Вы находитесь на странице: 1из 25

АКАДЕМИЯ НАУК МОЛДОВЫ

Институт генетики и физиологии растений

На правах рукописи
УДК: 579.895.421(478)(043.3)+595.421(478)(043.3)

МОВИЛЭ Александру

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ
ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ IXODES RICINUS (L.) И
ТРАНСМИССИВНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ОЧАГАХ
РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА

03.00.15 – Генетика

АВТОРЕФЕРАТ
доктора биологических наук

КИШИНЭУ, 2008
Работа выполнена в Центре общей и молекулярной биологии,
Институт зоологии АН Молдовы
Научный руководитель:
ТОДЕРАШ Ион доктор хабилитат биологии, профессор,
академик.
Научный консультант:
ДУКА Мария доктор хабилитат биологии, профессор,
член-корреспондент.
Официальные референты:
БОРХСЕНИУС СЕРГЕЙ, доктор биологии, профессор, Институт
Цитологии, Санкт-Петербург, Россия.
ЧЕМОРТАН ИГОР, доктор биологии, доцент, Государственный
университет медицины и фармакологии «Николае Тестимициану»,
Республика Молдова.
Члены Ученого Специализированного Совета:
ЖАKОТЭ Анатол, председатель, доктор хабилитат биологии, профессор,
академик.
КОТЕНКО Евгения, учёный секретарь, доктор биологии.
БАРБАКАР Николае, доктор хабилитат биологии, профессор.
ЛУПАШКУ Галина, доктор хабилитат биологии, конференциар.
ТУМАНОВА Лидия, доктор химии, конференциар.
Защита состоится 19 сентября 2008 г. в 1000 часов на заседании Научного
Специализированного Совета DH 10.03.00.15-06 при Институте генетики и
физиологии растений Академии Наук Молдовы (MD – 2002, г.Кишинев, ул.
Пэдурий, 20). Tel. (0373 22) 77 04 47; fax: (037322) 55 61 80,
E-mail: igcanc@mail.md
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке
Института генетики и физиологии растений Академии Наук Молдовы
и на веб-сайте CNAA http://www.cnaa.acad.md
Автореферат был отправлен “_____” _______________ 2008 г.
Учёный секретарь
специализированного совета,
доктор биологии КОТЕНКО Евгения
Научный руководитель,
доктор хабилитат биологии ТОДЕРАШ Ион
Научный консультант,
доктор хабилитат биологии ДУКА Мария

Автор МОВИЛЭ Александру

2
Актуальность темы:
Иксодовые клещи Ixodes ricinus (L.) являются переносчиками
множества патогенов из разных систематических групп животного царства:
вирусов, бактерий и простейших. При этом происходит формирование
сложно-организованных паразитарных систем.
В последнее время ряд авторов сообщают о появлении на территории
Европы сочетанных полиморфных очагов, в которых циркулируют до семи
различных патогенов человека, передающихся при укусе иксодовыми
клещами (Pichon et al., 2003; Rauter, Hartung, 2005). Спирохеты Borrelia
burgdorferi sensu lato и Грам-отрицательные внутриклеточные
рикетсиоподобные микроорганизмы родов Anaplasma sp. являются наиболее
распространёнными клещевыми патогенными микрорганизмами на территории
Европы (Loebermann et al., 2006). Обе группы включают, как патогенные, так и
непатогенные для человека виды и не идентифицируются классическими
методами исследований.
В последнее время особое внимание уделяется разнообразию инфекции в
организме иксодовых клещей с высоким уровнем антропогенного пресса.
Целенаправленные исследования Национального института США по
вопросам аллергологии и инфекционных заболеваний свидетельствуют, что
Borrelia sp. и Anaplasma sp. часто формируют сочетанные очаги в природных
условиях и способны передаваться при укусе клеща, как микст-инфекция
(www.niaid.nih.gov/topics/lymeDisease/research/co-infection). Это явление
представляет значительный практический интерес, поскольку подразумевает
возможность одновременной передачи человеку возбудителей сразу нескольких
инфекций. В случае заражения подобной микст-инфекцией терапевтическая
тактика медикаментозного лечения пациента должна подвергаться серьезной
корректировке, поскольку известно, что cмешанный инфекционный процесс
значительно отличается от моноинфекционного (Алексеев и др., 2001; Krause et
al., 1996).
Диагностика патогенных микроорганизмов в организме-переносчике
значительно осложняется не только генетическим полиморфизмом патогенных
микроорганизмов, но и гетерогенностью популяций самого хозяина (Estrada-
Peña et al., 1996).
Молекулярно-генетическое генотипирование иксодовых клещей,
патогенных микроорганизмов и позвоночных хозяев в клещевых очагах на
территории Молдовы во всем их разнообразии до сих пор не проведено на
уровне молекулярных исследований. Подавляющее число исследований было
посвящено определению наличия B. burgdorferi s.l. и Anaplasma sp. в клещах
без детальной видовой спецификации. Эти исследования были выполнены на
феноменологическом уровне (Коновалов и др., 2006; Gheorghiţa, 2007).
Описанные выше факторы обусловили выбор, в качестве объекта
исследований, иксодовых клещей вида I. ricinus и переносимых ими
патогенных микроорганизмов для человека и животных.

3
Цель работы:
Выявить молекулярно-генетическое разнообразие иксодовых клещей
Ixodes ricinus (L.) (Acarina, Ixodidae), патогенных микроорганизмов и
позвоночных хозяев в рамках системы «паразит – хозяин» в смешанных
очагах клещевых боррелиозов.
Для достижения указанной цели было необходимо решить следующие
задачи:
1. Протестировать диагностическую чувствительность некоторых
маркеров для видового определения иксодовых клещей (Acarina,
Ixodidae) и генотипирования патогенных микроорганизмов.
2. Провести молекулярно-биологическое генотипирование патогенов в
очагах Лайм боррелиоза на территории Республики Молдова.
3. Изучить генетический полиморфизм клещей Ixodes ricinus в очагах с
разным уровнем антропогенного пресса.
4. Проанализировать генетическую гетерогенность и сделать выводы по
внутривидовой филогении комплексов B. burgdorferi s. l. и
Anaplasmataceae.

Научная новизна:

• Впервые были проведены комплексные молекулярно-биологические


тесты различных маркеров для видового определения иксодовых клещей и
скрининга видов групп B. burgdorferi s.l. на территории Респблики Молдова.
Было выявлено наличие пяти видов B. burgdorferi s.l.: B. burgdorferi s.s., B.
garinii, B. afzelii, B. valasiana, B. lusitaniae, первые три из которых являются
возбудителями иксодовых клещевых боррелиозов.
• Впервые проведены пилотные исследования по комплексному
молекулярному экспресс-маркированию видов B. burgdorferi s.l. и
позвоночных хозяев клещей на основании анализа ДНК, выделенной из
организма иксодовых клещей I. ricinus. Использованные тесты дополняют
зоологические данные о прокормителях иксодовых клещей для выявления
круга резервуаров спирохет р. Borrelia в клещевых очагах.
• На основании использования арбитральных и универсальных
праймеров проведены исследования по изучению генетического
полиморфизма популяции иксодовых клещей I. ricinus на территории
Республики Молдова. Было выявлено пять гаплотипов по участку ДНК 12S
рРНК, и определена частота, с которой они встречаются на изучаемой
территории.
• На основании метода ПЦР с использованием универсальной пары
праймеров для 16S рРНК и последующего секвенирования полученных
ампликонов, впервые на территории Республики Молдова было выявлено
присутствие Anaplasma phagocytophilum (возбудитель гранулоцитарного
анаплазмоза человека) и Сandidatus Nicolleae massilliensis (патогенное
значение для человека не установлено). Полученные секвенированные

4
последовательности были депонированы в базу данных MBL/DDBJ/GenBank.
Номера доступа: MBL/DDBJ/GenBank для 16S рДНК: AB287399, AB287398,
AB287397, AB287396, AB287395.
• На основании молекулярных маркеров 16S – 23S рДНК для B.
burgdorferi s.l. и 16S рДНК – Anaplasmataceae был проведён анализ
филогенетических связей внутри этих видовых комплексов.

