Деградация белков: АТФ-зависимые протеазы прокариот и 26S-протеасома эукариот.

Механизм распознавания аномальных белков. Система убиквитинирования белков

эукариот. Роль контролируемого протеолиза в регуляции метаболизма у про- и эукариот

Расщепление белков обеспечивают ферменты протеиназы. В клетке

расщепляются отработавшие или “бракованные” белковые молекулы, но не
затрагиваются нужные, функционирующие белки. Это происходит благодаря
тому, что:
 протеиназы с широкой субстратной специфичностью, способные
разрушить любой белок до аминокислот, изолированы от цитоплазмы в лизосомах и вакуолях;
 свободные цитоплазматические протеиназы (сериновые)
узкоспецифичны и расщепляют небольшой набор определенных белков и – гораздо
медленнее – стареющие белки с некоторыми нарушениями пространственной структуры;
 протеиназы в особых цитоплазматических белковых комплексах – протеасомах
способны расщеплять лишь белки, особым образом подготовленные к расщеплению. В
этом случае изолированным компартментом является внутренняя полость протеасомы,
в которой расположено несколько центров с протеолитической активностью.

Обычно внутри лизосом расщепляются долгоживущие белки, преимущественно – связанные с

мембранами и захваченные во время эндоцитоза. В лизосомы способны проникнуть только
специально “помеченные” белки. Механизмы нелизосомального протеолиза используются
для разрушения белков с относительно короткой полужизнью.

АТФ-зависимые протеазы.
за распознавание субстрата у прокариот отвечают сами протеазы, поэтому их
в клетке, как правило, несколько (4-6). Энергозависимые протеазы
представляют собой, как правило, крупные олигомерные комплексы. Для
всех протеаз этого класса с известной структурой протеазные сайты
располагаются во внутренней камере олигомера, вход в которую слишком
мал для большинства нативных (свернутых) белков. Поступление субстрата
внутрь такой полости обеспечивается регульторными АТФазными
доменами (или субъединицами). Не удивительно, что именно АТФазные
субъединицы отвечают за субстратную специфичность. Аминокислотные
последовательности АТФазных субъединиц разных протеаз имеют сходство,
которое может свидетельствовать о сходстве механизмов их действия.
Поскольку распознавание субстратов
осуществляется регуляторными АТФазами, свойства субстратов, приводящие
к их деградации, не зависят от свойств, необходимых для разрезания
пептидных связей. Как только белок распознается и связывается
регуляторным АТФазным доменом, начинается последовательная деградация
полипептидной цепи с разрезами через каждые 5-10 АК. 
У E.coli изучены 4 АТФ-зависимые протеазы:
ClpAP
ClpXP
HflB(FtsH)
Lon
ClpAP ClpXP.
У этих протеаз АТФазная и протеазная активность принадлежат разным
субъединицам, и неудивительно, что эти субъединицы способны действовать
самостоятельно. ClpA и ClpX могут действовать как

шапероны. Гены clpX и clpP составляют оперон, clpA расположен отдельно в

моноцистронном опероне. Оба оперона имеют типичные промоторы
теплового шока.

а - ClpA и ClpX собираются в олигомерные кольца в присутствии АТФ и

действуют как молекулярные шапероны, способствуя рефолдингу некоторых
частично денатурированных белков; б - кольца ClpA или ClpX образуют
комплекс с двумя протеолитическими кольцами ClpP; частично
денатурированные белки поступают в кольца ClpA или ClpX,
"разворачиваются" и поступают в кольца ClpP, где происходит их
протеолитическое расщепление на короткие пептиды

HflB(FtsH) Zn и АТФ-зависимая протеаза,участвующая в деградации

цитоплазматических и мембранных белков, включая RpoH, SecY(часть
аппарата секреции). Единственная АТФ-зависимая протеаза, существенная
для жизни E. coli. В опероне с RpoH-зависимым промотором.

Lon. Деградирует белок N фага λ, ингибитор клеточного деления SulA,

позитивный регулятор биосинтеза капсулы RcsA и др. Кроме специфических
мишеней, Lon деградирует большинство аномальных белков E. coli. Белок –
гомотетрамер, имеет сайты связывания с АТФ и ДНК, причем связывание с
ДНК стимулирует протеазную активность. Транскрибируется с промотора
теплового шока. В белке можно выделить два домена – собственно
протеазный с карбоксильного конца с сериновым остатком в активном сайте
и следующий за ним АТФазный. Экспериментально показано, что эти два
домена могут быть экспрессированы как отдельные полипептиды, смесь
которых функционально соответствует интактной протеазе Lon.
Деградация 80–90% внутриклеточных белков осуществляется в протеасомах, имеющихся как у
прокариот, так и у эукариот.
Протеасома представляет собой комплекс полипептидных цепей-субъединиц, образующих
“бочонок с крышечкой”. Протеасому как с одной, так и с двумя “крышечками” традиционно
обозначают как 26S PR (где S – коэффициент седиментации, выраженный в единицах
Сведберга), хотя константа седиментации протеасомы с двумя “крышечками” равна 30S.

