Tubo
N.° 2 (Control): Colocar 5 mL de buffer pH 6,4. Adicionar 5 mL de sus-
pensión de glóbulos rojos tanados.
HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA
TANIZACIÓN
ÁCIDO
+ TÁNICO
HEMATÍES
HEMATÍES
TANADOS
SENSIBILIZACIÓN
DESAROLLO DE LA PRUEBA
HEMATÍES ANTICUERPOS
SENSIBILIZADOS ESPECÍFICOS
HEMAGLUTINACIÓN
Figura 25
8.9. RESULTADO
Reactiva: Se detecta la presencia de anticuerpos contra Trypanosoma
cruzi. Título: según lectura.
No reactiva: Ausencia de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi.
HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA
DILUSIÓN DEL SUERO
Figura 26
HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA
Tamizaje de sueros en la dilución de valor diagnóstico 1/4
En esta placa los pozos D4, G12 y H12 corresponden a sueros reactivos (positivos)
Figura 27
CAPÍTULO IX
ELISA
ELISA
MÉTODO INDIRECTO PARA LA DETECCIÓN Y MEDICIÓN DE ANTICUERPOS
ANTI Trypanosoma cruzi
Figura 28
9.5.3. Titulación
Para obtener el título de las muestras reactivas en el tamizaje, se realiza dilucio-
nes dobles de los sueros a partir de 1/100 y se procede de acuerdo con el
punto 9.3.
Figura 29
CAPÍTULO X
10.1. EQUIPO
• Microscopio para fluorescencia.
• Estufa graduada a 37 °C.
• Balanza de presición.
• Potenciómetro.
• Reloj.
• Refrigerador.
• Secadora o ventilador.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
PRIMERA ETAPA
SEGUNDA ETAPA
Figura 30
10.3. PROCEDIMIENTO
Elaborar el protocolo de trabajo en el fomato del anexo 9, asignar un casi-
llero para cada suero por evaluar y anotar en él su código.
10.4. LECTURA
La lectura se realiza en microscopio para fluorescencia, con objetivo de
20X.
Primero revisar los controles, en el control positivo debe observarse la
superficie y el flagelo de los parásitos de un color verde manzana fluores-
cente. (Figura 31) y en el control negativo al igual que en el blanco de
reactivos, debe observarse el parásito de color rojizo opaco, sin fluores-
cencia.
Si los controles responden como tales, la corrida es válida y se continua
con la lectura de las muestras examinadas
De acuerdo con la intensidad o ausencia de fluorescencia que muestran
los trypanosomas se registran las lecturas como:
REACTIVO (+). Cuando la superficie o los bordes de los parásitos fluorescen
francamente de un color verde manzana.
NO REACTIVO (-). Si los parásitos se observan opacos entre rojizos y ma-
rrones oscuros
INDETERMINADO (I), se observa una débil fluorescencia no homogénea en
los parásitos.
SUERO 1/32
S6 1/64 1/128 1/256 1/512 1/
1024
S6 CN B CI CP
7 8 9 10 11 12
CAPITULO XI
CONTROL DE CALIDAD
+ 3 ds
+ 2 ds
0,3 x
- 2 ds
- 3 ds
Ensayos
1 4 8 12 16 20
CAPÍTULO XII
BIOSEGURIDAD
12.5.1. Desinfección
a) Los procedimientos para eliminar elementos causantes de infeccio-
nes virales, bacterianas, micóticas y parasitarias, dependerán de la
naturaleza del agente presente en el material de vidrio u otro.
b) Los más comunes son: agentes químicos en estado líquido (mezcla
sulfocrómica, lejía, etc.) y los agentes físicos como el calor, hervido,
autoclave, irradiación ultravioleta, etc.
12.5.2 Lavado
Después de la eliminación de los agentes infecciosos (desinfección), el
material de vidrio sucio debe ser lavado, recomendándose el uso de
detergentes.
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ANEXO 1
1. COLORACIÓN GIEMSA
2. CULTIVO
2.4.2. Procedimiento
a) Sujetar al conejo en posición cúbito dorsal.
b) Ubicar la zona de punción (latido cardíaco), cortar con una tijera el
pelaje y desinfectar con alcohol yodado el área elegida.
c) Obtener por punción al corazón de 20 a 40 mL de sangre.
d) Muy cerca al mechero, para conservar la esterilidad de la sangre, va-
ciar la sangre a un matraz o balón estéril, el cual contiene perlas de
vidrio.
e) Agitar suavemente con movimientos rotatorios para desfibrinar la san-
gre durante cinco minutos.
2.5.2. Procedimiento
a) En un balón de 500 mL diluir el agar (baño María 80 ºC) en 100 mL de
agua destilada y autolavar a 121 ºC por 15 minutos.
b) Dejar enfriar a temperatura ambiente hasta, aproximadamente, 46 ºC y
aun estando el agar licuado, agregar 15 mL de sangre desfibrinada de
conejo, en ambiente de esterilidad.
c) Agregar las soluciones de antibióticos 0,1mL de la solución de
estreptomicina y 0,1 mL de penicilina.
d) Revertir 1,5 mL del medio en tubos de prueba con tapa rosca.
e) Controlar la esterilidad del medio a 37 ºC durante 18 horas.
f) Guardar a 4 ºC hasta el momento de uso.
