Вы находитесь на странице: 1из 232

Шепелин А.П., Д ятло в И.А.

питательные среды
для энтеробактерий

Оболеиск
2017
УДК 616.34-022.7: 57.083.134
ББК 55.141
П35

Рецензенты:
Егоров А.М., академик РАН, доктор биологических наук, профессор
Кафтырева Л.А., доктор медицинских наук, профессор

П35 Питательные среды для энтеробактерий / [А.П.Шепелин, И.А.Дятлов] -


М.: Издательство «Династия», 2017. - 232 с.: ил.

ISBN 978-5-98125-106-1

В монографии представлены материалы, касающиеся заболеваемости людей


острыми кишечными инфекциями, в частности патогенными микроорганизмами
из группы энтеробактерий. Описаны способы лабораторной диагностики, иденти­
фикации и дифференциации энтеробактерий классическими культуральными мето­
дами с помощью питательных сред, применяемых в бактериологической практике.
Отражено современное состояние производства питательных сред в России. В моно­
графии использованы литературные данные, а также результаты собственных много­
летних исследований по созданию, контролю и клиническим испытаниям разрабо­
танных питательных сред. Проведен анализ развития отечественного производства
питательных сред и детально описаны составы и способы их приготовления для диа­
гностики кишечных инфекций.
Монография адресована врачам-бактериологам и специалистам в области клини­
ческой и санитарной микробиологии, а также всем специалистам, работающим
в области in vitro диагностики, и будет интересна студентам медицинских вузов и
колледжей.
У Д К 61 6 .3 4 -0 2 2 .7 : 57.083.134
Б Б К 55.141

© Коллектив авторов, 2017


ISBN 978-5-98125-106-1 © Оформление. Издательство «Династия», 2017
оглавление

Перечень сокращений, условных обозначений,


символов, единиц и терминов.............................................................................................. 5
Глоссарий.................................................................................................................................... 6
Предисловие............................................................................................................................. 15

1. Общая характеристика бактерий семейства Enterobacteriaceae ..................... 17


2. Медицинское значение энтеробактерий ..................................................................20
3. Заболеваемость острыми кишечными инфекциями............................................ 25
4. Бактериологические методы диагностики инфекционных заболеваний......32
5. Современное состояние производства питательных сред в Р оссии.............. 35
6. Питательные среды для выделения энтеробактерий............................................ 41
6.1. Базовые питательные среды......................................................................................... 41
6.1.1. Питательный бульон...........................................................................................43
6.1.2. Забуференная пептонная вода.........................................................................45
6.1.3. Среды Эйкмана....................................................................................................48
6.1.4. Лактозный бульон (Питательная среда № 11).............................................55
6.1.5. Питательный агар................................................................................................57
6.1.6. Питательная среда КМАФАнМ .....................................................................59
6.1.7. Триптон-соевый агар и триптон-желчный агар..........................................62
6.2. Питательные среды для обогащения энтеробактерий (селективные)..........70
6.2.1. Питательная среда обогащения для бактерий семейства
Enterobacteriaceae............................................................................................................71
6.2.2. EC-бульон...............................................................................................................72
6.2.3. Среда Кесслера ....................................................................................................74
6.2.4. Среда Кода (S D S -Бульон)................................................................................ 80
6.2.5. Бульон МакКонки............................................................................................... 83
6.2.6. Бульон Мосселя ..................................................................................................86
6.2.7. Среды для накопления сальмонелл .............................................................. 89
6.2.7.1. RVS-бульон..............................................................................................90
6.2.7.2. Магниевая среда ................................................................................... 94
6.2.7.3. Селенитовый бульон ............................................................................98
6.2.7.4. Среда Мюллера-Кауфмана...............................................................101
6.3. Дифференциально-диагностические питательные среды (селективные)..........104
6.3.1. Агар М осселя...................................................................................................104

3
6.3.2. Питательная среда Эндо.................................................................................. 109
6.3.3. Сорбитол E. coli О157:Н7 агар........................................................................116
6.3.4. Среда Л евина......................................................................................................120
6.3.5. Висмут-сульфит агар........................................................................................ 123
6.3.6. Бактоагар Плоскирева .................................................................................... 130
6.3.7. SS-агар................................................................................................................... 134
6.3.8. Питательная среда для выделения иерсиний............................................139
6.3.9. Лактозный Т Т х агар с тергитолом 7 ........................................................... 142
6.3.10. Агар МакКонки................................................................................................148
6.3.11. X LD -агар............................................................................................................ 153
6.3.12. Питательная среда с бриллиантовым зеленым
и феноловым красным.................................................................................................157
6.4. Питательные среды для идентификации энтеробактерий...............................162
6.4.1. Агар Клиглера.....................................................................................................162
6.4.2. Питательные среды с мочевиной .................................................................167
6.4.3. Питательный агар по Ресселю........................................................................173
6.4.4. Питательные среды Гисса с углеводами..................................................... 176
6.4.5. Питательная среда для качественного определения
ферментации глюкозы (Питательная среда № 6)............................................... 178
6.4.6. Питательная среда для определения восстановления
нитратов в нитриты (Питательная среда № 7)..................................................... 180
6.4.7. Трехсахарный агар (Питательная среда № 13)..........................................183
6.4.8. Цитратная среда Козера ................................................................................. 185
6.4.9. Цитратный агар Симмонса (Питательная среда № 14).......................... 186
6.4.10. Питательная среда для определения индола
(Питательная среда № 15).......................................................................................... 188
7. Хромогенные и флюорогенные питательные среды.........................................191
Заключение............................................................................................................................213
Приложение...........................................................................................................................216
Список литературы.............................................................................................................. 222

4
п ереч ен ь со кращ ен и й , у с л о вн ы х о бо зн а ч ен и й ,
сим волов , ед и н и ц и терм и н о в

БГКП бактерии группы кишечной палочки


БФСБ флюорогенный селективный бульон
с бриллиантовым зеленым
ГЭ гастроэнтерит
ДАКП диффузно-агрегирующие кишечные палочки
КМАФАнМ количество мезофильных аэробных и факультативно
анаэробных микроорганизмов
КОЕ колониеобразующая единица
ЛПС липополисахарид
М УГ (M U G ) 4 - метилумбеллиферил -р-Д-глюкуронид
ОКБ общие колиформные бактерии
ОИ оппортунистические инфекции
ОКИ острые кишечные инфекции
ОКЗ острые кишечные заболевания
ПБДЭ пластины биохимические, дифференцирующие
энтеробактерии
ПГЖ панкреатический гидролизат желатина
ПГК панкреатический гидролизат казеина
ПГРМ панкреатический гидролизат рыбной муки
ПТИ пищевая токсикоинфекция
СИБ системы индикаторные бумажные для идентификации
микроорганизмов
СПМ санитарно-показательные микроорганизмы
ТГК триптический гидролизат казеина
ТКБ термотолерантные колиформные бактерии
ТУ технические условия
УПЭ условно-патогенные энтеробактерии
Ф Б У Н ГНЦ
ПМБ - Федеральное Бюджетное учреждение науки
«Государственный научный центр прикладной
микробиологии и биотехнологии»
ЭАгКП энтероагрегирующие кишечные палочки
ЭГКП энтерогеморрагические кишечные палочки
ЭИКП энтероинвазивные кишечные палочки
ЭПКП энтеропатогенные кишечные палочки
ЭТКП энтеротоксигенные кишечные палочки
IP T G изопропил-р^1-тиогалактопиранозид
Salmon-GAL 6-хлор-3-индолил-р^-галактопиранозид
SDS натрия лаурил сульфат (Sodium dodecyl sulfate)
X-G LU C 5- бром-4-хлор-3-индолил-р^-глюкуронид

5
гло ссари й

А в т о л и з (от авто... и греч. lysis - разложение, распад) - саморастворе­


ние тканей и клеток под действием их собственных гидролитических
ферментов.
А вто ли зят - водорастворимая часть смеси, белкового продукта, способ­
ного к автолизу (автолизат дрожжей, селезенки, рыбы и др.).
Агар-агар (от малайского «agar» - желе, англоязычные синонимы -
kan-ten, china grass, Japanese isinglass) - продукт, получаемый из экстракта
красных и бурых водорослей, произрастающих в Белом море и Тихом
океане; самый сильный желирующий продукт растительного происхожде­
ния, способный формировать гель при гораздо меньших концентрациях,
чем желатин. Гель из агар-агара застывает при температуре 38-45°C и
плавится при температуре 85-90°C .
Агглютинация (лат. agglutination - приклеивать, прилепить) - склеива­
ние в глыбки (комочки) микробов, эритроцитов или других клеточных
элементов и выпадение их в присутствии электролитов в осадок. Различают
А. специфическую, в основе которой лежит взаимодействие антигена с го­
мологичным антителом, содержащимся в организме животного, которому
был введен данный антиген (иммуноагглютинация); неспецифическую
(химическую), возникающую от изменения pH среды, концентрации элек­
тролитов; спонтанную, которую наблюдают при суспендировании бактерий
(находящихся в R-форме) в физиол. р-ре и при нагревании, что связано
с изменением коллоидного состояния бактериальной клетки. Антиген,
участвующий в А., наз. агглютиногеном, антитело - агглютинином, образу­
ющийся осадок - агглютинатом. При образовании агглютината имеет зна­
чение количественное соотношение антигена и антител (феномен оптиму­
ма). При избытке или недостатке антител происходит задержка А.
Азотистые основания (пурины и пиримидины) - азотсодержащие гете­
роциклические соединения, входящие в состав нуклеиновых кислот.
А м инокислоты - карбоновые кислоты с аминогруппой в ^-положении,
составные элементы белков.
Безопасность пищевой продукции - состояние пищевой продукции,
свидетельствующее об отсутствии недопустимого риска, связанного с
вредным воздействием на человека и будущие поколения.
Бактериологическая питательная среда (англ. Culture media o f Microbi­
ology) - субстрат, состоящий из компонентов, обеспечивающих необходи­
мые условия для культивирования микроорганизмов или накопления
продуктов их жизнедеятельности в искусственных условиях.
Бактериологический метод - метод, основанный на выделении чистой
культуры возбудителя и его дальнейшей идентификации, т.е. установле­

6
ния видовой принадлежности по морфологическим, тинкториальным,
культуральным, биохимическим, серологическим свойствам, отношению
к бактериофагам, бактериоцинам и т.д.
Бактериофаг (бактери[и] + греч. phagos - пожирающий) - вирус, ин­
фицирующий бактерии. Бактериофаги, подобно другим вирусам, являют­
ся абсолютными внутриклеточными паразитами, и их размножение про­
исходит в живой клетке, приводит к лизису клетки.
Белки - это биологические молекулы, участвующие практически во
всех процессах, протекающих в живых системах. Они служат катализато­
рами разнообразных биохимических реакций, осуществляют транспорт
веществ внутри клетки и между клетками, регулируют проницаемость
клеточных мембран, являются строительными блоками. Основной струк­
турной единицей белков являются аминокислоты.
Бельтинг (от англ. belting - приводной ремень) - тяжелая, очень плот­
ная и прочная техническая хлопчатобумажная ткань, изготовляемая
в виде приводных ремней. Получают техническую ткань бельтинг ГО СТ
332-91 из хлопчатобумажной крученой пряжи способом полотняного пе­
реплетения. Используется в качестве фильтровального материала.
Биомасса - общая масса одного вида микроорганизмов, приходящая­
ся на единицу площади или объема среды культивирования. Выражается
в массе сырого или сухого вещества (г/л и т.д.).
Биотехнология (от греч. bios - жизнь, techne - искусство, мастерство
и logos - слово, учение) - использование живых организмов и биологи­
ческих процессов в промышленном производстве. Биотехнология - меж­
дисциплинарная область, возникшая на стыке биологических, химичес­
ких и технических наук. С развитием биотехнологии связывают решение
глобальных проблем человечества - ликвидацию нехватки продоволь­
ствия, энергии, минеральных ресурсов, улучшение состояния здравоохра­
нения и качества окружающей среды.
Биохимические признаки (свойства) бактерий определяют набором
ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту.
Брак - продукция, передача которой потребителю не допускается из-за
наличия дефектов.
Буферные растворы, буферные системы, буферные смеси - системы,
поддерживающие определенную концентрацию ионов водорода H +,
то есть определенную кислотность среды. Кислотность буферных раство­
ров почти не изменяется при их разбавлении или при добавлении к ним
некоторых количеств кислот или оснований.
В ид - основная таксономическая единица, представляет собой совокуп­
ность особей одного генотипа, обладающих хорошо выраженным феноти­
пическим сходством. Вид подразделяют на подвиды, или варианты.

7
Гидролизат - это продукт, получаемый в процессе гидролиза (расще­
пления) белкового сырья. Гидролиз - один из методов деструкции белков,
в результате происходит разрыв пептидных связей белковой молекулы
в водной среде в присутствии ферментов или кислот (щелочей).
Глубинный способ культивирования - характеризуется тем, что микро­
организмы развиваются во всей толще жидкой питательной среды в спе­
циальных аппаратах (ферментаторах). Метод применим для выращива­
ния как аэробных (аэрация среды обязательна), так и анаэробных микро­
организмов. Во всех случаях проводят перемещение питательной среды
мешалками.
Декантация (от франц. decanter - сцеживать, сливать) - сливание жид­
кости с отстоявшегося осадка. Декантимирование в химической лабора­
торной практике и химической технологии - механическое отделение
твердой фазы дисперсной системы (суспензии) от жидкой путем слива­
ния раствора с осадка.
Иммунопрофилактика инфекционных болезней (далее - иммунопро­
филактика) - система мероприятий, осуществляемых в целях предупре­
ждения, ограничения распространения и ликвидации инфекционных бо­
лезней путем проведения профилактических прививок.
Иммунобиологические лекарственные препараты - лекарственные
препараты, предназначенные для формирования активного или пассивно­
го иммунитета либо диагностики наличия иммунитета или специфическо­
го приобретенного изменения иммунологического ответа на аллергизи-
рующие вещества. К иммунобиологическим лекарственным препаратам
относятся вакцины, анатоксины, токсины, сыворотки, иммуноглобулины
и аллергены;
Ингибирование роста - снижение скорости роста и изменение метабо­
лизма микроорганизмов при наличии в питательной среде отрицательно
действующих биологически активных веществ.
Ингибировать (лат. inhibere - задерживать) - замедлять или предотвра­
щать течение какой-либо реакции: например, синтеза ДНК, РНК или бел­
ков.
Индикатор (лат. indicator - указатель) - соединение, позволяющее ви­
зуализировать изменение концентрации какого-либо вещества или ком­
понента, например, в растворе при титрировании, или быстро определить
pH, Eh.
Инокулят (inoculum, лат. inoculation - прививка) - 1) определенная по
объему и массе доза материала (культуры клеток, вакцины, патологиче­
ского субстрата и др.), которая вводится в биологическую систему (жи­
вотный организм, питательную среду, культуру клеток и др.). Процесс
введения И. называют инокуляцией; 2) суспензия клеток, являющаяся

8
исходной для наращивания клеточной культуры и используемая для
первоначального посева на питательную среду. Для получения жидких
культур объем И. составляет обычно 4 -1 0 % от объема питательной
среды.
Инфекционные заболевания - инфекционные заболевания человека,
возникновение и распространение которых обусловлено воздействием на
человека биологических факторов среды обитания (возбудителей инфек­
ционных заболеваний) и возможностью передачи болезни от заболевшего
человека, животного к здоровому человеку.
Инфекционные заболевания, представляющие опасность д л я окру­
жающих - инфекционные заболевания человека, характеризующиеся тя­
желым течением, высоким уровнем смертности и инвалидности, быстрым
распространением среди населения (эпидемия).
Качество бактериологических питательных сред ( о сн о в , добавок) -
совокупность свойств продукции, обусловливающих ее способность удо­
влетворять определенным требованиям в соответствии с назначением.
К о ло ни я - это популяция микробных клеток одного вида, сформиро­
вавшаяся в результате деления одной микробной клетки в условиях
культивирования на плотной питательной среде при оптимальной тем­
пературе.
К онтаминация (от лат. contamination - смешение) - попадание загряз­
нителей в образец, культуру, питательную среду; в микробиологии - засо­
рение (загрязнение) посторонними микроорганизмами.
Культуральная ж и д к о с ть (англ. culture liquid) - сложная многофазная
система, содержащая питательные вещества, исследуемые микроорга­
низмы и продукты их жизнедеятельности.
Л имит (франц. limite от лат. limes - предел) - предел, ограничение;
предельная норма чего-либо.
Лимитирование роста - ограничение роста микроорганизмов каким-
либо фактором или их суммой.
Медицинскими изделиями являются любые инструменты, аппараты,
приборы, оборудование, материалы и прочие изделия, применяемые в ме­
дицинских целях отдельно или в сочетании между собой, а также вместе
с другими принадлежностями, необходимыми для применения указанных
изделий по назначению, включая специальное программное обеспечение,
и предназначенные производителем для профилактики, диагностики, ле­
чения и медицинской реабилитации заболеваний, мониторинга состояния
организма человека, проведения медицинских исследований, восстанов­
ления, замещения, изменения анатомической структуры или физиологи­
ческих функций организма, предотвращения или прерывания беременно­
сти, функциональное назначение которых не реализуется путем фармако­

9
логического, иммунологического, генетического или метаболического
воздействия на организм человека. Медицинские изделия могут призна­
ваться взаимозаменяемыми, если они сравнимы по функциональному на­
значению, качественным и техническим характеристикам и способны за­
менить друг друга.
Метаболизм - обмен веществ.
Настой - вытяжка из растительного или животного сырья, полученная
путем водного извлечения из сырья активного питательного начала.
Нативный (от лат. nativus - врожденный) - в биологии - находящийся
в природном состоянии, немодифицированный, сохранивший структуру,
присущую ему в живой клетке (напр., нативный белок).
Национальный календарь профилактических прививок - норматив­
ный правовой акт, устанавливающий сроки и порядок проведения гражда­
нам профилактических прививок.
Осадок - совокупность твердых частиц с заполняющей их поры жид­
костью.
Особо чистое вещество («О С Ч ») - квалификация установлена для
веществ высокой чистоты. К особо чистым относятся вещества более вы ­
сокой степени чистоты по сравнению с соответствующими химическими
реактивами высшей из существующих квалификаций. Особо чистые ве­
щества содержат примеси в таком незначительном количестве, что они не
влияют на основные специфические свойства веществ. число и концен­
трация примесей в отдельных особо чистых веществах различны и опреде­
ляются, с одной стороны, потребностями практики, а с другой - достиже­
ниями препаративной и аналитической химии. Цвет полосы на упаковке
ОСч-реактивов - желтый.
Оценка результатов - определение положительного или отрицательно­
го результата.
Параметр - в технике величина, характеризующая какое-либо свойство
процесса, явления, системы, технического устройства. Например, для те­
пловых процессов П. служат теплоемкость, тепловой поток, температур­
ный напор и т.д.
Пастеризация - процесс одноразового нагревания чаще всего жидких
продуктов или веществ при температуре до 60°С в течение 60 минут или
при температуре 70-80°С в течение 30 мин.
Пептон - продукт неполного гидролиза белков, состоящий главным об­
разом из смесей различных полипептидов; содержит также ди- и трипеп-
тиды, свободные аминокислоты.
Питательная среда - однокомпонентный или многокомпонентный суб­
страт, применяемый для культивирования микроорганизмов или культур
клеток высших организмов.

10
Пермеат ( или фильтрат) - это часть потока протекаемой очищенной
жидкости, которая в качестве прозрачной фракции проходит через мем­
браны.
Показатель качества (продукции) - это характеристика одного или не­
скольких свойств продукции, входящих в ее качество, рассматриваемая
применительно к определенным условиям ее создания и эксплуатации или
потребления. Каждая продукция обладает своей номенклатурой показате­
лей, которая зависит от назначения продукции, условий ее производства и
эксплуатации и многих других факторов. Показатель качества может вы ­
ражаться в различных физических единицах измерения (например, секун­
да, метр, кв. метр, куб. метр, км/ч, грамм, вольт, ватт и др.), условных едини­
цах измерения (балл, рубль, FLO PS, процент избирателей и др.), а также
быть безразмерным (вероятность наступления ожидаемого события и др.).
В виде технических требований показатели входят в состав технического
задания на разрабатываемую продукцию и технических условий.
Пребиотики - пищевые вещества, избирательно стимулирующие рост и
(или) биологическую активность представителей защитной микрофлоры
кишечника человека, способствующие поддержанию ее нормального со­
става и биологической активности при систематическом потреблении в
составе пищевой продукции.
Пробиотические микроорганизмы - живые непатогенные и нетокси-
генные микроорганизмы - представители защитных групп нормального
кишечного микробиоценоза здорового человека и природных симбиоти­
ческих ассоциаций, поступающие в составе пищевой продукции для улуч­
шения (оптимизации) состава и биологической активности защитной
микрофлоры кишечника человека.
Процесс технологический - последовательные и закономерные качест­
венные изменения в сырье, полуфабрикатах, изделиях, приводящие к по­
явлению продукта с новыми свойствами.
Разведение культуры - величина, указывающая, во сколько раз была
разведена суспензия культуры в отношении исходной, соответствующей
10 ед. по отраслевому стандартному образцу мутности (О С О -42-28-85 П).
Раствор - гомогенная (однородная) смесь, состоящая из частиц раство­
ренного вещества, растворителя и продуктов их взаимодействия. «Гомо­
генный» - значит, каждый из компонентов распределен в массе другого
в виде своих частиц, то есть атомов, молекул или ионов.
Ретентант ( или концентрат) - это часть потока жидкость, которая
задерживается и не проходит через мембраны.
Санация - совокупность процедур очистки и стерилизации, обеспе­
чивающих состояние системы, гарантирующее сохранение свойств про­
дукции в пределах соответствующих нормативных документов.

11
Санитарно-противоэпидемические (профилактические) мероприя­
тия - организационные, административные, инженерно-технические,
медико-санитарные, ветеринарные и иные меры, направленные на устра­
нение или уменьшение вредного воздействия на человека факторов среды
обитания, предотвращение возникновения и распространения инфекци­
онных заболеваний и массовых неинфекционных заболеваний (отравле­
ний) и их ликвидацию.
Санитарно-эпидемиологическое заключение - документ, выдаваемый
в установленных настоящим Федеральным законом случаях федеральны­
ми органами исполнительной власти, уполномоченными на осуществле­
ние федерального государственного санитарно-эпидемиологического над­
зора, и удостоверяющий соответствие или несоответствие санитарным
правилам факторов среды обитания, условий деятельности юридических
лиц, граждан, в том числе индивидуальных предпринимателей, а также
используемых ими территорий, зданий, строений, сооружений, помеще­
ний, оборудования, транспортных средств (абзац в редакции, введенной
в действие с 21 октября 2011 г. Федеральным законом от 19 июля 2011 г.
N 248-Ф З ).
Санитарно-эпидемиологическое благополучие населения - состояние
здоровья населения, среды обитания человека, при котором отсутствует
вредное воздействие факторов среды обитания на человека и обеспечива­
ются благоприятные условия его жизнедеятельности.
Санитарно-эпидемиологическая обстановка - состояние здоровья на­
селения и среды обитания на определенной территории в конкретно ука­
занное время.
Серия препарата - количество препарата, полученного в результате
смешивания сухих компонентов питательной среды в мельнице-смесителе
или сушки жидкого полуфабриката (для сухих питательных сред) при
одноразовой закладке. Для жидких или агаризованных питательных сред,
готовых к применению, под серией препарата подразумевают совокуп­
ность емкостей, полученных из полуфабриката одной емкости.
Сертификат - документ, удостоверяющий качество товара.
Система менеджмента качества (С М К ) - совокупность организацион­
ной структуры, методик, процессов и ресурсов, необходимых для общего
руководства качеством. Она предназначена для постоянного улучшения
деятельности, для повышения конкурентоспособности организации на на­
циональном и мировом рынках, определяет конкурентоспособность любой
организации, является частью системы менеджмента организации.
Стерилизация (от лат. sterilis - бесплодный) - уничтожение всех видов
микроорганизмов и их спор на поверхности и внутри различных предме­
тов, а также в жидкостях и в воздухе.

12
Техническое вещество («тех.») - низшая квалификация реактива.
Содержание основного компонента выше 70%. Цвет полосы на упаковке -
светло-коричневый.
Технология (от греч. techne - искусство, мастерство, умение и logos -
мысль, причина) - совокупность приемов и способов получения, обработ­
ки или переработки сырья, материалов, полуфабрикатов или изделий,
используемых в какой-либо отрасли деятельности, а также научное описа­
ние способов технического производства.
Тиндализация - способ стерилизации, предложенный Дж. Тиндалем.
Заключается в дробной обработке жидкостей и пищевых продуктов в те­
кучем паре при температуре 100°C или при трех- четырехкратном нагрева­
нии их до температуры 100-120°C с промежутками в 24 ч. За это время
споры бактерий, выжившие при температуре 100°C, прорастают, и вышед­
шие из них вегетативные клетки бактерий погибают при последующем
нагревании.
Титрование (франц. titre - качество, характеристика) - один из методов
количественного анализа, основанный на измерении количества реагента,
который полностью реагирует с анализируемым веществом.
Точная навеска - взвешивание на аналитических весах с точностью до
0,0002 г. Если не указано «точная навеска», то навеску берут с точностью
до 0,01 г.
Уровень действия - значение контролируемого параметра, превыше­
ние которого указывает на то, что процесс вышел за рамки нормальных
рабочих условий. Достижение уровня действия указывает на то, что не­
обходимо предпринять корректирующее вмешательство для приведения
технологического процесса в норму.
Факторы среды обитания - биологические (вирусные, бактериальные,
паразитарные и иные), химические, физические (шум, вибрация, ультра­
звук, инфразвук, тепловые, ионизирующие, неионизирующие и иные из­
лучения), социальные (питание, водоснабжение, условия быта, труда, от­
дыха) и иные факторы среды обитания, которые оказывают или могут
оказывать воздействие на человека и (или) на состояние здоровья буду­
щих поколений.
Фенотип - совокупность проявляющихся признаков клетки (организ­
ма, индивидуума).
Фильтрат - жидкость, пропущенная через фильтр.
Химически чистое вещество («х.ч.») - высшая степень чистоты реакти­
ва. Содержание основного компонента более 99%. Цвет полосы на упаков­
ке - красный.
Чистая культура - масса клеток, состоящая из микроорганизмов, при­
надлежащих одному виду и полученных как потомство одной клетки.

13
Чистую культуру обычно получают путем пересева на стерильную плот­
ную питательную среду клеток, взятых из изолированной колонии бакте­
рий. Культуральные свойства бактерий устанавливаются по морфологии
колоний и особенности роста культуры на питательных средах.
Чистое вещество («ч.») - содержание основного компонента (без при­
месей) 98% и выше. Цвет полосы на упаковке - зеленый.
Чистое вещество д л я анализа («ч.д.а.») - содержание основного компо­
нента может быть выше или значительно ниже 98%, в зависимости от об­
ласти применения. Примеси не превышают допустимого предела, позво­
ляющего проводить точные аналитические исследования. Цвет полосы на
упаковке - синий.
Штамм (от нем. stamm, буквально - «ствол», «основа») - чистая куль­
тура вирусов, бактерий, других микроорганизмов или культура клеток,
изолированая в определенное время и в определенном месте.
Экстракт (от лат. extractus - вытянутый, извлеченный) - концентриро­
ванный настой или вытяжка.

14
предисловие

Клиническое значение различных представителей семейства Entero-


bacteriaceae далеко неравнозначно. Общеизвестные возбудители дизенте­
рии ( Shigella flexneri, Shigella sonnei, Shigella dysenteriae, Shigella boydii),
брюшного тифа (Salmonella typhi), паратифов (Salmonella typhimurium,
Salmonella enteritidis) в последнее время нередко являются причиной вну­
трибольничных вспышек инфекции. Контаминация пищевых продуктов
сальмонеллами, эшерихиями, бактериями рода Proteus, а также другими
условно-патогенными энтеробактериями может стать причиной пищевых
токсикоинфекций [40].
В Российской Федерации ежегодно регистрируется 3 1 -3 2 млн случаев
инфекционных заболеваний различной этиологии. Острые кишечные
инфекции (О К И ) занимают второе место во всем мире по заболеваемости
и уровню наносимого экономического ущерба, уступая только острым
респираторным заболеваниям. По данным ВОЗ, около 70% всех случаев
ОКИ имеют вирусное происхождение и 30% бактериальную природу.
Несмотря на принимаемые в Российской Федерации меры, направлен­
ные на борьбу с инфекционными болезнями, уровни заболеваемости ОКИ
остаются высокими [35, 36, 78, 136]. Особую тревогу вызывает удельный
вес ОКИ, вызванных возбудителями неустановленной этиологии, кото­
рый в течение последних 7 лет составляет от 62% до 69%, что особенно
важно на фоне многолетней тенденции к росту показателей этой нозоло­
гии [6 9 -7 0 , 72].
Полиэтиологичность ОКИ, сходная клиническая симптоматика, нали­
чие стертых форм заболеваний диктуют необходимость проведения ис­
следований, не упуская возможности выделения любого представителя
семейства Enterobacteriaceae. Бактериологическое исследование имеет
важное значение для своевременного и правильного лечения и проведе­
ния противоэпидемических мероприятий. Важнейшим условием эффек­
тивности бактериологических исследований является адекватный выбор
и качество питательных сред [87, 89]. Они позволяют определить таксоно­
мически значимые признаки выросших культур микроорганизмов, а сле­
довательно, и правильно их идентифицировать.
Производство сухих коммерческих дифференциально-диагностических
питательных сред в России долгие годы базировалось на панкреатическом
гидролизате кильки каспийской, гидролизатах казеина и пептоне фермен­
тативном [38, 41, 48, 68, 95].

15
Научные исследования в области разработки питательных сред
в Ф Б У Н ГНЦ ПМБ начинались в 80-е годы х х столетия [1, 127, 128].
В основу разработок была заложена идея производства питательных
сред на основе панкреатического гидролизата рыбной муки (П ГРМ ),
технология производства которого была разработана в 1 990-1991 гг.
В настоящее время ПГРМ широко используется в составе питательных
сред для выделения и дифференциации энтеробактерий, для диагности­
ки особо опасных инфекций, дисбиотических состояний, выделения
дифтерии, контроля микробной загрязненности нестерильных лекар­
ственных средств и т.д. [13, 3 2 -3 4 , 121, 126].
Номенклатура питательных сред, выпускаемых в России, составляет
около 200 наименований, тогда как каждая из ведущих зарубежных фирм
(M erck (Германия), Oxoid (Англия), Bio-Merieux (Франция), Becton
Dickinson (СШ А ), HiMedia (Индия) и др.) [82, 102, 148, 158, 163, 168-170]
выпускает по 3 0 0 -5 0 0 наименований сред. Недостаточный ассортимент
сред в нашей стране приводит к практике их лабораторного изготовления,
что, естественно, сказывается на их качестве и стандартности.
Питательные среды для выделения определенного круга микроорганиз­
мов кишечника, прежде всего представителей семейства энтеробактерий,
являются наиболее востребованными и в достаточно широком ассорти­
менте производятся отечественной промышленностью [90, 126, 129].

Приносим искреннюю благодарность за помощь в работе над книгой


сотрудникам ФБУН ГНЦ ПМБ: Марчихиной И.И., Полосенко О.В.,
Шолоховой Л.П., Домотенко Л.В., Ажермачевой Н.И., Сергеевой А.Б.

16
i . общая характеристика бактерий
семейства ENTERQBACTERIACEAE

Семейство Enterobacteriaceae достаточно обширно; оно объединяет раз­


ные по своим свойствам бактерии.
История открытия различных представителей семейства Enterobac­
teriaceae тесно связана с «золотой эрой» микробиологии - временем осно­
вополагающих открытий Р.Коха, Л.Пастера. И.И.Мечникова, А.Иерсена,
Ш.Китазато, Э.Ру, Т.Эшериха, К. Шиги и других выдающихся микробио­
логов. Первый представитель семейства Serratia marcescens был открыт
Б.Базио еще в 1823 г., а типовой вид Escherichia coli - только через 62 года.
В 1893 г. Т.Смит обнаружил, что большинство грамотрицательных ки­
шечных бактерий можно разделять по способности ферментировать лак­
тозу. При этом лактозо-положительные виды чаще выделяли из испраж­
нений здоровых лиц, а лактозо-отрицательные - при кишечных инфекци­
ях. Обыкновенная кишечная палочка, тогда известная как Bacterium coli
commuis, ферментировала лактозу, что послужило основанием для появле­
ния термина «колиформные бактерии».
Свою современную историю семейство кишечных бактерий ведет
с 1937 г., когда О.Ран объединил группу бактерий со схожими морфологи­
ческими и биохимическими признаками в род Enterobacter, включавший
112 видов. Однако лишь через 21 год решением Международного комите­
та по номенклатуре бактерий было официально утверждено название
семейства Enterobacteriaceae, а его типовым родом был признан род
Escherichia. Уже через два года после предложения О.Рана V издание
«Определителя бактерий Д.Берджи» относило к энтеробактериям вместо
112 видов лишь 67, а V II издание (1974 г.) - лишь 37 [85].
За период, прошедший после выхода в 1984 г. первого издания «Bergey’s
Manual of Systematic Bacteriology», состав семейства Enterobacteriaceae
существенно расширился. Переклассифицированы, в основном с позиций
геносистематики, многие виды известных родов. Были открыты новые
виды энтеробактерий.
Таксономическое определение семейства Enterobacteriaceae, представ­
ленное в руководстве «Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology» (1984),
также сохраняет значение. «Семейство Enterobacteriaceae - это грамотри-
цательные тонкие палочки 0,3—1,0 х 0,6—1,0 мкм, подвижные перитрихи
(кроме Tatumella) или неподвижные. Они не образуют эндоспоры или
микроцисты, не кислотоустойчивы. Растут в присутствии кислорода или

17
Таблица 1. Р оды и виды бактерий семейства E n te ro b a c t e r ia c e a e , имеющие важное
эпидемиологическое и клиническое значение
Р од В ид

Budvicia B. aquatica
Buttiauxella B. agrestis, B. brennerae, B. ferragutiae, B. gaviniae, B. izardii, B. noackiae, B. warmboldiae
Cedecea C. davisae, C. lapagei, С. neteri
Citrobacter C. amalonaticus, C. freundii, C. diversus, С. farmer, C. sedlakii, C. rodentium, C. youngae,
C. braakii, C. werkmanii, C. gillenii, C. murliniae
Cronobacter C. sakazakii subsp. Sakazakii, C. sakazakii subsp. Malonaticus, C. dublinensis subsp.
Dublinensis, C. dublinensis subsp. lactaridi, C. dublinensis subsp. lausannensis,
C. turicensis, C. muytjensis
Edwardsiella E. tarda, E. hoshinae, E. ictaluri, E. tarda биогруппа 1
Enterobacter E. cloacae subsp. cloacae, E. cloacae subsp. dissolvens, E. amnigenus биогруппа 1,
E. amnigenus биогруппа 2, E. asburiae E. gergoviae, E. Hormaechei, E. nimipressuralis,
E. cancerogenus, E. pyrinus, E. kobei, E. helveticus, E. pulveris, E. turicensis
Escherichia E. coli, E. albertii, E. fergusonii, E. hermanii, E. vulneris
Ewingella E. americana
Hafnia H. alvei, H. alvei биовар 1, H. paralvei
Klebsiella K. oxytoca, K. pneumoniae subsp. pneumoniae, K. pneumoniae subsp. ozaenae,
K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis, K. mobilis, K. granulomatis, K. singaporensis,
K. variicola
Kluyvera K. ascorbata, К. cryocrescens, K. intermedia, K. georgiana
Leclercia L. adecarboxylata
Leminorella L. grimontii
L. richardii
Moellerella М. wisconsensis
Morganella M. morganii subsp. morganii, M. morganii subsp. sibonii, M. morganii биовар 1,
M. psychrotolerans
Pantoea P. agglomerans, P. dispersa
Plesiomonas P. shigelloides
Pragia P. fontium
Proteus P. vulgaris, P. mirabilis, P. myxofaciens, P. penneri
Providencia P. alcalifaciens, P. heimbachae, P. rettgeri, P. rustigianii, P. stuartii
Rahnella R. aquatilis
Raoultella R. planticola, R. terrigena, R. ornithinolytica
Salmonella S. bongori, S. enterica subsp. enterica, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp.
diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. indica, S. enterica subsp. salamae,
S. subterranean
Serratia S. marcescens subsp. marcescens, S. marcescens subsp. sakuensis, S. liquefaciens,
S. proteamaculans, S. ficaria, S. fonticola, S. grimesii, S. plymuthica, S. rubidaea,
S. odorifera биогруппа 1, S. odorifera биогруппа 2, S. urealytica, S. quinivorans
Shigella S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei
Shimwellia S. blattae, S. pseudoproteus
Yersinia Y enterocolitica subsp. enterocolitica, Y. enterocolitica subsp. palearctica, Y. pseudotuberculosis,
Y. pestis, Y. frederiksenii, Y. kristensenii, Y. intermedia, Y. mollaretii, Y. rohdei, Y. ruckeri,
Y. aldovae, Y. bercovieri, Y. aleksiciae, Y. massiliensis, Y. similis
Yokenella Y. regensburgei

18
без него. Хорошо развиваются в пептонных и мясных средах, обычно на
среде Мак Конки. Некоторые используют D-глюкозу как единственный
источник углерода, другие требуют в качестве добавок витамины и (или)
аминокислоты. Питание осуществляют за счет органических соединений;
механизм метаболизма дыхательный и ферментативный. Не галлофилы.
При ферментации D -глюкозы, других углеводов и многоатомных спиртов
продуцируют кислоты и видимые объемы газа. Каталазоположительны,
за исключением Shigella dysenteriae серовара 1 и Xenorhabdus nematophilus,
оксидазонегативны. Нитраты редуцируют в нитриты, за исключением не­
которых штаммов Erwinia и Yersinia. Содержание Г+Ц в ДНК 3 8 -6 0 моль%.
ДНК видов, принадлежащих к большинству родов, родственны между
собой не более чем на 20%. Такая же степень родства и к Escherichia
coli - типовому виду всего семейства. Исключение составляют некоторые
виды Yersinia, Proteus, Providencia, Hafnia, Edwardsiella, ДНК которых
имеют 10-20% родства с ДНК видов, принадлежащих к другим родам.
Все изученные виды содержат энтеробактериальный общий антиген (СА),
кроме Erwinia chrysanthemi. Типовой род - Escherichia Castellani и
Chalmere 1919 - определен Юридической комиссией Международного
комитета систематической бактериологии в 1958 году». Бактерии
Plesiomonas shigelloides, включенные в семейство энтеробактерий, имеют
оксидазу; бактерии Serratia marcescens subsp. sakuensis имеют эндоспоры.
Согласно второму изданию руководства «Bergey’s Manual of Systematic
Bacteriology (2005), бактерии семейства Enterobacteriaceae входят в домен
Bacteria, тип - Proteobacteria, класс - Gammaproteobacteria, порядок -
Enterobacteriales [96].
От 80 до 95% всех выделенных в клинической практике штаммов семей­
ства Enterobacteriaceae составляют Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli,
Proteus mirabilis. Роды и виды бактерий семейства Enterobacteriaceae,
имеющие важное эпидемиологическое и клиническое значение [96, 114],
представлены в табл. 1.
Классификация (а нередко и номенклатура) многих даже хорошо изу­
ченных родов окончательно еще не установлена и постоянно совершен­
ствуется на основе новых научных данных [46].

19
2. медицинское значение
энтеробактерий

По критериям болезнетворности семейство Enterobacteriaceae включа­


ет практически все категории микроорганизмов. Среди них выделяют
облигатные патогены, обязательно вызывающие заболевания после по­
падания в организм человека (например, Yersinia pestis или Salmonella
typhi). Наибольшую группу составляют условно-патогенные виды, адап­
тированные к обитанию в нестерильных областях организма и входящие
в состав нормальной микрофлоры. Их вирулентный потенциал весьма
вариабелен, но они выступают частыми возбудителями поражений у че­
ловека (например, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli или Proteus
vulgaris). Очень редко поражения у человека вызывают свободножи­
вущие виды, изредка попадающие в организм человека и вызывающие
поражения только при выраженных нарушениях его резистентности
(например, Yokenella regensburgei или Rahnella aquatilis). Семейство
также включает виды, не способные вызывать какой-либо инфекцион­
ной патологии, поскольку условия для их существования в организме
человека просто отсутствуют (например, Budvicia aquatica Xenorhabdus
nematophilus) [85].
Медицинскую значимость энтеробактерий определяет их способность
колонизировать кишечник человека и вызывать острые кишечные инфек­
ции, такие как брюшной тиф и паратифы, бактериальную дизентерию,
различные гастро- и колиэнтериты. Среди их возбудителей по-прежнему
лидируют сальмонеллы и шигеллы [87, 89, 114, 138].
В последние десятилетия одной из проблем здравоохранения разных
стран стали заболевания, вызванные эшерихиями. Роль кишечных патоге­
нов в патологии человека выросла в крупную проблему, и сложность ее
решения заключается в отсутствии четких критериев определения потен­
циальной способности кишечных патогенов вызывать болезненный про­
цесс, недостаточно изучены особенности эпидемиологии и профилактики
острых кишечных заболеваний, вызываемых энтеробактериями. Условно­
патогенные бактерии являются нормальными обитателями различных
областей и органов тела человека. При снижении резистентности организ­
ма и при определенных эпидемиологических условиях они могут вызы­
вать инфекции различного происхождения. Патогенность большинства
энтеробактерий обусловлена их способностью вырабатывать термола­
бильные и термостабильные энтеротоксины.

20
Среди диареегенных эшерихий в зависимости от наличия тех или иных
факторов патогенности и механизмов, лежащих в основе возникновения и
развития патологического процесса, классифицируют классические энтеро­
патогенные серотипы (ЭПКП). Энтеропатогенные эшерихии являются при­
чиной заболеваний с преимущественным поражением тонкой кишки у груд­
ных детей (колиэнтерит у детей раннего возраста). Энтеротоксигенные раз­
новидности продуцируют термолабильный и/или термостабильный токсины
(ЭТКП). Энтеротоксигенные кишечные палочки вызывают «диарею путеше­
ственников»; при этом в странах третьего мира за последние 2 0 -2 5 лет их
этиологическая роль возросла. Энтероинвазивные (ЭИКП) способны по­
вреждать и размножаться в клетках кишечного эпителия (по этому признаку
сходны с шигеллами); энтерогеморрагические (ЭГКП ) вызывают у детей и
взрослых геморрагический колит и продуцируют веротоксин и шига-подоб-
ный токсин. Различают также энтероагрегирующие (ЭАгКП) и диффузно­
агрегирующие (ДАКП) E. coli [37, 76, 85, 93, 98, 114, 147, 164].
В настоящее время доказано, что и другие условно-патогенные энтеро­
бактерии (Citrobacter, Hafnia, Serratia, Enterobacter, Morganella и др.) при
определенных условиях могут стать причиной воспалительных процес­
сов: отитов, менингитов, холециститов, энтероколитов, внутрибольнич­
ных инфекций [114].
Представители семейства Enterobacteriaceae играют важную роль в раз­
витии оппортунистических инфекций (О И ) мягких тканей. Являясь ки­
шечными комменсалами, при проникновении в другие места обитания
многие энтеробактерии проявляют патогенные свойства и вызывают ин­
фекционные поражения различной тяжести. Энтеробактерии снабжены
множеством факторов патогенности, способствующих их адгезии к эпите­
лию, повреждающих эукариотические клетки и индуцирующих синтез
противовоспалительных цитокинов [10, 85].
Первоначальное представление о принадлежности микроорганизма
к семейству Enterobacteriaceae формируется на основании изучения его
морфологии и отношения к окраске по Граму. Морфология энтеробакте­
рий сходна, основные различия между ними заключаются в ферментатив­
ных свойствах и антигенной структуре. Способность ферментировать
глюкозу, восстанавливать нитраты до нитритов, утилизировать углеводы
по ферментативному типу и отсутствие фермента оксидазы отличают
энтеробактерии от других грамотрицательных бактерий палочковидной
формы, имеющих значение в патологии человека [114].
В патогенезе поражений, вызываемых энтеробактериями, имеют значе­
ние липополисахарид (Л П С ) (эндотоксин, освобождающийся при разру­
шении бактерий), различные энтеротоксины, факторы инвазивности и
адгезии (жгутики и др.), а также ферменты патогенности.

21
Небольшое число признаков, выявляемых у культур энтеробактерий
на этапе первичной идентификации, не позволяет достоверно опреде­
лить их родовую принадлежность. Обычно по сочетанию биохимических
признаков на средах первичной идентификации (комбинированных)
можно заподозрить одновременно несколько ( 3 - 6 ) родов энтеробакте­
рий. В связи с этим для установления родовой принадлежности изучае­
мой культуры следует провести дифференциацию родов, т.е. использо­
вать соответствующие тесты из минимального дифференцирующего
ряда (табл. 2) [59].

Таблица 2. Дифференциация р о д о в ы х групп E n t e r o b a c t e r i a c e a e по биохимическим


свойствам при использовании минимального дифференцирующего ряда

-8
fc
$
Комбинирован- Сероводород + + + +
ная среда Лактоза* +, - - - ,+ Х + + - ,+ - ,+ - - -
Глюкоза (газ)* +, - - +, - + + + +, - - ,+ +, - - +
Мочевина - - - Х - (+), - х +, - + -
(+)
Минимальный Мочевина Х (+), (+), Х +, - +
дифференци­ (по Преусу или +
- - - - -
рующий ряд Кристенсену)**
Подвижность +, - - +, - + - + х + +, - - +
Индол + + + + + х +
Фенилаланин- - - - - - - - - + - -
дезаминаза
Цитрат Симонса - - +, - + + + х + х - -
Ацетат натрия + - Х х + + х х Х Х
(+) (+)
Лизиндекар­ +, - - +, - - + - ,+ + + - - +
боксилаза
Орнитинде- Х - ,+ + Х - + + + - ,+ Х +
карбоксилаза
Среда Кларка + + + + - , + - + Х + + +
реакция
с метиловым
красным
Реакция Фогеса- - - - - +, - + х х - - -
Проскауэра
Сорбит х х + + + + - + - ,+ х -
Примечание:
* При получении на комбинированной среде нечетких результатов эти тесты повторяют на отдельных средах
(жидкие или полужидкие среды с лактозой, глюкозой).
** При отсутствии этого субстрата в комбинированной среде или при получении на ней нечетких результатов.
*** Klebsiella pneumoniae.
* * * * Yersiniapestis.

22
При затруднениях в дифференциации прибегают к дополнительной
типизации изучаемой культуры, используя данные о биохимических ха­
рактеристиках родовых групп семейства Enterobacteriaceae (табл. 3) [59].

Таблица 3. Расширенная характеристика биохимических с в о й с т в р о д о в ы х групп


E n te ro b a cteria c ea e
Тест и л и -3 г*.


Escherichia

субстрат -3 >о
2» "3
-3
-3 "3
а 53
1 ^3
*5?
53
•а
е
53 •3 «о
§
•3
а •3

1
о 53
.ър >2» ‘S
05 й ‘С 1 05
8
о. s2 tS
Цитрат Симонса - - +, - + - + + х(37°)* + х - +
+(22°)
Мочевина - - - х - (+), (+), - х +, - + -
+
Малонат натрия - - - + - + - + +, - х - - - х
Фенилаланин- - - - - - - - - - + - х
дезаминаза
Сероводород - - +, - +, - + - - - - +, - - +
Подвижность +, - - +, - + + - + х(37°) + +, - -(37°)
+(22°) +(22°)
Индол +, - - + - - + + - + - - - +, - - -
Реакция + + + + + - + +(37°) +(37°) + +
с метиловым - -(22°) -
красным
Реакция Фогеса- - - - - - +, - + х(37°) х(37°) - - х
Проскауэра +(22°)
Лизиндекар­ +, - - +, - - + + - + + + - - -
боксилаза
Аргининди- х - + (+), + х - - +}- - - - - -
гидролаза
Орнитинде- х - + + х + - + + + - + х -
карбоксилаза
Глютаминовая + + - - - - - - +
кислота
Желатин - - - + - - - - + х - +
(+)
КСИ - - - + + - + + + + + - х
Ацетат натрия +, (+) - х х х + + -, (+) х х х х
Цитрат х - + + + + + + + х
Кристенсена
Целлобиоза - - х х - + + х х х + х
Газообразование +, - - + +, - + + + + х х х - -
из глюкозы
Адонит - + - - - + х - х - + х -
Арабиноза х х + + - + + + - - х +
Глицерин + х + + + - + + + + х
Дульцит х х +, - х - - + х - - - - -
Инозит - + - х - + - + - х - + х
+

23
Таблица 3. Продолжение
Тест и л и
субстрат
-3 >о2»

Escherichia

Salmonella
^3
о
1 53
-«5 •3

Serratia
Shigella
•3

Proteus
53
-«5 •3 3

Hafnia
53
**5?
-С5 8

•§
‘С 1 г« £
Ксилоза х х х + + + + х +, - х х
Лактоза х -, (+) - ,+ х - + + х - ,+ - - х
Мальтоза х х + + + + + + +, - + +
Маннит + +, - + + - + + + + - ,+ + +
Рамноза х х х + - + + + - х +, - +
Рафиноза х х - ,+ х - + + - - - -
Салицин х - - х - + х х + х +, - х
Сахароза х - - + - + + х + х - ,+ х
Сорбит х х + + - + + - + - ,+ х х
Примечание:
* Температура указана по Цельсию (С ).
** Приведены свойства, характерные для K. pneumoniae.
*** Приведены свойства без Y.pestis.
* * * * Приведены свойства, характерные для E m m a herbicola.

Для патогенных, а также для некоторых условно-патогенных энтеро­


бактерий идентификация включает, кроме биохимической, и серологиче­
скую характеристику. Последняя обеспечивает тонкую дифференциацию
энтеробактерий вплоть до определения сероваров и подсероваров. Другие
возможности внутривидовой дифференциации, основывающиеся на осо­
бенностях взаимодействия с препаратами бактериофагов, на феномене
колициногении или определении биоваров, реализуются при наличии со­
ответствующих эпидемиологических показаний [59].

24
з. заболеваемость острыми
кишечными инфекциями

Острые кишечные бактериальные инфекции часто вызываются предста­


вителями семейства Enterobacteriaceae: E. coli, C. freundii, K. spp., K. oxytoca,
E. cloacae, S. marcescens, H. olvei, P. mirabilis. Ведущие возбудители заболева­
ний желудочно-кишечного тракта этого семейства представлены в табл. 4.
Заболевания, вызванные указанными видами, чаще протекают по типу
пищевой токсикоинфекции и инфекционного заболевания (эшерихиозы).
холецистит, панкреатит, аппендицит, перитонит, парапроктит относят
к другой группе оппортунистических инфекций - гнойно-воспалительных.
Исследование отделяемого желудочно-кишечного тракта проводят при
воспалительных процессах различной локализации, которые могут быть
вызваны и представителями нормальной кишечной флоры, и микробами,
попавшими из внешней среды.
Согласно рекомендациям ВОЗ, все наиболее часто встречающиеся
в кале бактериальные патогены семейства Enterobacteriaceae разделены
по уровням приоритетности.
1. Патогены высокого уровня Таблица 4. Ведущие возбудители забо­
леваний желудочно-кишечного тракта
приоритетности:
С / заболевание
и м п то м Бактерии
• S. typhi, S. paratyphi;
Диарея (водная) Escherichia coli
• Shigella spp. Диарея (кровавая) Shigella spp.
2. Патогены среднего уровня Salmonella spp.
приоритетности: Escherichia coli
(энтероинвазивные)
• другие сальмонеллы;
Холецестит Escherichia coli
• Y. enterocolitica.
Enterobacter spp.
3. Патогены низкого уровня при­ Klebsiella spp.
оритетности: Абсцессы печени Escherichia coli
• E. coli (энтеропатогенные, энте- Klebsiella spp
ротоксигенные, энтероинвазивные, Proteus spp.
энтерогеморрагические). Поддиафрагмальный Escherichia coli
абсцесс Klebsiella spp.
Перечень микробов, являющих­
Enterobacter spp.
ся этиологическими агентами оп­
Абсцессы поджелудочной Escherichia coli
портунистических инфекций у че­ железы Enterobacter spp.
ловека, постоянно расширяется по Абсцесс заднего прохода Escherichia coli
мере усовершенствования методов и ректальной области
выделения и идентификации, ис­ Перитонит Escherichia coli

пользуемых в лабораториях, увели­ Enterobacter spp.

