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Régulation

métabolique

2. ENZYMES & ALLOSTERIE

L. GARRIGUE-ANTAR
N. DUBOIS
Régulation
métabolique
I. Les enzymes allostériques

1- Définition
Les enzymes clés (ou régulatrices) du métabolisme sont allostériques
➢ Nécessité pour la cellule de disposer d’énergie pour son fonctionnement
I. Les enzymes
allostériques ➢ Adaptation aux signaux de l’environnement

II. Les différents Enzyme allostérique : protéine oligomérique, avec un axe de symétrie, en général avec un nombre pair
modes de
régulation de sous-unités, et présentant 2 états conformationnels différents:
- Forme T (tendue), à faible affinité pour le substrat, inactive
T T R R
- Forme R (relâchée), à haute affinité pour le substrat, active
Forme T Forme R
- Changement de conformation T  R = transition allostérique
Faible affinité pour S Forte affinité pour S
- L’équilibre entre les formes T et R est défini par :
L= [T]/[R] et L>1
Plus il y a de formes T plus la concentration de S nécessaire pour activer l’enzyme est grande

- Une enzyme allostérique a plusieurs sites actifs portés par des sous-unités différentes.
- Les sous-unités peuvent être de structures identiques ou différentes.

L. GARRIGUE-ANTAR - Certaines sous-unités, régulatrices, peuvent ne pas comporter de site actif.


N. DUBOIS
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métabolique
I. Les enzymes allostériques

k cat[E]T [S]
Pour une enzyme Michaélienne : E + S  ES  E + P a=
K M + [S]
I. Les enzymes k[E]T [S]n
allostériques Pour une enzyme allostérique avec n sous-unités : E + n S  ESn  E + nP a=
K + [S]n
II. Les différents
modes de cinétique michaélienne
activité
régulation
amax La forme sigmoïde traduit la coopérativité :
la fixation de S facilite la liaison d’autres
molécules de S aux autres sous-unités
l’affinité de E pour S augmente
amax /2 passage de la forme T à la forme R

KM

KM : constante de Michaelis: concentration de substrat pour laquelle l’activité est égale à la moitié de l’activité
maximum (enzyme michaelienne)
L. GARRIGUE-ANTAR K0,5 : même définition, pour les enzymes allostériques
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I. Les enzymes allostériques

La coopérativité de type K correspond à des variations de l’affinité


La fixation d’une molécule de S sur une sous-unité augmente (K+ ) ou diminue (K-) l’affinité de S pour la
deuxième.
I. Les enzymes
allostériques Allostérie K+
II. Les différents
modes de Enzyme michaelienne
régulation Aucune coopérativité

Allostérie K-

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I. Les enzymes allostériques

La coopérativité de type V correspond à des variations de la vitesse maximum


I. Les enzymes
allostériques La fixation d’une molécule de S sur une sous-unité facilite (V+ ) ou rend plus difficile (V-) la
II. Les différents transformation de S en P par l’autre.
modes de
régulation

- Les 4 types d’allostérie interviennent in vivo.


- Cependant l’allostérie de type K et surtout K+ joue un rôle fondamental
dans la régulation métabolique.

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I. Les enzymes allostériques

Mesure de la coopérativité : Nombre de Hill

Rappel historique : travaux de Archibald Hill (1913)


I. Les enzymes
allostériques

II. Les différents


modes de Saturation: fraction d’occupation des sites de liaison à O2 :
régulation Y=0 vide; Y=1 occupé
La forme sigmoïde traduit la coopérativité:
la fixation de O2 facilite la liaison d’autres
Oxygènes aux autres hèmes

Myoglobine (Mb) : protéine monomérique, 1 s.u de globine


* Str. 3D élucidée par cristallographie aux RX en 1958 par Kendrew
* un seul site de liaison à l'oxygène
PO2 * affinité pour O2 très supérieure à celle de l'hémoglobine
Courbes de saturation en O2 différentes Hémoglobine (Hb): protéine multimérique, 4 s.u identiques 2 à 2
• Str. 3D élucidée par cristallographie aux RX en 1959 par Perutz
L. GARRIGUE-ANTAR • 4 sites de liaison à l’oxygène
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I. Les enzymes allostériques

Cas de la myoglobine [Mb] [O 2 ]


MbO2 Mb + O2 K= *
[MbO2 ]
I. Les enzymes
allostériques

II. Les différents


**
modes de
régulation

En remplaçant [MbO2] dans l’équation ** , on obtient :

[O 2 ]
Y= Équation de l’hyperbole
[O 2 ] + K

A partir de * , on peut écrire :


