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Rodriguez LEC, et al • Factores de virulencia en cepas de Aenomonas spp...

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Factores de virulencia en cepas de Aeromonas spp


aisladas de pacientes con bacteriemia
Virulence factors in strains of Aeromonas sp isolated of
patients with bacteremia

Luis Enrique Cabrera Rodríguez1 Resumen


Laura Bravo Fariñas2 Los microorganismos incluidos dentro del género Aeromonas
Maria Margarita Ramírez2 se aíslan cada vez más frecuentemente en infecciones extrain-
Alina Llop Hernández2 testinales. En el período comprendido de enero del 2005 hasta
Anabel Fernández Abreu2 diciembre del 2006, se estudiaron en el Laboratorio Nacional de
Luis Morier2 Referencia de Enfermedades Diarreicas Agudas del Instituto de
Graciela Borrego3 Medicina Tropical “Pedro Kourí” 44 cepas pertenecientes al gé-
nero Aeromonas, aisladas de muestras de sangre, procedentes de
1
Laboratorio de Microbiología Clínica. Centro 5 Centros Provinciales de Higiene, Epidemiología y Microbiología
Municipal de Higiene y Epidemiología de Güi­ del país. En la totalidad de las cepas se realizó la identificación
nes, Ciudad de la Habana, Cuba. en especies y la determinación de la presencia de algunos facto-
2
Laboratorio Nacional de Referencia de En­ res de virulencia como: la producción de enzimas extracelulares
fermedades Diarreicas Agudas. Instituto de (DNasa, gelatinasa, elastasa, lecitinasa y hemolisina), citotoxici-
Medicina Tropical “Pedro Kourí”, Ciudad de la dad en células Vero y presencia de fimbrias. Se identificaron 5
Habana, Cuba. especies, resultando Aeromonas jandaei la especie aislada con
3
Holguín. Laboratorio de Microbiología Clínica. mayor frecuencia. Todas las cepas presentaron al menos un factor
Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de virulencia de los investigados.
de Holguín, Ciudad de la Habana, Cuba. Palabras clave: Bacteriemia, Aeromonas, factores de virulencia.
 
Rev Panam Infectol 2007;9(4):19-23 Abstract
The microorganisms pertaining genus Aeromonas isolated more
Conflicto de intereses: ninguno and more frequently in the extraintestinal infection. In the period
at from January 2005 to December 2006, have been studied in the
National Reference Laboratory for Acute Diarrhoeal Diseases of the
“Pedro Kourí” Tropical Medicine Institute 44 strains pertaining to
the genus Aeromonas isolated of samples of blood sent by 5 pro-
vincial microbiology laboratories of the country. In the total strains
was made the identification in species and the determination of the
presence of some virulence factors like the extracelular production
of enzyme (lecithinase, gelatinase, Dnase, elastase and hemolisin)
citotoxity in Vero cells and fimbria presence. Five species have been
identify, Aeromonas jandaei was the specie most frequently found.
Every strains showed at least one of the virulence factor of the ones
that were investigated.
Key words: Aeromonas, virulence factors, bacteremia.

Recibido en 20/4/2007. Introducción


Aceptado para publicación en 26/6/2007. Los microorganismos miembros del género Aeromonas son ba-

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Rev Panam Infectol 2007;9(4):19-23