Теоретическая и практическая ценность работы:


В теоретическом плане данная работа может быть использована для
выявления генетического полиморфизма иксодовых клещей и передаваемых
клещами патогенных микроорганизмов на территориях с разным уровнем
антропогенного пресса. Полученные молекулярно-генетические данные
представляют интерес для реконструкции молекулярной эволюции видов B.
burgdorferi s.l. и Anaplasmataceae, а также выявления отношений «паразит-
хозяин».
В практическом плане работа представляет интерес для диагностики и
выявления генетического полиморфизма иксодовых клещей и клещевых
патогенов. Тест ПЦР-RLB с видоспецифичными олигонуклеотидами может
быть использован для экспресс- диагностики возбудителей клещевых
боррелиозов и прокормителей эктопаразитов на основании ДНК,
содержащейся в организме клещей. Полученные по методам сохранения,
экстракции и скрининга результаты дают возможность правильно подобрать
метод диагностики патогенных микроорганизмов в организме клещей для
своевременной профилактики очагов зоонозов и предотвращения развития
эпидемий и эпизоотий.
Материалы диссертации могут быть использованы в научной и
практической работе генетиков, эпидемиологов, ветеринаров,
микробиологов, а также как дидактический материал в преподавании курсов
«Генетика», «Молекулярная биология», «Микробиология и вирусология»,
«Общая паразитология» и «Эпидемиология».

Публикации:
По теме диссертации опубликовано 6 статей в национальных и
международных рецензируемых журналах, тезисы 4-х докладов на
национальных и международных конференциях.

Aпробация работы:
Основные положения диссертации докладывались на:
- VIII и IX International Jena Symposium on Ticks and tick-borne diseases
(Йена, Германия, 2005, 2007)
- V International Conference on Ticks and Tick-borne Pathogens
(Нойшатель, Швейцария, 2005)

5
- Международной научной конференции «Фауна, биология,
морфология и систематика паразитов» (Москва, 2006)
- научных семинарах департамента Эпидемиологии и Здоровья
населения (руководитель проф. D. Fish, Йельский Университет, США)
- в лаборатории Эко-эпидемиологии, (руководитель проф. L. Gern,
Нойшатель, Нойшательский Университет, Швейцария)
- в Обществе Риккетсиологии, лаборатория молекулярной биологии
рикетсий (руководитель проф. D. Rаoult, Марсель, Франция)
- в лаборатории медицинской зоологии (руководитель Dr. Sc. M.
Labuda, Институт зоологии, Братислава, Словакия)
- в ходе научной отчётной сессии Института зоологии АН Молдовы.
Работа проведена при финансовой поддержке стипендий правительства
Молдовы «Bursa de excelenţă», MRDA-CRDF (MTFP 016/05, MTFP 016/05
Follow ON), INTAS – AŞM (4748 PhD) и World Federation of Scientists.
Данные исследования были отмечены премией Академии Наук
Молдовы в номинации «Premiul Academiei de Ştiinţe a Moldovei pentru
lucrările ştiinţifice ale tinerilor savanţi pentru anul 2005 şi 2007».

Структура и объём диссертации:


Материалы диссертационной работы изложены на 95 страницах и
содержат 7 таблиц и 29 рисунков. Диссертация состоит из введения, 6 глав,
выводов, практических рекомендаций, резюме на русском, румынском и
английском языках. Список литературы включает 270 источников.

Ключевые слова:
Генетический полиморфизм; молекулярно-генетические маркеры;
иксодовые клещи; трансмиссивные микроорганизмы; позвоночные хозяева;
молекулярная филогения.
Благодарности. Автор выражает благодарность научным
руководителям (академику, проф. И. Тодераш и член-корреспонденту,
проф. М. Дука) и коллегам (Др. И. Успенская, Др. С. Георгица, В.
Бурлаку (Национальный научно-практический центр превентивной
медицины, Республика Молдова), Др. Ю. Коновалов (Институт
зоологии, АН Молдова), Проф. Д. Фиш, А. Гэтвуд (Йельский
Университет, США), Проф. M. Лабуда, Др. Ю. Кочь (Институт зоологии,
Словакия), Др. Л. Герн, К. Бурри, В. Дут, O. Рис (Нойшательский
университет, Швейцария), Проф. Д. Рауль, Проф. Ж.-М. Ролан (URMITE
UMR 6236, CNRS-IRD, Факультет медицины и фармации, Франция), Проф. A.
Алексеев, Др. Е. Дубинина (ЗИН, Россия) за научные консультации и
всестороннюю помощь.

6
Глава I. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ
КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ «ПАРАЗИТ – ХОЗЯИН»

В обзоре литературы рассматривается концепция «паразитарной


системы» и понятие очага, как частного случая взаимоотношений «хозяин -
паразит».
Обсуждается молекулярно – генетический полиморфизм системы
«паразит – хозяин» на примере растений и животных, в контексте
сопряжённой эволюции организмов.
Приводится анализ многих современных методов маркирования
разнообразных смешанных клещевых очагов.
Обсуждается роль клещей I. ricinus как переносчиков различных
патогенов. Особый акцент делается на генетический полиморфизм
популяции иксодовых клещей и патогенных микроорганизмов.

Глава II. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для диссертационной работы послужили данные,


собранные в течение 2000 – 2003 гг. в составе научной группы отдела Особо-
опасных инфекций (ООИ), Национального научно-практического центра
профилактической медицины, а также в период докторантуры 2003-2006 на
основе лаборатории паразитологии и гельминтологии Института зоологии
АН Молдовы.
Всего было собрано 750 экземпляров клещей I. ricinus в очагах с разной
степенью антропогенного пресса: территория заповедников «Кодры» и
«Пэдуреа домнеаскэ», урбаноценоз Кишинёва, лесо-парковые «Вадул-луй-
Водэ» и «Дурлешты». Весь собранный материал был подвергнут различным
молекулярно-биологическим исследованиям.
Классические методы исследования. Сбор и определение видовой
принадлежности иксодовых клещей проводились по методам Оленьева
(1923), Померанцева (1950) и Филлиповой (1977, 1997).
Молекулярно-биологические методы исследования включали в себя
различные протоколы экстракции нуклеиновых кислот, тестирование
выделенного ДНК при помощи ПЦР с использованием различных праймеров
(“basic” и “nested”) и последующим анализом полученных ампликонов с
использованием техники RFLP, RLB и секвенирования.
Выделение ДНК проводились тремя различными методами: 0.7 М
раствором гидроксида аммония (Burri et al, 2006), метод Бума (Hubbard et al,
1998), коммерческим набором реактивов ISOQUICK kit (ORCA Inc.).
Видовое определение и выявление полиморфизма иксодовых
клещей (Acarina, Ixodidae). Подтверждение правильности видового
определения и исследование полиморфизма клещей проводились по
протоколу basic PCR с амплификацией 420 п.о. участка 12S рДНК,
последующим секвенированием и проведением BLAST анализа (Norris et al.,
1999).
7
Молекулярно-генетический скрининг видовых комплексов
патогенных микроорганизмов.
Генотипирование Borrelia burgdorferi s.l. Диагностику всего видового
комплекса осуществляли по протоколам Koci et al., 2007 для «basic» PCR, с
молекулярным маркером 5S-23S рДНК и «nested» PCR участка 16S-23S
рДНК - по Liveris et al. (1999).
Генотипирование видов B. burgdorferi s.l. осуществлялось методами
PCR-RFLP c использованием рестриктазы MsuI (Postic et al., 1995), PCR-RLB
по методу Paupon et al., 2006 и проводился BLAST анализ секвенированных
ампликонов.
Генотипирование сем. Anaplasmatacea. Для тестирования был
использован протокол basic PCR с амплификацией фрагмента 420 п.о. гена
16S рДНК и последующим секвенированием (Parola et al., 2003).
Определение ДНК позвоночных хозяев в организме иксодовых
клещей пpоводилось методом «blood meal host DNA» с использованием
PCR-RLB и пары праймеров, универсальных для большинства членов
надкласса Tetrapoda (за исключением класса Amphibia). При этом
амплифицировали 12S рДНК с последующей гибридизацией ампликонов,
иммобилизированных на биотиновой мембране с видоспецифичными
олигонуклеотидами (Humair et al., 2007).
Секвенирование ПЦР продуктов. Очистку ПЦР продуктов проводили
на MiniElute PCR Purification Plate (Qiagen, Valencia, CA). Реакции
выполняли на автоматизированном сиквенаторе Applied Biosystem с
использованием Big Dye termination cycle 1.0 kit.
Методы статистики и биоинформатики. Статистическая обработка
данных проводилась при помощи компьютерной программы STATISTICA 6.0.
Нуклеотидное выравнивание секвенированных участков ДНК, BLAST анализ,
расчёт эволюционных изменений нуклеотидных последовательностей
генетических макромолекул - по двух-параметрическому методу Кимуры.
Построение филогенетических древ выполнено с использованием
дистанционно-матричных методов (алгоритмы связывания ближайших соседей
[Neighbour-joining] и попарного невзвешенного кластирования с
арифметическим усреднением [UPGMA]) при помощи компьютерной
программы MEGA 3.1 (Kumar et al., 2004).
Нуклеотидные последовательности базы данных
MBL/DDBJ/GenBank. Для проведения филогенетического анализа были
использованы следующие нуклеотидные последовательности: 12S рДНК I.
ricinus (AY945497, AY945452, AY945493), 16S-23S рДНК B. burgdorferi s.l.
(AF467863 B. burgdorferi s.s.; DQ437488 B. burgdorferi s.s.; AY121816 B. garinii;
AY8365549 B. garinii 20047; AY163782 B. afzelii); 16S рДНК
Ehrlichia/Anaplasma (EU098007 A. phagocytophilum; AF283007 A. centrale;
M60313 A. marginale; AF318945 A. ovis; M73222 Ehrlichia chaffeensis; U15527 E.
muris; AF179630 Wolbaсhia pipientis; M21789 Rickettsia prowazekii; U11021 R.
rickettsii; AY776 R. bacterium; DQ788562 Сandidatus Nicolleae massilliensis;
U12457 Neorickettsia helminthoeca).
8
Глава III. РАЗРАБОТКА И ОПТИМИЗАЦИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-
БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОТОКОЛОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ
РАЗНООБРАЗИЯ ОЧАГОВ ИКСОДОВЫХ КЛЕЩЕЙ IXODES RICINUS