В протеасоме различают:

– коровую часть – 20S CP , “бочонок” из 28 субъединиц, уложенных в стопку из четырех колец;

– регуляторные частицы – 19S RP, “крышечки”. Они могут замещаться другими
(альтернативными) регуляторными частицами или другими мультисубъединичными
белковыми комплексами. Гетерогенность регуляторных частиц и число комбинаций, в которых
они могут присоединяться к коровой части, дают целый набор протеасом с разными
функциями. Тканеспецифичные изоформы полипептидов регуляторных частиц возникают в
результате альтернативного сплайсинга предшественников их мРНК.

(Два внешних кольца коровой части

состоят из полипептидных цепей,
называемых α- субъединицами. Они
образуют физический барьер,
ограничивающий доступ белков во
внутреннюю протеолитическую полость, а
также взаимодействуют с регуляторными
комплексами, влияющими на функции
протеасомы. Пора, образуемая α-
субъединицами, открывается лишь при
активации протеасомы и тогда имеет
диаметр 13 Å.
Два внутренних кольца коровой части
состоят из β-субъединиц, отвечающих за
протеолитическую активность
протеасомы.)

Основная функция коровой части – это протеолиз попавших внутрь протеасомного “бочонка”
белков. Функцией регуляторных частиц является связать именно тот белок, который требует
расщепления, развернуть его и “протолкнуть” в канал коровой части.

Протеасома находится под постоянным контролем. Содержание разных вариантов протеасом

и их локализация в клетке динамично изменяются, подстраиваясь к потребностям клетки и
определенным стрессовым условиям. Содержание конкретного вида протеасомных
субъединиц и целых протеасом зависит, в частности, от пола организма и от типа ткани.
Протеасома постоянно собирается и разбирается, а ее субъединицы постоянно
взаимодействуют со множеством белков, которые ее стабилизируют, регулируют активность,
помогают в узнавании субстратов и т.д.

Протеасомы способны деградировать белки двумя способами:

убиквитин- зависимым и убиквитин-независимым.
Убиквитин (Ub) – небольшой белок, связанные ферментативное присоединение которого дает
возможность белку-субстрату проникнуть внутрь протеасомы.

При убиквитинзависимой деградации цепь полиUb не менее чем из четырех молекул

убиквитина является “меткой”, распознаваемой регуляторными частицами протеасомы.
Обычно полиUb формирует изопептидную связь с ε-аминогруппой лизина в молекуле
расщепляемого белка. При входе в канал “бочонка” протеасомы полипептидная цепь
“помеченного” убиквитином белка разворачивается и протягивается через него, гидролизуясь
до коротких пептидов (от 3 до 25 аминокислотных остатков), которые выходят из
противоположного отверстия канала. Сам убиквитин внутрь протеасомы не заходит, а после
уничтожения «отмеченной» молекулы освобождается и метит другую молекулу.

Механизм распознавания аномальных белков.

Аномальные белки возникают в результате ошибок при синтезе, когда в
цепь встраивается неправильная аминокислота, или в результате
химических повреждений, таких, как окисление боковых цепей
аминокислот. Разнообразные мутантные формы обычных белков также
распознаются в качестве аномальных. Механизм «узнавания» аномальных
или нефункциональных белков неизвестен, скорее всего, важную роль в
нем играют особенности третичной структуры белков, и замена даже
одной аминокислоты сильно снижает устойчивость белка к
внутриклеточному протеолизу. Последнее обстоятельство может
существенно мешать получению микроорганизмов-сверхпродуцентов, у
которых повышенное образование целевого продукта обусловлено
мутациями по соответствующим ферментам. Такие ферменты будут
восприниматься системой узнавания как аномальные и подвергаться
протеолизу, что тормозит биосинтетические процессы, а иногда и рост
микроорганизма. Специфический протеолиз может дополнять регуляцию
по механизму катаболитной репрессии. Решающую роль играет протеолиз
в так называемой SOS-регуляции, т.е. активации SOS-регулона,
включающего около 20 генов, которые индуцируются в ответ на
некоторые повреждения ДНК и образуют продукты, участвующие в ее
репарации. Среди этих продуктов присутствует белок RecA, участвующий
в ряде клеточных процессов является более «быстродействующим»
механизмом и раньше откликается на изменение внешних условий, чем
регуляция биосинтеза этих посредников. Оба уровня регуляции
необходимы для координированного управления биохимическими
процессами в клетке. В свою очередь, процессы регуляции активности
белковых посредников можно разделить на две большие группы:
регуляция активности путем обратимой ковалентной модификации
посредника и регуляция активности без ковалентной модификации
посредника.

