МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования «Вятский государственный университет»
Институт биологии и биотехнологии
Кафедра микробиологии

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ, ОБЛАДАЮЩИХ

АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ
ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

Работу выполнила студентка гр. Бб-4101 Новикова Ольга Александровна

Руководитель к.б.н., доцент кафедры микробиологии
Позолотина Надежда Владимировна

Киров 2018
Выпускная квалификационная работа выполнена на кафедре микробиологии
Вятского государственного университета
 Актуальность работы

Нарушение микробиоценоза желудочно-кишечного тракта –

дисбактериозы являются одной из важнейших проблем
современного здравоохранения. Наиболее эффективным и
безопасным методом лечения и профилактики дисбактериозов
является пробиотикотерапия

3
 Актуальность работы (продолжение)

Пробиотические препараты на основе живых микроорганизмов не

всегда эффективны по следующим причинам:

1. Недостаточная защищенность пробиотических микроорганизмов

в агрессивной среде желудка и кишечника;

2. Угнетающее действие собственной кишечной микрофлоры на

микроорганизмы пробиотика

4
 Актуальность работы (продолжение)

В составе метаболитных пробиотиков отсутствуют живые бактерии, но

включаются продукты метаболизма микроорганизмов.

Положительный эффект достигается за счет стимуляции собственной

микрофлоры кишечника, поэтому не возникает проблем приживаемости и
доставки пробиотических микроорганизмов в кишечник.

Для разработки пробиотика метаболитного типа необходимы штаммы

микроорганизмов, обладающие выраженной антагонистической
активностью в отношении разных видов энтеробактерий

5
Цель работы – выделение и идентификация
штаммов микроорганизмов, обладающих выраженной
антагонистической активностью в отношении разных
видов энтеробактерий

6
 Задачи:
1. Выделить из кишечного содержимого здоровых людей микроорганизмы,
обладающие высокой антагонистической активностью.
2. Изучить культурально-морфологические, тинкториальные и биохимические
свойства выделенных микроорганизмов, провести их идентификацию.
3. Изучить антагонизм выделенных культур микроорганизмов в отношении
разных видов энтеробактерий и осуществить выбор штаммов, в культуральной
жидкости которых содержатся метаболиты, обуславливающие антагонистическую
активность.
4. Изучить антагонистические свойства культуральных жидкостей, полученных
после выращивания отобранных антагонистически активных микроорганизмов.
5. Определить уровень антагонистической активности смесей культуральных
жидкостей разных видов микроорганизмов, способных ингибировать рост
энтеробактерий
7
 Характер роста микроорганизмов, выделенных из
кишечного содержимого человека

А В С

А – колонии колиморфных бактерий на среде Эндо; В – колонии энтерококков

на среде Калины; С – колонии лактобактерий на среде MRS-4

8
 Тинкториальные свойства выделенных
микроорганизмов

Морфология колиморфных бактерий, Морфология энтерококков, окраска по

окраска по Граму, х900 Граму, х900

Морфология лактобацилл, окраска по Граму,

х900 9
Антагонистическая активность изолятов лактобацилл
Двухслойная методика по Фредерику

1 – изолят №1; 2 – изолят №2; 3 – изолят №3; 4 – изолят №5

10
 Антагонистическая активность
изолятов микроорганизмов, выделенных на среде MRS-4

Диаметр зоны
Селективная задержки роста
Номер изолятов
питательная среда бактерий E. coli С600,
мм
1 25
2 24
3 10
MRS-4
4 0
5 20
6 0

11
 Антагонистическая активность
изолятов микроорганизмов, выделенных на среде Эндо

Диаметр зоны
Дифференциально-
задержки роста
диагностическая Номер изолятов
бактерий E. coli С600,
среда
мм
1 16
2 0
3 0
4 0
Эндо
5 0
6 13
7 0
8 0
12
 Антагонистическая активность
изолятов микроорганизмов, выделенных на среде Калины

Диаметр зоны
Селективная задержки роста
Номер изолятов
питательная среда бактерий E. coli С600,
мм
1 15
2 0
3 0
Калины 4 0
5 0
6 0
7 0

13
 Идентификация изолятов колиморфных бактерий
с помощью «ENTEROtest 24 N»

Изолят №1 идентифицирован как Escherichia coli 1 с вероятностью

99,25%, изолят №6 как Escherichia coli 6 с вероятностью 95,14%

Стрип «ENTEROtest» при видовой идентификации изолята №1

14
 Ферментация углеводов лактобациллами

1 – Lactobacillus sp. 1; 2 – Lactobacillus sp. 2; 3 – Lactobacillus sp. 3;