Дизайн универсальных и уникальных олигонуклеотидов для


молекулярно-биологических PCR-RLB тестов по выявлению круга
позвоночных хозяев иксодовых клещей Ixodes ricinus

В настоящее время техника PCR-RLB приобретает всё большую


популярность при проведении “blood meal DNA test” и выявлении круга хозяев
у кровососущих членистоногих.
Для поиска универсальных олигонуклеотидов для выявления ДНК
млекопитающих в целом, мелких млекопитающих и птиц были использованы
сиквенированные последовательности 12S рДНК различных млекопитающих и
птиц со средней длинной в 930 п.о. из базы данных MBL/DDBJ/GenBank.
Наиболее подходящий участок был выявлен между 425 – 575 п.о.,
длинной в 150 п.о. Нами был проведён дизайн праймеров 12S-6F и 12S-9R и
протестирован на эталонных образцах ДНК позвоночных животных.
В результате тестирования ДНК иксодовых клещей с использованием
предсказанных олигонуклеотидов для 12S рДНК позвоночных положительные
результаты были получены в 78.3% случаев. Родовое и видовое определение
хозяев на основании выбранного маркера было возможно в 83% тестов. Нами
выявлена следующая закономерность: наибольший процент проложительной
амплификации (до 93%) отмечался у клещей, собранных в мае, наименьший –
летом (в июле до 20%). Эти результаты хорошо сопоставимы с особенностями
жизненного цикла иксодовых клещей I. ricinus.

Сравнительный анализ чувствительности молекулярных


межгенных спейсеров митохондриальной ДНК в диагностике комплекса
B. burgdorferi s.l.

Использовали «nested» ПЦР и «basic» ПЦР протоколы для межгенных


молекулярных спейсеров 16S – 23S рДНК и 23S – 5S рДНК - соответственно.
Выявлено, что оба молекулярно-генетических маркера дают хорошие
результаты при диагностике всего видового комплекса B. burgdorferi s.l. ПЦР
амплификация была осуществлена со 100% успехом в обоих случаях.
Существенные отличия были выявлены при генотипировании видового
комплекса боррелий.
С nested PCR праймерами хорошо амплифицируется участок 16S–23S
рДНК (ITS-1). В результате электрофоретического анализа nested-PCR
продуктов ITS-1 региона видового комплекса B. burgdorferi s.l., нами были
определены три класса ампликонов различной длины: 430, 940 и 1040 п.о.
(Рис. 1).

9
Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР продуктов, полученных при
амплификации межгенного спейсера
16S – 23S рДНК: M – маркер, (100 pb, Biolabs, USA); ампликоны для: 1 –
Borrelia burgdorferi s.s., 2 - Вorrelia garinii, 3 –Borrelia afzelii

Проведённое секвенирование ДНК и BLAST анализ позволили


установить, что длина в 430 п.о. характерна для B. afzelii, 940 п.о. – B.
burgdorferi s.s. и 1040 п.о. – для В. garinii. Таким образом, данный ПЦР
протокол может быть полезен для первичной диагностики патогенных для
человека видов, вызывающих клещевые боррелиозы. ДНК остальных видов
не амплифицируются по этому nested-ПЦР протоколу, что свидетельствует о
необходимости доработки олигонуклеотидной последовательности
праймеров или температуры отжига.
Генотипирование по участку 23S – 5S рДНК проводили двумя
различными техническими методами: Riverse Line Blot Hybridisation (RLB)
(рис. 2) и Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) (рис. 3).

Рис 2. Результаты PCR-RLB на биотиновой мембране с видоспецифичными


олигонуклеотидами для Borrelia burgdorferi s.l.

10
Рис 3. Результаты PCR-RFLP электрофореза рестриктазой MseI участка
5S – 23S рДНК Borrelia burgdorferi s.l.
1, 2 – рестрикционная картина, характерная для Borrelia burgdorferi s.s.; 3 – B.
garinii, риботип 20047 (резервуар - птицы), 4 - B. garini, риботип NT 29 (резервуар -
мелкие млекопитающие), 5, 6 – B. afzelii;
7 – B. valasiana

При PCR-RFLP анализе было использовано расщепление ПЦР


продуктов рестритриктазой MseI, а в PCR-RLB были использованы
видоспецифичные олигонуклеотиды, которые гибридизировались на
биотиновой мембране.
В результате тестирования было выявлено, что RFLP уступает RLB в
чувствительности на 15,3%. В то же время RFLP метод удобен для
диагностики различных вариаций в пределах видового комплекса, так как в
случае мутаций теоретически может произойти изменение рестрикционной
картины. В наших исследованиях мы не обнаружили таких изменений.

Глава IV. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ МАРКИРОВАНИЕ


КОМПОНЕНТОВ СМЕШАННЫХ ОЧАГОВ КЛЕЩЕВОГО
БОРРЕЛИОЗА

Формирование смешанных очагов клещевого боррелиоза в


определённом биотопе определяется обязательным присутствием следующих
компонентов: 1) доминирующего (один или несколько членов видового
комплекса B. burgdorferi s.l.); 2) фонового (например, Anaplasma/Ehrlichia sp.)
патогенного микроорганизма в организме переносчика – кровососущего
членистоногого (клещи р. Ixodes); 3) резервуара патогена (прокормители
переносчиков – различные позвоночные животные) (Cercasskii et al., 2006).