25
чения удельного веса иммунокомпрометированных больных, а также в за­
висимости от тяжести и сложности клинических проявлений заболева­
ния. Желудочно-кишечный тракт - наиболее обсемененная экологиче­
ская ниша, которая является резервуаром огромного количества видов
микробов, способных к транслокации в другие органы и ткани пациента.
Транслокация происходит при наличии нарушений в физиологическом и
микробиологическом аспектах системы антиинфекционной резистентно­
сти организма. Это является причиной развития оппортунистических
инфекций. В перечень возбудителей инфекции включены сальмонеллы,
шигеллы, иерсинии, энтеропатогенные, токсигенные и геморрагические
кишечные палочки.
Заражение ОКИ происходит в результате приема контаминированной
микробами пищи, в которую они попадают от людей - больных и носите­
лей. В пищевых продуктах указанные виды бактерий способны к размно­
жению в условиях комнатной температуры, а клебсиеллы - при темпера­
туре бытового холодильника.
Кроме алиментарного, возможна передача возбудителей контактно­
бытовым и водным путем, хотя эти пути в большинстве случаев не могут
обеспечить попадание в организм достаточной инфицирующей дозы.
Инкубационный период короткий. При заражении протеем, клебсиел-
лами инкубационный период составляет 5 -2 4 ч. При попадании малой
дозы возбудителя инкубационный период может удлиняться до 2 - 3 дней.
При эшерихиозе он может затягиваться до 5 - 7 дней.
В развитии заболевания, кроме попадания высокой инфицирующей
дозы, патогенности возбудителя, большое значение имеют условия, спо­
собствующие быстрому и массовому размножению возбудителя в тонком
кишечнике или желудке. У грамотрицательных бактерий главным факто­
ром патогенности является эндотоксин, который выделяется в больших
количествах при гибели и массовом распаде попавших в кишечник бакте­
рий и оказывает местное цитотоксическое действие, действие на интра­
муральный нервный аппарат кишечника, периферические сосуды и клет­
ки других органов. Некоторые варианты эшерихий, клебсиелл дополни­
тельно продуцируют экзотоксин, капсульную субстанцию, ферменты-
токсины, которые также оказывают прямое или косвенное повреждающее
действие.
Начало болезни, как правило, острое, а нередко и бурное. В клини­
ческом течении выделяют три синдрома: общетоксический, энтеральный
и более редкий - септический. В одних случаях заболевание начинается с
общетоксического синдрома (озноб, лихорадка, головная и мышечная
боли, слабость, головокружение). В других - с энтерального синдрома
(тошнота, рвота, понос, боли в животе). К ним присоединяется энтераль-

26
600

500

Годы

Рис. 1. Динамика заболеваемости острыми кишечными инфекциями, на 100 тыс. на­


селения.

ный или общетоксический синдромы. Эти синдромы могут проявляться и


одновременно.
Клиническая картина заболевания проявляется в виде гастрита, энтери­
та, гастроэнтерита, колита, энтероколита и гастроэнтероколита. Любой
из названных выше микробов может вызвать любую форму заболеваний,
но при обобщенном анализе выявляется некоторая специфика. По типу
гастрита и гастроэнтерита протекают ОКИ, вызванные цитробактером,
протеем, клебсиеллами. Кишечная палочка вызывает колит, энтерит или
энтероколит. Большинство возбудителей вызывают легкие или средней
тяжести заболевания. Кишечная палочка может вызывать тяжелые формы,
сопровождающиеся обезвоживанием, или осложниться сепсисом.
Оппортунистические кишечные инфекции обычно заканчиваются кли­
ническим выздоровлением через 5 - 6 дней или даже раньше, воспалитель­
ные явления в кишечнике могут наблюдаться 7 - 1 0 дней, период освобож­
дения организма от возбудителя может затягиваться на длительное время.
Септические формы болезни могут иметь летальный исход [56, 77].
За последние 10 лет отмечается тенденция к увеличению числа реги­
стрируемых случаев ОКИ, что связано, в том числе, с повышением каче­
ства их регистрации и диагностики. В 2015 г. показатель заболеваемости
ОКИ в Российской Федерации составил 545,89 на 100 тыс. населения,
что практически не отличается от показателя 2014 г. При этом на долю
ОКИ неустановленной этиологии приходится 63,44% случаев. Сохра­
няются выраженные различия в эффективности этиологической диаг­
ностики ОКИ на различных территориях Российской Федерации [71]
(рис. 1 ).

27
Рис. 2. Динамика заболеваемости ротавирусной инфекцией, на 100 тыс. населения.

Ежегодно регистрируется более 500 вспышек инфекций с фекально­


оральным механизмом передачи инфекции, что составляет около 20%
всех регистрируемых групповых очагов. Причинами возникновения оча­
гов инфекционных заболеваний с фекально-оральным механизмом пере­
дачи явились: грубые нарушения санитарного законодательства по со­
держанию пищеблоков, технологии приготовления блюд, соблюдению
требований личной гигиены; ненадлежащий входной контроль качества
и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов; ис­
пользование в питании детей продовольственного сырья с истекшим
сроком годности и нарушением условий транспортирования и хранения;
нарушения технологического режима обработки продовольственного
сырья, несоблюдение требований к обработке и использованию кухонно­
го инвентаря.
Среди ОКИ установленной этиологии преобладали (60% ) вирусные
инфекции. При этом 84,5 % случаев ОКИ вирусной этиологии приходится
на ротавирусную инфекцию (Р В И ).
В период с 2010 г. по 2014 г. заболеваемость РВИ стабилизировалась на
высоких показателях - 69,6-74,9 на 100 тыс. населения, в 2015 г. отмечен
рост заболеваемости на 14,0% - зарегистрировано более 124,8 тыс. случаев,
показатель заболеваемости составил 85,45 на 100 тыс. населения (рис. 2).
К группе риска относятся дети до 5 лет, при этом наиболее поражаемым
контингентом являются дети в возрасте до года (показатель заболеваемо­
сти в 2015 г. составил 1307 на 100 тыс. населения) и дети в возрасте
1 -2 года (1442 на 100 тыс. населения).
В 2014 г. вакцинация против РВИ введена в Календарь профилакти­
ческих прививок по эпидемическим показаниям. В то же время объемы
иммунизации не оказывают существенного влияния на проявление эпиде-

28
Рис. 3. Динамика заболеваемости дизентерией, на 100 тыс. населения.

мического процесса РВИ . Так, в 2015 г. привито 23 268 детей (в 2014 г. -


5904 в 31 субъекте Российской Федерации).
В последние годы норовирусная инфекция (Н В И ) имеет тенденцию
к широкому распространению и является одной из ведущих причин в
формировании эпидемических очагов с фекально-оральным механиз­
мом передачи. Одной из отличительных особенностей НВИ в Россий­
ской Федерации является высокая доля заболеваний среди детей
до 14 лет. В 2015 г. она составила 76% общего числа заболевших. В зим­
ний сезон 2 0 1 4 -2 0 1 5 гг. отмечено появление нового субтипа вируса
(G II.17-G II.p 17), вызвавшего вспышки на юго-востоке Китая. Его рас­
пространение в странах Азии с вытеснением доминирующего субтипа
G II.4 генотип Sydney_2012 позволяет предположить у него большой
эпидемический потенциал и возможное значение в качестве нового пан-
демичного субтипа.
Вспышки инфекций рота- и норовирусной этиологии в группе инфек­
ций, реализуемых фекально-оральным механизмом, имеют наибольший
удельный вес (2015 г. - 62%, 2014 г. - 55,5%, 2013 г. - 46%, 2012 г. - 50,3%,
2011 г. - 55,6%). Наиболее эпидемически значимыми объектами остаются
детские дошкольные и общеобразовательные учреждения, медицинские
организации.
Заболеваемость бактериальной дизентерией в стране продолжала сни­
жаться (рис. 3).
Сохраняется неравномерное распределение заболеваемости по субъек­
там Российской Федерации, вплоть до отсутствия случаев заболеваний,
что в значительной степени зависит от социально-экономических условий
жизни населения, обращаемости граждан и качества регистрации инфек­
ционных заболеваний. Наиболее вовлекаемыми в эпидемический процесс

29
Рис. 4. Динамика заболеваемости сальмонеллезом, на 100 тыс. населения.

остаются дети до 17 лет, доля которых среди всех заболевших бактериаль­


ной дизентерией возросла с 53% в 2011 г. до 60% в 2015 г. Заболеваемость
в этой возрастной группе составила 20,72 на 100 тыс. населения (2014 г. -
23,5, 2013 г. - 25,9, 2012 г. - 31,4, 2011 г. - 30,2 на 100 тыс. населения).
Среди бактериологически подтвержденных случаев в 2015 г. удельный
вес возбудителей примерно одинаков: дизентерия Флекснера - 53,5%,
дизентерия Зонне - 44,4%. Доля бактериологически подтвержденных слу­
чаев дизентерии может рассматриваться в качестве одного из критериев
оценки информативности бактериологической диагностики ОКИ.
Одной из мер профилактики заболеваемости дизентерией является
ежегодная предсезонная иммунизация работников пищевых предприятий
и других декретированных групп населения, а также населения, подверг­
шегося воздействию паводка. В 2015 г. против дизентерии по эпидемиче­
ским показаниям привито более 180 тыс. человек в 46 субъектах Россий­
ской Федерации.
Заболеваемость сальмонеллезами снизилась на 13,2% и составила
25,28 на 100 тыс. населения (2014 г. - 29,1, 2013 г. - 33,56, 2012 г. - 36,6,
2011 г. - 35,9) (рис. 4).
В этиологической структуре доля сальмонеллы группы D (S. enteritidis)
в последние десятилетия составляет 78-81% всех диагностированных слу­
чаев. Но в последние годы появились данные о возрастающей роли саль­
монелл группы С (S. infantis), что свидетельствует о формировании новых
резервуаров возбудителя в природе и требует дальнейших исследований
для определения возможных источников инфекции, не имеющих большо­
го значения в предыдущие годы [71].
Во всех случаях ведущим методом для подтверждения клинического
диагноза является выделение возбудителя, поэтому при всех инфекцион­

30
ных заболеваниях применяется культуральный метод исследования [120,
141, 142, 146]. Многократное бактериологическое исследование, произво­
димое по обоснованным клиническим показаниям, увеличивает возмож­
ность обнаружения возбудителя, т.е. улучшает диагностику, что весьма
важно для своевременного и правильного лечения и проведения противо­
эпидемических мероприятий [99, 119].
Патогенные энтеробактерии семейства Enterobacteriaceae проявляют
свои вирулентные свойства при наличии определенных факторов, ини­
циирующих инфекцию. Инициирующими факторами являются: попада­
ние в организм человека высоких инфицирующих доз, проникновение
в необычные места локализации, селекции энтеробактерий с повышенной
вирулентностью за счет ослабления резистентности организма под влия­
нием неблагоприятных факторов. При ослаблении конкурентных взаимо­
отношений, сложившихся в ходе эволюции, возникающие более виру­
лентные штаммы могут более успешно выживать и реализовать свои
свойства.
Основными задачами клинической микробиологии являются:
• этиологическая диагностика инфекционного процесса - выделение и
идентификация возбудителя до рода и вида; необходимость дифференци­
ровать имеющееся заболевание от вызванных патогенными энтеробакте­
риями;
• установление причин дисбиотического состояния. Подтверждение
этиологической значимости патогенных энтеробактерий;
• выбор рациональных средств этиотропной терапии.
Поэтому при верификации диагноза бактериологический метод остает­
ся основным, а в числе приоритетных направлений - разработка и внедре­
ние в практику современных питательных сред для обнаружения, выде­
ления и идентификации энтеробактерий, а также определение их родовой
и видовой принадлежности [49].

31
4. бактериологические методы
диагностики инфекционных
заболеваний

Современная микробиология является фундаментальной наукой. Для


изучения микроорганизмов она использует методы других наук, прежде
всего физики, биологии, биоорганической химии, молекулярной биоло­
гии, генетики, цитологии, иммунологии. Как и всякая наука, микробио­
логия подразделяется на общую и частную. Общая микробиология изуча­
ет закономерности строения и жизнедеятельности микроорганизмов на
всех уровнях: молекулярном, клеточном, популяционном; генетику и вза­
имоотношения их с окружающей средой. Предметом изучения частной
микробиологии являются отдельные представители микромира в зависи­
мости от проявления и влияния их на окружающую среду, живую приро­
ду, в том числе человека. К частным разделам микробиологии относятся:
медицинская, ветеринарная, сельскохозяйственная, техническая (раздел
биотехнологии), морская, космическая микробиология. В зависимости от
природы изучаемых патогенных микроорганизмов медицинская микро­
биология в настоящее время делится на бактериологию, вирусологию,
микологию.
Поворотным этапом в развитии медицинской микробиологии принято
считать середину X IX в. Самым гениальным ученым X IX в. по праву был
признан француз Луи Пастер, научные труды которого показали роль
микроорганизмов в возникновении инфекции. Он научился выращивать
бактерии в искусственных питательных средах.
Большое значение для медицинской микробиологии имели открытия
немецкого ученого Роберта Коха, который обогатил микробиологию со­
вершенными методами исследования. Им и его учениками в практику ла­
бораторной техники введены плотные питательные среды (картофель, же­
латин, свернутая сыворотка, МПА), анилиновые красители, иммерсионная
система, микрофотографирование. Благодаря совершенствованию техни­
ки и методики микробиологических исследований Р.Кох окончательно
установил этиологию сибирской язвы, открыл возбудителя туберкулеза,
холеры и получил из туберкулезных микобактерий туберкулин. Ученый
разработал способ выделения чистой культуры патогенных бактерий.
К 80-м годам X IX в. российские бактериологи внесли немалый вклад
в развитие бактериологии. Открытия Пастера и Коха нашли широкую
поддержку и развитие в Российской империи в результате самоотвержен-

32
ной работы передовых представителей отечественной биологии и медици­
ны. Среди ученых, ставших основоположниками отечественной бактерио­
логии, следует особо выделить Г.Н.Габричевского, Н.М.Берестнева,
П.В.Циклинскую, Л.А.чугаева, Е.И.Марциновского, И.И.Мечникова и др.
Благодаря разработанной Р.Кохом технике использования чистых
культур и впервые примененных Л. Пастером иммунологических реакций
и химическому анализу бактериология признана как наука и с тех пор
продолжает оказывать влияние и проникать в такие появившиеся области
науки, как вирусология, иммунология и молекулярная биология.
Постулаты Коха - утверждения, которые можно сделать относительно
микроорганизма, доказывающие, что он является возбудителем некото­
рой болезни, и по сей день не потеряли своей значимости и остаются осно­
вополагающими постулатами микробиологии и инфектологии, соответ­
ствие которым является необходимым условием обоснования гипотезы
инфекционной этиологии какого-либо заболевания:
1 . микроорганизм постоянно встречается в организме больных людей

(или животных);
2 . микроорганизм должен быть изолирован от больного человека или

животного, и его штамм должен быть выращен в чистой культуре;


3. при заражении чистой культурой микроорганизма здоровый человек
(или животное) заболевает;
4. микроорганизм должен быть повторно изолирован от эксперимен­
тально зараженного животного или человека.
В современных условиях диагностика инфекционных болезней харак­
теризуется непрерывным совершенствованием уже найденных приемов и
методов распознавания болезней и поисками новых, более эффективных с
использованием молекулярной биологии, биотехнологии и биоинформа­
тики [ 1 0 ].
Однако бактериологические методы - «золотой стандарт» микробио­
логической диагностики, так как результаты исследований позволяют
точно установить факт наличия возбудителя в исследуемом материале.
Основу микробиологической диагностики инфекционных заболеваний
составляют:
• микроскопия: световая, фазово-контрастная, темнопольная, флуорес­
центная, электронная;
• культуральный метод (бактериологический, вирусологический);
• биологический метод (заражение лабораторных животных с воспро­
изведением инфекционного процесса на чувствительных моделях);
• молекулярно-генетический метод (ПЦР, ДНК- и РНК-зонды и др.);
• серологический метод - выявление антигенов микроорганизмов или
антител к ним (И Ф А ).

33
Результаты микроскопии позволяют ориентировочно судить о характе­
ре микрофлоры, ее количественном содержании и соотношении различ­
ных видов микроорганизмов в биологическом материале, а также дают
предварительную информацию об обнаружении этиологически значимого
инфекционного агента в данном биоматериале, что позволяет врачу сразу
начать лечение (эмпирическое).
На основании данных микроскопии проводят выбор питательных сред
для выращивания микробов. Посев исследуемого биоматериала на пита­
тельные среды производят с целью выделения чистых культур микроорга­
низмов, установления их вида и определения чувствительности к анти­
бактериальным препаратам [31]. Для этих целей используют различные
питательные среды, позволяющие выделить наибольшее количество видов
микроорганизмов.
Выделенные чистые культуры микроорганизмов подвергают дальнейше­
му изучению в диагностических тестах, основанных на морфологических,
ферментативных, биологических свойствах и антигенных особенностях,
характеризующих бактерий соответствующего вида или варианта [39].
Из-за широкого распространения инфекционных заболеваний, пора­
жающих все контингенты населения, бесконтрольного применения анти­
биотиков и антисептиков, микробиологические исследования имеют
приоритетное развитие среди других видов лабораторной диагностики.

34
5.
современное состояние
производства питательных сред
в россии

В лабораторную медицину успешно внедряются национальные стан­


дарты, регламентирующие требования к организации деятельности лабо­
раторий и свойствам средств лабораторного анализа. Научные публика­
ции, семинары, конференции и методические рекомендации по примене­
нию положений и требований национальных стандартов в практику
клинико-диагностических лабораторий способствуют их успешному вне­
дрению. Стандартизация лабораторных методов исследований обеспечи­
вает наиболее успешное функционирование лабораторий, удовлетворение
сотрудников условиями и результатами своего труда, адекватное взаимо­
понимание с клиническим персоналом и пациентами [50-52, 117, 125, 130].
Для диагностики инфекционных заболеваний важную роль играют бак­
териологические методы исследований, включая выделение возбудителя
с использованием дифференциально-диагностических питательных сред.
Для качества результатов исследований необходимо применение стан­
дартных питательных сред, реагентов и использование в работе стандарт­
ных методик в ходе взятия клинического материала, проведения и учета
результатов исследования [92].
Питательные среды являются одним из важнейших компонентов лабо­
раторных микробиологических исследований. Количество питательных
сред (с учетом модификаций), по различным источникам, превышает
5 тыс. прописей. В бактериологической практике чаще всего используют
сухие питательные среды, которые производятся в промышленных мас­
штабах. Сухие среды могут храниться в течение длительного времени,
удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав
[57, 121, 124].
Существенный вклад в нормативно-правовое регулирование производ­
ства и применения диагностических препаратов внес Федеральный закон
от 21.11.2011 № 323-3 «Об основах охраны здоровья граждан в Россий­
ской Федерации». В п. 1 ст. 38 указанного закона дано определение меди­
цинских изделий: «Медицинскими изделиями являются любые инстру­
менты, аппараты, приборы, оборудование, материалы и прочие изделия,
применяемые в медицинских целях... предназначенные производителем
для профилактики, диагностики, мониторинга состояния организма чело­
века, проведения медицинских исследований...»

35
В соответствии с этим определением питательные среды, используемые
для диагностики инфекционных заболеваний, относятся к медицинским
изделиям [44]. Положения ряда статей указанного закона устанавливают
основные правила допуска к обороту и ключевых этапов жизненного
цикла, а также применения и эксплуатации медицинских изделий.
Первоначальным этапом допуска на рынок медицинских изделий являет­
ся государственная регистрация препаратов, которая в соответствии
с Постановлением Правительства № 1416 от 27 декабря 2012 г. осущест­
вляется Росздравнадзором. В соответствии со ст. 38 323-Ф З при лабора­
торной диагностике инфекционных болезней можно использовать только
зарегистрированные медицинские изделия. В случае использования фаль­
сифицированных, контрафактных, недоброкачественных медицинских
изделий в соответствии с Федеральным законом от 31 декабря 2014 г.
№ 532-Ф З наступает административная и уголовная ответственность.
Питательные среды широко используются в различных областях -
в клинической и санитарной микробиологии, при производственном
контроле пищевых продуктов, в фармацевтической промышленности,
изучении объектов окружающей среды. Во всех ли случаях необходима
государственная регистрация питательных сред в качестве медицинского
изделия?
В соответствии со ст. 38 323-Ф З назначение препарата определяется
производителем, и если препарат не предназначен для целей, указанных
в данной статье, то он не является медицинским изделием, что было ука­
зано в нескольких письмах и разъяснениях Росздравнадзора. В результате
полученных ответов можно суммировать, что питательные среды, предна­
значенные для научных исследований, для санитарно-эпидемиологи­
ческих исследований, а также питательные среды для микробиологиче­
ского контроля образцов пищевых продуктов, кормов для животных,
фармацевтических и косметических продуктов, образцов окружающей
среды не подлежат государственной регистрации в Росздравнадзоре в ка­
честве медицинских изделий.
Среди методов микробиологической диагностики культуральный метод
занимает особое место, являясь «золотым стандартом» лабораторной диа­
гностики, поскольку именно обнаружение возбудителя заболевания при
культивировании на питательных средах является убедительным доказа­
тельством инфекционной природы болезни [28, 29, 8 6 , 111].
Перечень питательных сред, необходимых в работе микробиологи­
ческой лаборатории, определяется, в первую очередь, ее спецификой,
оснащением и финансовыми возможностями. В бактериологической
практике хорошо известны отечественные питательные среды общего на­
значения (питательный агар и питательный бульон), среды для выделе­

36
ния энтеробактерий (агар Эндо, среда Левина, висмут сульфит агар, бак-
тоагар Плоскирева, Мак Конки агар, X L D -агар, R V S-бульон и др.), среды
для воздушно-капельных инфекций (коринебакагар, коринетоксагар, бор-
детелагар), питательные среды для особо опасных инфекций ( F t -агар, агар
щелочной, пептон основной, легионелбакагар и др.).
Широкое применение в клинической микробиологии нашли отече­
ственные питательные среды для выделения возбудителей гнойных бакте­
риальных менингитов, гонококков, стафилококков, определения дисбио-
тических состояний. В отдельную группу выделены питательные среды
для контроля стерильности и микробной обсемененности нестерильных
лекарственных средств, которые могут использоваться и в клинической,
и санитарной микробиологии (тиогликолевая среда, агар Сабуро, манни-
тол-солевой агар, агар Симмонса, селенитовый бульон и др.).
Основные отечественные производители питательных сред (Ф Б У Н
ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора, филиал НПО «Микроген» (г. Москва) -
предприятие «Питательные среды» (г. Махачкала) и др.) обеспечивают
выполнение более 50% всех бактериологических исследований страны.
Среди присутствующих на отечественном рынке импортных питательных
сред значительную часть составляют питательные среды для микроорга­
низмов со сложными питательными потребностями, готовые к примене­
нию в чашках Петри, транспортные среды, хромогенные, дифференци­
ально-диагностические среды в картриджах для бактериологических ана­
лизаторов и др. [82, 148, 169].
Ф Б У Н ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора является одним из основных про­
изводителей питательных сред в России. Проведение научных исследова­
ний в области разработки питательных сред для широкого круга микро­
организмов, включая возбудителей особо опасных инфекций, туберкуле­
за, кишечных инфекций, гнойных бактериальных менингитов и др., нача­
лось в 80-е годы X X столетия. В настоящее время номенклатура выпу­
скаемых препаратов в Ф Б У Н ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора составляет
около 100 наименований. Большинство питательных сред прошло все
этапы Государственных испытаний, зарегистрировано в качестве меди­
цинских изделий Росздравнадзором и разрешено для применения в прак­
тическом здравоохранении. Питательные среды производства Ф Б У Н
ГНЦ ПМБ Роспотребнадзора широко используются бактериологически­
ми лабораториями в клинической и санитарной микробиологии [26, 30,
34, 122, 123].
Для проведения входного контроля качества питательных сред
сущ ествует несколько нормативных документов [74]. Общие требова­
ния к контролю качества питательных сред изложены в ГО С Т Р ЕН
12322-2010 [24].

37
Основным документом в лабораториях клинической и санитарной микро­
биологии является М УК 4.2.2316-08 [65]. Для микробиологических лабо­
раторий пищевой промышленности используется ГОСТ 11133-2016 [20].
Методы контроля качества питательных сред для фармацевтической про­
мышленности изложены в Государственной фармакопее [25].
Несмотря на широкое внедрение в бактериологическую практику мето­
дов генодиагностики и геноиндикации, бактериологический метод остает­
ся «золотым стандартом» в диагностике большинства инфекций. Этот
метод включает посев исследуемого материала на плотные питательные
среды с последующим выделением и идентификацией чистой культуры
возбудителя. Основной недостаток бактериологического метода - дли­
тельность исследования. Для быстрорастущих микроорганизмов резуль­
тат может быть получен не ранее, чем через сутки после посева на пита­
тельную среду. Для ускоренной идентификации выделяемых культур в
состав питательных сред для первичного посева или накопления чистой
культуры обычно вводят дифференцирующие субстраты и соответствую­
щие индикаторы. В классическом варианте это углеводы (лактоза, сорбит,
сахароза и т.д.), многоатомные спирты, аминокислоты, мочевина или дру­
гие субстраты, при расщеплении которых ферментами микроорганизмов
образуются вещества, изменяющие рН или окислительно-восстанови­
тельный потенциал питательной среды. В результате появления продук­
тов ферментации индикатор изменяет свой цвет и окрашивает, например,
колонии микроорганизмов и питательную среду вокруг, помогая отличить
их от бесцветных (неокрашенных) колоний микроорганизмов, не фермен­
тирующих данный субстрат. Дифференциация при таком подходе ослож­
няется тем, что сахаролитические и протеолитические ферменты микро­
организмов весьма многообразны и универсальны (часто встречаются
у представителей разных видов). Это обусловливает относительно невы­
сокие дифференцирующие свойства традиционных питательных сред.
Для более четкой дифференциации культур у них желательно определять
родо- и/или видоспецифические ферменты.
В конце X X в. в бактериологическую практику вошли дифференциаль­
ные среды нового поколения - хромогенные, принцип действия которых
основан на выявлении высокоспецифичных ферментов у искомых микро­
организмов.
Поскольку хромогенный субстрат или их смесь вводятся в состав пита­
тельных сред (в том числе селективных) для первичного посева, то ре­
зультат - выделение чистой культуры и ее идентификация - может быть
получен уже в течение первых суток исследования. Иногда при этом тре­
буется проведение быстрых подтверждающих тестов (например, капель­
ный тест на индол с реактивом Ковача для E. coli).

38
Эффективность микробиологической диагностики инфекционных за­
болеваний зависит не только от выбранного метода исследования и его
характеристик, но и от качества проведения преаналитического этапа ис­
следования, включающего взятие и транспортировку клинического мате­
риала в лабораторию для анализа. Даже незначительные ошибки на этом
этапе исследований неизбежно ведут к искажению окончательных резуль­
татов, не позволяя получить достоверные данные. По сведениям многих
авторов, на преаналитический этап приходится от 57 до 6 8 % всех диагнос­
тических ошибок, которые ведут к необходимости проведения повторных
исследований, но, что еще более серьезно, - к неправильной постановке
диагноза. Для повышения качества лабораторных исследований в первую
очередь необходимо повысить качество сбора проб биологического мате­
риала и транспортирования его в лабораторию.
Одним из возможных путей предотвращения ошибок преаналитическо­
го этапа является использование надлежащих транспортных систем, со­
держащих транспортные питательные среды. Использование для транс­
портировки аналита (гной, кишечное содержимое и т.п.) обычных пита­
тельных сред является, зачастую, серьезной ошибкой, поскольку в них
идет быстрое размножение менее требовательных сапрофитных микро­
организмов.
Промышленный выпуск транспортных сред осуществлен в Европе
еще в 1975 г. В России промышленное производство транспортных сред
до сих пор отсутствует, несмотря на то, что научные разработки и про­
мышленный выпуск сухих питательных сред начаты еще в 1952 г.
в Дагестанском научно-исследовательском институте по производству
питательных сред, а с 80-х гг. проводились и в Ф Б У Н ГНЦ прикладной
микробиологии.
К числу основных транспортных сред относятся среда Кэри Блэйер,
среда Эймса, среда Эймса с углем, среда Стюарта и специальные транс­
портные среды для отдельных видов микроорганизмов. Перечисленные
среды не являются питательными, содержат фосфатный буферный рас­
твор и тиогликолят натрия, предназначены для сбора и транспортировки
только бактериологических проб. Транспортная среда, с одной стороны,
обеспечивает сохранение жизнеспособности микроорганизмов, но в то же
время обязана ограничивать их размножение. Среда Стюарта предназна­
чена для сохранения и транспортировки широкого спектра патогенных
микроорганизмов. Наиболее требовательные микроорганизмы сохраня­
ются в данной среде около суток, прочие - до нескольких дней. Транс­
портная среда Кэри Блэйер представляет собой модификацию транспорт­
ной среды Стюарта, предназначенную специально для фекальных и рек­
тальных образцов.

39
Транспортная среда Эймса представляет собой очередную модифика­
цию транспортной среды Стюарта, в которой глицерофосфат заменен не­
органическим фосфатом, поскольку глицерофосфат является метаболи­
том некоторых энтеробактерий (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, ets.)
и может поддерживать рост некоторых грамотрицательных микроорга­
низмов. Метиленовый синий заменен на активированный уголь. В транс­
портную среду добавлены соли кальция, магния для поддержания прони­
цаемости бактериальных клеток. Эта транспортная среда способна более
трех дней поддерживать жизнеспособными бактерии семейства Entero-
bacteriaceae, однако наилучшие результаты дает культивирование в тече­
ние первых 24 ч [121, 123].

40
6. питательные среды для выделения
энтеробактерий

6 .i . ба зо вы е п и тательн ы е с ред ы

Белковой основой всех сред является питательный бульон, к которому


в зависимости от состава среды добавляются все остальные ингредиенты.
Существует два способа приготовления основного питательного бульона:
• на мясной воде с добавлением готового пептона, который представля­
ет собой смесь разнообразных частиц распада белка, не свертывающихся
при нагревании (пептоны, пептиды, аминокислоты и т.д.);
• на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи фер­
ментов или кислот: среды этой группы богаче аминокислотами.
Обычно гидролизаты содержат полный набор аминокислот и пептидов,
необходимых для нормального развития микробной популяции [2, 6 , 7,
79, 103, 133, 152, 153]. Однако ряд микроорганизмов не способны синте­
зировать некоторые органические соединения, необходимые для по­
строения нового клеточного материала. Поэтому для обеспечения роста
микроорганизмов такие соединения необходимо вносить в среду, в связи
с чем они и получили название «факторы роста». В качестве факторов
роста чаще всего используют добавки природного происхождения в виде
экстрактов, настоев, диализатов и др. При этом дрожжевой экстракт
используют как источник витамина группы В, азотистых оснований
и кофермента 1 .
В Ф Б У Н ГНЦ ПМБ разработана технология изготовления фермента­
тивных гидролизатов мяса, рыбы, рыбной муки, мясокостной муки, казеи­
на, желатина и т.д. Кормовая рыбная мука вырабатывается из рыбы, мор­
ских животных, ракообразных, беспозвоночных, а также из отходов, по­
лучаемых при их переработке. В зависимости от вида исходного сырья
различается качество рыбной муки. Она содержит: сырого протеина -
60-75% , жира - 6-14% , влаги - 4 -1 2 % и золы - 14-19% . Вместе с тем
аминокислотный состав белка рыбной муки достаточно постоянен и ха­
рактеризуется высоким содержанием глутаминовой (12,7-14,6% ) и аспа­
рагиновой (9,1-11,0% ) кислот, а также глицина (6,7-7,2% ), аланина (6,3­
6,5%), лейцина (7,2-8,3% ) и лизина (7,3-7,5% ); содержание других ами­
нокислот составляет 3-5% . Рыбная мука содержит и определенное коли­
чество витаминов: пантотеновая кислота - до 3 мг%; рибофлавин -
до 0,8 мг%; тиамин - до 13 мг%; холин - до 440 мг%.

41
Аминокислотные составы гидролизатов из отходов рыбной промыш­
ленности и кильки каспийской близки и характеризуются высоким содер­
жанием лейцина (2 ,5 -3 ,0 % ), лизина (2 ,5 -3 ,2 % ), аргинина (2,1 —3,0%)
и фенилаланина (1,6—1,7%), содержание других аминокислот составляет
0,5—1,5%. Некоторые различия наблюдаются в содержании глицина, ала­
нина, гистидина.
Казеин является основным белком молока, где его содержание коле­
блется от 2,3 до 2,9% и присутствует в виде казеинатов кальция, образуя
казеинат-кальций-фосфатный комплекс. Панкреатический гидролизат
казеина имеет неглубокую степень расщепления протеина, что обеспечи­
вает в питательных средах биологическую потребность микроорганизмов
в азотистом питании.
Для конструирования питательных сред вполне пригодной азотистой
основой по биохимическим показателям и аминокислотному составу явля­
ются белковые гидролизаты кормовых дрожжей [3, 47]. Однако необходимо
учитывать, что главной особенностью питательных сред, получаемых из
гидролизатов кормовых дрожжей, является высокое содержание в них угле­
водов. Эти два класса химических соединений имеют в своей структуре
функциональные группы NH 2 -, COOH-, CHO-, способствующие химичес­
ким реакциям как между представителями одного класса, так и между азот­
содержащими соединениями, что делает невозможным использование дан­
ного гидролизата в составе лактозо- и глюкозосодержащих сред.
Сравнительная характеристика белковых основ, используемых при
конструировании питательных сред, представлена в таблице 5.
Все исследуемые белковые основы содержат полный набор незамени­
мых аминокислот, хотя концентрация отдельных аминокислот колеблется
в зависимости от вида сырья (табл. 5).
Многолетний опыт по изучению сырьевой базы и использованию при
производстве питательных сред в ГНЦ ПМБ белковых основ различной
природы позволяет разрабатывать широкий ассортимент питательных
сред с использованием импортного и отечественного сырья.
Широкие исследования показали возможность использования всех вы ­
шеуказанных белковых основ при производстве питательных сред для
выделения и дифференциации энтеробактерий при проведении исследо­
ваний в санитарной и клинической микробиологии, но все же значитель­
ным преимуществом обладает панкреатический гидролизат рыбной
муки [1]. Сравнительный анализ аминокислотного состава показал при­
годность использования ПГРМ при конструировании микробиологиче­
ских питательных сред, так как рыбная мука удовлетворяет требованиям
по биологической ценности, доступности, относительной стандартности и
к тому же не является пищевым сырьем.

42
Таблица 5. Сравнительная характеристика белковых основ

Аминокислота, а «
элемент
11
Я
Ё
л
м
=3 к
1 Й
Щ g
’§ §
3 V®
0 3 ^ 1 1>-
£ н
й5 «О
н «
о К Й рц СО Н
н £ Н 5 L_| а п сз
ее 2 ш 2 й н
щ 5 ___ щ 5 ,3 5 I е * ш X
§• оа g-o § 6 З 'Г О ё О
н S н Он Л
а 1 & § е л
О О
X
<и И Ч
g- о
Ё ЁБ Ё Ё П Ё Ё1> С К £ щ

Аспарагиновая к-та 0,31 ± 0,05 0,85 0,51 ± 0,07 0,40 ± 0,03 0,82 0,39
Треонин 0,2 ± 0,1 0,85 0,62 ± 0,05 0,30 ± 0,01 0,26 0,18
Серин 0,13 ± 0,01 0,85 0,44 ± 0,06 0,40 ± 0,03 0,23 0.37
Глутаминовая к-та 0,18 ± 0,03 1,25 0,66 ± 0,06 0,50 ± 0,03 0,86 090
Глицин 0,07 ± 0,02 0,7 0,2 ± 0,02 0,50 ± 0,01 0,55 2,07
Аланин 0,16 ± 0,08 0,4 0,97 ± 0,09 1,00 ± 0,02 0,6 0,84
Валин 0,36 ± 0,1 1,55 1,08 ± 0,13 0,80 ± 0,02 0,39 0,22
Метионин 0,5 ± 0,15 0,85 0,61 ± 0,09 0,40 ± 0,02 0,17 0,10
Изолейцин 0,26 ± 0,1 1,35 1,06 ± 0,07 0,70 ± 0,01 0,27 0,16
Лейцин 2,36 ± 0,21 3,05 3,08 ± 0,25 2,40 ± 0,06 0,58 0,28
Тирозин 1,47 ± 0,34 1,55 1,38 ± 0,31 0,40 ± 0,01 0,23 0,08
Фенилаланин 1,61 ± 0,16 1,6 1,57 ± 0,16 1,30 ± 0,01 0,26 0,19
Лизин 2,41 ± 0,43 2,6 3,22 ± 0,40 1,30 ± 0,05 0,66 0,4
Гистидин 0,1 ± 0,02 1,25 0,46 ± 0,12 0,20 ± 0,02 1,66 0,90
Аргинин 2,1 ± 0,56 2,15 3,0 ± 0,61 1,70 ± 0,09 0,54 0,80
Триптофан не опред. не опред. не опред. 0,06 ± 0,01 0,052 0,02
Микроэлементы, %
Калий 1,4 0,89 1,0 ± 0,04 1,33 0,06
Натрий 5,0 14,7 5,05 ± 0,50 1,6 0,6
Кальций 0,35 не опред. 0,3 ± 0,07 следы
Магний 0,03 0,02 0,16 ± 0,02 0,079 0,001
Железо, мг% 0,03 1,5 4,1 ± 1,9 - 0,006

Разработка технологий производства и создание сухих питательных


сред были направлены на обеспечение бактериологических лабораторий
препаратами, используемыми для культивирования различных микроор­
ганизмов, неприхотливых по своим питательным потребностям, таких как
энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки при проведении ис­
следований в санитарной и клинической микробиологии [8 , 83, 128].

6 .1 .1 . П итательный бульон

Питательные бульоны могут служить в качестве основы для конструи­


рования разнообразных питательных сред, в том числе для культивирова­
ния патогенных микроорганизмов, плохо растущих на обычных средах.
В полужидком виде среда может быть использована для хранения кон­
трольных (эталонных) микроорганизмов.

43
Питательные бульоны зарубежных фирм-производителей, содержащие
в своем составе мясной пептон (5,0 г/л ), говяжий экстракт (1,5 г/л ), дрож­
жевой экстракт (1,5 г/л ), натрия хлорид (5,0 г/л ), предназначены для вы ­
ращивания и изучения культурально-морфологических свойств чистых
культур микроорганизмов. Такие среды используют для выращивания
неприхотливых микробов. Добавление крови, сыворотки и других ингре­
диентов делает ее пригодной для роста высокотребовательных микроорга­
низмов [93].
Имеются сведения [82], что добавление 0,05% теллурита калия к бульо­
ну делает его превосходной средой для культивирования Listeria mono­
cytogenes.
Сухой питательный бульон (сухая среда) производства НПО «Микроген»
используют для выращивания и изучения культурально-морфологических
свойств микроорганизмов различных таксономических групп, а также в ка­
честве питательной основы для приготовления питательных сред общего
назначения. Состав, г/л: гидролизат кильки панкреатический (10,05 г/л),
натрия хлорид (4,95 г/л).
Питательный бульон (ГРМ -бульон) производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ
предназначен для культивирования различных микроорганизмов, непри­
хотливых по своим питательным потребностям, таких как энтеробакте­
рии, синегнойная палочка, стафилококки и др., и представляет собой
смесь сухих компонентов из расчета, г/л:
Вариант 1
Панкреатический гидролизат рыбной муки (П ГРМ ) 18,0
Натрия хлорид 2,0
Вариант 2
ПГРМ 8,0
Пептон сухой ферментативный 8,0
Натрия хлорид 4,0
рН 7,2 ± 0,2
Приготовление среды: 20,0 г питательной среды размешивают в 1 л дис­
тиллированной воды, кипятят в течение 3 мин, фильтруют через бумаж­
ный фильтр, разливают по 1 0 , 0 мл в стерильные пробирки и стерилизуют
автоклавированием при температуре 121°С в течение 15 мин.
Готовая питательная среда прозрачная, желтого цвета. Готовую среду
используют в течение 1 мес при условии хранения ее при температуре
2-8°С .
Специфическая активность. ГРМ-бульон обеспечивает во всех засеян­
ных пробирках при посеве по 0,5 мл микробной взвеси рост каждого из
тест-штаммов: C. xerosis 1911 и S. aureus Wood-46 из разведения 10 - 6 не
позднее 48 ч инкубации; E. coli 3912/41 (055: K 59) и P. aeruginosa 27/99 -

44
из разведения 10 - 7 через 2 0 -2 4 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С
в виде диффузного помутнения среды.
Питательная среда обеспечивает образование индола и сероводорода
тест-штаммами S. flexneri 1a 8516 и S. typhi H-901 ГД Р /ГИ С К соответ­
ственно через 2 0 -2 4 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С.
Образование индола и сероводорода обнаруживается визуально по из­
менению цвета индикаторных бумажек. При положительной реакции на
индол бумажки, пропитанные модифицированным реактивом Эрлиха
(пара-диметиламинобензальдегид - 4 г; спирт этиловый - 50 мл; кислота
ортофосфорная - 1 0 мл), или система индикаторных бумажек для иденти­
фикации микроорганизмов (С И Б зарегистрирован в качестве медицин­
ского изделия) окрашиваются в розовый цвет, а при положительной реак­
ции на сероводород бумажки, пропитанные реактивом для индикации се­
роводорода (вода дистиллированная - 1 0 0 мл; свинец уксуснокислый -
20,0 г; натрий углекислый - 1,0 г), окрашиваются в черный цвет (рис. 5а).
Питательные бульоны должны содержать в достаточном количестве ис­
точники углерода, азота, неорганические соли, в ряде случаев - ростовые
факторы, иметь оптимальные концентрацию водородных ионов и окисли­
тельно-восстановительный потенциал, а также несомненно быть прозрач­
ными для визуальной оценки результатов при росте микроорганизмов.
Для интерпретации результатов накопления было проведено сравнение
регистрации степени роста в питательных бульонах разных производителей.
Сравнительные исследования биологических свойств питательных
бульонов различных зарубежных производителей, разрешенных к приме­
нению в Р Ф , с отечественным ГРМ-бульоном проводили на расширенном
наборе музейных тест-штаммов. Оценку качества препаратов проводили
по основным биологическим показателям: чувствительности, стабильно­
сти основных биологических свойств микроорганизмов. Учет результатов
проводили через 1 8 -2 0 ч инкубации посевов при температуре (37 ± 1)°С
с определением характерного роста (помутнение) бульонов, а также об­
разования индола и сероводорода с применением индикаторных полосок
соответствующих культур микроорганизмов. Результаты биологического
контроля качества питательных бульонов различных производителей
представлены на рис. 5b.

6 .1 .2 . З абуференная пептонная вода

Эффективность проводимого исследования, направленного на выделе­


ние сальмонелл из разных материалов, в первую очередь зависит от при­
менения соответствующих сред обогащения. Забуференная пептонная
вода широко используется в качестве первичной неселективной среды

45
а b
Рис. 5. Биологический контроль питательных бульонов на тест-штаммах: а - образова­
ние индола и сероводорода тест-штаммами S. flex n eri la 8516 и S. typhi H -901 ГД Р /ГИ С К
соответственно; b - тест на образование сероводорода при посеве тест-штамма S. typhi
H-901 Г Д Р /Г И С К питательных бульонов различных производителей: ГН Ц ПМ Б, Merck,
Pronadisa, HiMedia соответственно.

обогащения при исследовании пищевых продуктов и объектов окружаю­


щей среды для выявления бактерий рода Salmonella. Она используется
в качестве разбавителя для гомогенизации проб пищевых продуктов
в микробиологических анализах. При этом исходную суспензию инкуби­
руют при температуре (37 ± 1)°С в течение (18 ± 2) ч [16, 63].
Пептонная забуференная вода соответствует рекомендациям ИСО
(1993) и DIN Norms 10181 и 10160 по анализу молока и мяса, мясных про­
дуктов соответственно и выпускается различными производителями.
Состав забуференной пептонной воды некоторых фирм-производителей
в ее классической прописи: пептоны 10,0 г/л, натрий хлористый 5,0 г/л,
натрий фосфорнокислый двузамещенный х 12Ш О (3 ,5 -9 ,0 ) г/л, калий
фосфорнокислый однозамещенный 1,5 г/л [82, 148].
При проведении испытания в забуференную пептонную воду, исполь­
зуемую в качестве неселективного разбавителя, вносят исследуемый мате­
риал и учитывают результаты, определяя наличие роста с последующим
высевом в среды для селективного обогащения и дифференциально­
диагностические среды для выделения чистой культуры и дальнейшей
ее идентификации [16, 63].

46
Питательная среда для неселективного накопления бактерий (забуфе-
ренная пептонная вода) производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ предназначена
для санитарно-бактериологических исследований с целью неселективного
накопления бактерий и репарации сублетально угнетенных клеток, в част­
ности патогенных энтеробактерий.
Состав среды, г/л:
Пептон мясной 10,0
Панкреатический гидролизат казеина (П ГК ) 10,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,5
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5
Натрий хлористый 5,0
рН от 6 , 8 до 7,2
Приготовление среды: 30,0 г сухой питательной среды тщательно раз­
мешивают в 1 л воды дистиллированной, разливают по 9 мл в стеклянные
пробирки и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в те­
чение 15 мин. Готовая среда прозрачная, светло-желтого цвета.
Контроль специфической активности питательной среды допускается
осуществлять в течение 7 сут после ее приготовления при условии хране­
ния при температуре 2-8°С .
Специфическая активность. Питательная среда обеспечивает во всех
засеянных пробирках при посеве в 9 мл среды по 1,0 мл микробной взвеси
из разведения 10- 7 через (18 ± 2) ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С
визуально обнаруживаемый рост каждого тест-штамма E. coli ATCC
25922, S. enteritidis 11272 и S. typhimurium 79 в виде диффузного помутне­
ния среды (рис. 6 ).

Рис. 6. Р ост т е с т -ш т а м м о в . Слева направо: 1 пробирка - незасеянная среда; 2 пробирки


E. coli A TCC 25922; 2 пробирки S. enteritidis 11272; 2 пробирки S. typhimurium 79.

47
Таблица 6. Биологический контроль за- Специфическая активность забу-
буференной пептонной в о д ы на расши­ ференной пептонной воды оценива­
ренном наборе тест-штаммов
лась на расширенном наборе тест­
№ Наименование штаммов Забуфе-
п/ п ренная
штаммов из разведения 1 0 - 7 (табл. 6 ).
пептонная Богатая белковая основа пита­
вода
тельной среды для неселективного
1 E. coli ATCC 25922 +++
+++
накопления бактерий (забуферен-
2 E. coli 168/59 О111
3 E. coli 3912/41 О55 +++ ная пептонная вода) отечественно­
4 S. flexneri 1a 8516 +++ го производства обеспечивает хо­
5 S. sonnei «S form» +++ роший рост и накопление бактерий
6 S. dysenteriae I 1362 +++ из минимальных посевных доз.
7 S. typhimurium 79 +++ Фосфатный буфер защищает бак­
8 S. enteritidis 11272 +++
терии от губительного воздействия
9 S. paratyphi A-225 +++
кислых продуктов жизнедеятель­
10 S. gallinarum 665 ++
11 C. freundii 101/57 +++ ности микроорганизмов.
12 E. aerogenes 10006 +++
13 P. aeruginosa 27/99 +++ 6 .1 .3 . С р е д ы Э й к м а н а
14 P. aeruginosa ГИСК 453 +++
15 P. vulgaris HX 19 222 +++ Глюкозный и лактозный бульоны
16 P. mirabilis 3177 +++
Эйкмана относятся к дифферен­
17 K. pneumoniae 3534/51 +++
циально-диагностическим средам,
18 K. rhinoscleromatis NCTC 5046 +++
предназначенным для определения
19 Y. enterocolitica 287 II ++
20 Y. pseudotuberculosis III ++ E. coli при санитарном обследовании
21 L. monocytogenes 766 ++ пищевых продуктов и объектов
22 L. ivanovi + внешней среды (вода, смывы и т.д.)
23 S. epidermidis ATCC 14990 ++ [61, 64, 90]. В связи с неодинаковым
24 S. saprophyticus АТСС 15305 ++ санитарно-показательным значени­
25 S. aureus АТСС 6538-Р 209-P ++
ем отдельных родов бактерий груп­
26 E. faecalis 775 +++
пы кишечных палочек их диффе­
27 S. pyogenes Dick 1 на 18ч +
+
ренцируют на основании признаков,
28 A. faecalis 415
+++ - рост очень хороший; ++ - рост хороший; образующих комплекс ТЛИМАЦ:
+ - рост средний. Т - температурный тест (тест
Эйкмана);
Л - сбраживание лактозы;
И - тест индолообразования;
М - реакция с метиловым красным;
А - реакция на ацетилметилкарбинол (реакция Фогес-Проскауэра);
Ц - цитратный тест.
На первом месте комплекса стоит температурный тест - тест Эйкмана,
т.е. способность сбраживать углеводы (лактозу, глюкозу, маннит) при
температуре культивирования, превышающей температуру тела человека.

48
Для дифференциации эшерихий от других энтеробактерий предложена
температура культивирования 43-44°С , при которой они способны сбра­
живать углеводы. Температурный тест определяют на специальных сре­
дах Эйкмана, Кесслера, Булижа [4].
При работе в экспедиционных условиях, при исследовании проб воды
(текущий санэпиднадзор, производственный контроль) титрационным
методом используют как концентрированные среды Эйкмана, так и раз­
веденные в 1 0 раз.
В Ф Б У Н ГНЦ ПМБ для обнаружения и выделения энтеропатогенов из
пищевых продуктов, клинических объектов и непосредственного посева
проб воды разработаны сухие питательные среды Эйкмана с глюкозой и
лактозой следующего состава.
Среда Эйкмана с глюкозой г/л:
ПГРМ
и/или пептон сухой ферментативный 1 0 ,0

Глюкоза 5,0
Натрия хлорид 5,0
Натрия карбонат 0,01-0,025
Бромтимоловый синий 0,06
рН от 6 , 8 до 7,2
Среда Эйкмана с лактозой, г/л:
ПГРМ и/или пептон сухой ферментативный 1 0 ,0

Лактоза 5,0
Натрия хлорид 5,0
Натрия карбонат 0,01-0,025
Бромтимоловый синий 0,06
рН от 6 , 8 до 7,2
Приготовление среды: 20 г сухой смеси размешивают в 1 л дистиллиро­
ванной воды, кипятят в течение 1 - 2 мин, фильтруют через ватно­
марлевый фильтр, разливают по 5 мл в стерильные пробирки с поплавка­
ми и стерилизуют автоклавированием при температуре 110°С в течение
15 мин. Готовая среда прозрачная, зеленого цвета.
Стерильную среду используют для контроля специфической активно­
сти в течение 10 сут при условии ее хранения при температуре 2-8°C .
Питательная среда Эйкмана с глюкозой/лактозой обеспечивает визу­
ально обнаруживаемый рост E. coli и колиформных бактерий в виде по­
мутнения, газообразования и изменения цвета среды из зеленого в жел­
тый через 1 8 -2 4 ч инкубации при температуре 37 и 43°С.
Одним из требований, предъявляемых к средам Эйкмана, является воз­
можность приготовления их в концентрированном виде, необходимом для
проведения контроля воды.

49
Для приготовления концентрированного раствора навеску препарата,
рассчитанную на 1 л среды, растворяют в 1 0 0 мл дистиллированной воды,
кипятят, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки
по 1 мл с поплавками, стерилизуют автоклавированием при температуре
110°С в течение 15 мин. Стерилизация таких сред проводится в щадящем
режиме, так как в концентрированном виде содержание углеводов возрас­
тает до 10 раз. Готовая среда имеет кирпично-зеленый цвет. Возможна
опалесценция.
Определение специфической активности концентрированной среды
проводится аналогично определению для среды с обычной концентра­
цией. Перед контролем концентрированную среду разводят стерильной
дистиллированной водой в 1 0 раз.
Стерильную среду можно использовать для контроля специфической
активности в течение 1 0 сут при условии ее хранения при температуре
2-8°C .
Подготовка штаммов и техника посева - в соответствии с инструкция­
ми на аналогичные питательные среды (500 м.к. каждого тест-штамма
в 5 мл среды).
Специфическая активность. Среда Эйкмана с глюкозой обеспечивает
во всех засеянных пробирках при посеве в 5 мл среды по 0,5 мл микробной
взвеси из разведения 1 0 - 7 визуально обнаруживаемый рост каждого тест­
штамма E. coli 3912/41 (055:K 59), E. coli Ewing (O 124 K 72 ) 227, E. coli ATCC
25922, E. coli 4 (О 157:Н 7), E. aerogenes 10006, P. aeruginosa 27/99, P. vulgaris
HX 19 222 через 1 8 -2 4 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С, а также
тест-штаммов E. coli 3912/41 (055:K 59), E. coli ATCC 25922, E. coli 4
(О 157:Н 7) при температуре (43 ± 1)°С.
Среда Эйкмана с лактозой обеспечивает во всех засеянных пробирках
при посеве в 5 мл среды по 0,5 мл микробной взвеси из разведения 10 - 7
визуально обнаруживаемый рост каждого тест-штамма E. coli 3912/41
(055:K 59), E.coli Ewing (O 124 K 72 ) 227, E. coli ATCC 25922, E. coli 4
(О 157:Н 7), E. aerogenes 10006, P. aeruginosa 27/99, P. vulgaris HX 19 222
через 1 8 -2 4 ч инкубации (для E. aerogenes 10006 до 48 ч) при температуре
(37 ± 1)°С, а также тест-штаммов E. coli 3912/41 (055:K 59), E. coli ATCC
25922, E. coli 4 (О 157:Н 7) при температуре (43 ± 1)°С.
Рост тест-штаммов сопровождается помутнением сред в пробирках.
Ферментация углеводов учитывается по изменению цвета среды от зеле­
ного до желтого. Газообразование - по наличию газа в поплавках. Так как
среды Эйкмана используются и для определения фекальных загрязнений
воды, т.е. термотолерантных бактерий, инкубацию эшерихий проводят
при температурах 37 и 43°С. Инкубация посевов - до 48 ч в зависимости
от особенности биологических характеристик испытуемых штаммов.

