PCR

Thermophilus aquaticus (1969)

Polymerase Chain Reaction (PCR)

Reacción en cadena de la polimerasa

Consiste en la síntesis de ADN in vitro

Desarrollada en 1983 por Kary Mullis

Científico del año 1991 por la revista

Investigación y Desarrollo (R&D)

Novel de Química en 1993

 Aplicaciones de la PCR
Técnica más útil en biotecnología
que ha revolucionado la forma de hacer Ciencia

1. Clonado de genes
2. Construcción de mutantes
3. Secuenciación del genoma humano (y otros genomas)
4. Kit de detección de agentes infecciosos (chlamydias, HIV)
5. Detección de enfermedades genéticas (anemia falciforme,
fibrosis cística)

6. Detección de cáncer (oncogenes)

7. Compatibilidad genética en transplantes

8. Pruebas de paternidad

9. Diagnóstico de parásitos
10. Y muchas otras….
 Qué es una PCR y como se hace?
ADN molde: (extraído del organismo
bajo estudio)

Cebadores o primers: Fragmentos de

ADN de 20-30 pb que sirven para iniciar
la polimerización. Necesarios dos
(directo y reverso)

dNTPs: desoxinucleótidos trifosfato

Millones de copias de ADN
dATP: desoxiadenosina trifosfato
a partir de una única copia.
dCTP: desoxicitosina trifosfato
dGTP: desoxiguanosina trifosfato
El fragmento amplificado in vitro dTTP: desoxitimidina trifosfato
puede tener de 100 pb hasta
ADN polimerasa (* Taq): proteína que
20.000-30.000 pb de tamaño.
cataliza la síntesis del ADN a alta Tª
Iones Mg2+: (0.5 mM - 4 mM)
*Thermus aquaticus (Taq)
Pyrococcus furiosus (Pfu) Buffer: pH 8,3 - 8,9
Thermococcus litoralis (Vent)
¿En qué consiste una PCR?

1. Desnaturalización del ADN molde

2. Unión de los cebadores

o annealing de los primers

3. Extensión de los cebadores

¿Dónde se hace una PCR?

Termocicladora

Termobloque
 ¿Cómo se hace una PCR?

Programa standard de una PCR

Desnaturalización Extensión
94 ºC 94 ºC
Tª Unión cebador 72 ºC 72 ºC
5´ 1´
50-60 ºC 1-5´ 5´

1´

x 25-35 ciclos
Amplificación de ADN in vitro

Primer ciclo 2º ciclo 3er ciclo

Amplificación
exponencial
 Resultado de una PCR

Electroforesis del ADN amplificado

Optimización de una PCR

Modificación de la Tª de annealing
Modificación de la concentración de Mg2+
annealing del primer
desnaturalización de las cadenas
actividad enzimatica

Adición de Glicerol y DMSO:

para romper estructuras secundarias
del ADN
 Tipos y usos de la PCR

PCRs solapantes

PCRs anidadas

Mutagénesis dirigida

Mutagénesis al azar

PCR múltiple

RT PCR (reverse transcription PCR)

QRT-PCR (quantitative real time PCR)

 PCRs anidadas (nested PCRs)
Reamplificar una región de ADN dentro de un fragmento ya amplificado

Fragmento 1
A
5’
5’ Ventajas: una amplificación
más específica
B

C
5’
5’

C
5’
5’ Fragmento 2
D
 Mutagénesis dirigida
Introducir mutaciones en un lugar concreto del ADN

ADN molde
A

X
5’
5’ 5’
X 5’
B

5’
X 5’
5’

5’
X

X
X
5’

5’ Dpn I
5’

5’
X X

X
X
5’

5’

A
5’ X 5’ X
5’
5’
X 5’ X 5’
X

X
B
5’ X 5’ X
5’ 5’
 Mutagénesis al azar
Introducir mutaciones puntuales en los fragmentos amplificados

ADN molde
A
5’
5’

B
1 mM dGTP, dCTP y dTTP
0.2 mM dATP
Aumento Mg2+ (de 2 mM a 6.2 mM)

Presencia Mn2+

5’ X
5’ X
X 5’
X 5’

5’ X
X 5’
5’ X X
X X 5’
5’ X
X 5’
 PCRs múltiples
Reamplificar varias regiones de ADN al mismo tiempo

A C E

B D F
A+B
C+D
E+F
A
E
5’
5’ 5’
5’
B C
5’ F
5’

Diagnóstico de cepas virulentas o parásitos

Ventaja: diagnósticos más fiables
 RT PCR (Reverse Transcription PCR)
Amplificación de ADN a partir de ARN

ADN
P

5’
AAAAA 3’ mARN

3’
Reverso transcriptasa (virus)
Poli T o primer específico
5’
TTTTT 5’
AAAAA
3’

cDNA
A Rompe union
ARNsa H
RNA/DNA

PCR normal
Usos: B
Amplificar regiones codificantes de genes de eucariotas
Detectar expresión génica
Técnica semicuantitativa de la expresión génica
 QRT-PCR (quantitative real time PCR)
Se obtiene información on line de la amplificación

Estrategia 1: Estrategia 2:
colorantes de dsADN primers marcados

A A
5’ 5’
5’ 5’

B B
Fluóroforo Fluóroforo Quencher
(SYBR-Green I)

A 5’ 3’
5’
5’
5’
B 5’
Detector
de fluorescencia Detector
de fluorescencia
 Ventajas de la PCR en diagnóstico

No necesidad de cultivar el parásito

Alta sensibilidad (ej: detección de 3-4 P. falciparum/ml sangre)

Alta especificidad

Rapidez en el diagnóstico: Resultado en 4-5 horas

Detección de varios parásitos a la vez (incluidos mismo género)

ej: P. falciparum, vivax, ovale y malariae

Útil en el seguimiento del tratamiento (PCR cuantitativa)

Puede detectarse en cualquier tejido o fluido (sangre, orina,

heces, semen, biopsias de órganos)
 Inconvenientes y limitaciones

Técnica económicamente costosa

No accesible a todos los laboratorios

Conocer el genoma del parásito previamente

 Metodologia del diagnóstico de parásitos por PCR

Toma de muestra
(Sangre, Orina, Heces, Tejidos, Extracción de ADN total
semen)

Uso de primers específicos

Análisis de PCR:
electroforesis o fluorometría