Вы находитесь на странице: 1из 28

АКАДЕМИЯ НАУК МОЛДОВЫ

ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ

На правах рукописи
У.Д.К.: 582.951.4; 581.162.2; 577.218; 575.224.46; 577.344.2

БОНДАРЕНКО ВЛАДИМИР

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ФАКТОРОВ


ТРАНСКРИПЦИИ, ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО
ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ В РЕПРОДУКТИВНЫХ
ОРГАНАХ ТОМАТА.

03.00.15 - ГЕНЕТИКА

Автореферат диссертации на соискание степени доктора биологии

КИШИНЭУ, 2010
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В последние два десятилетия наблюдается значительный
прогресс в понимании молекулярных механизмов, лежащих в основе формирования и
функционирования флоральной системы растений. Появилась и получила дальнейшее
развитие АВС-модель формирования цветка, накоплено много научных данных
относительно основных молекулярных механизмов, обеспечивающих формирование
цветочных органов [9, 10, 13, 14, 15, 33].
Описание ситуации в данной области и определение стратегии исследований:
Большая часть современных знаний в области формирования и функционирования
флоральной системы ограничивается лишь начальным этапом формирования цветка, при
котором происходит определение идентичности флоральной меристемы вообще и
меристем соответствующих флоральных органов в частности. Представления о
молекулярных процессах, обеспечивающих дальнейшее формирование и
функционирование флоральной системы, ограничиваются лишь данными о том, что
комбинаторная активность ABCDE генов запускает в примордиях органов
соответствующие генные сети. В конечном счете, это приводит к обеспечению
репродуктивной функции растения. Недостаточное количество данных о генетических
механизмах, активизирующихся цветочными гомеотическими генами, не даёт
возможности их систематизировать в единую модель молекулярных взаимодействий.
Изучение молекулярных закономерностей дифференциации клеток и тканей в течении
развития и функционирования цветочных органов является одной из важнейших
фундаментальных задач, способных, в дальнейшем, обеспечить исследователей серьёзным
инструментарием для решения ряда прикладных задач.
На сегодняшний день, известна исключительная роль факторов транскрипции (ФТ) в
регуляции всех процессов формирования цветочной меристемы и определения
идентичности меристем флоральных органов. Достаточно упомянуть, что практически все
ABCDE гены кодируют ФТ содержащие консервативные домены MADS-бокс. Учитывая
вышесказанное, для изучения молекулярных механизмов формирования цветка мы
остановились на ФТ двух семейств (ФТ содержащие MADS-бокс и ФТ содержащие
домены типа «Цинковых пальцев»), а также на протеинкиназах, как регуляторах
активности ФТ.

3
Цель и задачи исследований:
Целью настоящей работы является молекулярно-генетическая характеристика ранее не
описанных генов, кодирующих факторы транскрипции, дифференциально
экспрессирующихся в репродуктивных органах томата в ходе мейоза.
Для достижения указанной цели перед нами стояли следующие задачи:
 Выявление ранее не описанных генов ФТ, дифференциально экспрессирующихся в
репродуктивных органах томата на стадиях мейоза и цветка;
 Молекулярная характеристика найденных генов;
 Изучение дифференциальной экспрессии данных генов в флоральных органах
томата на различных стадиях развития;
 Оценка возможности использования охарактеризованных генов в качестве
молекулярных маркеров в селекции или при паспортизации генотипов томата.
Методология научных исследований основана на молекулярной характеристике
неописанных ранее генов, изучении специфики их экспрессии, а также SCAR-анализе при
помощи специфических праймеров.
Научная новизна и оригинальность полученных результатов. Результаты
проведённых исследований экспрессии генов MADS-семейства в флоральных органах на
различных стадиях профазы I мейоза, стадии тетрады микроспор и на стадии цветка
свидетельствуют о первостепенной роли этого семейства ФТ на поздних стадиях развития
репродуктивной системы растений, включая стадию оплодотворения. Полученные нами
сведения о первичной структуре регуляторной области ТМ6 (томатного аналога ФТ АР3)
говорят о возможной зависимости экспрессии данного гена от абсцизовой кислоты.
Впервые у томата охарактеризован структурный аналог дрожжевого гена репарации
RAD16 - ген TRL1. Специфика экспрессии данного гена позволяет предположить его
вовлечённость в процессы репарации ДНК. Выявлено ингибирующее действие света на
экспрессию фактора репарации в органах, специализирующихся на темновой репарации.
Изучена экспрессия гена LeCDPK1 во флоральных органах томата и определена
первичная структура его интронов.
Теоретическая ценность работы. Получены новые сведения о функционировании
генных сетей, обеспечивающих репродуктивную функцию растений. Показано большое
значение ФТ в развитии, дифференциации и функционировании флоральной системы.
Выявлены некоторые молекулярные механизмы поддержания стабильности генома у
растений, в зависимости от специализации органов.

4
Практическая ценность работы. Предложены две пары праймеров для использования
в паспортизации генотипов томата и в селекции посредством молекулярных маркеров.
Для использования в качестве молекулярного маркера предлагается минисателлит,
выявленный в регуляторной области гена ТМ6.
Основные научные результаты к защите:
1. Идентифицирован и молекулярно охарактеризован новый ген томата TRL1,
являющийся аналогом дрожжевых генов RAD16 и RAD5. Специфика экспрессии гена
TRL1 свидетельствует об его участии в системе репарации ДНК у томата;
2. Молекулярно охарактеризована ранее неизвестная часть регуляторной области гена
ТМ6, в которой локализован ТАТА-бокс и минисателлит с 4мя повторами сайта
связывания ФТ HvABI5;
3. Выявлена первичная структура интронов гена LeCDPK1. Особенности экспрессии
LeCDPK1 в органах цветка позволяют предположить наличие у данного фактора
специфической роли в развитии репродуктивных органов;
4. Показана большая роль семейства MADS-содержащих ФТ на поздних стадиях
развития цветка, включая стадию оплодотворения.
Внедрение научных результатов: В международном банке нуклеотидных
последовательностей (NCBI) зарегистрированы 4 ранее неизвестные последовательности,
соответствующие изученным генам. Разработанные праймеры используются в
лаборатории Молекулярной генетики Института генетики и физиологии растений
Молдавской Академии Наук.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на:
Заседании специализированного учёного совета ИГФР, Conf. ştiinţ. studenţ. Ediţia a VI-a,
dedic. Zilei USM., 2001; Conf. ştiinţ. studenţ. Ediţia a VII-a, dedic. Zilei USM., 2002; Conf.
Tinerilor Savanţi ai AŞM, 2003; International Conference of Young Researchers, IV edition,
2006, Chisinau, Moldova; XX International Congress of Genetics, Germany, Berlin, 2008;
National Conference with International Participation “Current Problems of Plant Genetics,
Physiology and Breeding”, October 9-10, 2008. Работа была выполнена при финансовой
поддержке грантов фонда MRDA-CRDF (MTFP-013/05, MTFP-013/05 Follow On).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 2 статьи в
рецензируемых журналах, 2 статьи в национальных и международных сборниках, 5
тезисов докладов на национальных и международных конференциях.
Структура и объём диссертации. Материалы диссертационной работы изложены на
124 стр. (101 стр. основного текста), содержат 32 рисунка и 7 таблиц. Диссертация состоит

