Laboratorio de Bioquimica. Guia Del Estudiante. Compendio de Prácticas

UNIVERSIDAD DE CARABOBO
FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
Unidad Académica de Química Orgánica
Laboratorio de BIOQUÍMICA (QAO-901)

GUÍA DEL ESTUDIANTE
Compendio de Prácticas
Licenciatura en Química
Elaborado por:
Doctor Arnaldo José Armado M.
Colaboradores:
Licenciada María Tapizquent
(Coordinadora Unidad Académica Química Orgánica)
Licenciada Beatriz Moy
(Asistente de Laboratorio)
Bárbula, junio 2019

Laboratorio de Bioquímica – Guía del estudiante- Compendio de Prácticas- 2019- Dpto. Química FACYT-UC
Doctor Arnaldo Armado/ Licenciada María Tapizquent/ Licenciada Beatriz Moy
Los profesores miembros de la Unidad Académica de Química Orgánica (UAQO) del

Departamento de Química hacen constar que la presente producción intelectual: Laboratorio de
BIOQUÍMICA (QAO-901)- Guía del estudiante- Compendio de Prácticas, elaborada por el
profesor Arnaldo Armado, cumple cabalmente con el Programa de la Asignatura Laboratorio de
BIOQUÍMICA (QAO-901).
Profesora Elizabeth Perozo

Directora del Departamento de Química
Profesora María Tapizquent

Miembro de la UAQO
Profesora Minerva Márquez

Miembro de la UAQO
Profesora Angelesmary Roldan

Miembro de la UAQO
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CONTENIDO
Introducción
UNIDAD 1. ÁCIDOS NUCLEICOS
Introducción
Trabajos Prácticos
1.1.- Extracción y cuantificación de ADN de bacterias del suelo.
1.2.- Extracción y análisis de ADN de hígado de ratón.
UNIDAD 2. CARBOHIDRATOS
Introducción
Trabajos Prácticos
2.1.- Reconocimiento de carbohidratos en una muestra problema.
2.2.- Análisis cualitativo y cuantitativo de azúcares en banana.
2.3.- Aislamiento y determinación cuantitativa de lactosa en leche.
2.4.- Cuantificación de carbohidratos totales en microorganismos aislados de suelo
con diferentes condiciones nutricionales.
UNIDAD 3. PROTEÍNAS
Introducción
Trabajos Prácticos
3.1.- Reacciones de reconocimiento de aminoácidos.
3.2.- Análisis proteico de granos y cereales.
3.3.- Determinación cuantitativa de caseína en leche.
3.4.- Hidrólisis de proteínas y determinación cualitativa de aminoácidos mediante
cromatografía en papel.
UNIDAD 4. ENZIMAS
Introducción
Trabajos Prácticos
4.1.- Determinación de peroxidasa de rábano (Raphanus sativus).
4.2.- Análisis proteico y enzimático de bromelina de piña.
4.3.- Aislamiento y caracterización de la invertasa de levadura.
UNIDAD 5. LÍPIDOS
Introducción
Trabajos Prácticos
5.1.- Cuantificación de lípidos totales e identificación de los diferentes tipos de lípidos
presentes en yema de huevo.
5.2.- Fraccionamiento de lípidos de la yema de huevo y cuantificación de colesterol.
UNIDAD 6. PRÁCTICAS ESPECIALES
6.1.- Obtención de bebidas alcohólicas a partir de la fermentación de frutas.
6.2.- Conversión de lípidos en carbohidratos en el proceso de germinación de semillas.
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INTRODUCCIÓN
El laboratorio de bioquímica está enfocado hacia el reconocimiento y la determinación de
biomoléculas (carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos nucleicos) en diferentes muestras
biológicas. Adicionalmente, se plantea la realización de una práctica de determinación de
actividades enzimáticas, que permite al estudiante de bioquímica entender y aplicar los
conocimientos sobre cinética enzimática y los factores que la afectan.
El objetivo de esta guía es el de realizar un compendio de prácticas, que se enmarquen en
el programa vigente de la asignatura Laboratorio de Bioquímica de la Licenciatura en Química de
la Facultad de Ciencias y Tecnología de la Universidad de Carabobo, y de esta manera contar con
un material avalado por la Unidad Académica de Química Orgánica, para orientar al alumno de la
asignatura en la realización del trabajo experimental.
En este sentido, se han recopilado las prácticas, que permitirán al estudiante, mediante la
revisión de la bibliografía, diseñar procedimientos para cumplir con los objetivos planteados en
cada periodo lectivo.
Para cada una de las prácticas se les plantea los objetivos que se deben lograr y se les
proporciona las referencias bibliográficas que deben consultar. En algunos casos se les
proporciona el procedimiento completo para que realicen cada experiencia, y en otros se les
plantea diseñar los diferentes procedimientos a emplear para cumplir con los objetivos de cada
práctica.
Además de las prácticas estimadas dentro del contenido programático de la asignatura
Laboratorio de Bioquímica, se proponen como prácticas especiales dos prácticas relacionadas con
procesos metabólicos, que ayudarán al estudiante comprender un poco mejor las rutas
metabólicas involucradas en cada caso. Esta práctica especial, es opcional y se deja a la decisión
del profesor que imparta la asignatura en cada periodo lectivo.
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UNIDAD 1. ÁCIDOS NUCLEICOS
Introducción
Los ácidos nucleicos constituyen macromoléculas fundamentales para las células, pues ellas son
las encargadas de la transmisión de la información genética, de generación en generación. El ADN
es la molécula donde se encuentran codificados todos los genes (genoma) que una célula puede
expresar, mientras que el ARN se involucra en los procesos de trascripción y traducción de la
información biológica.
Los ácidos nucleicos, ADN y ARN, son polinucleótidos formados por monómeros llamados
nucleótidos. Un nucleótido se compone de un azúcar de 5 átomos de carbono (ribosa en el ARN
y desoxiribosa en el ADN), una base nitrogenada y una molécula de fosfato (PO 43-).
Los genomas presentan una organización diferente en células procariotas y eucariotas. En
las procarióticas, el ADN se encuentra como una larga molécula de dos cadenas formando el
cromosoma bacteriano que se condensa para dar origen a una masa visible llamada nucleoide.
En la mayoría de los organismos procarióticos, el ADN es circular y, en general, poseen un
cromosoma único. Por esta razón contienen una sola copia de cada gen, por lo que son
genéticamente haploides. La mayoría de los procariotas contienen también pequeñas cantidades
de ADN extracromosómico, dispuesto habitualmente de modo circular, que constituyen los
plásmidos.
En células eucariotas, a diferencia de las procariotas, los ácidos nucleicos se encuentran
compartamentalizados, el ADN se encuentra básicamente en el núcleo, asociado a histonas,
constituyendo nucleoproteinas que conocemos como cromosomas. El ARN se encuentra
mayoritariamente en el citoplasma, (ARNr) constituyendo partículas ribonucleoproteicas, los
llamados ribosomas. Otros tipos de ARN se encuentran formando ribonucleoproteínas solubles
en el citoplasma (ARNm) o prácticamente desprovistos de proteínas (ARNt).
En los cloroplastos y mitocondrias de célula eucarióticas, se encuentran ADN específico para cada
uno de estos organelos, además de ribosomas. Estas moléculas de ADN son círculos
covalentemente cerrados, estructura típica del ADN bacteriano. Los ribosomas también se
asemejan en muchos aspectos estructurales y funcionales a los bacterianos (tamaño, inhibición
por antibióticos y valor de coeficientes de sedimentación de los ARN ribosomales).
El contenido de ADN por célula es constante para todas las células del mismo organismo
mientras que el contenido de ARN varía de acuerdo al tejido y a la condición fisiológica de la
célula. Por ejemplo, el contenido de ADN por célula de ratón es de 4,6 pg, equivalente a 3 x 10 12
daltons o 4,6 x 109 pares de bases. (B. Lewin, Gene Expresión. Eucaryotic Chromosomes. J. Wiley
and Sons Ltd. 1974. p.7). Se ha reportado ~4.2 fg de DNA/célula bacteriana, basado en Kubitschek,
HE y Friedman, MC (1971) [Chromosome replication and the division cycle of Escherichia coli B/r.
Journal of Bacteriology. 107:95-99.]
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Trabajos Prácticos
Contenido: Extracción, purificación y cuantificación de ácido desoxirribonucleico (ADN). Efecto
hipercrómico. Reconocimiento de Fosfato y desoxirribosa en el ADN.
1.1. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN DE BACTERIAS DEL SUELO

OBJETIVOS
 Aislar ADN de una fuente bacteriana.
 Evidenciar algunas propiedades físicas de los ácidos nucleicos, tales como viscosidad,
absorción de luz ultravioleta, efecto hipercrómico.
 Evidenciar mediante reacciones químicas los diferentes constituyentes de la molécula de
ADN.
 Determinar cuantitativamente el contenido de ADN por gramo de bacteria, basado en su
capacidad de absorber luz en la región ultravioleta del espectro electromagnético.
PROCEDIMIENTO
I. AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEL SUELO
Para el aislamiento de las bacterias del suelo, se procede según los pasos que se describen a
continuación:
- Se preparan soluciones de NaCl 0,9%, caldo nutritivo y agar nutritivo.
- Se esteriliza todo el material a utilizar: placas Petri, pipetas volumétricas de 1 mL, tubos
de ensayo con 9 mL de solución de NaCl 0,9% (isotónica), medios de cultivos líquido y
sólido (agar y caldo nutritivo).
- Se pesa 1 g de la muestra de suelo y se coloca en un tubo esterilizado con 9 mL de solución
NaCl 0,9%, y se agita en vortex.
- A partir de la suspensión de suelo anterior, se realizan diluciones sucesivas 10-1, 10-2, 10-3,
10-4.
- De las diluciones 10-3, 10-4 se colocan 100 µL (de cada una) en placas Petri por duplicado.
Se añade agar que se debe mantener entre 40-45 °C para que no gelifica antes de tiempo.
Se coloca una placa de agar sin ningún inoculo bacteriano como control.
- Se deja gelificar y se incuban las placas a 35°C, durante 24 horas.
- Pasado el tiempo de incubación, se evidencia el crecimiento de las colonias, y se realiza el
conteo en cada placa.
- Se selecciona una colonia característica, y se inocula en medio líquido (caldo nutritivo),
usando un asa de níquel. Se incuba a 35°C durante 24-48 horas.
- Al observar turbidez, se evidencia el crecimiento bacteriano en el medio. Se puede medir
la absorbancia a 540nm para obtener un valor semicuantitativo del crecimiento
bacteriano.
- Este cultivo líquido es el que se empleará para realizar la extracción de ADN.
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Observación: Todo el procedimiento de cultivo se debe realizar con material esterilizado (tanto
material de vidrio, como medios de cultivos y soluciones), bajo campana de flujo laminar o usando
mechero para garantizar un ambiente estéril al realizar los cultivos bacterianos y evitar
contaminación con microorganismos del ambiente. Este procedimiento será realizado previo a la
sesión de la práctica por el asistente de laboratorio o el profesor de la asignatura. Los estudiantes
pueden participar, siempre bajo supervisión del profesor.
II. EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS

Esta práctica se efectuará según el protocolo planteado por Sims, y col. (2010).
Del cultivo bacteriano se toman alícuotas de 1-1,4 mL en un microtubo de centrifuga, y se
centrifuga durante 1 min a 2500 rpm. Se descarta entre 0,6-1,0 mL del sobrenadante dejando 0,4
mL del mismo (el sobrenadante descartado se agrega en un recipiente con cloro comercial). El
pellet se resuspende en el sobrenadante remanente mediante vortex. Se añaden 10 µL de
solución de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10%, se mezcla en vortex y se deja incubar durante
10 minutos a 37°C. Después de la incubación se añaden 0,75 mL de n-butanol (saturado con agua)
y se mezcla en vortex. Se centrifuga nuevamente, durante 5 min a 2500 rpm. Luego de centrifugar,
utilizando una micropipeta con punta estéril, se extraen 150 µL de la capa acuosa (inferior)
pasando cuidadosamente con la punta de la micropipeta a través de la capa orgánica (superior),
sin agitar el pellet. Se colocan los 150 µL de la capa acuosa en otro microtubo limpio y estéril, se
le añaden 700 µL de alcohol isopropílico, se agita y se centrifuga durante 5 min a 2500 rpm. Se
decanta cuidadosamente el sobrenadante, y al precipitado se le añaden 700 µL de alcohol etílico
al 70%, se mezcla y se centrifuga nuevamente, durante 2 min a 2500 rpm. Se decanta el
sobrenadante y se deja secar el pellet bajo campana de flujo laminar. Cuando este seco, se añaden
50 µL de NaOH 8 M y se agita en vortex. Esta será la solución concentrada de ADN.
Observación: Todo el procedimiento se debe realizar por duplicado, para obtener suficiente
solución con ADN para realizar los siguientes experimentos.
III. CARACTERÍSTICAS DE LAS MOLÉCULAS AISLADAS

a. Absorción de luz y efecto hipercrómico
Diluya cada 50 µL de la solución concentrada de ADN, en un volumen total de 2,5 mL (con agua
destilada estéril). Determine las absorbancias a 260, 280 y 320 nm. Posteriormente, esta solución
se calienta durante 10 min en agua hirviente. Determine, nuevamente las absorbancia a 260 nm.
Anote sus valores y calcule el cociente A260/A280.
b. Determinación cualitativa de desoxiribosa
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En un tubo de ensayo dispense 50 µL de la solución concentrada de ADN, adicione 2,5 mL de

reactivo de Bial y caliente a 100 ºC durante 10 min. Observe la coloración verde característica de
pentosa.
c. Determinación cuantitativa de fosfato en ADN

Debe realizar la mineralización del ADN, para ello coloque en un tubo de ensayo 0,5 mL de la
solución diluida de ADN y 1,0 mL de H2SO4 30% v/v, caliente vigorosamente sobre un mechero.
Observe el oscurecimiento de la solución, adicione 4-5 gotas de peróxido de hidrógeno y continúe
calentando hasta que la solución se torne incolora.
Disponga 6 tubos de ensayo y adicione las soluciones (volúmenes en mL) que se indican en la
tabla 1. Mida la absorbancia a 660 nm a todos los tubos, ajustando el espectrofotómetro a cero
con el blanco.
Tabla 1. Preparación de la curva de calibración para la determinación de fosfato en ADN.

Blanco Patrones Muestra
1 2 3 4 5 6
Patrón de fosfato (2,3 mg/100 mL) 0 0,25 0,50 0,75 1,00 --
Agua 1,00 0,75 0,50 0,25 -- 0,50
Molibdato de amonio (2,5% p/v) 2,00
Sulfato ferroso (5%) 1,00
Solución de ADN mineralizada -- -- -- -- -- 0,50
RESULTADOS
Tomando en consideración el peso de su cultivo celular (esta información será suministrada en
función de la turbidez del cultivo), el volumen (mL) de cultivo procesado, las diluciones efectuadas,
y las absorbancias determinadas, calcule:
 Concentración de ADN (μg/mL)
 Pureza de ADN
 Peso de una célula bacteriana.
En base a los volúmenes, diluciones y patrones usados en esta sección, calcule la cantidad de
fósforo en la muestra de ADN. Haga un duplicado de su muestra de ADN.
REFERENCIAS
Boyer, R. (2006) Biochemistry Laboratory: Modern Theory and Techniques, 1st ed. Benjamin
Cummings: San Francisco, 2006; p 297.
Sandhu, G. S., Precup, J. W., and Kline, B. C. (1989) BioTechniques, 7, 689-670.
Sims, Branscum, Kao y Keaveny (2010) J. Chem. Edu., 87(10), 1113.
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1.2. EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE ADN DE HÍGADO DE RATÓN

OBJETIVOS
 Aislar ADN del hígado de ratón.
 Evidenciar algunas propiedades físicas de los ácidos nucleicos, tales como viscosidad,
absorción de luz ultravioleta, efecto hipercrómico.
 Evidenciar mediante reacciones químicas diferentes constituyentes del ADN.
 Determinar cuantitativamente el contenido de ADN por gramo de hígado, en base a su
capacidad de absorber luz en la región ultravioleta del espectro electromagnético.
PROCEDIMIENTO
I. EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS
Esta práctica se efectuará según el protocolo planteado por Rendina (1974).
II. CARACTERÍSTICAS DE LAS MOLÉCULAS AISLADAS

a. Absorción de Luz y pureza del ADN
Diluya 1.0 mL de la solución de ADN, con 5 mL de NaCl 0.9%, determine la absorbancia a 260 nm
y ajuste la absorbancia a 1-2 Unidades/mL. Debe preparar un volumen mínimo de 6 mL. Luego,
determine la absorbancia a 280 nm. Anote sus valores y calcule el cociente A260 / A280.
Nota: 50 µg de ADN nativo por mL equivalen a 1 unidad de absorbancia a 260 nm.
b. Efecto Hipercrómico
Disponga de 1 tubo de ensayo y adicione 3 mL de la solución diluida de ADN preparada
anteriormente. Caliente por 10 minutos en agua hirviente y determine la absorbancia a 260 nm.
c. Determinación Cualitativa de ribosa:

Disponga de 1 tubo de ensayo y adicione 1 mL de la solución diluida de ADN preparada.
Realice la reacción de Bial descrita en la práctica de carbohidratos de esta guía.
¿Qué otra determinación cualitativa o cuantitativa podría realizar para identificar o cuantificar los
componentes de la molécula de ADN?
RESULTADOS
 Calcule el contenido de ADN (mg) por gramo de hígado.
 Determine el número máximo de células por gramo de hígado.
 Estime la masa de una célula hepática.
 Incluya las reacciones químicas implicadas en los diversos experimentos.
REFERENCIAS
Rendina, G. (1974) Técnicas de Bioquímica Aplicada. Editorial Interamericana. P.p. 89-92.
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UNIDAD 2. CARBOHIDRATOS
Introducción
Los carbohidratos son biomoléculas que están ampliamente distribuidos en el mundo de los seres
vivos desempeñando funciones muy variadas a nivel estructural y metabólico. Los mismos se
clasifican de acuerdo al número de átomos de carbono que poseen o de acuerdo a su grupo
carbonilo en aldehídos o cetonas; características que a su vez confieren la base de la mayoría de
las reacciones usadas para su identificación y cuantificación.
Los métodos espectrofotométricos son útiles para estimar la cantidad de azúcares de
manera general. Para analizar los carbohidratos totales se emplean reacciones que involucran
calentamiento de las muestras con H2SO4, para hidrolizar los polisacáridos y deshidratar los
monosacáridos y así obtener las formas furfural e hidroximetilfurfural de las pentosas y hexosas,
respectivamente.
Dada la importancia de los carbohidratos se han desarrollado varios métodos para su
determinación: Fehling, Benedict, Barfoed, entre otros, pero la mayoría se basan en el mismo
principio: los azúcares con un grupo aldehído libre o un grupo cetónico se clasifican como
azúcares reductores y se transforman fácilmente en enodioles; al calentarlos en soluciones
alcalinas, dichos enodioles son altamente reactivos y se oxidan fácilmente en presencia de
oxígeno u otros agentes oxidantes, por lo tanto, los azúcares en solución alcalina rápidamente
reducen iones oxidantes como Ag+, Hg+, Cu2+ y Fe(CN)63- y los azúcares se oxidan formando
mezclas complejas de ácidos. Esta acción reductora es la que se utiliza tanto en las
determinaciones cualitativas como cuantitativas.
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Trabajos Prácticos
Contenido: Reacciones de reconocimiento de carbohidratos. Determinación cuantitativa de
carbohidratos en un material biológico.
2.1. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVOS
 Conocer diferentes reacciones de identificación de los carbohidratos.
 Identificar el carbohidrato presente en una muestra problema mediante la realización de
diferentes reacciones de identificación.
PROCEDIMIENTO
Se realizarán las siguientes pruebas de reconocimiento de carbohidratos, según el procedimiento
que se describe para cada una de ellas.
 Reacción de Molish
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 1 mL de la sustancia que se indica y 2 o 3
gotas del reactivo de Molish, agite los tubos. Seguidamente, por las paredes de cada tubo,
agregue 1 mL de ácido sulfúrico concentrado. Observe que ocurre. Anote sus observaciones.
Tubo 1 2 3 4 5 6
Sustancia Almidón Glucosa Sacarosa Lactosa Agua Problema
 Reacción de Benedict
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 1 mL de la sustancia que se indica y 1 mL del
reactivo de Benedict, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de agua
hirviente. Observe que ocurre. Anote sus observaciones.
Tubo 1 2 3 4 5 6
 Reacción de Barfoed
reactivo de Barfoed, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de agua
hirviente y controle el tiempo de aparición de un precipitado. Anote sus observaciones.
Tubo 1 2 3 4 5 6
Sustancia Glucosa Sacarosa Fructosa Lactosa Agua Problema
 Reacción de Seliwanoff
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 0,5 mL de la sustancia que se indica y 1 mL
del reactivo de Seliwanoff, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de agua
hirviente. Anote sus observaciones.
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Tubo 1 2 3 4 5 6
Sustancia Glucosa Sacarosa Fructosa Lactosa Agua Problema
 Reacción de Bial
reactivo de Bial, agite los tubos. Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de agua hirviente.
Anote sus observaciones.
Tubo 1 2 3 4 5 6
Sustancia Glucosa Ribosa Fructosa Lactosa Agua Problema
 Reacción del Ácido Múcico

Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno aproximadamente 300 mg de los compuestos
que se indican; luego añada 0,2 mL de agua y 1 mL ácido nítrico concentrado, agite los tubos.
Seguidamente, sumerja los tubos en un baño de agua hirviente. Después de 1-2 horas observe al
microscopio. Anote sus observaciones.
Tubo 1 2 3 4 5 6
Sustancia Glucosa Galactosa Fructosa Lactosa Agua Problema
Observación: Esta prueba se realiza con los compuestos solidos (patrones y muestras problemas).
Usted solo realizará la reacción del ácido múcico con su muestra problema y un patrón.
 Reacción de Lugol
Disponga de 6 tubos de ensayo, agregue a cada uno 0,5 mL de la sustancia que se indica y 1-2
gotas del reactivo de lugol, agite los tubos. Observe lo que ocurre. Anote sus observaciones.
Tubo 1 2 3 4 5 6
RESULTADOS
 Diseñe un cuadro donde señale (para cada carbohidrato utilizado y su muestra problema)
con positivo (+) ó negativo (-) los resultados de cada reacción o prueba realizada.
 Identifique la muestra problema.
 Discuta los resultados (incluya las reacciones para cada prueba de identificación).
REFERENCIAS
Alemany L. M.; Font S., S. (1983) Prácticas de Bioquímica. Editorial Alambra, España. P.p. 70-78.
Barboza, C.J - Ortiz, G. - Salcedo. Manual de prácticas de Bioquímica. Universidad de Guanajuato.
P.p. 35-36.
Rendina, G. (1974) Técnicas de Bioquímica Aplicada. Editorial Interamericana. P.p. 110-121
Voet, D. and Voet, J.G. (1995) Biochemistry. 2nd edition. John Wiley & Sons, Inc. USA.
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2.2. ANÁLISIS CUANTITATIVO DE AZÚCARES EN BANANA
Introducción
En general, los carbohidratos constituyen la mayor parte de los componentes vegetales. Son
carbohidratos los diferentes azúcares, almidones, celulosa, hemicelulosas, pectinas y numerosas
gomas.
Los azúcares como la glucosa, fructosa y sacarosa se acumulan especialmente en el
citoplasma; los almidones funcionan como carbohidratos de reserva y se encuentran en forma de
plastidios; la hemicelulosa y pectinas son los polisacáridos que conforman el material estructural
y las gomas son productos de desecho.
Tradicionalmente las frutas se han valorado por su atractiva apariencia, textura, valor
nutritivo y fundamentalmente por su sabor. En todos estos atributos de calidad los carbohidratos
desempeñan un papel relevante, por ejemplo, el sabor está dado básicamente por un balance
entre azúcares y ácidos orgánicos. El sabor característico de y diferente de las frutas se debe a la
gran variación en composición y concentración de los azúcares; el color atractivo se debe
principalmente a los glucósidos (antocianinas y antoxantinas) y la firmeza está determinada por
los polisacáridos estructurales.
Es importante señalar que las proporciones de los diversos carbohidratos existentes en las
frutas pueden experimentar modificaciones como consecuencia de la actividad metabólica.
Durante la maduración se producen cambios intensos en donde los azúcares son los sustratos
preferidos para la biosíntesis y suministro de energía.
Los azúcares son oxidados (vía glucólisis) hasta ácido pirúvico, el cual a su vez, por
descarboxilación oxidativa se convierte en Acetil-CoA que se metaboliza, vía ciclo de Krebs, dando
lugar a la formación de CO2, H2O y energía la cual queda disponible para la biosíntesis de otros
componentes (otros azúcares, ácidos orgánicos, ácido ascórbico, proteínas, nucleótidos
azucarados, glucósidos, etc.). Durante todo este proceso, el contenido de azúcares aumenta casi
invariablemente básicamente por hidrólisis que experimentan los polisacáridos, aunque algunos
azúcares sean utilizados como sustratos para la actividad respiratoria.
En el presente trabajo práctico se determinará el contenido de azúcares reductores y
almidón en bananas (cambur) con diferentes grados de maduración, con la finalidad de evidenciar
la variación que se lleva acabo con el proceso de maduración.
OBJETIVOS
 Determinar cuantitativamente el contenido de azúcares reductores en un material
biológico mediante el método espectrofotométrico del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS).
 Comparar el contenido de almidón en bananas verdes y maduras.
 Evidenciar el cambio en el contenido de azúcares reductores en cambur a diferentes
grados de maduración.
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PROCEDIMIENTO
Para realizar la práctica debe disponer de bananas (cambur) a diferentes grados de maduración
(verde, maduro y pasado de maduro). El profesor indicará a cada estudiante o grupo de
estudiante con cual muestra de banana trabajará. El procedimiento a seguir para cada muestra
de banana a diferentes grados de maduración se describe a continuación.
I. SEPARACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