Разнообразие видов Borrelia burgdorferi s.l., сем. Anaplasmataceae и


резервуарных позвоночных хозяев в клещевых очагах Ixodes ricinus на
территории Республики Молдова

В результате амплификации ДНК с видоспецифичными праймерами


5S-23S рДНК для спирохет комплекса B. burgdorferi s.l. было выявлено, что
средняя степень заражения боррелиями по исследованным точкам сбора

11
составила 9,6±0,4. ДНК боррелий чаще находили в самках, собранных на
территории г. Кишинёва (22,5±0,4%), в то время, как в остальных точках
сбора - в самцах - уровень заражения колебался в пределах 13,7±0,8%. Этот
факт представляет особый интерес для эпидемиологии Лайм боррелиоза на
изучаемой территории, так как в литературных источниках встречается
информация, что боррелиями наиболее заражены самки и нимфы клещей
(Gray et al., 1999).
Проведённое генотипирование комплекса видов B. burgdorferi s.l.
позволило выявить на территории Республики Молдовы циркуляцию пяти
видов: B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. valasiana и B. lusitaniae
(Таблица 1). На изучаемой территории установлено яркое доминирование
вида B. afzelii (в среднем 46,7%).
Сравнение генетического разнообразия боррелий, анаплазм/эрлихий и
позвоночных хозяев на территории Молдовы позволило выявить
существенные различия в формировании и функционировании клещевых
очагов.
Территория урбаноценоза Кишинёва. На этой территории отмечено
присутствие ДНК всех пяти видов борелий, при доминировании B. garinii
(39,3%) и B. afzelii (32,3%). Фоновый вид – B. lusitaniae (16,1%). При
генотипировании группы Anaplasma/Ehrlichia sp. выявлено присутствие
только A. phagocytophilum в 9% исследованных клещей. Число микст-
инфекций клещей составило 2,5% в следующей комбинации: A.
рhagocytophilum и B. afzelii – 3%, B. lusitaniae/A. phagocytophilum и B.
valasiana/A. phagocytophilum – 1% заражения. Проведенные тесты на наличие
ДНК хозяев в организме клещей позволили показать, что основными
прокормителями личинок и нимф клещей на 63% являются птицы, на 35% –
мелкие млекопитающие, на 2% – ящерицы. В прокормлении личинок и нимф
участвуют 4 вида мелких млекопитающих: Apodemus agrarius, A. flavicollis, A.
sylvaticus и Clethrionomys glareolus. Среди птиц основную роль играют
Garrulus glandarius, Erithacus rubecula и Passer domesticus. Клещи в
имагинальной фазе развития питаются на коровах (Bos taurus taurus), собаках
(Canis lupus familiaris) и овцах (Ovis orientalis aries).
Таблица 1.
Результаты генотипирования видового комплекса Borrelia burgdorferi s.l. на
различных территориях в период 2005-2006 гг.

Идентифицированные виды боррелий, %


Точки сбора B.b. B.g B. B. vs B. B.b. микст-
s.s. afz lust s.l. инфекция
Кишинэу 3,6 39,3 32,1 16,1 8,.9 - -
Вадул-луй-Водэ 10 - 70 - 10 10 -
“Кодры” 7,7 7,7 - 38,5 30,7 7,7 7,7
“Пэдуреа - 14,3 38,1 9,5 28,6 9,5 -
домнеаскэ”
Всего 7,1 20,4 46,7 21,4 19,6 9,1 7,7
12
Территория зоны отдыха Вадул-луй-Водэ. На территории зон отдыха
Вадул-луй-Водэ найдено три вида боррелий: B. afzelii (70%), B. burgdorferi
s.s. (10%) и B. lusitaniae (10%) в клещах I. ricinus. В 10% случаев ДНК не
была определена до вида. Нами не было зарегистрировано наличие
Anaplasma/Ehrlichia. Основную роль в прокормлении предимагинальных
стадий развития клещей играют: птицы (Passer domesticus и Sturnus vulgaris) –
25%, мелкие млекопитающие (Apodemus agrarius, A. flavicollis и Clethrionomys
glareolus) – 65%, ящерицы (Lacerta sp.) – 10%. Тестирование имаго клещей на
присутствие ДНК позвоночных, позволило выявить такой же спектр
прокормителей, как и для урбаноценоза Кишинёва.
Полученные данные не соответствуют предположению о поддержании
птицами очагов Лайм боррелиоза на данной территории (Успенская И.Г.,
устное сообщение). Однако, по данным различных авторов (Алексеев и др.,
2003; Haninkova et al., 2004; Paupon et al., 2006), эти хозяева играют
значительную роль в прокормлении иксодовых клещей I. ricinus.
В то же время в проанализированном коллекционном материале
клещей I. lividus (собранных в 1980–90-е гг.) – облигатного эктопаразита
ласточек береговушек (Riparia riparia) - впервые выявлено присутствие ДНК
двух видов боррелий: B. burgodrferi s.s. и B. garinii в этом виде клеща.
Учитывая тот факт, что в заброшенных гнёздах ласточек береговушек могут
гнездиться другие виды птиц, являющиеся прокормителями I. ricinus –
основного переносчика боррелий, не исключено, что вследствие
антропогенной трансформации среды произошла смена видов-доминантов
боррелий.
Территория заповедника «Кодры». В результате генотипирования
боррелий выявлено присутствие на данной территории 4 видов при ярком
доминировании B. valasiana (38,5%) и B. lusitaniae (30,7%). Интересно
отметить полное отсутствие геновида B. afzelii на территории заповедника
«Сodrii», при том, что в целом в пределах Республики Молдова он является
доминирующим. Группа Anaplasma/Ehrlichia была выявлена в 16,4% случаев:
в 10,3% - А. phagocytophilum и в 6,1% - Сandidatus N. massilliensis. Микст-
инфекция B. garinii и B. valasiana в клещах была выявлена в 7,7% случаев.
Наши результаты свидетельствуют о том, что основная роль в
прокормлении предимагинальных стадий развития принадлежит птицам
(Turdus merula, Erithacus rubecula и Fringilla sp.). BLAST анализ участка 16S-
23S rDNA геновида B. garinii исключил последние сомнения о значительной
роли птиц в поддержании очагов Лайм боррелиоза на данной территории. В
90% случаев сиквенированные последовательности соответствовали
риботипу B. garinii 20047, который абсолютно преобладает в энзоотическом
цикле птиц. Роль грызунов на этой территории, как резервуаров боррелий,
незначительна – 10% B. garinii. Среди мелких млекопитающих в
прокормлении личинок и нимф участвуют Apodemus sylvaticus и
Clethrionomys glareolus. ДНК тесты подтвердили, что имаго питается на Vulpes
vulpes (35%), Sus scrofa (35%), Meles meles (25%) и Capreolus capreolus (5%).
13
Территория заповедника «Пэдуреа домнеаскэ». На территории
заповедника «Пэдуреа домнеаскэ» циркулируют четыре геновида боррелий
при ярковыраженном доминировании B. afzelii (38.1%). Отмечено полное
отсутствие B. burgdorferi s.s.
А. phagocytophilum и Сandidatus N. Massilliensis были зарегистрированы
в 0,3% и 6,4% случаев - соответственно.
На данной территории основную роль в поддержании энзоотического
цикла играют мелкие млекопитающие (Clethrionomys glareolus, Apodemus
flavicollis и A. agrarius) и пресмыкающиеся (Lacerta sp.). В прокормлении
имаго участвует тот же круг прокормителей, что и в заповеднике «Кодры».

Глава V. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ


КЛЕЩЕЙ IXODES RICINUS (L.)
В ОЧАГАХ РЕСПУБЛИКИ МОЛДОВА

Молекулярный полиморфизм участка 12S рДНК клещей Ixodes ricinus

Полученые сиквенированные последовательности 12S рДНК длиною в


420 п.о, содержали в процентном соотношении нуклеотидов: р(T) = 40,2%,
p(C) = 12,9%, p(A) = 39,4% и p(G) = 7,5%. Данный участок ДНК имеет
низкое содержание Цитозина и Гуанина, что в целом характерно для ДНК
беспозвоночных животных. Участок 12S rRNA содержит: константные,
вариабельные и неинформативные участки – 86,69%, 2,91% и 10,4%,
соответственно. В вариабельных участках наиболее всего встречаются
транзиции и трансверсии, процентное содержание которых составило 1,3% и
1,11% - соответственно. Нами были отмечены транзиции двух категорий:
А→G (0,5%) и С→Т (0,8%). Трансверсий было выделено так же две
категории: А→Т (0,9%) и G→Т (0,11%). Делеции Тимина и Цитозина на
исследуемом участке были выявлены в 0,5% случаев.
На основании полученных данных нами была построена дендрограмма,
отражающая филогенетическое родство выявленных гаплотипов с
использованием алгоритма UPGMA. Как видно из полученной дендрограммы
(Рис. 4) все сиквенированные последовательности участка 12S рДНК
объединяются в пять групп (I-V).
Анализируя филогенетическое родство выявленных гаплотипов клеща I.
ricinus можно заключить, что генетическая вариация V является
прародительской формой всех остальных. Данный обособленный кластер
даёт начало двум большим подкластерам. Степень различия равна 21%.
Первый подкластер включает только гаплотип II, второй – распадается ещё
на два, один из которых включает обособленный гаплотип I, а другой –
объединяет вариации III и IV. Процент различия внутри этой подкластерной
группы составляет < 0,05.