PO 2 Y
On a donc Et comme O2 est un gaz, on peut exprimer: =
L. GARRIGUE-ANTAR K 1− Y
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Cas de la myoglobine PO 2 Y
=
K 1− Y
I. Les enzymes
allostériques
Pour linéariser l’hyperbole, on transforme en log :
II. Les différents
modes de
régulation

C’est l’équation d’une droite (y=ax + b) de coefficient


directeur égal à 1

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Cas de l’hémoglobine [Hb] [O 2 ]n


Hb(O2)n Hb + nO2 K=
[Hb(O 2 ) n ]
I. Les enzymes
allostériques
[Hb(O 2 ) n ] Occupé
II. Les différents Y=
modes de [Hb] + [Hb(O 2 ) n ] Total
régulation
n
PO 2 Y
=
K 1− Y

Y
log = n log PO2 − log K
1− Y

n>1 traduit le phénomène de coopérativité


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La pente n = nombre de Hill
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I. Les enzymes allostériques
Nombre de Hill : Application aux enzymes
a
Soit la fonction y = log
I. Les enzymes a max − a
allostériques
• Sous-unités indépendantes : enzyme michaélienne
II. Les différents
a max [S] y = log a = log[S] − logK
modes de
a=

M
régulation
K M + [S] a max a
La courbe est alors une droite de pente 1.

Eléments de démonstration
a max[S] [S] a
a= =
K M + [S] K M (amax - a)

a
Passer en log: log = log[S] − logK M
a max − a
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I. Les enzymes allostériques
Nombre de Hill : Application aux enzymes

• Coopérativité totale :
I. Les enzymes
amax[S]n y = log
a
= nlog[S] − logK
allostériques a=
K + [S]n a max − a
II. Les différents
modes de
régulation
La courbe est alors une droite de pente n égale au nombre de sous-unités.

• coopérativité partielle (cas réel, enzyme allostérique) Mesure de nH

La courbe n’est pas une droite.

Cependant elle s’assimile à une droite

dans un large domaine autour de K.

La pente est dite nombre de Hill nH.

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I. Les enzymes allostériques

Le nombre de Hill caractérise le degré de coopérativité.


I. Les enzymes
allostériques Il peut être relié à la pente de la courbe a=f([S]) autour du K0,5.

II. Les différents La pente est d’autant plus grande que nH est grand.
modes de
régulation

Si le nombre de Hill est inférieur à 1,5, l’enzyme est pratiquement michaélienne.

S’il est inférieur à 1, la liaison du ligand a un effet coopératif négatif.

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I. Les enzymes allostériques

Résumé : Caractérisation d’une enzyme allostérique K+


I. Les enzymes
allostériques
• On trace :
II. Les différents
modes de le graphe a = f([S])
régulation
la courbe de Hill: log(a/amax-a) = f (log[S])

• On détermine amax, K0,5 et nH

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I. Les enzymes allostériques
Pour rendre compte des interactions coopératives entre sous-unités , 2 modèles (cas limites) sont proposés:
➢ Le modèle concerté de Monod-Wyman-Changeux (MWC, 1965)
Toutes les sous-unités reproduisent ensemble le changement de conformation subi par l’une
I. Les enzymes d’elles, de façon à conserver les axes de symétrie de la molécule
allostériques

II. Les différents


modes de
K R  K T
régulation

1- les sous-unités sont équivalentes et l’oligomère possède au moins un axe de symétrie


2- Il n’existe que 2 états conformationnels T et R (pas d’hybride)
3- Il n’existe que 2 constantes d’affinité KT (affinité de la forme T pour le substrat)
et KR (affinité de la forme R pour le substrat)
4- La transition T>R ou R>T conserve la symétrie du modèle
L: constante d’équilibre de la transition T>R (constante allostérique)
C : rapport traduisant la différence d’affinité pour R et T
[T] KR
Par convention, la forme T est la plus stable : L= 1 c= 1
[R] KT
L. GARRIGUE-ANTAR Pour qu’il y ait allostérie K+, il faut que S ait plus d’affinité pour R que pour T : L  1, K R  K T  c  1
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I. Les enzymes allostériques

➢ Le modèle séquentiel de Koshland (1966)


- Les changements dans la conformation d’une s.u se traduisent par des changements progressifs de la
conformation des autres s.u (perte de la symétrie de la molécule)
I. Les enzymes
allostériques - Les interactions entre les sous-unités peuvent être positives ou négatives.
- Chaque fixation de substrat améliore la conformation et l’affinité augmente.
II. Les différents  Il existe plusieurs états intermédiaires, et plusieurs constantes d’affinité:
modes de
régulation  KT > KR1 > KR2 > KR3