5
из введения, 3 глав, выводов и практических рекомендаций, 4 приложений, резюме на
русском, румынском и английском языках. Список литературы включает 246 источников.
Ключевые слова. Томат, флоральные органы, репродуктивная система, мейоз,
факторы транскрипции, экспрессия генов, репарация ДНК.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ РЕПРОДУКТИВНОЙ


СИСТЕМЫ РАСТЕНИЙ
В данной главе рассматриваются современные представления о формировании
флоральной системы. Освещается развитие АВС модели закладки цветочных органов.
Обсуждаются имеющиеся сведения о молекулярных механизмах различных стадий
формирования цветка.
Показана исключительная роль факторов транскрипции в развитии флоральной
системы. Детально рассматриваются два семейства факторов транскрипции: ФТ
содержащие домен MADS-бокс и ФТ содержащие домен «Цинковые пальцы». В качестве
универсального регулятора активности ФТ приводятся протеинкиназы, осуществляющие
свои функции посредством фосфорилирования.
Констатируется серьёзная нехватка научных данных относительно молекулярных
механизмов, определяющих поздние стадии формирования цветка.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ПРОВЕДЁННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

В данной работе в качестве объекта исследований выступает одно из важнейших


сельскохозяйственных растений – томат. Для молекулярной характеристики
использовались клоны геномных библиотек и библиотек кДНК лаборатории
Молекулярной генетики Института генетики и физиологии растений Академии Наук
Молдовы. Изучение экспрессии выявленных генов проводилось с использованием РНК
сорта Глория. Для определения прикладной ценности различных праймеров,
разработанных в ходе молекулярной и функциональной характеристики изученных генов,
использовалась ДНК 15 сортов и 13 линий коллекции ИГФР АНМ.
Для молекулярной характеристики исходных клонов применялись следующие методы:
рестрикция, лигирование, трансформация бактерий E. coli, электрофорез, электроэлюция,
ПЦР, автоматическое секвенирование.

6
Стадии развития цветка определялись цитологически с использованием пыльников в
качестве маркеров.
Для изучения экспрессии применялись такие методы, как ОТ ПЦР (ПЦР с обратной
транскрипцией), полуколичественная ОТ ПЦР, «ПЦР в Реальном Времени». Для
построения графиков по результатам «ПЦР в Реальном Времени», использовались
значения 2-∆Ct. В качестве флюоресцентного агента при проведении «ПЦР в Реальном
Времени» использовался SYBR Green.
Все праймеры, использовавшиеся в данной работе, являются оригинальными и
подбирались к нуклеотидным последовательностям, выявленным в результате
секвенирования химерных плазмид. Для проведения «ПЦР в Реальном Времени»
разрабатывались праймеры, образующие ампликоны длиной 200-300 нуклеотидов.
В ходе биоинформационной обработки результатов использовались следующие
программы: Primer 3 v0.4.0, MultAlign, AUGUSTUS, NSITE, MO Excel XP, MO Picture
Manager; Corel Photo-Paint X3, V13.0.0.576; Corel Draw, V13 (2005); Nucleic Acid Sequence
Massager, TreeCon.

3. НЕКОТОРЫЕ МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ


РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ

3.1. Гены, кодирующие MADS-бокс-содержащие факторы транскрипции.


3.1.1. Скрининг геномных библиотек и библиотек кДНК.
Для выявления клонов MADS-бокс-содержащих генов проводилась гибридизация
геномных библиотек и библиотек кДНК репродуктивных органов томата с фрагментом
ДНК, содержащим MADS-бокс. В результате этих экспериментов было
идентифицировано 10 клонов кДНК и 38 геномных клонов. Полученные клоны
подвергались частичному секвенированию. В дальнейшем изучались клоны с ранее
неизвестными нуклеотидными последовательностями [29, 31].
3.1.2. Анализ нуклеотидной последовательности.
Посредством метода автоматического секвенирования была определена первичная
структура клонов 5tRK1 и 6M.
Сравнение первичных структур клонов 5tRK1 и 6M с последовательностями,
зарегистрированными в банке данных NCBI, выявило их высокую гомологию с
промоторной областью гена томата ТМ6 (NCBI Accession Number DQ539419; [23]). Ген
ТМ6 является аналогом гена APETALA3 (Arabidopsis thaliana) у томата [19].

7
Рисунок 3.1. Сопоставление нуклеотидных последовательностей клонов 6М и 5tRK1 с
регуляторной и частичной кодирующей последовательностью гена ТМ6.

Клон 5tRK1 полностью соответствует уже известной последовательности гена ТМ6, в


свою очередь, клон 6М, в 5´-концевой области, содержит неизвестную ранее структуру
(рис. 3.1) (NCBI A/N GU355902).
В первичной структуре клона 6М, были выявлены различные мотивы связывания
регуляторными белками (рис. 3.2):

Рисунок 3.2. Карта выявленных в клоне 6М мотивов связывания регуляторных белков.


Участок 1-610 – ранее неизвестная регуляторная последовательность гена ТМ6.

Как следует из представленной карты (рис. 3.2), нам удалось существенно дополнить
имеющиеся сведения относительно строения регуляторной области гена ТМ6. В
частности, локализован ТАТА-бокс в положении 523-532 п.н., кроме того, в положениях
24-36, 101-113, 178-190, 255-267 был обнаружен мотив связывания фактора HvABI5 в
четырёх повторах. HvABI5 относится к ФТ с ДНК-связывающим доменом типа
«лейциновой молнии» [7], играющим важную роль в активации экспрессии генов под
действием абсцизовой кислоты. Таким образом, учитывая наличие четырёх сайтов
связывания фактора HvABI5 в промоторной области гена ТМ6, можно ожидать участие
абсцизовой кислоты в осуществлении В-функции во флоральном примордии томата.
Ещё одним важным результатом изучения первичной структуры клона 6М стало
обнаружение, в положении 18-286, минисателлита, состоящего из 3,5 минисателлитных

8
групп в положениях 18-94, 95-171, 172-248, 249-286. Все 4 сайта связывания ФТ HvABI5
входят в состав обнаруженного минисателлита. Можно предположить, что мутации в этой
области регуляторной последовательности гена ТМ6 оказывают значительное влияние на
его экспрессию, а значит, на процесс формирования цветка томата при осуществлении В-
функции.
3.1.3. Изучение дифференциальной экспрессии MADS генов.
Для изучения специфики экспрессии представителей семейства MADS генов в
репродуктивных органах томата в ходе мейоза применялся метод ОТ ПЦР. В качестве
матриц использовалась кДНК, синтезированная на основе РНК, выделенной из различных
органов цветка на различных стадиях развития [30]. Для проведения реакции ПЦР были
созданы две пары праймеров, специфичные MADS-семейству: M1f+M1r и M2f+M2r.
Обобщённые данные о выявленных ампликонах представлены в таблице 3.1:

Таблица 3.1. Ампликоны, полученные на основе пары праймеров M1f+M1r. Пм –


предмейоз, Л-З – лептонема-зигонема, П-Д – пахинема-диплонема, Дк – диакинез, Т –
тетрада, Ц – взрослый цветок
Вегетатив.
Пестики Пыльники Лепестки Чашелистики
органы
Длина
(пн)

Корень

Лист
Пм Л-З П-Д Т Ц Пм Л-З П-Д Дк Т Ц Пм Л-З П-Д Т Ц Пм Л-З П-Д Т Ц

500 + +
350 + + +
300 + + + + + + + +
250 +
200 +
180 + + + +
170 +
150 + + +
130 +
100 + + + +
Как видно из сводной таблицы, в органах цветка в процессе развития имеет место чётко
выраженная дифференциальная экспрессия различных представителей семейства MADS-
бокс-содержащих генов. Особенно отчётливо это видно в репродуктивных органах, в
которых картина экспрессии претерпевает значительные изменения в ходе профазы I
мейоза в пыльниках. Имеет место экспрессия различных генов в различных комбинациях
на различных стадиях. Полученные данные свидетельствуют о том, что семейство MADS-
бокс-содержащих генов, и после окончания процесса закладки органов цветка,
продолжает играть одну из ключевых ролей в функционировании репродуктивной
системы.
Значительное увеличение числа ампликонов в пыльниках на стадии цветка, по
сравнению с другими стадиями развития, выбивается из общей логики процессов,
происходящих во флоральной системе. Как мы увидим далее, транскрипты других

9
исследованных нами генов (не содержащих MADS-бокс) на стадии взрослого цветка в
пыльниках либо не выявлялись вовсе, либо их концентрация была крайне незначительной,
что можно объяснить окончанием процесса формирования пыльцы. Поэтому,
наблюдающаяся в данном случае активизация, выбивается из общего ряда и может
свидетельствовать о значительной роли семейства MADS-содержащих ФТ в ходе
окончательного созревания пыльцы и опыления.
Обобщённые данные об экспрессии генов семейства MADS в органах цветка и
вегетативных органах, полученные посредством пары праймеров M2f+M2r, представлены
в таблице 3.2:

Таблица 3.2. Ампликоны, полученные на основе пары праймеров M2f+M2r. Пм –


предмейоз, Л-З – лептонема-зигонема, П-Д – пахинема-диплонема, Дк – диакинез, Т –
тетрада, Ц – взрослый цветок
Вегетативные
Пестики Пыльники Лепестки Чашелистики
органы
Длина
(пн)

Корень

Лист
Пм Л-З П-Д Т Ц Пм Л-З П-Д Дк Т Ц Пм Л-З П-Д Т Ц Пм Л-З П-Д Т Ц

700 +
630 +
600 +
500 +
470 + + + + + + +
400 + + + +
360 + + + + + + + + + + +
290 + + + + +
250 +
220 + + + + + + + + + +
180 + + + +
130 + +
100 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

В случае с праймерами M2f+M2r, как видно из представленной таблицы, картина


экспрессии генов семейства MADS претерпевает некоторые изменения. В отличие от
ситуации с праймерами M1f+M1r, в данном случае, в пыльниках наибольшее число
ампликонов отмечено на стадии предмейоза, а наименьшее – на стадии взрослого цветка.
При этом ампликон размером около 100 п.н., встречающийся во всех исследованных
органах на всех исследованных стадиях, в пыльниках на стадии предмейоза не выявлен.
Ещё одним отличием является значительное число ампликонов в лепестках на различных
стадиях и незначительное количество ампликонов в пестиках.
При всех различиях представленных картин дифференциальной экспрессии MADS-
содержащих факторов транскрипции в органах цветка томата общим является то, что в
пыльниках число ампликонов и разнообразие их комбинаций значительно превосходит
остальные органы. Учитывая имеющиеся сведения о большом значении комбинаторной
составляющей для функционирования ФТ семейства MADS [26], и принимая во внимание

10
полученные нами результаты, можно постулировать значительную роль данных факторов
в развитии и функционировании всех компонентов флоральной системы и, особенно,
пыльников.

3.2. Гены, кодирующие протеинкиназы.


3.2.1. Скрининг геномных библиотек и библиотек кДНК.
Для выявления клонов протеинкиназных (PK) генов проводилась гибридизация
геномных библиотек и библиотек кДНК репродуктивных органов томата с
олигонуклеотидами (26 п.н.), представляющими участок шестого PK домена.
В результате этих экспериментов было идентифицировано 11 клонов кДНК и 15
геномных клонов. Для дальнейшей работы был выбран геномный клон 3tII, содержащий
неизвестные ранее последовательности нуклеотидов [29, 31].
3.2.2. Анализ нуклеотидной последовательности.
Посредством метода автоматического секвенирования была определена первичная
структура клона 3tII. Длина клона 3tII составила 2226 пар нуклеотидов.
Сравнение первичной структуры 3tII с последовательностями, зарегистрированными в
банке данных NCBI, выявило, что клон соответствует гену кальций-зависимой
протеинкиназы томата LeCDPK1. Нам удалось впервые определить первичную структуру
интронов LeCDPK1 (NCBI Accession Number EU499600).
3.2.3. Изучение экспрессии гена LeCDPK1 в репродуктивных органах.
Изучение экспрессии гена LeCDPK1 во флоральных органах томата проводилось
посредством полуколичественного ОТ ПЦР.

А Б
Рисунок 3.3. Транскрипционная активность гена LeCDPK1 в репродуктивных органах (А
– в пестиках; Б – в пыльниках).
Транскрипционная активность изученного гена представлена в процентах от уровня
транскрипции актина. Пм – предмейоз, Л-З – лептонема-зигонема, П-Д – пахинема-
диплонема, Дк – диакинез, Т – тетрада, Ц – цветок.

11
Было выявлено, что в репродуктивных органах ген LeCDPK1 транскрибируется на
стадии мейоза и не транскрибируется на стадиях тетрады и цветка (рис. 3.3). В пыльниках,
в отличие от пестиков, транскрипты LeCDPK1 на стадии предмейоза не обнаружены (рис.
3.3 Б). Чёткое ограничение экспрессии LeCDPK1 в репродуктивных органах может
свидетельствовать о наличии специфической функции при формировании половых
клеток. Это, косвенно, подтверждается тем, что в других флоральных, а также в
вегетативных органах экспрессия LeCDPK1 находится на одном постоянном уровне (рис.
3.4; рис. 3.5), с некоторыми флуктуациями в лепестках (рис. 3.4 А).