Se pesa 1 g de banana y se tritura en un mortero, homogenizando con 10 mL de agua destilada.
Esta mezcla (homogenato) se coloca en tubo de centrífuga, agregando 10 mL adicionales de agua
al mortero para trasvasar la mayor parte del homogenato. Se centrifuga durante 10 min a 2500
rpm. Se decanta el sobrenadante en un cilindro graduado, y se añaden 10 mL de agua destilada
al pellet, agitando con una varilla de vidrio. Centrifugar nuevamente durante 10 min a 2500 rpm.
Se añade el sobrenadante en el cilindro graduado con el anterior, y se mide el volumen final
(extracto de azúcares reductores).
II. SEPARACIÓN DEL ALMIDÓN

El pellet del paso anterior es resuspendido en 10 mL de agua destilada. Se filtra en un papel de
filtro previamente pesado. Se agregan otros 10 mL de agua al tubo de centrifuga para lavarlo, y
se sigue el filtrado. El precipitado se coloca en estufa a 40-50 °C durante 2-3 horas para secar.
Cuando esté totalmente seco se pesa.
III. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

Se prepara una solución patrón de glucosa 1 mg/mL. Se prepara una solución disolviendo 2 g de
ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) en 40 mL de NaOH 2 M y se lleva a 100 mL. Se disuelven 60 g de
tartrato de sodio y potasio en la solución anterior, se calienta hasta disolver y se lleva a 200 mL
con agua destilada. Esta será la solución de DNS para la curva de calibración. Se identifican tubos
de ensayo, y se agregan las cantidades que se muestran en la tabla 2.
A cada tubo se le agregan 2 mL de solución de DNS. Se incuban los tubos en un baño de agua
hirviente durante 5 minutos. Se enfrían en un baño de agua fría con hielo. Se adicionan 5 mL de
agua destilada. Se mide la absorbancia a 540nm.
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Tabla 2. Preparación de curva de calibración para la determinación de azúcares reductores.

Tubo Volumen de solución Volumen de agua Contenido de Absorbancia
patrón (mL) destilada (mL) glucosa (mg) 540 nm
1 0 1,0
2 0,2 0,8
3 0,4 0,6
4 0,6 0,4
5 0,8 0,2
6 1,0 0
M1
M2
RESULTADOS
 Determine el porcentaje de almidón por cada 100 g de banana en cada muestra.
 Construya la curva de calibración para azúcares reductores.
 Determine el contenido de azucares reductores por cada 100 g de banana.
 Compare el contenido de almidón y de azúcares reductores en cada muestra de banana
a diferentes grados de maduración.
 Discuta los resultados.
REFERENCIAS
Deal, S. T.; Farmer, C. E. y Cerpovicz, P. F. (2002) Carbohydrate Analysis: Can We Control the
Ripening of Bananas? J. Chem. Edu., 79(4): 479.
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2.3. AISLAMIENTO Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LACTOSA EN LECHE

OBJETIVOS
 Determinar el contenido de azúcares totales en un material biológico mediante un
método espectrofotométrico.
 Cuantificar el contenido total de lactosa en leche.
PROCEDIMIENTO
La separación de lactosa y la caseína de la leche, se realizará mediante el protocolo reportado por
Alemany y Font (1983). Una vez aislada la caseína se puede emplear para la práctica de
determinación cuantitativa de caseína en leche (trabajo práctico 3.3) o en la hidrólisis de
proteínas (trabajo practico 3.4). La lactosa se determinará cuantitativamente usando el método
de la Antrona. El procedimiento a utilizar se describe a continuación:
- En un vaso de precipitados de 100 mL se colocan 50 mL de leche descremada, se calienta
aproximadamente a 40°C, se añade gota a gota solución de ácido acético al 5% (vinagre)
hasta la formación de un precipitado. Se mide el pH, el cual debe ser 4 (si no se ha logrado
el pH debe seguir agregando solución de ácido acético).
- Se filtra al vacío aproximadamente durante 15 minutos, para separar todo el líquido
posible (filtrado contentivo de lactosa) del precipitado (caseína). El precipitado se coloca
entre varias toallas de papel absorbente, para ayudar a secar la caseína y posteriormente
se deja secar completamente (puede colocarla en estufa a temperatura no mayor a 50°C).
Guardar la caseína ya seca para la práctica de determinación de caseína.
- Al filtrado se añade 1,5 g de CaCO3 en polvo y se agita durante unos minutos. Se calienta
la mezcla a ebullición suave durante 10 min.
- Se filtra al vacío, la mezcla caliente. El filtrado será la solución de lactosa. Mida el volumen.
- Se toma una alícuota de 0,5 mL de la solución de lactosa y se lleva a 50 mL con agua
destilada. A partir de esta solución de lactosa diluida, se realiza la determinación
cuantitativa de lactosa.
- Se dispone de 7 tubos de ensayo y se añaden los volúmenes de las soluciones que se
indican en la tabla 3.
- Los tubos se sumergen en un baño de agua/hielo, se incuban 5 min y se adicionan 2,5 mL
de solución de antrona, agitando inmediatamente en forma vigorosa, manteniendo en
frio. Este paso es importante realizarlo siguiendo estrictamente estas indicaciones, de lo
contrario la coloración obtenida no será proporcional a la cantidad de lactosa presente.
- Posteriormente se sumergen los tubos en un baño de agua hirviente durante 10 minutos.
Se enfría y se mide la absorbancia a 530 nm.
- Se construye la curva de calibración relacionando los mg de lactosa con la absorbancia
medida.
16
Tabla 3. Preparación de la curva de calibración de lactosa por el método de la antrona.

Tubo Patrón de lactosa Volumen de agua Absorbancia 530nm
(0,16 mg/mL) (mL)
1 0 0,5
2 0,1 0,4
3 0,2 0,3
4 0,3 0,2
5 0,4 0,1
6 0,5 0
Muestra 0,1 0,4
PRECAUCIONES PARA TRABAJAR CON EL REACTIVO DE ANTRONA: Este reactivo está preparado
con H2SO4, éste es un ácido fuerte, muy corrosivo. Se debe evitar el contacto con los ojos y la piel,
y si hubiera exposición se debe lavar con abundante cantidad de agua fría. La dilución del ácido
con agua es muy exotérmica y la solución resultante se vuelve muy caliente incluso hasta romper
el contenedor y quemar la piel. Esto se previene realizando las soluciones en baños de agua-hielo.
Nunca se debe agregar agua al ácido ya que puede producir salpicaduras, siempre se debe agregar
el ácido al agua.
Observación: El aislamiento de caseína se realiza paralelamente al aislamiento de la lactosa. La

caseína aislada debe guardarla hasta la siguiente semana para realizar la práctica de
determinación cuantitativa de caseína en leche (trabajo práctico 3.3) o hidrólisis de proteínas
(trabajo practico 3.4).
RESULTADOS
 Grafique la curva de calibración de lactosa.
 Reporte el porcentaje de lactosa obtenido en la leche.
 Discuta los resultados.
REFERENCIAS
Alemany L. M.; Font S., S. (1983) Prácticas de Bioquímica. Editorial Alambra, España.
Rendina, G. (1974) Técnicas de Bioquímica Aplicada. Editorial Interamericana.
17
2.4. CUANTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS TOTALES EN MICROORGANISMOS AISLADOS DE

SUELO CON DIFERENTES CONDICIONES NUTRICIONALES
Introducción
Los glúcidos están ampliamente distribuidos en el mundo de los seres vivos y desempeñan
funciones estructurales y metabólicas. Las bacterias poseen un gran número de carbohidratos
diferentes: azúcares libres, derivados de azúcares, polisacáridos simples (polímeros de azúcares)
y polisacáridos complejos (polímeros de azúcares diferentes, aminoazúcares, ácidos urónicos,
etc). Algunas macromoléculas contienen además componentes no glucídicos (lipopolisacáridos,
peptidoglucanos, ácidos teicoicos, ácidos nucleicos, glucoproteínas, etc).
Los métodos colorimétricos son útiles para estimar la cantidad de azúcares simples y sus
polímeros. Los ensayos más convenientes para carbohidratos totales involucran calentamiento
de las muestras con H2SO4 para hidrolizar los polisacáridos y deshidratar los monosacáridos para
obtener las formas furfural e hidroximetilfurfural de las pentosas y hexosas respectivamente.
Estas soluciones son luego tratadas con un reactivo aromático (antrona o fenol) para producir un
compuesto coloreado que se puede medir espectrofotométricamente. Las pentosas, hexosas,
heptosas y sus derivados, excepto aminoazúcares, reaccionan generando un producto coloreado,
mientras que las triosas y tetrosas no.
Aunque, no existe un método que permita la determinación de todos los azúcares presentes
en bacterias, debido a la gran variabilidad estructural que poseen, los métodos de antrona y fenol
son los más utilizados por su simplicidad, rapidez y baja interferencia con otros componentes
celulares, por lo que generan un índice confiable de carbohidratos totales. No obstante,
presentan dos desventajas notables, primero los azúcares individuales no pueden ser
identificados; y trabajar con soluciones concentradas de ácidos o fenol es peligroso.
En el presente trabajo práctico se analizará como las condiciones nutricionales pueden
afectar el contenido de azúcares en bacterias del suelo. Para ello, se determinará el contenido de
carbohidratos totales de bacterias aisladas de suelo, crecidas en dos medios de cultivo diferentes,
empleando el método de la antrona.
OBJETIVOS
 Determinar el contenido de azúcares totales en un material biológico mediante un
método espectrofotométrico.
 Analizar el efecto del medio de cultivo sobre el contenido de carbohidratos totales de
bacterias aisladas de suelo, utilizando el método de antrona.
PROCEDIMIENTO
I. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
18
 Soluciones estándares de glucosa: Se utilizarán soluciones madres de 20, 40, 60 y 80 µg/ml

con las cuales se realizará la curva de calibrado del método.
 Solución de H2SO4: Preparar solución madre al 75% v/v. TENER EN CUENTA LAS
PRECAUCIONES PARA MANIPULAR ESTE ÁCIDO.