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Application

Dans le cas limite d’une enzyme possédant deux sous-unités identiques, avec un
substrat qui n’a pas d’affinité pour la forme T, le modèle MWC s’écrit :

4 voies de transformation possibles pour S

1. Simplifiez la loi si L=O. Quel est alors le comportement de l’enzyme?


Montrez que l’on peut prévoir ce résultat en simplifiant le modèle ci-dessus.
2. Donnez sur un graphe (a= f([S]) l’allure de la courbe correspondant à L = 0

3. Donnez sur le même graphe les allures des courbes correspondant


à L = 0, L = 10, L=100.
Régulation
métabolique
I. Les enzymes allostériques

Les effecteurs allostériques

I. Les enzymes - Le modulateur (effecteur) a un site de fixation (site allostérique) différent


allostériques
du site actif.
II. Les différents
modes de
- Il se fixe préférentiellement sur l’une des deux formes T ou R
régulation - Il modifie l’état de conformation de l’enzyme

Le modulateur stabilise la forme T : c’est un inhibiteur


K0,5 augmente.

Le modulateur stabilise la forme R : c’est un activateur


K0,5 diminue.

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I. Les enzymes allostériques

I. Les enzymes
allostériques

II. Les différents


modes de
régulation

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métabolique
II. Les différents modes de régulation

1- Fixation réversible d’effecteurs allostériques : feedback regulation


INTRO - Régulation négative par un intermédiaire métabolique qui s’accumule
❖ sur une enzyme située en amont (rétroinhibition) >>> inhibition de sa formation
I. Les enzymes
allostériques
- Régulation positive par un intermédiaire métabolique qui s’accumule
II. Les différents ❖ sur une enzyme située en aval (activation) >>> activation de sa consommation
modes de
régulation

Mécanisme de rétroinhibition

- Mécanisme de régulation de type rapide (sec à min)


> ajustement de la voie aux besoins immédiats
> Effet transitoire
L. GARRIGUE-ANTAR
N. DUBOIS - Étapes cibles : première enzyme d’une voie, ou un point de branchement
Régulation
métabolique
II. Les différents modes de régulation

Cas de voies divergentes


INTRO
Isoenzymes E1 et E’1: régulation en fonction des besoins
I. Les enzymes en X ou Y
allostériques

II. Les différents


modes de
régulation

Cas de voies convergentes


Q dépend de D et E
Si D est en excès par rapport à E,
rétroinhibition sur E1
Si E est en excès par rapport à D
activation sur E1 pour plus de D

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II. Les différents modes de régulation

Exemple de la glycolyse Glycolyse inhibée


INTRO Accumulation de G6P:
- 10 réactions, 10 enzymes Rétroinhibition sur Hexokinase
I. Les enzymes - 3 étapes irréversibles HK, PFK, PK
allostériques - PFK enzyme très fortement régulée,
étape lente (F6P tend à s’accumuler)
II. Les différents
modes de
régulation
Glycolyse active
Accumulation de F1,6P2
Activation sur la Pyruvate Kinase
++
+

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Régulation
métabolique
II. Les différents modes de régulation

2- Modification covalente réversible


- Modifications post-traductionnelles >>> Notion d’isoformes d’une enzyme
I. Les enzymes
allostériques a - Essentiellement la phosphorylation/déphosphorylation

II. Les différents


Enzymes: Kinase et Phosphatase (réversibilité si 2 enz )
modes de
régulation Acides aminés cibles : Ser, Thr, Tyr (aa hydroxylés)
Séquence consensus : Arg-Arg-X-Ser/Thr

❖ modification de la structure 3D
activation ou inhibition de l’enzyme
❖ Mécanisme de régulation de type rapide (min à hrs)
> ajustement de la voie aux besoins immédiats

b - Autres modifications covalentes : méthylation, acétylation, tyrosinylation et sulfatation


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Régulation
métabolique
II. Les différents modes de régulation

2- Modification covalente réversible : exemple de la Glycogène phosphorylase


Dégradation du glycogène
(Glucose)n + Pi (Glucose)n-1 + Gluc1-Ph
I. Les enzymes
allostériques Glycogène
Phosphorylase Forme « a » (active)
II. Les différents
Active (Ph)
modes de
régulation
ADP
Protein
Phosphatase I kinase
Pi ATP

Glycogène
Forme « b » (inactive)
Phosphorylase
Inactive (déPh) Ralentissement de la dégradation du glycogène

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Régulation
métabolique
II. Les différents modes de régulation
C- ces cycles de phosphorylation peuvent être hormono-dépendants

❖ Insuline déphosphoryle les phosphatases de la cascade à partir de son récepteur et les rend actives
I. Les enzymes ❖ Glucagon phosphoryle les kinases et les rend actives.
allostériques
Exemple du glucagon : mobilisation de la PKA dans les cellules hépatiques
II. Les différents
modes de
régulation