А Б
Рисунок 3.4. Транскрипционная активность гена LeCDPK1 в лепестках (А) и в
чашелистиках (Б).
Транскрипционная активность изученного гена представлена в процентах от уровня
транскрипции актина. Пм – предмейоз, Л-З – лептонема-зигонема, П-Д – пахинема-
диплонема, Т – тетрада, Ц – взрослый цветок.

Рисунок 3.5. Транскрипционная активность гена LeCDPK1 в вегетативных органах.


Транскрипционная активность изученного гена представлена в процентах от уровня
транскрипции актина.

Результаты исследований позволяют предположить участие протеинкиназы LeCDPK1 в


репродуктивных механизмах [30]. Особенно это касается пыльников, учитывая резкое
увеличение транскрипционной активности гена LeCDPK1 в данных органах на стадии
диакинеза.

12
3.3. Гены, содержащие домен Zn-finger.
3.3.1. Анализ нуклеотидной последовательности.
Посредством метода автоматического секвенирования была определена нуклеотидная
последовательность обнаруженного в лаборатории «Молекулярной Генетики» геномного
клона 5tR1 (гибридизовался с зондами, содержащими «цинковые пальцы»). Длина клона
5tR1 составила 3528 пар нуклеотидов.
Биоинформационная обработка выявленной последовательности, посредством
программы AUGUSTUS gene prediction tool (version 2.0.2.), показала наличие 10ти экзонов
(рис. 3.6 А). Предсказанная полипептидная последовательность состоит из 532
аминокислот (рис. 3.6 Б).

Рисунок 3.6. Биоинформационная обработка нуклеотидной последовательности клона


5tR1.
А - Структура геномного клона TRL1. Чёрные прямоугольники - экзоны. Р1 и Р2 –
праймеры, при помощи которых изучалась экспрессия. Б – Консервативные домены в
предсказанной полипептидной структуре. Sf 2 – домен связывания АТФ хеликаз
Суперсемейства 2, Wm1 – Walker motif I, Wm2 – Walker motif II, SNF2_N – N-концевой
домен семейства SNF2, DExH – хеликазный домен DExH-box, RING - домен Ring finger.

Биоинформационная обработка предсказанной полипептидной последовательности


5tR1 программой Scan Prosite (ExPASy Proteomics Server) выявила наличие хеликазного
АТФ-связывающего домена первого типа Суперсемейства 2 в положении 65-290 (рис. 3.6
Б) [32]. Дальнейшее сравнение консервативных доменов в среде BLASTP позволило
классифицировать выявленный домен как N-концевой домен семейства SNF2 (CD
Length: 382 aa, E-value: 9e-35), входящего в Суперсемейство 2 (SF2) хеликаз [12].
Хеликазы SF2 вовлечены в различные механизмы метаболизма ДНК, такие, как
репликация, репарация, рекомбинация, транскрипция, метаболизм РНК [1, 16, 22, 27].

13
Мотивы Уолкера (консервативные аминокислотные последовательности, отвечающие за
связывание и гидролиз АТФ [24, 28]), выявленные в предсказанной полипептидной
последовательности (Wm1 – в положении 79-84, Wm2 – в положении 225-234),
соответствуют группе хеликаз SF2, названной DExH группой (рис.3.6 Б).
Изучение иерархии консервативных доменов, проведённое в среде BLASTP, показало
близость предсказанной полипептидной последовательности 5tR1 к факторам нуклеотид-
эксцизионной репарации (НЭР) дрожжей: RAD16 и RAD5 (семейство SNF2).
В C-концевом участке предсказанной полипептидной последовательности был выявлен
домен Zinc finger типа RING (CD Length: 41, E-value: 0.007). Белки, содержащие RING-
finger, участвуют во многих процессах клеточного метаболизма, таких, как связывание и
узнавание ДНК/РНК, белок-белковые взаимодействия [5, 11].
Комбинация АТФ-связывающего хеликазного домена в N-концевой области и домена
RING-finger в C-концевой области, выявленная в предсказанной полипептидной
последовательности 5tR1, характерна для белков, вовлечённых в репарацию ДНК [24, 25].
Дрожжевые белки репарации ДНК RAD5 и RAD16, кроме хеликазного домена DExH,
также содержат RING finger [17, 20]. Это позволило предположить, что молекулярно
охарактеризованный нами геномный клон 5tR1 соответствует ранее не известному гену
томата, структурно схожему с дрожжевым геном RAD16. Обнаруженный ген получил
название TRL1 (Tomato RAD16-Like 1), как первый известный аналог RAD16 у томата.
Ген TRL1 зарегистрирован нами в нуклеотидном банке NCBI (Accession Number
EU434821).
3.3.2. Экспрессия TRL1 в условиях фоновой радиации.
Для ответа на вопрос о возможной функциональной схожести гена TRL1 с RAD16 была
изучена специфика его экспрессии во флоральных органах томата в условиях фоновой
радиации, на различных стадиях мейоза пыльников, а также на стадии цветка [3].
Экспрессия гена TRL1 изучалась нами посредством метода ПЦР в Реальном Времени.
Наименьшая концентрация транскриптов гена TRL1, у всех флоральных органов, была
выявлена на стадии предмейоза. При этом в чашелистиках, лепестках и пестиках
наибольшая концентрация транскриптов данного гена была выявлена на стадии цветка. В
пестиках диапазон изменения уровня экспрессии гена TRL1 в ходе развития цветка
оказался самым большим.

14
Рисунок 3.7. Транскрипционная активность TRL1 во флоральных органах томата в
условиях фоновой радиации.
Пм – предмейоз, Л-З – лептотена-зиготена, П-Д – пахитена-диплотена, Дк – диакинез, Т –
тетрада, Ц – цветок. Для построения диаграмм использовались значения 2-∆Ct.

Стабильно высокий уровень экспрессии данного гена в чашелистиках на всех стадиях


развития цветка, по всей видимости, связан с тем, что в период формирования флоральной
системы бутоны практически всё время закрыты, а значит, негативному воздействию
фонового УФ-излучения подвергаются лишь чашелистики. И только на стадии цветка,
когда бутон открыт, все флоральные органы подвергаются примерно одинаковому
воздействию УФ-излучения. Как видно из рисунка 3.7, и в лепестках, и в пестиках
выявлено значительное повышение концентрации транскриптов TRL1 на стадии цветка по
сравнению со всеми предыдущими стадиями. В то же время, в пыльниках, на стадии
цветка, концентрация транскриптов TRL1 хоть и выше, чем на стадии мейоза, но ниже,
чем на стадии тетрады. Возможно, это обстоятельство связано с резким падением уровня
пролиферативной активности пыльников на стадии цветка в связи с окончанием процесса
формирования фертильной пыльцы [6]. Снижение концентрации транскриптов TRL1 в
пыльниках на стадии диакинеза, вероятно, связано с тем, что на данной стадии профазы I,
ДНК наиболее компактизована и транскрипционная активность генов стремится к нулю
[21].