3. HEMAGLUTINACIÓN INDIRECTA
Solución 2:
NA2HPO4 .................................................. 2,13 g
H2O destilada .................... 100 mL
Solución 1 7 mL 18,4 mL
Solución 2 18 mL 6,7 mL
NaCI 2,1 g 2,1 g
Agua destilada 250 mL 250 mL
4. ELISA
4.1. Buffer fosfato salino (PBS) pH 7,2
KCI .............................................................................................. 0,2 g
Na2HPO4 anhidro ....................................................................... 1,148 g
Na H2PO4 anhidro ...................................................................... 0,2 g
NaCI ............................................................................................ 8,0 g
Agua destilada ........................................................................... 1000 mL
Conservar a 4 ºC.
Solución B
NaHCO3 ..................................................................................................................................................... 4,2 g
Agua destilada c.s.p. ................................................................. 100 mL
Mezclar 0,4 mL de la solución A con 10 mL de la solución B.
Verificar o ajustar el pH a 8,5. Utilizar la solución A si está por debajo de 8,5
y la solución B si está por encima de este valor.
TÍTULO RECOMENDADO
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11 12
ANEXO 2
1. AISLAMIENTO
El parásito se puede aislar a partir de:
1.1.a. Hemocultivo:
• Sembrar la muestra de sangre heparinizada de un paciente chagásico
agudo en medio de cultivo bifásico agar sangre - suero fisiológico.
• Proceder igual que en el hemocultivo para el diagnóstico.
• Generalmente, la parasitemia en sangre circulante es baja por lo que,
a mayor volumen de sangre sembrada, mayor posibilidad de éxito en
el aislamiento.
1.1.b. Xenodiagnóstico:
• Aplicar el xenodiagnóstico a un paciente chagásico agudo.
• Seguir el procedimiento que se detalla para el aislamiento a partir de
los vectores.
1.2. Vectores
Procedimiento:
• Desinfectar el insecto positivo a la infección por T. cruzi sumergiéndo-
lo durante un minuto en una solución alcohólica al 70%.
• Cortar la parte terminal del abdomen del insecto con la ayuda de unas
pinzas y tijeras finas desinfectadas retirar el tubo digestivo y colocarlo
sobre una lámina porta objetos.
• Sembrar el material fecal y el tubo digestivo en medio de cultivo bifásico
agar sangre-suero fisiológico e incubar a 28 ºC.
2. MANTENIMIENTO
2.2. En animales
• La inoculación en animales de experimentación es otra forma de ais-
lar y mantener el parásito. Se usa ratones jóvenes y el control se reali-
za examinando periódicamente la parasitemia en una gota de sangre,
en fresco, obtenida por corte en la porción terminal de la cola.
• El traspaso de animal a animal se hace por inoculación intraperitoneal de
sangre positiva. Así se conserva la capacidad de infección del parásito.
2.3. Criopreservación
Es la conservación de los parásitos a -80 ºC, este procedimiento man-
tiene las características nativas del parásito. Se realiza colocando una
suspensión de parásitos procedentes de cultivo en medios de conser-
vación con glicerol a diferentes concentraciones.
ANEXO 3
PREPARACIÓN DE ANTÍGENOS
1.4. RECOMENDACIONES
• Emplear láminas limpias, libres de grasa, para facilitar la fijación uni-
forme de la suspensión de parásitos a la lámina y para evitar los arte-
factos que dificultan la lectura.
• Proceder de la siguiente manera para la limpieza:
- En un frasco couplin o frasco con tapa, que contiene alcohol -
acetona V:V, sumergir las láminas IFI nuevas, durante 1 a 24 ho-
ras. Secarlas con una gasa limpia y conservarlas envueltas con
papel hasta el momento de su uso.
- Las láminas IFI usadas, lavarlas previamente con detergente y
luego proceder al igual que con las nuevas.
- Los cubreobjetos dejarlos en un recipiente que contenga alcohol
al 70% durante 30 minutos, luego secarlos con gasa limpia una a
una. Conservarlas en su caja o en una placa Petri hasta su uso.
2.2. PROCEDIMIENTO
a) Filtrar el cultivo a través de una capa de gasa o lana de vidrio.
b) Centrifugar el cultivo a 4000 rpm durante 10 minutos.
c) Retirar el sobrenadante, en el sedimento se encuentran los parásitos.
d) Lavar los parásitos de la siguiente manera:
-Resuspender el sedimento en 5 mL de PBS.
-Centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos.