50
Рис. 7. Р о с т тест-штаммов на средах Эйкмана. а - среда Эйкмана с лактозой: слева - рост
тест-штамма E. coli 675, справа - исх. цвет среды; b - среда Эйкмана с лактозой: рост тест­
штаммов K. pneum oniae 418 и E. coli 3 9 1 2 /4 1 (О 55:К 59) соответственно; с - среда Эйкмана
с г л ю к о з о й : рост тест-штаммов E. coli АТСС 25922 и S. flex n eri 1а 8516 соответственно.

В отличие от контрольной среды Эйкмана - Eijkman Lactose Broth


(HiM edia), среды Эйкмана с глюкозой и лактозой Ф Б У Н ГНЦ ПМБ
содержат индикатор бромтимоловый синий, что дает возможность более
правильно интерпретировать результаты анализа, поэтому в качестве
контрольных сред использовались среды Эйкмана лабораторного изго­
товления следующего состава [61]: пептон - 1 0 , 0 г/л , натрия хлорид -
5,0 г/л , углевод - 5,0 г/л , 1,6% неспиртовой раствор бромтимолового
синего - 2 мл.
Биологические показатели сред Эйкмана с глюкозой и лактозой с исполь­
зованием расширенного набора тест-штаммов представлены в табл. 7 и 8 .
На рис. 7 представлен переход окраски исходного цвета сред Эйкмана
при росте тест-штаммов, утилизирующих углеводы.
Питательная среда Эйкмана с лактозой/глюкозой производства Ф Б У Н
ГНЦ ПМБ имеет ряд преимуществ: обеспечивает ускоренную дифферен­
циацию термотолерантных эшерихий от других энтеробактерий, четкую
интерпретацию результатов в присутствии индикатора бромтимолового
синего, простой визуальный учет результатов по диффузному помутне­
нию, газообразованию и контрастному изменению цвета среды, высокую
чувствительность за счет использования универсальных белковых пита­
тельных основ (П ГРМ , пептона), возможность приготовления концентри­
рованного раствора, что важно для использования при полевых работах
для повышения эффективности эпидемиологического мониторинга объ­
ектов внешней среды.

51
Таблица 7. Сравнительная характеристика биологических показателей питательных сред Эйкмана с глюкозой при через 24 48 ч
инкубации
Тест-штаммы Температура Контроль роста Среда Эйкмана с глюкозой Глюкозный бульон Эйкмана
культивирования ГРМ -агар (Ф Б У Н ГНЦ ПМ Б) лабораторного изготовления
(кол-во колоний)

со

со
О

О
Escherichia coli 4 ( 0 1 5 7 : Н 7 ) 95 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е

со

со
—]
О

О
Е. coli 6 7 5 94 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е

со

со
—]
О

О
Е. coli 3 9 1 2 / 4 1 ( 0 5 5 : К 5 9 ) 87 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
Е. coli А Т С С 2 5 9 2 2 3 7 “С 100 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
Е. coli E w in g 2 2 7 ( 0 1 2 4 ) 3 7 “С 82 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
Е. aero genes 1 0 0 0 6 3 7 “С 95 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
К. pneum oniae 4 1 8 3 7 “С 99 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
C .freu n d ii 1 0 1 / 5 7 3 7 “С 80 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
S .flex n eri l a 8 5 1 6 3 7 “С 100 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й
S .f a e c a l i s l lS 3 7 “С 93 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й
P. vulgaris H X 1 9 2 2 2 3 7 “С 87 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
K. pneum oniae 3 5 3 4 / 5 1 K 5 6 3 7 “С 92 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
5 . m arcescens 1 3 7 “С 98 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
P. aeruginosa ' ll/ 9 9 3 7 “С 85 И з м е н е н и е ц в е т а с р е д ы в с и н е -з е л е н ы й И з м е н е н и е ц в е т а с р е д ы в с и н е -з е л е н ы й
5 . aureus W o o d -4 6 3 7 “С 84 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й
E .fa e c iu m l 1 7 1 3 7 “С 96 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й
5 . typhi Г Д Р H -9 0 1 3 7 “С 100 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й
Т абли ц а 8. С р а в н и т е л ь н а я х а р а к т е р и с т и к а б и о л о ги ч ес к и х п о к а за т е л е й п и та те л ьн ы х с р ед Э й к м а н а с л а к т о з о й п р и ч е р е з 2 4 48 ч
инкубации.
Тест-штаммы Температура Контроль роста Среда Эйкмана с лактозой Л актозный бульон Эйкмана
культивирования ГРМ -агар (Ф Б У Н ГНЦ ПМ Б) лабораторного изготовления
(кол-во колоний)

со

со
О

О
Escherichia coli 4 ( 0 1 5 7 : Н 7 ) 95 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е

—]
со

со
О

О
Е. coli 6 7 5 94 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е

—]
со

со
О

О
Е.соН 3 9 1 2 / 4 1 ( 0 5 5 : К 5 9 ) 87 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
Е. coli А Т С С 2 5 9 2 2 3 7 “С 100 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
Е. coli E w in g 2 2 7 ( 0 1 2 4 ) 3 7 “С 82 П о м у тн ен и е без и зм ен ен и я ц вета ср еды И з м е н е н и е ц в е т а с р е д ы в с в е т л о -з е л е н ы й
(з е л е н ы й )
Е. aero genes 1 0 0 0 6 3 7 “С 95 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета среды в ж елты й, слабое
сл аб о е газо о б р азо ван и е газо о б р азо ван и е
К. pneum oniae 4 1 8 3 7 “С 99 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
C .freu n d ii 1 0 1 / 5 7 3 7 “С 80 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
S .flex n eri l a 8 5 1 6 3 7 “С 100 Незначительное изменение цвета среды И з м е н е н и е ц в е т а с р е д ы в ж е л т о -з е л е н ы й
в светло-зеленый
S .f a e c a l i s l lS 3 7 “С 93 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й
P. vulgaris H X 1 9 2 2 2 3 7 “С 87 П о м утн ен и е без и зм ен ен и я ц вета ср еды Н е з н а ч и т е л ь н о е и зм е н е н и е ц в е т а с р е д ы
(з е л е н ы й ) в с л а б о -з е л е н ы й
K. pneum oniae 3 5 3 4 / 5 1 K 5 6 3 7 “С 92 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й , И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й ,
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
5 . m arcescens 1 3 7 “С 98 И зм ен ен и е цвета ср еды в ж елты й, слабое И зм ен ен и е цвета ср еды в ж елты й, слабое
га з о о б р а з о в а н и е газо о б р азо ван и е
P. aeruginosa ' ll/ 9 9 3 7 “С 85 И з м е н е н и е ц в е т а с р е д ы в с и н е -з е л е н ы й И з м е н е н и е ц в е т а с р е д ы в с и н е -з е л е н ы й
5 . aureus W o o d -4 6 3 7 “С 84 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й
E .fa e c iu m l 1 7 1 3 7 “С 96 И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й И зм ен ен и е ц вета ср еды в ж елты й
5 . typhi Г Д Р H -9 0 1 3 7 “С 100 И з м е н е н и е ц в е т а с р е д ы в с и н е -з е л е н ы й И з м е н е н и е ц в е т а с р е д ы в с и н е -з е л е н ы й
По результатам исследований проб из водоисточников с использовани­
ем сред Эйкмана с лактозой и глюкозой, проведенных на базе Ф Б У З
«Центр гигиены и эпидемиологии в Калужской области», было отмечено,
что испытуемые среды при различных температурах дают характерный
рост БГКП во всех разведениях, что подтверждает высокую чувствитель­
ность среды; основные биохимические свойства микроорганизмов на
испытуемых средах сохранялись;
Таблица 9. Выявляемое™ микроорга­ выявляемость энтеробактерий при
низмов на питательных средах при по­ посеве клинического материала со­
севе клинического материала
ставила 100%. Средой сравнения
Выявленные Среда Контрольная
штаммыпри Эйкмана среда служила питательная среда
испытаниях с лактозой Кесслера-ГРМ Кесслера ГРМ.
Количество 756 756 Широкие испытания питатель­
посевов
Количество 120 120 ной среды проводились при сани­
находок тарных обследованиях предприя­
S. marcsesens 1 1 тий общественного питания, воды
E. coli Lac- 84 84
поверхностных водоемов и сточ­
E. coli Lac+ 7 7
ных вод, пищевых продуктов (мо­
K. pneumoniae 2 2
K. oxytoca 1 1
локо и молочнокислые продукты,
E. aerogenes 9 9 кондитерские изделия с кремом).
E. cloacae 2 2 Всего было исследовано 623 мо­
C. diversus 1 1 лочных продукта, в 6 8 были обна­
C. freundii 13 13 ружены БГК П ; 756 смывов -
Итого, %: 100 100 из них 1 2 0 положительных нахо­
док; 46 поверхностных водоемов -
Таблица 10. Выявляемость микроорга­ 8 находок; 30 колодцев и родни­
низмов питательных средах при посеве
ков - 1 2 положительных находок
клинического материала
(табл. 9).
Выявленные Среда Контрольная
штаммыпри Эйкмана среда Испытания среды Эйкмана с глю­
испытаниях с
глю ко зо йКесслера-ГРМ козой проводились при санитарных
Количество 756 756
посевов обследованиях предприятий обще­
Количество 128 128 ственного питания (смывы, воды
находок питьевой расфасованной в емкости,
E. coli Lac- 21 21
воды колодцев деревень Калужской
E. coli Lac+ 66 66
области). Результат исследований
K. pneumoniae 1 1
K. oxytoca 2 2
на этом этапе составил 128 положи­
E. aerogenes 11 11 тельных находок и 1 0 0 % результат
E. cloacae 7 7 сходимости со средой Кесслера-
C. diversus 2 2 ГРМ (табл. 10).
C. freundii 18 18 Проведенные испытания каче­
Итого, %: 100 100 ства питательных сред Эйкмана в

54
Ф Б У З «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотреб­
надзора показали, что чувствительность сред Эйкмана с глюкозой и лак­
тозой составила 100%, скорость роста энтеробактерий на средах Эйкмана
сопоставима со скоростью роста на контрольной среде, биохимические и
культуральные свойства микроорганизмов стабильны. чувствительность
сред Эйкмана с глюкозой и лактозой (при посеве 19 штаммов энтеробак­
терий, в том числе в посевной дозе < 1 0 2 микробных клеток, инкубации
в течение 2 4 -4 8 ч) составила 100%.
Сопоставление роста энтеробактерий на средах Эйкмана со скоростью
роста на среде Кесслера-ГРМ показало, что культуральные свойства мик­
роорганизмов стабильны в 100% случаев как при посеве на среды Эйкма-
на, так и при посеве на среду Кесслера-ГРМ.

6 .1 .4 . Л актозный бульон (П итательная среда № 11)

Бульон лактозный используется во многих стандартных методах тести­


рования молочных и других пищевых продуктов и материалов на наличие
энтеробактерий и других грамотрицательных микроорганизмов. Кроме
того, его широко используют для анализа воды и пищевых продуктов на
предмет обнаружения колиформных бактерий.
Лактозный бульон служит для предварительного обогащения сальмо­
нелл при тестировании пищевых продуктов в случаях, когда процесс
консервации может привести к повреждению данных микроорганизмов
или уменьшению их количества. Предварительное обогащение в несе­
лективной среде позволяет восстановить клеточные повреждения
микроорганизмов путем растворения токсичных и ингибирующих ве ­
ществ и обеспечения необходимой питательной базы. Предварительное
обогащение в данной среде дает более высокий процент высеваемости
сальмонелл по отношению к другим организмам после инкубации.
Сальмонеллы не способны ферментировать лактозу в отличие от боль­
шинства других бактерий. В процессе ферментации лактозы pH среды
понижается, оказывая бактериостатический эффект на конкурентные
микроорганизмы.
Бульон лактозный (Lactose Broth) иностранных компаний является
средой для обнаружения колиформ и сальмонелл в воде, пищевых про­
дуктах и других объектах. Такие среды обычно содержат гидролизат жела­
тина (5,0 г/л ), лактозу (5,0 г/л ), мясной экстракт (3,0 г/л ).
Желатин и мясной экстракт являются источниками питательных ве­
ществ, необходимых для роста микроорганизмов: азота, витаминов, мине­
ральных солей и аминокислот. Лактоза - ферментируемый углевод, ис­
точник углерода и энергии [82].

55
Зарубежными фирмами-производителями выпускается лактозный
бульон с феноловым красным (Phenol Red Lactose Broth) для изучения
ферментации лактозы как важной характеристики для идентификации
колиформных бактерий (по рекомендации международного комитета
(ISO 9308-1:1990)) [148].
Среда содержит пептический перевар животной ткани, обеспечиваю­
щий присутствие азотистых веществ и микроэлементов для роста микро­
организмов. Феноловый красный является индикатором рН, который
в кислой среде становится желтым. хлорид натрия обеспечивает опти­
мальное осмотическое давление.
Лактозный бульон - Питательная среда №11 ГРМ производства
Ф Б У Н ГНЦ ПМБ предназначен для предварительного обогащения
бактерий семейства Enterobacteriaceae при контроле микробной загряз­
ненности нестерильных лекарственных средств и для других объектов,
а также при проведении исследований в санитарной и клинической мик­
робиологии.
Состав лактозного бульона, г/л:
ПГРМ 2 0 ,0

Дрожжевой экстракт 2 ,0

Лактоза 5,0
Феноловый красный 0,08
рН от 7,0 до 7,4
Приготовление среды: 27,08 г питательной среды размешивают в 1 л
дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин, фильтруют через
ватно-марлевый фильтр, разливают по 1 0 мл в стеклянные пробирки с по­
плавками и стерилизуют автоклавированием при температуре (121 ± 1)°С
в течение 15 мин.
Готовая среда прозрачная, красного цвета. Допускается легкая опалес­
ценция. Готовую среду используют в течение 14 дней при условии хране­
ния в холодильнике.
Специфическая активность. Лактозный бульон обеспечивает во всех
засеянных пробирках, содержащих по 1 0 мл среды, рост тест-штаммов
E. coli ATCC 25922 и K. pneumoniae 418 через (21 ± 3) ч инкубации при
температуре (33 ± 2)°С при посеве по 1,0 мл микробной взвеси каждого
тест-штамма из разведения 1 0 -8, сопровождающийся изменением цвета
среды из красного в желтый и газообразованием. Рост S. abony ГИСК
103/39 происходит без изменения цвета среды и газообразования при
инкубации в течение (21 ± 3) ч при температуре (33 ± 2)°С при посеве
по 1 , 0 мл микробной взвеси тест-штамма из разведения 1 0 - 8 (рис. 8 ).
Оптимальный состав Питательной среды №11 ГРМ обеспечивает пита­
тельные потребности для интенсивного роста и дифференциации бакте-

56
а b

Рис. 8. Р о с т т е с т - ш т а м м о в н а л а к т о з н о м б у л ь о н е : а - слева: рост тест-штамма E. coli ATCC


25922, справа: контроль (незасеянная среда); b - слева: рост тест-штамма S. abony ГИСК
103/39, справа: контроль (незасеянная среда).

рий семейства Enterobacteriaceae. Наличие роста энтеробактерий регист­


рируют визуально по изменению цвета среды из красного в желтый и
газообразованию.

6 .1 .5 . П итательный агар

Питательный агар является основой многих питательных сред лабора­


торного изготовления. Добавление в эту среду биологических жидкостей
(лошадиной или бараньей крови, сыворотки крови, яичного желтка и
др.) делает ее пригодной для культивирования относительно прихотли­
вых микроорганизмов. Питательный агар широко используется для де­
монстрации в ходе учебного процесса, когда требуется длительное вы ­
живание культур при температуре окружающей среды с минимальным
риском роста контаминирующей флоры (что часто бывает со средами
богатого состава).
Питательные агары зарубежных фирм-производителей содержат пеп­
тон (5,0 г/л ), натрия хлорид (5,0 г/л ), экстракт говяжий (1,5 г/л ), дрожже­
вой экстракт (1,5 г/л ), агар (15,0 г/л ) и рекомендуют использовать для
выращивания широкого спектра микроорганизмов, не требующих специ­
альных добавок [148].

57
Питательный агар (СП А) производства НПО «Микроген», предназна­
ченный для культивирования широкого спектра микроорганизмов, содер­
жит панкреатический гидролизат кильки (17,9 г/л ), натрия хлорид
(7,7 ± 0,3 г/л ) и агар (11,2 ± 1,2 г/л ) [38, 91].
ГРМ-агар предназначен для культивирования различных микроорга­
низмов, таких как энтеробактерии, синегнойная палочка, стафилококки,
а также для проведения исследований в санитарной и клинической мик­
робиологии.
Состав питательного агара для культивирования микроорганизмов
сухой (ГРМ -агар), г/л:
Вариант 1
ПГРМ 24,0
Натрия хлорид 4,0
Агар микробиологический 1 0 ,0

Вариант 2
ПГРМ 1 2 ,0

Пептон сухой ферментативный 1 2 ,0

Натрия хлорид 6 ,0

Агар микробиологический 1 0 ,0 ± 2 ,0

рН от 7,1 до 7,5
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на этикетке
для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают
в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 2 мин до полного расплав­
ления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в сте­
рильные флаконы и стерилизуют автоклавированием при температуре
121°С в течение 15 мин. Среду охлаждают до температуры 45-50°С , разли­
вают в стерильные чашки Петри слоем 4 - 6 мм. После застывания среды
чашки подсушивают, соблюдая правила асептики, в течение 4 0 -6 0 мин.
ГРМ агар после фильтрации и стерилизации прозрачный, желтого
цвета.
Готовую среду используют в течение 1 мес при условии хранения ее при
температуре 2-8°С .
Специфическая активность. ГРМ-агар обеспечивает на всех засеянных
чашках Петри рост:
- тест-штаммов S. flexneri 1a 8516 и S. sonnei «S form» (рис. 9а) при по­
севе по 0 , 1 мл микробной взвеси из разведения 1 0 - 6 через 1 8 -2 0 ч инкуба­
ции при температуре (37 ± 1)°С в виде бесцветных прозрачных круглых
колоний диаметром (1,5 ± 0,5) мм;
- тест-штаммов P. aeruginosa 2 7 /9 9 и S. marcescens 1 с образованием
сине-зеленого и красного пигмента соответственно через 1 8 -2 0 ч инкуба­
ции при температуре (37 ± 1)°С для P. aeruginosa 27/99 и (22 ± 2)°С для

58
Рис. 9. Р ост тест-штаммов на ГРМ агаре: а - S. so n n ei «S form»; b - S. m arcescen s 1.

S. marcescens 1 при посеве по 0,1 мл микробной взвеси, соответствующей


10 единицам по стандартному образцу мутности.
Среды должны содержать питательные вещества, необходимые для био­
синтеза клеточных компонентов и получения энергии в количествах, соот­
ветствующих специфическим потребностям данного микроорганизма.
ГРМ-агар поддерживает рост различных систематических групп микро­
организмов и широко используется во многих областях микробиологии
для культивирования и хранения микроорганизмов.

6 .1 .6 . П и т а т е л ь н а я сред а КМ А Ф А н М

Определение количества мезофильных аэробных и факультативно


анаэробных микроорганизмов (КМ А Ф А нМ ) относится к оценке числен­
ности группы санитарно-показательных микроорганизмов: бактерий,
дрожжей, плесневых грибов. Их общая численность свидетельствует
о санитарно-гигиеническом состоянии продукта, степени его обсеменен-
ности микрофлорой [11, 23, 118].
В Российской Федерации и странах Таможенного союза параметры
КМАФАнМ не должны превышать установленных Т Р ТС «О безопаснос­
ти пищевой продукции» и другими техническими регламентами Тамо­
женного союза [75, 104-108].
Показатель КМАФАнМ характеризует качество, свежесть и безопас­
ность продуктов питания, а также позволяет оценивать уровень санитарно­
гигиенических режимов на производстве, условий хранения и транспор­
тировки продукта.
Показатель КМАФАнМ оценивается по численности мезофильных
аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, выросших

59
в виде видимых колоний на плотной питательной среде после инкубации
при 37°С в течение 2 4 -4 8 ч.
Питательная среда для определения количества мезофильных аэроб­
ных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (среда КМ АФАнМ )
производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ предназначена для санитарно-бакте­
риологических исследований пищевых продуктов, фармацевтических и
косметических продуктов, воды, объектов окружающей и производствен­
ной среды с целью определения общей бактериальной обсемененности.
Состав среды КМАФАнМ , г/л:
Панкреатический гидролизат рыбной муки сухой
(П ГРМ сухой) 7,5
Пептон сухой ферментативный
для бактериологических целей 7,5
Панкреатический гидролизат казеина сухой
(П ГК сухой) 10,0
Дрожжевой экстракт 2,0
Натрий хлористый 3,5
Глюкоза 1,0
Агар бактериологический 10,0 ± 3,0
рН от 7,2 до 7,6
Приготовление среды: навеску среды КМАФАнМ в количестве, указан­
ном на этикетке для приготовления конкретной серии, размешивают в 1 л
дистиллированной воды, кипятят 2 мин до полного расплавления агара,
фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в стерильные емко­
сти и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение
15 мин. Среду охлаждают до температуры 4 5 -5 0 °С , разливают по
(20 ± 5) мл в стерильные чашки Петри, после застывания среды подсуши­
вают. Готовая питательная среда в чашках от желтого до светло-коричне­
вого цвета. Допускается легкая опалесценция.
Контроль специфической активности среды допускается осуществлять
в течение 7 сут после ее приготовления при условии хранения при темпе­
ратуре 2-8°С .
Специфическая активность. Среда КМАФАнМ обеспечивает при посе­
ве по 0,1 мл микробной взвеси через (21 ± 3) ч инкубации при температуре
(37 ± 1)°С на всех засеянных чашках Петри рост тест-штамма B. cereus
NCTC 8035 (АТСС 10702) из разведения 10-5, а также рост тест-штаммов
S. aureus АТСС 6538-Р, E. cloacae ГИСК A-186 из разведения 10-6.
При визуальном просмотре чашек колонии должны выглядеть следую­
щим образом:
- B. cereus NCTC 8035 - плоские, мелкобугристые, слегка вогнутые,
матовые, с волнистыми краями, диаметром 3 ,0 -6 ,0 мм.

60
Рис. 10. Р о с т т е с т - ш т а м м о в на ср еде К М А Ф А н М : а - B. cereus N CTC 8035 (А ТС С 10702);
b - S. aureus АТСС 6538-Р.

- S. aureus АТСС 6538-Р - круглые, слегка выпуклые, с ровными края­


ми, диаметром 1,5-2,0 мм;
- E. cloacae ГИСК A-186 - круглые колонии в S-форме, диаметром
2 ,0 -3 ,0 мм.
Рост тест-штаммов на среде КМ АФАнМ производства Ф Б У Н ГНЦ
ПМ Б представлен на рис. 10.
Контроль питательной среды КМ АФАнМ в сравнении с питательной
средой для количественного определения микробной загрязненности
«Питательная среда №1 ГРМ » на расширенном наборе тест-штаммов
представлен в табл. 1 1 .

Таблица 11. К он троль питательной ср ед ы К М А Ф А н М н а р асш и р ен н о м н аб о р е т е ст ­


ш там м ов

№ Т е ст -ш т а м м ы П и т ат е л ь н а я ср е д а К М А Ф А н М П и тате льн а я ср е д а № 1 - Г Р М
п/ п Р а з в е д е н и е 1 0 -6 (ф б у н гн ц п м б ) (ф б у н гн ц п м б )

тем п ер ату р а ку льт и в и р о ван и я т ем п ер ату р а ку льт и в и р о ван и я


( 3 7 ± 1 ) 0С ( 3 3 ± 2 ) 0С

М о р ф о л о ги я ко лон ий , д и ам етр

1. B. cereus NCTC 8035 Плоские, мелкобугристые, слегка Плоские, мелкобугристые, слегка


вогнутые, матовые, с волнистыми вогнутые, матовые, с волнистыми
краями колонии диаметром краями колонии диаметром
3,0-6,0 мм 2,0-5,0 мм
2. S. aureus АТСС 6538-Р Круглые, слегка выпуклые, Круглые, слегка выпуклые,
с ровными краями колонии с ровными краями колонии
диаметром 1,5-2,0 мм диаметром 1,5-2,0 мм
3. S. epidermidis ATCC 14990 Круглые, слегка выпуклые Круглые, слегка выпуклые
колонии, с ровными краями, колонии с ровными краями
диаметром 1,4-2,0 мм диаметром 1,2-1,8 мм
4. E. cloacae ГИСК A-186 Круглые колонии в S-форме Круглые колонии в S-форме
диаметром 2,0-3,0 мм диаметром 1,5-2,0 мм
5. E. coli ATCC 25922 Круглые блестящие колонии Круглые блестящие колонии
диаметром 2,0-2,5 мм диаметром 2,0-2,2 мм

61
Т абл и ц а 11. Продолжение
№ Т е с т -ш т а м м ы П и тательная ср ед а К М А Ф А н М П и тател ьн ая ср е д а № 1 -Г Р М

п / п Р а з в е д е н и е 1 C -6 ( ф б у н г н ц п м б ) ( ф б у н г н ц п м б )

тем п ература культи ви р овани я тем п ература культи ви р овани я


( 3 7 ± 1 ) 0С ( 3 3 ± 2 ) 0С

м о р ф о л о ги я ко л о н и й , д и ам етр

6. E. coli 3912/41 О55 Круглые блестящие колонии Круглые блестящие колонии


диаметром 2,2-2,6 мм диаметром 2,0-2,4 мм
7. S. flexneri 1a 8516 Круглые блестящие бесцветные Круглые блестящие бесцветные
колонии диаметром 1,8-2,0 мм колонии диаметром 1,4-1,8 мм
8. S. sonnei «S-form» Круглые колонии в S-форме Круглые колонии в S-форме
диаметром 2,0-2,5 мм диаметром 1,8-2,2 мм
9. S. typhimurium 79 Круглые блестящие бесцветные Круглые блестящие бесцветные
колонии диаметром 2,0-2,2 мм колонии диаметром 1,6-2,0 мм
10. S. enteritidis 11272 Круглые блестящие бесцветные Круглые блестящие бесцветные
колонии диаметром 1,8-2,0 мм колонии диаметром 1,6-1,8 мм
11. C. freundii 101/57 Круглые крупные выпуклые Круглые крупные выпуклые
слизистые колонии диаметром слизистые колонии диаметром
4,0-6,0 мм 3,5-5,0 мм
12. K. pneumoniae 3534/51 Круглые крупные слизистые Круглые крупные слизистые
колонии диаметром 4,0-6,0 мм колонии диаметром 3,5-5,0 мм
13. P. aeruginosa 27/99 Расплывчатые колонии Расплывчатые колонии
без пигмента диаметром без пигмента диаметром
3,5-5,0 мм 3,0-3,5 мм
14. S. pyogenes Dick 1 Круглые, с ровными краями Круглые, с ровными краями
колонии диаметром 1,0-1,2 мм колонии диаметром 0,6-1,0 мм

Совокупность компонентов, входящих в состав среды, обеспечивает


питательные потребности для визуального обнаружения роста и опреде­
ления количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных
микроорганизмов.

6 .1 .7 . Т риптон - соевый агар и триптон - желчный агар

Триптон-соевый агар и триптон-желчный агар используются в стан­


дартных методах и экспресс-тестах для обнаружения и подсчета Е. coli и
других колиформных микроорганизмов методом мембранной фильтра­
ции. Выпускаются различными производителями, не имеют отличий
в компонентном составе и содержат триптический гидролизат казеина,
папаиновый перевар соевой муки, желчные соли и агар.
За счет своих питательных особенностей триптон-соевый агар исполь­
зуется для культивирования широкого спектра микроорганизмов, а также
изучения культурально-морфологических свойств микроорганизмов раз­
личных таксономических групп.
Панкреатический гидролизат казеина (П ГК ) имеет неглубокую степень
расщепления протеина и обеспечивает в питательных средах биологиче-

62
скую потребность достаточно широкого круга микроорганизмов в азоти­
стом питании. Триптические гидролизаты казеина используются как
белковая основа питательных сред для выращивания требовательных
медленно и быстрорастущих микроорганизмов, нуждающихся в кровяных
питательных средах.
Казеин является основным белком молока, где его содержание коле­
блется от 2,3 до 2,9% и присутствует в виде казеинатов кальция, образуя
казеинат-кальций-фосфатный комплекс. Под влиянием трипсина проис­
ходит гидролитический распад пептидных связей с образованием низко­
молекулярных полипептидов со значительно меньшей величиной моле­
кулы, чем у исходных веществ, а также небольшого количества свободных
аминокислот. Трипсин катализирует гидролиз преимущественно пептид­
ных связей в молекулах белков, в которых карбоксильная группа образо­
вана основными аминокислотами с положительно заряженной боковой
цепью - аргинином или лизином. При определенных условиях можно
установить его действие и на иные связи. Наряду с белками трипсин рас­
щепляет и низкомолекулярные субстраты - сложные эфиры и амиды,
т.е. обладает эстеразной и амидазной активностью.
Гидролизат соевой муки входит в состав триптон-соевого агара.
Используемый в качестве одной из основ питательных сред для культи­
вирования энтеропатогенных микроорганизмов гидролизат соевой муки
недопустим к использованию в производстве питательных сред из-за на­
личия в нем углеводов. Поэтому в качестве субстрата для гидролиза были
выбраны соевые белковые изоляты, содержащие практически чистый сое­
вой белок 95% и являющиеся недорогим многотоннажным продуктом,
используемым в пищевой промышленности.
Для гидролиза соевых изолятов были выбраны достаточно доступные
ферменты: панкреатин и папаин. Получены образцы гидролизатов сое­
вых белков. При разработке среды триптон-соевый агар использовали
соевые пептоны импортного производства как стабильное и доступное
сырье.
Анализ литературных данных и накопленный опыт по гидролизу раз­
личного белкового сырья позволили разработать технологию производ­
ства триптона, триптон-соевого агара и триптон-желчного агара.
Особый интерес представляют технология получения триптона по
Адамсу и Хенди [36] и сравнение его с производимым в Ф Б У Н ГНЦ
ПМБ панкреатическим гидролизатом казеина. 500 г технического казе­
ина замачивают в 1 л дистиллированной воды и оставляют на 2 0 -2 4 ч
при температуре 4°С. Затем добавляют 4 л дистиллированной воды,
подщелачивают до рН 9,5 и разваривают при 45°С. В полученный 10%
вязкий раствор казеина добавляют 400 г поджелудочной железы.

63
Таблица 12. Физико-химические показатели триптического гидролизата казеина
сухого производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ
pH N aM , % N a C l, % № 6 щ ., % В лаж ность, %

5,75 3,8 9,9 10,7 3,9

Гидролиз ведут при температуре 45°С, рН 9,5, при постоянном переме­


шивании в течение 24 ч с хлороформом (рН корректируют). через 24 ч
доводят рН до 4,0 и оставляют на 24 ч. После фильтрации получают
прозрачный триптон. Физико-химические показатели триптона: -рН 4,0;
с.о. - 14,2%; № м - 532 мг%; NaCl - 4%; ^ б щ - 1300 мг%; № м в пере­
счете на с.о. - 3,7%.
Зарубежные производители используют в составе триптон соевого
агара (Tryp tic Soy Agar): казеиновый пептон 15,0 г/л , соевый пептон
5,0 г/л , хлорид натрия 5,0 г/л , агар 15,0 г/л . Триптон желчный агар
(Tryptone Bile Agar) дополнительно содержит желчные соли 1,5 г/л
[154, 158].
В Ф Б У Н ГНЦ ПМБ была разработана технология получения трипти­
ческого гидролизата казеина, состав которого приведен в табл. 12.
Готовые питательные среды: триптон-соевый агар и триптон-желчный
агар на основе триптического гидролизата казеина (Т Г К ) в сравнении
с коммерческими аналогами были проверены на расширенном наборе
тест-штаммов микроорганизмов (табл. 13).
Исследования показали, что по совокупности биологических показате­
лей роста энтеробактерий триптон-соевый агар с использованием ТГК не
уступает контрольным средам, а по росту высокотребовательных мик­
роорганизмов, таких как стрептококки и нейссерии, превосходит некото­
рые коммерческие аналоги.

Рис. 11. Рост тест-штаммов на триптон-соевом агаре: a - E. coli Ewing (O 1 2 4 K 7 2 ) 227;


b - S. p n e u m o n ia e A T C C 6305 (гемолиз).

64
Триптон-соевый агар относится к питательным средам общего назначе­
ния, предназначенным для поддержания роста микроорганизмов различ­
ных систематических групп, также используется для обнаружения и под­
счета E. coli и колиформных бактерий стандартным методом и в экспресс­
тестах. Рост тест-штаммов на среде представлен на рис. 11. Кроме того,
триптон-соевый агар на основе ТГК может использоваться для определе­
ния гемолиза соответствующих штаммов (рис. lib ) .

Таблица 13. Б и о л о г и ч е с к и е п о к а з а т е л и т р и п т о н -с о е в о г о а г а р а р а з н ы х п р о и з в о д и т е ­
л ей н а р асш и р ен н о м н аб о р е ко н тро льн ы х т е с т -ш т а м м о в м и к р о о р га н и зм о в

№ Н аи м ен о ва н и е Т р и п т о н -со е вы й К он тр оль
п/ п т ест -ш т ам м а. а га р н а о сн о в е
T ry p tic S o y A g a r C a s e in S o y a К он тр оль р о ст а
Р а з в е д е н и е 1 0 -6 т гк
(C A S O A g a r) B e a n D ig e s t (Г Р М -а га р )
[1 5 4 ] A g a r [1 5 8 ]

тем п ер ату р а и в р е м я и н ку ба ц и и 3 7 ° С 2 4 ч

ди а м е т р , м о р ф о л о ги я ко лон ий

1 E. coli 3912/41 1,8-2,0 2,5-3,0 2,0-2,5 2,0-3,0


(055K59) круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
2 E. coli Ewing 1,8-2,0 2,3-2,5 2,0-2,3 2,0-2,5
(O124K72) 227 круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
3 E. coli 675 1,8-2,2 2,0-2,5 2,0-2,3 2,0
круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
4 E. coli АТСС 25922 2,0-2,5 2,5-3,0 2,0-2,5 2,0-2,1
круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
5 K. pneumoniae 1,8-2,2 2,5-3,0 2,0-2,5 2,0-2,5
3534/51 круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
6 C. freundii 101/57 1,8-2,0 2,5-2,8 1,8-2,3 2,2-2,3
круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
7 K. pneumoniae 418 2,0-3,0 3,0-3,5 2,5-3,0 2,5-3,0
круглые гладкие, круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
8 S. aureus ATCC 1,6 1,6 1,4-1,6 1,6-1,8
6538-P круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
9 E. faecalis ATCC 0,6 0,8-0,9 0,7-0,8 0,6-0,8
19433 (NCTC 775) круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
10 S. pneumoniae 0,8-1,4 0,6-0,8 0,8-1,0
ATCC 6305 круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные
11 N. meningitidis 1,0-1,4 0,6-0,8 0,8-1,0
ATCC 13102 круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные
12 S. pyogenes Dick I 1,0 1,0 0,8 0,6
круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие круглые, гладкие
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные

65
Состав триптон-соевого агара производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ, г/л
ПГК 10,0
ТГК 10,0
Соевый пептон 5,0
Натрий хлористый 5,0

со
Натрий углекислый

о
Агар бактериологический 11,0 ± 2,0
рН от 6,9 до 7,4
Приготовление среды: навеску триптон-соевого агара в количестве, ука­
занном на этикетке для приготовления конкретной серии, размешивают в
1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин до полного расплавления
агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют автоклави­
рованием при температуре 121°С в течение 15 мин. Охлаждают до темпе­
ратуры 50-45°С и разливают в стерильные чашки Петри. После застыва­
ния среды чашки подсушивают.
Триптон-соевый агар в чашках Петри прозрачный, желтого цвета.
Допускается небольшая опалесценция.
Контроль специфической активности питательной среды осуществля­
ют в течение 7 сут после ее приготовления при условии хранения при
температуре 2-8°С .
Специфическая активность. Триптон-соевый агар обеспечивает визу­
ально обнаруживаемый рост тест-штаммов E. coli АТСС 25922, E. coli
3912/41 (О 55:К 59), K. pneumoniae 3534/51, C. freundii 101/57, S. aureus
ATCC 6538-P в виде бесцветных круглых колоний диаметром 1,0-3,0 мм,
а штамм S. pyogenes Dick I - диаметром до 1,0 мм.
Триптон-желчный агар - селективная среда, предназначенная для про­
ведения бактериологического исследования клинического и другого мате­
риала с целью получения дополнительной информации о состоянии и
клинической ситуации при диагностике заболеваний, вызванных энтеро­
бактериями.
Триптон-желчный агар (производства Ф Б У Н ГНЦ ПМ Б), состав, г/л
ТГК 10,0
ПГК 15,0
Соли желчных кислот 1,5
Натрий углекислый 0,1-0,3
Агар бактериологический 13,0±3,0
рН от 7,0 до 7,4
Приготовление среды: навеску триптон-желчного агара в количестве,
указанном на этикетке для приготовления конкретной серии питательной
среды, размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин до пол­
ного расплавления агара. Стерилизуют автоклавированием при темпера-

66
Рис. 12. Р о с т т е с т - ш т а м м о в н а т р и п т о н -ж е л ч н о м агар е: a - E. coli 3 9 1 2 /4 1 (055:K 59);
b - K. pneumoniae 418.

туре 121°С в течение 15 мин. Охлаждают до температуры 45 -5 0 °С и раз­


ливают в стерильные чашки Петри. После застывания среды чашки под­
сушивают. Триптон-желчный агар после кипячения и стерилизации про­
зрачный, желтого цвета, допускается легкая опалесценция.
Контроль специфической активности питательной среды осуществля­
ют в течение 7 сут после ее приготовления при условии хранения при
температуре 2-8°С .
Специфическая активность. Триптон-желчный агар обеспечивает ви­
зуально обнаруживаемый рост E. coli АТСС 25922, E. coli 3912/41 (055:
K59), E. coli Ewing (О 124К 72) 227, Kpneumoniae 418 при посеве по 0,1 мл
микробной взвеси каждого тест-штамма из разведения 10-6 через 2 0 -2 4 ч
инкубации при температурах (37 ± 1) и (43 ± 1)°С в виде бесцветных круг­
лых колоний диаметром 1,0-3,0 мм.
Ингибирующие свойства. Триптон-желчный агар полностью подавля­
ет рост тест-штаммов S. aureus ATCC 6538-P из разведения 10-4 на всех
засеянных чашках Петри при посеве по 0,1 мл микробной взвеси через
2 0 -2 4 ч инкубации при температурах (37 ± 1) и (43 ± 1)°С.
Результаты биологического контроля триптон-желчного агара на кон­
трольных тест-штаммах представлены на рис. 12.
Биологические показатели триптон-желчного агара на расширенном
наборе контрольных тест-штаммов микроорганизмов при различных тем­
пературах культивирования в сравнении с коммерческим аналогом пред­
ставлены в табл. 14, 15.
На среде при температуре инкубации 37°С ингибируется рост стафило­
кокков, роение протеев.
Триптон-желчный агар при температуре инкубации 43°С обладает сле­
дующими ростовыми свойствами: обеспечивает рост E. coli, обладает вы-

67
Таблица 14. Б и о л о г и ч е с к и е п о к а з а т е л и т р и п т о н -ж е л ч н о г о а г а р а н а р а с ш и р е н н о м н а ­
боре ко н тро льн ы х т е с т -ш т а м м о в м и к р о о р га н и зм о в (и н к у б а ц и я п о с е в о в п р и т е м п е р а ­
туре (3 7 ± 1 )°С )

№ Н аи м ен о ва н и е тест-ш там м о в Т ри п тон -ж елч н ы й ага р К он тр оль р о ст а


п/ п (р а зв е д е н и е 1 0 -6) ф б у н гн ц п м б т е ст-ш там м о в
н а T r y p to n e B ile A g a r

ди а м е т р , м о р ф о л о ги я ко лон ий

1. E. coli 3912/41 (055:K59) 2,0—2,2 2,0-2,2


круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
2. E. coli Ewing (O124K72) 227 1,8-2,2 1,8-2,2
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
3. E. coli 675 1,8-2,0 1,8-2,0
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
4. E. coli АТСС 25922 1,8-2,0 1,8-2,0
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
5. K. pneumoniae 3534/51 2,6-3,0 2,6-2,9
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
6. C. freundii 101/57 1,0-2,0 1,0-2,0
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
7. E. cloacae ГИСК А-186 2,6-3,0 2,6-3,0
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
8. E. faecalis ATCC 19433 (NCTC 775) Рост отсутствует Рост отсутствует
9. S. aureus Wood-46 (10-4) Рост отсутствует Рост отсутствует
10. S. aureus «Виотко» (10-4) Рост отсутствует Рост отсутствует
11. S. aureus ATCC 6538-P (10-4) Рост отсутствует Рост отсутствует
12. S. saprophyticus АТСС 15305 (10-4) Рост отсутствует Рост отсутствует
13. S. epidermidis ATCC 14990 (10-4) Рост отсутствует Рост отсутствует
14. P. vulgaris HX 19222 (10-4) Рост без роения Рост без роения
15. S. typhi H 901 1,2-1,4 1,2-1,5
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
16. S. paratyphi A-225 1,8-2,0 1,7-2,0
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
17. S. dysenteriae I 1362 1,0-1,6 1,0-1,5
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные

раженным ингибирующим эффектом в отношении стафилококков, саль­


монелл, подавляет роение протеев, частично-колиформных бактерий.
На питательной среде возможно проведение быстрого подтверж­
дающего капельного теста на индол с реактивом Ковача для E. coli
(рис. 13).
Рост других тест-штаммов при температуре инкубации 43°С, не относи­
мых к эшерихиям, но продуцирующих индол, отсутствует, поскольку при
повышенной температуре инкубации в присутствии желчных солей рост
этих тест-штаммов подавляется, что значительно облегчает работу по вы ­
явлению эшерихий.
Кроме того, для подтверждения возможности использования сред:
триптон-соевого агара и триптон-желчного агара при обнаружении эше-
рихий и колиформных бактерий ускоренным тестом, питательные среды

68
Таблица 15. Б и о л о г и ч е с к и е п о к а з а т е л и т р и п т о н -ж е л ч н о г о а г а р а н а р а с ш и р е н н о м н а ­
б о р е т е с т -ш т а м м о в (и н к у б а ц и я п о с е в о в п р и т е м п е р а т у р е ( 4 3 ± 1 ) ° С ) .

№ Н а и м е н о ва н и е тест -ш т ам м о в Т р и п тон -ж елч н ы й агар К он тр ол ь р о ст а


п/ п (р а зв е д е н и е 1 0 -6) ф б у н гн ц п м б тест -ш т ам м о в
н а T r y p to n e B ile A g a r

ди ам етр , м о р ф о л о ги я колон ий

1. E. coli 3912/41 (055:K59) 2,0-2,2 2,0-2,2


круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
2. E. coli Ewing (O124K72) 227 1,8-2,2 1,8-2,2
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
3. E. coli 675 1,8-2,0 1,8-2,0
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
4. E. coli АТСС 25922 1,8-2,0 1,8-2,0
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
5. K. pneumoniae 3534/51 Рост отсутствует Рост отсутствует
6. C. freundii 101/57 Рост отсутствует Рост отсутствует
7. E. cloacae ГИСК А-186 1,6-2,6 1,6-2,2
круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
8. E. faecalis ATCC 19433 (NCTC 775) Рост отсутствует Рост отсутствует
9. S. aureus Wood-46 (разведение 10-4) Рост отсутствует Рост отсутствует
10. S. aureus «Виотко» (10-4) Рост отсутствует Рост отсутствует
11. S. aureus ATCC 6538-P (10-4) Рост отсутствует Рост отсутствует
12. S. saprophyticus АТСС 15305(10-4) Рост отсутствует Рост отсутствует

могут быть приготовлены в виде двухслойной среды - путем заливки го­


рячего триптон-соевого агара (50°С слоем 1 мм) поверх затвердевшей
среды триптон-желчного агара [18]. Среды готовятся за 1 ч до посевов.
Время инкубации при температуре 37°С - 4 ч, затем при температуре
43,5°С - 19 ч. Колонии эшерихий и колиформных бактерий круглые, глад­
кие, бесцветные, диаметром 1,5-2,8 мм. Рост S. aureus Wood-46, P. vulgaris
HX 19 222, S. aureus ATCC 6538-P отсутствует.

Рис. 13. Р о с т т е с т - ш т а м м а н а т р и п т о н - ж е л ч н о м а г а р е ( Ф Б У Н Г Н Ц П М Б ) : а - E. coli


АТСС 25922; b - проведение индольного теста с реактивом Ковача для E. coli АТСС 25922.

69
6 .2 . п и та тел ьн ы е с ред ы д л я о бо га щ ен и я
эн теро бактери й (с е л е к ти вн ы е )

Этап диагностики ОКИ и исследование других образцов, предполо­


жительно контаминированных энтеробактериями, бактериологическим
методом основан на непременном использовании питательных сред для
селективного накопления и выделения энтеробактерий. Как правило, вы ­
деление энтеробактерий осложняется тем, что обычно они загрязнены и
другими микроорганизмами, а применение питательных сред для селек­
тивного накопления энтеробактерий позволяет повысить эффективность
диагностики ОКИ и выявляемость кишечных патогенов, тем самым стан­
дартизировать бактериологические исследования.
Для посева проб материала, высококонтаминированных различной ми­
крофлорой (испражнения, гной, секционный материал к др.), наиболее
целесообразно применять высокоселективные питательные среды, а для
проб, обычно не содержащих сопутствующей микрофлоры (кровь, спин­
номозговая жидкость и др.), - слабоселективные дифференциальные
среды. Однако, учитывая возможность выделения из испражнений или
другого материала в качестве возбудителей заболеваний не только пато­
генных, но и условно-патогенных энтеробактерий, которые могут сильно
подавляться на высокоселективных средах, оптимальным является одно­
временное применение тех и других сред.
С целью приведения методов, регламентирующих бактериологичес­
кий контроль, в соответствие с международными стандартами и обеспе­
чения возможности получения сопоставимых и достоверных результа­
тов анализа отечественными и зарубежными лабораториями были рас­
смотрены и проанализированы среды для выявления энтеробактерий.
Анализ проводился комплексно по основным компонентам, обеспечи­
вающим ростовые, селективные и дифференциально-диагностические
свойства сред.
Определение присутствия или отсутствия бактерий семейства Entero-
bacteriaceae в определенном образце проводится согласно традиционной
схеме: предварительное обогащение в неселективной среде, обогащение
в селективной жидкой среде с последующим выделением типичных коло­
ний на селективно-диагностических агаризованных средах для подтверж­
дения принадлежности колоний к бактериям семейства Enterobacteriaceae
[14, 19].

70
6 .2 .1 . П итательная среда обогащения для бактерий семейства
Enterobacteriaceae

Для определения количества бактерий семейства Enterobacteriaceae


в качестве селективной среды обогащения используется глюкозный буль­
он с желчью и бриллиантовым зеленым [19]. В соответствии с требова­
ниями ГО СТ 32064-2013 можно приготовить среду лабораторного изго­
товления следующего состава: ферментативный гидролизат животных
тканей (10,0 г), глюкоза (5,0 г), натрий фосфорнокислый двузамещенный
безводный (6,45 г), калий фосфорнокислый однозамещенный безводный
(2,0 г), говяжья желчь (20,0 г), бриллиантовый зеленый (0,0125 г), вода
(1000 см3). Устанавливают рН среды 7,2 ± 0,2.
Срок хранения готовой питательной среды при температуре (5 ± 3)°С
не более 1 мес. Среду разливают в пробирки по 10 см3 и в колбы
по 90 см3 для использования среды нормальной и двойной концентра­
ции. Использование сред двойной концентрации предусматривает добав­
ление количества продукта или его разведения по объему, равному коли­
честву среды.
Сухая питательная среда обогащения для бактерий семейства Entero­
bacteriaceae выпускается отечественными производителями как питатель­
ная среда №3. Среда предназначена для обогащения бактерий семейства
Enterobacteriaceae при контроле микробной загрязненности нестерильных
лекарственных средств и других объектов, а также при проведении иссле­
дований в санитарной и клинической микробиологии. Среда обеспечивает
питательные потребности для интенсивного роста энтеробактерий и инги-
биции отдельных видов микроорганизмов.
Питательная среда обогащения для бактерий семейства Enterobacteria­
ceae - Питательная среда №3 ГРМ состоит из смеси сухих компонентов
из расчета г/л:
ПГРМ 15,0
Дрожжевой экстракт 2,0
Глюкоза 10,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 7,5
Калий фосфорнокислый однозамещенный 2,5
Феноловый красный 0,08
Малахитовый зеленый или
бриллиантовый зеленый 0,015
Натрий углекислый 0 ,1-0,5
рН от 7,1 до 7,5
Приготовление среды: 37,6 г питательной среды размешивают в 1 л дис­
тиллированной воды, кипятят в течение 2 мин, фильтруют через ватно­

71
марлевый фильтр, разливают по 10 мл в стеклянные пробирки и стерили­
зуют автоклавированием при температуре (121 ± 1)°С в течение 15 мин.
Готовая Питательная среда №3 ГРМ после фильтрации и стерилизации
прозрачная, красного цвета. Среду можно использовать в течение 14 дней
при условии хранения в холодильнике.
Специфическая активность. Питательная среда обогащения для бакте­
рий семейства Enterobacteriaceae обеспечивает во всех засеянных пробир­
ках рост каждого из тест-штаммов E. coli АТСС 25922 и E. cloacae ГИСК
A-186 из разведений 10-8 при посеве по 1,0 мл микробной взвеси в 10 мл
питательной среды №3 ГРМ через (21 ± 3) ч инкубации при температуре
(33 ± 2)°С с изменением цвета среды из красного в желтый.
Ингибирующие свойства. Питательная среда №3 ГРМ полностью по­
давляет во всех засеянных пробирках, содержащих по 10 мл среды, рост
тест-штамма S. aureus FDA 209-P (АТСС 6538-Р ) при посеве по 1,0 мл
микробной взвеси из разведения 10-5 через (21 ± 3) ч инкубации при тем­
пературе (33 ± 2)°С.
Наличие роста энтеробактерий регистрируют визуально по помутне­
нию и изменению цвета среды из красного в желтый. Селективные аген­
ты - малахитовый и бриллиантовый зеленый ингибируют рост грамполо-
жительной микрофлоры.