15
3.3.3. Экспрессия TRL1 после γ-облучения.
Для дальнейшего изучения индуцибельности экспрессии гена TRL1 было
предусмотрено облучение полевого материала γ-лучами [3, 5].
После облучения все органы растений, включая корни, находились на свету в течение
2х часов, по истечении которых проводилась их фиксация в жидком азоте. В качестве
контроля использовался не облучённый полевой материал.

Рисунок 3.8. Транскрипционная активность TRL1 в вегетативных органах.


Серые столбцы – уровень транскрипции в необлучённых растениях, выращенных в
полевых условиях; чёрные столбцы – уровень транскрипции в растениях, выращенных в
полевых условиях и подвергшихся γ-облучению. Для построения диаграммы
использовались значения 2-∆Ct.

Изучение экспрессии TRL1 в вегетативных органах показало, что после облучения его
экспрессия усиливается в листьях и ослабевает в корнях (рис. 3.8).
При фоновой радиации (данные контроля) наименьший уровень экспрессии выявлен в
лепестках (рис. 3.9). Это объясняется тем, что на данной стадии развития бутон закрыт, и
всё негативное влияние фоновой УФ радиации воспринимается чашелистиками, в
которых, при нормальных условиях, выявлен наибольший уровень экспрессии
исследуемого гена. В то же время достаточно высокий (по сравнению с лепестками)
контрольный уровень экспрессии данного гена в пыльниках и пестиках, по всей
видимости, связан с их пролиферативной активностью. После облучения экспрессия гена
TRL1 во всех флоральных органах усиливается примерно на одном уровне, с сохранением
исходного соотношения. На стадии цветка все органы подвергаются примерно равному
воздействию фоновой УФ-радиации, пролиферативная активность пыльников падает, а в
пестиках проходит двойное оплодотворение и начало развития плода [8]. Всё это внесло
свои коррективы и в специфику экспрессии TRL1 (рис. 3.9). Если во время мейоза уровень
экспрессии исследуемого гена в лепестках, как при нормальных условиях, так и после γ-
облучения, значительно отставал от других органов, то на стадии цветка эти различия уже
16
не столь явны. Более того, после γ-облучения концентрация транскриптов TRL1 в
лепестках превышает таковую в пыльниках. В свою очередь, в пестиках контрольной
группы уровень экспрессии TRL1 приближается к таковому чашелистиков, а после γ-
облучения становится наибольшим.

Рисунок 3.9. Транскрипционная активность TRL1 во флоральных органах.


Серые столбцы – уровень транскрипции в необлучённых растениях, выращенных в
полевых условиях; чёрные столбцы – уровень транскрипции в растениях, выращенных в
полевых условиях и подвергшихся γ-облучению. Для построения диаграмм
использовались значения 2-∆Ct.

Таким образом, кроме усиления экспрессии гена TRL1 посредством γ-радиации, можно
констатировать строгую связь между его работой и потребностями организма. Логика
такой динамики экспрессии TRL1 становится вполне понятной, если согласиться с тем,
что данный ген участвует в репарации ДНК.
3.3.4. Экспрессия после УФ-облучения.
Учитывая тот факт, что на репарацию ДНК растений значительное влияние оказывает
световой фактор, причём это влияние зависит от типа конкретного органа, а точнее от
того, какая из систем репарации специфична данному органу, нами был предусмотрен
следующий эксперимент. Для моделирования условий темновой и световой репарации
10ти дневные проростки томата, выращенные в искусственных условиях, облучались УФ-
лучами дозой 2 Дж/см2, после чего одна часть растений помещалась в темноту, а другая
часть оставалась при исходном освещении. Корни растений, как во время облучения, так и
при дальнейшей темновой и световой экспозиции, были открыты. Через 15, 30, 60 и 120
минут материал фиксировался в жидком азоте. В качестве контроля использовался
необлучённый материал [2, 4].

17
Рисунок 3.10. Динамика изменения транскрипционной активности гена TRL1 в 10-ти
дневных проростках: в условиях искусственного освещения и в темноте.
Для построения графика использовались значения 2-∆Ct.

Как видно из рисунка 3.10, УФ-облучение, также, как и γ-облучение, индуцирует


повышенную экспрессию TRL1 в листьях на свету. В свою очередь в корнях, после УФ-
облучения, также, как и после γ-облучения, концентрация транскриптов снижается.
Темновая экспозиция после УФ обработки дала прямо противоположную картину
экспрессии гена TRL1 (рис. 3.10). В этом случае концентрация транскриптов в корнях
возрастала, в то время как в листьях снижалась. Такое распределение уровней экспрессии
TRL1 при световой и темновой экспозициях, на наш взгляд, является дополнительным
доказательством непосредственной вовлечённости данного гена в процессы репарации
ДНК. Как известно, в различных органах растений, на разных стадиях их развития,
репаративная система функционирует по-разному. Kimura и др. [18] показали, что во
взрослых листьях риса устранение повреждений ДНК осуществляется практически
исключительно за счёт фотореактивации и частично mismatch repair (MMR), в то время
как активно пролиферирующие ткани сохраняют стабильность генома, в первую очередь,
за счёт эксцизионной репарации. Авторы обнаружили, что в темноте, в листьях
повреждения ДНК не репарировались в должной мере, в отличие от апикальной
меристемы корней (RAM), где они удалялись быстро. Таким образом, усиление
экспрессии TRL1 в облучённых листьях на свету и её уменьшение в темноте
соответствуют специализации репаративной системы данных органов. При наличии
световой энергии репарация в листьях осуществляется на необходимом уровне, а при её
отсутствии репаративная система либо не работает вообще, либо работает очень слабо,
что и отражается на концентрации транскриптов TRL1. В корнях при темновой
экспозиции после УФ-облучения репаративная система работает нормально, поскольку не

18
нуждается в световой энергии, поэтому и уровень экспрессии высок. Уменьшение
концентрации транскриптов изучаемого гена в облучённых корнях при световой
экспозиции, по всей вероятности, связано с ингибирующим влиянием света на работу
системы репарации корней томата. Это предположение подкрепляется динамикой
изменения концентрации транскриптов TRL1 в корнях во время световой экспозиции. В
данном случае имеет место как резкое падение уровня экспрессии, так и резкий его
подъём, причём уже через 60 минут после облучения концентрация транскриптов выше
контрольной.
На основании динамики экспрессии гена TRL1 можно предположить, что примерно
через 120 минут после УФ-облучения, в листьях на свету и в корнях в темноте, основная
часть повреждений ДНК, вызванных облучением, удаляется. При этом в корнях при
световой экспозиции через такой же промежуток времени удаление повреждений
продолжается, а в листьях при темновой экспозиции – только начинается.