Association
spontanée

-synthèse: cellules  du pancréas


-hyperglycémiant
L. GARRIGUE-ANTAR
N. DUBOIS - Récepteur à 7 TM + protéines G
Régulation
métabolique
II. Les différents modes de régulation

D- Amplification du signal de phosphorylation/déphosphorylation

Hormone (10-10M)
I. Les enzymes
allostériques

II. Les différents Adénylate cyclase


modes de
régulation
AMPc

Kinase

Enzyme active

Produit (G1P)

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Régulation
métabolique
II. Les différents modes de régulation

3- Régulation du taux d’enzyme


- Régulation dépendante entre synthèse et dégradation de l’enzyme (turn-over)
I. Les enzymes
allostériques - Régulation transcriptionnelle, induite ou réprimée par des protéines régulatrices (hormones)
- Régulation au niveau post-traductionnel par conversion d’une proenzyme en enzyme active (rapide)
II. Les différents
modes de - Régulation par isoenzymes :
régulation
Ce sont des enzymes de structure primaire légèrement différentes, catalysant la même réaction.
Origine différentes : organismes différents, organes différents, compartiments différents d’une même cellule,
et même dans un seul compartiment
→ propriétés différentes (physicochimiques, régulation, caractéristiques cinétiques…)
- Régulation par la compartimentalisation cellulaire

- Mécanisme de régulation lent (hrs à jours)


> mécanisme d’adaptation à un changement durable de l’environnement
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Régulation
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II. Les différents modes de régulation

Exemple : Adaptation de l’organisme en condition limitante en oxygène

➢ Activation de HIF-1 (hypoxia inducible factor-1)


I. Les enzymes
allostériques ❖ Liaison au DNA et activation de la transcription des gènes cibles :
II. Les différents ❖ Gènes de la survie cellulaire
modes de
régulation ❖ Gènes codant pour des facteurs angiogéniques
❖ Gènes d’adaptation métaboliques : GLUT1 (transporteur de glucose), enz de la glycolyse…
Activation de la glycolyse nécessaire car seulement 2 ATP produits/glucose en anaérobiose

➢ Isoenzymes de la Lactate Déshydrogénase (LDH):


4 sous-unités de type H (Heart) ou M (Muscle), codées par 2 gènes distincts
5 isoenzymes différentes avec différentes combinaisons de sous-unités H ou M : LDH1, 2, 3, 4 ,5
LDH1 (=H4) majoritaire dans le cœur
LDH5 (=M4) majoritaire dans le muscle squelettique

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métabolique
II. Les différents modes de régulation

Glycolyse

I. Les enzymes
allostériques

II. Les différents


modes de
régulation

H4: affinité> pour Lactate que pour Pyr


→ Réaction LacPyr (métabolisme aérobie: cycle de Krebs)
Le cœur ne supporte pas de passer en anaérobiose

M4: affinité> pour Pyr que pour Lac


→ Réaction PyrLac (métabolisme anaérobie, fermentation lactique)
→ Récupération d’énergie pour la contraction

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Régulation
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II. Les différents modes de régulation

Exemple : conversion d’une protéine inactive en protéine active par protéolyse


- transformation irréversible
- Exemples:
I. Les enzymes -les protéases digestives
allostériques -les enzymes de la coagulation du sang
-…..
II. Les différents
modes de La sécrétion sous forme inactive permet la protection des tissus qui pourraient être attaqués par la
régulation forme active de ces enzymes protéolytiques.

Chymotrypsinogène  chymotrypsine.
- enzyme du suc pancréatique.
- α-chymotrypsine : endoprotéase qui hydrolyse la liaison peptidique d’un acide aminé aromatique
(Tyr, Trp, Phe) coté carboxylique.
- Synthèse sous forme de chymotrypsinogène (proenzyme inactive)
- stockage dans les vésicules des cellules acineuses
- Excrétion au moment de la digestion et activation dans l’intestin par l’entérokinase
L. GARRIGUE-ANTAR
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II. Les différents modes de régulation

Exemple : compartimentalisation/relocalisation de l’enzyme ou du substrat


Cas du citrate

I. Les enzymes
allostériques
glucose CO2 Synthèse des
acétylCoA malonylCoA Ac. Gras

glycolyse
II. Les différents
modes de OAA
Malate
régulation
pyruvate citrate AcétylCoA Carboxylase
cytoplasme

C.Krebs acétylCoA IDH inactive


pyruvate citrate Citrate : carrefour métabolique
OAA Point de contrôle :Isocitrate DH (IDH)
IDH active

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