-Retirar el sobrenadante.
e) Repetir el lavado.
f) Resuspender los parásitos en agua destilada (1:10).
g) Congelar (-70 ºC) y descongelar (37 ºC) por seis veces sucesivas.
h) Agregar un volumen igual de solución Nacl al 1,7%.
i) Centrifugar durante 30 minutos a 4000 rpm y 2 ºC.
j) El sobrenadante constituye el antígeno. Agregar la solución de
Merthiolate al 1:10 000.
k) Conservar en congelación (-4 a -20 ºC) hasta el momento de su uso.
ANEXO 4
URGENTE
MATERIAL BIOLÓGICO PERECIBLE
DESTINO: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
DIRECCIÓN: CALLE CÁPAC YUPANQUI 1400
JESÚS MARÍA - LIMA 11
TELEFONOS: 471-9920 / 471-2529
MUESTRA
EXAMEN DE
LABORATORIO OBTENCIÓN CARACTE- PROCESA-
TIPO DE SANGRE CANTIDAD CONSERVACIÓN TRANSPORTE
RÍSTICAS MIENTO
Hasta 5 días:
ELISA
Suero o Refrigeración
IFI En tubo No hemolizado 4-8 ºC
plasma vacutainer 1 - 2 mL Mediato Con refrigerante
HAI No contaminado
sanguíneo sin Mayor de 5 días:
IB Congelación
anticoagulante
-20 a - 80 ºC
Dirección
Calle y N° Localidad Distrito Provincia Departamento
II. ANTECEDENTES
Diagnóstico clínico Aspectos epidemiológicos
Sintomático Asintomático Presencia de chirimachas en su
vivienda No Sí Hubo Dónde Cuándo
OTRA:
Completó el
Recibió medicamento
tratamiento
No Sí Hace cuanto tiempo Nombre del medicamento No Sí
I. DATOS PERSONALES
II. ANTECEDENTES
Diagnóstico clínico
Sintomático: marcar con X si hay alguna sintomatología compatible con la enfermedad. En caso
de infecciones agudas o crónicas, identificar con una X el casillero correspondiente a los
síntomas presentes.
Asintomático o indeterminado: marcar con una X cuando no hay sintomatología pero hay
antecedentes epidemiológicos que hacen sospechar de la infección.
Aspectos epidemiológicos
Llenar o marcar con una X los casilleros correspondientes. Precisar en lo posible las fechas de los
datos solicitados.
Áreas endémicas: Arequipa, Moquegua, Tacna, Ica, Cajamarca, Amazonas y San Martín.
Marcar el casillero que corresponda. Anotar la fecha, el nombre del establecimiento que realizó el
diagnóstico, la técnica y nombre del kit usado, en caso de ELISA absorbancia (Abs) de la muestra
y el valor de corte (Vc) correspondiente.
Los exámenes solicitados serán los apropiados para confirmar el diagnóstico presuntivo y
estarán de acuerdo a la situación clínica de la persona: agudo, crónico portador, congénito.
Marcar con una X el casillero confirmación del diagnóstico, en caso de tener resultados de
laboratorio anteriores y el de seguimiento cuando se solicita el examen de laboratorio de persona
con tratamiento.
Debe colocarse las fechas según el momento del proceso: al obtener la muestra y al ingresar al
laboratorio que efectuará el examen.
ESTABLECIMIENTO DE SALUD
NOTA: Enviar todas las láminas o sueros positivos y 10% de los negativos examinados en el trimestre (láminas coloreadas con Giemsa de
exámenes de sangre por gota gruesa, concentración). Adjuntar el presente formato con la información solicitada empleando una hoja para
cada actividad y el formato de solicitud de diagnóstico de las muestras positivas o reactivas
.
CONJUGADO
Fecha de
Título
vencimiento
Blanco de reactivos B
Sí No
VALIDACION DE LA CORRIDA
OBSERVACIONES
Firma
Responsable del control interno Fecha
Día Mes Año
ANEXO 9
1 2 3 4 5 6
1 1 1 1 1 1
7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6
1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1
7 8 9 10 11 12
1 2 3 4 5 6
1 1 1 1 1 1
1 1 1 1 1 1
7 8 9 10 11 12
OBSERVACIONES
ANTIGENO IFI
Fecha de
Lote N°
vencimiento
Día Mes Año
CONJUGADO
Lote N° Título
CONTROLES
Código N° Título Lectura
Suero control positivo a T.cruzi CP 1/
LECTURA E INTERPRETACIÓN
No fluorece - No reactivo NR
OBSERVACIONES
Firma
Responsable del control interno Fecha
Día Mes Año
CEPREDIM
SE TERMINÓ DE IMPRIMIR
POR ENCARGO DEL INS
EN EL MES DE ABRIL DE 2006,
EN LOS TALLERES GRÁFICOS DEL
CENTRO DE PRODUCCIÓN EDITORIAL E IMPRENTA DE
LA UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
JR. PARURO 119. LIMA 1.
TELÉFONO: 619-7000, ANEXO: 6009 / FAX: 6015
E-MAIL: CEPEDIT@UNMSM.EDU.PE
TIRAJE: 1000 EJEMPLARES