3.4. Изучение факторов транскрипции в качестве молекулярных маркеров


Для определения возможности использования исследованных генов в качестве
молекулярных маркеров, был проведён ряд экспериментов по амплификации различных
участков гена протеинкиназы LeCDPK1 с использованием в качестве матриц ДНК
различных линий и сортов из коллекции Института Генетики и Физиологии Растений
АНМ.
В случае с парой праймеров SolCDPK удалось обнаружить некоторый полиморфизм,
кореллирующий с фенотипом. Как видно из рисунка 3.11, при проведении реакции ПЦР с
использованием пары праймеров SolCDPK имеет место однородная картина за
исключением дорожек №5, 7 и 14. В указанных треках отсутствует ампликон длиной
около 270 нуклеотидов. Линии, соответствующие указанным трекам, обладают
наименьшей жароустойчивостью по сравнению с остальными исследованными. Это
обстоятельство позволяет предположить сцепленность ампликона 270 с
жароустойчивостью.

19
Рисунок 3.11. SCAR-анализ при помощи праймеров SolCDPK f + SolCDPK r. В качестве
матрицы используется ДНК линий межвидового гибрида S. lycopersicon × L. chilense. S –
Smart Ladder (EuroGeneTec), 1 – L-340, 2 – L-341, 3 – L-342, 4 – L-343, 5 – L-344, 6 – L-345,
7 – L-346, 8 – L-347, 9 – L-348, 10 – L-349, 11 – L-350, 12 – L-351, 13 – L-352, 14 –
Microtom, 15 – Н/Д

При помощи пары праймеров ZmPK5 нам удалось получить полиморфные спектры,
специфичные для линии 303 (рис. 12, трек 6) и линии 311 (рис.3.12, трек 7). Кроме того,
можно наблюдать дополнительные полосы у генотипа Призёр и линии 301 (рис. 3.12,
треки 1 и 4). При этом необходимо отметить, что линия 301 обладает повышенной
устойчивостью к вирусным инфекциям и высокой продуктивностью, а линия 303, в свою
очередь, также обладает высокой продуктивностью и в скором времени может быть
омологирована.

Рисунок 3.12. SCAR-анализ при помощи праймеров ZmPK5.1 + ZmPK5.2. M – Smart


Ladder (EuroGeneTec), 1 – Призёр, 2 – Глория, 3 – Оранжевый крупный, 4 – Линия 301, 5 –
Линия 302, 6 – Линия 303, 7 – Линия 311, 8 – Линия 312, 9 – Екатерина

Таким образом, удалось получить первоначальные сведения о возможности


использования гена протеинкиназы в качестве молекулярного маркера. В ходе
дальнейших исследований будет выяснен возможный диапазон использования пар
праймеров SolCDPK и ZmPK5 в паспортизации генотипов томата и в селекции при
помощи маркеров (MAS).

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ И ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ


Выводы:
1. Впервые молекулярно охарактеризован TRL1 – аналог дрожжевого гена RAD16 у
томата. Изучение индуцибельности экспрессии гена TRL1 в ответ на ионизирующее и
УФ-излучение показало его функциональную схожесть с дрожжевым аналогом,
играющим важную роль в репарации ДНК.

20
2. Изучение динамики экспрессии TRL1, при темновой и световой репарации, в листьях и
корнях показало участие изученного гена в различных системах репарации и их
строгую детерминированность в зависимости от типа органа. Показано ингибирующее
действие освещения на экспрессию гена TRL1 в корнях после УФ-облучения.
3. Изучение первичной структуры геномного клона 6М позволило расширить
представление о регуляторной области гена MADS-содержащего фактора
транскрипции томата ТМ6. Локализован ТАТА-бокс данного гена, а также, впервые
выявлены 4 мотива связывания фактора транскрипции HvABI5. Все 4 мотива
связывания HvABI5 входят в состав обнаруженного нами минисателлита,
перспективного для использования в качестве молекулярного маркера в MAS.
4. Впервые молекулярно охарактеризована геномная последовательность
протеинкиназного гена LeCDPK1. Изучение специфики экспрессии LeCDPK1 в органах
цветка позволило предположить наличие у данного фактора специфической роли в
развитии репродуктивных органов на стадии мейоза пыльников.
5. Сравнение специфики экспрессии генов MADS-семейства с экспрессией других
изученных генов доказывает, что первостепенная роль этого семейства факторов
транскрипции, известная на стадии закладки цветочных органов и определении их
идентичности (АВС-модель), сохраняется и на более поздних стадиях развития,
включая стадию оплодотворения.

Практические рекомендации:
 Предлагаются 4 пары праймеров (TM6MS1, TM6MS2, TM6MS3, TM6MS4) для
дальнейшего использования в прикладных целях минисателлита, выявленного в
регуляторной области ТМ6.
 Пары праймеров SolCDPK и ZmPK5 рекомендуются к использованию в селекции и
паспортизации генотипов томата.