6 .2 .2 . E C - бульон

Для обнаружения и определения количества презумптивных бактерий


E. coli и последующего расчета наиболее вероятного числа (Н В Ч ) исполь­
зуется E C -бульон, в котором посевы инкубируются при температуре 44°С.
Презумптивная E. coli (presumptive E. coli) - бактерия, ферментирующая
при температуре 44°С лактозу с образованием газа и образующая индол
из триптофана. Если в ЕС-бульоне обнаружилось газообразование и, парал­
лельно, образование индола в пептонной воде при температуре 44°С,
результат расценивается как «содержащие презумптивную E. coli» в грам­
мах или см3 [17].
Питательная среда для селективного определения колиформных бакте­
рий и E. coli (E C -бульон) предназначена для санитарно-бактериологичес­
ких исследований воды, пищевых продуктов и других материалов с целью
селективного определения колиформных бактерий при температуре инку­
бирования (37 ± 1)°С, а также E. coli и термотолерантных колиформных
бактерий при температуре инкубирования (44 ± 0,5)°С.
Согласно соответствующим документам [17, 21], исследуемый матери­
ал после культивирования в жидкой селективной обогатительной среде
при обнаружении затемнения, образования хлопьев или вспенивания

72
среды высевают в ЕС-бульон. После инкубирования при различных тем­
пературах культивирования (37 ± 1)°С и (44 ± 0,5)°С проводят визуаль­
ный учет результатов, учитывая наличие роста по диффузному помутне­
нию среды и газообразованию.
Лактозный бульон ЕС выпускается различными фирмами-произво-
дителями. Как правило, в состав сред входит казеиновый пептон (трип-
тон) (20,0 г/л ), лактоза (5,0 г/л ), смесь солей желчных кислот (1,5 г/л ),
фосфатный буфер (K H 2 PO 4 , K 2 H PO 4 ), и натрий хлористый (5,0 г/л ).
При приготовлении ЕС-бульона в лабораторных условиях компоненты
растворяют в 1000 см3 воды, при необходимости подогревают. Устанав­
ливают такой уровень рН, чтобы после стерилизации он соответствовал
6,8 ± 0,2. Среду разливают по 10 см в пробирки с поплавками и использу­
ют для инкубирования при температуре 37°С с целью обнаружения коли-
формных бактерий, а также при температуре 45,5°С - с целью обнаруже­
ния E. coli.
Сухая отечественная питательная среда для селективного определения
колиформных бактерий и E. coli обеспечивает питательные потребности
для накопления колиформных бактерий и E. coli. Соли желчных кислот
подавляют рост грамположительных микроорганизмов. Фосфатный
буфер поддерживает требуемый рН питательной среды.
Состав среды, г/л:
ПГК сухой 20,0
Лактоза 5,0
Калий фосфорнокислый двузамещенный 3,5
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,5
Натрий хлористый 5,0
Соли желчных кислот 1,5
рН от 6,8 до 7,2
Приготовление среды: 36,5 г ЕС-бульона тщательно размешивают в 1 л
воды дистиллированной, кипятят 2 мин, фильтруют через ватно-марлевый
фильтр, разливают по 9 мл в пробирки с поплавками и стерилизуют авто­
клавированием при температуре 121°С в течение 15 мин. Готовая среда
прозрачная, светло-желтого цвета.
Контроль специфической активности питательной среды допускается
осуществлять в течение 7 сут после ее приготовления при условии хране­
ния при температуре 2-8°С .
Специфическая активность. ЕС-бульон обеспечивает во всех засеян­
ных пробирках при посеве в 9,0 мл среды по 1,0 мл микробной взвеси из
разведения 10-7 через 2 4 -4 8 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С
визуально обнаруживаемый рост в виде диффузного помутнения и газо­
образования каждого из тест-штаммов E. coli ATCC 25922, E. coli 675,

73
а b
Рис. 14. Р о с т к о н т р о л ь н ы х т е с т - ш т а м м о в на E C -б у л ь о н е п р о и зво д ства Ф Б У Н ГН Ц
а - K. pneumoniae 418; b - E. coli 675.
П М Б :

K. pneumoniae 418 и рост в виде диффузного помутнения и газообразова­


ния через 2 4 -4 8 ч инкубации при температуре (44 ± 0,5)°С каждого из
тест-штаммов E. coli ATCC 25922, E. coli 675 (рис. 14).
Ингибирующие свойства. ЕС-бульон полностью подавляет во всех за­
сеянных пробирках рост тест-штамма E. faecalis ATCC 19433 (N CTC 775)
и B. cereus NCTC 8035 при посеве в 9,0 мл среды по 1,0 мл микробной взве­
си из разведения 10-4 через 2 4 -4 8 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С.

6 .2 .3 . С р е д а Ке с с л е р а

Большое значение для идентификации энтеробактерий имеет способ­


ность микроорганизмов сбраживать лактозу, что обусловлено наличием
у них р-галактозидазы. Эффективность сбраживания лактозы зависит еще
и от наличия специфического фермента - пермеазы галактозидов, которая
способствует проникновению лактозы в клетку. Штаммы, имеющие
в-галактозидазу, но лишенные пермеазы, не могут поглощать лактозу со
скоростью, достаточной для интенсивного брожения, и обычно классифи­
цируются как неспособные к сбраживанию этого сахара. Сбраживание
лактозы свойственно представителям родов Escherichia и Enterobacter, но
преимущественно отсутствует у представителей родов Salmonella, Shigella
и Proteus. Образование газа в результате сбраживания лактозы является

74
очень важным отличительным признаком для энтеробактерий - газообра­
зующие бактерии рода Escherichia и Enterobacter отличаются по этому кри­
терию от болезнетворных микроорганизмов группы Shigella и Salmonella,
которые могут сбраживать лактозу, но без выделения газа. Кроме того,
очень опасными являются лактозоотрицательные варианты кишечной
палочки - это измененные эшерихии, утратившие способность сбражи­
вать лактозу. Обнаружение лактозоотрицательных вариантов E. coli в объ­
ектах внешней среды свидетельствует об опасном фекальном загрязнении,
т.е. эпидемиологической опасности этих объектов для человека [97].
Для проведения первичного обнаружения бактерий группы кишечных
палочек (БГК П ) по признаку ферментации лактозы до образования кис­
лоты и газа используют комбинированные среды. Ведущие зарубежные и
отечественные фирмы выпускают среды Lauryl Tryptose Broth, Brilliant
Green bile broth, среду Кесслера, Violet Peptone Bile Lactose Broth [139, 154],
среду Кода, лактозный и глюкозный бульоны, питательную среду №3
ГРМ для контроля микробной загрязненности (среда обогащения для
бактерий семейства Enterobacteriaceae). Эти среды предназначены для об­
наружения колиформных бактерий при анализе воды, продуктов и других
контаминированных объектов.
Прототип среды Кесслера был введен в микробиологическую практику
в 1927 г., когда ученые Кесслер и Свинертон [169] предложили среду для
обнаружения колиформных бактерий в молоке и молочных продуктах.
В настоящее время среда, называемая средой Кесслера, а в некоторой
литературе Кесслера-Свинертона (в зависимости от наличия в компо­
нентном составе лактозы или глюкозы) широко применяется в санитарно­
микробиологическом исследовании объектов внешней среды: почвы,
воды, пищевых продуктов, а также оборудования предприятий пищевой
промышленности, для оценки санитарного состояния лечебных учрежде­
ний, учреждений общественного питания и т.д.
Большое значение для санитарной оценки внешней среды имеет обна­
ружение в ней болезнетворных микроорганизмов, но для экспресс-диаг­
ностики судят о загрязненности внешней среды по обнаружению в ней
санитарно-показательных микроорганизмов. Санитарно-показательными
микроорганизмами являются представители нормальной микрофлоры
организма человека - кишечные палочки. Присутствие этого микроба
во внешней среде говорит о ее загрязнении выделениями человека -
фекальном загрязнении [94].
Целью использования таких питательных сред, как среды Кесслера, явля­
ется накопление чистой культуры и одновременное выявление некоторых
свойств бактерий, что позволяет упростить процедуру дальнейшей диффе­
ренциации за счет сужения круга подозреваемых микроорганизмов.

75
На практике в бактериологических лабораториях в качестве селектив­
ной среды накопления широко используется среда лабораторного приго­
товления с кристаллическим фиолетовым, так называемая среда Кесслера,
в состав которой входит пептон 10 г/л, лактоза 2 ,5 -1 0 ,0 г/л, желчь 50 мл и
раствор кристаллического фиолетового (1%-ный водный р-р) 2 ,0 -4 ,0 мл
[42, 58, 67].
В составах сред Кесслера, выпускаемых зарубежными фирмами, также
входят: пептон 10,0 г/л, лактоза 10,0 г/л, желчь 5,0 г/л, генцианвиолет
0,04 г/л вносится в сухом виде [168, 169].
Среда Кесслера в готовом виде представляет собой прозрачную жид­
кость фиолетового цвета. Среду разливают в пробирки по 5 мл с поплав­
ками и стерилизуют автоклавированием при температуре 112°С в течение
20 мин.
Посев на указанную среду проводят по 0,5 мл микробной взвеси каждо­
го тест-штамма. Посевы инкубируют при (37 ± 1)°С, учет результатов про­
водят через 24 ч инкубации. Для определения термотолерантных коли-
формных бактерий посевы дополнительно инкубируют при температуре
(43 ± 1)°С. О ферментации лактозы судят по помутнению среды и образо­
ванию газа в поплавках.
Сухая питательная среда Кесслера-ГРМ имеет следующий состав, г/л:
Пептон сухой 3,0
ПГРМ 7,0
Лактоза 10,0
Желчь очищенная 3,0
Кристаллический фиолетовый 0,04
Натрий углекислый 0,01-0,25
рН от 7,3 до 7,7
Приготовление среды: 23,0 г сухой смеси размешивают в 1 л дистилли­
рованной воды. Кипятят 2 - 3 мин, фильтруют через бумажный фильтр,
разливают по 5 мл в стерильные пробирки с поплавками и стерилизуют
автоклавированием при температуре 112°С в течение 20 мин. Готовая
среда имеет фиолетовый цвет. Стерильную среду используют в течение
4 нед при условии ее хранения при температуре 2-8°C , в темном месте.
Специфическая активность. Питательная среда обеспечивает во всех
засеянных пробирках визуально обнаруживаемый рост тест-штаммов
E. coli 675, K. pneumoniae 418, C. freundii 101/57 в виде диффузного помут­
нения среды и газообразования, тест-штамма E. aerogenes 10006 - в виде
диффузного помутнения среды и слабого газообразования, тест-штамма
P. aeruginosa 2 7 /9 9 в виде слабого помутнения среды без газообразования
через 2 2 -2 4 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С, а также тест-штамма
E. coli 675 в виде диффузного помутнения среды и газообразования через

76
Рис. 15. Р о с т к о н т р о л ь н ы х т е с т - ш т а м м о в н а с р е д е К е с с л е р а - Г Р М . Слева направо:
контроль (незасеянная среда), E. coli 675 (температура культивирования (4 3 ± 1)°С и
(37 ± 1)°С), K. pneum oniae 418, C. freu n d ii 101/57, E. aerogenes 10006, P. aeruginosa 2 7/99,
P. vulgaris HX 19 222, S. aureus W ood-46.

2 2 -2 4 ч инкубации при температуре (43 ± 1)°С при посеве по 0,5 мл ми­


кробной взвеси каждого тест-штамма из разведения 10-6 (рис. 15).
Показатель инги 6 и ц и и . Питательная среда полностью подавляет
во всех засеянных пробирках рост тест-штамма P. vulgaris HX 19 222 при
посеве по 0,5 мл микробной взвеси из разведения 10-4 и тест-штамма S.
aureus Wood-46 при посеве по 0,5 мл микробной взвеси из разведения 10-1
через 4 4 -4 8 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С.
Поскольку среда Кесслера-ГРМ предназначена для визуального обна­
ружения роста микроорганизмов по помутнению среды, одним из главных
показателей среды является прозрачность. При посеве широкого набора
тест-штаммов из различных разведений от 10-4 до 10-7 рост лактозополо­
жительных тест-штаммов наблюдался во всех засеянных пробирках
при 37°С в виде помутнения среды и образования газа, лактозоотрица­
тельных - в виде помутнения среды и слабого газообразования или в виде
слабого диффузного помутнения среды без газообразования.
Наличие роста культур в пробирках со средой Кесслера-ГРМ проводили
визуально с последующим высевом микробной взвеси на чашки Петри с
питательной средой (ГРМ-агар) и последующей инкубацией при температу­
ре (37 ± 1)°С в течение 2 0 -2 4 ч. На всех чашках с питательной средой отме­
чен рост колиформных бактерий, слабый рост шигелл, почти отсутствовал
рост протеев, ингибировался рост стрептококка и стафилококка (табл. 16).

77
Таблица 16. С р авн и тельн ая хар ак тер и сти к а б и о ло ги ч еск и х п о к азател ей пи тательн ой
ср е д ы К е с с л е р а -Г Р М при тем пературе 37°С

№ Т е ст -ш т а м м ы К он тр оль П о к а за т е л и С реда К он тр ольн ы й в ы с е в


п/ п р о ст а к у л ь т у р ы р о ст а К есслер а- н а Г Р М -а г а р ч е р е з
н а Г Р М -а г а р е в ср е д е ГРМ 2 4 ч п о сл е к у л ь т и ­
(п о с е в н а я К есслер а- ви р о ван и я в ср е д е
д о за ) ГРМ К е с с л е р а -Г Р М

1. E. coli 675 27 газ + спл. рост


помутнение +
2. E. coli 3912/ 41 (055:K 59) 40 газ ± спл. рост
помутнение +
3. E. coli АТСС 25922 38 газ + спл. рост
помутнение +
4. E. coli 168/59 (0111:К58) 50 газ - спл. рост
помутнение +
5. E. coli Ewing 227 (0124) 47 газ - спл. рост
помутнение ±
6. E. aerogenes 10006 29 газ ± спл. рост
помутнение +
7. K. pneumoniae 418 33 газ + спл. рост
помутнение +
8. C. freundii 101/57 34 газ + спл. рост
помутнение +
9. S. typhi Н-901 ГДР/ГИСК 48 газ - спл. рост
помутнение ±
10. S. typhimurium 79 35 газ - спл. рост
помутнение ±
11. S. paratyphi А 225 23 газ - спл. рост
помутнение ±
12. S. paratyphi B 8006 30 газ - спл. рост
помутнение ±
13. S. typhi «bismuth» 51 газ - спл. рост
помутнение ±
14. S. sonnei «S-form» -120* газ - 300*
помутнение -
15. S. flexneri 1а 8516 -180* газ - нет роста
помутнение -
16. S. dysenteriae 1 1362 -150* газ - 200*
помутнение -
17. S. faecalis 775 -1000* газ - 6
помутнение -
18. P. mirabilis Сиднеев спл. рост газ - единичные
помутнение - колонии
19. P. vulgaris HX 19 222 спл. рост газ - нет роста
помутнение -
20. K. pneumoniae 3534/51 K56 -1000* газ ± спл. рост
помутнение +
21. Hafnia alvei 130 -1000* газ - 1000*
помутнение ±
22. Hafnia alvei 1 -1000* газ - 1000*
помутнение ±
23. P. aeruginosa 613-60 -100* газ - спл. рост
помутнение ±

78
Таблица 16. О кончание

№ Т е ст -ш т а м м ы К он тр оль П о к а за т е л и С реда К он тр ольн ы й в ы с е в


п/ п р о ст а к у л ь т у р ы р о ст а К есслер а- н а Г Р М -а г а р ч е р е з
н а Г Р М -а г а р е в ср е д е ГРМ 2 4 ч п о сл е к у л ь т и ­
(п о с е в н а я К есслер а- ви р о ван и я в ср е д е
д о за ) ГРМ К е с с л е р а -Г р М

24. P. aeruginosa 27/99 -100* газ - спл. рост


помутнение +
25. S. aureus Wood-46 спл. рост газ - нет роста
помутнение -
26. I. pseudotuberculosis III 32 газ - 500*
помутнение ±
27. I. enterocolitica 287 25 газ - 400*
помутнение ±
Примечание:«+» - реакции положительные;« - » - реакции отрицательные; «±» - реакции
слабоположительные * - подсчет вели ориентировочно, при наличии на чашке 100 и более колоний.

По результатам апробации среды Кесслера-ГРМ, проведенной в Ф Б У З


«Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области», было отмечено,
что при посеве свежевыделенных штаммов E. coli, Citrobacter, Klebsiella на
средах присутствовали рост и образование газа из минимальных посевных
доз (табл. 17).
По видам выделенные культуры распределены в таблице 18.
Результаты приведенных исследований позволяют сделать вывод, что
среда Кесслера-ГРМ проста, удобна в приготовлении, стандартна, обла-
дает высокой чувствительностью
в отношении БГКП.
Таблица 17. Р е з у л ь т а т ы б и о л о г и ч е с к о ­
го к о н тр о л я ср е д ы К е с с л е р а -Г Р М Аналогичные испытания среды
Н аи м ен о ва н и е К о л -в о В и д ы культур Кесслера-ГРМ были проведены
у ч р еж д ен и я п о сево в/ и к о л -в о
в Ф Б У З «Центр гигиены и эпиде­
/в ы д е л е н о
С м ы вы
ку л ь т у р миологии в Калужской области».
ЛПУ 50/4 E. coli - 2 Было исследовано 2175 проб в виде
K. pneumoniae - 1
S. infantis - 1
смывов, пищевых продуктов и т.д.
Детские 95/19 E. coli - 12 В качестве среды сравнения ис­
комбинаты K. pneumoniae - 3 пользовалась среда Кесслера лабо­
C. freundii - 4
раторного приготовления. В ходе
Предприятие 40/24 E. coli - 9
общ. питания K. pneumoniae - 15 исследований установлено, что вы-
Предприятие 10/0 являемость культур на среде Кес-
пищевой про­
мышленности
Пищевые Таблица 18. Р асп р еделен и е по ви дам
продукты
1
f

37°C 4 3°С
Детские 9/5 E. coli - 3
учреждения K. oxytoca - 2 Escherichia 26 24
Предприятие 3/1 K. pneumoniae Klebsiella 22 -
общ. питания Citrobacter 4 -
Молокозавод 11/0 - Salmonella 1 1

79
Таблица 19. Вы являем ое™ н а питатель­
слера-ГРМ выше по сравнению
н ы х ср е д а х при п о се ве о б р а зц о в с контрольной, так как количество
В ы я вл е н н ы е С реда С реда находок БГКП составило 103, что
ш там м ы при К есслер а- К есслер а
на 3 находки (по E. coli Lac - и E. coli
и сп ы тан и я х грм лаб ор ато р н о го
и зго т о в л е н и я Lac+) больше по сравнению с конт­
Количество 2715 2715 рольной средой (табл. 19).
посевов
Количество 103 100
находок 6 .2 .4 . С р е д а К о д а

БГКП, в т.ч. 98 95 (S D S - б у л ь о н )
E. coli Lac- 41 40
E. coli Lac+ 14 12
В связи с тем, что кишечная па­
K. pneumoniae 1 1
лочка в 95% случаев сбраживает
K. oxytoca 8 8
лактозу, этот углевод часто приме­
E. aerogenes 9 9
E. cloacae 8 8 няют при конструировании диф­
C. diversus 3 3 ференциальных сред, позволяю­
C. freundii 14 14 щих отличить кишечную палочку
P. aeruginosa 5 5 от других болезнетворных пред­
ставителей киш ечно-тифозной
группы. Все эти среды содержат лактозу и какой-либо индикатор.
Применение дифференциальных сред основано на том, что при росте на
них кишечной палочки расщепляется лактоза с образованием кислых
продуктов, изменяющих цвет индикатора. Так, для выделения и диффе­
ренциации энтеробактерий при санитарном обследовании пищевых про­
дуктов и объектов внешней среды, при контроле санитарно-гигиени­
ческого состояния производства и определении БГКП в смывах приме­
няются среды Кода [58].
Признаком роста лактозоположительных энтеробактерий (БГК П ) я в­
ляется изменение цвета среды с темно-зеленого до ярко-желтого; лакто­
зоотрицательных энтеробактерий (шигелл, сальмонелл) - помутнение
среды без изменения цвета.
Среда Кода, выпускаемая НПО «Микроген» в качестве азотистой осно­
вы, содержит пептон ферментативный или сухой питательный бульон на
гидролизате кильки, потребность в углеводном питании восполняет лак­
тоза, в качестве ингибитора используется сульфонол, а индикатором слу­
жит бромтимоловый синий.
Ведущие зарубежные фирмы выпускают аналоги среды Кода под назва­
нием Lauryl Tryptose Broth (лаурил-триптозный бульон) [148]. Среды
содержат: триптозу, лактозу, одно- и двузамещенный фосфаты калия, на­
трий лаурил сульфат (додецилсульфат натрия). Эти среды предназначены
для обнаружения колиформных бактерий при анализе воды, продуктов
и других объектов. Высокая питательная ценность и присутствие фосфат­

80
ного буфера в среде обеспечивают быстрый рост бактерий, даже медленно
ферментирующих лактозу. Лаурилсульфат подавляет рост сопутствую­
щей микрофлоры.
В нашей стране альтернативной средой Кода и близкой по назначению
и составу к импортной (Lauryl Tryptose Broth), содержащей натрий доде-
цилсульфат, является сухая питательная среда для выделения и иденти­
фикации энтеробактерий (S D S -бульон) на основе панкреатического гид­
ролизата рыбной муки, обладающая хорошими ростовыми дифференци­
рующими и селективными в отношении грамположительных микроорга­
низмов свойствами.
Состав, г/л:
Натрий додецилсульфат 0,5
Пептон сухой ферментативный 7,5
ПГРМ 7,5
Лактоза 1 0 ,0

Натрия хлорид 6 ,0

Бромтимоловый синий 0,05


Натрия карбонат 0,3 ± 0,05
рН от 7,3 до 7,7
Приготовление среды: 32,0 г питательной среды размешивают в 1 л
дистиллированной воды. Кипятят 1 - 2 мин и разливают по 5 мл в сте­
рильные пробирки. Не автоклавировать! Готовая среда после стерилиза­
ции кипячением прозрачная, зеленого цвета. Среду можно использовать
в течение 7 сут при условии ее хранения при температуре 2 -8 °С в тем­
ном месте.
Наличие роста и ферментацию лактозы в S D S -бульоне устанавливают
визуально по диффузному помутнению среды и изменению цвета среды
из зеленого в желтый (рис. 16).
Специфическая активность. Питательная среда (S D S -бульон) обеспе­
чивает во всех засеянных пробирках при посеве в 5 мл среды по 0,5 мл
микробной взвеси каждого тест-штамма: E. coli 675, E. coli Ewing (O 124K 72)
227, E. aerogenes 10006, K. pneumoniae 3534/51, C. freundii 101/57,
S. marcescens 1, S. flexneri 1a 8516 из разведения 10- 6 через 4 4 -4 8 ч инкуба­
ции при температуре (37 ± 1)°С (для E. coli 675 и E. aerogenes 10006 через
2 0 -2 4 ч) визуально обнаруживаемый рост тест-штаммов: E. coli 675,
E. aerogenes 10006, K. pneumoniae 3534/51, C. freundii 101/57, S. marcescens
1 в виде помутнения и изменения цвета среды из зеленого в желтый,

а тест-штаммов E. coli Ewing (O 124K 72 ) 227 и S. flexneri 1a 8516 в виде по­


мутнения без изменения исходного цвета среды.
Показатель инги Б и ц и и . Питательная среда полностью подавляет рост
тест-штаммов P. vulgaris HX 19 222 и S. aureus W ood-46 во всех пробир-

81
Рис. 16. Р о с т к о н т р о л ь н ы х т е с т - ш т а м м о в в S D S - б у л ь о н е . Слева-направо: контроль (неза­
сеянная среда), S. aureus W ood-46, P. vulgaris H X 19222, K. pneum oniae 3 5 3 4 /5 1 , C. freun dii
101/57, E. coli Ewing (O 124K 72) 227, E. coli 675, S. marcescens 1, E. aerogenes 10006, S. flexn eri
1a 8516.

ках при посеве по 0,5 мл микроб­


ной взвеси из разведения 10-1 через
Таблица 20. В ы являем о сть эн тер о бак­ 4 4 -4 8 ч инкубации при температу­
терий на S D S -б у л ь о н е и ср еде Кода ре (37 ± 1)°С.
Н П О «М и к р о ге н » при п о се ве о б р а зц о в
Клинические испытания SDS-
( по р езу льтатам н а д в у х б а за х )
бульона по микробиологическим по­
В ы я вл е н н ы е S D S -б у л ь о н С реда К ода
ш там м ы при казателям как на свежевыделенных,
и сп ы тан и я х так и на музейных штаммах энтеро­
to

to
О

Количество
посевов
бактерий были проведены в Ф Б У З
Количество 110 96 «Центр гигиены и эпидемиологии
положительных в Московской области» и Ф Б У З
находок
энтеробактерий, «Центр гигиены и эпидемиологии
в т. ч. в Калужской области» (табл. 20).
E. coli Lac+ 49 40 В результате проведенных иссле­
C. freundii 22 22
дований установлено, что по коли­
C. diversus 2 1
честву положительных находок эн­
K. pneumoniae 26 22
S. infantis 1 1 теробактерий, в частности E. coli
K. oxytoca 2 2 Lac+ и K. pneumoniae, питательная
E. cloacae 2 2 среда для выделения и идентифи­
E. aerogenes 2 2 кации энтеробактерий (SD S-буль­
E. coli Lac- 4 4 он) превосходит среду Кода.

82
6.2.5. Бу л ь о н Ма к Ко н к и

Фармакопеей СШ А (U S P X X III 1995) и Европейской фармакопеей


(Е Р II) [143] для непосредственного посева проб воды с целью обнару­
жения, выделения и подсчета колиформных микроорганизмов и ки­
шечных патогенов рекомендованы бульоны МакКонки. Эти среды
могут быть также использованы для обнаружения и выделения энте­
ропатогенов в фекалиях, моче, пищевых продуктах и других объектах
[4, 134].
Принцип действия бульонов МакКонки основан на способности E. coli
ферментировать входящую в состав сред лактозу с образованием кислоты
и газа [40]. Образование кислоты обнаруживается по изменению цвета
среды в желтый, а газообразование - по наличию собравшегося в поплав­
ках газа. Желчь обеспечивает рост интестинальных бактерий и подавляет
рост грамположительных микроорганизмов.
Бульоны МакКонки выпускаются ведущими зарубежными производи­
телями и имеют одинаковый количественный состав. Качественно они
отличаются питательной основой и индикатором. Питательной основой
служат: пептон мясной, панкреатические гидролизаты казеина и желатина
либо комбинации смеси этих основ.
В составе бульона МакКонки-ГРМ в качестве азотистой основы исполь­
зуется смесь ПГРМ с пептоном, что обеспечивает хорошие ростовые свой­
ства тест-штаммов микроорганизмов.
В качестве индикатора в бульоне МакКонки-ГРМ были апробированы
нейтральный красный и бромкрезоловый пурпурный. При визуальной
оценке изменения окраски среды в результате роста E. coli и колиформных
бактерий лучшие показатели были достигнуты с использованием бром-
крезолового пурпурного в концентрации 0,04 г/л. Входящие в состав
бульона МакКонки желчь очищенная и кристаллический фиолетовый
обеспечивают улучшенную дифференциацию между ферментирующими
и не ферментирующими лактозу микроорганизмами при отсутствии грам-
положительных кокков.
Состав бульона МакКонки-ГРМ, г/л:
ПГРМ 10,0
Пептон сухой ферментативный 10,0
Дрожжевой экстракт 1,0
Лактоза 10,0
Натрий хлористый 3,0
Желчь крупного рогатого скота очищенная 5,0-7,0
Бромкрезоловый пурпурный водорастворимый 0,04
рН от 7,0 до 7,4

83
Рис. 17. Р о с т т е с т - ш т а м м о в н а б у л ь о н е М а к К о н к и - Г Р М . Слева направо: контроль
(незасеянная среда), S. aureus 209 Р, S. flexn eri 1a 8516, S. typhimurium 79, E. coli АТСС 25922,
K. pneum oniae 418.

Приготовление среды: препарат в количестве, указанном на этикетке


для приготовления конкретной серии питательной среды, тщательно раз­
мешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин, фильтруют через
бумажный фильтр, разливают по 5 мл в стерильные пробирки с поплавка­
ми и стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение
15 мин. Готовая среда прозрачная, красновато-фиолетового цвета. Готовую
среду используют в течение 2 нед при температуре хранения 2-8°С .
Обнаружение E. coli и колиформных бактерий в бульоне МакКонки-ГРМ
основано на визуальном обнаружении изменения исходного цвета среды
из красновато-фиолетового в желтый и наличия пузырьков газа в поплав­
ках при росте микроорганизмов, способных ферментировать лактозу.
Специфическая активность. Бульон МакКонки-ГРМ обеспечивает во
всех засеянных пробирках при посеве в 5 мл среды по 0,5 мл микробной
взвеси каждого тест-штамма из разведения 10-6 через 2 2 -2 4 ч инкубации
при температуре (37 ± 1)°С визуально обнаруживаемый рост: E. coli
3912/41 (О 55:К 59), E. coli АТСС 25922, K. pneumoniae 418, E. aerogenes
10006 - в виде диффузного помутнения среды, изменения цвета среды из
красновато-фиолетового в желтый, с образованием газа в поплавках;
S. flexneri 1a 8516, S. typhimurium 79 - в виде диффузного помутнения
среды, без газообразования и изменения исходного цвета среды; S. aureus
209 Р - рост подавлен (слабое диффузное помутнение среды), без газо­
образования и изменения исходного цвета среды (рис. 17).
С целью оценки качества сред по показателям чувствительности и ин­
гибирующим свойствам проведен контроль в сравнении с импортным
бульоном МакКонки [148] по определенному перечню тест-штаммов,
наглядно демонстрирующему чувствительность, специфичность, диффе-

84
Таблица 21. С равн ительн ая хар актер и сти ка бульонов М акК онки о т еч ествен н о го
и и н остр ан н ого п р о и зв о д ст в а по б и о ло ги ч ески м п о к азател я м

С реды Б и о л о ги ч е ск и е п о к а за т е л и
ср авн ен и я

Е. coli Е coli Е. coli K. pneu- S. flexneri S. typhi- S. aureus


3 9 4 i/i2 1 6 8 /5 9 a t c c moniae ia 8 5 i6 murium W o o d -4 6
0 5 5 :К 5 9 O i i i :K 5 8 25922 4 i8 79

Бульон Измене- Измене- Измене- Измене- К-та - К-та - Нет роста


МакКонки ние цвета ние цвета ние цвета ние цвета Газ - Газ -
ГРМ среды среды среды среды
в желтый в желтый в желтый в желтый
К-та + К-та + К-та + К-та +
Газ + Газ + Газ + Газ +
Бульон Измене- Измене- Измене- Измене- К-та - К-та - Нет роста
МакКонки ние цвета ние цвета ние цвета ние цвета Газ - Газ -
импортного среды в среды в среды в среды
производства желтый желтый желтый в желтый
К-та + К-та + К-та + К-та +
Газ + Газ + Газ + Газ +

ренцирующие и ингибирующие свойства среды. Сравнительные характе­


ристики бульонов МакКонки по биологическим показателям представле­
ны в табл. 21.
Клинические испытания бульона МакКонки-ГРМ проводились в Ф Б У З
«Центр гигиены и эпидемиологии в Ярославской области» и Ф Б У З
«Центр гигиены и эпидемиологии в Ставропольском крае» в соответствии
с инструкциями по применению.
В качестве штаммов для оценки качества питательной среды МакКонки-
ГРМ использовали свежевыделенные из клинического материала и иден­
тифицированные до вида культуры микроорганизмы. Все штаммы были
типичны по своим культурально-морфологическим и биохимическим
свойствам.
Специфическая активность бульона МакКонки-ГРМ определялась при
посеве клинического материала (112 образцов фекалий) по визуально об­
наруживаемому росту (диффузное помутнение с изменением или без из­
менения цвета среды, газообразование либо отсутствие газа). Принадлеж­
ность к энтеробактериям дополнительно подтверждалась пересевом на
дифференциально диагностические среды Эндо, Левина, Висмут-суль-
фит-агар. После определения биохимических свойств отобранных коло­
ний с использованием различных тест-систем и проведения серологи­
ческой типизации была подтверждена родовая и видовая принадлежность
к энтеробактериям только в 13 образцах. Выделенная культура идентифи­
цировалась как S. enteritidis (Л а к -) - 4 изолята, S. sonnei III d (Л а к -) -
1 изолят, S. typhimurium (Л а к -) - 2 изолята, S. flexneri 1 b (Л а к -) - 2 изо­
лята, S. oranienburg (Л а к -) - 1 изолят, S. sonnei II g (Л а к -) - 2 изолята,
E. coli (Л ак +) - 1 изолят.

85
Проведенные испытания бульонов МакКонки доказали, что лактоза,
входящая в состав сред, является субстратом, отношение к которому явля­
ется диагностическим признаком E. coli и колиформных микроорганиз­
мов. Наличие в средах желчи придает селективность, а присутствие инди­
катора позволяет судить о биохимических реакциях и наличии определен­
ной ферментной системы, а следовательно, позволяет отличить клоны,
сбраживающие лактозу.

6 .2 .6 . Б ульон М осселя

Среда разработана Mossel (1963, 1964) с соавт. для селективного


накопления энтеробактерий из пищевых продуктов и других источни­
ков [155].
Принцип действия питательной среды основан на ингибирующей спо­
собности бычьей желчи и бриллиантового зеленого в отношении нежела­
тельной сопутствующей бактериальной флоры, в то время как глюкоза,
входящая в состав среды, способствует росту всех энтеробактерий. Бульон
Мосселя обладает большой буферной емкостью, что в значительной сте­
пени защищает культуру от губительного воздействия кислоты, образую­
щейся при ферментации глюкозы в процессе жизнедеятельности микро­
организмов.
В качестве питательной основы в таких бульонах обычно использует­
ся панкреатический гидролизат желатина, триптон, пептон мясной и др.
Составы бульонов Мосселя различных фирм-изготовителей [135, 148]
идентичны и содержат в основном панкреатический гидролизат желати­
на или пептон мясной (10,0 г/л ), глюкозу (5 ,0 -5 ,5 г/л ), желчь бычью
(20,0 г/л ), бриллиантовый зеленый (0 ,0 1 3 5 -0 ,0 1 5 г/л ) и фофатный
буфер.
Особенностью бульонов является достаточно высокая концентрация
желчи в среде. В то же время среда должна быть прозрачной. Внесение
нативной желчи или желчи сухой очищенной в состав бульона Мосселя
приводило к образованию осадка и опалесценции среды. Поэтому основ­
ной целью при разработке бульона Мосселя (производства Ф Б У Н ГНЦ
П М Б) было создание отечественной сухой питательной среды для се­
лективного накопления энтеробактерий, прозрачной в готовом к приме­
нению состоянии, не требующей дополнительной фильтрации и облада­
ющей более высокими селективными свойствами с целью обеспечения
доступности и получения объективных результатов бактериологическо­
го контроля.
Для достижения прозрачности готовой питательной среды была специ­
ально разработана технология осветления желчи. Для этого проводилась

86
предварительная подготовка сырой желчи. Из нативной желчи КРС осаж­
дали белки и высокомолекулярные пептиды в двух изоэлектрических
точках при рН 3,5 и 8,5, кипятили в течение 10 мин с последующей филь­
трацией при каждом значении рН через фильтровальную ткань (бель-
тинг). Заключительный этап подготовки желчи состоял из адсорбции
примесей активным углем и внесения, с целью окончательного осветле­
ния желчи, расчетного количества двузамещенного фосфата натрия в пе­
ресчете на содержание сухих веществ кипячения и фильтрации. Это по­
зволило исключить дополнительное внесение фосфата натрия в состав
среды и обеспечило прозрачность и высокую буферную емкость готовой
среды [81].
В бульоне Мосселя отечественного производства (Ф Б У Н ГНЦ П М Б)
в качестве белковой питательной основы использовали ПГРМ, который
обеспечивает достаточно эффективное накопление энтеробактерий в мак­
симально короткий срок.
Для определения ростовых свойств засев производили по 0,5 мл ми­
кробной взвеси каждого из тест-штаммов из разведения 10-6 в 5,0 мл
бульона Мосселя, т.е. 500 микробных клеток (м.кл.) в 5 мл среды. Посевы
инкубировали при температуре (37 ± 1)°С в течение 2 0 -2 4 ч. Учет резуль­
татов проводили визуально по диффузному помутнению среды.
Эффективность среды - выход м.кл. с 1 мл питательной среды и при­
рост числа микроорганизмов относительно засеянного (показатель эф­
фективности) определяли в соответствии с М УК 4.2.2316-08 «Методы
контроля бактериологических питательных сред» [65].
Для получения предварительных данных по определению показателя
эффективности бульона Мосселя из засеянных пробирок каждого тест­
штамма, содержащих 100 м.кл./мл (нулевой посев), производили высев по
0,1 мл микробной взвеси на чашки Петри с ГРМ-агаром.
Через 1 8 -2 0 ч инкубации посевов на ГРМ-агаре при температуре
(37 ± 1)°С производили подсчет сформировавшихся колоний. Показа­
тель эффективности рассчитывали по отношению числа колоний после
инкубации культуры в накопительной среде к числу колоний при нулевом
посеве.
Сравнительная характеристика показателей эффективности бульона
Мосселя различных фирм-производителей представлена в табл. 22.
Визуальный учет результатов накопления энтеробактерий по оконча­
нии срока инкубации посевов в бульонах Мосселя был идентичен.
Значения коэффициентов эффективности для энтеробактерий находят­
ся в пределах от 3 до 30, в зависимости от исследуемого штамма. Наиболее
эффективное накопление наблюдалось при культивировании эшерихий,
клебсиелл, в меньшей степени - шигелл.

87
Таблица 22. П о к а з а т е л ь эф е э е к т и в н о с т и б у л ь о н а М о с с е л я

Н аи м ен о ва н и е В р ем я культи­ Бульон Бульон К оэф ф и ц и ен т эф ф ек ти вн о сти


т е ст-ш там м о в ви р о в а н и я , ч М осселя М о сселя
с бульона с бульона
о т еч ествен н ы й им портны й
М осселя М о ссе л я [8 2 ]
[8 2 ] отеч ествен н о го им п ортного

E. coli АТСС 0 5 4
25922 19,2 3,5
3 96 14
E. coli О55:К59 0 12 13
3912/41 28 13
3 336 170
S. flexneri 0 2 2
1a8516 3 4
3 6 8
S. typhimurium 0 14 6
79 7,1 18
3 100 110
K. pneumoniae 0 7 7
418 21,4 18
3 150 126
K. pneumoniae 0 9 8
3534/51 17,4 16
3 157 129

Сухая коммерческая питательная среда для селективного накопления


всех видов энтеробактерий (бульон Мосселя) имеет следующий состав, г/л:
ПГРМ сухой или пептон мясной 10,0
Желчь очищенная модифицированная
(Ж О М ) сухая 32,0
Глюкоза 5,0
Натрий хлористый 2,4
Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,5
Бриллиантовый зеленый 0,015
Натрий углекислый 0,15 ± 0,05
рН от 7,0 до 7,5
Приготовление среды: препарат в количестве, указанном на этикетке
для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают
в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин, фильтруют через ватно­
марлевый фильтр, стерилизуют автоклавированием при температуре
121°С в течение 15 мин и разливают в пробирки по 5,0 мл.
Готовая питательная среда прозрачная, зеленого цвета.
Контроль специфической активности питательной среды допускается
осуществлять в течение 7 сут после ее приготовления при условии хране­
ния при температуре 2-8°С .
Результаты биологического контроля бульона Мосселя на контрольных
тест-штаммах представлены на рис. 18.
Питательные бульоны Мосселя для селективного обогащения энте­
робактерий имеют ряд преимуществ: среды просты в приготовле­
нии; имеют высокую эффективность накопления энтеробактерий, вы-

88
Рис. 18. Р о с т к о н т р о л ь н ы х т е с т - ш т а м м о в . Слева направо: E. coli А ТСС 25922, S. flexn eri 1a
8516, K. pneum oniae 353 4 /5 1 , E. coli О 55:К59 39 1 2 /4 1 , S. typhimurium 79, S. aureus W ood-46,
контроль (незасеянная пробирка).

сокий ингибирующий эффект среды в отношении стафилококков, по­


этому используются для проведения бактериологического исследова­
ния клинического и другого материала с целью предварительного вы ­
явления возбудителей инфекционных заболеваний, вызванных энтеро­
бактериями.

6 .2 .7 . С реды для накопления сальмонелл

Заболевания сальмонеллезом характеризуются язвенным поражением


лимфатической системы тонкой кишки, бактериемией, лихорадкой, ци­
клическим клиническим течением с выраженной интоксикацией, розео-
лезной сыпью на кожных покровах туловища, гепато- и спленомегалией.
Изъязвление пейеровых бляшек подвздошной кишки примерно в 1% слу­
чаев приводит к кишечному кровотечению и прободению кишечника с са­
мыми неблагоприятными последствиями для больного.
Болезни, связанные с употреблением пищевых продуктов, известны
с древних времен. Считалось, что они обусловлены наличием в продук­
тах токсинов. В 1888 г. немецкий ученый А.Гертнер (A.Gertner) во время
вспышки пищевых отравлений в Тюрингии выделил из мяса коровы и
селезенки человека, погибшего в результате употребления этого мяса,
один и тот же микроорганизм. Оказалось, что он идентичен микробу, вы ­
деленному в 1885 г. Д.Сальмоном (D.Salm on) и Т.Смитом (^ S m ith ) из

89
организма свиней, который, как считали авторы, является возбудителем
свиной чумы. В 1898 г. этот микроб и сходные с ним по морфологии
и биологическим свойствам микроорганизмы были названы в честь
Сальмона сальмонеллами. В последующие годы ежегодно выделялось
до 50 новых разновидностей сальмонелл. В 1933 г. в соответствии с реко­
мендацией Международного номенклатурного комитета все эти микро­
организмы получили родовое название Salmonella, а болезнь, вызывае­
мая ими, - сальмонеллез [132].
Степень тяжести болезни, а следовательно, и жизнь больного зависят
от быстрых результатов бактериологического исследования, подтверж­
дающего диагноз и этиологию заболевания. Диагностика сальмонелле­
за, так же как и острых кишечных инфекций, основывается на непремен­
ном использовании питательных сред для селективного выделения этих
бактерий.
В настоящее время известен ряд схем, используемых в различных стра­
нах для выделения сальмонелл. В идеале для этого должны быть выбраны
высокочувствительные и специфичные методы. В то же время эти методы
должны быть простыми, быстрыми и недорогими [45, 63].
В течение нескольких десятилетий в практике здравоохранения Р Ф
применяются магниевая и селенитовая среды накопления для выделения
сальмонелл из различных объектов [9, 43, 64, 113]. По росту на простом
агаре и обычных жидких питательных средах сальмонеллы почти нераз­
личимы. Но основным моментом в средах обогащения являются наличие
эффекта накопления сальмонелл из исследуемых образцов различной сте­
пени биологического загрязнения и ингибирующая способность по отно­
шению к сопутствующей микрофлоре.
Ведущими зарубежными и отечественными фирмами выпускаются ана­
логи Modified Rappaport Vassiliadis Medium (среда Раппапорта-Васси-
лиадиса модифицированная) Himedia, Магниевая среда (БиоКомпас-С),
R V S-бульон (Ф Б У Н ГНЦ П М Б), RVS broth - накопительный бульон по
Раппапорту-Вассилиадису (M erck) и т.д.

6.2.7.1. R V S-бульон
В число признанных сред, способствующих преимущественному нако­
плению сальмонелл, наряду с признанными селенитовым бульоном,
бульоном Мюллера и т.д., относятся среды с использованием соли магния
в качестве селективного агента. Среда с магнием имеет ряд модификаций,
которые часто обозначают общим названием - бульон Раппапорта-
Вассилиадиса (R V S -бульон) [148].
R V S-бульон обеспечивает питательные потребности для визуального
обнаружения роста сальмонелл (за исключением S. typhi и S. paratyphi А).

90
Ингибирующие свойства среды основаны на дегидратирующем действии
магния хлорида в отношении эшерихий, малахитового зеленого в отноше­
нии грамположительной микрофлоры. Низкое значение рН увеличивает
селективность бульона, что очень важно при исследовании объектов,
высококонтаминированных различными сопутствующими микроорга­
низмами.
Ведущими зарубежными фирмами выпускается ряд питательных сред
для селективного накопления сальмонелл. Белковой основой зарубеж­
ных аналогов являются казеиновые и соевые пептоны 4 ,5 -5 ,0 г/л, хлори­
стый магний 1 8 ,7 3 -4 0 ,0 г/л , натрий хлористый 7 ,2 -8 ,0 г/л , калий
фосфорнокислый однозамещенный 0 ,6 -1 ,6 г/л , малахитовый зеленый
0 ,0 3 6 -0 ,0 4 г/л , калий фосфорнокислый двузамещенный 0 ,2 -0 ,4 г/л.
[82, 148, 154].
Результаты роста тест-штаммов микроорганизмов на R V S-бульоне оце­
нивают визуально по диффузному помутнению среды и результатам высева
по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из R V S-бульона на агар
Эндо-ГРМ. Эффективность среды, т.е. прирост числа микроорганизмов от­
носительно засеянного, определяли в соответствии с М УК 4.2.2316-08 [65].
Прирост числа микроорганизмов вычисляют по формуле:
П\ х K
Э , где
n0
Э - показатель эффективности (прирост); n - среднее число колоний, вы ­
росших на агаре Эндо-ГРМ; П0 - среднее число колоний при «нулевом
посеве»; К - степень разведения.
Установлено, что концентрация 15,0 г/л безводного хлористого магния
и 0,04 г/л малахитового зеленого обеспечивает высокие ингибирующие
свойства среды в отношении эшерихий и стафилококков и не оказывает
влияния на рост сальмонелл.
Состав сухого отечественного питательного бульона для накопления
сальмонелл (R V S -бульон), г/л:
Соевый пептон 1,0
ПГРМ 4,0
Магний хлористый безводный 15,0
Натрий хлористый 8,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,6
Малахитовый зеленый 0,04
Натрий углекислый 0,1 —0,3
рН от 5,0 до 5,4
Приготовление среды: 30 г препарата тщательно размешивают в 1 л
дистиллированной воды кипятят в течение 2 мин, фильтруют через

91
Рис. 19. Р о с т т е с т - ш т а м м о в н а R V S - б у л ь о н е ( о т е ч е с т в е н н о г о п р о и з в о д с т в а ) . Слева на­
право: контроль (незасеянная среда), E. coli А ТСС 25922 (2 пробирки), S. enteritidis 11272
(2 пробирки), S. typhimurium 79 (2 пробирки).

ватно-марлевый фильтр, разливают по 10 мл в стеклянные пробирки


и стерилизуют автоклавированием при температуре 112°С в течение
20 мин.
Готовая среда в пробирках прозрачная, темно-голубого цвета.
Готовую среду можно использовать в течение 1 мес после ее приготов­
ления при условии хранения при температуре 2-8°С .
Специфическая активность. R V S -бульон обеспечивает во всех засеян­
ных пробирках при посеве в 10 мл среды по 1,0 мл микробной взвеси из
разведения 10-6 через (24 ± 3) ч инкубации при температуре (41,5 ± 1)°С
визуально обнаруживаемый рост каждого тест-штамма S. enteritidis 11272
и S. typhimurium 79 в виде диффузного помутнения среды.
Ингибирующие свойства. Питательная среда полностью подавляет во
всех засеянных пробирках рост тест-штамма E. coli ATCC 25922 при по­
севе по 1,0 мл микробной взвеси из разведения 10-4 через (24 ± 3) ч инку­
бации при температуре (41,5 ± 1)°С.
Рост сальмонелл в R V S -бульоне в виде диффузного помутнения на­
глядно продемонстрирован на рис. 19.
Биологические показатели сред и R V S-бульона (производства Merck)
на основных культурах микроорганизмов представлены в табл. 23.
Из таблиц видно, что R V S -бульоны различных производителей имеют
идентичные результаты: обеспечивают рост сальмонелл (за исключением
S. typhi) и ингибируют рост эшерихий и шигелл.
Контрольный высев после культивирования в R V S -бульонах дополни­
тельных тест-штаммов на среды Эндо-ГРМ и питательную среду № 1-ГРМ
представлен в табл. 24.

92
Таблица 23. Б и о л о ги ч еск и й контроль бульон ов по Р а п п а п о р т у -В а с с и л и а д и с у (R V S
б у л ь о н )*

Т е ст -ш т а м м ы (р а з в е д е н и я ) R V S -б у л ь о н К он тр . в ы с е в R V S -б у л ь о н К он тр . в ы с е в
(о т е ч е с т в е н ­ п о сл е к у л ь т и в и ­ импортны й п о сл е к у л ь ­
ный) р о ван и я в R V S - (M e rc k ) тиви р ован и я
б у л ь о н е (о т е ч . в R V S -б у л ь о н е
п р о и з .) н а ага р ( M e r c k ) н а а га р
Э н д о -Г Р М Э н д о -Г Р М

S. flexneri 1 a 8516 10-4 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
S. sonnei «S-form» 10-4 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
S. typhi H-901 ГДР/ГИСК 10-6 Помутнение 6 кол. Помутнение 3 кол.
отсутствует 1,0-1,5 отсутствует 1,0-1,5
Бесцв. или Бесцв. или
слегка розов., слегка розов.,
круглые, прозр. круглые, прозр.
S. paratyphi А-225 10-6 Слабое Сплошной рост Слабое Сплошной рост
помутнение помутнение
S. paratyphi В-8006 10-6 Дифф. Сплошной рост Дифф. Сплошной рост
помутнение помутнение
S. typhimurium 79 10-6 Дифф. Сплошной рост Дифф. Сплошной рост
помутнение помутнение
S. typhi «bismuth» 869 10-6 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
S. gallinarum 665 10-6 Помутнение Сплошной рост помутнение Сплошной рост
S. london 3496 10-6 Дифф. Сплошной рост Дифф. Сплошной рост
помутнение помутнение
S. enteritidis 11272 10-6 Дифф. Сплошной рост Дифф. Сплошной рост
помутнение помутнение
E. coli 168/59 (O111:K58) 10-4 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
E. coli АТСС 25922 10-4 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
E. coli 675 10-4 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
S. choleraesuis 10-6 Дифф. Сплошной рост Дифф. Сплошной рост
помутнение помутнение
* Посевная доза 100 м.к. в 1 мл RVS-бульона.

Таблица 24. К онтрольны й вы сев п о сле культивир ован ия в R V S бульоне на ср еду


Э н д о -Г Р М *

Т е ст -ш т а м м ы К он тр. К он тр. К он тр. К он тр.


в ы с е в п о сл е в ы с е в п о сл е в ы с е в п о сл е в ы с е в п о сл е
к у льт и в и р о ван и я к у льт и в и р о ван и я к у льт и в и р о ван и я к у льт и в и р о ван и я
в R V S -б у л ь о н е в R V S -б у л ь о н е в R V S -б у л ь о н е в R V S -б у л ь о н е
(о т е ч . п р о и з .) на (о т е ч . п р о и з .) ( M e r c k ) н а А га р (M e rc k )
А га р Э н д о -Г р М н а ср е д у Э н д о -Г Р М на ср еду
№ 1 -Г Р М № 1 -Г Р М

C. albicans ATCC 60193 Нет роста Нет роста 1 Нет роста


d <0,8 мм
Слабо-розовая
S. aureus 209-P Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
S. aureus Wood-46 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
K. pneumoniae 418 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
S. marcescens 1 1 3 1 Нет роста
d 1,0 мм d 1,0-1,2 мм d 1,0 мм
бесцветная без пигмента бесцветная

93
Таблица 24. О кончание

Т е ст -ш т а м м ы К он тр. К он тр. К он тр. К он тр.


в ы с е в п о сл е в ы с е в п о сл е в ы с е в п о сл е в ы с е в п о сл е
к у льт и в и р о ван и я к у льт и в и р о ван и я к у льт и в и р о ван и я к у льт и в и р о ван и я
в R V S -б у л ь о н е в R V S -б у л ь о н е в R V S -б у л ь о н е в R V S -б у л ь о н е
(о т е ч . п р о и з ) н а (о т е ч . п р о и з ) н а (М е т е к ) н а А га р (М е т е к ) н а с р е д у
А га р Э н д о -Г Р М среду № 1 - г Р м Э н д о -Г Р М № 1 ГРМ

P. aeruginosa 27/99 4 9 Сливной рост Сливной рост


d 4,0-6,0 мм d 3,0-7,0 мм d 3,0-4,0 мм d 4,5 мм
гладкие, гладкие, гладкие,
блестящие блестящие блестящие, слабый
зеленый пигмент
P. aeruginosa 453 Нет роста Нет роста Сливной рост Сливной рост
d 10,0 мм d 4,0-7,0 мм
гладкие, типичные,
расплывчатые слабый зеленый
пигмент
E. aerogenes 10006 Сплошной рост, Сплошной рост Сплошной рост, Сплошной рост
малиновые малиновые
E. cloacae A-186 Сливной рост, Сплошной рост Сплошной рост, Сплошной рост
слабо-розовые слабо-розовые
P. vulgaris HX 19 222 Нет роста Нет роста Сливной рост 15
без роения, роение
розового цвета
B. cereus 8035 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
E. coli Ewing 227 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
* Посевная доза 100 м.к. в 1 мл RVS-бульона.

Результаты проведенных исследований показали, что в импортном


R V S-бульоне, в отличие от отечественного бульона, для накопления саль­
монелл отмечена недостаточная ингибиция псевдомонад и протеев, что
может затруднять интерпретацию результатов при просмотре чашек после
высева из таких сред накопления.