cilos Gram negativos, anaerobios facultativos, oxidasa servación de Pasteur fueron inoculadas en Caldo
positiva, pertenecientes a la familia Aeromonadaceae.(1) Cerebro-Corazón, e incubadas a 37°C durante 18
Los mismos tienen una distribución mundial y se han a 24 horas en condiciones de aerobiosis. Para la
aislado e identificado en humanos, animales, agua y confirmación de género las cepas fueron sembradas
alimentos.(2) en placas de Agar Mac Conkey y en Agar Triptona –
La diarrea es la afección clínica que con mayor Soya suplementado con sangre de carnero al 5%,
frecuencia producen las especies del género Aero­ e incubadas en las mismas condiciones de tempe-
monas. En individuos sanos o con factores predis- ratura, aireación y tiempo antes mencionadas, al
ponentes como Diabetes Mellitus, Inmunodepresión, cabo del cual se seleccionaron al menos 3 colonias
Neoplasias, entre otros, estos microorganismos por placas, las cuales fueron inoculadas en los
pueden pasar al torrente sanguíneo, produciendo medios de diferenciación primaria Agar Hierro y
bacteriemias y procesos infecciosos en diferentes dos azúcares de Kligler (AHK) y Agar Hierro Lisina
órganos y sistemas, por ejemplo: meningoencefa- (AHL). Se escogieron aquellas colonias que después
litis, neumonía, infecciones hepato-biliares, las del crecimiento durante 18 a 24 horas las cepas
que en ocasiones pueden comprometer la vida al presentaron codificación genética para la enzima
paciente.(3,4) citocromo oxidasa. A las cuales se les realizó el
Estas infecciones se pueden adquirir en la co- estudio fisiológico correspondiente para ubicarlas
munidad o en el ambiente hospitalario, a través de en el género Aeromonas.(1)
la ingestión de alimentos, agua, contacto con suelo Para la identificación en especies se aplicaron
y por el uso de dispositivos intravenosos.(5) los esquemas Aerokey ll(9) (hidrólisis de esculina,
Se han descrito numerosos factores de virulencia producción de indol y fermentación de la sacarosa)
asociados a la enteropatogenicidad en las especies y el Aerosquema(10) (fermentación de la arabinosa,
del género Aeromonas, entre los que se pueden producción de gas de glucosa y resistencia a la
mencionar: la producción de enzimas extracelu- cefalotina).
lares (DNasa, gelatinasa, proteasas, hemolisinas), A las cepas en estudio se le determinaron los
citotoxinas, enterotoxinas, hemaglutininas, entre siguientes factores de virulencia: la producción de
otros, haciendo más complejo el cuadro clínico al enzimas extracelulares (DNasa, gelatinasa, elastasa,
paciente.(5,6) lecitinasa y hemolisina), citotoxicidad en células
A pesar de los adelantos en el control de las Vero y presencia de fimbrias.
enfermedades infecciosas, las infecciones extrain- La actividad DNasa fue investigada según Blaze-
testinales y nosocomiales por los microorganismos vic.(11) Un halo rozado alrededor de las colonias en
antes mencionados son cada día más frecuentes Agar DNasa con 0.01% de azul de toluidina indico
y constituyen una amenaza grave para la salud de actividad de nucleasa.
la población mundial. (3,7,8) Por la antes expuesto La enzima elastasa se determinó por la metodo-
se decidió realizar la identificación en especies logía establecida por Scharmann.(12) Se inoculó por
y determinar la presencia de algunos factores de punteo en la superficie del medio Agar elastina,
virulencia en 44 cepas de Aeromonas aisladas de incubándose hasta 7 días a 370C. Un halo transpa-
pacientes con bacteriemias en diferentes centros rente alrededor de la colonia indico la presencia de
de salud del país. la enzima elastasa.(12)
El estudio de la enzima gelatinasa se realizó por
Materiales y métodos la técnica de Blazevic.(11) Se inoculo por punteo en la
En el período comprendido de enero del 2005 superficie del medio Agar gelatina, incubandose 24
hasta diciembre del 2006 se estudiaron en el La- horas a 370C. Una opacidad alrededor de la colonia
boratorio Nacional de Referencia de Enfermedades indico producción de la enzima gelatinasa.
Diarreicas Agudas del Instituto de Medicina Tropical La presencia de la enzima lecitinasa se deter-
“Pedro Kourí” (IPK) 44 cepas de Aeromonas spp mino por el protocolo recomendado por Blazevic.(11)
aisladas de muestras de sangre, procedentes de 5 Se inoculó por punteo en la superficie del medio
laboratorios de Microbiología clínica de los Centros Agar lecitina, incubandose 48 horas a 370C. Un
Provinciales de Higiene y Epidemiología del país halo transparente alrededor de la colonia indico la
que incluyeron Pinar del Río, Ciudad de la Habana, presencia de la enzima.
Camagüey, Holguín y Santiago de Cuba. Estos mi- Para la actividad hemolítica (ß hemolisina), se
croorganismos fueron aislados e identificados como siguió la técnica descrita por Robinsón.(13) Se tomo
patógenos únicos de hemocultivos. una asada y se inoculó en estría por agotamiento en
Las 44 cepas mantenidas en medio de con- Agar Triptona – Soya suplementada con sangre de

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carnero al 5%, incubándose 24 horas a 370C. Un Discusión