 Reactivo de antrona: Preparar la solución agregando 100 mg de antrona a 2,5 ml de etanol
absoluto y llevar a un volumen final de 50 ml con H2SO4 al 75%. Agitar hasta disolución. La solución
debe ser preparada en el momento y conservar a 4 C a resguardo de la luz en frasco color ámbar.
II. DETERMINACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS TOTALES EN CULTIVOS BACTERIANOS DEL SUELO

Cada grupo tendrá 1,5 mL de cultivo de microorganismos aislados de suelo crecidos en un medio
rico (por ejemplo medio Luria-Bertani) y 1,5 mL de cultivo de los microorganismos crecidos en un
medio mínimo mineral (MM) constituido por CaCl2, CuSO4, FeSO4, MgSO4, ZnSO4, NaCl y (NH4)2SO4
en buffer fosfato, usando glucosa como única fuente de carbono, a partir de los cuales se realizará
la determinación de carbohidratos totales. Para ello debe seguir el procedimiento que se describe
a continuación para cada muestra:
 Recolectar las células por centrifugación a 3000 rpm durante 15 min y descartar el
sobrenadante obtenido.
 Resuspender el precipitado en 1 mL de solución fisiológica (NaCl 0,9 %) para lavar las
células y eliminar restos del medio de cultivo que pueden interferir en la determinación.
Centrifugar nuevamente a 3000 rpm durante 15 min y descartar el sobrenadante.
 Resuspender el precipitado en 700 µL de H2O destilada. Esta muestra se utilizará para la
determinación de carbohidratos.
 Rotular 7 tubos de vidrio como: B, T20, T40, T60, T80, LB, MM
 Colocar en cada tubo 600 µl de la solución patrón o muestra correspondiente y 600 µl de
H2O en el tubo del blanco de reacción.
 Enfriar los tubos y el reactivo de antrona en hielo.
 Agregar 3 ml del reactivo de antrona frío a cada tubo y mezclar durante 5 minutos en frío.
 Transferir los tubos a un baño de agua a 100 C e incubar EXACTAMENTE durante 10
minutos.
 Retirar los tubos y colocar nuevamente en hielo.
 Medir la absorbancia de cada tubo a 625 nm.
RESULTADOS
 Preparar la curva de calibración de glucosa.
 Determinar la concentración de carbohidratos totales en cada muestra problema.
 Discuta sus resultados.
REFERENCIAS
19
UNIDAD 3. PROTEÍNAS
Introducción
Las proteínas son moléculas constituidas por cadenas lineales de α-aminoácidos que se
encuentran unidos entre sí por enlaces peptídicos llegando a ser extremadamente complejas en
cuanto a su estructura y función. Gracias a su gran heterogeneidad estructural pueden cumplir
funciones muy variadas en los sistemas vivos haciendo que prácticamente todos los procesos
biológicos dependan de la presencia y actividad de este tipo de biomoléculas. Entre las funciones
que desempeñan en los sistemas biológicos se destacan el estructural, transporte, defensa,
regulación, movimiento y catálisis.
La solubilidad de una proteína en disolución acuosa se debe fundamentalmente a su
estructura terciaria, en la que los residuos de aminoácidos hidrofóbicos se agrupan en el interior
de la estructura de la proteína mientras que en la superficie aparecen los residuos hidrofílicos que
interaccionan con las moléculas de agua por fuerzas de Van der Waals o puentes de hidrogeno
creando una capa de solvatación que evita que dichas moléculas puedan agruparse en complejos
insolubles. Ciertos factores como la temperatura, el pH, la fuerza iónica o la constante dieléctrica
del medio modifican las interacciones entre las proteínas con el disolvente, disminuyendo la
estabilidad en la estructura secundaria y terciaria, provocando su precipitación en un proceso
conocido como desnaturalización.
Debido a la gran importancia que poseen las proteínas, se cuenta con varios métodos que
permiten su determinación cuantitativa en muestras biológicas. Estas metodologías,
principalmente desarrolladas con motivos nutricionales, se basan generalmente en métodos
espectroscópicos. Entre los más usados, se encuentra el método de Biuret.
En este método, la reacción de color para medir la concentración de proteínas
solubles por espectrofotometría se basa en la formación de complejos entre el ión cúprico y
dos cadenas polipeptídicas contiguas que tengan al menos dos enlaces peptídicos sucesivos. El
reactivo del Biuret contiene sulfato de Cobre(II) y NaOH, y el Cu, en un medio fuertemente
alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret)
cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas. Esta reacción la producen
los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos, ya que se debe a la presencia del
enlace peptídico (- CO- NH -), el cual no está presente en los aminoácidos libres.
20
Trabajos prácticos
Contenido: Solubilidad de proteínas. Métodos de fraccionamiento de proteína. Determinación
cuantitativa de proteínas. Reacciones de reconocimiento de aminoácidos.
3.1. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS

OBJETIVOS
 Estudiar algunas reacciones de reconocimiento de aminoácidos.
 Evidenciar la presencia de algunos aminoácidos en una muestra proteica, mediante la
realización de reacciones específicas de identificación.
PROCEDIMIENTO
Se realizarán las siguientes pruebas de reconocimiento de aminoácidos, según el procedimiento
que se describe para cada una de ellas.
 Reacción de Sakaguchi
En tubos de ensayos debidamente identificados, se añaden 1 mL de las sustancias que se indican:
Tubo 1 2 3 4
Sustancia Arginina 1% Caseína 1% Tirosina 1% Agua
Se adicionan a cada tubo 0,25 mL de NaOH al 10% y 0,25 mL de α-naftol 0,05%. Después de 5 min
de reposo se agregan 3-5 gotas de hipobromito de sodio. Se observa la aparición de color y se
anotan las observaciones.
 Reacción de Acreé-Rosenheim
Tubo 1 2 3 4
Sustancia Triptófano 1% Caseína 1% Cisteína 1% Agua
Se adicionan a cada tubo 0,5 mL de formaldehído y 1 mL de HCl concentrado. Se calienta el tubo
en baño de agua hirviente. Se observa la aparición de color y se anotan las observaciones.
 Prueba de Biuret
Tubo 1 2 3 4 5
Sustancia Biuret* Caseína 1% Urea 1% Tirosina 1% Agua
Se adicionan a cada tubo 1 mL de NaOH 10% y 0,5 mL de CuSO4 0,5%. Se observa la aparición de
color y se anotan las observaciones.
El compuesto biuret se prepara calentando suavemente cristales de urea, sobre un mechero.
Inicialmente la urea se funde y posteriormente se descompone originando un sólido blanco
(compuesto biuret) y amoníaco que se desprende como gas. NO confundir reactivo de Biuret con
el compuesto biuret.
21
 Prueba xantoproteíca
Tubo 1 2 3 4
Sustancia Fenilalanina 1% Caseína 1% Tirosina 1% Agua
Se adicionan a cada tubo 0,5 mL de HNO3 concentrado y 2 mL de NaOH 8M. Se observa la
aparición de color y se anotan las observaciones.
 Prueba de sulfidación
Tubo 1 2 3 4
Sustancia Arginina 1% Caseína 1% Cisteína 1% Agua
Se adicionan a cada tubo 1 mL de NaOH 10% y 0,25 mL de nitrato de plomo. Se calienta el tubo
en baño de agua hirviente. Se observa la aparición de color y se anotan las observaciones.
RESULTADOS
 Diseñe un cuadro donde señale (para cada aminoácido utilizado y su muestra problema)
con positivo (+) o negativo (-) los resultados de cada reacción o prueba realizada.
 Discuta los resultados (incluya las reacciones para cada prueba de identificación).
REFERENCIAS
22
3.2. ANÁLISIS PROTEICO DE GRANOS Y CEREALES
Introducción
Es conocido que los cereales y granos, son alimentos que poseen un alto contenido de proteínas.
Adicionalmente, las proteínas vegetales pueden clasificarse, según su solubilidad frente a
diferentes solventes y no basándose en aspectos estructurales de éstas.
La clasificación más comúnmente empleada, fue desarrollada por Osborne (1924) y
consiste en una serie de extracciones consecutivas con: agua, solución de sal diluida, solución de
alcohol y solución de ácidos o álcalis diluidos. Usando esta secuencia de separación, las proteínas
se pueden clasificar en albúminas, globulinas, prolaminas (o gliadinas) y glutelinas (o gluteninas)
respectivamente.
Entre los grupos clasificados no existe un límite rígido, sin embargo se puede lograr el
fraccionamiento de las proteínas provenientes de una misma fuente.
Las albúminas corresponden al grupo de proteínas que son solubles en agua destilada y
en soluciones salinas diluidas.
Las globulinas son insolubles (euglobulinas) o muy ligeramente solubles en agua destilada
pero son solubles en soluciones salinas diluidas. Con base en las propiedades de solubilidad no es
posible distinguir entre albúminas y seudoglobulinas. Si se aplican los conceptos de precipitación
por salado, se observa que las globulinas precipitan en soluciones de sulfato de amonio del 50%
de saturación, mientras que las albúminas lo hacen a concentraciones mayores del 75% de
saturación. Estas precipitaciones son mejores si se hacen a pH cercanos a sus puntos isoeléctricos.
Las prolaminas son insolubles en agua pero se disuelven en soluciones acuosas de
alcoholes de bajo peso molecular, en concentraciones entre el 50 y el 90%. Las glutelinas son
insolubles en los solventes anteriores pero se solubilizan en soluciones diluidas de ácido o bases.
Estos dos últimos grupos solo se encuentran en materiales vegetales, mientras que las proteínas
animales están constituidas básicamente por albúminas y globulinas.
En el presente trabajo práctico, se determinará el contenido de proteínas en granos y
cereales, y se realizará el fraccionamiento basado en la solubilidad de las proteínas presentes, con
la finalidad de comparar el contenido proteico de los diferentes granos y/o cereales en estudio, y
evidenciar la presencia de los diferentes tipos de proteínas en cada uno de ellos.
OBJETIVOS
 Determinar el contenido de proteínas en una fuente biológica mediante un método
espectrofotométrico.
 Comparar el contenido proteico de diferentes granos y/o cereales.
 Cuantificar mediante el método de Biuret, las fracciones proteicas obtenidas mediante el
fraccionamiento por diferencia de solubilidades de los diferentes tipos de proteínas
presentes en harina de granos y/o cereales.
23
PROCEDIMIENTO
I. AISLAMIENTO DE PROTEÍNAS DE DIFERENTES GRANOS
Se colocan en un mortero unos 5 g del grano o cereal seleccionado y se trituran hasta obtener
una harina fina. En el caso de granos (caraotas, frijoles, entre otros) se debe quitar la concha antes
de triturarlos.
Una vez obtenida la harina se realiza el fraccionamiento según el esquema de la figura 1 y
se describe a continuación:
 Se pesan 2.0 g de muestra (en cada caso será una de las harinas de: arveja, soya, fríjol, haba,
trigo, cebada, etc.); se coloca en un tubo de ensayo, se agregan 10 mL de H2O
desmineralizada, se agita manualmente durante 10 min y se centrifuga la suspensión a 2500
rpm por 3 minutos. El sobrenadante se trasvasa a un balón aforado de 25 mL. Se le agrega al
residuo otros 10 mL de H2O destilada y se repite exactamente el proceso anterior. Después
de centrifugar, el sobrenadante de esta segunda extracción se adiciona al balón que contiene
el primer sobrenadante y se completa hasta el aforo con agua destilada. Así se tiene separada
la fracción de las albúminas.
 Sobre el residuo que queda de la separación de las albúminas, se repite ahora todo el proceso
anterior, pero agregando esta vez solución de NaCl al 1%. Después de centrifugar, los
sobrenadantes de la primera y segunda extracción con NaCl al 1%, se llevan a otro balón
aforado de 25 mL y se completa hasta el aforo con el mismo NaCI al 1%. Esta es la fracción de
las globulinas.
 Sobre el residuo anterior se extrae en idéntica forma la fracción de las prolaminas, usando
esta vez alcohol etílico al 75% y una temperatura de extracción cercana a 60 ºC.
 Por último sobre el mismo residuo, con la adición de solución de NaOH 0,1 N y aplicando el
mismo procedimiento general, se separa la fracción de las glutelinas.
RECORDAR: el tratamiento de la harina, con cada uno de los solventes, extrae la fracción indicada:
Solvente Extractor Fracción
Agua destilada Albúminas
Cloruro de sodio al 1% Globulinas
Etanol al 75% Prolaminas
Hidróxido de sodio 0.1 N Glutelinas
II. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO PROTEICO EN CADA FRACCIÓN MEDIANTE EL MÉTODO