6.2.7.2. Магниевая среда


При обнаружении сальмонелл в пищевых продуктах, объектах окружаю­
щей среды, а также при лабораторной диагностике сальмонеллезов исполь­
зуют среды обогащения. При этом можно использовать как среды отечест­
венного производства, так и импортные, разрешенные к реализации в Рос­
сии. При необходимости допускается приготовление некоторых сред в ла­
бораторных условиях, одной из которых является магниевая среда [16, 53,
59, 63, 64]. Селективность питательной среды основана на ингибирующей
способности хлористого магния в отношении эшерихий, а бриллиантового
и малахитового зеленого - в отношении сопутствующей микрофлоры.
Состав магниевой среды лабораторного приготовления включает: пеп­
тон ферментативный - 4,2 г, натрий хлористый - 7,15 г, калий дигидро­
фосфат - 1,48 г, дрожжевой экстракт - 9,0 мл, воду дистиллированную -
890,0 мл. Отдельно готовят растворы: магний хлористый 35,7 г, вода дис­

94
тиллированная 90,0 мл; бриллиантовый зеленый 0,5%-ный водный рас­
твор - 0,9 мл. Все три раствора в указанных количествах смешивают,
разливают в необходимых объемах в колбы, флаконы или пробирки, сте­
рилизуют при 112°C 30 мин [59, 64].
Сухая питательная среда для накопления сальмонелл (Магниевая
среда) отечественного производства имеет следующий состав, г/л:
ПГРМ 4,0
Магний хлористый безводный 15,0
Натрий хлористый 8,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,6
Бриллиантовый зеленый 0,0045
Малахитовый зеленый 0,001

со
Натрий углекислый

о
рН от 5,0 до 5,4
Приготовление среды: 29,0 г сухой питательной среды тщательно разме­
шивают в 1 л дистиллированной воды кипятят в течение 2 мин, фильтруют
через ватно-марлевый фильтр, разливают по 10 мл в стеклянные пробирки и
стерилизуют автоклавированием при температуре 112°С в течение 20 мин.
Готовая среда в пробирках прозрачная, сине-зеленого цвета.
Контроль специфической активности питательной среды допускается
осуществлять в течение 7 сут после ее приготовления при условии хране­
ния при температуре 2-8°С .
Специфическая активность. Магниевая среда обеспечивает во всех за­
сеянных пробирках при посеве в 10 мл среды по 1,0 мл микробной взвеси
из разведения 10-6 через (24 ± 3) ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С
визуально обнаруживаемый рост каждого тест-штамма S. enteritidis 11272
и S. typhimurium 79 в виде диффузного помутнения среды.
Показатель эффективности. Показатель эффективности должен быть не
менее 10 (отношение среднего числа колоний, выросших на чашках с ГРМ-
агаром, либо на среде аналогичного назначения, после обогащения в течение
6 ч в Магниевой среде, к среднему числу колоний, выросших до обогащения).
Ингибирующие свойства. При посеве в магниевую среду по 1,0 мл мик­
робной взвеси тест-штамма E. coli ATCC 25922 из разведения 10-5 через
(24 ± 3) ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С визуально обнаруживае­
мый рост должен отсутствовать во всех засеянных пробирках.
Биологические показатели Магниевой среды на расширенном наборе
тест-штаммов представлены в табл. 25. Контрольной средой сравнения
являлся питательный бульон для накопления сальмонелл по Раппапорту-
Вассилиадису (R V S -бульон).
При определении ингибирующих свойств Магниевой среды параллель­
но проводили посев всех тест-штаммов в ГРМ-бульон, где наблюдался

95
Таблица 25. Б и о л о ги ч еск и е п о к азател и М агн и ево й ср еды н а р асш и р ен н о м наборе
т е с т -ш т а м м о в .

№ Н аи м ен о ва н и е Р азве­ М а гн и е в а я ср е д а К он тр ол ь R V S -б у л ь о н
п/ п т ест -ш т ам м а ден и е

1. S. typhimurium 79 10-6 Диффузное помутнение Диффузное помутнение


2. S. abony IHE 103/39 10-6 Диффузное помутнение Диффузное помутнение
3. S. enteritidis 11272 10-6 Диффузное помутнение Диффузное помутнение
4. S. london 3496 10-6 Диффузное помутнение Диффузное помутнение
5. S. typhi «bismuth» 10-6 Слабое диффузное помутнение Диффузное помутнение
6. S. paratyphi B 8006 10-6 Диффузное помутнение Диффузное помутнение
7. S. enterica meunchen O6 10-6 Диффузное помутнение Диффузное помутнение
8. E. coli О111 168/59 10-5 Визуальное отсутствие роста Визуальное отсутствие роста
9. E. coli АТСС 25922 10-5 Визуальное отсутствие роста Визуальное отсутствие роста
10. S. flexneri 1a 8516 10-5 Визуальное отсутствие роста Визуальное отсутствие роста
11. S. sonnei «S form» 10-5 Визуальное отсутствие роста Визуальное отсутствие роста
12. K. pneumoniae 418 10-5 Визуальное отсутствие роста Визуальное отсутствие роста
13. K. pneumoniae 3534/51 10-5 Визуальное отсутствие роста Визуальное отсутствие роста
14. S. pyogenes 1911 10-5 Визуальное отсутствие роста Визуальное отсутствие роста
15. S. aureus Wood-46 10-5 Визуальное отсутствие роста Визуальное отсутствие роста
16. P. vulgaris HX 19 222 10-5 Визуальное отсутствие роста Визуальное отсутствие роста
17. P. aeruginosa 27/99 10-5 Визуальное отсутствие роста Визуальное отсутствие роста

рост каждого тест-штамма в виде помутнения среды через (24 ± 3) ч инку­


бации при температуре (37 ± 1)°C.
Из полученных результатов видно, что среда обеспечивает питательные
потребности для роста и накопления сальмонелл. Селективные свойства
среды основаны на низком значении рН и ингибирующем действии хло­
ристого магния, малахитового зеленого, бриллиантового зеленого в отно­
шении ряда грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов,
таких как эшерихии, шигеллы, стафилококки, протеи, клебсиеллы, стреп­
тококки, псевдомонады и т.д. Малахитовый зеленый частично угнетает
рост S. typhi и S. typhosa, поэтому для селективного накопления указанных
патогенных микроорганизмов данная среда менее эффективна.
В клинико-бактериологической лаборатории инфекционной клинической
больницы №1 г. Ярославля (ГУ З ЯО ИКБ №1) были проведены исследова­
ния образцов клинического материала с применением питательной среды для
накопления сальмонелл (Магниевая среда отечественного производства).
Доставленный в лабораторию клинический материал, содержащий
520 образцов в пробирках с транспортной средой Кэри-Блэра (испраж­
нения, моча, гной) вносили в Магниевую среду. Через сутки из всех про­
бирок с Магниевой средой бактериологической петлей проводили штри­
ховые пересевы на плотные среды: среду Левина-ГРМ , S S -агар, агар Эндо-
ГРМ, постоянно используемые в лаборатории при посеве материала,

96
предположительно контаминиро-
ванного сальмонеллами.
После культивирования на вы ­
шеуказанных плотных средах через
24 ч визуально определяли наличие
колоний с характерной для иско­
мых микроорганизмов морфоло­
гией. Для дополнительного под­
тверждения принадлежности к
роду сальмонелл микробиологиче­
ской петлей отбирали по 1 - 6 коло­
ний с чашек, делали мазки по Граму,
определяли биохимические свой­ Рис. 20. Р о с т к о л о н и й , подозрительных на
сальмонеллы, на SS-агаре после накопле­
ства с помощью дополнительных ния в Магниевой среде.
тестов и диагностических сальмо-
неллезных адсорбированных сывороток.
В ходе визуального исследования колоний, выросших при посеве
520 образцов клинического материала, предварительно отобрали чашки
с посевами, на которых обнаружены лактозоотрицательные колонии.
На рис. 20 представлен рост подозрительных колоний на сальмонеллы
на S S -агаре после накопления в Магниевой среде.
При анализе результатов обнаружено, что после накопления в М аг­
ниевой среде выявление возбудителя значительно упрощается, так как
сопутствующая микрофлора после культивирования в Магниевой среде
подавлена, поэтому в дальнейшей работе использовали чашки с посевами
после накопления.
После проведения биохимической идентификации возбудителей саль­
монелл путем изучения пересевов отобранных колоний на средах длинно­
го пестрого ряда и серологической идентификации для всех образцов
с лактозоотрицательными колониями была подтверждена родовая и видо­
вая принадлежность к сальмонеллам у 16 изолятов. Средой сравнения
служил Селенитовый бульон.
Сравнительная оценка выявляемости сальмонелл из клинического ма­
териала представлена в табл. 26.
Таким образом, питательная среда для накопления сальмонелл сухая
(Магниевая среда) полностью соответствует требованиям, предъявляе­
мым к средам аналогичного назначения: обеспечивает накопление сальмо­
нелл из исследуемых образцов различной степени биологического загряз­
нения; в процессе исследований клинического материала выделено
16 культур Salmonella spp., что было подтверждено на среде сравнения
(Селенитовый бульон).

97
Таблица 26. Выявляемость и с к о м ы х микроорганизмов на Магниевой среде и среде
сравнения - Селенитовом бульоне при посеве клинического материала
Магниевая Средасравнения
среда Селенитовыйбульон
Количество посевов клинических образцов 520 520
Количество положительных находок 52 62
в том числе подтвержденных как: Salmonella enteritidis 12 12
Salmonella london 1 1
Salmonella stanley 1 1
Salmonella bovis morbificans 1 1
Salmonella virchow 1 1
Лактозоотрицательные 36 46
Выявляемость и % ± m совпадений результатов исследования 95 ± 2% 95 ± 2%
положительных проб*
* при доверительной вероятности 90%, при учете среднего результата полученного двумя специалистами.

6.2.7.3. Селенитовый бульон


Для накопления сальмонелл из клинического материала, пищевых
продуктов и др. объектов рекомендуют использовать селенитовую
среду [63]. Некоторые авторы употребляют название селенитовая сре­
да Лейфсона [64]. Селенит ингибирует рост колиформных бактерий
и энтерококков в первые 6 - 1 2 ч культивирования, не влияя на рост
сальмонелл.
Пропись селенитовой среды описана в Приказе Минздрава №535
«Об унификации микробиологических (бактериологических) методов ис­
следования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях
лечебно-профилактических учреждений» [73].
Промышленное производство этой среды сталкивается с определенны­
ми трудностями, поскольку в состав Селенитового бульона входит ток­
сичный реактив - гидроселенит натрия. Этот реактив вызывает раздраже­
ние кожного покрова человека, поражение слизистой оболочки и дыха­
тельных путей (ПДК 0,1 мг/м3), поэтому во время работы необходимо
использовать индивидуальные средства защиты органов дыхания и рук.
Состав селенитового бульона:
Пептон 5,0 г,
Лактоза 4,0 г,
Фосфатный буфер 10,0 г,
Натрий гидроселенит 4,0 г,
Вода дистиллированная 1000 мл
Приготовление.
1) Основной питательный раствор включает пептона - 5 г, натрия фос­
форнокислого двузамещенного - 7 г, натрия фосфорнокислого однозаме-
щенного - 3 г, лактозы - 4 г, дистиллированной воды - 1000 мл, pH рас­

98
твора 6,9—7,1. Стерилизуют текучим паром два дня подряд по 30 мин.
Срок хранения при 4 -6 °C в течение 1 -2 мес.
2) 10% раствор кислого селенистокислого натрия готовят на стерильной
дистиллированной воде ex tempore. Раствор селенита стерилизации не
подлежит.
Для получения готовой среды (ex tempore) 2 мл 10% раствора кислого
селенистокислого натрия добавляют к 50 мл основного раствора. Приго­
товленную среду по 5 мл асептически разливают в стерильные пробирки.
Стерилизацию готовой среды не производят.
Существует другая обогатительная среда - бульон селенит - цистино­
вый (Selenite Cystine Broth) фирмы Pronadisa (Испания), модифициро­
ванная добавлением аминокислоты цистина для создания определенного
окислительно-восстановительного потенциала, для обнаружения некото­
рых штаммов шигелл и сальмонелл, присутствующих в очень малом коли­
честве в образцах [159].
Сухая питательная среда для накопления сальмонелл (Селенитовый
бульон) отечественного производства предназначена для санитарно-бакте­
риологических исследований пищевых продуктов, объектов окружающей
среды и других материалов с целью селективного накопления сальмонелл и
последующим высевом на дифференциально-диагностические среды.
Оптимальный состав среды обеспечивает питательные потребности для
накопления сальмонелл. Бактерии восстанавливают гидроселенит натрия,
образуя щелочь. Повышение рН уменьшает токсичность гидроселенита
натрия, что способствует росту сопутствующей микрофлоры. Ферментация
лактозы лактозоположительными микроорганизмами приводит к образо­
ванию кислоты, которая снижает рН, тем самым обеспечивая селективные
свойства среды. Фосфатный буфер поддерживает требуемый рН и допол­
нительно стабилизирует токсичность гидроселенита натрия.
Состав Селенитового бульона, г/л:
Пептон мясной/ферментативный 4,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 3,0
Калий фосфорнокислый однозамещенный 7,0
Лактоза 4,0
Натрия гидроселенит (без теллура) 4,0
рН от 6,6 до 7,0
Приготовление: 22,0 г сухого Селенитового бульона тщательно размеши­
вают в 1 л воды дистиллированной, нагревают до температуры 50-60°С .
Среду не кипятят, не стерилизуют! Разливают по 9,0 мл в стерильные стек­
лянные пробирки.
Готовая среда в пробирках прозрачная, светло-желтого цвета. Допуска­
ется легкая опалесценция.

99
Готовую среду можно использовать в течение 7 сут после ее приготовле­
ния при условии хранения при температуре 2-8°С .
Специфическая активность. Селенитовый бульон обеспечивает во всех
засеянных пробирках при посеве в 9 мл среды по 1,0 мл микробной взвеси
из разведения 10-6 через 6 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С нако­
пление каждого тест-штамма S. enteritidis 11272 и S. typhimurium 79, реги­
стрируемого высевом на агар Эндо-ГРМ. Через 1 8 -2 0 ч инкубации на
агаре Эндо-ГРМ должен наблюдаться рост бесцветных колоний.
Показатель эффективности. Показатель эффективности должен быть
не менее 10 (отношение среднего числа колоний Salmonella enteritidis
11272 и Salmonella typhimurium 79, выросших на чашках с агаром Эндо-
ГРМ , либо на среде аналогичного назначения, после обогащения в тече­
ние 6 ч в Селенитовом бульоне, к среднему числу колоний, выросших до
обогащения).
Показатель ингибиции. Показатель ингибиции должен быть не менее
3 (отношение среднего числа колоний Escherichia coli ATCC 25922, вырос­
ших на чашках с агаром Эндо-ГРМ, либо на среде аналогичного назначе­
ния, до обогащения в Селенитовом бульоне, к среднему числу колоний,
выросших после обогащения в течение 6 ч).
На рис. 21 смесь тест-штаммов S. enteritidis 11272 (бесцветные колонии)
и E. coli ATCC 25922 (малинового цвета колонии) на агаре Эндо-ГРМ до и
после обогащения в Селенитовом бульоне через 6 ч инкубации.
Исследуемый материал вносят в Селенитовый бульон согласно соот­
ветствующим документам [59] и инкубируют 1 8 -2 0 ч при температуре
(37 ± 1)°С с последующим высевом на дифференциально-диагностические

Рис. 21. Р ост смеси тест-штаммов S. en teritidis 11272 (бесцветны е колонии) и Е . coli
ATCC 25922 (малинового цвета колонии) на агаре Э ндо-ГРМ д о и после обогащения
в селенитовом бульоне: а) посев на среду Эндо до обогащения; b ) посев на среду Эндо пос­

ле инкубации в течение 6 ч в Селенитовом бульоне.

100
питательные среды, такие как агар Эндо, X L D -агар и другие с последую­
щим отбором подозрительных колоний и их идентификацией.

6 .2 .7 а С р е д а М ю л л е р а -К а у ф м а н а
Питательная среда Мюллера готовится только в лабораторных услови­
ях, так как содержит мел и раствор Люголя.
Первоначально тетратионатовый бульон был разработан Мюллером
[42, 156] и предназначался для накопления сальмонелл. Принцип дей­
ствия заключался в том, что в питательной среде, при добавлении к ней
тиосульфата натрия и раствора Люголя ex tempore, образуется тетратионат
натрия, который не влияет на рост большинства сальмонелл, но значи­
тельно ингибирует рост эшерихий. В среде бульон обеспечивает питатель­
ные вещества, а мел обладает буферными свойствами.
Состав среды Мюллера:
Мел, стерилизованный сухим жаром 45 г
или Кальция карбонат, сухой, стерильный 25 г
Бульон Хоттингера (1,2—1,3% аминного азота) 900 мл
Раствор Люголя (калия иодид - 20 г, йод
кристаллический - 25 г, вода дистиллированная - 100 мл) 20 мл
Натрия тиосульфат (Na2 S 2 O 3 ) 50%
Стерильный раствор 100 мл
рН среды 7,2-7,4.
Раствор Люголя и раствор тиосульфата натрия вносится асептически во
флакон со стерильным бульоном хоттингера (автоклавирование при
121°С 30 мин) и затем разливается по пробиркам. Готовая среда дальней­
шей стерилизации не подлежит.
Впоследствии среда Мюллера была модифицирована Кауфманом [150],
который предложил ввести бриллиантовый зеленый и желчь для подавле­
ния роста сопутствующих микроорганизмов и более эффективного выде­
ления сальмонелл. Состав среды Кауфмана: среда Мюллера (стериль­
ная) - 500 мл, желчь бычья (стерильная) - 250 мл, бриллиантовый зеле­
ный (0,1% водный раствор) - 50 мл.
Ингредиенты смешивают, подогревают до кипения, асептически разлива­
ют в стерильные пробирки по 10 мл. Не стерилизуют. Перед розливом в сте­
рильные пробирки среду необходимо тщательно перемешать для равномер­
ного распределения осадка карбоната кальция. Бриллиантовый зеленый
добавляют после нагревания среды, так как оно снижает его селективные
свойства. Данная среда не подходит для роста S. typhi, S. pullorum.
При добавлении бриллиантового зеленого и раствора йода среда стано­
вится светло-зеленой, опалесцирует, имеет выраженный белый преципи­
тат. Но, несмотря на выраженную опалесценцию готовой среды, некото­

101
рые баклаборатории все же отдают ей предпочтение, так как существует
мнение, что среда имеет высокую ингибирующую способность к сопут­
ствующей микрофлоре высококонтаминированных объектов.
Некоторыми зарубежными фирмами-производителями выпускает­
ся основа тетратионатного бульона Мюллера-Кауфмана, предназначен­
ная для эффективного обогащения и выделения сальмонелл следующего
состава: белковая основа (казеиновый пептон 7 ,0 -8 ,6 г/л, папаиновый
перевар соевой муки 2,3 г/л , пептон мясной 4,5 г/л , мясной экстракт
0 ,9 -4 ,3 г/л , экстракт дрожжей 1,8 г/л , хлорид натрия 2 ,3 -4 ,5 г/л , тио­
сульфат натрия 3 0 ,5 -4 0 ,7 г/л , бриллиантовый зеленый 0,0095-0,01 г/л,
раствор Люголя 1 9,0-20,0 мл, карбонат кальция 2 5 ,0 -3 8 ,7 г/л , желчь
4 ,7 5 -4 ,7 8 г/л [82, 148, 170]. Для подавления роста протеев в среду можно
внести 4 мг/л антибиотика новобиоцина [170].
В бульоне Мюллера-Кауфмана отечественного производства (Ф Б У Н
ГНЦ П М Б) в качестве белковой питательной основы использовали
ПГРМ, обеспечивающий достаточно эффективное накопление сальмонелл
в максимально короткий срок. Тетратионат, образующийся из тиосульфа­
та, при добавлении йода к питательной среде подавляет рост колиформ-
ных бактерий и других сопутствующих энтеробактерий. Образующиеся
кислые продукты распада тетратионата нейтрализуются углекислым
кальцием. Соли желчных кислот способствуют росту сальмонелл, значи­
тельно подавляют многие микроорганизмы. Бриллиантовый зеленый ин­
гибирует рост грамположительной микрофлоры.
Состав сухой отечественной питательной среды для селективного на­
копления сальмонелл (среда Мюллера-Кауфмана, основа), г/л:
ПГРМ 7,0
Пептон мясной 5,0
Натрий хлористый 4,5
Дрожжевой экстракт 2,5
Бриллиантовый зеленый 0,01
Желчь крупного рогатого скота очищенная 5,0
Кальций углекислый 25,0
Натрия тиосульфат безводный 27,0
Приготовление: 76,0 г сухой основы тщательно размешивают в 1 л дис­
тиллированной воды, кипятят в течение 2 мин, добавляют 20,0 мл рас­
твора Люголя (20,0 г йода и 25,0 г калия йодида в 100 мл стерильной
дистиллированной воды) и при постоянном перемешивании для равно­
мерного распределения частиц углекислого кальция разливают по 9 мл в
стерильные пробирки.
Готовая среда в пробирках непрозрачная, сине-зеленого цвета, с белым
преципитатом.

102
Рис. 22. Р ост к о н тро льн ы х тест-штаммов на среде Мюллера-Кауфмана (производства
ф б у н г н ц Слева направо: контроль - незасеянная пробирка, E. coli A TCC 25922
п м б ).

(2 пробирки), S. enteritidis 11272 (2 пробирки), S. typhimurium 79 (2 пробирки).

Контроль специфической активности основы питательной среды допу­


скается осуществлять в течение суток после ее приготовления при усло­
вии хранения при температуре 2-8°С . Среда, готовая к употреблению
(с раствором Люголя), должна быть использована в тот же день.
Специфическая активность. Среда Мюллера-Кауфмана должна обе­
спечивать во всех засеянных пробирках при посеве в 9 мл среды по 1,0 мл
микробной взвеси из разведения 10-6 через (24 ± 3) ч инкубации при тем­
пературе (37 ± 1)°С рост каждого тест-штамма S. enteritidis 11272 и
S. typhimurium 79 в виде помутнения среды. Наличие роста подтверждает­
ся высевом на ГРМ-агар или на среду аналогичного назначения.
Показатель эффективности. Показатель эффективности должен быть
не менее 10 (отношение среднего числа колоний, выросших на чашках
с ГРМ-агаром, либо на среде аналогичного назначения, после обогащения
в течение 6 ч в среде Мюллера-Кауфмана, к среднему числу колоний,
выросших до обогащения).
Ингибирующие свойства. При посеве в среду Мюллера-Кауфмана по
1,0 мл микробной взвеси тест-штамма E. coli ATCC 25922 из разведе­
ния 10-5 через (24 ± 3) ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С рост дол­
жен отсутствовать. Отсутствие роста E. coli ATCC 25922 подтверждается
высевом на ГРМ агар или на среду аналогичного назначения.
На рис. 22 представлен вид среды Мюллера-Кауфмана при росте тест­
штаммов E. coli ATCC 25922, S. enteritidis 11272 и S. typhimurium 79 в виде
помутнения среды через 24 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С.

103
6 .з . д и ф ф е р е н ц и а л ь н о -д и а г н о с т и ч е с к и е
п и тательн ы е с ред ы (с е л е к ти вн ы е )

Выбор питательных сред для первичного посева определяют, исходя из


характера исследуемого материала (испражнения, моча, рвотные массы и
т.д.) и представления о возможном содержании в нем тех или иных энте­
робактерий и их ассоциаций. При этом учитывают исследования, диагноз
или эпидемическую ситуацию. Поэтому в набор сред должны быть вклю­
чены среды как для выделения патогенных энтеробактерий, так и обеспе­
чивающие возможность выделения УПЭ.
Для посева проб, учитывая возможность выделения из испражнений
или других материалов в качестве возбудителей заболевания энтеробакте­
рий, которые могут сильно подавляться на высокоселективных средах,
оптимальным является одновременное применение высокоселективных и
слабоселективных сред. С этой целью используют различные питатель­
ные среды, такие как агар Эндо, среда Плоскирева, висмут-сульфит агар,
среда Левина, Violet red bile glucose agar acc. to Mossel и др. Отечественными
производителями освоен выпуск препаратов, используемых при выделе­
нии и дифференциации энтеробактерий.

6 .3 .1 . А гар М осселя

Принцип действия агаризованных сред Мосселя различных фирм-


производителей идентичен: селективный учет и выделение энтеробакте­
рий на среде возможны благодаря наличию в среде кристаллического
фиолетового и солей желчных кислот, в значительной степени угнетаю­
щих рост сопутствующих микроорганизмов. Бактерии, ферментирующие
углевод с образованием кислоты, обнаруживаются по изменению цвета
индикатора и зонам преципитации вокруг колоний за счет присутствия в
среде желчи. На данной питательной среде обнаруживаются все предста­
вители семейства Enterobacteriaceae, однако она не является абсолютно
специфичной для этих микроорганизмов, так как некоторые сопутствую­
щие бактерии проявляют аналогичные признаки роста.
Моссель модифицировал Violet red bile agar [155], содержащий лактозу,
добавлением глюкозы, тем самым улучшив выделение бактерий семейства
Enterobacteriaceae. Исследования последних лет показали, что лактоза
может быть исключена из состава среды. Наиболее известна питательная
среда Violet red bile glucose agar. Составы питательных сред для выделе­
ния всех видов Enterobacteriaceae по Мосселю разных фирм-производи-
телей [82, 149, 154, 163], как правило, содержат: пептон мясной, или пан­
креатический гидролизат желатина, или панкреатический гидролизат ка­

104
зеина (7,0 г/л ), натрий хлористый (5,0 г/л ), соли желчных кислот (1,5 г/л ),
глюкозу (5 ,0 -1 0 ,0 г/л ), нейтральный красный (0.03 г/л ), кристаллический
фиолетовый (0,002 г/л ), агар (1 1 ,0 -1 5 ,0 г/л ).
В качестве питательной основы для агара Мосселя отечественного про­
изводства использованы ПГРМ и пептон мясной. При выборе питатель­
ной основы в состав среды первоначально включали оба углевода: лактозу
и глюкозу. В дальнейшем из состава среды была исключена лактоза,
т.к. назначение этой среды, а именно селективное выделение и учет энте­
робактерий, вполне возможны при наличии только глюкозы. Наиболее
оптимальной в данной среде является концентрация солей желчных кис­
лот 1,5 г/л.
Состав сухой отечественной питательной среды для селективного вы ­
деления и учета энтеробактерий (агар Мосселя), г/л:
ПГРМ и/или пептон мясной 15,0
Дрожжевой экстракт 1,0
Натрий хлористый 5,0
Глюкоза 10,0
Соли желчных кислот 1,5
Нейтральный красный 0,05
Кристаллический фиолетовый 0,002
Натрий углекислый 0,15 ± 0,05
Агар бактериологический 11,0 ± 3,0
рН от 7,0 до 7,5
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на этикетке
для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают в
1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин до полного расплавления
агара. Охлаждают до температуры 4 5 -50°С и разливают в стерильные
чашки Петри. После застывания среды чашки подсушивают. Готовая пи­
тательная среда в чашках Петри прозрачная, красного цвета.
Контроль специфической активности питательной среды допускается
осуществлять в течение 7 сут после ее приготовления при условии хране­
ния при температуре 2-8°С .
Специфическая активность. Агар Мосселя обеспечивает визуально
обнаруживаемый рост E. coli АТСС 25922, E. cloacae A-186, S. abony IHE
103/39, S. flexneri 1a 8516 при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого
тест-штамма из разведения 10-6 через 2 0 -2 4 ч инкубации при темпера­
туре (37 ±1)°С. Колонии всех тест-штаммов круглые, малинового цвета,
с зоной преципитации, диаметром 1,0-3,0 мм.
Ингибирующие свойства. Агар Мосселя полностью подавляет рост
тест-штаммов S. aureus 209-Р (A T C C 6538-P) и E. faecalis ATCC 19433
(NCTC 775) из разведения 10-1 на всех засеянных чашках Петри при по-

105
Рис. 23. Р ост тест-штаммов на агаре Мосселя: а - E. cloacae A-186; b - E. coli A TCC 25922.

севе по 0,1 мл микробной взвеси через 4 4 -4 8 ч инкубации при температу­


ре (37 ± 1)°С.
Биологический контроль агаров Мосселя разных производителей на
широком наборе тест-штаммов представлен в табл. 27.
Питательные агары Мосселя, по результатам визуального учета резуль­
татов, обладают высокой чувствительностью в отношении энтеробакте­
рий, обеспечивая хороший их рост, при этом подавляется рост стафило­
кокков, энтерококка, подавлено роение протеев.
Результаты биологического контроля агара Мосселя производства
Ф Б У Н ГНЦ ПМБ на некоторых контрольных тест-штаммах представле­
ны на рис. 23.
Исследования образцов клинического материала с применением сухой
отечественной питательной среды для селективного выделения и учета
энтеробактерий (агар Мосселя) проведены в испытательном лаборатор­
ном центре Противочумной станции в Ф Г Б У З «Медико-санитарная часть
№164 Федерального медико-биологического агентства». В работе исполь­
зованы 35 образцов клинического материала.
В качестве среды сравнения использовали V R B D agar to M O SSEL
Merck, в качестве коммерческих сред для выделения энтеробактерий ис­
пользовали: агар Эндо-ГРМ, висмут-сульфит-ГРМ агар, ГРМ-бульон.
Клинический материал помещали в ГРМ -бульон, используемый
в качестве накопительного бульона. После инкубирования в течение
24 ч при 37°С во всех 35 пробирках с посевами клинических образцов
визуально наблюдался рост в виде диффузного помутнения бульона.
Далее из накопительного бульона делали высев по 0,1 мл на чашки
с агаром Мосселя. После инкубирования чашек с посевами в течение
24 ч при 37°С визуально определяли наличие колоний, с характерной
для энтеробактерий морфологией: круглые, малинового цвета колонии

106
Таблица 27. Биологический контроль агара Мосселя (производства ФБУН ГНЦ
ПМБ) и Violet red bile glucose agar acc. to Mossel (Merck)
№ Наименование тест­ АгарМосселя КонтрольViolet red Контрольроста
п/ п штаммовразведение фбун гнц пмб bile glucose agar acc. тест-штаммов
to Mossel (Merck) на ГРМ-агаре
1. S. flexneri 1 a 8516 0,6-1,2 0,6-1,4 0,5-0,6
10-6 Круглые, Круглые, малиновые Круглые,
малиновые со слабой зоной гладкие,
без зон преципитации преципитации бесцветные
2. S. sonnei «S-form» 1,2-2,0 2,0-2,5 2,0-2,5
10-6 Круглые, малиновые Круглые, Круглые,
со слабой зоной малиновые с зоной гладкие,
преципитации преципитации бесцветные
3. S. typhi H901 1,2-1,8 1,4-2,5 2,0-2,2
10-6 Круглые, малиновые Круглые, малиновые с Круглые, гладкие,
со слабой зоной зоной преципитации бесцветные
преципитации
4. S. typhimurium 79 2,0-2,5 2,0-2,8 2,5-3,0
10-6 Круглые, малиновые с Круглые, малиновые Круглые, гладкие,
зоной преципитации с зоной преципитации бесцветные
5. E. coli 3912/41 (055:К59) 1,8-2,0-2,3 2,3-3,0 2,0-3,0
10-6 Круглые, малиновые Круглые, малиновые Круглые, гладкие,
с зоной преципитации с зоной преципитации бесцветные
6. E. coli 25922 1,8-2,2 2,0-2,2 2,5-2,7
10-6 Круглые, малиновые Круглые, Круглые,
со слабой зоной малиновые с зоной гладкие,
преципитации преципитации бесцветные
7. Р. vulgaris HX 19 222 1,0-1,2-1,8 Частичное роение Сплошное роение
10-6 Круглые, малиновые Круглые, малиновые
без зон преципитации без зон преципитации
8. P. mirabilis 3177 1,6-2,0 2,5-3,0 Сплошное роение
10-6 Круглые, малиновые Круглые, малиновые
с зоной преципитации с зоной преципитации
9. K. pneumoniae 418 2,8-3,2 2,5-3,0 2,5-3,0
10-6 Круглые, Круглые, слабо­ Круглые, слизистые,
слабо-малиновые малиновые с зоной бесцветные
с зоной преципитации преципитации
10. Y. enterocolitica 287-II 2,5-3,0 2,5-3,0 2,5-3,0
10-6 Круглые, Круглые, слабо­ Круглые, слизистые,
слабо-малиновые малиновые с зоной бесцветные
с зоной преципитации преципитации
11. Y. pseudotuberculosis III 2,5-3,0 2,5-3,0 2,5-3,0
10-6 Круглые, Круглые, Круглые,
слабо-малиновые слабо-малиновые слизистые,
с зоной преципитации с зоной преципитации бесцветные
12. S. aureus «Wood-46» Нет роста Нет роста Сплошной рост
10-1
13. S. aureus 209-P Нет роста Нет роста Сплошной газон
10-1
14. S. faecalis 775 Нет роста Нет роста Сплошной рост
10-1
15. S. salivarius 80225 Нет роста Нет роста Сплошной рост
10-1
16. B. cereus 8035 Нет роста Нет роста Сплошной рост
10-1

107
Рис. 24. Энтеробактерии, выросшие на агаре Мосселя при посеве клинических образцов.

с зоной преципитации, диаметром 1,0—3,0 мм. Во всех 35 посевах на


чашках с агаром Мосселя из пробирок с бульоном визуально наблюдал­
ся характерный для энтеробактерий рост колоний в количестве от еди­
ничных колоний до 1000 на чашке. Для дополнительного подтвержде­
ния принадлежности к роду энтеробактерий микробиологической пет­
лей отбирали по 1 - 2 колонии с чашки и делали мазки по Граму, высев
на дифференциальные среды: агар Эндо-ГРМ , висмут-сульфит - ГРМ -
агар, определяли биохимические свойства с помощью соответствую ­
щих тест-систем.
На рис. 24 представлены результаты посевов нескольких образцов кли­
нического материала с характерным для энтеробактерий ростом колоний
на агаре Мосселя.
Результаты по выявляемости энтеробактерий на агаре Мосселя и среде
сравнения при посеве клинического материала представлены в табл. 28.
Результаты исследований показали возможность селективного вы ­
деления и учета энтеробактерий с агаров Мосселя при проведении бак­
териологического исследования клинического материала с целью по­
лучения дополнительной информации о клинической ситуации при
диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями. Во всех 35 об­
разцах клинического материала в результате посева на агары Мосселя
были обнаружены энтеробактерии, что подтверждено дополнительны­
ми тестами (мазки по Граму, высев на дифференциальные среды, под­
тверждение биохимических свойств с помощью соответствующих тест­
систем).

108
Таблица 28. Выявляемость энтеробактерий на агаре Мосселя и среде сравнения
при посеве клинического материала
Испытуемаясреда-агар Среда сравнения
Мосселя
Количество посевов (образцы) 35 35
Количество положительных 35 35
находок* круглые, малинового цвета круглые, малинового цвета
колонии, с зоной преципитации, колонии, с зоной преципитации,
d 1,0-3,0 d 1,0-3,0
Энтеробактерий, в т.ч.** 37 37
E. coli 23 23
Citrobacter 2 2
Enterobacter 4 4
Klebsiella 1 1
Proteus 3 3
Salmonella 1 1
Hafnia 1 1
Shigella 2 2
Выявляемость энтеробактерий, 95 ± 2% 95 ± 2%
% ± m совпадений результатов
исследования положительных проб*
* При доверительной вероятности 90%, при учете среднего результата, полученного на агаре Мосселя.
** Подтверждение проводилось для колоний, выделенных с агара Мосселя.

6 .3 .2 . П и тательн ая среда Э ндо

В 1904 г. Эндо разработал питательную среду для выделения тифоид­


ных палочек из фекалий, получившую широкое практическое примене­
ние. В настоящее время среди бактериологов широко известна питатель­
ная среда - агар Эндо, используемая для диагностики заболеваний людей
и животных, обсемененности объектов внешней среды и пищевых продук­
тов патогенными энтеробактериями при первичном посеве биоматериала
[12, 91, 114].
Ведущими зарубежными фирмами для дифференциации лактозофер­
ментирующих энтеробактерий производится агар Эндо, включающий
в качестве ингибитора грамположительных микроорганизмов натрий сер­
нистокислый и основной фуксин. В составах агаров Эндо, выпускаемых
зарубежными фирмами, входят мясной пептон (1 0 ,0 -1 5 ,0 г/л ), натрий
фосфорнокислый двузамещенный (3,5 г/л ), лактоза (10,0 г/л ), сульфит
натрия (2,5 г/л ) и агар (1 0 ,0 -1 5 ,0 г/л ) [139, 154, 167, 168, 169].
Состав среды Эндо, производимой в нашей стране, несколько отли­
чается по своему составу от импортных аналогов, прежде всего тем, что
в качестве питательной основы содержит панкреатический гидролизат
кильки и экстракт кормовых дрожжей в качестве стимулятора роста мик­
роорганизмов. Среда дополнительно содержит хлористый натрий, а кон-

109
Р и с . 25. Р о с т тест-штаммов на агаре Э н д о - Г Р М : а - E. coli 0 5 5 3 9 1 2 /4 1 малинового цвета
с металлическим блеском, S. sonnei «S-form» - розового цвета; b - микробная смесь E. coli
055 3912/41 с S. dysenteriae I 1362.

центрация других солей и фуксина снижена, при этом увеличено содержа­


ние лактозы.
Дифференцирующие свойства среды Эндо основаны на способности
микроорганизмов ферментировать лактозу. Микроорганизмы, не сбражи­
вающие лактозу, образуют на среде бесцветные прозрачные колонии.
Лактозоположительные микроорганизмы ферментируют лактозу до об­
разования ацетальдегида, который, реагируя с натрием сернистокислым,
окрашивает колонии в красный цвет. Рост грамположительной микро­
флоры на среде полностью отсутствует, благодаря наличию сульфита на­
трия и фуксина основного.
химизм цветных превращений среды Эндо заключается в том, что
фуксин по своему химическому составу является производным соляно­
кислого розанилина. Розанилин бесцветен. Поэтому обесцвеченный
в среде Эндо розанилин соединяется с альдегидами, образованными
кишечной палочкой или другими бактериями, ферментирующими лак­
тозу, вследствие чего колонии на среде окрашиваются в красный цвет
(рис. 25).
На отечественном рынке медицинских изделий представлен достаточно
широкий спектр питательных сред Эндо различных фирм-производителей
[115, 116].
Среди разрешенных к применению и широко используемых российски­
ми потребителями - питательные среды производства HiMedia (Индия),
Merck (Германия) и Pronadisa (Испания), а также отечественные пита­
тельные среды производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ [26, 148, 154, 159].
Состав агара Эндо-ГРМ, г/л:
ПГРМ 12,0

110
Дрожжевой экстракт 1,0
Натрия хлорид 3,4
Лактоза 10,0
Натрия сульфит безводный 0,8
Натрия фосфат двузамещенный 12-водный 0,5
Фуксин основной 0,2
Агар микробиологический 10,0 ± 3,0
рН от 7,2 до 7,6
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на этикетке
для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают
в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 - 3 мин до полного расплавления
агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, снова доводят до кипе­
ния, охлаждают до температуры 45 -5 0 °С и разливают в стерильные чашки
Петри. После застывания среды чашки подсушивают.
Готовая питательная среда в чашках Петри прозрачная, розового цвета.
Среду необходимо использовать в день приготовления. Хранить до посева
в темноте!
Специфическая активность. Питательная среда обеспечивает на всех
засеянных чашках Петри рост тест-штаммов S. sonnei «S form», S. dysente-
riae I 1362, E. coli 3912/41 (055:К 59), E. coli 168/59 (0111:К 58) через
1 8 -2 0 ч инкубации при температуре (37±1)°С при посеве по 0,1 мл мик­
робной взвеси культуры каждого тест-штамма из разведения 10— 6, разбав­
ленного стерильным 0,9%-ным раствором хлористого натрия в соотноше­
нии 1:1 (условное разведение 10— 7).
Колонии S. dysenteriae I 1362 бесцветные, круглые, прозрачные, диамет­
ром 1,0—1,5 мм;
E. coli 3912/41 (055:К 59) —круглые, малинового цвета с металлическим
блеском, диаметром 2 ,0 -3 ,0 мм;
S. sonnei «S form» — бесцветные или слегка розового цвета, со сла­
бовыраженным центром, круглые, прозрачные, диаметром 1,5—2,5 мм;
E. coli 168/59 (0111 :К58) —круглые, малинового цвета, металлический
блеск колоний может быть неясно выражен, диаметром 1,5—2,5 мм.
Дифференцирующие свойства среды. Питательная среда обеспечива­
ет четкую дифференциацию шигелл от эшерихий на всех засеянных чаш­
ках при посеве 0,1 мл каждой микробной смеси S. sonnei «S form» и E. coli
168/59 (0111:К 58), S. dysenteriae I 1362 и E. coli 3912/41 (055:К 59) из раз­
ведения 10— 6 через 18—20 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С.
Ингибирующие свойства среды. Питательная среда полностью пода­
вляет рост тест-штамма S. aureus Wood-46 на всех засеянных чашках при
посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10— 1через 18—20 ч инку­
бации при температуре (37 ± 1)°С.

111
Питательные среды, независимо от производителя, должны в соответ­
ствии с заявленными в нормативной документации показателями каче­
ства давать достоверные и сопоставимые результаты. Лабораторная прак­
тика показывает, что микробиологические исследования одного и того же
биоматериала на аналогичных питательных средах различных фирм-
производителей, даже при соблюдении идентичных лабораторных усло­
вий, могут иметь различия в результатах. Поэтому были проведены срав­
нительные исследования дифференциально-диагностических свойств пи­
тательной среды Эндо различных зарубежных производителей, разрешен­
ных к применению в Российской Федерации, с отечественным агаром
Эндо-ГРМ на расширенном наборе музейных тест-штаммов и клиниче­
ском материале от больных.
Оценку качества испытуемых препаратов проводили по основным био­
логическим показателям: чувствительности, стабильности основных био­
логических свойств микроорганизмов, дифференцирующим, ингибирую­
щим свойствам питательных сред и выявляемости патогенных энтеробак­
терий из клинического материала [65]. Для определения дифференциру-

Рис. 26. Р о с т тест шамма Е . coli 0 5 5 3 9 1 2 /4 1 на средах Э н д о различных производителей:


а - HiMedia; b - Ф Б У Н ГНЦ П М Б; с - Pronadisa; d - Merck.

112
ющих свойств готовили смеси лактозоположительных тест-штаммов
эшерихий с лактозоотрицательными тест-штаммами сальмонелл и ши-
гелл в соотношении 1:1. Учет результатов проводили через 1 8 -2 0 ч инку­
бации посевов при температуре (37±1)°С и визуально определяли размер,
характер роста и дифференциацию выросших колоний.
Результаты биологического контроля качества питательной среды -
агара Эндо различных производителей представлены на рис. 26 и в табл. 29.

Таблица 29. Характеристика питательных сред различных фирм-производителей


по биологическим показателям
Штаммы АгарыЭндо
(разведение 10-6) HiMedia Merck Pronadisa гнц пмб
диаметрколоний(мм), морфология
E. coli 055 3912/41 1,0-1,2 2,5-3,2 1,2-1,4 2,0-2,5
Круглые, SR-форма Круглые, Круглые,
малиновые, без Круглые, ярко­ малиновые, малиновые,
металлического розовые, без с металлическим с металлическим
блеска металлического блеском блеском
блеска
E. coli 0111 168/59 0,6-0,8 0,8-1,0 0,6-0,8 0,8-1,0
Круглые, бледно­ Круглые, бледно­ Круглые, Круглые, розовые,
розовые, без розовые, без малиновые, со слабым
металлического металлического с металлическим металлическим
блеска блеска блеском блеском
E. coli ATCC 25922 0,8-1,2 1,2-1,4 1,4-1,6 2,0-2,5
Круглые, Круглые, бледно­ Круглые, Круглые,
розовые, без розовые, без малиновые, малиновые,
металлического металлического с металлическим с металлическим
блеска блеска блеском блеском
E. cloacae A-186 0,6-1,4 1,6-1,8 0,6-1,4 1,8-2,2
Круглые, розовые Круглые, розовые Круглые, малиновые Круглые, розовые
E. aerogenes 10006 1,2-1,4 1,6-1,8 1,0-1,2 1,6-1,8
Круглые, Круглые, Круглые, малиновые Круглые, розовые
бледно-розовые бледно-розовые
K. pneumoniae 418 1,6-1,8 2,0-2,2 2,5-3,0 2,5-3,0
Круглые, Круглые, Круглые, Круглые, розовые
розовые бледно-розовые малиновые с прозрачным
ободком
S. typhi H-901 0,6-0,8 1,8-2,0 1,0-1,2 1,4-1,6
ГДР/ГИСК Круглые, бледно­ Круглые, Круглые, Круглые,
розовые прозрачные, прозрачные, прозрачные,
бледно-розовые розовые бледно-розовые
S. typhimurium 79 0,6-0,8 2,0-2,5 0,6-0,8 2,0-2,2
Круглые, бледно­ 50% SR-форма Круглые, Круглые,
розовые Круглые, розовые бледно-розовые
бледно-розовые
S. dysenteriae I 1362 0,6-0,8 0,2-0,4 Нет роста 1,2-1,6
Круглые, Круглые, Круглые,
бесцветные прозрачные, прозрачные,
бледно-розовые бледно-розовые
S. flexneri 1 a 8516 0,4-0,6 1,0-1,2 0,6-0,8 1,2-1,4
Круглые, Круглые, Круглые, Круглые,
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные

113
Таблица 29. Окончание
Штаммы АгарыЭ ндо
(разведение 10-6) HiMedia Merck Pronadisa гн ц п м б

диаметрк о л о н и й ( м м ) , морфология
S. sonnei «S-form» 0,8-0,9 1,2-1,5 0,8-1,0 1,8-2,0
Круглые, Круглые, Круглые, Круглые,
прозрачные, прозрачные, прозрачные, прозрачные,
бледно-розовые бледно-розовые бледно-розовые бледно-розовые
S. aureus Wood-46 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
10-1
S. dysenteriae I 1362 Нет Нет Нет Четкая
10-6 + E. coli 055 дифференциации дифференциации дифференциации дифференциация
3912/41 10-6
S. sonnei «S-form» Слабая Слабая Слабая четкая
10-6 + E. coli 0111 дифференциация дифференциация дифференциация дифференциация
168/59 10-6

Из таблицы видно, что лактозоположительные тест-штаммы микроорга­


низмов на всех образцах питательных сред - розовые либо малиновые ко­
лонии с металлическим блеском или без него. Количество колоний различ­
ных штаммов эшерихий колебалось от 20 до 60. Диаметр выросших коло­
ний E. coli, как правило, не менее 1,3 мм; на среде Эндо-ГРМ производства
Ф Б У Н ГНЦ ПМБ колонии эшерихий в диаметре достигали 2,5 мм.
Рост различных штаммов энтеробактеров (E. cloacae A-186, E. aerogenes
10006) и клебсиелл (K. pneumoniae 418) на всех питательных средах Эндо
имел типичную картину - крупные колонии бледно-розового или розово­
го цвета.
Лактозоотрицательные штаммы энтеробактерий формировали на сре­
дах бесцветные или бледно-розовые колонии. Хорошие ростовые свойства
показывали следующие штаммы шигелл и сальмонелл: S. typhi H-901
ГД Р/ГИ С К , S. typhimurium 79, S. flexneri 1 a 8516, S. sonnei «S-form».
На исследуемых средах полностью подавлен рост грамположительного
тест-штамма S. aureus Wood-46.
При определении дифференцирующих свойств среды Эндо было отмече­
но, что на питательных средах фирмы HiMedia и Merck тест-штаммы E. coli
почти не имели металлического блеска. В результате проведенных исследова­
ний ростовых свойств среды Эндо различных производителей на музейных
тест-штаммах было установлено, что лактозоположительные энтеробактерии
формировали на среде колонии розового или малинового цвета, а лактозо­
отрицательные бактерии - бесцветные или бледно-розовые колонии.
Для оценки эффективности диагностических свойств сред Эндо были
проведены их клинические испытания по обнаружению энтеробактерий по
признаку ферментации лактозы. Взятие и посев клинического материала
производили в соответствии с методическими рекомендациями [54, 59].

114
Внутрилабораторный контроль качества питательных сред осуществлен
согласно М У К 4.2.2316-08 [65].
Клиническим материалом для исследований служили фекалии от боль­
ных ОКИ, пищевой токсикоинфекцией (П ТИ ), сальмонеллезом, гастро­
энтеритом (ГЭ ), энтеритом (Э Н ), энтероколитом (Э К ), доставленные
в бактериологическую лабораторию муниципального учреждения здраво­
охранения Видновской районной клинической больницы (М У З В Р К Б ).
Пробы помещали в транспортную среду и доставляли в бактериологиче­
скую лабораторию в течение 1 -1 8 ч [62].
Для подтверждения принадлежности выделенных изолятов к семейству
Enterobacteriaceae использовали общепринятый комплекс биохимических
и иммунологических методов.
Выделение энтеробактерий из клинического биоматериала проводи­
лось по общепринятой схеме исследования испражнений. Было изучено
138 биопроб от больных ОКИ, ПТИ, ГЭ, ЭН, ЭК. Выделено 15 штаммов
патогенных энтеробактерий: 14 сальмонелл, 1 шигелла. Десять сальмо­
нелл и одна шигелла были выделены с первичного посева фекалий на
среду Эндо, а четыре сальмонеллы - только со среды ВСА после накопле­
ния в среде обогащения.
Как видно из данных, представленных в табл. 30, со среды Эндо произ­
водителей Merck, Pronadisa, ГНЦП М Б было выделено одинаковое коли­
чество патогенных энтеробактерий - 11, со среды Эндо HiMedia - 9.
Таким образом, показатель высеваемости патогенных энтеробактерий для
среды Эндо производства Merck, Pronadisa, ГНЦ ПМБ является одинако­
вым и составляет 8,0%; для среды Эндо производства HiMedia - 6,5%.
Следует отметить, что по морфологии колоний энтеробактерий, вырос­
ших на средах Эндо производства Merck, Pronadisa, HiMedia, ГНЦ ПМБ
из смеси микроорганизмов, легко выделялись лактозонегативные коло­
нии патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Колонии лакто­
зоположительных E. coli были с металлическим блеском, следовательно,
морфология колоний соответствовала характеристикам, заявленным в
паспорте производителя.

Таблица 30. Выявляемое™ патогенных энтеробактерий на питательных средах Э ндо


Производитель Количество положительных находок Выявляемость
среды Эндо S. typhimurium S. infantis S. enteritidis S. sonnei патогенных
энтеробактерий (%)
Merck 5 1 4 1 8,0
Pronadisa 5 1 4 1 8,0
HiMedia 5 0 4 0 6,5
ФБУН ГНЦ ПМБ 5 1 4 1 8,0
Среда ВСА 7 1 7 - 10,2

115
6 .3 .3 . С о р б и т о л Е. coli 0 1 5 7 :Н 7 а га р

Лабораторная диагностика энтерогеморрагической кишечной палочки


включает метод классического бактериологического исследования возбу­
дителей ОКИ, основанный на выделении чистой культуры микроорганиз­
ма и последующей идентификации по культурально-морфологическим,
биохимическим и антигенным свойствам, а также использовании экспери­
ментальных или молекулярно-генетических методов, подтверждающих
продукцию токсинов выделенными штаммами. После посева материала
на дифференциально-диагностические среды и инкубирования в термо­
стате при 37°С для дальнейшего исследования отбирают лактозоположи­
тельные, сорбитотрицательные эшерихии для постановки реакций агглю­
тинации с диагностической сывороткой к E. coli О157:Н7 [109, 136, 164].
Ведущими зарубежными фирмами выпускаются среды для выделения
кишечной палочки О157:Н7 - Mac Conkey Sorbitol Agar [135, 139, 154].
Состав таких сред включает пептон, соли желчных кислот, сорбит, хлорид
натрия, нейтральный красный, кристалвиолет, агар. Использование этих
сред позволяет четко дифференцировать штаммы серогруппы О157:Н7
от других эшерихий.
Сухая отечественная питательная среда для выделения и дифференциа­
ции E. coli O157:H7 и других энтеробактерий по признаку ферментации
сорбита (Сорбитол E. coli O157:H7 агар) предназначена для бактерио­
логических исследований в санитарной и клинической микробиологии
с целью выделения и дифференциации E. coli O157:H7 при диагностике
инфекционных заболеваний [ 80] следующего состава, г/л:
ПГРМ 12,0
Дрожжевой экстракт 1,0
Сорбит 10,0
Натрия хлорид 3,4
Натрия сульфит 0,8
Натрия фосфат двузамещенный 12-водный 0,5
Фуксин основной 0,2
Агар микробиологический 10,0
рН от 7,2 до 7,6
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на этикетке
для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают
в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 - 3 мин до полного расплавления
агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, снова доводят до кипе­
ния, охлаждают до температуры 45-50°С , разливают в стерильные чашки
Петри, оставляют для застывания и подсушивания при температуре
(37 ± 1)°С в течение 4 0 -6 0 мин.

