Вы находитесь на странице: 1из 33

Идентификация маркеров

каннабимиметиков
в моче методом ВЭЖХ-МС-МС
высокого разрешения
Лабутин Андрей
Томский областной
наркодиспансер
Методы доказательства стр-ры
соединений
◼ 1. хромато-масс-спектрометрия
◼ 2. УФ-, ИК-спектроскопия
◼ 3. ЯМР спектроскопия
◼ 4. встречный синтез (использование
стандартных образцов)
◼ Применение тандемной масс-спектрометрии
пожалуй является единственным методом
доказательства структуры метаболитов СК, по
причине крайне незначительного количества
вещества и сложной матрицы, что делает
невозможным применение таких методов как
ЯМР и ИК, встречный синтез, как метод
доказательства стр-ры, также недоступен в
условиях химико-токсикологических
лабораторий, как по организационным так и
по юридическим причинам.
Преимущества метода ВЭЖХ-мс-мс
для химико-токсикологического
анализа
◼ 1. мягкие варианты ионизации,
позволяющие получить молекулярный
(МН+) ион
◼ 2. лучшая очистка от посторонних
шумов аналитического сигнала
◼ 3. получение дополнительной
структурной информации о веществе.
Основные превращения
каннабимиметиков в организме
◼ - моногидроксилирование (изменение массы на 15.9949
а.е.м),
O ◼ - дигидроксилирование (изменение массы на
31.9898а.е.м),
◼ - замещение фтора на гидроксил (изменение массы на
1.9957 а.е.м),
◼ - карбоксилирование (изменение массы на 29.9741
N а.е.м, и 11.9835 а.е.м для фторалкилированных
психоактивных веществ),
F ◼ - карбоксилирование с укорочением углеродной цепи на
2 атома углерода (изменение массы на 1.9429 а.е.м, и
16.0477 а.е.м для фторалкилированных психоактивных
веществ).
◼ - дезметилирование (изменение массы на 14.0156 а.е.м)
◼ - гидролиз сложноэфирной связи и гидролиз
терминальных амидных групп (молекулярная масса
метаболита определяется исходя из структуры
соединения, находящегося в незаконном обороте,
метаболиты которого требуется определить в
биосредах)
◼ Таким образом, как сами каннабимиметики, так и их метаболиты
зачастую имеют общие фрагменты в структурных формулах, и
похожие схемы распада в источнике ионизации и камере
соударений масс-селективного детектора, что ведет к тому в
спектре метаболитов и нативных веществ присутствуют
идентичные по структуре ионы, несущие информацию о
структуре исходного соединения.
◼ Критерием присутствия идентичных ионов в спектрах нативных
каннабимиметиков и их метаболитов является наличие
идентичных ионов во вторичных спектрах исследуемых ионов,
полученных на тандемном масс-спектрометре, притом разница в
атомных единицах массы не должна превышать 5ppm для ионов
предшественников и 5ppm для ионов-продуктов
Алгоритм поиска метаболитов
каннабимиметиков
◼ 1. поиск на хромато-масс-
спектрограмме образца с помощью
программного обеспечения прибора
осколочных ионов в мс-мс спектрах,
соответствующих наиболее
распространенным фрагментам
известных психоактивных соединений.
(таблица 1)
Таблица характерных
осколочных ионов (фрагмент)
Точная масса Структурная формула
фрагмента (а.е.м) фрагмента
O
145,0396 +
C