DE BIURET.
Se realiza una curva de calibración con disoluciones estándar de albúmina sérica bovina (ASB) a
diferentes concentraciones, mediante el método de Biuret agregando los contenidos como se
indica en la siguiente tabla 4. Al mismo tiempo que se elabora la curva de calibración, a tubos de
24
ensayo con 2 mL de cada fracción se les agrega 3 mL del reactivo de Biuret. Después de 20 minutos
se mide la absorbancia a 540 nm.
Figura 1. Esquema para el fraccionamiento de proteínas en granos y cereales.
Tabla 4. Preparación de curva de calibración, con albúmina sérica bovina (ASB), para la
determinación de proteínas mediante el método de Biuret.
Volumen de disolución Concentración de Volumen de Volumen de
Tubo patrón de albúmina la disolución reactivo de agua destilada
sérica bovina (mL) estándar (mg mL ) -1 Biuret (mL) (mL)
B 0 0 3 2
1 0,3 0,3 3 1,7
2 0,4 0,4 3 1,6
3 0,6 0,6 3 1,4
4 0,8 0,8 3 1,2
5 1,2 1,2 3 0,8
6 2 2 3 0
25
RESULTADOS
 Construya la curva de calibración para la determinación de proteínas.
 Determine el porcentaje de albúminas, globulinas, prolaminas, glutelinas por cada 100 g
de grano o cereal.
REFERENCIAS
Gutiérrez P., S. P. (s/f) Guía de prácticas del curso de bioquímica. Práctica N° 1: Fraccionamiento
de proteínas en semillas de leguminosas y cereales por solubilidad. Universidad Nacional Abierta
y a Distancia – UNAD – Escuela de Ciencias Básicas, Tecnología e Ingeniería – ECBTI - Colombia.
Disponible en Internet: https://es.scribd.com/document/19506418/Lab-Bioquimica-ii-09-1
Consultada en agosto, 2018.
De la Vega R., G. (2009) Proteínas de harina de trigo: clasificación y propiedades funcionales.

Temas de Ciencia y Tecnología, 13 (38): 27-32.
26
3.3. DETERMINACIÓN DE CASEÍNA EN LECHE

OBJETIVOS
 Determinar el contenido de proteínas en una fuente biológica mediante un método
espectrofotométrico.
 Cuantificar el contenido de caseína en leche mediante dos métodos analíticos.
PROCEDIMIENTO
I. Determinación de caseína mediante el método gravimétrico
El aislamiento de caseína se realiza paralelamente al aislamiento de la lactosa. Ver el
procedimiento a seguir en la práctica de aislamiento y determinación cuantitativa de lactosa en
leche (trabajo práctico 2.3).
Para determinar el contenido de caseína, se pesa la caseína obtenida y se realizan los cálculos en
función a la alícuota utilizada.
II. Determinación cuantitativa de caseína en leche por espectrofotometría mediante el

método de Biuret
Para cuantificar la cantidad de caseína en leche mediante el método colorimétrico de Biuret
realice los siguientes pasos:
 Se preparan dos diluciones de aproximadamente 10 mL de leche descremada (lo ideal es
utilizar la misma leche empleada para aislamiento de caseína y lactosa para poder comparar
los resultados) en tubo de ensayo usando agua destilada. Las diluciones finales son 1/10 y
1/20 y se preparan haciendo diluciones seriadas.
 Se realiza la curva de calibración según el procedimiento II planteado en el trabajo práctico
3.2.
 Al mismo tiempo que se elabora la curva de calibración, a tubos de ensayo con 2 mL de cada
dilución se les agrega 3 mL del reactivo de Biuret. Después de 20 minutos se mide la
absorbancia.
RESULTADOS
 Determine el porcentaje de caseína en la leche mediante el método gravimétrico.
 Determine el porcentaje de caseína mediante el método colorimétrico de Biuret.
 Compare los valores obtenidos (utilice métodos estadísticos).
REFERENCIAS
27
3.4. HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE SUS AMINOÁCIDOS

MEDIANTE CROMATOGRAFÍA EN PAPEL
OBJETIVOS
 Determinar cualitativamente los aminoácidos presentes en la caseína de la leche, mediante
cromatografía en papel.
PROCEDIMIENTO
I. HIDRÓLISIS DE LA PROTEÍNA
Se prepara un aparato de reflujo empleando un balón de destilación redondo de 100 mL de
capacidad. Se introducen 20 mL de HCl 19%, 0,5 g de la proteína (gelatina, caseína, cabello o seda)
y perlas de ebullición. Se calienta la mezcla, sobre una manta de calentamiento o llama muy débil,
a reflujo durante 35 min para la hidrólisis de caseína o gelatina, o durante 50 min para cabello o
seda. Después del periodo de reflujo, se decolora la solución añadiendo 0,5 g de carbón activado
en caliente y agitando vigorosamente. Se filtra por gravedad a través de papel de filtro,
recolectando el filtrado en una fiola de 50 mL (debe ser un líquido incoloro o amarillo pálido). Se
verifica si la hidrólisis se realizó de forma completa, aplicando la prueba de Biuret a una pequeña
alícuota de la muestra. Si no ha sido completa la hidrólisis se añade 3-5 mL de HCl al 19% y se
calienta la mezcla unos 5 min más. Se comprueba nuevamente si se completó la hidrólisis. Cuando
haya finalizado la hidrólisis, se enfría la mezcla y se guarda para su posterior uso.
II. SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA DE PAPEL

Para realizar la separación de los aminoácidos obtenidos por hidrólisis de las proteínas mediante
cromatografía en papel debe investigar y diseñar un protocolo experimental tomando en cuenta
lo siguiente:
 Utilice como patrones soluciones 0,1 M de los aminoácidos: alanina, glicina, tirosina, prolina,
cisteína, fenilalanina y arginina. Cada una de las soluciones se acidifica con 10 gotas de HCl al
19% por cada 10 mL de solución.
 La corrida cromatográfica se debe realizar en una cámara cromatográfica contentiva de una
solución de fenol al 80% procurando una profundidad de 1,5 cm.
 El tiempo de corrida aproximado es de 4 horas.
 El relevado se realiza, después de evaporar el solvente, rociando con solución de ninhidrina
y calentando en estufa a 110°C.
RESULTADOS
 Determine los Rf de cada patrón utilizado y de cada aminoácido producto de la hidrólisis de
la proteína.
 Identifique los principales aminoácidos de la caseína.
28
REFERENCIAS
29
UNIDAD 4. ENZIMAS
Introducción
Como se sabe, entre las funciones de las proteínas se encuentra que pueden actuar como
catalizador, siendo esta función de gran importancia debido a que la mayoría de las reacciones
metabólicas ocurren gracias a la presencia de proteínas específicas. Estas proteínas son
denominadas enzimas, y funcionan como biocatalizadores permitiendo que las reacciones
termodinámicamente espontaneas se produzcan en condiciones fisiológicas a velocidades útiles
para los organismos vivos.
A parte de su importancia para los seres vivos, por su acción en prácticamente todas las
reacciones del metabolismo, las enzimas poseen un elevado potencial biotecnológico por lo que
pueden ser aplicadas en muchos procesos industriales.
Es importante recordar que muchas enzimas con potencial biotecnológico, siguen el
modelo cinético de Michaelis-Menten. El compartimiento típico para este tipo de enzimas es que
a concentraciones bajas de sustrato, la reacción se aproxima a una cinética de primer orden
donde la velocidad varía linealmente con la concentración debido a que los sitios activos de la
enzima aún no se encuentran saturados por el sustrato. A medida que aumenta la concentración
de sustrato va aumentando el grado de saturación de los sitios activos, haciendo que la cinética
siga un comportamiento mixto entre orden cero y uno. Finalmente al saturarse todos los sitios
activos la velocidad de reacción se vuelve casi independiente de la concentración de sustrato
haciendo que concentraciones más altas tengan muy poca variación en la velocidad, es decir, se
comporten como reacciones de orden cero.
Para determinar los parámetros cinéticos de una enzima (KM y Vmáx), es más conveniente
ajustar los resultados al modelo de Lineweaver-Burk también conocido como de doble reciprocas.
Dicho modelo, modifica el modelo de Michaelis-Menten, utilizando operaciones matemáticas y
se expresa según la siguiente ecuación:
1 𝐾𝑀 1 1
= +
𝑣 𝑉𝑚á𝑥 [𝑆] 𝑉𝑚á𝑥
La temperatura y el pH son dos de los parámetros más importantes a la hora de trabajar

con enzimas, debido a que cualquiera de estos factores puede desnaturalizar fácilmente la
proteína conllevando a una pérdida de la actividad. En el caso de las altas temperaturas se ve
afectada la estructura terciaria que como se ha mencionado anteriormente se mantiene gracias
a fuerzas no covalentes altamente sensibles al calor, mientras que a bajas temperaturas no ocurre
la desnaturalización sino una simple disminución de la actividad enzimática. Por su parte los
cambios de pH modifican la carga neta de la proteína modificando las interacciones
electroestáticas entre la molécula proteica y el solvente.
30
Trabajos prácticos
Contenido: Reconocimiento y estudios enzimáticos en materiales biológicos. Determinación
cuantitativa de una actividad enzimática. Determinación de KM y Vmax. Efecto de temperatura, pH,
concentración de sustrato, entre otros factores que afectan la actividad enzimática.
4.1. DETERMINACIÓN DE PEROXIDASA DE RÁBANO (Raphanus sativus)

OBJETIVOS
 Evaluar la actividad enzimática de peroxidasa en un extracto de rábano (Raphanus sativus).
 Comprobar los efectos de la concentración de sustrato, pH, temperatura y tiempo de
incubación sobre la actividad enzimática.
 Estimar los parámetros cinéticos (KM, VMÁX, CAT) de la peroxidasa para el sustrato utilizado.
PROCEDIMIENTO
I. EXTRACTO ENZIMÁTICO
Basándose en la metodología planteada por Armado (2002) se prepara el extracto de rábano y se
determina el contenido de proteínas presente en dicho extracto, mediante el método Biuret
(siguiendo el mismo procedimiento indicado en el experimento II, práctica 3.4).
II. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE PEROXIDASA DEL EXTRACTO VEGETAL

Diseñe un protocolo para determinar la actividad del extracto vegetal usando como sustrato
fenol, en presencia de H2O2. Varíe la cantidad de extracto desde 0 hasta 2 mL, y determine donde
se obtiene mayor actividad.
III. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE FENOL Y H2O2 SOBRE LA ACTIVIDAD PEROXIDASA

Usando la cantidad de extracto donde se observe mayor actividad según el experimento anterior,
diseñe sendos experimentos donde varíe la concentración de fenol manteniendo constante la
concentración de H2O2, por un lado y otro donde manteniendo fija la concentración de fenol,
varíe la concentración de H2O2.
IV. EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD PEROXIDASA