halo transparente alrededor de la colonia indico la Los microorganismos incluidos dentro del género
presencia de la enzima beta hemolisina. Aeromonas se aíslan cada vez más frecuentemente
Para la actividad citotóxica, se utilizó la línea en infecciones extraintestinales. Esto se debe, en
celular Vero ATCC-CCL 81, procedentes del Labora- gran medida, a una mayor supervivencia de los pa-
torio de Cultivo de Células del IPK. Se realizó por la cientes con enfermedades graves y al reconocimiento
técnica propuesta por Ljungh.(14) La observación de de estos agentes como patógenos humanos.(3,6,7)
redondeamiento, vacuolización y degeneración de Desde 1987 han sido reconocidas Aeromonas
igual o más del 50% de las células indicó citotoxi- veronii, Aeromonas schubertii, Aeromonas jandaei,
cidad. Aeromonas trota, Aeromonas allosaccharophila, Aero­
Para realizar la determinación de la presencia monas encheleia y Aeromonas bestiarum como causa
de fimbrias se procedió según el método de Nishi- de infecciones intestinales y extraintestinales.(16,17) En
kawa.(15) Se preparo una suspensión bacteriana y la actualidad se reconocen cuatro especies del genero
una de glóbulos rojos humanos grupo O al 3% de Aeromonas como causa de septicemia: Aeromonas
varios donantes. Se mezclo 20µl de ambas en una hydrophila, Aeromonas veronii (ambos biotipos), Ae­
lámina portaobjeto. Se agitó durante 5 minutos. romonas caviae, y Aeromonas jandaei.(18,19,20) Aunque
Como resultado positivo se observa aglutinación de cuando se revisa la literatura médica Aeromonas hydro­
los glóbulos rojos. phila es la especie que con mayor frecuencia es aislada
de hemocultivos.(20,22) Los resultados en relación a la
Resultados identificación en especie de la presente investigación
De las 44 cepas en estudio, en 35 (79.5%) se son similares a los obtenidos en los estudios antes
identificaron 5 especies, Aeromonas jandaei 12 mencionados.
(27.2%), Aeromonas veronii bv sobria 8 (18.1%), En América Latina y el Caribe son escasos los
Aeromonas trota 6 (13.6%), Aeromonas caviae estudios sobre factores de virulencia (producción de
5 (11.3%), Aeromonas hydrophila 4 (9.0%), 9 enzimas extracelulares, citotoxicidad en células Vero
(20.3%) no pudieron ser identificadas en especies y presencia de fimbrias) realizados en los microorga-
por lo que se clasificaron como Aeromonas spp. nismos pertenecientes al género Aeromonas aislados
En la tabla 1 se observa el resultado de la pre- de muestras de sangre.(23)
sencia de los factores de virulencia de las cepas de En relación a la producción de las enzimas ex-
Aeromonas estudiadas. Todas las cepas presentaron tracelulares, las cepas de Aeromonas hydrophila del
al menos un factor de virulencia de los investiga- presente estudio evidenciaron la producción de la
dos. La enzima lecitinasa estuvo presente en 39 enzima ß hemolisina y DNasa. Nuestros datos son
cepas (88.6%), seguido de la enzima gelatinasa semejantes a los obtenidos en un estudio relacionado
en 37 cepas (84.0%). Aeromonas hydrophila y con los posibles factores de virulencia implicados en
Aeromonas jandaei fueron las especies que presen- la patogenicidad de cepas de Aeromonas hydrophila
taron mayor positividad a los factores de virulencia aisladas de bacteriemias realizado en Malasia, quienes
estudiados. encontraron la enzima DNasa en las 18 cepas estudia-

Tabla 1. Presencia de los factores de virulencia estudiados en las cepas de Aeromonas

Producción de enzimas extracelulares


Citotoxicidad Presencia
Especies No
Beta en células Vero de fimbrias
DNasa Elastasa Gelatinasa Lecitinasa
hemolisina
Aeromonas hydrophila 4 4 4 3 3 4 4 1
Aeromonas caviae 5 5 - 4 5 5 - 5
Aeromonas trota 6 6 - 6 6 - - 5
Aeromonas veronii bv sobria 8 - - 8 8 8 8 4
Aeromonas sp 9 6 4 8 7 1 5 3
Aeromonas jandaei 12 4 - 8 10 12 12 10
Total 44 25 8 37 39 30 29 28
% 100 56.8 18.1 84.0 88.6 68.1 65.9 63.6
Fuente: Protocolo de trabajo. IPK. 2002-2003.