N
N
H

O
144,0443 C
+

N
H

O
217,0608 C
+

N
N
OH

O
Алгоритм поиска метаболитов
каннабимиметиков
◼ 2. поиск на хромато-масс-спектрограмме
образца с помощью программного
обеспечения прибора ионов, которые
соответствуют по массе протонированным
ионам метаболитов наиболее известных
психоактивных соединений, в том числе
входящих в Перечень наркотических средств.
При этом молекулярная масса возможного
метаболита определяется исходя из наиболее
распространенных путей метаболизма,
описанных в литературе
Алгоритм поиска метаболитов
каннабимиметиков
◼ 3. вторичные масс-спектры молекулярных
ионов (МН+) обнаруженных в п.2 должны
содержать ионы, соответствующие по брутто
формуле ионам (при расхождении по мол.
массе не более 5ррм), образующимся в ходе
мс-мс эксперимента с нативными веществами
(как с учетом метаболитических изменений
массы приведенных выше, так и без них),
либо каким-либо ионам, приведенным в
таблице 1, либо иным, известным из
литературных данных.
Алгоритм поиска метаболитов
каннабимиметиков
◼ 4. вторичные масс-спектры осколочных
ионов образующихся в ионном
источнике при повышенном
напряжении на фрагменторе от
нативных соединений и от метаболитов,
должны содержать аналогичные
фрагментные ионы (при расхождении
по массе не более 5ррм)и иметь
аналогичный характер фрагментации.
◼ Для целей установления спектральных
характеристик нативных соединений (точные
молекулярные массы, мс-мс спектры высокого
разрешения, пути фрагментации),
предполагается регулярно исследовать
образцы новых психоактивных веществ на
момент изъятия не относящихся к
наркотическим средствам, изымаемые из
незаконного оборота органами ФСКН и МВД
Пример 1. Поиск метаболитов
вещества АМ(N)-2201 в
биологическом образце (моче).
-F

+COOH
O
+OH

N
N

F
◼ Исходя из структуры соединения с учетом
изложенных в п.п. 2 данных можно предположить
что протонированные формы метаболитов будут
иметь следующие мол.массы (приведены только
наиболее вероятные метаболиты):
◼ - 377,1659 (моногидроксиметаболит)
◼ - 373,1547 (С5-карбоксиметаболит)
◼ - 359,1754 (С5-ОН - метаболит - продукт замещения
фтора гидроксигруппой)
◼ - 345,1234 (продукт карбоксилирования с
укорочением углеродной цепи на 2 атома углерода)
Для указанных масс получены следующие
хроматограммы (даны в наложении, окно поиска
5ррм)
Для пика соответствующего протонированной форме вероятного

моногидроксиметаболита получен следующий мс-мс спектр

+
O

N
N

+
O

N
N
OH
+ CH2
O O OH

+
N
N N
H +
N
N H N
H
H CH2
Для пика соответствующих протонированной форме вероятного С5-

карбоксиметаболита получен следующий мс-мс спектр

+
O

+
O

N
N O

OH
O

N +
N O
N
N

+
CH2

◼Ионы с m/z 217,0966 и 227,0811 в масс-спектре С5-карбокси


метаболита могут быть объяснены элиминированием
соответственно молекулы воды и карбонильной группы из
соответствующего фрагмента метаболита.
Для пика соответствующего протонированной форме вероятного

С5-гидрокси метаболита получен следующий мс-мс спектр

+
O

N
N
CH2

+
O

+
O

N
N
N
N OH
H
Для пика соответствующего протонированной форме вероятного
продукта карбоксилирования с укорочением углеродной цепи на 2

атома углерода получен следующий мс-мс спектр

+
O

N
N OH

+ +
O O
O

+
N N
N H
N H
H
Фрагментация нативного соединения

◼ Бутлеровские сообщения. 2014. Т.37. №1


◼ 3-Нафтоилиндазолы и 2-нафтоилбензимидазолы –
◼ новые группы синтетических каннабиноидов: химическая
◼ структура, аналитические характеристики и идентификация
◼ первых представителей в составе курительных смесей,
◼ а также некоторых метаболитов в моче
◼ © Шевырин Вадим Анатольевич, Гофенберг Мария Александровна,
◼ Мелкозеров Владимир Петрович, Неверо Александр Сергеевич,
◼ Ельцов Олег Станиславович, Куприянова Ольга Всеволодовна
◼ и Моржерин Юрий Юрьевич
◼ Как видно полученные данные m/z вторичных
ионов прекрасно совпадают с расчетными
данными, так как разница в массовых числах
наблюдаемых вторичных ионов не превышает
5ррм от их рассчетных значений.
◼ Кроме того общий характер фрагментации
веществ совпадает с описанной в литературе
фрагментацией нативного соединения.
Также была сравнена фрагментация ионов 233.1085 и 145,0396, полученных от
предполагаемых метаболитов и от нативных веществ при повышенном напряжении