14
I. ricinus
I. ricinus
I. ricinus
I. ricinus IV
I. ricinus
I. ricinus
I. ricinus III
I. ricinus I
I. ricinus II
I. ricinus V

0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0.00

Рис 4. Филогенетическое родство гаплотипов 12S рДНК клещей Ixodes ricinus,


выявленных на территории Молдовы

Частота встречаемости гаплотипов I, II, III, IV и V, выявленных на


территории Республики Молдова, равна 25%, 2%, 6%, 52% и 15% -
соответственно (рис. 5). Как видно из полученных результатов, наиболее
часто встречается вариант IV, реже всего – вариант II.
Изучение разнообразия гаплотипов клещей в стационарных пунктах
показало присутствие выделенных гаплотипов в различном процентном
соотношении. Так, в очагах г. Кишинёва и Вадул-луй-Водэ присутствуют все
пять обнаруженных вариантов при ярком доминировании гаплотипа IV; в
“Кодры” – все, кроме II; в заповеднике “Пэдуреа домнеаскэ” – отсутствует
III.

15% 25%

2%

6%
52%

Гаплотипы I Гаплотипы II Гаплотипы III


Гаплотипы IV Гаплотипы V

Рис. 5. Встречаемость гаплотипов 12S рДНК в популяциях клещей Ixodes ricinus

Рассчитанный индекс видового разнообразия Шеннона, указывает на


то, что наиболее генетически разнообразны очаги на территории
урбаноценоза Кишинёва и Вадул-луй-Водэ; значение индекса составляет
1,224 и 1,216 - соответственно. В то же время, индекс разнообразия составил
1,198 для очагов заповедника “Кодры” и 1,206 – в “Пэдуреа домнеаскэ”.
Полученные секвенированные последовательности были сравнены с
базой данных MBL/DDBJ/GenBank, и на основании полученных результатов
построено филогенетическое древо с использованием алгоритма UPGMA
(рис. 6).

15
98 I. ricinus 12S862 12S ribosomal RNA
100 I. ricinus 12S142 12S ribosomal RNA
I.ricinus gaplotype II
I. ricinus Moldavian populations
I. ricinus 12S small ribosomal RNA su...
85 I. ricinus gaplotype V

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0


Рис 6. Филогенетическое древо гаплотипов 12S рДНК клещей Ixodes ricinus,
Республики Молдова, Западной и Восточной Европы

Дендрограмма включает в себя три больших кластера. Гаплотип II


объединяется в подкластеры с клещами, которые были собраны на
территории Швейцарии. Величина бутстрапа составила 100%. К сожалению,
нам не удалось выяснить территориальную принадлежность клещей, которые
объединены в подкластер гаплотипа V. Предположительно – это территория
Восточной Европы. Величина бутстрапа данного подкластера составляет
85%. Третий подкластер является обособленным и включает в себя только
гаплотипы, выделенные на территории Молдовы.

Глава VI. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ И


ВНУТРИВИДОВОЙ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ КОМПЛЕКСОВ
BORRELIA BURGDORFERI S.L. И ANAPLASMATACEAE

Генетический полиморфизм ITS-1 региона B. burgdorferi s.s. и B. garinii

Проведённый BLAST анализ секвенированного спейсера ITS-1


позволил обнаружить сходство на 99% с видом B. garinii, риботип 20047. B.
burgdorferi s.s., была определена для других изолятов как риботип В418 и
156b с 98 – 100% и 99% сходства - соответственно.
Среднее содержание в процентном соотношении нуклеиновых
оснований участка ITS-1 B. burgdorferi s.s. составило: p(T) = 35,2%; p(C) =
13,3%; p(A) = 31,7%; p(G) = 19,9%; B. garinii – p(T) = 31,3%; p(C) = 13,5%;
p(A) = 31,9%; p(G) = 23,3%.
Сравнение нуклеотидных последовательностей вариабельного
спейсерного региона B. burgdorferi s.s. выявило 0.6% трансверсий А→Т (в
районах 13, 284, 365, 409, 816 н.п.), 0,8% С→Т (в позициях 5, 7, 46, 139, 280,
285, 300 п.о.) и 0,1% транзиций А→G в положениях 447 и 503 п.о.
Количество вариабельных сайтов составило 1,5%.
В то же время, количество вариабельных сайтов на участке 16S-23S
рДНК B. garinii составляет 4,1%. Точковые мутации зафиксированы в двух
районах: 12-140 и составляют 224-617 п.о. Интересно отметить, что
количество нуклеотидных замен первого района ниже по сравнению со
вторым. Чаще всего встречаются двусторонние транзиции А↔G (3%), в
16
редких случаях – транзиции С→Т (0,6%) и трансверсии G→Т (0,3%). В 0,2%
встречаются замены нуклеотидов скомпонованные в триплеты AGA → GTG
или AGG → TAT в первом районе.
Как видно из полученных результатов, для B. garinii характерен
больший полиморфизм по сравнению с B. burgdorferi s.s, что необходимо
учитывать при диагностике клещевого боррелиоза.
Значение в инфекционной патологии выявленных нами генетических
вариантов в пределах видового комплекса B. burgdorferi s.l. может оказаться
различным и требует дальнейшего изучения.

Внутривидовой филогенетический анализ


комплекса Borrelia burgdorferi s.l.

Для филогенетического анализа был использован молекулярный


маркер 16S-23S рДНК. Рассчитанное генетическое расстояние среди видов
боррелий показало широкую вариабельность - от 0,147 до 0,3. Эти
результаты свидетельствует о большом полиморфизме внутри видового
комплекса.
На основании рассчитанного индекса генетического сходства была
построена дендрограмма, раскрывающая молекулярно-филогенетические
связи внутри видового комплекса B. burgdorferi s.l. (рис. 7).
Как видно из дендрограммы, виды Borrelia группируются в четыре
больших кластера: 1 кластер включает B. bissetii, 2 – B. japonica, 3 – B.
burgdorferi s.s., и 4 - группу видов B. afzelii, B. garinii, B. valasiana, B.
lusitaniae. Сравнивая филогенетические связи внутри комплекса наиболее
распространённых видов на территории Европы, можно проследить, что
виды образуют два больших независимых подкластера; первый подкластер
включает B. burgdorferi s.s., второй подкластер распадается на ряд более
мелких, выходящих один из другого.
Как видно из рисунка, кластер B. valasiana даёт начало двум группам,
включающим B. lusitaniae и B. afzelii, B. garinii. Из наших результатов
следует, что в наибольшем филогенетическом родстве находятся виды B.
afzelii и B. garinii. Интересно отметить, что именно они являются
доминирующими на территории Европы (Haninkova et al., 2003).

B.afzelii

B.garinii

B.lusitaniae

B.valasiana

B.burgdorferi s.s.