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das y con los de una investigación realizada en España encontraron la presencia de fimbrias en las cepas de
en el año 2003, sobre determinación y expresión de Aeromonas hydrophila estudiadas. Sin embargo en
genes de virulencia, que incluyo las siguientes especie: un investigación sobre prevalencia y propiedades de
Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae, y Aeromonas virulencia en cepas de Aeromonas llevada a cabo en
jandaei donde los autores demostraron la presencia Brazil, los autores encontraron la presencia de fimbrias
de estas enzimas en la totalidad de las cepas antes en todas las cepas de Aeromonas hydrophila aisladas
citadas aisladas de muestras clínicas.(21,24) de muestras intestinales y extraintestinales.(27,28)
En las cepas de Aeromonas veronii bv sobria, se La identificación en especies del género Aero­
observó la presencia de la enzima beta hemolisina y monas, así como sus atributos de patogenicidad
gelatinasa. Resultado que coincide con el publicado demostrados en los aislamientos que formaron parte
por Mayoral, quien demostró la presencia de estas de este estudio, pusieron en evidencia la circulación
enzimas, en la misma especie aislada de un paciente en Cuba de este microorganismo aislado de pacientes
con celulitis con gran secreción de pus, y diseminación con bacteriemias.
al torrente sanguíneo.(4)
Varios autores han propuesto la existencia de Referencias
complejos mecanismos de patogenicidad en el género 1. Garrity GM, Bell JA, Lilburm TG. Taxonomic outline
Aeromonas, que pueden ser usados como marcadores of the prokaryotes. En: Bergey’s Manual of Systematic
de virulencia, entre los que se pueden mencionar: Bacteriology. 2nd ed. Release 4.0;Oct 2003. [Citado el
10 de febrero del 2004]. Disponible en: URL:http://
fosfolipasas, proteasas, hemolisina, enterotoxina y
dx.doi.org/10.1007/bergeysoutline200310
citotoxina favoreciendo la invasividad, la actividad
2. Sharon LA, Wendy K, Cheung W, Janda JM. The Genus
citolítica y la adherencia.(25,27) Aeromonas: biochemical characteristics, atypical reac-
Las cepas de Aeromonas hydrophila de la presente tions, and phenotypic identification schemes. J Clin
investigación presentaron signos de citotoxicidad. Re- Microbiol. 2003;79(6):2348-57.
sultado que esta acorde con el obtenido por Vadivelu 3. Clark NM, Chenoweth CE. Aeromonas infection of the
J y cols., 1995, los cuales encontraron la presencia hepatobiliary system: Report of 15 cases and review of
de este marcador de virulencia en la cepas que fueron the literature. Clin Infect Dis. 2003;37:506-13.
objetos de estudio, además Bauab TM y cols., 2003, 4. Mayoral C, Gómez M, Schmeling MF, Peirano S.
de las 39 cepas de Aeromonas hydrophila aislada de Celulitis y bacteriemia por Aeromonas veronii biovar
sobria, presentación de un caso. Infect Microbiol Clin.
muestras extraintestinales el (43.6%) de las cepas pre-
2000;12(2):71-3.
sentaron citotoxicidad en la línea celular Vero.(16,21) 5. Soler L, Figueras MJ, Chacón MR, Vila J, Marco F,
En un estudio realizado por Wilcox relacionado Martínez–Murcia A J et al. Potential virulence and anti-
con la presencia de citotoxinas en células Vero por microbial susceptibility of Aeromonas popoffi recovered
Aeromonas caviae encontró que esta especie no resultó from freshwater and seawater. FEMS Immunol Med
citotoxica.(25) Resultado similar fue obtenido en este Microbiol. 2002;32(3):243-7.
trabajo. Sin embargo en una investigación realizada 6. Sechi LA, Deriu A, Falchi MP, Fadda G, Zanetti S. Dis-
por Krzyminska en Polonia relacionada con la actividad tribution of virulence genes in Aeromonas spp. Isolated
enteropatogénica de Aeromonas caviae aisladas en from Sardinian waters and from patients with diarrhoea.
J Appl Microbiol. 2002;92(2):221-7
muestras de diarreas encontró que la mayoría de las
7. Bravo Fariñas L, Morier L, Castañeda N, Ramírez M,
cepas fueron citotoxicas en células Vero.(26) Resultado
Silva M, Castro- Escarpulli G. Aeromonas: an emerging
que discrepa con el nuestro. pathogen associated with extraintestinal infection in
La adherencia bacteriana a las células del huésped Cuba. Rev Cubana Med Trop. 2003;55(3):208-9.
susceptible representa un paso importante para la 8. Castro-Escarpulli G, Aguilera Arreola GM, Giono Ce-
colonización tisular y es mediada por moléculas lla- rezo S, Hernández-Rodríguez C, Rodríguez Chacon
madas adhesinas. Numerosas investigaciones sugieren M, Soler Falgás L. El género Aeromonas: ¿Un pató-
que la adhesión es probablemente mediada por una geno importante en México? Enf Infecc Microbiol.
variedad de pilis u otros factores de colonización los 2002;22(4):206-16.
cuales pueden estar o no relacionados con la hema- 9. .Carnahan A, Behran S, Joseph S. Aerokey ll: a flexible
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Analizando la presencia de fimbrias a través de la 10. Furuwatari CH, Kawakami Y, Akahame T, Hidaka E, Oki-
técnica de hemaglutinación, se observa baja positi- mura Y, Nakayama J et al. Proposal for an Aeroscheme
vidad en las cepas de Aeromonas hydrophila a este (modified Aerokey ll) for the identification of clinical
factor, coincidiendo con los resultados de un estudio Aeromonas species. Med Sci Res. 1994;22:617-9.
relacionado sobre patrones de adherencia realizado 11. Blazevic DJ, Ederer GM. Principles of biochemical test
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