фрагментора
◼ Как видно из рисунков, в полученных мс-мс спектрах
присутствуют пики, соответствующие частям
структур наиболее широко распространенных
синтетических каннабимиметиков (как претерпевших
метаболитические изменения, так и нет), также
фрагментация основных ионов в масс-спектрах
метаболита и нативного вещества – совпадают (ионы
233.1085 и 145,0396). Кроме того, по причине
совпадения посчитанных точных масс метаболитов и
масс протонированных молекулярных ионов,
определенных в ходе исследования можно сделать
вывод о наличии метаболитов вещества AM(N)-2201
в исследуемом образце.
Пример 2. Поиск метаболитов
вещества AB-PINACA в
биологическом образце (моче).
CH3
H3C NH2
O
NH O

N
N
CH3
Хрома-масс-спектромма осколочных ионов мс-мс
фрагментации (сверху для ионов 215,1179, снизу для
145,0383) окно поиска 3ррм
◼ установлено что эти ионы образуются из иона-прекурсора
с m/z 332.1968 в спектре которого наряду с указанными
ионами также присутствует ион 286.1906
◼ Анализируя литературные данные и приведенный масс-спектр, можно
сделать вывод, что данное соединение с m/z 332.1968 содержит 1-Н-
пентилиндазольный фрагмент (ионы с m/z 215.1179 и 145.0396),
который, по всей видимости, принадлежит иону с m/z 286.1906, и, в
свою очередь, образуется из псевдомолекулярного ([M+H]+) иона с
m/z 332.1968. Очевидно, что переход 332.1968→286.1906
соответствует потере карбоксильной группы и протона (–46,0062
а.е.м), а структура обнаруженного соединения должна выглядеть
следующим образом:

CH3
H3C OH
O
NH O

N
N
CH3
◼ Данное соединение является метаболитом
синтетического каннабиметика AB-PINACA (MBA(N)-018,
N-(1-карбамоил-2-метилпроп-1-ил)-1-пентил-1H-индазол-
3-карбоксамид) и его образование происходит в ходе
гидролиза терминальной амидной группы исходного
соединения.
◼ Для подтверждения предложенной структуры
проводилась серия анализов образцов мочи, содержащих
синтетический каннабиметик AB-PINACA, при
повышенном напряжении на фрагментаторе масс-
спектрометра, что позволило получить основные
фрагментарные ионы на источнике. Использование этого
подхода позволило получить больше структурной
информации за счет большего количества различных
ионов.
◼ При сравнении фрагментаций ионов 215.1179, и
286.1914, взятых от нативного вещества и от вероятных
метаболитов, можно сделать вывод о правильности
изложенного выше предположения
Сверху мс-мс спектр иона 215 от нативного вещества, снизу мс-мс
спектр от иона 215 предположительного метаболита
Сверху мс-мс спектр иона 286 от нативного вещества, снизу мс-мс
спектр от иона 286 предположительного метаболита
◼ Для поиска метаболитов синтетических каннабиметиков
реализованы два подхода:
◼ – поиск метаболитов известного соединения с
использованием масс-спектра высокого разрешения
второго поколения ионов вероятных метаболитов,
который обеспечивает высокую надежность
определения;
◼ – целевой поиск продукт-ионов, характерных для
наиболее распространенных классов психоактивных
соединений. Данный подход является более
универсальным и позволяет обнаружить соединения,
претерпевшие более глубокие изменения в ходе обмена
веществ (например, гидролиз эфирных или амидных
связей), за счет возможности установления значения
точных масс всех ионов, включая ион-прекурсор, что в
совокупности со знанием масс некоторых
характеристичных фрагментов, их структур и других
литературных данных позволяет сделать вывод о
наличии и предполагаемой структуре метаболитов
психоактивных веществ в анализируемом образце.
◼ Для повседневной работы ПО прибора
позволяет вести библиотеку спектров
точных масс вторичных ионов, с
возможностью автоматизировнной
обработки хроматограмм, что
освобождает от необходимости каждый
раз проводить работу по
идентификации соединений заново.
Пример автоматизированного библиотечного поиска