21
БИБЛИОГРАФИЯ

1. Auborg S., Kreis M., Lecharny A. The DEAD box RNA helicase family in Arabidopsis
thaliana. In: Nucleic Acids Research. 1999, 27, No. 2, p. 628-636.
2. Bondarenco V. S. Influence of gamma - and UV-irradiation on the Expression of a Novel
Helicase-like gtr1 Gene Presumably Involved in DNA Repair Processes in Tomato
(Solanum lycopersicum); XX International Congress of Genetics, Germany, 2008, p. 277-
278.
3. Bondarenco V. S. Expression of TRL1 gene in floral organs of tomato (Solanum
lycopersicum). Romanian Biotechnological Letters, 2009, Vol. 14, No. 6, p. 4786-4791.
4. Bondarenco V. S., Barbacar N. I., TRL1 gene expression in tomato (Solanum
lycopersicum) floral organs after γ-irradiation. Materialele Conferinţei Naţionale (jubiliare)
cu participare internaţională “Probleme Actuale în Igiena Radiaţiilor, Radioprotecţie şi
Radiobiologie”. Chişinău, 17 octombrie 2009, p. 118-121.
5. Borden K. L., Freemont P. S. The RING finger domain: a recent example of a sequence-
structure family. In: Curr. Opin. Struct. Biol. 1996, 6 (3), p. 395–401.
6. Brukhin V. et al. Flower development schedule in tomato Lycopersicon esculentum cv.
Sweet cherry. In: Sexual Plant Reproduction. 2003, 15, p. 311–320.
7. Casaretto J. A., Ho T. The transcription factors HvABI5 and HvVP1 are required for the
abscisic acid induction of gene expression in barley aleurone cells. In: Plant Cell. 2003, 15,
p. 271-284.
8. Chasan R., Walbot V. Mechanisms of Plant Reproduction: Questions and Approaches. In:
The Plant Cell. 1993, 5, p. 1139-1146.
9. Coen E. S., Meyerowitz E. M. The war of the whorls: Genetic interactions controlling
flower development. In: Nature. 1991, 353, p. 31–37.
10. Favaro R. et al. MADS-box protein complexes control carpel and ovule development in
Arabidopsis. In: Plant Cell. 2003, 15, p. 2603-2611.
11. Freemont P. S. The RING finger. A novel protein sequence motif related to the zinc finger.
In: Anal NY Acad. Sci. 1993, 684, p. 174-192.
12. Gorbalenya A. E, Koonin E. V. Helicases: Amino acid sequence comparisons and structure-
function relationships. In: Curr. Opin. Struc. Biol. 1993, 3, p. 419-429.
13. Hayama R., Coupland G. Shedding light on the circadian clock and the photoperiodic
control of flowering. In: Plant Biol. 2003, 6, p. 13-19.
14. Hepworth S. R. et al. Antagonistic regulation of flowering-time gene SOC1 by CONSTANS
and FLC via separate promoter motifs. In: EMBO J. 2002, 21, p. 4327–4337.
15. Honma T., Goto K. Complexes of MADS-box proteins are sufficient to con-vert leaves into
floral organs. In: Nature. 2001, 409, p. 525–529.
16. Jankowsky E. et al. Active Disruption of an RNA-Protein Interaction by a DExH/D RNA
Helicase. In: Science. 2001, 291, p. 121-125.
17. Johnson R. E. et al. Saccharomyces cerevisiae RAD5-encoded DNA repair protein contains
DNA helicase and zinc-binding sequence motifs and affects the stability of simple repetitive
sequences in the genome. In: Mol.Cell. Biol. 1992, 12(9), p. 3807–3818.
18. Kimura S. et al. DNA repair in higher plants; photoreactivation is the major DNA repair
pathway in non-proliferating cells while excision repair (nucleotide excision repair and base
excion repair) is active in proliferating cells. In: Nucleic Acids Research. 2004, 32, No. 9, p.
2760-2767.
19. Kramer E., R. Dorit, V. Irish. Molecular evolution of genes controlling petal and stamen
development: duplication and divergence within the APETALA3 and PISTILLATA MADS-
box gene lineages. In: Genetics. 1998, 149, p. 765-783.

22
20. Lovering R. et al. Identification and Preliminary Characterization of a Protein Motif Related
to the Zinc Finger. In: Proc. of the Nat.Acad. of Sci.of the USA. 1993, 90, No. 6, p. 2112-
2116.
21. Ma H. Molecular genetic analysis of microsporogenesis and microgametogenesis. In: Annu.
Rev. Plant Biol. 2005, 56, p. 393-434.
22. Owttrim, G. W. RNA helicases and abiotic stress. In: Nucleic Acids Research. 2006, 34, No.
11, p. 3220–3230.
23. Rijpkema A. S. et al. Analysis of the Petunia TM6 MADS box gene reveals functional
divergence within the DEF/AP3 lineage. In: Plant Cell. 2006, 18, p. 1819–1832.
24. Rocak S., Linder P. DEAD-box proteins: the driving forces behind RNA metabolism. In:
Nat.Rev.Mol.Cell.Biol. 2004, 5, p. 233–241.
25. Stone S. L. et al. Functional analysis of the RING-type ubiquitin ligase family of
Arabidopsis. In: Plant Physiol. 2005, 137, p. 13-30.
26. Theissen G., Saedler H. Plant biology. Floral quartets. In: Nature. 2001, 409 (6819), p. 469-
471.
27. Tuteja N, Tuteja R. Unraveling DNA helicases. Motif, structure, mechanism and function.
In: European Journal of Biochemistry. 2004, 271 (10), p. 1849–1863.
28. Walker J. E. et al. Distantly related sequences in the α- and β- subunits of ATP synthase,
myosin, kinases and other ATP-requiring enzymes and a common nucleotide binding fold.
In: EMBO J. 1982, 1, p. 945-951.
29. Бондаренко В. С., Барбакарь Н. И. Молекулярная характеристика генов двух
семейств факторов транскрипции у томата (Lycopersicum esculentum). In: Conferinţa
ştiinţifică studenţească. Ediţia a VI-a, dedicată Zilei USM., 2001, p. 105.
30. Бондаренко В. С., Барбакарь Н. И. Экспрессия некоторых факторов транскрипции в
репродуктивных органах томата. Conferinţa ştiinţifică studenţească. In: Ediţia a VII-a,
dedicată Zilei USM., 2002, p. 113.
31. Бондаренко В. С., Барбакарь Н. И. Молекулярная характеристика некоторых
факторов транскрипции, экспрессирующихся в репродуктивных органах томата. In:
Conferinţa Tinerilor Savanţi ai Academiei de Ştiinţe a Moldovei, 2003, p. 47.
32. Бондаренко В. С. Изучение RAD16–подобного гена томата (Oral Presentation). In:
International Conference of Young Researchers, IV edition, November 10, 2006, Chisinau,
Moldova, p. 80.
33. Бондаренко В. С. Молекулярные аспекты формирования флоральной системы.
Buletinul Academiei de Ştiinţe a Moldovei. Ştiinţele Vieţii, 3(300), 2006, p. 74-83.

23
ADNOTARE
Bondarenco Vladimir, „Analiza moleculară a unor factori de transcripţie cu expresie
diferenţiată în organele de reproducere la tomate”, teză de doctor în biologie, Chişinău 2010.
Teza constă din: introducere, trei capitole, concluzii generale şi recomandări, bibliografie din
246 titluri, 4 anexe. Este redactată pe 101 pagini de text de bază, cu un volum total de 124
pagini, conţine 32 figuri şi 7 tabele. Rezultatele obţinute sunt publicate în 9 lucrări ştiinţifice.
Cuvinte-cheie: tomate, organe florale, sistem de reproducere, meioză, expresia genelor,
factori de transcripţie, repararea ADN.
Domeniul de studiu: 03.00.15 – Genetică
Scopul lucrării: caracterizarea molecular-genetică a unor gene noi, ce codifică factorii de
transcripţie cu expresie diferenţiată în organele de reproducere a tomatelor în cursul meiozei.
Obiectivele: identificarea genelor noi ce codifică factorii de transcripţie cu expresie
diferenţiată în organele de reproducere a tomatelor la stadiile de meioză şi polen matur;
caracterizarea moleculară a genelor identificate; studiul expresiei diferenţiate a genelor de interes
în organele florale la diferite etape de dezvoltare; estimarea posibilităţii utilizării genelor
caracterizate în calitate de markeri moleculari în ameliorarea şi/sau paşaportizarea genotipurilor
de tomate.
Noutatea şi originalitatea ştiinţifică. Pentru prima dată a fost studiată expresia a 3 familii de
factori reglatori în organe florale de tomate la diferite stadii ale profazei I a meiozei. Au fost
identificate şi caracterizate gene şi fragmente de gene noi: regiunea reglatoare a genei TM6,
succesiunea genomică a LeCDPK1 şi analogul structural şi funcţional al genei RAD16 – TRL1.
Semnificaţia teoretică. Au fost obţinute date noi privind funcţionarea reţelelor genice ce
asigură funcţia reproductivă a plantelor. Au fost identificate unele mecanisme moleculare de
menţinere a stabilităţii genomului plantelor în dependenţă de specializarea organelor.
Valoarea aplicativă. Pentru utilizarea în ameliorarea asistată de markeri moleculari şi
paşaportizarea genotipurilor de tomate, sunt propuşi primeri noi. Minisatelitul identificat în
regiunea reglatoare a genei TM6 poate fi utilizat în programele de selecţie în scopul diferenţierii
diferitelor genotipuri.
Implementarea rezultatelor ştiinţifice. Succesiunile de nucleotide ale clonelor identificate şi
analiza lor au fost înregistrate în banca internaţională de date (NCBI) şi pot fi accesate prin
Internet de întreaga comunitate ştiinţifică. Primerii elaboraţi sunt utilizaţi în laboratorul Genetică
moleculară al Institutului de Genetică şi Fiziologie a Plantelor al A.Ş.M.