B.japonoca

B. bis setii

17
Рис. 7. Филогенетический анализ некоторых видов Borrelia burgdorferi s.l.
на основе сиквенированных последовательностей ДНК ITS-1 региона

Не менее интересен тот факт, что следующим по близости


филогенетического родства является вид B. lusitaniaе, который был открыт
сравнительно недавно (Le Fleche et al., 1997).
Данная дендрограмма раскрывает специфичность боррелий по
отношению к позвоночным хозяевам. Вид B. burgdorferi s.s. распространён,
как в США, так и на территории Европы. Он филогенетически далёк от
остальных четырёх. Возможно, в эволюционном плане этот вид боррелий
является наиболее древним. У него не столь выражена специфичность по
отношению к позвоночным хозяевам.
Дальнейшая эволюция боррелий, вероятно, развивалась по
направлению адаптации к позвоночным хозяевам. Так, для B. valasiana
исключительным резервуарным хозяином являются птицы, а для B. afzelii –
мелкие млекопитающие. На дендрограмме соответствующий кластер
является независимым и не даёт начала другим кластерам.
Вид B. lusitaniae является промежуточным в эволюции. Ранее
считалось, что он связан исключительно с ящерицами и обитает в районах
Средиземноморья, однако исследования последних лет полностью
опровергли эту гипотезу. Вид диагностировался в птицах (Paupon et al.,
2006). Эта находка не является сюрпризом, так как наши молекулярно-
филогенетические исследования свидетельствуют о дальнем родстве между
B. lusitaniae и B. valasiana.
Промежуточное положение занимает B. garinii. Этот вид, как было
показано в наших исследованиях и в работах других авторов (Kurtenbach et
al., 2006), характеризуется большой вариабельностью и различной
спецификацией к позвоночным хозяевам. Известно, что B. garinii риботип
NT47 встречается в организме мелких млекопитающих, а риботип 20047 – в
птицах (Kurtenbach et al., 2003).
На основании полученных данных, мы можем заключить, что, скорее всего, эволюция
в отношении специализации к хозяевам среди боррелий шла от экспансии на новые
территории с птицами к оседанию в крови млекопитающих, в биотопах.

Генетический полиморфизм и филогения некоторых


видов семейства Anaplasmataceae

В результате амплификации ДНК, выделенной из иксодовых клещей


Ixodes ricinus, с использованием универсальной пары праймеров
амплифицирующих участок 16S рДНК семейства Anaplasmataceae, на
территории Республики Молдова нами впервые было выявлено присутствие
данной группы патогеннов в организме иксодовых клещей.
После проведения BLAST анализа сиквенированных ПЦР продуктов
было выявлено, что в очагах иксодовых клещей циркулирует два вида
18
комплекса Anaplasma/Ehrlichia: A. phagocytophilum и Сandidatus N.
massilliensis.
Вид A. phagocytophilum поражает гранулоциты человека и животных и
является возбудителем гранулоцитарного анаплазмоза человека.
Сandidatus N. massilliensis был недавно описан на основании ДНК
анализа [DQ788562] в лаборатории проф. Дидера Раульта (Марсель,
Франция); территория Республики Молдова стала второй после Франции, где
был обнаружен данный вид. До настоящего времени Сandidatus N.
massilliensis не был зарегистрирован как патогенный для человека, и
считается эндосимбионтом в организме клещей I. ricinus.
Нами были прочтены нуклеотидные последовательности
митохондриального гена 16S рДНК длиною в 270 п.о. BLAST анализ
секвенированного участка 16S рДНК показал, что четыре ПЦР продукта
имеют 100%-ное сходство с образцами A. phagocytophilum из
Международного Генетического Банка. В одном случае было обнаружено
сходство на 99%. В этом образце были выявлены транзиция G→A в позиции
42, 58 и 106 п.о. Среднее содержание в процентном соотношении
нуклеиновых основании составило: p(T) = 23,7%; p(C) = 18,0%; p(A) = 26,2%;
p(G) = 32,2%. В секвенированных последовательностях 16S рДНК A.
phagocytophilum константные участки составляют 86,8%, неинформативные –
12,6%, вариабельные – 0,6%.
В то же время, в результате BLAST анализа этих участков ДНК
Сandidatus N. massilliensis, показано 98% сходства с видами из
MBL/DDBJ/GenBank. Среднее содержание нуклеиновых основании
составило: T = 23,2%; C = 14,6%; A = 30,.5%; G = 31,7%. Как видно из
полученных результатов, 16S рДНК Сandidatus N. massilliensis имеет
несколько большее содержание Аденина и меньшее – Цитозина, по
сравнению с A. phagocytophilum. Константные участки составляют 86,3%,
вариабельные участки – 1,1%, неинформативные участки – 12,6%. В
вариабильных участках, встречаются транзиции и трансверсии, процентное
содержание которых составило 0,3% и 0,8% - соответственно. Нами были
отмечены транзиции: А→G и С→Т (0,8%). Трансверсий было выделено две
категории: А→Т (0,3%) и G→Т (0,5%).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что N. massilliensis
более полиморфен по сравнению с A. phagocytophilum.
На основании полученных нами результатов и данных из базы
MBL/DDBJ/GenBank, построена дендрограмма, раскрывающая
филогенетические связи внутри комплекса Ehrlichia/Anaplasma (рис 8).

19
G 5 6 d(3) A.ph

98 EU098007 A. phagocytophilum PoTiA2dt 16S


B 6 9 d A Ph 2
91 A. phagocytophilum IR128Chi 16S ribos...
AF283007 A. centrale 16S ribosomal RNA

96 M60313 A. marginale 16S rRNA


100
AF318945 A. ovis 16S r...
E. canis Oklahoma 16S rRNA
49
100 M73222 E. chaffeensis 16S r
66 U15527 E. muris AS145 16S rRNA
AF179630 W. pipientis 16S ribosomal RNA

100 M21789 R. prowazekii 16S ribosomal RNA


U11021 R. rickettsii 16S rRNA
91 AY776 R. bacterium 16S rRNA

100 B5 1 d(4) 100


42 DQ788562 C. N. massiliensis France 16S
U12457 N. helminthoeca 16S ribosomal RNA

0.02

Рис. 8 Филогенетический анализ видов Сandidatus Nicolleae massilliensis и


Anaplasma phagocytophilum

Оба вида происходят от рикетсиоподобного предка. A. phagocytophilum


группируется в подкластер с другими видами рр. Anaplasma и Ehrlichia.
Величина индекса будстрапа внутри подкластера составляет – 98%, на
внешней границе кластера – 96%.
Сandidatus N. massilliensis филогенетически близок к р. Rickettsia.
Величина индекса бутстрапа на внешней границе ветви составила 100%.
Сравнение длины ветвей Nicolleae и Rickettsiа позволяет заключить, что N.
massilliensis филогенетически моложе, чем риккетсии. Известно, что тест
бутстрап должен составлять > 95%. В то же время, величина бутстрапа на
внешней границе кластера составила 91%, что не является достаточным для
того, чтобы счесть результаты действительными. Таким образом, для
уточнения филогенетического положения вида N. massilliensis нужны
дальнейшие исследования.

20
ОБСУЖДЕНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

В результате проведённого молекулярного маркирования клещевых


очагов I. ricinus было выявлено наличие пяти видов комплекса B. burgdorferi
s.l.: B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. valasiana, B. lusitaniae (первые
три из которых являются возбудителями клещевых боррелиозов) и два вида
комплекса Anaplasma/Ehrlichia: A. phagocytophilum (возбудитель
гранулоцитарного анаплазмоза человека) и Сandidatus N. massilliensis. Нами
была отмечена следующая закономерность, характерная для всех очагов:
присутствие B. afzelii и B. garinii риботипа NT 43 было отмечено только в
клещах, которые питались на мелких млекопитающих, B. garinii риботип
20047 и B. valasiana – на птицах; B. lusitaniae – на птицах и ящерицах; B.
burgdorferi s.s. оказались не специфичными в отношении резервуарного
хозяина.
Полученные в ходе теста «blood meal host DNA» результаты,
связанные с организмом клещей совпали с зоологическими данными по
доминированию различных видов позвоночных животных и их роли в
прокормлении предимагинальных и имагинальных стадий развития
иксодовых клещей I. ricinus на изучаемых территориях (Георгица и др., 2006;
Успенская, И.Г., 1987; Vasilaşcu, 2007).
Наши данные подтвердили гипотезу о функционировании очагов
клещевого боррелиоза за счёт наземно-кормящихся и наземно-гнездящихся
птиц. Эти животные играют существенную роль в распространении всех
известных видов боррелий за исключением B. afzelii и некоторых геномных
групп B. garinii. Не менее серьёзное значение имеют мелкие млекопитающие,
которые являются единственным резервуаром B. afzelii – возбудителя кожной
формы боррелиоза. Анализ филогенетических связей внутри комплекса
боррелий и сопоставление этих данных со специализацией к позвоночному
хозяину наводит на мысль, что экспансия новых территорий происходила
при помощи птиц, а в поддержании функционировании очага участвуют
мелкие млекопитающие.
Проведённый анализ филогенетических связей комплекса
Anaplasma/Ehrlichia выявил, что оба идентифицированных вида происходят
от рикетсиоподобного предка. A. phagocytophilum находится в близком
родстве с другими видами рр. Anaplasma и Ehrlichia. Дивергенция родов
произошла относительно недавно, и эволюция идёт параллельно. В то же
время, вид N. massilliensis филогенетически близок к р. Rickettsia, но с
эволюционной точки зрения моложе. На основании наших данных можно
заключить, что филогенетическое положение вида N. massilliensis требует
уточнения, возможно, с применением более длинных молекулярно-
генетических маркеров.