Se determina la actividad enzimática utilizando soluciones amortiguadoras a diferentes pH (entre
4 y 9), tomando la cantidad de extracto, concentración de sustrato y H2O2 donde se obtiene mayor
actividad.
Se determina la actividad enzimática a diferentes temperaturas, usando los parámetros
anteriormente determinados, que permiten una mayor actividad.
NOTA: Para detener la reacción agregue a cada sistema 2 mL de H2SO4 al 20%, en todos los
experimentos.
31
RESULTADOS
 Determine la velocidad de reacción y actividad específica en base a las absorbancias
obtenidas, el tiempo de reacción y la concentración de proteína.
 Construya una gráfica para cada parámetro evaluado en función de la actividad
enzimática. Discuta el efecto de cada parámetro sobre la actividad enzimática.
 Obtenga las gráficas de: V vs [S], 1/V vs 1/[S] y V/[S] vs V.
 Estime los parámetros cinéticos KM, VMÁX, CAT mediante los tres gráficos anteriores, y
discuta acerca de las posibles diferencias en los valores obtenidos.
REFERENCIAS
Armado, A. (2002) Metodología para la determinación de fenoles y otros compuestos aromáticos
utilizando extractos vegetales. Trabajo de ascenso. FACYT. Universidad de Carabobo.
32
4.2. ANÁLISIS PROTEICO Y ENZIMÁTICO DE BROMELINA DE PIÑA (Ananas comosus).
Introducción
Una enzima de gran importancia comercial es la bromelina, una proteasa presente en el fruto de
ciertas plantas de la familia de las bromeliáceas como la piña, la cual es capaz de romper los
enlaces péptidos presentes en las proteínas, propiedad que le ha permitido tener importantes
aplicaciones en la industria alimentaria como ablandador de carne y complemento alimenticio.
Se ha descrito también que muestra acción farmacológica aumentando la absorción de
ciertos medicamentos por lo que se ha utilizado en tratamientos de desórdenes alimenticios,
enfermedades virales y en la formulación de vacunas.
La finalidad de este trabajo práctico es extraer y purificar la bromelina de diferentes partes
del fruto de piña, cuantificar el contenido de proteínas totales y determinar los factores que
afectan la actividad enzimática así como también los parámetros cinéticos de la enzima como KM
y Vmáx.
OBJETIVOS
 Purificar parcialmente la bromelina de la piña.
 Cuantificar el contenido de proteína en el extracto de bromelina.
 Determinar la actividad enzimática de la bromelina contenida en la piña.
 Determinar los efectos de la concentración de sustrato, pH y temperatura sobre la actividad
enzimática.
 Estimar los parámetros cinéticos de la enzima (KM y Vmáx).
PROCEDIMIENTO
I. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS PARCIALMENTE PURIFICADOS
Se procede de la siguiente manera: se realizan cortes finos de la muestra (tallo, fruto y follaje por
separado), se pesan 2g de muestra, la cual se coloca en un mortero de porcelana con mazo para
su maceración, se adicionan 5mL de agua destilada, una vez llevado a cabo el macerado se
decanta a un tubo de ensayo y se coloca en un baño de hielo durante 5 minutos y se agregan 5mL
de acetona fría (0-1oC) dejándose reposar hasta observar un precipitado blanco. Se centrifuga
durante 5 minutos a 1000 rpm y se descarta el sobrenadante y el precipitado se resuspende en
10 mL de solución amortiguadora (buffer fosfato) a pH 7. Este extracto se usará para la
determinación de proteínas y para los ensayos de actividad enzimática.
II. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS EN LOS EXTRACTOS DE BROMELINA OBTENIDOS

Se realiza una curva de calibración con disoluciones estándar de albúmina sérica bovina a
diferentes concentraciones mediante el método de Biuret, siguiendo el mismo procedimiento
indicado en tabla 4, experimento II, práctica 3.2. Al mismo tiempo que se elabora la curva de
calibración, a 3 tubos de ensayo con 1 mL de cada uno de los extractos y 1 mL de agua destilada,
se les agrega 3mL del reactivo de Biuret, después de 20 minutos se mide la absorbancia a 540 nm.
33
(NOTA: Si los tubos que contienen los extractos dan absorbancias fuera de la curva de calibración,
se debe realizar la determinación nuevamente tomando cantidades de extracto adecuadas para
que las absorbancias se encuentren en el intervalo de la curva de calibración)
III. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Para la determinación de la actividad enzimática se rotulan tubos de ensayo para cada extracto
obtenido y un blanco. A cada tubo rotulado para cada extracto se le adiciona 1,5 mL de disolución
de caseína al 1%, 0,5 mL del extracto y 2 mL de solución amortiguadora de fosfato 50 mM. Al tubo
rotulado como blanco se le añade solo 1,5 mL de disolución de caseína y 2 mL de solución
amortiguadora. Se colocan los tubos en un baño a 37 ºC durante 25 minutos, y luego se les añade
2 mL de disolución de ácido acético 1 M. Al tubo señalado como blanco se le añade ahora 0,5 mL
de extracto. Se centrifugan todos los tubos y toma de cada tubo 5 mL de sobrenadante y se
colocan en tubos donde previamente se han añadido 7,5 mL de reactivo alcalino. Posteriormente
se adicionan 5 mL de reactivo de Folin diluido (1:10). Se espera que transcurra 1,5 horas y se mide
la absorbancia a 700 nm.
IV. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO, pH y TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA DE BROMELINA.
Se rotulan 5 tubos y se colocan los volúmenes indicados en la tabla 5, y se procede mediante el
mismo protocolo descrito anteriormente (procedimiento III).
Tabla 5. Variación de la concentración de sustrato (caseína) para evaluar la actividad de bromelina

Tubo Volumen de Volumen de Volumen de solución Volumen de solución
extracto solución de amortiguadora de de ácido acético de
enzimático caseína al 1% fosfato de pH 7 (mL) concentración 1M
(mL) (mL) (mL)
1 0,5 0,5 3,0 2
2 0,5 1,0 2,5 2
3* 0,5 1,5 2,0 2
4 0,5 2,0 1,5 2
5 0,5 2,5 1,0 2
Para determinar el efecto del pH sobre la actividad enzimática, se realiza el experimento
utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente pero usando soluciones amortiguadoras de
diferentes pH (5, 7, 9 y 11). Se debe realizar un blanco para cada pH.
34
Para determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática se realiza el

experimento a diferentes temperaturas: 0°C (baño hielo/agua), 25-30°C (temperatura ambiente),
37°C y 60°C (baño termostatado). Se debe colocar un blanco para cada temperatura. Debe medir
las temperaturas exactas para poder realizar los gráficos respectivos.
V. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Se prepara una solución patrón de tirosina (200 µg/mL) en buffer fosfato. A partir de esta solución
patrón se preparan las soluciones de trabajo, como se indica en la tabla 6.
Tabla 6. Preparación de soluciones de trabajo para la curva de calibración de tirosina, usando

reactivo de Folin.
Tubo Volumen de Volumen de Volumen de solución Volumen de
solución patrón solución de amortiguadora de solución de ácido
de tirosina (mL) caseína 1% (mL) fosfato pH=7 (mL) acético 1M (mL)
1 0 1,5 2,5 2
2 0,5 1,5 2 2
3 1 1,5 1,5 2
4 2 1,5 0,5 2
5 2,5 1,5 0 2
Se centrifugan todos los tubos y toma de cada tubo 5 mL de sobrenadante y se colocan en tubos
donde previamente se han añadido 7,5 mL de reactivo alcalino. Posteriormente se adicionan 5
mL de reactivo de Folin diluido (1:10). Se espera 1,5 horas y se mide la absorbancia a 700 nm.
RESULTADOS
 Realice el cálculo del contenido de proteínas en el extracto enzimático.
 Calcule la actividad enzimática específica.
 Construya las gráficas de Lineweaver-Burk y determina VMáx y KM.
 Construya gráficos que permitan evidenciar el efecto del pH y la temperatura sobre la
actividad de la bromelina.
REFERENCIAS
Herrera C., Bolaños N., y Lutz G., (2003) Química de los Alimentos. Manual de Laboratorio. Ira.
Primera Edición. Editorial de la Universidad de Costa Rica. Capitulo IV. (pág. 36).
López I., Díaz J., y Merino F. (1996) La Bromelina: una proteasa de interés comercial. Ciencia y
Tecnología Alimentaria. (2). Universidad de la Coruña.
35
Hernández M. et al. (2005). Obtención de preparados enzimáticos a partir de tallos de piña

(Ananas Comosus) con potencialidades de uso en biotecnología y la Medicina. CENIC. 36. Revista
digital disponible en: http://www.redalyc.org/pdf/1812/181220525089.pdf
36
4.3. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LA INVERTASA DE LEVADURA

OBJETIVOS
 Extraer la enzima de la levadura.
 Cuantificar el contenido de proteínas en el homogenato.
 Determinar la actividad enzimática de la invertasa.
 Determinar los efectos de la concentración de sustrato, pH, temperatura y tiempo de
incubación sobre la actividad enzimática.
PROCEDIMIENTO
I. OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CRUDO DE INVERTASA DE LEVADURA DE PANADERÍA
Se pesa 1 g de levadura y se añaden en 200 mL de solución amortiguadora de acetato 0,1 M pH
5,0 en NaCl. Se agita la mezcla durante 15 min, luego se centrifuga durante 10 minutos a 2500
rpm. El sobrenadante (extracto enzimático) se mantiene en frío.
II. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR BRADFORD

III. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Se preparan en tubos de ensayo las mezclas de reacción según se indica:
 Tubo 1 (Blanco de sustrato): 2 mL solución amortiguadora de acetato (pH 5); 2 mL de agua
destilada; 0,1 mL de extracto enzimático.
 Tubo 2 (Blanco de enzima): 2 mL solución amortiguadora de acetato (pH 5); 1,1 mL de agua
destilada; 1 mL de solución de sacarosa 0,2 M.
 Tubos 3 y 4 (Muestra problema): 2 mL solución amortiguadora de acetato (pH 5); 1 mL de
agua destilada; 0,1 mL de extracto enzimático; 1 mL de solución de sacarosa 0,2 M.
Se incuban todo los tubos a 55°C durante 15 min. Pasado el periodo de incubación, se miden 1
mL y se trasvasan a otros tubos de ensayo, y se añaden 2 mL de reactivo de DNS. Se incuban
durante 10 min en un baño de agua hirviente. Se enfría en baño de agua con hielo, y se añaden 3
mL de agua destilada. Se mide la absorbancia a 570 nm.
IV. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO, PH Y TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA.
Basándose en el ensayo anterior, diseñe protocolos, que le permitan determinar la actividad de
invertasa variando:
 Tiempo de incubación (5, 10 15, 20, 30 min),
 Concentración de enzima (variando los volúmenes del extracto enzimático en 0,1; 0,2; 0,3;
0,4; 0,5 mL).
 Concentración de sustrato (variando los volúmenes de la solución de sacarosa en 0; 0,25; 0,5;
1,0; 2,0 mL)
 pH (4,0; 4,5; 5,0; 6,0)
37
 Temperatura (4, 10, 30, 55, 100 °C).
V. CURVA DE CALIBRACIÓN DE GLUCOSA