24
АННОТАЦИЯ
Бондаренко Владимир, «Молекулярный анализ некоторых факторов
транскрипции, дифференциально экспрессирующихся в репродуктивных органах
томата». Диссертация на соискание степени доктора биологических наук, Кишинев,
2010. Диссертация содержит: введение, три главы, выводы и практические рекомендации,
библиографию из 246 источников, 4 приложения, 101 страницу основного текста, 124
страницы общего обьёма, 32 рисунка, 7 таблиц. Полученные результаты опубликованы в 9
научных работах.
Ключевые слова: томат, флоральные органы, репродуктивная система, мейоз,
экспрессия генов, факторы транскрипции, репарация ДНК.
Область исследований: 03.00.15 – генетика
Цель работы: молекулярно-генетическая характеристика ранее не описанных генов
факторов транскрипции, дифференциально экспрессирующихся в репродуктивных
органах томата в ходе мейоза.
Задачи: выявление новых генов факторов транскрипции, дифференциально
экспрессирующихся в репродуктивных органах томата; молекулярная характеристика
найденных генов; изучение дифференциальной экспрессии данных генов во флоральных
органах томата; оценка возможности использования охарактеризованных генов в качестве
молекулярных маркеров в селекции или при паспортизации генотипов томата.
Научная новизна. Впервые была изучена экспрессия генов трёх семейств регуляторных
факторов на различных стадиях профазы I мейоза в различных флоральных органах
томата. Были идентифицированы и охарактеризованы гены и фрагменты новых генов:
регуляторная область гена ТМ6, геномная последовательность LeCDPK1 и структурно-
функциональный аналог гена репарации RAD16 – ген TRL1.
Теоретическое значение. Получены новые сведения о функционировании генных сетей,
обеспечивающих репродуктивную функцию растений. Выявлены важные молекулярные,
ограно-специфичные механизмы поддержания нативности генома у растений.
Практическое значение работы. Для паспортизации генотипов томата и селекции
посредством молекулярных маркеров предложены новые праймеры. В качестве
молекулярного маркера предлагается новый минисателлит, выявленный в регуляторной
области гена ТМ6.
Внедрение научных результатов. Первичная структура 3х новых геномных клонов и
их молекулярная характеристика опубликована в международном банке генов (NCBI), и
доступна заинтересованным учёным во всём мире.

25
ABSTRACT
Bondarenco Vladimir, “Molecular Analysis of Some Transcription Factors with a
Differencial Expression in Reproductive Organs of Tomato”, a thesis of a Doctor in Biology,
Chisinau, 2010. The paper consists of: Introduction, 3 chapters, Conclusions and
Recommendations, 246 bibliographic sources, a total volume of 124 pages, containing 32 figures
and 7 tables. The obtained results have been published in 9 scientific papers.
Key words: tomato, floral organs, reproductive system, meiosis, gene expression,
transcription factors, DNA repair.
Study domain: 03.00.15 – Genetics.
Research goal: molecular genetic characterization of some novel genes of transcription
factors with a differencial expression in reproductive organs of tomato through meiosis.
Objectives: identification of new genes of transcription factors with a differencial expression
in reproductive organs of tomato at meiosis and mature flower stages; molecular characterization
of the new genes; study of the differencial expression of the genes in floral organs at different
developmental stages; assessment of the possibility of using the analysed genes as molecular
markers during tomato selection processes or fingerprinting.
Scientific Innovation: For the first time the expression of 3 families of transcription factors
was studied in different floral organs during profase I of meiosis. New genes and gene fragments
were revealed and analysed: regulatory region of TM6 gene, genomic sequence of LeCDPK1
and structural and functional analogue of RAD16 repair gene – TRL1.
Theoretical Significance: New data about the function of gene networks that assure plant
reproduction was obtained. Important molecular mechanisms of the vegetal genome nativeness
in regard to organ specialization were discussed.
Practical Importance: New primers are proposed for tomato fingerprinting and marker
assissted selection. A new minisatellite that was found in the regulatory region of TM6 gene is
proposed as a molecular marker.
Implementation of scientific results: The primary structures of 3 new clones and their
molecular characterization were registered in the international genes’ bank (NCBI) and can now
be accessed by the whole scientific community.

26
БОНДАРЕНКО ВЛАДИМИР

МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ФАКТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ


ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНО ЭКСПРЕССИРУЮЩИХСЯ В РЕПРОДУКТИВНЫХ
ОРГАНАХ ТОМАТА.

03.00.15 - ГЕНЕТИКА

Автореферат на соискание степени доктора биологии

__________________________________________________________________
Принято к публикации: 1 марта 2010 Формат бумаги 60x84 1/16
Офсетная бумага. Офсетная печать. Тираж 50 экз.
Авторских листов.: 1 Заказ №180312.
__________________________________________________________________________
Tipografia “Elena – V.I.” S.R.L., MD2028, Chişinău, str. Academiei 3.
.

27
ACADEMIA DE ŞTIINŢE A MOLDOVEI
INSTITUTUL DE GENETICĂ ŞI FIZIOLOGIE A PLANTELOR

Cu titlu de manuscris
C.Z.U.: 582.951.4; 581.162.2; 577.218; 575.224.46; 577.344.2

BONDARENCO VLADIMIR

ANALIZA MOLECULARĂ A UNOR FACTORI DE


TRANSCRIPŢIE CU EXPRESIE DIFERENŢIATĂ ÎN
ORGANELE DE REPRODUCERE LA TOMATE

03.00.15 - GENETICĂ

Autoreferatul tezei de doctor în biologie

CHIŞINĂU, 2010

28