4 – Lactobacillus sp. 5; к - контроль
15
 Ферментативная активность энтерококков

Наименование сбраживаемого Способность изолята Enterococcus

субстрата №1 ферментировать субстрат
Лактоза +
Маннитол +
Сорбитол +
Мелибиоза +
Адонитол -
Сахароза +
Аргинин -
Примечания
1 «+» бактерии ферментируют субстрат
2 «-» бактерии не ферментируют субстрат
Образование H2S не происходит.
Выделенный штамм принадлежит к виду Enterococcus faecalis
16
 Спектр и уровни антагонистической активности
культуральных жидкостей выделенных микроорганизмов в
отношении разных видов энтеробактерий

Титр культуральной жидкости …, подавляющей рост микроорганизмов

Тест-штаммы Enteroco
Escherich Escherich Lactobaci Lactobaci Lactobaci Lactobaci
ccus
ia coli 1 ia coli 6 llus sp.1 llus sp.2 llus sp.3 llus sp.5
faecalis
Escherichia
1/16 1/16 1/16 1/64 1/32 1/32 1/16
coli С600
Providencia
1/4 1/4 1/4 1/8 1/32 1/16 1/16
rettgeri
Salmonella
- 1/4 - 1/32 1/8 1/128 1/64
pullorum
Hafnia alvei - 1/8 1/8 1/16 1/16 1/128 1/32
Proteus
- - - 1/64 1/16 1/16 1/16
vulgaris
П р и м е ч а н и е – «-» рост тест-штамма не подавляется
17
 Уровнь антагонистической активности смесей
культуральных жидкостей в отношении Escherichia coli С600

Титр смесей культуральных жидкостей изолятов…,

подавляющих рост Escherichia coli С600
Lactobacillus
Escherichia Escherichia Lactobacillus sp. 3,
Тест-штамм
coli 6 и coli 6 и sp. 3 и Escherichia
Enterococcus Lactobacillus Enterococcus coli 6 и
faecalis sp. 3 faecalis Enterococcus
faecalis
Escherichia
1/4 1/16 1/16 1/16
coli С600

18
 Спектр антагонистической активности смеси
культуральных жидкостей штаммов: Escherichia coli 6,
Enterococcus faecalis и Lactobacillus sp. 3 в отношении
разных видов энтеробактерий

Титр смеси культуральных жидкостей штаммов:

Escherichia coli 6, Enterococcus faecalis и
Тест-штаммы
Lactobacillus sp. 3 подавляющей рост
микроорганизмов
Providencia rettgeri 1/8
Salmonella pullorum 1/8
Hafnia alvei 1/8
Proteus vulgaris 1/8

19
 Антагонистическая активность смеси культуральных
жидкостей исследуемых штаммов в сравнении с
«Хилак форте»

Титр препарата «Хилак

Титр смеси
форте», подавляющий
культуральных
Тест-штаммы рост чувствительных
жидкостей исследуемых
штаммов
микроорганизмов
микроорганизмов
Providencia rettgeri 1/4 1/8
Salmonella pullorum 1/16 1/8
Hafnia alvei 1/8 1/8
Proteus vulgaris 1/8 1/8

20
 Выводы

1. Из кишечного содержимого здоровых людей было выделено 4 штамма

лактобактерий, 2 штамма кишечной палочки и 1 штамм энтерококков,
обладающих выраженной антагонистической активностью в отношении
разных видов энтеробактерий.

2. Результаты изучения культурально-морфологических, тинкториальных и

биохимических свойств позволили идентифицировать полученные изоляты
как Escherichia coli – 2 штамма, Enterococcus faecalis – 1 штамм и 4 штамма
Lactobacillus spp. Полученные штаммы депонированы в коллекции
микробных культур кафедры микробиологии ВятГУ.

21
 Выводы (продолжение)
3. На основании результатов оценки антагонистической активности
свободных от бактерий культуральных жидкостей в отношении разных
видов энтеробактерий осуществлен выбор трех штаммов: Escherichia coli,
Enterococcus faecalis и Lactobacillus sp., обладающих наиболее выраженной
антагонистической активностью.

4. Установлено, что препарат, включающий смесь культуральных жидкостей

трех штаммов: Escherichia coli, Enterococcus faecalis и Lactobacillus sp.,
обладает уровнем антагонистической активности в отношении разных
видов энтеробактерий, сопоставимым с коммерческим пробиотиком
«Хилак форте», что свидетельствует о перспективности использования этих
штаммов при разработке нового пробиотического препарата
метаболитного типа
22
 Практическое предложение

Продолжить исследования, включающие изучение

антагонистической активности культуральных жидкостей
выделенных штаммов в отношении расширенного перечня
разных видов энтеробактерий и оценку безвредности
культуральных жидкостей выделенных штаммов для
млекопитающих

23
Автор выражает благодарность руководителю дипломной работы к.б.н.,
доценту кафедры микробиологии Позолотиной Надежде Владимировне,
а также д.м.н. Маракулину Игорю Вадимовичу за консультативную
помощь при выполнении дипломной работы

Доклад окончен, благодарю за

внимание!

24