116
Готовая питательная среда в чашках Петри прозрачная, розового цвета.
Среду необходимо использовать в день приготовления. хранить до посева
в темноте!
Специфическая активность. Питательная среда обеспечивает на всех
засеянных чашках Петри рост тест-штаммов: E. coli 4 (О 157:Н 7), E. coli
3912/41 (055: К59), S. typhimurium 79, S. flexneri 1 a 8516 через 1 8 -2 0 ч ин­
кубации при температуре (37 ± 1)°С при посеве по 0,1 мл микробной взве­
си каждого тест-штамма из разведения 10— 6, разбавленной стерильным
0,9%-ным раствором натрия хлористого в соотношении 1:1.
Колонии: E. coli 4 (О 157:Н 7) круглые, полупрозрачные, бесцветные или
светло-розовые, диаметром 1,5-2,5 мм.
E. coli 3912/41 (055:К 59) круглые, малинового цвета со слабовыражен­
ным металлическим блеском или без него, диаметром 1,5-2,5 мм.
S. typhimurium 79 круглые, малинового цвета, с металлическим блеском,
диаметром 1,0-2,0 мм.
S. flexneri 1 a 8516 круглые, полупрозрачные, бесцветные или светло­
розовые, диаметром 1,0—1,5 мм.
Дифференцирующие свойства среды. Питательная среда обеспечива­
ет четкую дифференциацию сорбитотрицательных от сорбитположитель-
ных штаммов на всех засеянных чашках при посеве 0,1 мл каждой микроб­
ной смеси тест-штаммов E. coli 4 (О 157:Н 7) с E. coli 3912/41 (055:К 59),
E. coli 4 (О 157:Н 7) с S. typhimurium 79 из разведения 10— 6 через 18—20 ч
инкубации при температуре (37 ± 1)°С.
Показатель инги 6 и ц и и . Питательная среда полностью подавляет рост
тест-штамма S. aureus Wood-46 на всех засеянных чашках при посеве по
0,1 мл микробной взвеси из разведения 10— 1 через 18—20 ч инкубации при
температуре (37 ± 1)°С.
Изучены биологические свойства среды Сорбитол E. coli О157:Н7 агара
на широком наборе тест-штаммов. Параллельно производился посев на
среду агар Эндо-ГРМ и ГРМ-агар. Результаты исследований представле­
ны в табл. 31.
Анализ представленных данных показывает, что:
• сорбитотрицательные, но лактозоположительные тест-штаммы (группа
E. coli О157:Н7) образуют бесцветные или слабо-розовые колонии диаме­
тром от 1,5 до 2,0 мм;
• сорбитотрицательные и лактозоотрицательные тест-штаммы (шигел-
лы, протеи и гафнии) образуют бесцветные или слабо-розовые колонии,
диаметром от 0,5 до 2,0 мм;
• сорбитположительные, но лактозоотрицательные тест-штаммы
(S. paratyphi B, S. typhimurium) образуют ярко-малиновые колонии с ме­
таллическим блеском, диаметром от 1,5 до 2,0 мм;

117
Таблица 31. Биологические свойства среды Сорбитол Е . coli 0157:Н7 агара на широ­
ком наборе тест-штаммов
№ Наименованиештамма СорбитолЕ. coli Контрольные среды
п/ п 0157:Н7 агар АгарЭндо-ГРМ ГРМ-агар
морфологиякультур(диаметр, мм), цвет
1. E. coli 4 (О157:Н7) 1,5—2,0 2,0-2,5 1,5-2,5
бесцв. малин., с мет. бл. бесцв.
2. E. coli 25 (О157:Н7) 1,5—2,0 бесцв. 2,0-2,5 малин., 1,5-2,5
с мет.бл. бесцв.
3. E. coli 3912/41 (055:К59) 1,5—2,0 1,5-2,5 1,5-2,5
малин., со сл. мет. бл. малин., с мет. бл. бесцв.
4. E. coli АТСС 25922 1,5—2,0 1,5-2,5 1,5-2,5
малин., со сл. мет. бл. малин., с мет. бл. бесцв.
5. E. coli 0124 2,0-2,5 1,5-2,5 1,5-2,5
интенс. розовые малин., со сл.мет. бл. бесцв.
6. E. coli 168/59 (0111:К58) 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-1,5
розовые малин. бесцв.
7. E. aerogenes 418 1,5-2,5 1,5-2,5 1,5-2,5
малин., расплывч., малин., расплывч., бесцв. расплывч.,
слизист. слизист. слизист.
8. S. aureus Wood-46 роста нет роста нет спл. рост
9. S. faecalis 775 роста нет роста нет спл. рост
10. Alcaligenes faecalis 73 1,0-1,5 1,0-1,5 0,5-1,5
сл.розовые сл. розовые бесцв.
11. P. mirabilis Цветков роение роение роение
сл.розовые сл. розовые
12. P. vulgaris HX 19 222 роение роение роение
сл. розовые сл. розовые
13. S. flexneri 1 a 8516 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-1,5
бесцветные бесцветные бесцв.
14. S. sonnei «S form» 1,5-2,0 1,5-2,5 1,0-1,5
розовые слабо розовые бесцв.
15. S. paratyphi A 225 1,5-2,5 1,5-2,5 1,5-2,5
интенс. розовые бесцветные бесцв.
16. S. paratyphi B 8006 1,5-2,0 1,5-2,0 1,5-2,5
малин. с мет. бл. бесцв., слизист. бесцв., слизист.
17. K. pneumoniae 8172 1,0-1,5 1,5-2,0 1,5-2,5
интенс. розовые малин. бесцв.
18. S. typhimurium 79 1,5-2,0 1,5-2,0 1,5-2,5
малин., с мет.бл. бесцв., слизист. бесцв., слизист.
19. S. typhi «bismut» 1,0-1,5 1,5-2,0 1,5-2,0
интенс. розовые бесцветн. бесцв.
со сл. мет. бл.
20. S. dysenteriae 1 1362 0,5-1,0 0,5-1,0 0,5-1,0
бесцв. бесцв. бесцв.
21. C. freundii 3150 1,5-2,5 1,5-2,5 1,5-2,5
малин. ярко-розовые бесцв.
22. Hafnia alvei 1 1,5-2,0 1,5-2,0 1,5-2,0
розовые розовые бесцв.

118
• сорбитположительные и лакто­
зоположительные тест-штаммы
(E. coli, Enterobacter) образуют коло­
нии малинового цвета, со слабым
металлическим блеском или без него.
Процент прорастания всех куль­
тур составляет не менее 90% по
сравнению с ГРМ-агаром.
Рост тест-штаммов на среде Сор­
битол E. coli О157:Н7 представлен
на рис. 27.
Для оценки качества разработан­
ной среды были проведены более де­
тальные длительные испытания на
различном клиническом материале в
Ф Б У З «Центр гигиены и эпидемио­
логии в Тульской области». Два
штамма E. coli, выделенные от боль­
ного ГУС ребенка при посеве на
среду Сорбитол E. coli О157:Н7 агар,
определены как E. coli О157:Н7, что
было подтверждено соответствую­
щими диагностическими сыворотка­
ми. Также было исследовано еще
19 культур E. coli, выделенных от
больных ГУС детей, находящихся на
лечении в больницах г. Тулы. Из них
11 штаммов идентифицированы как
сорбитотрицательные. Дальнейшие
исследования с применением диаг-
ностикумов также подтвердили при­
надлежность выделенных культур
к E. coli О157:Н7.
Кроме того, клинические испыта­
ния Сорбитол E. coli О157:Н7 агара
проводились в баклаборатории
Ф Б У З «Федеральный центр гигие­
ны и эпидемиологии». Исполь­
Рис. 27. Р о с т тест-штаммов на среде Сор­
зовались контрольные тест-штам­
битол Е . coli 0 1 5 7 :Н 7 : а - S. typhimurium
мы E. coli О157:Н7 номер 1282, 904, 79; b - E. coli О 157:Н 7; с - микробная смесь:
а также другие тест-штаммы кишеч­ S. typhimurium 79 с E. coli О157:Н7.

119
ной палочки, сальмонелл и шигелл. В качестве контрольных сред использо­
вали среду Mac Conkey Sorbitol Agar (Merck). По чувствительности и диф­
ференцирующим свойствам питательная среда Сорбитол E. coli О157:Н7
агар не уступала импортным средам аналогичного назначения.

6 .3 .4 . С реда Л евина

В числе коммерческих отечественных сред, используемых для выделе­


ния энтеробактерий, выпускается дифференциальная питательная среда,
которая обладает слабоселективными свойствами - питательная среда
с эозин-метиленовым синим - среда Левина. Эта среда используется при
лабораторной диагностике дизентерии, брюшного тифа, сальмонеллезов и
других кишечных инфекций. Впервые агар с эозином и метиленовым
синим был предложен в 1916 г. Холт-Харрисом и Тигом (J.E . Holt-Harris,
О. Teague), позднее, в 1918 г., состав среды был модифицирован Левином.
Он упростил первоначальную пропись, используя только пептон в каче­
стве основы и добавив к нему калия фосфат однозамещенный в качестве
буферной системы, он исключил из состава среды сахарозу и увеличил
концентрацию лактозы [5].
Дифференцирующая способность основана на изменении рН под дейст­
вием кислоты, образующейся при ферментации бактериями лактозы.
Комплекс индикатора выпадает в осадок при рН 4,7, окрашивая колонии
кислотообразующих бактерий в темно-сине-фиолетовый, почти черный
цвет, часто с зеленым блеском. Бактерии, не ферментирующие лактозу,
образуют бесцветные или розоватые колонии [85].
Эозин и метиленовый голубой в агаре Левина придают среде слабосе­
лективные свойства, ингибируя рост грамположительных бактерий. Эти
же красители обеспечивают возможность дифференциации лактозофер­
ментирующих и неферментирирующих лактозу бактерий за счет окраши­
вания колоний. Ряд бактерий, положительных по Граму и не ферментири-
рующих лактозу, хорошо растут на этой среде и должны быть дифферен­
цированы дополнительными биохимическими тестами.
Среда может быть использована для выделения коагулазоположитель-
ных стафилококков. Стафилококки образуют на среде мелкие, диаметром
до 1 мм, бесцветные или светло-фиолетовые колонии с темным центром.
Ведущими зарубежными фирмами [154, 168, 169] выпускается агар
Левина (агар с эозином и метиленовым голубым) следующего состава, г/л:
Пептон или панкреатический гидролизат желатина 10 г/л
Лактоза 10 г/л
Калия фосфат двузамещенный 2,0 г/л
Эозин 0,4 г/л

120
Метиленовый голубой 0,065 г/л
Агар 15,0 г/л.
Питательная среда с эозин-метиленовым синим сухая (среда Левина)
НПО «Микроген» предназначена для выделения энтеробактерий из иссле­
дуемого материала и их дифференциации по признаку ферментации лакто­
зы, выделения коагулазоположительных стафилококков при обследовании
декретированных групп и представляет собой смесь сухих компонентов:
питательный агар сухой 36,28 г/л, сахар молочный 12,95 г/л, эозин-Н
0,63 г/л метиленовый голубой 0,076 г/л, сода кальцинированная 0,064 г/л.
Ф Б У Н ГНЦ ПМБ выпускается среда Левина ГРМ, предназначенная
для бактериологических исследований в клинической и санитарной мик­
робиологии с целью выделения и дифференциации энтеробактерий при
диагностике инфекционных заболеваний следующего состава, г/л:
ПГРМ 12,0
Дрожжевой экстракт 1,0
Лактоза 10,0
Натрия гидрофосфат 0,7
Натрия хлорид 4,2
Эозин-Н 0,4
Метиленовый синий или метиленовый голубой 0,065
Агар микробиологический 9,0 ± 3,0
рН от 7,0 до 7,4
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на этикетке
для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают в 1 л
дистиллированной воды, кипятят в течение 3 мин, фильтруют через ватно­
марлевый фильтр и стерилизуют автоклавированием при температуре 110°С
в течение 20 мин. Стерильную среду охлаждают до температуры 45-50°С, раз­
ливают в стерильные чашки Петри слоем 5 - 6 мм. После застывания среды
чашки подсушивают при температуре (37 ± 1)°С в течение 4 0 -6 0 мин. Готовая
среда в чашках Петри прозрачная, красновато-коричневого цвета. Контроль
специфической активности среды допускается осуществлять в течение 3 сут
после ее приготовления при условии хранения при температуре 2-8°С.
Специфическая активность. Питательная среда обеспечивает на всех
засеянных чашках Петри рост тест-штаммов S. flexneri 1a 8516 и E. coli
168/59 (O 111:K 58) через 1 8 -2 0 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С
при посеве по 0,1 мл микробной взвеси культуры каждого тест-штамма из
разведения 10-7, и рост тест-штамма S. aureus 209-P (АТСС 6538-Р ) через
48 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С при посеве по 0,1 мл микроб­
ной взвеси культуры тест-штамма из разведения 10-5.
Колонии S. flexneri 1a 8516 круглые, прозрачные, бесцветные или слабо­
розовые, диаметром 1,0—1,5 мм.

121
Колонии E. coli 168/59 (O 111:K 58) круглые, темно-фиолетового цвета
с зеленым металлическим блеском (возможно наличие отдельных коло­
ний без металлического блеска), диаметром 1,5-2,0 мм.
Колонии S. aureus 209-P (АТСС 6538-Р) круглые, бесцветные или
светло-фиолетовые с темным центром, диаметром до 1,0 мм.
Дифференцирующие свойства среды. Питательная среда обеспечива­
ет четкую дифференциацию шигелл от эшерихий на всех засеянных чаш­
ках при посеве по 0,1 мл микробной смеси S. flexneri 1a 8516 и E. coli 168/59
(O 111:K 58) из разведения 10-6 (в соотношении 1:1) через 1 8 -2 0 ч инкуба­
ции при температуре (37 ± 1)°С.
Микробный рост на среде Левина ГРМ представлен на рис. 28.
Питательная среда с эозин-метиленовым синим (среда Левина) широко
используется бактериологическими лабораториями и позволяет получать
хорошие результаты по высеваемости энтеробактерий.

Рис. 28. Р о с т различных микроорганизмов на среде Левина ГРМ: а - E. coli 168/59


(О 111:К 58); b - S. flex n eri 1a 8516; с - микробная смесь тест-штаммов S. flex n eri 1a 8516 и
E. coli 168 /5 9 (O 111:K 58); d - посев клинического материала.

122
Традиционно с целью получения изолированных колоний проводится
прямой посев образцов клинического материала на дифференциально­
диагностические питательные среды с дальнейшей визуальной первичной
идентификацией выросших колоний. На среде Левина исследуются лак­
тозоотрицательные колонии, подозрительные на принадлежность к ши-
геллам, сальмонеллам и энтеропатогенной лактозоотрицательной кишеч­
ной палочке (ЭПКП).
На базе лаборатории М Б У З «Пятигорская городская инфекционная
больница» были проведены испытания питательной среды Левина ГРМ
производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ с использованием клинического мате­
риала от больных с ОКИ. Колонии, подозрительные на принадлежность к
патогенным и условно-патогенным энтеробактериям со среды Левина-
ГРМ, пересевались на дополнительные среды для первичной идентифика­
ции по биохимическим признакам и с использованием соответствующих
серологических исследований.
В качестве контрольных культур использовались клинические изоляты:
шигеллы, сальмонеллы и лактозоотрицательные кишечные палочки
(ЭПКП). Специфическая активность питательных сред при посеве кли­
нических изолятов соответствовала показателям, заложенным в норма­
тивной документации на среду.
В результате проведенных исследований среды Л евина-ГРМ было об­
наружено наличие в клиническом материале сальмонелл и энтеропатоген­
ных эшерихий. Таким образом, в бактериологических исследованиях
успешноприменяются универсальныедифференциально-диагностические
среды, в том числе и питательная среда Левина, обеспечивающие рост
многих видов грамотрицательных и некоторых грамположительных бак­
терий с целью выделения условно патогенных энтеробактерий (У П Э ).

6 .3 .5 . В исмут- сульфит агар

Большинство сальмонелл хорошо растет на обычных питательных средах


и не требует специальных ростовых факторов. Лабораторная диагностика
сальмонеллезов имеет огромное значение, поскольку нередко только бакте­
риологическое исследование позволяет поставить точный диагноз.
При выборе питательных сред для выделения сальмонелл учитывают про­
исхождение пробы клинического материала (испражнения, кровь, моча и др.),
предполагаемые виды энтеробактерий в соответствующей пробе, а также цель
бактериологического исследования и другую информацию (диагноз, эпиде­
мическая ситуация и др.), содержащуюся в сопроводительном документе.
При посеве материала с целью обнаружения сальмонелл необходимо
использовать набор плотных и жидких элективных питательных сред,

123
обеспечивающих наиболее благоприятные условия для роста сальмонелл
(среды Плоскирева и висмут-сульфит агар, а также среды обогащения -
Мюллера, селенитовая, магниевая и др.) [73].
Из плотных сред, производимых в нашей стране, высокоселективным
действием в отношении сальмонелл обладает висмут-сульфит-агар. За ру­
бежом для выделения сальмонелл наряду с этой средой широкое примене­
ние получили такие среды, как бриллиантовый зеленый и ксилозо-лизин-
бриллиантовый зеленый агары и др. Висмут-сульфит-агар подавляет рост
сопутствующей кишечной микрофлоры, что позволяет увеличить в не­
сколько раз количество посевного материала, чем это возможно при ис­
пользовании других дифференциальных сред, которые применяются для
подобных целей [128].
На висмут-сульфит-агаре почти все сальмонеллы образуют черные ко­
лонии с металлическим блеском, при этом наблюдается прокрашивание
участка среды под колониями в черный цвет. Исключение составляют
S. paratyphi A и некоторые другие серовары, которые образуют на этой
среде серовато-зеленые с темным центром или коричневые колонии.
Дифференцирующие свойства среды основаны на способности микро­
организмов продуцировать сероводород, образующийся при реакции с вис­
мута цитратом, соединение черного цвета - висмут-сульфит. Коммерческая
питательная среда производства НПО «Микроген» для выделения сальмо­
нелл - висмут-сульфит агар в качестве белковой основы содержит панкреа­
тический гидролизат кильки каспийской 27,1 г/л, а также: глюкозу 4,5 г/л,
висмута цитрат 1,7 г/л, экстракт кормовых дрожжей 0,6 г/л, натрия сульфит
безводный 2,55 г/л, соль Мора 1,15 г/л, динатрия фосфат обезвоженный
2,55 г/л, бриллиантовый зеленый 0,016 г/л, соду кальцинированную 0,6 г/л,
натрия хлорид 2,5 г/л, агар микробиологический 12,4 ± 2,5 г/л.
Ведущими зарубежными фирмами выпускается висмут-сульфит агар,
в компонентном составе которого в основном содержится панкреатиче­
ский гидролизат казеина или пептон 5 ,0 -1 0 г/л, мясной экстракт 5,0 г/л,
глюкоза - 5,0 г/л, Na2 H PO 4 б /в - 4,0 г/л, FeSO 4 от 0,3 до 0,5 г/л, индикатор
висмут-сульфит - 8,0 г/л, бриллиантовый зеленый 0,015-0,025 г/л, агар
микробиологический 15,0-20,0 г/л [149, 154, 159, 167, 169].
Питательные среды отечественного и импортного производства отлича­
ются не только видами белковых гидролизатов, но и содержанием других
компонентов - экстрактов, солей, ингибиторов.
Висмут-сульфит-ГРМ-агар производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ выпуска­
ется на основе панкреатического гидролизата рыбной муки и предназна­
чен для бактериологических исследований в клинической и санитарной
микробиологии с целью выделения сальмонелл из исследуемого материа­
ла при диагностике инфекционных заболеваний.

124
Состав, г/л
ПГРМ 24,0
Экстракт пекарных дрожжей 1,0
Натрий хлористый 2,0
Глюкоза 4,5
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 2,0
Натрий сернистокислый 4,0
Висмут лимоннокислый 1,7
Железо (II) сернокислое 7-водное 0,6
Бриллиантовый зеленый 0,010-0,015

V)
Натрий углекислый

4^
О

О
Агар микробиологический 11,0 ± 3,0
рН от 7,4 до 7,8
Приготовление среды: сухую среду в количестве, необходимом для при­
готовления конкретной серии, тщательно размешивают в 1 л воды дистил­
лированной, кипятят при постоянном перемешивании в течение 3 мин
до полного расплавления агара. Охлаждают до температуры 45-50°С ,
взбалтывают, разливают в чашки Петри. Готовая среда в чашках непро­
зрачная, зелено-желтого цвета.
Контроль специфической активности среды осуществляется в течение
3 сут при условии хранения в защищенном от света месте при температуре
от 2 до 25°С.
Специфическая активность. Питательная среда обеспечивает на всех
засеянных чашках Петри рост тест-штаммов S. typhi H-901 ГД Р/ГИ С К,
S. typhimurium 79, S. paratyphi A-225, S. london 3496, S. gallinarum 665 и
S. typhi «bismuth» при посеве по 0,1 мл микробной взвеси культуры каж­
дого тест-штамма из разведения 10-6, разбавленной стерильным 0,9% раст­
вором натрия хлорида в соотношении 1:1 не позднее 48 ч инкубации при
температуре (37 ± 1)°С.
Визуально определяют наличие и характер роста.
Колонии S. typhi H-901 ГД Р/ГИ С К , S. typhimurium 79 и S. london 3496
круглые, черные, с блестящей зоной вокруг них, диаметром 1,0—3,0 мм;
среда под колониями окрашивается в черный цвет.
Колонии S. paratyphi A-225 круглые, зеленые, с темным центром диа­
метром 1,0—2,5 мм.
Колонии S. gallinarum 665 круглые, темно-зеленые диаметром 0,8—1,2 мм.
Колонии S. typhi «bismuth» полиморфные, черные с металлическим
блеском или без него, диаметром 1,0-2,0 мм; среда под колониями окра­
шивается в черный цвет.
Дифференцирующие свойства среды. При посеве по 0,1 мл микробной
смеси тест-штаммов S. typhimurium 79 и E. coli 3912/41 (О55:К59) на всех за­

125
сеянных чашках Петри через 4 4 -4 8 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С
наблюдается четкая дифференциация сальмонелл от кишечной палочки.
Показатель инги 6 и ц и и . Питательная среда полностью подавляет рост
тест-штаммов S. aureus W ood-46 из разведения 1 0 1, K. rhinoscleromatis
NCTC 5046 из разведения 10-5 и роение тест-штамма P. vulgaris H X 19 222
из разведения 10-6 на всех засеянных чашках Петри при посеве соот­
ветственно по 0,1 мл микробной взвеси через 4 4 -4 8 ч инкубации при тем­
пературе (37 ± 1)°С. Рост тест-штамма E. coli 3912/41 (О 55:К 59) на среде
должен подавляться не менее чем в 100 раз по отношению к числу коло­
ний, выросших на питательном агаре.
Колонии P. vulgaris HX 19 222 круглые, светло-зеленого цвета, диамет­
ром 1,0-2,0 мм.
Колонии E. coli 3912/41 (055:K 59) круглые, зеленовато-коричневые,
диаметром 0 ,5 -1 ,5 мм.
Рост тест-штаммов на Висмут-сульфит-ГРМ агаре представлен на рис. 29.

d
Рис. 29. Р о с т тест-штаммов на Висмут-сульфит-ГРМ агаре: а - S. typhi H-901 Г Д Р /
ГИ СК; b - S. typhimurium 79; с - P. vulgaris H X 19 222; d - смесь E. coli 3 9 1 2 /4 1 (055:K 59)
с S. typhimurium 79.

126
Биологические свойства Висмут-сульфит-ГРМ-агара были изучены на
расширенном наборе не только семейства энтеробактерий, но и других
микроорганизмов. В этих исследованиях использована методика оценки
качества питательных сред с посевной дозой 100 микробных клеток
(0,1 мл из разведения 10-6).
Результаты исследований представлены в табл. 32.

Таблица 32. Ростовые свойства Висмут-сульфит-ГРМ агара и аналогов на расширен­


ном наборе тест-штаммов
№ Тест-штаммы Висмут-сульфит- Висмут-сульфит-агар ГРМ-агар
п/ п ГрМ-агар НПО«Микроген»
1. S. typhi H-901 3111 1,0-1,5 1,0-1,5 1,2-1,4
кругл., черн., металл. бл., кругл., черн., металл. бл., круглые, бесцветные
потемн. среды потемн. ср.
2. S. typhi H-901 1,2-1,4 1,2-1,6 1,4-1,6
ГДР/ГИСК кругл., черн., металл. бл., кругл., черн., металл. бл., круглые, бесцветные
потемн. среды потемн. среды
3. S. choleraesuis 147 1,0-1,6 1,0-2,0 1,4-1,6 круглые,
кругл., зеленые, кругл., св.-зеленые, бесцветные
с темным ц. с темн. ц.
4. S. london 3496 1,5-2,0 2,5-3,0 1,6-2,5
кругл., черн., металл. бл., кругл., черн., металл. бл., круглые, бесцветные
потемн. среды потемн. среды
5. S. typhimurium 79 1,5-2,0 1,5-3,0 1,5-2,5
кругл., черн., металл. бл., кругл., черн., металл. бл., круглые, бесцветные
потемн. среды потемн. среды
6. S. typhimurium 2871 1,0-1,5 1,5-2,5 1,5-2,0
кругл., черн., металл. бл., кругл., черн., металл. бл., круглые, бесцветные
потемн. среды потемн. среды
7. S. typhimurium 164 1,5-2,0 2,0-2,5 1,6-1,8
кругл., черн., металл. бл., кругл., черн., металл. бл., круглые, бесцветные
потемн. среды потемн. среды
8. S. paratyphi B 8006 1,5-2,0 2,0-2,5 1,5-2,0
кругл., черн., металл. бл., кругл., черн., металл. бл., круглые, бесцветные
потемн. среды потемн. среды
9. S. paratyphi А 67 0,5-1,5 1,0-2,5 1,5-2,0
кругл., с зел.-корич- кругл., зеленые, круглые, бесцветные
невым центром с темным центром
10. S. paratyphi А 28 0,5-1,2 0,5-1,8 1,5-2,0
кругл., кругл., св. зеленые, круглые, бесцветные
с зел.-коричневым с зел. коричн. ц.
центром
и. S. paratyphi А 225 1,0-1,5 2,0-2,5 1,5-2,0
кругл., зеленые, кругл., зеленые, круглые, бесцветные
с темным центром с темным центром
12. S. gallinarum 665 1,0-1,2 1,2-1,4 1,0-1,2
кругл., кругл., круглые, бесцветные
зел.-коричневые зел.-коричневые
13. S. typhi «bismut» 1,0-1,5 1,2-1,6 кругл., черн., 1,2-1,4
кругл., черн., металл. бл., металл. бл., потемн. круглые, бесцветные
потемн. среды среды
14. S. flexneri 1 а 8516 0 0 1,5-2,0
круглые, бесцветные

127
Таблица 32. Окончание
№ Тест-штаммы Висмут-сульфит- Висмут-сульфит-агар ГРМ-агар
п/ п ГРМ-агар НПО«Микроген»
15. S. sonnei «S form» 1,0-1,2 0,5-2,0 1,5-2,0
кругл., светл., кругл., светл., круглые, бесцветные
зел.-коричн. зел.-коричн.
16. Y. enterocolitica 287 0 0 1,0-1,2
круглые, бесцветные
17. K. pneumoniae 3534/51 0,2-0,8 1,5-3,5 2,5-3,0
круглые, коричневые круглые, круглые, бесцветные
зелено-коричневые
18. K. oxytoca 0,5-1,5 1,6-2,5 2,0-3,5
круглые, зелено-коричн. темно-коричн. слаб. круглые, бесцветные
металл. бл. вокруг кол.
19. P. aeruginosa 27/99 0 0,1-0,6 1,4-2,0
зел.-коричн. круглые, бесцветные
20. P. mirabilis 3177 0,5-3,0 роение роение
круглые, темно-зеленые
21. S. pyogenes Dick I нет роста нет роста -
22. P. vulgaris HX 19222 1,0-1,5 1,5-2,5 спл. роение
кругл., св.-зеленые, круглые, зеленые
зеленый центр
23. E. faecium 7171 нет роста нет роста -1,0
круглые, бесцветные
24. E. coli 3941/12 0,5-1,5 0,5-1,5 1,5-2,5
(055:K59) круглые, круглые, круглые, бесцветные
зел.-коричневые зел.-коричневые
25. E. faecalis 775 нет роста нет роста 0,5-1,0
круглые, бесцветные
26. S. aureus Wood-46 нет роста нет роста спл. рост
27. K. rhinoscleromatis нет роста нет роста спл. рост
NCTC 5046

Исследования характера роста музейных тест-штаммов при посеве на


чашки Петри с висмут-сульфит-агарами показали, что тест-штаммы, про­
дуцирующие сероводород, прорастают в виде черных колоний с потемне­
нием среды и металлическим блеском. чувствительность сред в отноше­
нии сальмонелл - процент прорастания составлял 90-100% к контролю
роста тест-штаммов на ГРМ-агаре.
Установлено, что Висмут-сульфит-ГРМ-агар обладает ярко выраженными
ингибирующими свойствами в отношении большинства энтеробактерий,
стафилококков и стрептококков. Более выраженным ингибирующим эффек­
том Висмут-сульфит-ГРМ-агар обладал и в отношении тест-штаммов
P. aeruginosa 27/99, K. pneumoniae 3534/51, K. oxytoca. При росте тест-штамма
P. mirabilis 3177 на контрольной среде наблюдалось роение штамма, в то
время как на Висмут-сульфит-ГРМ-агаре роение было полностью подавлено.
Испытания качества питательной среды для выделения сальмонелл
(Висмут-сульфит-ГРМ-агара) были проведены на базе филиала Ф Б У З

128
«Центр гигиены и эпидемиологии в Московской области» и Ф Б У З «Центр
гигиены и эпидемиологии в Тульской области». В качестве контроля были
взяты питательные среды для выделения сальмонелл (висмут-сульфит агар)
производства НПО «Микроген» и Bismuth Sulfite Agar фирмы Pronadisa.
Приготовление сред проводилось в строгом соответствии с инструк­
цией по применению. Посев клинического материала в виде микробных
взвесей монокультур микроорганизмов осуществлялся на среды одного
дня приготовления с соблюдением условия равнозначности. Посевы ин­
кубировались при температуре (37 ± 1)°С в течение 4 4 -4 8 ч с последую­
щей визуальной оценкой ростовых, дифференцирующих и ингибирую­
щих свойств питательных сред через 24 и 48 ч.
Ростовые свойства оценивались по количеству выросших колоний
в условных единицах. Дифференцирующие свойства - по характеру роста
штаммов энтеробактерий, продуцирующих и не продуцирующих сероводо­
род. Ингибирующие свойства сред - по степени подавления роста микробов-
ассоциантов. В табл. 33 приведены результаты проведенных исследований.
Совокупность экспериментальных данных по музейным штаммам и
клиническом материале позволяет установить:
•висмут-сульфит агар обладает достаточно высокой чувствительно­
стью и обеспечивает рост тест-штаммов сальмонелл при посеве по 0,1 мл
микробной взвеси из разведения 10-7 (10 м.к.);

Таблица 33. Ростовые и дифференцирующие свойства висмут-сульфит-агаров


№ Наименование Контрольные среды Висмут-сульфит-ГРМ
п/ п культур BismuthSulfite agar Висмут-сульфит-агар агар
[159] [38]
характеристикаколоний характеристикаколоний характеристикаколоний
1. K. pneumoniae м елки е колонии, м елки е колонии,
коричневого цвета, коричневого цвета,
-
1 , 0 - 2 , 0 мм 1 , 0 - 2 , 0 мм

2. P. mirabilis кр уп ны е колонии, кр уп ны е колонии,


светло-кор и ч н евого светло-кор и ч н ево го
цвета, 2 , 0 - 3 , 0 мм цвета, 2 , 0 - 3 , 0 мм

3. E. coli Lac+ нет роста св етло-к ор и ч н евы е светло-к ор и ч н евы е


колонии, 1 , 0 - 2 , 0 мм колон ии, 1 , 0 - 2 , 0 мм

4. E. coli Lac нет роста св етло-к ор и ч н евы е светло-к ор и ч н евы е


колонии, 1 , 0 - 2 , 0 мм колон ии, 1 , 0 - 2 , 0 мм

5. S. sonnei нет роста нет роста нет роста

6. S. enteritidis нет роста м елки е колон ии черного м елки е колон ии черного


ц вета с м еталл. блеском цвета с м еталл. блеском
и тем ны м окраш иван ием и тем ны м окраш иван ием
среды среды

7. S. typhimurium м елки е колон ии черного м елки е колон ии черного м елки е колон ии черного
цвета с м еталл. блеском ц вета с м еталл. блеском цвета с м еталл. блеском
и тем ны м окраш иван ием и тем ны м окраш иван ием
среды среды

129
•через 24 ч инкубации колонии тест-штамов S. typhi H-901 ГД Р/ГИ С К ,
S. typhi «bismuth», S. typhimurium 79, S. london 3496 прорастают в виде круг­
лых, зелено-коричневых колоний с потемнением среды вокруг и металли­
ческим блеском. Колонии S. paratyphi A-225 - круглые, прозрачные. Рост
E. coli 3912/41 (055:K 59) может наблюдаться в виде точечных колоний.
Таким образом, уже через 24 ч предварительная дифференциация на дан­
ной среде возможна;
•через 48 ч инкубации на висмут-сульфит-агаре колонии S. typhi H-901
ГД Р/ГИ С К , S. typhi «bismuth», S. typhimurium 79 и S. london 3496 становят­
ся черными с металлическим блеском и потемнением среды. При снятии
колоний бактериологической петлей остается черный след. S. paratyphi
A-225 - круглые, зеленые с темным центром, а S. gallinarum 665 образует
зелено-коричневые, круглые колонии диаметром 0,8—1,2 мм;
•на среде висмут-сульфит агар полностью подавляется рост тест-штам­
мов S. aureus Wood-46 и K. rhinoscleromatis NCTC 5046, а также роение
P. vulgaris HX 19 222;
• на средах ингибируется рост тест-штаммов E. coli 3912/41 (055:K 59).

6 .3 .6 . Б а к т о а г а р П л о с к и р е в а

Обнаружение возбудителей дизентерии, брюшного тифа, паратифов,


сальмонеллезов имеет большое диагностическое и эпидемиологическое
значение. Применяемый в настоящее время в бактериологической практи­
ке метод выделения шигелл и сальмонелл из испражнений предусматри­
вает посев на плотные селективные и дифференциальные среды. За рубе­
жом для этих целей используются Salmonella Shigella Agar, Deoxycholate
Citrate Agar, Hektoen Enteric Agar, XLD Agar (Xylose Lysine Deoxycholate
Agar) и др. [128]. В нашей стране для выделения шигелл и сальмонелл
широко используется коммерческая дифференциально-диагностическая
среда —бактоагар Плоскирева [84].
Среда Плоскирева позволяет дифференцировать группы или виды бакте­
рий по ферментативной активности и используется для выделения чистой
культуры энтеробактерий на 1-м этапе; позволяет дифференцировать бакте­
рии по признаку ферментации лактозы. В связи с наличием в составе среды
ингибиторов (соли желчных кислот, йод, индикаторы) среда должна пода­
влять рост грамположительной микрофлоры, эшерихий, роение протея.
Лактозоотрицательные бактерии (в частности, шигеллы, сальмонеллы) ра­
стут на данной среде в виде бесцветных колоний. Лактозоположительные
бактерии (в частности, эшерихии) образуют колонии малинового цвета [55].
На протяжении почти четырех десятилетий бактоагар Плоскирева по­
лучил в России широкое распространение как элективная среда для вы-

130
Рис. 30. Лактозоотрицательные бактерии (шигеллы, сальмонеллы) - бесцветные. Лакто­
зоположительные бактерии (эшерихии) - м а л и н о в о г о цвета.

деления тифо-паратифозных и дизентерийных бактерий. В состав бакто-


агара Плоскирева входит [38]: панкреатический гидролизат кильки
12,5 г/л, соли желчных кислот 8,1 г/л, натрия хлорид 3,5 г/л, сахар молоч­
ный 7,59 г/л, натрия гидроцитрат двузамещенный 8,82 г/л, нейтральный
красный 0,04 г/л, бриллиантовый зеленый 0,02 г/л, динатрия фосфат
2,25 г/л, натрий серноватистокислый 6,86 г/л, йод 0,12 г/л, сода кальци­
нированная 1,42 г/л, агар микробиологический 8,75 ± 1,0 г/л.
По ростовым свойствам бактоагар Плоскирева обеспечивает рост ши-
гелл и сальмонелл в виде бесцветных колоний (розовый оттенок допуска­
ется) и их дифференциацию от эшерихий, которые образуют малиновые
колонии (рис. 30), а также подавление роста стафилококка.
В состав селективных сред для выращивания патогенных энтеробак­
терий входят желчь и соли желчных кислот. Смесь желчных кислот,
получаемая в результате щелочного гидролиза желчи, обычно входит
в состав среды Плоскирева. За рубежом в составе селективных сред ис­
пользуют соли отдельных желчных кислот, в основном дезоксихолат
натрия.
В Ф Б У Н ГНЦ ПМБ отработана и успешно используется технология
изготовления сухих основ путем внесения необходимых компонентов в
ПГРМ перед высушиванием для улучшения качества диагностических
питательных сред.
Питательная среда для выделения шигелл и сальмонелл (агар
П лоскирева-ГРМ ) производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ разработана на осно­
ве ПГРМ, высушенного с гигроскопичными солевыми добавками (тио­
сульфат и цитрат натрия) в целях уменьшения слеживаемости среды и
улучшения ее качества. В качестве витаминной добавки использован экс­
тракт пекарных дрожжей.

131
Ингибирующие вещества (желчные соли, бриллиантовый зеленый,
йод), входящие в состав среды, полностью подавляют рост грамположи-
тельной микрофлоры и в 2 - 3 раза рост кишечной палочки, не препятствуя
росту шигелл и сальмонелл.
Дифференцирующие свойства среды основаны на изменении рН в кис­
лую сторону при росте лактозоферментирующих бактерий, которые об­
разуют на агаре Плоскирева-ГРМ за счет индикатора нейтрального крас-
ного колонии малинового цвета.
Агар Плоскирева-ГРМ следующего состава, г/л:
ПГРМ сухой с тиосульфатом и цитратом натрия 34,5
Лактоза 10,0
Экстракт пекарных дрожжей 5,0
Желчь крупного рогатого скота очищенная 7,0 ± 1,5
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-вод. 2,0
Натрий хлористый 1,0
Нейтральный красный 0,04
Бриллиантовый зеленый 0,00033
Йод кристаллический 0,04
Агар микробиологический 9,0 ± 3,0
рН от 6,8 до 7,2
Приготовление среды: сухую среду в количестве, необходимом для при­
готовления конкретной серии питательной среды, тщательно размешива­
ют в 1 л воды дистиллированной, кипятят в течение 3 мин, периодически
перемешивая, до полного расплавления агара. Охлаждают до температуры
40-45°С , разливают в чашки Петри. Перед посевом чашки со средой под­
сушивают на рабочем столе с открытыми крышками в течение 9 0 -1 0 0 мин
при температуре 18-25°С . Готовая среда в чашках прозрачная, коричневато­
красного цвета.
Контроль специфической активности среды допускается осуществлять
в течение 2 сут после ее приготовления при условии хранения в темном
месте при температуре 18-25°С .
С п е ц и ф и ч е с к а я а к т и в н о с т ь . Питательная среда обеспечивает на
всех засеянных чашках Петри через 1 8 -2 0 ч инкубации при температу­
ре (37 ± 1)°С рост тест-штаммов S. flexneri 1a 8516, S. sonnei «S form»,
S. typhi H-901 ГД Р /ГИ С К , S. paratyphi A-225, E. coli 391 2 /4 1 (О 55:К 59)
при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из разве­
дения 10-6, разбавленной стерильным 0,9%-ным раствором натрия хло­
рида в соотношении 1:1 (для E. coli 39 1 2 /4 1 (О 5 5 :К 5 9 ) из разведе­
ния 10-6).
Д и ф ф е р е н ц и р у ю щ и е с в о й с т в а с р е д ы . Питательная среда обеспечивает
четкую дифференциацию шигелл и сальмонелл от E. coli 3912/41 (О 55:К 59)

132
на всех засеянных чашках Петри
при посеве по 0,1 мл микробной
смеси каждого из тест-штаммов
S. flexneri 1a 8516, S. sonnei «S form»,
S. typhi H-901 ГД Р/ГИ С К , S. para­
typhi A-225 из разведения 10-6
с тест-штаммом E. coli 3912/41
(О 55:К 59) из разведения 10-5 через
1 8 -2 0 ч инкубации при температу­
ре (37 ± 1)°С (рис. 31).
П о к а за т е л ь инги 6 иции . Питатель­
ная среда полностью подавляет Рис. 31. Р о с т смеси тест-штаммов: колонии
шигелл - нежные, гладкие бесцветные или
рост тест-штамма S. aureus Wood-
слегка розового цвета; колонии эшерихий -
46 на всех засеянных чашках при малинового цвета. Микробная смесь: E. coli
посеве по 0,1 мл микробной взвеси 3 9 1 2 /4 1 (О 5 5:К 59) и S. flexn eri 1a 8516.
из разведения 10-1 через 1 8 -2 0 ч
инкубации при температуре (37 ± 1)°С. Рост тест-штамма E. coli 3912/41
(О 55:К 59) на среде должен быть подавлен в 2 - 3 раза по отношению
к числу колоний на питательном агаре при посеве по 0,1 мл микробной
взвеси из разведения 10-6.
Биологические свойства агара Плоскирева-ГРМ в сравнении с коммер­
ческим аналогом бактоагаром Плоскирева производства НПО «Микроген»
на наборе тест-штаммов представлены в табл. 34.

Таблица 34. Биологические свойства агаров Плоскирева


№ Тест-штаммы, АгарПлоскирева- Бактоагар ГРМ-агар
п/ п разведение ГРМ Плоскирева
диаметрколоний(мм), морфология
1. S. flexneri 1a 8516 1,0-1,5 1,0-1,5 1,0-2,0
условно 10-7 бесцв., нежные, бесцв., нежные, бесцв. круглые
гладкие, круглые гладкие, круглые
2. S. sonnei «S-form» 1,5-2,0 1,5-2,0 1,0-2,0
условно 10-7 бесцв., нежные, бесцв., нежные, бесцв. круглые
гладкие, круглые гладкие, круглые
3. S. typhi H 901 ГДР/ 1,4-1,8 1,4-1,8 1,0-2,0 бесцв.
/ГИСК условно 10-7 бесцв., нежные, бесцв., нежные, круглые
гладкие, круглые гладкие, круглые
4. S. paratyphi A-225 1,0-1,4 1,0-1,4 1,0-2,0
условно 10-7 бесцв., нежные, бесцв., нежные, бесцв. круглые
гладкие, круглые гладкие, круглые
5. E. coli 3912/ Количество Количество Количество
/41 (055 K59) 10-6 колоний 26 колоний 32 колоний 62
2,0-2,5 малин., 2,0-2,5 2,0-3,0
круглые, выпуклые, малин., круглые, бесцв. круглые
гладкие выпуклые, гладкие
6. S. aureus Wood-46 10 1 Рост отсутствует Рост отсутствует Сплошной рост

133
Таблиц а 34. Окончание
№ Тест-штаммы, АгарПлоскирева- Бактоагар ГРМ-агар
п/ п разведение грм Плоскирева
диаметрколоний(мм), морфология
7. 5. typhi H 901 Г Д Р / Ч еткая Ч еткая Н е засева л и
ГИ С К /E . coli 3 9 1 2 / 4 1 диф ф еренциация диф ф еренциация
( 0 5 5 :К 5 9 ) 1 0 -6/ 1 0 -5

8. 5. paratyphi A - 2 2 5 / четкая Ч еткая Н е засева л и


/ E . coli 3 9 1 2 / 4 1 ( 0 5 5 :К 5 9 ) диф ф еренциация диф ф еренциация
1 0 -6/ 1 0 -5

9. 5. flexneri 1a 8 5 1 6 / Ч еткая Ч еткая Н е засева л и


/ E . coli 3 9 1 2 / 4 1 ( 0 5 5 :К 5 9 ) диф ф еренциация диф ф еренциация

10. 5. sonnei « S - f o r m » / Ч еткая Ч еткая Н е засева л и


/E .coli 3 9 1 2 / 4 1 ( 0 5 5 :К 5 9 ) диф ф еренциац ия диф ф еренциация

Из таблицы видно, что среды Плоскирева обладают высокой чувстви­


тельностью в отношении сальмонелл и шигелл, а также обеспечивают хо­
рошие дифференцирующие свойства. При учете ростовых свойств пита­
тельных сред отмечено, что количество колоний кишечной палочки на
агарах Плоскирева в 2 - 3 раза меньше по сравнению с количеством коло­
ний, выросших на ГРМ-агаре.

6 .3 .7 . S S - а г а р

Наиболее близким по составу и принципу действия к бактоагару


Плоскирева является S S -агар. Составы S S -агаров, выпускаемых различ­
ными фирмами, идентичны [131], что может являться, по-видимому, кри­
терием хорошо сбалансированной по всем компонентам среды. В составах
сред имеется пептон 5,0 г/л, мясной экстракт 5,0 г/л, лактоза 10,0 г/л, тио­
сульфат натрия 8,5 г/л, цитрат железа 1,0 г/л, бриллиантовый зеленый
3,3 х 10-4, нейтральный красный 0,025 г/л. Некоторые отличия наблюда­
ются в содержании желчи и солей желчных кислот 5 ,5 -8 ,5 г/л, агара
12,0-13,5 г/л и цитрата натрия 8,5-10,0.
Относительно способа действия S S -агара отмечается, что бриллиан­
товый зеленый, желчь и высокая концентрация тиосульфата и цитрата
в большой степени ингибируют сопутствующую микрофлору. Образова­
ние сульфида обнаруживается при использовании тиосульфата и ионов
железа - колонии становятся черными. Присутствие колиформных бак­
терий основывается на определении деградации лактозы в кислоту, где
рН-индикатором является нейтральный красный [149, 154, 159].
Состав питательной среды для выделения сальмонелл и шигелл сухой
(S S -агар) производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ, г/л:
Вариант 1
ПГРМ 16,0

134
Натрия тиосульфат 8,5
Натрия цитрат 10,0
Дрожжевой экстракт 5,0
Лактоза 10,0
Желчь очищенная 7,5
Железа окисного цитрат 1,0
Нейтральный красный 4 х 10-2
Бриллиантовый зеленый 33 х 10-5
Агар микробиологический 10,0 ± 2,0
Вариант 2
ПГРМ с тиосульфатом и цитратом натрия 35,0
Дрожжевой экстракт 5,0
Лактоза 10,0
Желчь очищенная 7,0 ± 1,5
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 1,0
Железа окисного цитрат 1,0
Нейтральный красный 4 х 10-2
Бриллиантовый зеленый 33 х 10-5
Агар микробиологический 10,0 ± 3,0
рН от 6,8 до 7,2
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на этикетке
для приготовления конкретной серии питательной среды, тщательно раз­
мешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 2 - 3 мин,
периодически перемешивая, до полного расплавления агара. Охлаждают
до температуры 40-45°С , разливают в чашки Петри. Перед посевом чашки
со средой подсушивают на рабочем столе с открытыми крышками в тече­
ние 9 0 -1 0 0 мин. Готовая среда в чашках прозрачная, коричневато-крас­
ного цвета.
Готовую среду, разлитую в чашки Петри, можно использовать в течение
10 сут при температуре хранения 2 -8 °С и в течение 2 сут при температуре
хранения 18-25°С (хранить чашки следует в темном месте).
С п е ц и ф и ч е с к а я а к т и в н о с т ь . S S -агар обеспечивает на всех засеянных
чашках Петри через 1 8 -2 0 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С рост
тест-штаммов S. typhi H-901 ГД Р/ГИ С К , S. paratyphi A-225, S. flex n eri 1a
8516, S. sonnei «S form» при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого
тест-штамма из разведения 10-6, разбавленной стерильным 0,9%-ным рас­
твором хлористого натрия в соотношении 1:1.
Колонии S. typhi H-901 ГД Р/ГИ С К , S.paratyphi A-225, S. flex n eri 1a 8516
бесцветные, нежные, гладкие, круглые, диаметром 1,0—2,0 мм.
Колонии S. sonnei «S form» бесцветные или слегка розового цвета, неж­
ные, гладкие, круглые, диаметром 1,0-2,0 мм.

135
Д и ф ф е р е н ц и р у ю щ и е с в о й ств а ср е д ы . Питательная среда обеспечивает
четкую дифференциацию сальмонелл и шигелл от E. coli 3912/41 (055:K59)
на всех засеянных чашках Петри при посеве по 0,1 мл микробной смеси
каждого из тест-штаммов S. typhi H-901 ГДР/ГИ СК, S. paratyphi A-225,
S. flexneri 1a 8516, S. sonnei «S form» с тест-штаммом E. coli 3912/41 (055:K59)
через 1 8 -2 0 ч инкубации при темпе­
ратуре (37 ± 1)°С. Колонии E. coli
3912/41 (055:K59) выпуклые, глад-
кие, малинового цвета.
И н ги б и р у ю щ и е с в о й с т в а с р е д ы .
Питательная среда полностью по­
давляет рост тест-штамма S. aureus
W ood-46 на всех засеянных чашках
при посеве по 0,1 мл микробной
взвеси из разведения 10-1 через
1 8 -2 0 ч инкубации при температу­
ре (37 ± 1)°С. Рост тест-штамма
E. coli 3912/41 (055:K 59) на среде
должен подавляться не менее чем
в три раза по отношению к числу
колоний на питательном агаре при
посеве по 0,1 мл микробной взвеси
из разведения 10-5. При посеве по
0,1 мл микробной взвеси из разве­
дения 10-6 тест-штаммов P. mirabilis
3177 и P. vulgaris HX 19 222 через
1 8 -2 0 ч инкубации при температу­
ре (37 ± 1)°С на всех засеянных
чашках полностью подавлено рое­
ние штамма P. mirabilis 3177 и ча­
стично (с образованием зон без рое­
ния) - штамма P. vulgaris HX 19 222
(колонии P. mirabilis 3177 бурого
цвета с темным центром диаметром
2 ,0 -4 ,0 мм, P. vulgaris H X 19 222 -
бесцветные диаметром 2 ,0 -4 ,0 мм).
Рост контрольных тест штаммов
Рис. 32. Р о с т тест-штаммов на SS-arap на S S -агаре представлен на рис. 32.
производства ФБУН ГНЦ ПМБ:
Проведена сравнительная оценка
3912/41 (055:K 59); b - S. paratyphi A-225;
с - микробная смесь S. typhi H -901 Г Д Р / дифференциально-диагностических
/Г И С К с E. coli 3912 /4 1 (055:K 59). сред сальмонелла-шигелла-агара

136
различных зарубежных производителей, разрешенных к применению в
Российской Федерации, с отечественным S S -агаром по основным биохи­
мическим и биологическим показателям, характеризующим их качество.
В качестве сред сравнения использовались: SS-агар (Pronadisa); S S -агар
(HiMedia); S S -агар (Merck) и питательная среда для выделения шигелл и
сальмонелл (S S -агар) производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ. В качестве неингиби­
торной среды для контроля роста тест-штаммов использовали ГРМ-агар.
Подготовку вышеуказанных питательных сред к исследованиям производи­
ли в соответствии с инструкцией по приготовлению каждого из препаратов.
Сравнительную оценку качества препаратов проводили по основным
физико-химическим и биологическим показателям.
В качестве основных биохимических характеристик питательных сред
определяли рН среды, содержание аминного азота, хлоридов, прочность
студня среды и потерю в массе при высушивании.
Результаты проведенных исследований селективных дифференциально­
диагностических питательных сред для выделения и идентификации
энтеробактерий различных фирм-изготовителей сравнимы по физико­
химическим показателям:
• уровень рН питательных сред имеет значения от 6,9 до 7,4, что обес­
печивает нейтральные или слабощелочные условия, благоприятные для
роста большинства микроорганизмов;
• содержание аминного азота как одного из основных показателей пита­
тельных сред, необходимого для удовлетворения потребностей микроор­
ганизмов в азотистом питании, идентично для всех фирм-изготовителей и
составляет 1,6—2,1%;
• содержание хлоридов в питательных средах является показателем со­
ответствия уровня осмотического давления, необходимого для сохране­
ния жизнедеятельности микроорганизмов, и составляет 1,2—1,8% в им­
портных средах и от 7,0 до 14,0% в отечественных средах;
• потеря в массе при высушивании для всех испытуемых образцов не
превышает 4,0%, что обеспечивает стабильность физического состояния
сред на протяжении всего срока годности.
Биологические показатели изучали по чувствительности, стабильности
основных биологических свойств микроорганизмов, дифференцирующим
и ингибирующим свойствам питательных сред (табл. 35).
Для проведения биологического контроля чашки Петри с испытуемы­
ми и контрольными средами засевали 0,1 мл микробной взвеси каждого
из тест-штаммов для определения показателей чувствительности и инги-
биции и 0,1 мл смеси лактозоположительных тест-штаммов E. coli с лакто­
зоотрицательными тест-штаммами сальмонелл и шигелл (в соотноше­
нии 1:1) для определения дифференцирующих свойств питательных сред.