Se prepara la curva de calibración para glucosa, según tabla 2, procedimiento III descrito en
el trabajo práctico 2.2. En este caso, determine la absorbancia a 570 nm.
RESULTADOS
 Grafique las curvas de calibración para glucosa y para proteínas.
 Determine gráficamente el efecto del tiempo de incubación, la concentración de enzima, pH
y la temperatura sobre la actividad de invertasa.
 Calcule los parámetros cinéticos de la enzima (Vmáx y KM).
REFERENCIAS
Timerman AP, Fenrick AM, Zamis TM. (2009) The Isolation of Invertase from Baker’s Yeast: A Four-
Part Exercise in Protein Purification and Characterization. Journal of Chemical Education 86 (3):
379-381.
38
UNIDAD 5. LÍPIDOS
Introducción
Los lípidos son un grupo heterogéneo de biomoléculas. A causa de su diversidad, el término lípido
tiene una definición más operativa que estructural. Los lípidos se definen como aquellas
sustancias de los seres vivos que se disuelven en solventes apolares, como el éter, el cloroformo
y la acetona, y que no lo hacen de manera perceptible en el agua.
Los lípidos realizan un conjunto extraordinario de funciones en los seres vivos. Algunos
lípidos, como las grasas y los aceites, son reservas energéticas vitales. Diversas clases de
moléculas lipídicas son componentes estructurales importantes de las membranas biológicas.
Además, otras moléculas lipídicas actúan como hormonas, antioxidantes, pigmentos, o factores
de crecimiento vitales y vitaminas. Otras clases de moléculas lipídicas son utilizadas como señales
químicas. Por último, algunas moléculas lipídicas que se encuentran en las cubiertas externas de
varios organismos tienen funciones protectoras o impermeables.
Los lípidos pueden clasificarse de diferentes formas. En esta exposición, los lípidos pueden
subdividirse en las siguientes clases: ácidos grasos, triacilgliceroles, ésteres de ceras, fosfolípidos
(fosfoglicéridos y esfingomielinas), esfingolípidos (moléculas diferentes a la esfingomielina que
contienen el aminoalcohol esfingosina), isoprenoides (moléculas formadas por unidades
repetidas de isopreno, un hidrocarburo ramificado de cinco carbonos).
Con frecuencia, los lípidos se encuentran combinados covalentemente o mediante enlaces
débiles, con miembros de otras clases de biomoléculas, constituyendo moléculas híbridas tales
como los glucolípidos, que contienen lípidos y glúcidos, y las lipoproteínas que contienen lípidos
y proteínas. En estas biomoléculas las propiedades químicas y físicas características de sus
componentes están fusionadas para cumplir funciones biológicas especializadas.
Por otro lado, los métodos para la determinación cuantitativa de lípidos, en general se
fundamentan en extracciones con solventes orgánicos (de baja polaridad), aprovechando la
solubilidad de los lípidos en dichos solventes. Algunos de los solventes más utilizados para le
extracción de lípidos son: éter etílico, mezcla cloroformo-etanol, hexano, entre otros.
Al realizar el tratamiento de una muestra biológica con un solvente orgánico, se obtiene
un extracto que contiene el conjunto de las sustancias extraídas que pueden incluir,
triacilgliceroles, fosfolípidos, lecitinas, esteroles, ceras, ácidos grasos libres, carotenos, clorofilas
y otros pigmentos. La composición del extracto lipídico, dependerá, obviamente, de la fuente
biológica que se esté analizando.
39
Trabajos prácticos
Contenido: Extracción de lípidos totales de una fuente biológica. Determinación cuantitativa de

lípidos totales. Identificación de lecitinas y colesterol. Separación de lípidos mediante
cromatografía de capa fina (TLC). Fraccionamiento de lípidos. Cuantificación de colesterol.
5.1.- CUANTIFICACIÓN DE LÍPIDOS TOTALES E IDENTIFICACIÓN DE DIFERENTES TIPOS DE

LÍPIDOS EN YEMA DE HUEVO
OBJETIVOS
 Determinar el contenido de lípidos totales en la yema de huevo.
 Evidenciar mediante pruebas de identificación la presencia de lecitinas y colesterol.
 Separar los lípidos presentes en la yema de huevo mediante cromatografía de capa fina.
PROCEDIMIENTO
I. EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS DE LA YEMA DE HUEVO
En un vaso de precipitados de 100 mL, limpio y seco, previamente pesado, se coloca la yema de
un huevo. Se determina la masa de la yema de huevo. Seguidamente, se agita la yema con varilla
de vidrio, hasta formar una pasta homogénea. Se toman 5 mL de la pasta formada, y se agregan
y se añaden 25 mL de la mezcla de extracción (cloroformo-metanol, 2:1). Se agita constante
mente durante 5 min. Se filtra la suspensión a través de una gasa adaptada a un envudo de
gravedad. Se recoje el filtrado en un vaso de precipitados limpio 100 mL. Se filtra nuevamente,
pero esta vez utilizando papel de filtro. Se anota el volumen obtenido. Se colocan en un tubo de
centrífuga de vidrio, 10 mL de filtrado y se agregan 2 mL de agua. Se agita vigorosamente el tubo
tapado con un tapon de goma. Luego, se centrifuga a 1500 rpm durante 10 min. Se retira
cuidadosamente la capa superior formada por metanol y agua, utilizando una pipeta Pasteur,
eliminando inclusive las proteínas y otros materiales precipitados en la interfase. Se mide el
volumen de la capa clorofórmica.
II. CUANTIFICACIÓN DE LÍPIDOS TOTALES EN LA YEMA DE HUEVO

Se toma una alícuota de 3 mL del extracto clorofórmico y se coloca en un vaso de precipitados de
50 mL previamente pesado. Se evapora cuidadosamente el solvente orgánico en una plancha de
calentamiento. Se deja enfriar el vaso a temperatura ambiente, y se pesa nuevamente.
III. PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN PARA LECITINAS Y COLESTEROL

a. Identificación de lecitinas: Se toma el mismo vaso de precipitados con lípidos totales, y se
añaden 3 mL de la mezcla de extracción, se agita hasta dilución completa. Se añaden 15 mL
de acetona fría y se deja en reposo durante 10 min en un baño de agua fría con hielo. Observe
la formación de un precipitado blanco. Estas son las lecitinas. Filtre a través de paepl de filtro.
40
Guarde el filtrado para la identificación de esteroles. El precipitado de lecitinas se disuelve

en 1 mL de mezcla extractante, para realizar la cromatografía en capa fina.
b. Identificación de colesterol: Se colocan 10 mL del filtrado anterior en un vaso de precipitados,

y se evadora hasta sequedad. Se deja enfriar el vaso de precipitados y se disuelve el residuo
en 2 mL de cloroformo. Se transfiere 1 mL de esta solución a dos tubos de ensayos limpios y
secos. Al tubo 1 se le agregan 15 gotas de anhídrido acético y 5 gotas de H2SO4 concentrado,
agite y observe la aparición de color (reacción de Libermann- Burchard). Al tubo 2, se agrega
1 mL de H2SO4 concentrado, cuidadosamente a través de las paredes del tubo, tratando de
observar la formación de una interfase. Observe la aparición de color (reacción de Salkowski).
IV. SEPARACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE LÍPIDOS POR CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA (TLC)

a. Aplicación de la muestra: Las muestras se aplican a la placa para TLC, cubierta con Sílica
Gel 60, previamente activada, mediante un capilar, en forma de una mancha situada a
unos 2 cm de uno de los extremos y a 1 cm del borde inferior. Tenga cuidado al aplicar la
muestra, de no pinchar la placa con el capilar, ya que puede dañarla. Todas las muestras
deben aplicarse a igual distancia del extremo de la placa. Es recomendable aplicar las
muestras en varias porciones sucesivas dejando secar, entre cada aplicación.
b. Equilibrado de la cámara cromatográfica: La separación se lleva a cabo en un vaso de

precipitados de 400 mL con el eluyente de desarrollo (mezcla hexano-éter dietílico-agua
80:20:1) formando una capa menor de 1 cm de profundidad. Esta cámara debe ser
preparada al menos 1 hora antes del desarrollo de la cromatografía, para crear una
atmósfera saturada con vapor del eluyente en el interior de la cámara.
c. Desarrollo de la cromatografía: Una vez equilibrada la cámara, se introduce verticalmente

la placa de TLC apoyándola sobre el fondo de la cámara. El extremo que lleva la muestra
debe ser el que se sumerge en el eluyente. La muestra no debe quedar sumergida en el
eluyente, debe quedar por encima del mismo. Se tapa la cámara y comienza la separación
de las muestras a medida que el eluyente asciende por la placa. Se considera terminado
el cromatograma cuando el frente (avance del eluyente sobre la película de sílice) llegue
al borde superior de la palca. En este momento, la placa se saca de la cámara y se deja
secar antes de su revelado.
d. Revelado de la placa: El revelado se realiza rociando (utilizando un recipiente atomizador)

solución de ácido sulfúrico al 30% sobre la placa. Posteriormente se coloca en estufa a
100°C durante 15 min. Se sitian los centros de las manchas correspondientes de los lípidos.
41
A partir de la distancia de la línea de partida de los puntos, dividida entre la distancia del
frente de la línea de origen se obtienen los Rf para cada tipo de lípido separado.
RESULTADOS
 Determine la cantidad de lípidos presentes en 100 g de yema de huevo.
 Escriba las reacciones de las pruebas cualitativas realizadas.
 Realice un esquema de la separación cromatográfica obtenida.
 Determine los Rf para los lípidos separados.
REFERENCIAS
Alemany, M. y Font, S. (1982) Prácticas de Bioquímica. Editorial Alhambra, S.A. Madrid, España.
Rendina, G. (1974) Técnicas de Bioquímica aplicada. Editorial Interamericana, S. A. México.
42
5.2.- FRACCIONAMIENTO DE LÍPIDOS DE LA YEMA DE HUEVO Y CUANTIFICACIÓN DE

COLESTEROL
OBJETIVOS
 Determinar el contenido de lípidos totales en la yema de huevo.
 Realizar el fraccionamiento de lípidos en esteroles y lecitinas.
 Cuantificar el contenido de colesterol presente en la yema de huevo
PROCEDIMIENTO
I. AISLAMIENTO DE LÍPIDOS TOTALES DE LA YEMA DE HUEVO.
Siguiendo el procedimiento sugerido por Barreto (2005), se pesa 1g de yema de huevo y se
añaden 10 mL de una mezcla cloroformo-metanol (2:1). Se homogeniza bien y se filtra a través
de papel de filtro, recolectando el filtrado en un cilindro graduado, para poder medir el volumen
obtenido. Se añaden al filtrado anterior 0,2 veces su volumen de una solución de CaCl2 0,02% p/v,
mezclar bien y centrifugar por 5 minutos a 2500 rpm. Se remueve la fase superior y se añade a la
fase clorofórmica el doble de su volumen de una mezcla de cloroformo-metanol-agua (2:50:50).
Se mezcla bien y se centrifuga durante 5 min a 2500 rpm. Se descarta la fase superior y se mide
el volumen de la fase inferior (extracto clorofórmico).
II. DETERMINACIÓN DE LÍPIDOS TOTALES EN YEMA DE HUEVO.

Se toma una alícuota de 4 mL del extracto clorofórmico y se coloca en un vaso de precipitados
previamente pesado. Se evapora el solvente, cuidadosamente hasta sequedad (en una plancha
de calentamiento o estufa). Luego se deja enfriar a temperatura ambiente en un desecador, y se
pesa nuevamente.
III. FRACCIONAMIENTO DE LÍPIDOS

Se realiza el fraccionamiento de lípidos de la yema de huevo, para obtener así las fracciones de
lecitinas y esteroles, según el procedimiento que se esquematiza a continuación:
Coloque 2 mL del extracto clorofórmico en dos tubos de centrífuga

↓
Añada 4 mL de acetona fría (a cada tubo)
Deje en frío por 10 minutos
↓
Centrifugue durante 5 minutos a 2000 rpm
↓ ↓
Sólido Sobrenadante
↓ ↓
Lecitinas (Fracción L) Esteroles (Fracción E)
43
IV. CUANTIFICACIÓN DE COLESTEROL

Se evapora hasta sequedad la fracción E obtenida en el experimento anterior. Se pesa la fracción.
Se deja enfriar y se disuelve el residuo en ~2 mL de cloroformo.
A continuación, emplee algún método de cuantificación de colesterol. Consulte con el asistente,
previo al experimento para conocer la existencia de los reactivos químicos necesarios.
RESULTADOS
 Determine la cantidad de lípidos en base a 100 g de yema de huevo.
 Determine el porcentaje de colesterol por cada 100 g de yema de huevo y en base al
contenido lipídico.
 Compare sus resultados con los reportados en la bibliografía.
REFERENCIAS
Barreto, J. (2005) Lipid Extraction and Cholesterol Quantification: A Simple Protocol. Chem. Edu.
82 (1): 103-104.
44
UNIDAD 6. PRÁCTICAS ESPECIALES

Contenido: Metabolismo de carbohidratos. Glucolisis. Fermentación. Ciclo de Krebs. Ciclo del
glioxalato.
6.1.- OBTENCIÓN DE BEBIDAS ALCOHÓLICAS A PARTIR DE LA FERMENTACIÓN DE FRUTAS