21
ВЫВОДЫ:
1. Молекулярно-генетический анализ участка 12S рДНК популяций иксодовых
клещей I. ricinus позволил выявить наличие пяти гаплотипов, три из которых
являются уникальными для Республики Молдова, два остальных имеют
сходство с гаплотипами популяций клещей из Западной и Восточной Европы.
2. В экспериментах по генотипированию Borrelia sp. выявлена циркуляция 5
видов комплекса B. burgdorferi s.l.: B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B.
valasiana, B. lusitaniae, первые три из которых являются патогенными для
человека, вызывают различные формы клещевых боррелиозов. В целом на
территории Молдовы доминирует вид B. afzelii.
3. В результате молекулярного маркирования в очагах клещевого боррелиоза
установлена следующуая закономерность: присутствие B. afzelii и B. garinii
риботип NT 43 только в клещах, которые питались на мелких млекопитающих,
B. garinii риботип 20047 и B. valasiana – на птицах; B. lusitaniae – на птицах и
ящерицах; B. burgdorferi s.s. – не специфичен в отношении резервуарного
хозяина
4. На основании «blood meal DNA» 12S рДНК RLB-ПЦР теста выявлено, что на
исследованных территориях, среди диких животных в прокормлении личинок и
нимф доминирующую роль играют 2 вида птиц (Turdus merula и Erithacus
rubecula), 2 вида мелких млекопитающих (Apodemus sylvaticus и Clethrionomys
glareolus) и 1 вид ящериц (Lacerta viridis); в прокормлении имаго клещей
учавствуют лисы, кабаны, косули.
5. В результате амплификации ДНК, выделенной из иксодовых клещей I. ricinus,
с использованием универсальной пары праймеров, амплифицирующих участок
16S рДНК для рикетсий Anaplasmataceae, нами впервые было выявлено
присутствие данной группы патогенов в организме иксодовых клещей на
территории Республики Молдова.
6. Проведеннный BLAST-анализ секвенированных последовательностей участка
16S рДНК видового комплекса Ehrlichia/Anaplasma позволил показать
присутствие в очагах иксодовых клещей двух патогенных видов: A.
phagocytophilum – возбудителя гранулоцитарного анаплазмоза человека и
Сandidatus N. massilliensis – эндосимбионта иксодовых клещей.
7. На основании молекулярно-филогенетического анализа видовой группы
Ehrlichia/Anaplasma показано, что A. phagocytophilum находится в близком
родстве с другими видами рр. Anaplasma и Ehrlichia. Вид N. massilliensis
представляется филогенетически близким к р. Rickettsia.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:
1. Молекулярно-генетический маркер 16S–23S рДНК может быть рекомендован
для экспресс диагностики на присутствие возбудителей Лайм боррелиоза (B.
burgdorferi s.s., B. afzelii, B. garinii) в очагах иксодовых клещей;
2. Секвенированные последовательности нуклеотидов патогенна A.
phagocytophilum, выделенного на территории Республики Молдова
депонированы в базу данных MBL/DDBJ/GenBank (AB287399, AB287398,
AB287397, AB287396, AB287395) и могут быть рекомендованы для проведения
BLAST-анализа и построения филогенетических древ.

22
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
I. Научные статьи опубликованные в международных журналах
1. MOVILA, А., USPENSKAIA, I., TODERAS, I., MELNIC, V., CONOVALOV, Ju.
Prevalence of Borrelia burgdorferi and Coxiella burneti pathogens in ticks collected from the
different biocenoses of the Republic of Moldova. International Journal of Medical
Microbiology, 2006,Vol. 296, S.1, p. 142 – 147. (Impact Factor = 2.760).
2. KOCI, Ju., MOVILA, A., TARAGELOVA, V., TODERAS, I., USPENSKAYA, I.,
DERDAKOVA, M., LABUDA, M. First detection of Anaplasma phagocytophilum and its co-
infections with Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus ticks (Acari: Ixodidae) from
Republic of Moldova. Experimental and Applied Acarology, 2007, p. 147 - 152. (Impact
Factor = 0.978).
3. MOVILA, A., GATEWOOD, A., TODERAS, I., DUCA, M., PAPERO, M.,
CONOVALOV, J., USPENSKAIA, I., FISH, D. Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato
in Ixodes ricinus L. and I. lividus Koch ticks collected from wild birds in the Republic of
Moldova. International Journal of Medical Microbiology, 2008, Vol. 296, S.1, p. 149 - 153.
(Impact Factor = 2.760).
II. Научные статьи опубликованные в национальных журналах
4. МОВИЛЭ, А.А. Молекулярный полиморфизм 12S рДНК иксодового клеща Ixodes
ricinus L. в очагах Молдовы. Buletinul Academiei de Ştiinţe, Seria Ştiinţele Vieţii, 2007, Nr.
2 (302), p. 66 - 69.
5. TODERAŞ, I., MOVILĂ, A. Distribution of tick-borne bacterial pathogens in the different
foci of Moldova. Buletinul Academiei de Ştiinţe, Seria Ştiinţele Vieţii, 2006 Nr. 3, p. 106-114.
6. ТОДЕРАШ, И.К., МОВИЛЭ, А.А., ГЕРН, Л., ГЭТВУД, А., ДОУЕТ, В., РАУЛЬТ, Д.,
ФИШ, Д. Молекулярно-генетическая диагностика клещевых инфекций на территории
Республики Молдова. Akademos. Revista de ştiinţă, inovare, cultură şi artă, 2007, Nr. 4(8),
p. 43 – 45.
III. Научные статьи опубликованные в сборниках и материалах конференций
7. УСПЕНСКАЯ, И.Г., ГЕОРГИЦА, С.Д., МОВИЛЭ, А.А., БУРЛАКУ, В.И., ГУЦУ,
А.Г., КОНОВАЛОВ, Ю.Н., МЕЛЬНИК, В.Н., КУЛЬБАЧНАЯ, Е.В. Структура и
динамика млекопитающих и иксодовых клещей различных ландшафтно-
фаунистических зон территории Молдовы, их эпизоотологическое значение. Академику
Л.С. Бергу – 130 лет: Сборник научных статей. Бендеры: Eco-TIRAS, 2006, с. 153 - 159.
8. ГЕОРГИЦА, С.Д., МОВИЛЭ, А.А., УСПЕНСКАЯ, И.Г., КРОИТОРУ, В., ГУЦУ, А.В.,
ТОДЕРАШ, И.K., КОНОВАЛОВ, Ю.Н., БУРЛАКУ, В.И., МЕЛЬНИК, В.Н.,
КУЛЬБАЧНАЯ, Е.В. Формирование сочетанных очагов зооантропонозов в условиях
урбаноценоза г. Кишинева, Республики Молдова. Материалы международной научной
конференции «Фауна, биология, морфология и систематика паразитов» 19-21 апреля
Москва, 2006, c 81-84.
IV. Научные публикации в форме тезисов
9. МОВИЛЭ, А.А. Молекулярное маркирование биоразнообразия очагов Лайм
боррелиоза, на примере заповедника «Кодры». International Conference of Young
Researchers, nov. 9, 2007, Chişinău, Moldova, 5 ed., p. 86
10. MOVILA, A., GATEWOOD, A., TODERAS, I., PAPERO, M., CONOVALOV, J.,
USPENSKAIA, I., FISH, D. Prevalence of Borrelia burgdorferi sensu lato in Ixodes ricinus L.
and I. lividus Koch ticks collected from wild birds in the Republic of Moldova. Abstracts of IX
international Jena symposium on tick-borne diseases, 15-17 March 2007, Jena, Germany,
p. 24.