137
Таблица 35. Биологические показатели SS-agar различных фирм-изготовителей
Тест-штаммы HiMedia Merck Pronadisa гнц пмб
(разведение iO-6) диаметрколоний(мм), морфология
S. flexneri 1 a 8516 1,2-1,5 1,4-1,6 0,8-1,0 1,6-1,8
SR-форма Круглые, Круглые, Круглые,
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
S. sonnei «S-form» 1,2-1,4 1,2-1,6 1,2-1,6 2,0-2,2
Круглые, Круглые, Круглые, Круглые,
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
S. paratyphi A-225 1,4-1,6 Нет роста 1,0-1,2 1,5-1,8
SR-форма Круглые, Круглые,
бесцветные бесцветные бесцветные
S. typhi H-901 1,2-1,4 1,2-1,4 1,2-1,4 1,5-2,0
ГДР/ГИСК SR-форма Круглые, Круглые, Круглые,
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
S. typhmurium 79 1,4-2,0 1,6-2,0 1,6-2,0 1,8-2,2
Круглые, Круглые, Круглые, Круглые,
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
с темным центром с темным центром с темным центром с темным центром
S. enteritidis 11272 1,6-2,0 1,8-2,0 1,0-2,0 2,0-2,5
Круглые, Круглые, Круглые, Круглые,
бесцветные бесцветные бесцветные бесцветные
с темным центром с темным центром с темным центром с темным центром
B. cereus 8035 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
E. coli 055 3912/41 2,0-2,3 1,5-1,8 2,0-2,2 2,0-2,5
Круглые, Круглые, Круглые, Круглые,
коричневато­ малиновые малиновые малиновые
красные
E. coli 0111 168/59 1,2-1,5 Нет роста Нет роста Нет роста
Круглые,
коричневато­
красные
E. coli ATCC 25922 1,8-2,0 Нет роста Нет роста Нет роста
Круглые,
коричневато­
красные
E. aerogenes 10006 1,8-2,0 1,8-2,0 0,6-1,0 2,0-2,4
Круглые, розовые Круглые, розовые Круглые, розовые Круглые, розовые
E. faecalis 775 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
K. pneumoniae 418 1,8-2,0 2,0-2,2 2,0-2,5 3,0-3,5
Круглые, Круглые, Круглые, Круглые,
слизистые, слизистые, слизистые, слизистые,
розовые розовые розовые розовые
P. mirabilis 3177 2,0-2,5 2,0-2,5 0,8-1,0 2,5-3,0
Круглые, Круглые, Круглые, Круглые,
бесцветные с бесцветные бесцветные бесцветные
темным центром с темным центром с темным центром
P. vulgaris HX 19 222 1,0-1,8 1,2-1,8 0,8-1,0 2,0-3,0
Круглые, Круглые, Круглые, Очаговое роение
бесцветные. бесцветные. бесцветные.
Единичное роение Роения нет Роения нет
S. aureus Wood-46 Нет роста Нет роста Нет роста Нет роста
S. flexneri 1 a 8516 Нет Дифференциация Дифференциация. Дифференциация
10-6 + E. coli 055 дифференциации E. coli с зоной
3912/4110-5 преципитации

138
Таблица 35. Окончание
Тест-штаммы HiMedia Merck Pronadisa гнц пмб
(разведение 10-6) диаметрколоний(мм), морфология
S. sonnei «S-form» Нет Дифференциация Дифференциация. Дифференциация
10-6 + E. coli 055 дифференциации E. coli с зоной
3912/4110-5 преципитации
S. typhi H-901 Нет Дифференциация Дифференциация. Дифференциация
ГДР/ГИСК 10-6 + дифференциации E. coli с зоной
E. coli 055 3912/41 преципитации
10-5
S. paratyphi A-225 Нет Дифференциация. Дифференциация. Дифференциация
10-6 + E. coli 055 дифференциации Единичные колонии E. coli с зоной
3912/41 10-5 S. paratyphi преципитации

Через 1 8 -2 0 ч инкубации посевов при температуре (37 ± 1)°С визуально


учитывали наличие, характер роста и дифференциацию выросших коло­
ний. Определяли ингибирующие свойства сред.
Результаты биологического контроля S S -агара различных производи­
телей показали высокую высокую чувствительность данной среды в от­
ношении энтеробактерий.
S S -агар отечественного производства обладал хорошими ростовыми
свойствами и обеспечивал рост всех тест-штаммов без изменения их мор­
фологических признаков. На S S -агаре отечественного производства, в от­
личие от импортных аналогов, колонии тест-культур по истечении срока
инкубации посевов имели больший диаметр колоний. На среде не выявле­
но ингибирующего эффекта в отношении энтеробактерий.
Отмечено, что на всех испытуемых средах тест-штаммы микроорганиз­
мов, способных продуцировать сероводород из тиосульфата натрия, об­
разовывали колонии с темным центром.
Положительным фактором является отсутствие роения P. vulgaris HX
19 222 на средах фирм Merck и Pronadisa, тогда как на S S -агаре ГНЦ ПМБ
наблюдалось очаговое роение данного тест-штамма, а на S S -агаре фирмы
HiMedia - роение отдельных колоний.
Таким образом, исходя из результатов проведенных исследований, был
сделан вывод о возможности широкого использования исследуемых пита­
тельных сред для селективного выделения энтеробактерий в клинической
и санитарной микробиологии.

6 .3 .8 . П и тательн ая среда д л я в ы д е л ен и я иерсиний

Иерсиниозы широко распространены в мире. В ряде стран Европы ки­


шечный иерсиниоз занимает третье место по заболеваемости среди ки­
шечных инфекций после кампилобактериоза и сальмонеллеза. Заболе­
ваемость псевдотуберкулезом в Российской Федерации регистрируется

139
практически повсеместно, преимущественно в виде вспышек, кишечным
иерсиниозом - в виде спорадических случаев [60, 66, 161].
Схема микробиологического выделения иерсиний, принятая в настоя­
щее время, состоит из последовательных этапов: обогащения, первичного
посева на плотные дифференциально-диагностические среды (С Б Т С ,
Эндо) или другие коммерческие дифференциальные среды для диагно­
стики иерсиниозов, разрешенные к применению на территории Российской
Федерации (среда Мак-Конки и др.), вторичный отсев с твердых пита­
тельных сред на пробирки с одной из дифференциальных сред, содержа­
щих мочевину, в виде скошенного столбика (Клиглера, Олькеницкого и
др.). Выделенные культуры используются для дальнейшей идентифика­
ции на биохимических тестах и серологического типирования.
Иностранные компании выпускают среду Yersinia Selective Agar Base
(Основа селективного агара для иерсиний), созданную по прописи агара
CIN Schiemann [162]. Schiemann модифицировал первоначальную пропись
агара CIN, заменив в ней смесь желчных кислот на дезоксихолат натрия.
Эта среда рекомендуется для селективного выделения из клинического ма­
териала и пищевых продуктов Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis , Y. pestis
на основе пептона 20,0 г/л с добавлением дрожжевого экстракта 2,0 г/л,
маннита 20,0 г/л, натрия пирувата 2,0 г/л, натрия хлорида 1,0 г/л, натрия
дезоксихолата 0,5 г/л, нейтрального красного 0,03 г/л, кристаллического
фиолетового 0,001 г/л.
На среде можно отличить бактерии по признаку ферментации маннита.
Ее селективные свойства связаны с присутствием дезоксихолата натрия и
кристаллического фиолетового, которые подавляют рост грамположи-
тельных и многих грамотрицательных микроорганизмов. Добавление ан­
тибиотиков делает ее высокоселективной в отношении иерсиний. Селек­
тивная добавка состоит из лиофилизированной смеси трех разных инги­
биторов, подавляющих рост сопутствующей флоры, встречающейся при
культивировании иерсиний, в частности, Y. enterocolitica: цефсулодин
7,5 мг; иргасан 2,0 мг; новобиоцин 1,2 мг [148].
Ф Б У Н ГНЦ ПМБ выпускается сухая питательная среда для выделения
возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза под названием
Иерсиния-агар [27]. Это среда предназначена для бактериологических ис­
следований в санитарной и клинической микробиологии с целью выделе­
ния возбудителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза при диа­
гностике инфекционных заболеваний.
Состав Иерсиния-агара, г/л:
ПГРМ 23,5
Желчь очищенная 4,0
Натрия хлорид 3,0

140
Глюкоза 10,0
Мочевина 5,0
Бромтимоловый синий 0,128

со
Натрий углекислый

о
Бриллиантовый зеленый 66 X 10-5
Агар микробиологический 10,0 ± 3,0
рН от 7,5 до 7,9
Приготовление среды: сухую среду в количестве, необходимом для при­
готовления конкретной серии питательной среды, размешивают в 1 л дис­
тиллированной воды, нагревают до кипения и кипятят 5 мин на медлен­
ном огне. Затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и вновь кипя­
тят 1 -2 мин. Охлаждают до 4 5 -50°С и разливают в чашки Петри. Разлитая
в чашки Петри среда прозрачная, сине-зеленого цвета: может быть ис­
пользована в течение 2 сут при температуре хранения 2-8°С .
С п е ц и ф и ч е с к а я а к т и в н о с т ь . Иерсиния-агар обеспечивает рост тест­
штаммов Y. enterocolitica 287-II, Y. pseudotuberculosis III на всех засеянных
чашках Петри при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10-7
за время культивирования от 24 до 48 ч при температуре (28 ± 1)°С соот­
ветствующей морфологии (рис. 33).
Д и ф ф е р е н ц и р у ю щ и е с в о й с т в а с р е д ы . Питательная среда обеспечива­
ет четкую дифференциацию тест-штаммов Y. enterocolitica 287-II и
Y. pseudotuberculosis III от тест-штаммов E. coli 3912/41 (055:K 59) и S.
flexneri 1а 8516 на всех засеянных чашках Петри при посеве по 0,1 мл
смеси тест-штамма Y. enterocolitica 287-II с E. coli 3912/41 (055:K 59), Y.
enterocolitica 287-II с S. flexneri 1а 8516, Y. pseudotuberculosis III с E. coli
3912/41 (055:K 59), Y. pseudotuberculosis III с S. flexneri 1а 8516 через 48 ч
инкубации при температуре (28 ± 1)°С.
При визуальном просмотре чашек колонии указанных штаммов выгля­
дят следующим образом:
Y. enterocolitica 287-II - круглые, гладкие, блестящие, сине-зеленые, диа­
метром не менее 1,5 мм;
Y. pseudotuberculosis III - матовые, шероховатые, зеленовато-синие,
с фестончатым краем и темным, выпуклым центром, диаметром не
менее 1,0 мм;
E. coli 3912/41 (055:K 59) - ярко-желтые, сочные, круглые, выпуклые,
диаметром не менее 2,0 мм;
S. flexneri 1а 8516 - желтые, плоские, диаметром не менее 1,0 мм.
И н г и б и р у ю щ и е с в о й с т в а с р е д ы . Иерсиния-агар полностью подавляет
рост тест-штамма S. aureus Wood-46 на всех засеянных чашках Петри при
посеве 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10-2 через 48 ч культивиро­
вания при температуре (28 ± 1)°С.

141
Рис. 33. Р о с т тест-штаммов на Иерсиния-агаре: а - Y. enterocolitica 287-II; b - Y. p seu d o ­
tuberculosis III; с - E. coli 3 9 1 2 /4 1 (055:K 59); d - микробная смесь Y. pseudotuberculosis III
с E. coli 3 9 12/41 (055:K 59).

Результаты биологического контроля Иерсиния-агара на наборе тест­


штаммов представлены в табл. 36.
Иерсиния-агар широко используется в бактериологической диагности­
ке и позволяет одновременно выделять штаммы как Y.enterocolitica, так и
Y. pseudotuberculosis. Кроме того, питательная среда для выделения возбу­
дителей кишечного иерсиниоза и псевдотуберкулеза обладает выражен­
ными селективными свойствами по отношению к отдельным видам ми­
кроорганизмов.

6 .3 .9 . Л актозн ы й Т Т Х агар с терги то ло м 7

До недавнего времени в России не было коммерческой сухой питательной


среды для обнаружения и учета E. coli и колиформных бактерий с тергито­
лом 7. Государственный стандарт ГОСТ 31955-2013 (ИСО 9308-1:2000) [18]

142
Таблица 36. Результаты биологического контроля Иерсиния-агара на наборе
тест-штаммов.
№ Тест-штаммы Разведение Морфологияколоний, диаметр
п/ п
1. Y. enterocolitica 287-II 10-7 Круглые, гладкие, блестящие, сине-зеленые,
диаметром 1,5-2,5 мм
2. Y. pseudotuberculosis III 10-7 Матовые, шероховатые, зеленовато-синие,
с фестончатым краем и темным, выпуклым центром,
диаметром 1,0-2,5 мм
3. E. coli 3912/41 (055:K59) 10-7 Ярко-желтые, сочные, круглые, выпуклые,
диаметром 2,0-3,0 мм
4. S. flexneri 1а 8516 10-7 Желтые, плоские, диаметром 1,0-1,8 мм
5. P. aeruginosa 27/99 10-7 Круглые, гладкие, сине-зеленого цвета
диаметром 1,0-1,8 мм
6. P. mirabilis Сиднеев 10-7 Круглые, гладкие, желтоватого цвета
с синеватым центром, диаметром 2,0-2,5 мм
7. K. pneumoniae 3534/51 10-7 Крупные, слизистые, желто-оранжевого цвета
диаметром 3,0-3,5 мм
8. S. aureus Wood-46 10-2 Рост отсутствует
9. S. faecalis 775 10-2 Рост отсутствует

регламентирует для обнаружения и количественного учета E. coli и коли-


формных бактерий использование лактозного Т Т Х агара с гептадецилсуль-
фатом натрия (среда с тергитолом 7) - лабораторного приготовления.
Недостатком среды лабораторного приготовления является сложность
в приготовлении, включающая раздельную подготовку базовой среды,
растворов гептадецилсульфата натрия и Т Т х с последующей раздельной
стерилизацией и приготовление среды полного состава с соблюдением
правил асептики, нестандартность.
В состав базовой среды входит лактоза 20,0 г/л, пептон 10,0 г/л, дрож­
жевой экстракт 6,0 г/л, мясной экстракт 5,0 г/л, бромтимоловый синий
0,05 г/л, агар 15,0-20,0 г/л. Раствор гептадецилсульфата натрия: тергитол
7 - 0,2 г на 100 мл дистиллированной воды, раствор 2, 3, 5-трифенилтетра-
золиум хлорида: Т Т Х - 0,05 г на 100 мл дистиллированной воды.
Трудность приготовления заключается в отдельной стерилизации осно­
вы и раствора тергитола 7 автоклавированием, а раствора ТТх-методом
мембранной фильтрации с последующим соединением растворов в асеп­
тических условиях. Т Т Х при повышенных температурах разрушается, что
приводит к отсутствию дифференциации в отношении лактозоотрица­
тельных, но восстанавливающих Т Т Х бактерий.
Среда полного состава: базовая среда - 100 мл; раствор гептадецилсуль­
фата - 5 мл; раствор Т Т Х - 5 мл. Полученную среду хранят в защищенном
от света месте при температуре (5 ± 3)°C не более 10 сут.
Гидролиз лактозы до кислоты лактозоположительными бактериями
регистрируется индикатором бромтимоловым синим, изменяющим цвет

143
среды от зеленого до желтого. Селективность среды обеспечивается гепта-
децилсульфатом натрия (Тергитол-7) и 2,3,5-трифенилтетразолий хлори­
дом ( Т Т х ), подавляющими большинство грамположительных бактерий.
Т Т х играет роль и дифференцирующего вещества. Восстанавливаемый
лактозоотрицательными бактериями Т Т х окрашивает колонии в красно­
коричневый цвет. Лактозоположительные колиформные бактерии и E. coli
не восстанавливают Т Т х , поэтому их колонии желто-оранжевого цвета.
В качестве зарубежных аналогов выпускается Lactose T TC Agar with
Tergitol-7 - селективная дифференциальная среда для выявления и учета
Е. coli и колиформных бактерий в воде методом мембранных фильтров
с добавкой Т Т Х (0,025), следующего состава, г/л:
Лактоза 20,0
Пептон 10,0
Дрожжевой экстракт 6,0
Мясной экстракт 5,0
Бромтимоловый синий 0,05
Тергитол-7 0,1
Агар-агар 12,7
Среду автоклавируют 15 мин при 121°С, охлаждают до 45-50°С и добавля­
ют 5 мл 0,05% водного раствора Т Т Х (раствор Т Т Х стерилизуется фильтро­
ванием через мембрану 0,2 мкм) из расчета на 100 мл основной среды [82].
При разработке Лактозного Т Т Х агара с тергитолом 7 производства
Ф Б У Н ГНЦ ПМБ [100] была отработана технология высушивания пан­
креатического гидролизата рыбной муки с тергитолом 7 с сохранением всех
биологических свойств питательной среды. В состав питательной среды был
дополнительно внесен додецилсульфат натрия (SD S) с целью улучшения
ингибиторных свойств среды. Доказана возможность замены импортных
пептонов на панкреатический гидролизат рыбной муки с тергитолом 7, вы­
пускаемый в ГНЦ ПМБ. Модифицирован способ приготовления среды.
Питательная среда вместе с Т Т Х и тергитолом 7 стерилизуется кипячением.
Состав агара для обнаружения и учета E. coli и колиформных бактерий
(Лактозный Т Т Х агар с тергитолом 7) г/л:
ПГРМ с тергитолом 7 6,1
Дрожжевой экстракт 5,0
Лактоза 10,0
Бромтимоловый синий 0,08
Натрий додецилсульфат 0,1
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид 0,025
Натрий углекислый 0,15 ± 0,1
Агар бактериологический 11,0 ± 3,0
рН от 7,0 до 7,4

144
Приготовление среды: Лактозный Т Т Х агар с тергитолом 7 в количе­
стве, необходимом для приготовления конкретной серии питательной
среды, указанном на этикетке, размешивают в 1 л дистиллированной
воды, нагревают до кипения и кипятят при постоянном перемешивании
в течение 3 - 4 мин на медленном огне до полного расплавления агара.
Охлаждают до температуры 40-45°С , разливают в стерильные чашки
Петри и оставляют для застывания. Перед посевом чашки со средой под­
сушивают. Автоклавирование не требуется.
Готовая среда в чашках прозрачная, зеленого цвета.
Контроль специфической активности питательной среды допускается
осуществлять в течение 14 сут после ее приготовления при условии хране­
ния при температуре 2-8°С .
С п е ц и ф и ч е с к а я а к т и в н о с т ь . Питательная среда обеспечивает визуаль­
но обнаруживаемый рост E. coli 3912/41(055:К 59), E. coli АТСС 25922,
K. pneumoniae 418, S. sonnei «S-form», S. typhimurium 79 при посеве 0,1 мл
микробной взвеси каждого тест-штамма из разведения 10-6 . Через 2 0 -2 4 ч
инкубации посевов при температуре (37 ± 1)°С визуально учитывают на­
личие и характер роста.
Колонии E. coli 3912/41(055:К 59), E. coli АТСС 25922 - круглые, слизи­
стые, желто-оранжевого цвета с желтой зоной, диаметром 2 ,0 -3 ,0 мм.
Колонии K. pneumoniae 418 - круглые, слизистые, оранжевого цвета,
диаметром 2 ,5 -4 ,0 мм.
Колонии S. sonnei «S-form» - круглые, красно-коричневого цвета
с синей зоной, диаметром 1,5-2,5 мм.
Колонии S. typhimurium 79 - красно-коричневого цвета с неровным
краем и с синей зоной, диаметром 2 ,0-3,5 мм.
Д и ф ф е р е н ц и р у ю щ и е с в о й с т в а . Питательная среда обеспечивает чет­
кую дифференциацию S. typhimurium 79 от E. coli 3912/41 (О 55:К 59) при
посеве 0,1 мл микробной смеси из разведений 10-6 тест-штаммов через
2 0 -2 4 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С.
И н г и б и р у ю щ и е с в о й с т в а . Питательная среда полностью подавля­
ет рост тест-штамма S. aureus W ood-46 при посеве 0,1 мл микробной
взвеси из разведения 10-3 через 2 0 -2 4 ч инкубации при температуре
(37 ± 1)°С.
Биологические показатели питательной среды на широком наборе тест­
штаммов представлены табл. 37. В качестве среды сравнения использова­
ли питательную среду фирмы Merck (Германия).
Дифференцирующие свойства сред основаны:
• на изменении рН в кислую сторону при росте лактозоферментирую­
щих бактерий, которые образуют на среде колонии желтого или желто­
оранжевого цвета с желтой зоной вокруг колоний;

145
Таблица 37. Сравнительная характеристика расширенного набора тест-штаммов
микроорганизмов на Лактозном ТТХ-агаре с тергитолом 7 и среде сравнения
№ Тест-штаммы Лактозныйагар ЛактозныйТТХ Контрольроста
п/ п Разведение с тергитолом-7 агарс тергитолом7 на среде №1 ГРМ
импортиого отечественного
производства производства
1. E. coli О55:К59 3912/41 1,5-1,8 2,0-3,0 2,5-3,0
10-6 Круглые, гладкие, Круглые, гладкие, Круглые, гладкие,
блестящие, блестящие, бесцветные
желто-оранжевого желто-оранжевого
цвета со сл. желтой цвета с желтой
зоной вокруг зоной вокруг
колоний колоний
2. E. coli 25922 1,6-1,8 1,5-1,8 3,0-3,2
10-6 Круглые, гладкие, Круглые, гладкие, Круглые, гладкие,
блестящие, желто­ блестящие, желто­ бесцветные
оранжевого цвета оранжевого цвета
3. E. coli Ewing (0124К 72) 227 1,6-2,0 3,0-3,5 3,0-4,0
10-6 Круглые, гладкие, Круглые, Круглые, гладкие,
блестящие, шероховатые, бесцветные
кирпичного цвета матовые, светло­
со сл. синей зоной коричневого цвета
вокруг колоний со сл. синей зоной
вокруг колоний
4. K. pneumoniae 418 1,2-1,6-1,8 2,5-3,5 3,0-4,0
10-6 Круглые, гладкие, Круглые, гладкие, Круглые, гладкие,
блестящие, желто­ блестящие, бесцветные
коричневого цвета оранжевого цвета
5. B. cereus 8035 Нет роста Нет роста 2,0-5,0
10-4 Плоские, матовые,
с волнистыми краями
6. C. freundii 101/57 1,5 2,0-3,0 2,0-3,0
10-6 Круглые, желто­ Круглые, гладкие, Круглые, гладкие,
оранжевые с желтой блестящие, оранжевые бесцветные
короной вокруг с желтой зоной вокруг
колоний колоний
7. S. sonnei «S-form» 0,8-1,4 1,6-2,2 1,5-2,2
10-6 Круглые, гладкие, Круглые, гладкие, Круглые, гладкие,
блестящие, красно­ блестящие, красно­ бесцветные
коричневого цвета коричневого цвета
со сл. синей зоной с синей зоной вокруг
вокруг колоний колоний
8. S. flexneri 1 a 8516 Нет роста 0,8-1,5 1,6-1,8
10-6 Круглые, гладкие, Круглые, гладкие,
коричневатого цвета бесцветные
9. S. enteritidis 11272 1,0-1,8 2,5-4,5 2,5-3,5
10-6 Круглые, гладкие, Круглые, гладкие, Круглые, гладкие,
блестящие, красно­ блестящие, красно­ бесцветные
коричневого цвета коричневого цвета с
с синей зоной вокруг синей зоной вокруг
колоний колоний
10. S. typhimurium 79 1,4-1,8 2,0-2,3 2,5-3,5
10-6 Круглые, гладкие, Круглые, гладкие, Круглые, гладкие,
блестящие, красно­ блестящие, красно­ бесцветные
коричневого цвета коричневого цвета
с синей зоной вокруг с синей зоной вокруг
колоний колоний

146
Таблица 37. Окончание
№ Тест-штаммы Лактозныйагар ЛактозныйТТХ Контрольроста
п/ п Разведение стергитолом-7 агарстергитолом на среде №1 ГРМ
импортного 7 отечественного
производства производства
11. L. monocytogenes 766 Нет роста Нет роста 0,3-0,5
10-6 Круглые, гладкие,
бесцветные
12. S. marcescens 1 Нет роста до 0,5 1,0-1,2
10-6 Круглые, гладкие,
цвета среды
13. P. aeruginosa 27/99 0,8-1,0 1,2-1,5 1,8-2,2
10-6 Круглые, гладкие, Круглые, гладкие, Круглые, гладкие,
блестящие, темно­ блестящие, бесцветные
коричневого цвета кирпичного цвета
с синей зоной вокруг с синей зоной вокруг
колоний колоний
14. P. mirabilis 3177 Нет роста 0,8-1,2 Сплошное роение
10-6 Круглые, гладкие,
блестящие, светло­
коричневого цвета
15. E. faecalis 775 10-1 Нет роста Нет роста Сплошной рост
16. S. saprophyticus ССМ883 Нет роста Нет роста Сплошной рост
10-1
17. S. aureus 209 - Р 10-1 Нет роста Нет роста Сплошной рост

• на восстановлении Т Т Х лактозоотрицательными бактериями, кото­


рые окрашиваются в красно-коричневый цвет.
Селективность среды обеспечивает гептадецилсульфат натрия и
2,3,5-трифенилтетразолия хлорид ( Т Т х ), подавляющие рост большин­
ства грамположительных бактерий.
Рост некоторых тест-штаммов на Лактозном Т Т х агаре с тергитолом 7
представлен на рис. 34.
Оценка эффективности диагностических и ингибирующих свойств
среды, предназначенной для обнаружения и учета E. coli и колиформ-
ных бактерий, проводилась в Испытательном лабораторном центре П чС
в М С ч №164. В качестве контрольной среды использовали питательную
среду Lactose T TC agar with Tergitol 7 (M erck). Посев материала осущест­
влялся с соблюдением условия равнозначности. Посевы инкубировались
при температуре 37°С в течение 2 0 -2 4 ч.
В ходе выполнения работ было исследовано более 100 образцов клини­
ческого материала и пищевых продуктов. Работа одновременно проводи­
лась на общепринятых питательных средах, используемых для контроля
клинического материала в баклабораториях.
По результатам испытаний Лактозного Т Т Х агара с тергитолом 7 было
отмечено, что при посеве исследуемых образцов на среды отмечался рост
бактерий типичной морфологии, что было подтверждено соответствую-

147
Рис. 34. Р о с т тест-штаммов на Лактозном ТТХ агаре с тергитолом 7: а - K .pneum oniae 418;
b - S. typhimurium 79; с - E. coli 3 9 1 2 /4 1 (0 5 5 :К 5 9 ); d - микробная смесь тест-штаммов: E. coli
3 9 1 2 /4 1 (0 5 5 :К 5 9 ) с S. typhimurium 79.

щими методами и тест-системами. Питательная среда позволяет прово­


дить предварительную дифференциацию колиформ от кишечных патоге­
нов. Выявляемость кишечных патогенов на Лактозном Т Т х агаре с терги­
толом 7 и на контрольной среде составляла 99,9%.

6 .3 .1 0 . А г а р М а к К о н к и

Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения


(В О З ), в бактериологических лабораториях для работы с энтеробактерия­
ми рекомендован ряд сред, в том числе и агар МакКонки, а также их мно­
гочисленные модификации. Данные среды обладают как селективными,
так и диагностическими свойствами.
Фармакопеей США (U SP X X III 1995) и Европейской фармакопеей
(Е Р II) для непосредственного посева проб воды с целью обнаружения,
выделения и подсчета колиформных микроорганизмов и кишечных пато­
генов рекомендован агар МакКонки. Эти среды могут быть также исполь­

148
зованы для обнаружения и выделения энтеропатогенов в фекалиях, моче,
пищевых продуктах и других объектах [4].
Агар МакКонки выпускаются ведущими зарубежными производителя­
ми питательных сред в нескольких модификациях. Питательной основой
данных сред служат: пептон мясной, панкреатические гидролизаты казеи­
на и желатина либо комбинации смеси этих основ. Кроме основы, в среды
входят также: лактоза, желчные соли, натрия хлорид, нейтральный крас­
ный, кристаллический фиолетовый, агар [148, 154, 167, 168].
Основным различием в вариациях состава агара МакКонки является
наличие (либо отсутствие) в среде кристаллического фиолетового и кон­
центрация желчи бактериологической (солей желчных кислот). Присутст­
вие в среде кристаллического фиолетового в комбинации с высоким со­
держанием желчи в значительной степени подавляет рост грамположи-
тельных микроорганизмов и является определяющим фактором в назна­
чении данной среды не только для обнаружения, но и для выделения и
подсчета колиформных бактерий.
В компонентном составе бульона МакКонки-ГРМ присутствует желчь
крупного рогатого скота очищенная сухая (Ж О Г). В связи с различной
ингибиторной способностью желчи в состав среды введен разброс по со­
держанию этого компонента (5 ,0 -7 ,0 г/л ), что обеспечивает значительную
селективность и улучшенную дифференциацию ферментирующих лакто­
зу колиформных микроорганизмов. В качестве белковой основы исполь­
зуются ПГРМ и пептон ферментативный.
Дифференцирующие свойства среды основаны на изменении рН в кис­
лую сторону при росте лактозоферментирующих бактерий, которые об­
разуют на агаре МакКонки колонии от розового до красного цвета за счет
индикатора нейтрального красного.
Ингибирующие вещества (желчные соли, кристаллический фиолето­
вый), входящие в состав среды, значительно подавляют рост грамположи-
тельной микрофлоры.
Состав агара МакКонки-ГРМ, г/л:
ПГРМ 10,0
Пептон сухой ферментативный 10,0
Дрожжевой экстракт 1,0
Лактоза 10,0
Натрий хлористый 5,0
Желчь крупного рогатого скота очищенная сухая 5 ,0-7,0
Кристаллический фиолетовый 0,001
Нейтральный красный 0,05
Агар микробиологический 11,0 ± 3,0
рН от 7,0 до 7,4

149
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на эти­
кетке для приготовления конкретной серии питательной среды, тща­
тельно размешивают в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение
3 мин, стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в тече­
ние 15 мин. Охлаждают до температуры 4 0 -4 5 °С , разливают в стериль­
ные чашки Петри. Готовая среда в чашках прозрачная, коричневато­
красного цвета. Готовую среду, разлитую в чашки Петри, можно исполь­
зовать в течение 10 сут при температуре хранения 2 -8 °С и в течение
2 сут при температуре хранения 1 8 -25°С (хранить чашки следует в тем­
ном месте).
С п е ц и ф и ч е с к а я а к т и в н о с т ь . Питательная среда обеспечивает на всех
засеянных чашках Петри через 1 8 -2 0 ч инкубации при температуре
(37 ± 1)°С рост тест-штаммов E. coli 3912/41 (О 55:К 59), E. coli АТСС
25922, S. flexneri 1a 8516, S. typhimurium 79, P. mirabilis 3177, E. faecalis 775
при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из разведе­
ния 10-6.
Колонии E. coli 3912/41 (О 55:К 59), E. coli АТСС 25922 - гладкие, кру­
глые, не слизистые, от розового до красного цвета, диаметром 1,5-3,5 мм.
Колонии S. flexneri 1a 8516 - прозрачные, гладкие, круглые, блестящие,
бесцветные или бледно-розового цвета, диаметром 1,0—2,0 мм.
Колонии S. typhimurium 79 - круглые, гладкие, бесцветные, диаметром
1,5-3,0 мм.
Колонии P. mirabilis 3177 - круглые, гладкие, блестящие, бесцветные,
диаметром 2 ,0 -4 ,0 мм. Роение подавлено.
Колонии E. faecalis 775 - мелкие, розово-красного цвета, диаметром
до 1,0 мм.
Д и ф ф е р е н ц и р у ю щ и е с в о й с т в а . Питательная среда обеспечивает
четкую дифференциацию S. typhimurium 79 от E. coli 39 1 2 /4 1 (О 55:К 59)
на всех засеянных чашках Петри при посеве по 0,1 мл микробной взве ­
си смеси тест-штаммов через 1 8 -2 0 ч инкубации при температуре
(37 ± 1)° С.
И н г и б и р у ю щ и е с в о й с т в а . Питательная среда подавляет рост тест­
штамма S. aureus 209 Р на всех засеянных чашках Петри при посеве
по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10-5 через 1 8 -2 0 ч инкубации
при температуре (37 ± 1)°С. Допускается наличие роста в виде отдельных
точечных колоний.
Рост тест-штаммов на агаре МакКонки-ГРМ представлен на рис. 35.
Были проведены сравнительные испытания агаров МакКонки про­
изводства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ и HiMedia (Индия) и по биологическим
свойствам. Результаты ростовых свойств агаров МакКонки представлены
в табл. 38.

150
Рис. 35. Р о с т тест-штаммов на агаре МакКонки-ГРМ: а - E. coli АТСС 25922; b - S. typhi-
murium 79; с - S. flex n eri la 8516; d - микробная смесь: S. typhimurium 79 с E. coli 3 9 12/41
(О 55:К 59).

Таблица 38. Сравнительные биологические показатели агаров МакКонки


№п/п Тест-штаммы(разведения) АгарМакКонки-ГРМ АгарМакКонки
диаметриморфологияколоний
1. S. flexneri 1a 8516 0,8-1,2 1,0
10-6 прозрачные, гладкие, круглые, прозрачные, гладкие, круглые,
блестящие, бесцветные или блестящие, бесцветные или
бледно-розового цвета бледно-розового цвета
2. S. typhi H-901 ГДР/ГИСК 1,0-1,2 1,0-1,2
10-6 круглые, бесцветные круглые, бесцветные
3. S. paratyphi A-225 1,2-1,6 1,2-1,6
10-6 круглые, бесцветные круглые, бесцветные
4. S. enteritidis 11276 1,0-1,5 1,6-2,0
10-6 круглые, бесцветные круглые, бесцветные
5. E. coli 3941/12 (055:K59) 1,6-1,8 1,4-2,0
10-6 гладкие, круглые, гладкие, круглые,
не слизистые, красного цвета не слизистые, красного цвета
6. E. coli 168/59 (О111:К58) 1,6-2,0 1,5-2,0
10-6 гладкие, круглые, гладкие, круглые,
не слизистые, красного цвета не слизистые, красного цвета

151
Таблица 38. Окончание
№п/ п Тест-штаммы(разведения) АгарМакКонки-ГРМ АгарМакКонки
диаметриморфологияколоний
7. K. pneumoniae 3534/51 2,0-3,0 2,0-2,5
10-6 круглые, слизистые, розовые круглые, слизистые, розовые
8. E. aerogenes 10006 1,5-2,0 1,5-2,0
10-6 круглые, бесцветные круглые, бесцветные
9. E. faecalis 775 до 0,5 до 0,5
10-6 круглые, розово-красные круглые, розово-красные
10. P. mirabilis 3177 2,0-4,0 2,0-4,0
10-6 круглые, гладкие, круглые, гладкие,
бесцветные, роение бесцветные, роение
подавлено подавлено
11. S. typhimurium 79 1,5-2,0 1,5-2,0
10-6 круглые, гладкие, бесцветные круглые, гладкие, бесцветные
12. S. aureus 209 Р рост подавлен рост подавлен
10-5
Диф. S. typhimurium 79 и четкая дифференциация четкая дифференциация
свойства E. coli 3912/41 (О55:К59) 10-6

Из таблицы видно, что агары МакКонки обеспечивают рост кишечных


патогенов и дифференциацию E. coli. Рост грамположительных микроор­
ганизмов подавлен.
Клинические испытания среды МакКонки-ГРМ были проведены на
базе Ф Б У З «Центр гигиены и эпидемиологии в Ставропольском крае».
Исследовано 978 образцов клинического материала. В процессе выполне­
ния работ определялась возможность обнаружения и выделения патоген­
ных и условно-патогенных энтеробактерий из клинического материала
(испражнения, моча и т.д.) на предоставленных для испытаний средах
МакКонки.
В результате полученных исследований на агаре МакКонки-ГРМ, а так­
же на контрольных средах (агар Плоскирева и агар МакКонки других про­
изводителей) из клинических образцов были выделено одинаковое коли­
чество шигелл (S. flexneri 3а, S. flexneri VI, S. flexneri 2в, S. sonnei III d,
S. sonnei II g), сальмонелл (S. typhimurium А-1, S. infantis, S. typhimu-
rium В-4, S. enteritidis), протеев (P. mirabilis, P. vulgaris, P. rettgeri), цитро-
бактеров (C. freundii, C. diversus), клебсиелл (K. oxytoca, K. pneumoniae),
псевдомонад (P. aeruginosa), а также E. faecalis и E. coli.
На основании клинических исследований было доказано, что агары
МакКонки обладают высокой чувствительностью в отношении коли-
формных бактерий и кишечных патогенов и ингибирующим эффектом
в отношении стафилококков для использования их при исследовании
воды, молочных продуктов, фармпрепаратов, а также для исследования
мочи, патологических материалов.

152
6 .3 .1 1 . X L D - а г а р

Агар XLD-Agar был разработан Тейлором для повышения эффектив­


ности изоляции и идентификации кишечных патогенов, в особенности
Shigella. Кишечные патогены на этой среде дифференцируются не только
от непатогенных микроорганизмов, ферментирующих лактозу, но и от
многих непатогенных микроорганизмов, не ферментирующих лактозу
или сахарозу. Кроме того, специальная рецептура улучшает рост бактерий
рода Shigella, который был затруднен в других рецептурах из-за наличия
токсичных селективных факторов. Результаты, полученные в ряде клини­
ческих исследований, подтвердили относительно высокую эффектив­
ность агара XLD-Agar для первичной изоляции Shigella и Salmonella [165].
В соответствии с национальным стандартом Р Ф ГО СТ «Метод выявле­
ния бактерий рода Salmonella» [16] в перечень плотных дифференциально­
диагностических питательных сред, наряду с общепринятыми, входит
ксилозолизиновый агар с дезоксихолатом (X L D -агар).
Среда обладает селективным действием и позволяет дифференцировать
колонии по ферментации сахаров и образованию сероводорода [82]. Диф­
ференциация бактерий идет не только по сахаролитическому действию и
сероводороду, но и по образованию микробом лизиндекарбоксилазы.
Подщелачивание среды из-за лизиндекарбоксилирования с образованием
кадаверина может скрыть реакцию сбраживания ксилозы бактериями
рода Salmonella, однако другие энтеробактерии вырабатывают достаточно
кислоты благодаря сбраживанию лактозы и сахарозы, и возвращение
к прежнему состоянию рН в среде не происходит.
Дифференцирующие свойства среды основаны на изменении рН в кис­
лую сторону при росте бактерий, гидролизующих углеводы, входящие
в состав среды, с образованием желтых или беловато-желтых колоний,
окруженных желтой зоной, с преципитатом или без него. Бактерии, в част­
ности рода Salmonella, продуцирующие сероводород, обнаруживаемый
в присутствии тиосульфата натрия и соли железа (III), реагируют с ним
с образованием черного пигмента колоний. Следует отметить, что некото­
рые представители рода Citrobacter способны декарбоксилировать лизин и
выделять сероводород, но из-за закисления среды продуктами сбражива­
ния лактозы и сахарозы они образуют на X L D -агаре желтые колонии, ино­
гда с черным центром. Это обусловлено содержанием в среде соли железа,
реагирующей с сероводородом с образованием сульфида железа. Бактерии,
декарбоксилирующие лизин, могут быть обнаружены по пурпурному
окрашиванию среды вокруг колоний вследствие повышения рН. Реакции,
протекающие в X L D -агаре, могут проходить одновременно или последо­
вательно, что вызывает появление различных оттенков цвета индикатора

153
или изменяет его цвет от желтого до красного при длительном культиви­
ровании (рис. 36).
X L D -агар выпускается ведущими зарубежными фирмами для выделе­
ния и дифференциации патогенных энтеробактерий, в частности сальмо­
нелл и шигелл, при проведении бактериологических исследований в кли­
нической и санитарной микробиологии
Составы питательных сред практически не отличаются, за исключением
концентрации агара 13,5-16,5 г/л. В состав сред, как правило, входят кси­
лоза 3,5 г/л, L-лизин 5,0 г/л, лактоза 7,5 г/л, сахароза 7,5 г/л, хлористый
натрий 5,0 г/л, дрожжевой экстракт 3,0 г/л, феноловый красный 0,08 г/л,
натрия дезоксихолат 2,5 г/л, натрия тиосульфат 6,8 г/л, железа аммония
цитрат 0,8 г/л.
Особенностью этой питательной среды является необходимость бы­
строго охлаждения после нагрева, так как перегрев или медленное охлаж­
дение приводит к осаждению и образованию сгустков, в результате на
среде рост колоний будет затруднен, а результаты реакций - нечеткими.
Оптимизация компонентного состава питательной среды для выделения и
дифференциации патогенных энтеробактерий сухого X L D -агара произ­
водства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ сводилась к частичной замене дезоксихолата
натрия на желчь очищенную. Варьирование величины от 2,0 до 3,0 г/л
связано с различной ингибиторной способностью желчи. Установлено,
что частичная замена дезоксихолата натрия на желчь очищенную приво­
дит к стабилизации физических параметров и позволяет избежать требо­
ваний к быстрому охлаждению среды в процессе приготовления.
Состав сухой отечественной питательной среды для выделения и диф­
ференциации патогенных энтеробактерий (X L D -агар), г/л:
Ксилоза 3,5
Лизин 5,0
Лактоза 7,5
Сахароза 7,5
Натрия хлорид 5,0
Дрожжевой экстракт 3,0
Желчь очищенная 2,5 ± 0,5
Дезоксихолат натрия 1,5
Натрия тиосульфат 6,8
Железа аммиачного цитрат 0,8
Феноловый красный 0,08
со
О

Натрий углекислый
Агар микробиологический 10,0 ± 3,0
рН от 7,2 до 7,6
Среда не подлежит автоклавированию и перегреву.

154
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на этикет­
ке, тщательно размешивают в 1 л дистиллированной воды, осторожно
кипятят при постоянном помешивании не более 2 мин до полного рас­
плавления агара. Охлаждают до температуры 40-45°С , разливают в сте­
рильные чашки Петри. Перед посевом чашки со средой подсушивают
в течение 9 0 -1 0 0 мин.
Готовая среда в чашках прозрачная, красного цвета.
Контроль специфической активности среды допускается осуществлять
в течение 2 сут после ее приготовления при условии хранения в темном
месте при температуре 18-25°С .
С п е ц и ф и ч е с к а я а к т и в н о с т ь . Питательная среда обеспечивает на всех
засеянных чашках Петри рост каждого тест-штамма S. flexneri 1a 8516,
S. typhimurium 79, S. enteritidis 11272, E. coli 3912/41 (055:K 59), P. mirabilis
3177 при посеве по 0,1 мл микробной взвеси из разведения 10-6 через
2 0 -2 4 ч инкубации при температуре (37±1)°С в виде соответствующих
колоний.
Колонии S. flexneri 1a 8516 - круглые, прозрачные, цвета среды, диаме­
тром 1,0-1,5 мм.
Колонии S. typhimurium 79, S. enteritidis 11272 - круглые, прозрачные,
бесцветные с черным центром, диаметром 1,0-3,0 мм.
Колонии E. coli 3912/41 (055:K 59) - круглые, непрозрачные, желтые,
с желтой зоной вокруг, диаметром 1,5-3,0 мм.
Колонии P. mirabilis 3177 - круглые, прозрачные, желтого цвета с чер­
ным центром, диаметром 1,0-2,5 мм.
Д и ф ф е р е н ц и р у ю щ и е с в о й с т в а . При посеве по 0,1 мл микробной смеси
тест-штаммов S. typhimurium 79 и E. coli 3912/41 (055:K 59) из разведения
10~6 на всех засеянных чашках Пет­
ри через 2 0 -2 4 ч инкубации при
температуре (37 ± 1)°С должна на­
блюдаться четкая дифференциация
сальмонелл от кишечной палочки.
И н г и б и р у ю щ и е с в о й с т в а . Пита­
тельная среда должна полностью
подавлять на всех засеянных чаш­
ках Петри рост тест-штамма S. aureus
W ood-46 при посеве по 0,1 мл ми­
кробной взвеси из разведения 10-4
через 2 0 -2 4 ч инкубации при тем­
пературе (37 ± 1)°С.
Рис. 36. Р о с т смеси тест-штаммов S. ty p h i­
На рис. 36 рост смеси тест-штам­ m urium 79, Е . coli 3 9 1 2 /4 1 (0 5 5 :К 5 9 ),
мов S. typhimurium 79 (бесцветные S. f l e x n e r i 1а 8 516.

155
с черным центром), E. coli 3912/41 (055:K 59) (желтые, с желтой зоной во­
круг), S. flexneri 1a 8516 (прозрачные, цвета среды).
Проведены исследования X L D -агара на расширенном наборе тест­
штаммов микроорганизмов в сравнении с зарубежным аналогом (табл. 39).
Из таблицы видно, что среды обладают селективным действием и по­
зволяют дифференцировать микроорганизмы по ферментации сахаров,
образованию сероводорода и наличию лизиндекарбоксилазы.
На базе лаборатории М Б У З «Пятигорская городская инфекционная
больница» были проведены широкие испытания питательной среды для

Таблица 39. Сравнительная характеристика XLD-агаров разных производителей


Тест-штаммы XLDагар (ГНЦПМБ) XLDагар(среда сравнения)
характерроста тест-штаммовизразведения 10-6(100 м.к.)
(диаметр, морфология)
S. flexneri 1 a 8516 1,5 0,8-1,0
Круглые, блестящ., сл. розов. Круглые, блестящ., сл. розов.
S. sonnei «S-form» 2,0 1,6
Круглые, блестящ., сл. розов. Круглые, блестящ., сл. розов.
S. typhi H-901 ГДР/ГИСК 2,0 1,6
Круглые, блестящ., белые Круглые, блестящ., белые
с черным центром
S. paratyphi А-225 1,5 0,6
Круглые, блестящ., сл. розов. Круглые, блестящ., сл. розов.
S. typhimurium 79 2,5-3,0 1,4-1,6
Круглые, расплывч., Круглые, черные
прозрачн. с черным центром
S. typhi «bismuth» 869 1,8-2,0 1,5-1,6
Круглые, блестящ., кремовые Круглые, блестящ., кремовые
S. gallinarum 665 0,6-0,8 0,3
Круглые, блестящ., прозр. Круглые, блестящ., прозр.
S. london 3496 3,0 1,8
Круглые, блестящ., с черным центром Белые с черным центром
S. enteritidis 11272 2,0 1,0-1,6
Круглые, блестящ., с черным центром Круглые, блестящ., черные
S. dysenteriae 1362 2,0 1,0
Круглые, блестящ., розовые Круглые, блестящ., розовые
E. coli 3912/41 (055:K59) 1,7-2,0 1,5-1,7
Желтые со слегка выраж. центром Белые, со слегка выраж. центром
с зоной преципитации
E. aerogenes 10006 2,5-3,0 2,0
Круглые, выпуклые, кремовые, Круглые, кремовые,
с зоной преципитации обесцвечивание среды
K. pneumoniae 3534/51 2,0-2,5 2,0-2,5
Круглые, желтые Круглые, желтые
P. mirabilis 3177 2,0-2,2 1,8
Слизистые, полупрозр. Слизистые, полупрозр.
с черным центром с серым центром
S. aureus Wood-46 Нет роста Нет роста
S. choleraesuis 1,8-2,0 1,0-1,4
Круглые, блестящ., кремовые Круглые, блестящ., кремовые

156
выделения и дифференциации патогенных энтеробактерий (X L D -агар)
производства Ф Б У Н ГНЦ ПМБ с использованием клинического мате­
риала от больных ОКИ.
Колонии, подозрительные на принадлежность к патогенным и условно­
патогенным энтеробактериям с X L D -агара, пересевались на дополнитель­
ные среды для первичной идентификации по биохимическим признакам
и с использованием соответствующих серологических исследований.
В качестве контроля были смоделированы смеси из клинических изо-
лятов: mix 1 (ЭПКП + шигелла + сальмонелла) и mix 2 (сальмонел­
ла + лактозоположительная кишечная палочка + ЭПКП). Специфическая
активность питательных сред при посеве клинических изолятов соответ­
ствовала показателям, заложенным в нормативной документации на
среду. В результате проведенных исследований было подтверждено на­
личие в клинических образцах S. enteritidis, ЭПКП, S. dysenteriae.
Питательная среда для выделения и дифференциации патогенных
энтеробактерий (X L D -агар) позволяет расширить номенклатуру выпус­
каемых дифференциально-диагностических сухих питательных сред
для получения сопоставимых и достоверных результатов в соответствии
с требованиями российских и международных стандартов (E P II и
U SP X X III).

6 .3 .1 2 . П и т а т е л ь н а я сред а с бри лли ан то вы м зел ен ы м

и ф ен о ло вы м кра сн ы м

Сахароза - лактозный агар с бриллиантовым зеленым и феноловым


красным является селективной средой для выделения сальмонелл, за ис­
ключением S. typhi и Shigella, из патогенного материала: мочи, фекалий,
пищевых продуктов и других объектов. Росту сопутствующих микроорга­
низмов препятствует увеличенная концентрация бриллиантовой зелени.
Сальмонеллы не ферментируют ни сахарозу, ни лактозу, поэтому присут­
ствие этих сахаров позволяет идентифицировать сопутствующие лактозо­
положительные или лактозоотрицательные, но сахарозоположительные
микроорганизмы.
Компонентный состав питательных сред с бриллиантовым зеленым
и феноловым красным различных зарубежных фирм-производителей
включает мясной или казеиновый пептон 5 ,0 -1 0 ,0 г/л, мясной экстракт
3 .0 - 5,0 г/л, дрожжевой экстракт 3,0 г/л, натрий хлористый 3 ,0 -5 ,0 г/л,
натрий фосфорнокислый двузамещенный 1,0-2,0 г/л, натрий фосфорно­
кислый однозамещенный 0,6 г/л, лактозу 10,0 г/л, сахарозу 10,0 г/л, фено­
ловый красный 0 ,08-0,09 г/л, бриллиантовый зеленый 0,125г/л, агар
1 2 .0 - 13,0 г/л [82, 148].

157
Основными факторами, влияющими на ростовые, дифференцирующие
и ингибирующие свойства сахароза-лактозного агара с бриллиантовым
зеленым и феноловым красным, являются: концентрация питательной
основы, стимулирующей добавки, и бриллиантового зеленого в качестве
ингибитора сопутствующей микрофлоры.
Питательный агар с бриллиантовым зеленым, феноловым красным,
лактозой и сахарозой сухой (Б Ф Л С -ГР М -агар ) отечественного производ­
ства обеспечивает хороший рост сальмонелл, шигелл и других представи­
телей энтеробактерий и имеет следующий состав, г/л:
ПГРМ 15,0
Дрожжевой экстракт 2,0
Натрий хлористый 3,0
Натрий фосфорнокислый однозамещенный 1,0
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,5
Лактоза 10,0
Сахароза 10,0
Феноловый красный 0,09
Бриллиантовый зеленый 0,02
Малахитовый зеленый 0,01

со
Натрий углекислый

о
Агар бактериологический 13,0 ± 3,0
рН от 6,8 до 7,2
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на этикетке
для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают
в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин до полного расплавления
агара. Стерилизуют автоклавированием при температуре 121°С в течение
15 мин, охлаждают до температуры 4 5 -50°С и разливают в стерильные
чашки Петри. Готовая питательная среда прозрачная, красного цвета.
Контроль специфической активности питательной среды допускается
осуществлять в течение 7 сут после ее приготовления при условии хране­
ния при температуре 2-8°С .
С п е ц и ф и ч е с к а я ак ти вн ость. Питательная среда обеспечивает визуально
обнаруживаемый рост S. typhimurium 79, S. enteritidis 11272, E. coli ATCC 25922
при посеве по 0,1 мл микробной взвеси каждого тест-штамма из разведения
10-6 через 2 0 -2 4 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С.
Колонии S. typhimurium 79 и S. enteritidis 11272 - круглые, гладкие, ро­
зового цвета, диаметром от 1,5 до 3,0 мм.
Колонии E. coli ATCC 25922 - круглые, гладкие, желтые, с желтой зоной
вокруг, диаметром от 1,5 до 3,0 мм.
Д и ф ф е р е н ц и р у ю щ и е с в о й с т в а . При посеве по 0,1 мл микробной смеси
тест-штаммов S. enteritidis 11272 и E. coli ATCC 25922 из разведения 10-6

158
Рис. 37. Микробная смесь тест-штаммов S . en teritidis 11272 с Е . coli А ТС С 25922.