OBJETIVOS
 Evidenciar experimentalmente la formación de etanol, a través de la ruta metabólica de la
fermentación alcohólica.
 Elaborar una bebida alcohólica mediante la fermentación del jugo de una fruta.
PROCEDIMIENTO
Investigue un procedimiento adecuado para realizar la fermentación alcohólica de una fruta,
que le permita obtener una bebida alcohólica.
Tome en cuenta lo siguiente para diseñar su protocolo experimental:
 Debe seleccionar una fruta de fácil adquisición, y que el costo esté dentro de su
presupuesto.
 Debe elaborar un montaje adecuado para la fermentación alcohólica del mosto de la
fruta seleccionada.
 Las etapas que debe tener su protocolo, son lavado y extracción de la fruta, elaboración
del mosto, fermentación, clarificación, filtrado y envasado.
RESULTADOS
 Determine el rendimiento de la fermentación.
 Determine la cantidad de etanol obtenido por fermentación.
REFERENCIAS
Barbado, J. (2005) Vinos de elaboración casera. Editorial Albatros. Primera edición. Buenos Aires,
República Argentina.
González, M. (2013) Elaboración artesanal de vino de frutas. Primera edición. Venezuela.
45
6.2.- Conversión de lípidos en carbohidratos en el proceso de germinación de semillas
Introducción
Desde el punto de vista metabólico, las células animales y vegetales difieren en diversos aspectos.
Una de estas diferencias radica en que las células vegetales, junto con algunos microorganismos,
son capaces de obtener carbohidratos a partir de grasas. En semillas dicha conversión es esencial
para su desarrollo, ya que gran parte de su energía se almacena en forma de triacilgliceroles.
Las plantas con capaces de sintetizar los azúcares mediante el empleo del ciclo del
glioxilato que puede considerarse una variante anabólica del ciclo del ácido cítrico. Por ejemplo,
el ciclo del glioxilato permite a las plantas y a las bacterias llevar a cabo la conversión neta de las
grasas en carbohidratos, evitando las reacciones de generación de CO2 del ciclo del ácido cítrico
(Mathews, 2002).
En cuanto a las enzimas participantes la citrato sintasa, la aconitasa y la malato
deshidrogenasa del ciclo del glioxilato son isozimas de las enzimas del ciclo del ácido cítrico; pero,
la isocitrato liasa y la malato sintasa son únicas del ciclo del glioxilato. En plantas, estas enzimas
se encuentran en orgánulos unidos a membrana denominados glioxisomas donde se llevan a cabo
tanto la β-oxidación de los ácidos grasos para producir acetil-CoA, como la utilización de dicho
acetil-CoA en el ciclo del glioxilato. Los glioxisomas no están presentes en todos los tejidos de las
plantas en todo momento. Se presentan en semillas oleaginosas (ricas en lípidos) durante la
germinación, antes de que las plantas en desarrollo adquieran la capacidad de sintetizar glucosa
por la fotosíntesis.
Durante el ciclo del glioxilato, el acetil-CoA se convierte en succinato y este es exportado
a la mitocondria, donde las enzimas del ciclo del ácido cítrico lo transforman en malato. Una
isozima citosólica de la malato deshidrogenasa oxida el malato a oxalacetato, un precursor de la
gluconogénesis. De esta forma, las semillas en germinación pueden convertir el carbono lipídico
en glucosa (Lehninger, 2006).
El objeto de esta práctica consiste en evidenciar la conversión de lípidos a carbohidratos
en semillas de ajonjolí (Sesamun indicum) antes y después de su germinación como consecuencia
de la ruta del glioxilato.
PROCEDIMIENTO
I. GERMINACIÓN DE LAS SEMILLAS
Pesar 2 lotes de aproximadamente 0,5 g de semillas de ajonjolí. Lavar las semillas usando 10 mL
de NaHClO al 1% para cada lote y se enjuaga con agua destilada hasta eliminar el olor a cloro.
Preservar en un frasco estéril de boca ancha que contenga papel filtro humedecido y cubrir con
gasa. Almacenar en una estufa a 28°C o en un sitio limpio a temperatura ambiente por 4 días o
hasta que se evidencie germinación en la mayoría de las semillas.
46
II. PREPARACIÓN DE LOS EXTRACTOS Y DETERMINACIÓN DE BIOMOLÉCULAS

a. Cuantificación de Carbohidratos
Realizar los siguientes pasos para un lote de semillas de ajonjolí germinadas y otro sin germinar.
 Homogenizar en un mortero el lote de semillas y transferir a un vaso de precipitados.
 Añadir 10 mL de etanol al 75% y homogenizar con una varilla de vidrio.
 la mezcla resultante y centrifugar por 30 min a 2500 rpm.
 Filtrar el extracto y se medir el volumen.
 Almacenar los extractos en frío y emplear para el siguiente paso.
 Preparar tubos de ensayo con los reactivos que se indican en el cuadro I.
Tabla 7. Reactivos a emplear para la realización de una curva de calibración para determinación
de carbohidratos presentes en semillas de ajonjolí.
Tubo Blanco 1 2 3 4 5
Patrón de glucosa (mL) 0 0,2 0,4 0,6 - -
Agua destilada (mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,9 0,9
Extracto sin germinar (mL) - - - - 0,1 -
Extracto germinadas (mL) - - - - - 0,1
Realizar los siguientes pasos bajo campana:

 Agitar cada tubo en el vórtex por 1 min y añadir 0,6 mL de fenol al 5%.
 Nuevamente, agitar cada tubo en el vórtex por 1min y añadir 2 mL de H 2SO4
concentrado.
 Agitar cada tubo en el vórtex cuidadosamente por 30 segundos.
 Dejar enfriar los tubos y medir la absorbancia a 480nm.
b. Cuantificación de lípidos totales

 Tomar dos lotes de semillas (un lote se semillas germinadas y otro sin germinar).
 Triturar cada lote en un mortero.
 Homogenizar con 10 mL de cloroformo-metanol frío.
 Separar el sobrenadante pasándolo a un tubo de centrífuga.
 Homogenizar las semillas con 5 mL adicionales de cloroformo-metanol y adicionar el
sobrenadante en el tubo de centrífuga correspondiente.
 Centrifugar a 2500 rpm por 5min.
 Pesar dos vasos de precipitados secos de 50 mL previamente rotulados (semillas
germinadas y semillas sin germinar) y trasvasar los sobrenadantes al vaso de precipitados
correspondiente.
 Eliminar los solventes en baño de María.
 Pesar nuevamente cada vaso de precipitados.
47
CALCULOS A REALIZAR
 Realizar las curvas de calibración para la determinación de carbohidratos por el método de
fenol.
 Determinar el contenido de carbohidratos y de lípidos en las semillas germinadas y no
germinadas.
 Comparar y discutir los resultados obtenidos.
REFERENCIAS
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/ProtocoloLipidosAjonjoli_21851
48
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS GENERALES
Arzola, C. y Holguín, C. (2006) Manual de Prácticas de Bioquímica. Universidad Autónoma de

Chihuahua. Facultad de Zootecnia.
Boyer, R. F. (2012) Biochemistry laboratory: modern theory and techniques. Rodney Boyer. 2nd
ed. ISBN-13: 978-0-13-604302-7/ ISBN-10: 0-13-604302-X
Guía prácticas “Bioquímica”. 1º Licenciado en Química, Curso 2006/07. Universidad de Huelva,

FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES. Departamento de Química y Ciencia de los Materiales.
Área de Bioquímica y Biología Molecular.
Pavia, D. (1976) Química Orgánica Experimental. Primera edición. EUNIBAR, Barcelona España.
Rendina, G. (1974) Técnicas de Bioquímica aplicada. Editorial Interamericana, S. A. México.
Shriner, R. L.; Fuson, R. C. y Curtin, D. Y. (2001) Identificación sistemática de compuestos

orgánicos. Editorial Limusa, S. A. México.
49

Laboratorio de Bioquimica. Guia Del Estudiante. Compendio de Prácticas

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UNIVERSIDAD DE CARABOBO

FACULTAD EXPERIMENTAL DE CIENCIAS Y TECNOLOGÍA

Laboratorio de BIOQUÍMICA (QAO-901)

Bárbula, junio 2019

Los profesores miembros de la Unidad Académica de Química Orgánica (UAQO) del

Profesora Elizabeth Perozo

Profesora María Tapizquent

Profesora Minerva Márquez

Profesora Angelesmary Roldan

UNIDAD 1. ÁCIDOS NUCLEICOS

1.1. EXTRACCIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE ADN DE BACTERIAS DEL SUELO

II. EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLEICOS

III. CARACTERÍSTICAS DE LAS MOLÉCULAS AISLADAS

b. Determinación cualitativa de desoxiribosa

En un tubo de ensayo dispense 50 µL de la solución concentrada de ADN, adicione 2,5 mL de

c. Determinación cuantitativa de fosfato en ADN

Tabla 1. Preparación de la curva de calibración para la determinación de fosfato en ADN.

1.2. EXTRACCIÓN Y ANÁLISIS DE ADN DE HÍGADO DE RATÓN

II. CARACTERÍSTICAS DE LAS MOLÉCULAS AISLADAS

c. Determinación Cualitativa de ribosa:

2.1. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE CARBOHIDRATOS

 Reacción del Ácido Múcico

2.2. ANÁLISIS CUANTITATIVO DE AZÚCARES EN BANANA

I. SEPARACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

II. SEPARACIÓN DEL ALMIDÓN

III. DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES

Tabla 2. Preparación de curva de calibración para la determinación de azúcares reductores.

2.3. AISLAMIENTO Y DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LACTOSA EN LECHE

Tabla 3. Preparación de la curva de calibración de lactosa por el método de la antrona.

Observación: El aislamiento de caseína se realiza paralelamente al aislamiento de la lactosa. La

2.4. CUANTIFICACIÓN DE CARBOHIDRATOS TOTALES EN MICROORGANISMOS AISLADOS DE

 Soluciones estándares de glucosa: Se utilizarán soluciones madres de 20, 40, 60 y 80 µg/ml

PRECAUCIONES PARA MANIPULAR ESTE ÁCIDO.

II. DETERMINACIÓN DE LOS CARBOHIDRATOS TOTALES EN CULTIVOS BACTERIANOS DEL SUELO

3.1. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS

3.2. ANÁLISIS PROTEICO DE GRANOS Y CEREALES

II. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO PROTEICO EN CADA FRACCIÓN MEDIANTE EL MÉTODO

Figura 1. Esquema para el fraccionamiento de proteínas en granos y cereales.

De la Vega R., G. (2009) Proteínas de harina de trigo: clasificación y propiedades funcionales.

3.3. DETERMINACIÓN DE CASEÍNA EN LECHE

II. Determinación cuantitativa de caseína en leche por espectrofotometría mediante el

3.4. HIDRÓLISIS DE PROTEÍNAS Y DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE SUS AMINOÁCIDOS

II. SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA DE PAPEL

La temperatura y el pH son dos de los parámetros más importantes a la hora de trabajar

4.1. DETERMINACIÓN DE PEROXIDASA DE RÁBANO (Raphanus sativus)

II. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE PEROXIDASA DEL EXTRACTO VEGETAL

III. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE FENOL Y H2O2 SOBRE LA ACTIVIDAD PEROXIDASA

IV. EFECTO DEL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD PEROXIDASA

4.2. ANÁLISIS PROTEICO Y ENZIMÁTICO DE BROMELINA DE PIÑA (Ananas comosus).

II. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS EN LOS EXTRACTOS DE BROMELINA OBTENIDOS

III. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

IV. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO, pH y TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD

Tabla 5. Variación de la concentración de sustrato (caseína) para evaluar la actividad de bromelina

Para determinar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática se realiza el

V. CURVA DE CALIBRACIÓN PARA LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Tabla 6. Preparación de soluciones de trabajo para la curva de calibración de tirosina, usando

Hernández M. et al. (2005). Obtención de preparados enzimáticos a partir de tallos de piña

4.3. AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE LA INVERTASA DE LEVADURA

II. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR BRADFORD

IV. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO, PH Y TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD

 Temperatura (4, 10, 30, 55, 100 °C).

V. CURVA DE CALIBRACIÓN DE GLUCOSA