23
ADNOTARE
Movilă Alexandru „Diversitatea genetică a căpuşelor ixodide Ixodes ricinus (L.)
şi microorganismelor transmisibile în focarele Republicii Moldova”.
Teză de doctor în Biologie (specialitatea 03.00.15 – genetică), Chişinău, 2008, 95
p., 7 tab., 29 fig., 270 bibl.
Cuvinte cheie: Polimorfismul genetic; marcheri molecular-genetici; căpuşe
Ixodes ricinus; microorganismele transmisibile; vertebratele gazdă; filogenie
moleculară.
Scopul lucrării este studierea diversităţii molecular-genetice a căpuşelor ixodide Ixodes
ricinus (L.) (Acarina, Ixodidae), microorganismelor patogene şi vertebratelor gazde în focarele
boreliozei acariene pe teritoriul Republicii Moldova.
În total au fost colectate 750 exemplare de I. ricinus în focare cu diferit nivel de presing
antropogen: teritoriul rezervaţiilor „Codrii” şi „Pădurea Domnească”, urbanocenoza Chişinău,
staţiile forestiere „Vadul-lui-Vodă” şi „Durleşti”.
Investigarea diversităţii genetice a populaţiilor I. ricinus a fost efectuată cu utilizarea
markerului mitocondrial ADNr 12S. Secvenţierea succesiunilor nucleotidice cu lungimea de 420 pb
conţineau 86.69%, 2.91% şi 10.4% regiuni constante, variabile şi noninformaţionale, consecutiv.
Frecvenţa tranzacţiilor (1,3%) a fost mai mare decât cea a transversiilor (1,11%). Deleţiile au
constituit 0,5%. A fost determinată prezenţa a 5 haplotipuri printre populaţiile căpuşelor I.
ricinus: trei dintre ele sunt unicale pentru Republica Moldova, altele două sunt similare cu cele
din Europa de Vest şi de Est. Diversitatea haplotipurilor a fost mai mică pe teritoriul
rezervaţiilor „Codrii” şi „Pădurea Domnească”, şi mai mare în urbanocenoza Chişinău.
Complexul B. burgdorferi s.l. a fost semnalat în 9,6±0,4% cazuri de investigare a căpuşelor
ixodide I. ricinus. În focarele oraşului Chişinău femelele aveau un procent mare de infestare. În
baza metodelor PCR-RFLP şi PCR-RLB cu utilizarea markerului genetic ADNr 23S-5S au fost
evidenţiate 5 specii B. burgdorferi s.l.: B. burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. valasiana, B.
lusitaniae. Specie dominantă este B. afzelii.
Speciile familiei Anaplasmataceae au fost depistate pentru prima dată pe teritoriul Republicii
Moldova printre 8,02±0,43% cazuri de căpuşe ixodide investigate. Analiza BLAST a produselor
PCR ADNr 16S a permis evidenţierea a două specii: A. phagocytophilum şi Сandidatus N.
massilliensis cu 98% - 100% similaritate cu MBL/DDBJ/GenBank. Arborele filogenetic a
demonstrat că succesiunile nucleotidice ale ADN-ului speciei A. phagocytophilum formează un
cluster comun cu aceleaşi specii ce habitează pe teritoriul Europei şi SUA; indicele bootstrap a
constituit98%, iar clusterele pentru Сandidatus Nicolleae massilliensis, sunt separate cu valoarea
indicelui bootstrap 100%.
În baza analizei RLB-PCR a porţiunii ADNr 12S s-a stabilit că printre animalele sălbatice un
rol dominant ca gazde pentru larvele şi nimfele căpuşelor posedă două specii de păsări (Turdus
merula şi Erithacus rubecula), două specii de micromamalii (Apodemus sylvaticus şi
Clethrionomys glareolus) şi o specie de şopârle (Lacerta viridis); drept gazde ale imago căpuşelor
participă vulpile, mistreţii şi căprioarele.
În rezultatul analizei căpuşelor I. ricinus, cu utilizarea markerilor molecular-genetici, în focare
a fost stabilită următoarea legitate: prezenţa B. afzelii şi B. garinii ribotipul NT 43 numai în
căpuşele care s-au hrănit pe micromamalii, B. garinii ribotipul 20047 şi B. valasiana – pe
păsări; B. lusitaniae – pe păsări şi şopârle; B. burgdorferi s.s., A. phagocytophilum şi Сandidatus
N. massilliensis – nu este specific în privinţa gazdei rezervor.

24
ABSTRACT

Movila Alexandru “Genetic diversity of ixodid ticks Ixodes ricinus (L.) and
tick-borne pathogens in foci of the Republic of Moldova”
PhD thesis in Biology (speciality: 03.00.15 – genetics), Chisinau, 2008, 95 p., 7
tabl., 29 fig., 270 bibl. references.
Key words: genetic polymorphism, molecular-genetic markers, ixodid ticks,
tick-borne pathogens, vertebrate hosts, molecular phylogeny.
The aim of this study was to investigate the molecular-genetic diversity of Ixodes ricinus
ticks, tick-borne pathogens and vertebrate hosts in foci of the Republic of Moldova.
Altogether, 750 ticks were examined from stationary foci (Chisinau city, “Codri” and
“Padurea domneasca” forest reserves, “Vadul-lui-Voda” recreation zone) in the Republic of
Moldova.
The genetic diversity of I. ricinus (L.) ticks was investigated at a 420 base pair fragment of
the 12S rDNA mitochondrial genetic marker. The number of invariable, variable and
noninformative sites were 86,69%, 2,91% and 10,4%, respectively. The frequency of transitions
(1,3%) was higer than transvertions (1,11%). Gaps were detected in 0,5% cases. Following
alignment, five different haplotypes were detected. Three haplotypes are unique for Republic of
Moldova, while the other two are shared with ticks from the Central and Western Europe.
Haplotype diversity was lowest in the “Codri” and “Padurea domneasca” forest reserves and
greatest in the urbanocenosis of Chisinau city.
B. burgdorferi s.l. was detected in 13,7±0,8% of I. ricinus ticks. Borreliae were most
prevalent in female ticks collected from Chisinau city. Using PCR-RFLP and PCR-RLB at the 23S-
5S rDNA genetic marker we confirmed the prevalence of five B. burgdorferi s.l. species: B.
burgdorferi s.s., B. garinii, B. afzelii, B. valasiana, B. lusitaniae. The dominant species in Moldova
was B. afzelii.
Members of the family of Anaplasmataceae were detected in 8,02±0,43%. BLAST analysis
of partially sequenced 16S rDNA PCR products confirmed these samples as Anaplasma
phagocytophilum and Сandidatus Nicolleae massilliensis with 98% - 100% sequence similarity. In
the phylogenetic tree constructed on the basis of 420 bp of the 16S rDNA, A. phagocytophilum se-
quences from Moldova clustered with granulocytic species that are pathogenic in humans and
animals in Europe and the USA with 98% bootstrap support. Сandidatus Nicolleae massilliensis, on
the other hand, were clearly separated with 100 bootstrap values. These data represent the first
evidence of anaplasmataceae in the ticks from Moldova.
To evaluate the importance of vertebrate species as tick hosts and reservoir hosts in foci of
the Republic of Moldova, we applied PCR-RLB targeting 12S rDNA vertebrate mitochondrial gene
for blood meal analysis in questing I. ricinus ticks. The most prevalent identified host DNA for
nymphs were two birds species (Turdus merula and Erithacus rubecula), two small mammal
species (Apodemus sylvaticus and Clethrionomys glareolus) and one lizard (Lacerta viridis). The
dominant hosts for adults ticks were foxes, deers and wild boars.
B. burgdorferi s.s., A. phagocytophilum and Сandidatus N. massilliensis are considered
generalist species, there is evidence that B. garinii ribotype 20047 and B. valasiana are maintained
by avian hosts and that B. afzelii, B. garinii ribotype NT 43, B. lusitaniae is more commonly
associated with rodents and lizards hosts, respectively.

25