на всех засеянных чашках через 2 0 -2 4 ч инкубации при температуре


(37 ± 1)°С наблюдается четкая дифференциация сальмонелл от кишечной
палочки (рис. 37).
И н г и б и р у ю щ и е с в о й с т в а . Питательная среда подавляет рост тест­
штамма S. aureus W ood-46 из разведения 10-3 и роение тест-штамма
P. vulgaris HX 19 222 из разведения 10-6 на всех засеянных чашках при
посеве по 0,1 мл микробной взвеси через 2 4 -4 8 ч инкубации при темпера­
туре (37 ± 1)°С.
Биологические показатели БФ Л С -ГРМ -агара в сравнении с контроль­
ной средой BPLS-Agar for the isolation of Salmonella (M erck) представлены
в табл. 40.
Из таблицы видно, что высокая питательная ценность питательных
сред обеспечивает хороший рост сальмонелл и шигелл. Росту сопутствую­
щих микроорганизмов, в основном грамположительных бактерий, препят­
ствует оптимальная концентрация бриллиантового зеленого. Присутствие
сахарозы и лактозы позволяет идентифицировать сопутствующие как сла­
болактозоположительные, так и лактозоотрицательные, но при этом саха­
розоположительные микроорганизмы и обеспечивает четкую дифферен­
циацию сальмонелл, не ферментирующих ни сахарозу, ни лактозу.
Лабораторным критерием диагностики является выделение чистой куль­
туры патогена при использовании селективных сред обогащения, диффе­
ренциально-диагностических сред, с дальнейшей биохимической иденти­
фикацией и установлением серовара изолята в реакциях агглютинации.
В клинико-бактериологической лаборатории г. Ярославля (инфекцион­
ная клиническая больница №1 ГУЗ Я О ) были проведены исследования
образцов клинического материала с применением питательного агара
с бриллиантовым зеленым, феноловым красным, лактозой и сахарозой
сухой (БФ Л С -ГР М -агар). Всего было проанализировано 520 образцов

159
Таблица 40. Результаты биологического контроля БФЛС-агаров
Тест-штаммы Разведения Питательные среды
БФЛС ГРМ-агар 5 BPLS-Agar for the isolation
of Salmonella
S. typhimurium 79 10-6 2,5-3,2 1,6-1,8
Круглые, гладкие, розовые Круглые, гладкие, розовые
S. gallinarum 665 10-6 1,0 Нет роста
Круглые, гладкие,
бледно-розовые
S. paratyphi A 225 10-6 1,8-2,0 1,8-2,0
Круглые, гладкие, Круглые, гладкие,
бледно-розовые бледно-розовые
S. typhi H-901 10-6 1,4-1,6 0,6
ГДР/ГИСК Круглые, гладкие, розовые Круглые, гладкие,
бледно-розовые
S. flexneri 1 a 8516 10-6 1,4-1,6 Нет роста
Круглые, гладкие, розовые
E. coli О55:К59 3912/41 10-6 1,2-2,0 1,0-1,6
Круглые, гладкие, желтые Круглые, гладкие, желтые
E. coli 25922 10-6 2,0-2,7 1,2-1,4
Круглые, гладкие, желтые Круглые, гладкие, желтые
P. vulgaris HX 19 222 10-6 1,8-2,0 1,0-1,2
Круглые, гладкие, желтые. Круглые, гладкие, желтые.
Роения нет Роения нет
S. aureus 209-P 10-5 Нет роста Нет роста

ПБА (патогенных биологических агентов), поступивших в лабораторию


для исследования из различных отделений ГУЗ ЯО ИКБ №1, в том числе
испражнения (кал) - 438, моча - 72, гной - 5, кровь - 5.
Доставленный в лабораторию клинический материал из среды Кэри-
Блэра высевали прямым посевом на питательные среды Левина-ГРМ,
S S -агар, предположительно контаминированные Salmonella spp, и парал­
лельно на БФ Л С-ГРМ -агар.
Через сутки анализировали прямые посевы на наличие колоний с ха­
рактерной для искомых микроорганизмов морфологией: круглые, глад­
кие, розового цвета диаметром от 1,5 до 3,0 мм на БФЛ С-ГРМ -агаре.
Из всех пробирок после накопления в Селенитовом бульоне бактериоло­
гической петлей проводили штриховые пересевы также на S S -агар и па­
раллельно на Б Ф Л С ГРМ-агар. Посевы инкубировали 24 ч при темпера­
туре культивирования 37°С.
Для дополнительного подтверждения принадлежности к роду сальмо­
нелл при визуальном обследовании посевов микробиологической петлей
отбирали единичные колонии с чашек после прямого посева и после на­
копления, делали мазки по Граму, определяли биохимические свойства
с помощью дополнительных тестов и диагностических сальмонеллезных
адсорбированных сывороток.

160
Рис. 38. Микробный рост при посеве клинического материала на БФЛС ГРМ агаре:
а - прямой посев образца; b - после накопления в селенитовом бульоне.

Всего было отобрано 52 чашки с посевами после накопления на SS-ага­


ре и на Б Ф Л С -ГР М агаре, на которых обнаружены лактозоотрицательные
колонии.
На рис. 38 представлены фотографии результата прямого посева образ­
ца (кал) на Б Ф Л С ГРМ-агар и посева после накопления в селенитовом
бульоне этого же образца.
После биохимической типизации возбудителей сальмонелл путем изу­
чения пересевов отобранных колоний на средах длинного пестрого ряда и
серологической типизации для всех образцов с лактозоотрицательными
колониями была подтверждена родовая и видовая принадлежность к саль­
монеллам у 16 изолятов.
Сравнительная оценка выявляемости сальмонелл из клинического ма­
териала представлена в табл. 41.

Таблица 41. Выявляемость и с к о м ы х микроорганизмов на средах при посеве клиниче­


ского материала
БФЛС ГРМагар Контрольная среда
SS-агар
Количество посевов клинических образцов 520 520
Количество положительных находок, * 62 63
в том числе подтвержденных как:
Salmonella enteritidis 12 12

Salmonella london 1 1

Salmonella Stanley 1 1

Salmonella bovis morbificans 1 1

Salmonella virchow 1 1

Лактозоотрицательные 46 47
Выявляемость и % ± m совпадений результатов 95% ±2% 95% ±2%
исследования положительных проб*
* - при доверительной вероятности 90%, при учете среднего результата.

161
Питательный агар с бриллиантовым зеленым, феноловым красным,
лактозой и сахарозой сухой (Б Ф Л С -ГР М -агар ) полностью соответствует
требованиям, предъявляемым к средам аналогичного назначения: в про­
цессе исследований клинического материала выделено 16 культур Salmo­
nella spp, что было подтверждено на среде сравнения.

6 .4 . п и тательн ы е с ред ы д ля и д ен ти ф и кац и и


эн теро бактери й

Одним из наиболее часто применяемых в настоящее время способов


быстрой идентификации чистой культуры микроорганизмов, позволяю­
щих стандартно и качественно проводить данный вид исследования, явля­
ется использование питательных сред с соответствующими индикатора­
ми. В ходе инкубации испытуемого штамма протекают биохимические
реакции, результаты которых регистрируются визуально по изменению
цвета индикатора в среде. Такая среда является подтверждающей средой
(confirmation medium): питательная среда, которая частично или пол­
ностью способствует идентификации или определению характеристик
микроорганизмов, которые проводят после предварительных стадий
оживления, выделения и/или обогащения [22].
Для проведения первичной идентификации энтеробактерий по сочета­
нию ряда признаков, важных для определения семейства, рода или неко­
торых видов энтеробактерий используют комбинированные среды.
К числу таких сред относят среду Клиглера, агар Олькеницкого, двух­
слойную комплексную среду (Д У К С ), трехсахарный агар с солями железа
(T S I) и др.

6 .4 .1 . А г а р К л и г л е р а

Среды Клиглера широко используются в бактериологических лабора­


ториях для биохимической типизации изолятов. Первоосновой многих
комбинированных сред послужила среда Ресселя, предназначавшаяся для
выявления образования кислоты и газа при ферментации глюкозы и лак­
тозы. В 1917 г. Клиглер модифицировал ее добавлением сульфатного
железа и тиосульфата натрия с целью выявления продукции сероводоро­
да. Состав сред Клиглера, методика посева и результаты, полученные
в процессе роста энтеробактерий на них, идентичны.
В зарубежной и отечественной микробиологической практике исполь­
зуют среды Клиглера следующего состава: пептон или панкреатический
гидролизат казеина 20,0 г/л, мясной экстракт 3,0 г/л и/или дрожжевой

162
экстракт 3,0 -6 ,0 г/л , натрий хлористый 5,0 г/л, лактоза 10,0 г/л, глюкоза
1,0 г/л, цитрат аммонийного железа 0 ,3 -0 ,5 г/л, натрия тиосульфат
0 ,3-0,5 г/л, феноловый красный 0,024-0,05 г/л, агар 11,0-15,0 г/л. Не­
которыми производителями внесен дополнительно натрия метабисуль­
фит 0,5 г/л, натрия карбонат 0,8 г/л [135, 154, 168].
Среды Клиглера после стерилизации разливают в пробирки и скаши­
вают так, чтобы остался столбик высотой 2 5 -3 0 мм. Готовые среды имеют
красный цвет.
Посев на указанные среды проводят по скошенной части в виде прямой
линии, затем в толщу агарового столбика и заканчивают по скошенному
агару штрихом. Укол в толщу агарового столбика не должен достигать
дна, для того чтобы не нарушать анаэробные условия сбраживания глюко­
зы. Посевы инкубируют при 37°С. Учет результатов производят через
2 0 -2 4 ч инкубации.
В результате роста бактерий, при расщеплении сахаров образуется кис­
лота, наличие которой улавливают с помощью индикатора (фенолового
красного), окрашивающего среду в желтый цвет. В аэробных условиях
(в скошенной части агара) бактерии, ферментирующие только глюкозу,
содержащуюся в малых концентрациях, утилизируют ее полностью в пер­
вые часы роста. К моменту учета реакции (1 8 -2 4 ч) для своего питания
они используют уже пептоны, имеющиеся в среде в качестве белковой
питательной основы. При этом в скошенной части происходит образова­
ние аммиака и подщелачивание среды (красный цвет). В столбике же
желтый цвет сохраняется, так как, хотя глюкоза также за этот срок фер­
ментирована, кислые конечные продукты ее расщепления в анаэробных
условиях еще сохраняются и поддерживают низкое значение рН. Полу­
чается желтый столбик и красный скос.
Энтеробактерии, сбраживающие и глюкозу, и лактозу, вызывают под­
кисление среды во всей пробирке (желтый столбик и скошенная часть).
Лактоза (1% ) входит в состав среды в концентрации, превышающей
в 10 раз концентрацию глюкозы. Поэтому через 1 8 -2 4 ч инкубации лакто­
за еще не исчерпана и в скошенной части (в аэробных условиях), вслед­
ствие чего кислая реакция сохраняется как в столбике, так и в скошенной
части среды. Если бактерии при ферментации углеводов как конечный
продукт метаболизма образуют газ (Н 2 , СО 2 ), появляются разрывы среды
в столбике агара.
Некоторые энтеробактерии обладают энзимом - тиосульфатредукта­
зой, вследствие чего способны образовывать сероводород из неоргани­
ческих соединений серы, что является дифференцирующим признаком.
В агаре Клиглера реакция проходит в два этапа. В начале в анаэробных
условиях, в кислой среде под действием микробного энзима тиосульфат

163
восстанавливается в сульфит с выделением значительного количества се­
роводорода, представляющего собой бесцветный газ. Затем необходим
второй этап: для его обнаружения в среду в качестве индикатора введены
соли железа (малочувствительный реагент), которые вступают в реакцию
с сероводородом, образуя сульфид железа в виде нерастворимого преци­
питата черного цвета. В результате при положительной реакции среда
в столбике чернеет.
Используя среду Клиглера, можно ориентировочно определить у иссле­
дуемой культуры способность к индолообразованию с помощью индика­
торной полоски.
Так как ПГРМ удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым
к белковым основам при производстве сред для выделения энтеробакте­
рий, эта белковая основа использовалась при производстве отечествен­
ной питательной среды Клиглера-ГРМ. Для более быстрого выявления
штаммов, замедленно ферментирующих лактозу, производят посев на
среды с повышенным содержанием лактозы (до 10%). Это дает возмож­
ность выявлять такие штаммы уже через 1 8 -2 4 ч инкубации. На среде
Клиглера, содержащей 1% лактозы, в этот срок штаммы, замедленно
ферментирующие лактозу, не обнаруживаются (неполное окрашивание
скошенной части среды в желтый цвет). Поэтому в составе отечествен­
ного агара Клиглера-ГРМ увеличено содержание лактозы до 2%. Эта
добавка позволила полностью устранить вышеуказанный недостаток, не
усложняя состава среды.
Агар Клиглера-ГРМ имеет следующий состав, г/л:
ПГРМ 20,0
Лактоза 20,0
Натрия хлорид 5,0
Натрия тиосульфат 0,3
Глюкоза 1,0
Железа окисного цитрат 0,3
Феноловый красный 0,05
Натрия сульфит 0,5
Натрия карбонат 0,01-0,25
Агар микробиологический 10,0 ± 3,0
рН от 7,2 до 7,6
Кроме того, при производстве агара Клиглера-ГРМ возможно приме­
нение технологии получения основы путем высушивания жидкого гид­
ролизата с тиосульфатом натрия. В этом случае такая основа вносится
в среду в количестве 20,5 г/л.
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на этикет­
ке для приготовления конкретной серии питательной среды, размешива­

164
ют в 1 л дистиллированной воды, кипятят в течение 2 - 3 мин до полного
расплавления агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разлива­
ют по 7,0 мл в пробирки и стерилизуют автоклавированием при темпера­
туре 112°С в течение 20 мин. После стерилизации среду в пробирках
скашивают, оставив столбик высотой 2 5 -3 0 мм. Готовая среда имеет
красный цвет.
Стерильную питательную среду можно использовать в течение 3 нед
при условии ее хранения при температуре 2-8 °C или в течение 3 сут
при температуре хранения 18-25°С (хранить пробирки следует в темном
месте).
Ферментацию лактозы учитывают на скошенной части агара Клиглера-
ГРМ (среда желтеет), глюкозы - в столбике (среда желтеет), газообразо­
вание - по появлению пузырьков воздуха или разрыва среды в столбике,
образование сероводорода - по почернению среды в столбике, а при сла­
бом образовании - по почернению на границе столбика и скошенной
части среды или, реже, на дне пробирки. В случае отрицательной реакции
среда остается красной либо скошенная поверхность приобретает малино­
вый оттенок.
С п е ц и ф и ч е с к а я ак ти в н о сть . Питательная среда обеспечивает во всех за­
сеянных пробирках рост каждого тест-штамма S. typhi «bismuth», S. para­
typhi B 8006, S. sonnei «S form», E. coli 3912/41(055: K59), P. alcalifaciens
1068-50, P. mirabilis Сиднеев, P. aeruginosa 613-60 при посеве культуры по
одной бактериологической петле диаметром 2 мм не позднее 48 ч инкуба­
ции при температуре (37 ± 1)°С с типовыми биохимическими характе­
ристиками (рис. 39).
Биологические свойства при посеве широкого набора тест-штаммов на
агар Клиглера-ГРМ представлены в табл. 42.
При проведении клинических испытаний агара Клиглера-ГРМ в каче­
стве среды сравнения была использована среда Клиглера производства
НПО «Биомед» (п. Петрово-Дальнее). Приготовление сред проводилось
строго в соответствии с Инструкциями по применению (инкубация при
температуре 37°С в течение 48 ч на контрольной среде и в течение 24 ч
на агаре Клиглера-ГРМ). Посев клинического материала осуществлялся
на среды с соблюдением условия равнозначности.
Было исследовано 349 посевов биоматериала на базе лаборатории
Ф Б У З «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» и 231 посев
в лаборатории Ф Б У З «Центр гигиены и эпидемиологии в Калужской об­
ласти». В результате проведенных испытаний показано, что образцы агара
Клиглера-ГРМ дали более четкие результаты по расщеплению глюкозы,
лактозы, более четкому газообразованию и продукции сероводорода
по сравнению с контрольной средой. Причем, на агаре Клиглера-ГРМ

165
a b c d e f
Рис. 39. Р о с т тест-штаммов на агаре Клиглера-ГРМ: a - P. aeruginosa 613-60 - не фермен­
тирует лактозу, глюкозу, газа не образует, не продуцирует сероводород; b - S. paratyphi B
8006 - не расщепляет лактозу, ферментирует глюкозу с образованием газа, продуцирует
сероводород; c - S. sonnei «S form» - не расщепляет лактозу, ферментирует глюкозу без
образования газа, не продуцирует сероводород; d - E. coli 3912 /4 1 (0 5 5 :K 5 9 ) ферментирует
лактозу, глюкозу с образованием газа, не продуцирует сероводород; e - S. typhi «bismuth»
не расщепляет лактозу, ферментирует глюкозу без образования газа, слабо продуцирует
сероводород; f - P. mirabilis Сиднеев не расщепляет лактозу, ферментирует глюкозу с об­
разованием газа, продуцирует сероводород.

Таблица 42. Биологические свойства агара Клиглера-ГРМ через 24 ч инкубации


№ Тест-штаммы Описаниер о с т о в ы х показателейагара Клиглера-ГРМ
п/ п

1 . E. coli 3912/41 (055:K59) Скошенная часть агара и столбик среды желтого цвета,
разрыв агара в столбике
2 . E. coli АТСС 25922 Скошенная часть агара и столбик среды желтого цвета,
разрыв агара в столбике
3. S. flexneri 1а 8516 Скошенная часть агара малинового цвета, столбик
желтого цвета
4. S. sonnei «S form» Скошенная часть агара малинового цвета, столбик
желтого цвета
5. S. typhi Н-901 ГДР/ГИСК Скошенная часть агара малинового цвета, столбик
желтого цвета, слабое почернение по уколу
6 . S. typhimurium 79 Скошенная часть агара малинового цвета, интенсивное
почернение и газообразование в столбике
7. S. paratyphi B 8006 Скошенная часть агара малинового цвета, столбик черного
цвета, газообразование
8 . S. paratyphi А 225 Скошенная часть агара малинового цвета, столбик желтого
цвета, слабое газообразование
9. S. typhi «bismuth» Скошенная часть агара малинового цвета, столбик желтого
цвета, почернение на границе столбика и скошенной части
10 . E. aerogenes CCM 2531 Скошенная часть агара и столбик среды желтого цвета,
разрыв агара

166
Таблица 42. Окончание
№ Тест-штаммы Описаниеростовых показателейагара Клиглера ГРМ
п/ п
1 1 . P. mirabilis Сиднеев Скошенная часть агара малинового цвета, столбик
черно-зеленого цвета, газообразование
1 2 . P. vulgaris HX 19 222 Скошенная часть агара малинового цвета, столбик среды
черного цвета, разрыв агара в столбике
13. Y. enterocolitica 287 Скошенная часть агара малинового цвета, столбик
желтого цвета
14. Y. enterocolitica 26-04 (Lac+) Скошенная часть агара малинового цвета, столбик
желтого цвета
15. Y. рseudotuberculosis I Скошенная часть агара малинового цвета, столбик среды
желтого цвета
16. K. pneumoniae 3534/51 K56 Скошенная часть агара малинового цвета, столбик
желтого цвета, пузырьки газа в столбике
17. Vibrio cholerae НАГ 76(1) Скошенная часть агара малинового цвета, столбик
желтого цвета
18. P. aeruginosa 613-60 Скошенная часть агара и столбик малинового цвета
19. C. freundii 101/57 Скошенная часть агара желтого цвета, столбик черного цвета,
пузырьки газа в столбике
2 0 . S. faecalis 735 Скошенная часть агара и столбик среды желтого цвета
2 1 . A. faecalis 73 Скошенная часть агара и столбик малинового цвета

в Ф Б У З «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской области» удалось


дополнительно выделить S. sonnei. В Ф Б У З «Центр гигиены и эпидемио­
логии в Калужской области» на питательных средах 22 штамма, иденти­
фицировались как энтеробактерии: E. coli O151 (индол + ), Salmonella
amager гр. Е, Citrobacter, Enterobacter. Кроме этого, существенным отличи­
ем агара Клиглера-ГРМ от контрольной среды явилось сокращение вре­
мени инкубации в два раза.
Результаты исследований на широком наборе музейных штаммов и
клинических испытаний позволили установить, что агар Клиглера-ГРМ
обеспечивает питательные потребности для роста и идентификацию по
биохимическим свойствам энтеробактерий при исследовании клиниче­
ского материала и объектов окружающей среды.

6 .4 .2 . П и та тельн ы е сред ы с м очевиной

Ведущими зарубежными фирмами выпускаются питательные среды


с мочевиной: агар Кристенсена, бульон с мочевиной, агар Клиглера с мо­
чевиной. Мочевина вводится раствором асептически в охлажденную
до 55°С стерильную среду. Основным белковым компонентом во всех им­
портных средах с мочевиной является мясной пептон или пептон из жела­
тина 1,0 г/л, глюкоза 1,0 г/л, дигидрофосфат калия 0 ,8 -1 ,0 г/л, натрия
хлорид 5,0 г/л, феноловый красный 0,012 г/л, агар 12,0-15,0 г/л [149, 154].

167
Среды по Олькеницкому лабораторного изготовления готовятся на
основе питательного агара 25,0 г/л. В состав сред также входит сахароза
10,0 г/л, лактоза 10,0 г/л, глюкоза 1,0 г/л, тиосульфат натрия 0,3 г/л, соль
Мора или железо сернокислое 0,2 г/л, 4 мл 0,041% водного р-ра фенолово­
го красного. 2 0 -5 0 мл мочевины 50% (в зависимости от модификации)
вносится ex tempore. Среду после стерилизации разливают асептически в
стерильные пробирки, охлаждают в наклонном положении для получения
столбика высотой 2,5 см и скошенной части длиной 4 см [73].
Утилизацию мочевины на таких средах учитывают по изменению
цвета столбика и скошенной части питательной среды, ферментацию
лактозы учитывают на скошенной части питательной среды, глюкозы -
в столбике, газообразование - по появлению пузырьков воздуха или раз­
рыва среды в столбике, образование сероводорода - по почернению
среды в столбике. В случае отрицательной реакции первоначальный
цвет среды не меняется.
Железо-глюкозо-лактозный агар с мочевиной производства Ф Б У Н
ГНЦ ПМБ предназначен для бактериологических исследований в сани­
тарной и клинической микробиологии с целью идентификации энтеро­
бактерий по их способности утилизировать мочевину, ферментировать
лактозу, глюкозу, образовывать газ и сероводород.
Для улучшения стабильности и срока хранения при производстве
Железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной (Ф Б У Н ГНЦ П М Б) ис­
пользуется основа ПГРМ, высушенная с тиосульфатом натрия. Кроме
того, на основании исследований по варьированию количественного со­
става мочевины, а также с учетом производимых различными изго­
товителями питательных сред с мочевиной, определена наиболее опти­
мальная концентрация мочевины 10,0 г/л, вносимая в среду до автоклави­
рования. Поэтому процесс стерилизации питательной среды проводится
в щадящем режиме при 0,4 атм. (температура 110°С) в течение 15 мин.
Такой режим стерилизации позволяет обеспечить хорошие дифференци­
рующие свойства среды, а также сохранить цветовую гамму при визуаль­
ной оценке проявления биохимических свойств тестируемых микроорга­
низмов [88, 137].
О ферментации лактозы судят по изменению цвета среды в скошен­
ной части, а о ферментации глюкозы - в столбике, в котором при газоо­
бразовании появляются пузырьки (разрывы среды или ее отслоение от
стенок пробирки). Однако в случае указанного расщепления мочевины
уреазоположительными штаммами учет ферментации углеводов невоз­
можен, так как в процессе роста таких тест-штаммов цвет всей среды
будет приобретать малиновую окраску. В процессе биологического кон­
троля Железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной по прописи трех­

168
сахарного агара определение утилизации мочевины было затруднено.
Это проявилось в виде недостаточной дифференциации тест-штамма
Y. enterocolitica (неполное окрашивание столбика в малиновый цвет),
тогда как в агаре Клиглера-ГРМ (к которому после стерилизации
ex tempore добавляли мочевину), содержащем 2% лактозы, такого недо­
статка не обнаруживалось. Исходя из этого, было решено увеличить
содержание лактозы в среде до 2%, полностью устранив сахарозу из
прописи среды. Поэтому, опираясь на те сведения, где отмечалось при­
готовление среды с мочевиной на основе среды Клиглера, то есть без
сахарозы, и учитывая результаты, полученные на широком наборе тест­
штаммов, определена пропись питательной среды (Ж елезо-глюкозо-
лактозного агара с мочевиной) без сахарозы, но с увеличенной навеской
лактозы - 20,0 г/л.
В Железо-глюкозо-лактозном агаре с мочевиной для образования серо­
водорода и формирования черного преципитата использованы цитрат
железа и тиосульфат натрия.
Пропись питательной среды с мочевиной (Ф Б У Н ГНЦ П М Б) (Железо-
глюкозо-лактозного агара с мочевиной), г/л:
ПГРМ с тиосульфатом натрия 20,5
Лактоза 20,0
Глюкоза 1,0
Натрия фосфат двузамещенный 1,0
Калия фосфат однозамещенный 1,3
Натрий хлористый 5,0
Железа окисного цитрат 0,3
Феноловый красный 0,05
Мочевина 10,0
Агар 10,0 ± 3,0
Натрия карбонат 0,01-0,25
рН от 6,9 до 7,3
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на этикетке
для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают в
1 л дистиллированной воды, стерилизуют автоклавированием при темпе­
ратуре 110°С в течение 15 мин. После стерилизации охлажденную до тем­
пературы 4 0 -50°С среду разливают по 7 мл в стерильные пробирки и
скашивают, оставляя столбик высотой 2 5 -3 0 мм. Готовая среда имеет
красный цвет.
Стерильную питательную среду можно использовать в течение 3 нед
при условии ее хранения при температуре 2 -8 °C или в течение 3 сут при
температуре хранения 18-25°С (хранить пробирки следует в темном
месте).

169
С п е ц и ф и ч е с к а я а к т и в н о с т ь . Питательная среда обеспечивает во всех
засеянных пробирках рост каждого тест-штамма Y. enterocolitica 287 II,
Y. pseudotuberculosis III, S. sonnei «S-form», E. coli 3912/41(055: K59),
C. freundii 101/57, P. vulgaris HX 19 222 при посеве культуры по одной
бактериологической петле диаметром 2 мм через 1 8 -2 0 ч инкубации при
температуре (37 ± 1)°С с соответствующими типовыми биохимическими
характеристиками (рис. 40).
Утилизацию мочевины учитывают по изменению цвета столбика и ско­
шенной части питательной среды (среда приобретает малиновый цвет),
ферментацию лактозы учитывают по изменению цвета скошенной части
(среда желтеет), глюкозы - по изменению цвета столбика (среда желтеет),
образование газа - по появлению пузырьков воздуха или разрыва среды
в столбике, образование сероводорода - по почернению среды в столбике.
В случае отрицательной реакции среда остается красной.
Биологические показатели Железо-глюкозо-лактозного агара с мочеви­
ной по отношению к ряду музейных тест-штаммов семейства Enterobac-
teriaceae в сравнении с контрольной средой приведены в таблице 43.
Культивирование проводили при температуре 37°С с учетом результа­
тов не позднее 20 ч (рис. 40).

1 2 3 4 5 6 7
Рис. 40. Р о с т тест-штаммов на Железо-глюкозо-лактозном агаре с мочевиной: 1 - конт­
роль (незасеянная среда); 2 - Y. enterocolitica 287 II утилизирует мочевину, не расщепля­
ет лактозу, ферментирует глюкозу без образования газа, не продуцирует сероводород;
3 - Y. pseudotuberculosis III утилизирует мочевину, не расщепляет лактозу, ферментирует
глюкозу без образования газа, не продуцирует сероводород; 4 - S. sonnei «S form» не утили­
зирует мочевину, не расщепляет лактозу, ферментирует глюкозу без образования газа, не
продуцирует сероводород; 5 - E. coli 3 9 1 2 /4 1 (055: K 59) не утилизирует мочевину, фермен­
тирует лактозу, глюкозу с образованием газа, не продуцирует сероводород; 6 - P. vulgaris
H X 19 222 утилизирует мочевину, не расщепляет лактозу, ферментирует глюкозу, проду­
цирует сероводород; 7 - C. freundii 101/57, не утилизирует мочевину, расщепляет лактозу,
ферментирует глюкозу с образованием газа, продуцирует сероводород.

170
Таблица 43. Характеристика биологических показателей Железо-глюкозо-лактозного
агара с мочевиной на расширенном наборе музейных тест-штаммов
№ Тест-штаммы Железо-глюкозо- Контроль
п/ п лактозныйагар Трехсахарныйагар Агар Клиглера-ГРМ
с мочевиной с мочевиной с мочевиной
1 . Y. enterocolitica 287 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
и столбик среды ярко-малинового цвета, и столбик среды
ярко-малинового цвета неполное окрашивание ярко-малинового цвета
столбика в малиновый
цвет
2 . Y. enterocolitica 500 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
и столбик среды ярко-малинового цвета, и столбик среды
ярко-малинового цвета неполное окрашивание ярко-малинового цвета
столбика в малиновый
цвет
3. Y. pseudotuberculosis I Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
и столбик среды ярко-малинового цвета, и столбик среды
ярко-малинового цвета неполное окрашивание ярко-малинового цвета
столбика в малиновый
цвет
4. Y. pseudotuberculosis III Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
и столбик среды и столбик среды и столбик среды
ярко-малинового цвета ярко-малинового цвета ярко-малинового цвета
5. M. morganii 235 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
и столбик среды ярко­ и столбик среды и столбик среды ярко­
малинового цвета ярко-малинового цвета малинового цвета
6 . P. vulgaris HX 19 222 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
ярко-малинового цвета, ярко-малинового ярко-малинового
столбик среды черного цвета, столбик среды цвета, столбик среды
цвета черного цвета, слабое черного цвета
газообразование
7. P. mirabilis 3177 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
ярко-малинового цвета, ярко-малинового ярко-малинового цвета,
столбик среды черного цвета, столбик среды столбик среды черного
цвета черного цвета, слабое цвета
газообразование
8 . K. pneumoniae 3534/51 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
ярко-малинового ярко-малинового ярко-малинового
цвета, столбик среды цвета, столбик цвета, столбик среды
оранжевого цвета, среды оранжевого оранжевого цвета,
наличие в столбике цвета, разрыв среды наличие в столбике
пузырьков газа в столбике пузырьков газа
9. H. alvei 1 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
красно-малинового красно-малинового красно-малинового
цвета, столбик среды цвета, столбик среды цвета, столбик среды
желтого цвета, наличие желтого цвета, наличие желтого цвета, наличие
в столбике пузырьков в столбике пузырьков в столбике пузырьков
газа газа газа
1 0 . P. rettgeri Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
и столбик среды и столбик среды ярко­ и столбик среды
ярко-малинового цвета малинового цвета ярко-малинового цвета
1 1 . K. chinoscleromatis 5046 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
красно-малинового и столбик среды красно-малинового
цвета, столбик среды желтого цвета цвета, столбик среды
желтого цвета желтого цвета

171
Таблица 43. Окончание
№ Тест-штаммы Железо-глюкозо- Контроль
п/ п лактозныйагар Трехсахарныйагар Агар Клиглера-ГРМ
смочевиной смочевиной смочевиной
1 2 . E. coli 3912/ 41 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
(055:K59) и столбик среды и столбик среды и столбик среды
желтого цвета, желтого цвета, желтого цвета,
наличие в столбике наличие в столбике наличие в столбике
пузырьков газа пузырьков газа пузырьков газа
13. E. coli Ewing Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
(O 1 24 K7 2 ) 227 красно-малинового красно-малинового красно-малинового
цвета, столбик среды цвета, столбик среды цвета, столбик среды
желтого цвета, желтого цвета, желтого цвета,
наличие в столбике наличие в столбике наличие в столбике
пузырьков газа пузырьков газа пузырьков газа
14. E. aerogenes 10006 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
и столбик среды и столбик среды и столбик среды
желтого цвета, желтого цвета, желтого цвета,
наличие в столбике наличие в столбике наличие в столбике
пузырьков газа пузырьков газа пузырьков газа
15. C. freundii 101/57 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
и столбик среды и столбик среды и столбик среды
желтого цвета, желтого цвета, желтого цвета, слабое
почернение среды наличие в столбике почернение среды
в столбике, наличие пузырьков газа в столбике, наличие
в столбике пузырьков в столбике пузырьков
газа газа
16. C. diversus 684 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
и столбик среды и столбик среды и столбик среды
желтого цвета, разрыв желтого цвета, разрыв желтого цвета, разрыв
среды в столбике среды в столбике среды в столбике
17. P. alcalifaciens 1068 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
красно-малинового красно-малинового красно-малинового
цвета, столбик среды цвета, столбик среды цвета, столбик среды
желтого цвета, наличие желтого цвета, наличие желтого цвета, наличие
в столбике пузырьков в столбике пузырьков в столбике пузырьков
газа газа газа
18. S. paratyphi B 8006 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
красно-малинового красно-малинового красно-малинового
цвета, столбик среды цвета, столбик среды цвета, столбик среды
черного цвета, наличие черного цвета, наличие черного цвета, наличие
в столбике пузырьков в столбике пузырьков в столбике пузырьков
газа газа газа
19. S. sonnei «S form» Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
красно-малинового красно-малинового красно-малинового
цвета, столбик среды цвета, столбик среды цвета, столбик среды
желтого цвета желтого цвета желтого цвета
2 0 . S. paratyphi А 225 Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
красно-малинового красно-малинового красно-малинового
цвета, столбик среды цвета, столбик среды цвета, столбик среды
желтого цвета, наличие желтого цвета, наличие желтого цвета, наличие
в столбике пузырьков в столбике пузырьков в столбике пузырьков
газа газа газа
2 1 . V. cholerae Скошенная часть Скошенная часть Скошенная часть
не 01 Р-9741 красно-малинового красно-малинового красно-малинового
цвета, столбик среды цвета, столбик среды цвета, столбик среды
желтого цвета желтого цвета желтого цвета

172
Таблица 44. Выявляемость энтеробактерий на испытуемой и ко н тро льн о й средах при
посеве клинического материала
Выявленные штаммыпри Железо-глюкозо-лактозный Контрольная среда
испытаниях агарс мочевиной Клиглера-ГРМ

Э
О

О
сп

сп
Т

Т
О

О
Количество посевов

С
Количество положительных находок 22 18
S.flexneri 2a 15 15
S. enteritidis 3 3
P. rettgeri 3 -
K.pneumoniae 1 -

Испытания Железо-глюкозо-лактозного агара с мочевиной проводили


в лаборатории Ф Б У З «Центр гигиены и эпидемиологии в Тульской об­
ласти» с использованием музейных, свежевыделенных штаммов, биомате­
риала от больных, шовного и перевязочного материала при исследовании
его на стерильность.
При посеве на среду музейных штаммов энтеробактерий: E. coli, S. sonnei,
S. flexneri, S. enteritidis, K. oxytoca, P. vulgaris, P. rettgeri, C. freundii среда
показала хорошие идентифицирующие свойства по способности микро­
организмов расщеплять мочевину, ферментировать лактозу, глюкозу, об­
разовывать газ и сероводород.
При работе с клиническим материалом испытания показали хоро­
шие идентифицирующие свойства питательной среды Железо-глюкозо-
лактозного агара с мочевиной и предпочтительное ее использование перед
средой Клиглера вследствие ведущего теста по расщеплению мочевины
(табл. 44).
По совокупности биологических свойств Железо-глюкозо-лактозный
агар с мочевиной полностью удовлетворяет всем требованиям, предъяв­
ляемым к аналогичным средам для использования в практике здравоохра­
нения в качестве одной из сред для первичной идентификации микроор­
ганизмов по их способности утилизировать мочевину, ферментировать
лактозу, глюкозу, образовывать газ и сероводород.

6 .4 .3 . П и та тельн ы й агар по Р есселю

Этот агар описан первоначально Russell [160]. В приведенной прописи


среды лакмус заменен на феноловый красный. Эту среду используют для
дифференциации грамотрицательных бактерий кишечной группы, осо­
бенно эшерихий, сальмонелл и шигелл, по их способности ферментиро­
вать глюкозу и лактозу. Образование кислоты в ходе инкубирования
определяют по изменению цвета индикатора фенолового красного в ско­
шенной части (аэробная ферментация) и в столбике среды (анаэробная

173
ферментация). На образование газа в ходе ферментации указывают пу­
зырьки и разрывы среды в столбике. Такие микроорганизмы, как S. typhi,
ферментируют глюкозу, но не лактозу, поэтому сначала на короткое время
скошенная часть закисляется. По мере расхода глюкозы в аэробных усло­
виях выделяющиеся амины снова защелачивают среду. В анаэробных
условиях (в столбике) среда остается кислой.
Зарубежными фирмами [148] выпускается двухсахарный агар по
Ресселю Double Sugar Agar Russell. Среду используют для дифференциа­
ции грамотрицательных бактерий кишечной группы по их способности
ферментировать глюкозу и лактозу с образованием газа или без него.
^ с т а в среды, г/л:
Пептический перевар животной ткани 2,50
Гидролизат казеина 7,5
Мясной экстракт 3,0
Лактоза 10,0
Глюкоза 1,0
Натрия хлорид 5,0
Феноловый красный 0,025
Агар 15,0
В качестве индикатора в питательной среде Double Sugar Agar Russell
используется феноловый красный, поэтому кислая реакция при росте
культур микроорганизмов регистрируется наличием желтого цвета среды;
при подщелачивании индикатор дает усиление красного окрашивания.
В Ф Б У Н ГНЦ ПМБ выпускается питательная среда для первичной
идентификации энтеробактерий сухая (среда Ресселя-ГРМ ), предназна­
ченная для бактериологических исследований в санитарной и клиниче­
ской микробиологии с целью первичной идентификации энтеробактерий.
Среда Ресселя-ГРМ содержит углеводы (лактозу и глюкозу) которые, раз­
лагаясь с образованием кислоты, вызывают изменение цвета индикатора
бромтимолового синего из зеленого в желтый. При подщелачивании ин­
дикатор дает синее окрашивание.
Среда Ресселя-ГРМ имеет следующий состав, г/л:
ПГРМ 12,0
Натрия хлорид 4,0
Лактоза 13,0
Глюкоза 1,0
Бромтимоловый синий 0,03
Агар микробиологический 7,0 ± 2,0
рН от 7,0 до 7,4
Приготовление среды: сухую среду в количестве, указанном на этикетке
для приготовления конкретной серии питательной среды, размешивают

174
Рис. 41. Р о с т тест-штаммов на среде Ресселя-ГРМ. Слева направо: S. flex n eri 1a 8516;
S. paratyphi A-225; E. coli 339 (055:K 59); А. faecalis 415; контроль (незасеянная среда).

в 1 л дистиллированной воды, кипятят 2 мин до полного расплавления


агара, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 6 - 8 мл
в стерильные пробирки и стерилизуют автоклавированием в течение
20 мин при температуре 112°С. Среду в пробирках скашивают, оставляя
столбик высотой 1 5 -2 0 мм. Готовая среда имеет зеленый цвет.
Стерильную среду можно использовать в течение 3 нед при условии ее
хранения при температуре 2-8°C или в течение 3 сут при температуре хране­
ния 18-25°С (хранить пробирки следует в защищенном от света месте).
С п е ц и ф и ч е с к а я ак ти в н о сть . Среда Ресселя-ГРМ обеспечивает рост каж­
дого тест-штамма S. flexneri 1a 8516, S. paratyphi A-225, E. coli 339 (055:K59)
и A. faecalis 415 при посеве по одной бактериологической петле, через 18-20 ч
инкубации при температуре (37 ± 1)°С. При этом рост тест-штамма
S. flexneri 1a 8516 сопровождается изменением цвета столбика среды в жел­
тый и посинением ее скошенной части; рост S. paratyphi A-225 - изменени­
ем цвета столбика среды в желтый с образованием газа и посинением ско­
шенной части среды; E. coli 339 (055:K 59) - изменением цвета всей среды в
желтый с образованием газа в столбике; рост А. faecalis 415 - изменением
цвета всей среды в синий или посинением ее скошенной части (рис. 41).
При бактериологических методах исследований объектов на наличие
энтеробактерий, согласно нормативным документам [59], после взятия,
посева инфицированного материала и последующего инкубирования
чашек с дифференциально-диагностическими средами производится учет
характера роста с отбором 3 - 5 подозрительных колоний на одну из сред
для первичной идентификации - Клиглера, Ресселя, Олькеницкого.
Результаты реакций на таких средах предварительны и требуют изучения
дополнительных ферментативных характеристик, позволяющих опреде­
лить родовую принадлежность выделенных бактерий.

175
6.4.4. Пи т а т е л ь н ы е сред ы Ги с с а с углево д а м и

Углеводные среды применяют для дифференциации бактерий по спо­


собности ферментировать углеводные субстраты.
При ферментации углеводов происходит образование смеси кислот
(молочной, уксусной и др.), которые снижают значение рН. Конечные
продукты ферментации углеводов и спиртов в большинстве случаев - об­
разование, наряду с кислотами, спиртами, альдегидами, и газообразных
веществ (Н 2 и СО 2 ).
Для обнаружения сахаролитических ферментов выделенной культуры
используют ассортимент питательных сред Гисса, называемых «пестрым»
рядом. Короткий «пестрый» ряд Гисса содержит обычно 5 пробирок
со средами, содержащими один из следующих углеводов: глюкозу, лакто­
зу, маннит, мальтозу и сахарозу. При более углубленном исследовании
биохимических свойств изолятов «пестрый» ряд дополняют средами
Гисса с дульцитом, сорбитом и другими углеводами.
Для обнаружения ферментации углеводов в среды Гисса вводят инди­
катор Андреде, ВР-водно-голубой и розоловую кислоту, бромтимоловый
синий и др. Для выявления газообразования в жидких средах применяют
трубки Durhem - поплавки (маленькие трубочки, запаянные с одного
конца). Образующийся газ вытесняет жидкость из поплавков. Пузырьки,
заполненные газом, находятся у запаянного конца трубки [114]. В полу­
жидких средах о процессе газообразования судят по пузырькам, разрывам
или трещинам, появляющимся в толще агара.
В состав сред Гисса обычно входят: пептон 10,0 г/л, натрия хлорид 5,0 г/л,
углевод 5,0-10,0 г/л, индикатор Андреде 10,0 мл/л или 1,0 мл 1,6% раствора
бромтимолового синего, агар 5,0-8,0 г/л. Питательной основой сред для
определения ферментации углеводов является пептонная вода. Мясной
бульон для этой цели не пригоден, так как он может содержать различные
углеводы, а это может привести к получению ложных результатов.
В результате роста бактерий, расщепляющих соответствующий углевод,
среды, содержащие индикатор Андреде, приобретают ярко-розовую окра­
ску, а среды с бромтимоловым синим меняют исходный зеленый цвет на
желтый.
Некоторые производители используют в качестве индикатора бромкре-
золовый пурпурный или индикатор В Р (аурин, анилиновый голубой 1:1).
В этом случае при росте микроорганизмов, ферментирующих углевод,
наблюдается изменение цвета среды с бромкрезоловым пурпурным с пур­
пурного на желтый, с индикатором ВР - с розового на голубовато-фиоле­
товый. Недостаток сред лабораторного изготовления заключается в слож­
ности предварительного приготовления растворов индикатора.

176
В отличие от сред, изготавливаемых в лабораторных условиях, сухие
питательные среды Гисса обеспечивают лучшее качество и сравнимость
проводимых исследований. Преимуществом также является простота из­
готовления.
В Ф Б У Н ГНЦ ПМБ производится сухая питательная среда для иденти­
фикации энтеробактерий (среда Гисса-ГРМ ). Среду Гисса-ГРМ выпуска­
ют в виде отдельных 5 препаратов, в состав каждого из которых входит
или углевод (лактоза, глюкоза, сахароза, мальтоза), или многоатомный
спирт (маннит).
Состав среды Гисса-ГРМ, г/л:
ПГРМ 6,0
Натрия хлорид 3,5
Натрия фосфат двузамещенный 0,2
Бромтимоловый синий 0,04
Агар 3,5 ± 0,5
Концентрация каждого из используемых углеводов: лактозы, глюкозы
сахарозы, мальтозы и многоатомного спирта - маннита составляет - 3,5 г/л.
рН от 7,2 до 7,6
Приготовление среды: сухую среду в количестве, необходимом для при­
готовления конкретной серии питательной среды, размешивают в 1 л дис­
тиллированной воды, кипятят 3 мин до полного расплавления агара,
фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают по 4 мл в стериль­
ные пробирки, стерилизуют автоклавированием при температуре 112°С
в течение 20 мин. Готовая среда сине-зеленого цвета.
Контроль специфической активности среды осуществляют в течение
10 сут после ее приготовления при условии хранения при температуре 2-8°С.
С п е ц и ф и ч е с к а я а к т и в н о с т ь . Питательная среда обеспечивает через
1 8 -2 0 ч инкубации при температуре (37 ± 1)°С при посеве в пробирки по

Таблица 45. Проявление биохимических характеристик при росте тест-штаммов


на средах Гисса-ГРМ
Т е ст -ш т а м м ы Реакция

Г л ю к о за Л а к т о за С ахар о за М а л ь т о за М аннит

S. flexneri 1a 8 5 1 6 К - - К К

S. dysenteriae I 1362 К - - К* -

S. typhi 6 5 К - - К К

E. coli 3 9 1 2 / 4 1 ( 0 5 5 :K 5 9 ) КГ КГ - КГ КГ

P. vulgaris H X 19 2 22 КГ - КГ КГ -

K. pneumoniae 3 5 3 4 / 5 1 КГ К Г* КГ КГ КГ

S. aureus «В и о т к о » К К К К К

Примечание: К - кислотообразование (изменение цвета среды с сине-зеленого на желто-зеленый или


желтый); Г - образование газа (наличие пузырьков в глубине среды или на ее поверхности);«-» - отсутствие
проявления признаков; * - возможна слабаяреакция.

177
Рис. 42. Р о с т тест-штаммов на среде Гисса-ГРМ с маннитом. Слева направо: контроль
(незасеянная среда); K .pneum oniae 3 5 3 4 /5 1 ; P. vulgaris H X 19 222; E. coli 3 912 /4 1 (055: K 59);
S. typhi 65; S. dysenteriae I 1362; S. flexn eri 1a 8516.

одной бактериологической петле из разведения, соответствующего 10 еди­


ницам по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-85 П, соответствую­
щего года выпуска, рост тест-штаммов S. flexneri 1a 8516, E. coli 3912/41
(055: K59), S. dysenteriae I 1362, P. vulgaris HX 19 222, K. pneumoniae
3534/51, S. typhi 65, S. aureus «Виотко» и проявление биохимических
свойств в соответствии с табл. 45.
На рис. 42 представлены результаты биологического контроля среды
Гисса-ГРМ с маннитом.
Для обеспечения питательных потребностей для роста и идентифика­
ции по биохимическим свойствам некоторых высокотребовательных мик­
роорганизмов к готовым средам Гисса добавляют 10-30% стерильной ло­
шадиной сыворотки. При расщеплении углеводов с образованием кисло­
ты среда меняет цвет, а сыворотка сворачивается. Срок наблюдения над
изменением цвета среды при бактериальном росте - 4 8 -7 2 ч.

6 .4 .5 . П итательная среда для качественного определения


ферментации глюкозы (П итательная среда № 6)

При бактериологическом исследовании материала принадлежность


к семейству энтеробактерий устанавливают не только по основным мор­
фологическим признакам и антигенной структуре, но и наличию (или от­
сутствию) определенных биохимических признаков. Одним из основных
идентифицирующих тестов, входящих в минимальный дифференцирую­
щий ряд, является ферментация углеводов. Для этого применяются пита­
тельные среды для качественного определения ферментации глюкозы
энтеробактериями.

178
Физиологические свойства энтеробактерий точно определяет термин
«ферментирующие бактерии», так как они ферментируют углеводы и
утилизируют их в качестве источника энергии, что легко установить
в тесте хью -Лейфсона (способность окислять и/или ферментировать
глюкозу); исследуемые микроорганизмы засевают в 2 пробирки со сре­
дой, содержащей глюкозу; первую инкубируют в аэробных условиях (для
выявления окисления), вторую - в анаэробных (для выявления фермен­
тации) условиях. Используют для дифференцировки бактерий, окисляю­
щих глюкозу (например, псевдомонад) от ферментирующих ее (напри­
мер, энтеробактерий).
Для O F -теста коммерческими фирмами выпускается среда Хью-Лейф-
сона (Hugh Leifson Medium), предназначенная для определения способа
утилизации карбогидратов у микроорганизмов по анаэробному или аэроб­
ному пути (ферментация, окисление или отсутствие утилизации). Состав
среды: пептон 2,0 г/л, натрия хлорид 5,0 г/л, калия гидрофосфат 0,3 г/л,
глюкоза (в растворе) 10,0 г/л, бромтимоловый синий 0,05 г/л, агар 2,0 г/л.
Для использования среды готовят стерильное вазелиновое масло [148].
Ф Б У Н ГНЦ ПМБ для качественного определения ферментации глюко­
зы энтеробактериями в анаэробных и аэробных условиях выпускается
Питательная среда №6 ГРМ. Среда предназначена для контроля микроб­
ной загрязненности нестерильных лекарственных средств и исследований
в санитарной и клинической микробиологии.
Состав, г/л:
ПГРМ 20,0
Дрожжевой экстракт 2,0
Натрия хлорид 3,5
Глюкоза 10,0
Феноловый красный 0,08
рН от 7,0 до 7,4
Приготовление среды: 35,6 г препарата размешивают в 1 л дистиллиро­
ванной воды, кипятят в течение 2 мин, фильтруют через ватно-марлевый
фильтр, разливают по 10 мл в стеклянные пробирки и стерилизуют авто­
клавированием при температуре 121°С в течение 15 мин.
Готовая среда прозрачная, красного цвета. Готовую среду можно ис­
пользовать в течение 14 дней при условии хранения в холодильнике.
Принцип метода - визуальное обнаружение изменения цвета питатель­
ной среды за счет снижения рН в результате ферментации глюкозы куль­
турами, выделенными из исследуемых образцов.
С п е ц и ф и ч е с к а я а к т и в н о с т ь . Питательная среда обеспечивает во всех
засеянных пробирках, содержащих по 10 мл питательной среды, рост тест­
штаммов E. coli ATCC 25922 и E. cloacae ГИСК A-186 через (21 ± 3) ч ин­

179
кубации при температуре (33 ± 2)°С при посеве бактериологической пет­
лей с изменением цвета среды из красного в желтый в аэробных и анаэроб­
ных (под слоем стерильного вазелинового масла) условиях и газообразо­
ванием (рис. 43).

6 .4 .6 . П и т а т е л ь н а я среда д л я о п ределен и я во сстан овлен и я

н и тра то в в н и три ты (П и т а т е л ь н а я среда № 7)

Бактерии, использующие в качестве источника азота нитраты (а таких


много), должны иметь ферментную систему для его восстановления, так
как в конструктивном метаболизме азот участвует только в восстановлен­
ной форме. Таким образом, восстановление нитрата в системе реакций
конструктивного метаболизма, получившее название ассимиляционной
нитратредукции (NO 3 переходит в NH 3 ), очевидно. Оно имеет место всегда
при выращивании на среде с нитратами в качестве единственного источни­
ка азота.
Для выявления микробной нитратредуктазы ставят тест на восстанов­
ление нитрата в нитрит (последний в присутствии ^Ы -диметил-1-наф-
тиламина образует диазосоедине­
ние, которое окрашивает среду в
красный цвет) [112]. Культуру вы ­
ращивают на полужидкой среде, со­
держащей 0,1% нитрата, и добавля­
ют смесь указанного реактива с
сульфаниловой кислотой, наблю­
дая в течение нескольких минут за
развитием красного окрашивания
среды (свидетельствует о присут­
ствии нитрита) (рис. 44).
Среда маннит-нитратная для
определения подвижности фирмы
Pronadisa производства Conda,
(Испания) является полужидкой
средой, позволяющей быстро иден­
тифицировать энтеробактерии на
основании подвижности, утилиза­
ции маннита и восстановления ни­
Рис. 43. Р о с т тест-штамма Е . coli АТСС трата до нитрита [170].
25922 на Питательной среде № 6 ГР М . Состав, г/л:
Слева направо: в анаэробных условиях; в
Казеиновый пептон 10,0
аэробных условиях; контроль (незасеянная
среда). Маннит 7,5

180
Нитрат калия 1,0
Феноловый красный 0,04
Бактериологический агар 3,5
pH 7,6 ± 0,2
Казеиновый пептон - источник
питательных веществ, необходимых
для роста микроорганизмов: азота,
витаминов, минеральных солей и
аминокислот. Маннит - ферменти­
руемый углевод. Нитрат калия -
источник дополнительных пита­
тельных веществ. Микроорганизмы,
способные восстанавливать нитрат,
обладают повышенной подви