Система убиквитинирования белков

Убиквитинлигаза (англ. E3 ubiquitin ligase) — фермент-лигаза, ковалентно
присоединяющий убиквитин к белку-мишени изопептидной связью.
Убиквитинлигазы являются частью системы убиквитинопосредованного
распада белка в протеасомах. Известно, что протеасома расщепляет не
любые белки, а только те, которые были «помечены» убиквитином.
Убиквитинлигазы специфично узнают белки-субстраты и участвуют в их
полиубиквитинировании (присоединении цепочек из молекул
убиквитина), которое, в конечном счёте, приводит к деградации последних
в протеасомах. Кроме этого, убиквитинлигазы осуществляют и другие
модификации белков убиквитином, такие как моноубиквитинирование и
мультиубиквитинирование, которые имеют регуляторное значение.
Механизм убиквитинирования белков.
Процесс убиквитинирования белков происходит в несколько стадий.
Ферменты, катализирующие отдельные его этапы, получили условные
названия:
 Е1 (убиквитинактивирующий фермент),
 Е2 (убиквитинконъюгирующий фермент) и
 Е3 (убиквитинлигаза).

Фермент Е1 АТФ-зависимо активирует убиквитин с формированием

высокоэнергетической тиоэфирной связи между карбоксильной группой
С-концевого остатка глицина убиквитина и остатком цистеина в молекуле
Е1.
Затем активированный убиквитин переносится на молекулу Е2 с
формированием сходной тиоэфирной связи.
Убиквитинлигазы взаимодействуют одновременно с Е2 благодаря Е2-
связывающему домену и с белком-субстратом благодаря
субстратсвязывающему домену. Они осуществляют перенос
активированного убиквитина с Е2 на субстрат либо напрямую, либо через
образование промежуточного тиоэфирного соединения.
Чаще всего убиквитин-лигазы катализируют образование изопептидной
связи между карбоксильной группой С-концевого остатка глицина
убиквитина и ε-аминогруппой одного из остатков лизина в белке-мишени,
реже связь образуется между убиквитином и N-концевой аминогруппой
или боковой цепью цистеина белка.
После присоединения первой молекулы убиквитина к субстрату Е3-
ферменты последовательно добавляют ещё несколько молекул, так же
соединяя их изопептидной связью. Эта модификация называется
полиубиквитинированием.
В молекуле убиквитина присутствуют 7 остатков лизина, каждый из
которых может участвовать в образовании изопептидной связи.
Последствия полиубиквитинирования зависят от того, какой из этих
остатков был задействован в формировании цепочки. Так,
полиубиквитиновые цепи, соединённые при участии Lys-48, чаще всего
являются сигналом к протеасомальной деградации (минимальная длина
цепочки — 4 молекулы убиквитина), а образованные через Lys-63 играют
регуляторную роль в эндоцитозе белков(процесс транспорта
макромолекул внутрь клетки ( белков , полисахаридов , полинуклеотидов
и т. д. ) и репарации ДНК. Также выделяют и другие типы модификаций,
катализируемых Е3-ферментами: моноубиквитинирование
(присоединение единственного остатка убиквитина) и
мультиубиквитинирование, или множественное моноубиквитинирование.
Моноубиквитинирование — довольно распространённая регуляторная
посттрансляционная модификация, которая может влиять на способность
белка взаимодействовать с другими молекулами, на его внутриклеточную
локализацию, а также может служить сигналом к его деградации в
лизосомах. Мультиубиквитинирование мембранных белков приводит к их
эндоцитозу и расщеплению в лизосомах. Убиквитинлигазы разделяют на
три семейства в зависимости от структуры домена, связывающего
убиквитинконъюгирующий фермент (E2): убиквитинлигазы, содержащие
HECT-домен(homologous to E6-AP carboxyl terminus), RING-домен (англ.
really interesting new gene) или U-бокс.

Роль контролируемого протеолиза в регуляции метаболизма у про- и

эукариот.
Протеолиз — ферментативный гидролиз белков и пептидов,
катализируется протеолитическими ферментами (пептид-гидролазами,
протеазами) и играет важную роль в регуляции обмена веществ в
организме.
Протеолитические ферменты играют ключевую роль в жизненном цикле
клеток всех организмов, представляющих три основных эволюционных
клеточных домена жизни - бактерии, эукариоты и археи.
Клетки эукариот содержат широкий спектр различных протеиназ,
локализованных практически во всех структурных компанентах клетки и
цитоплазме. Цитоплазматические долгоживущие белки, переносятся
эукариотическими клетками для деградации в лизосомы, а
короткоживущие цитоплазматические белки подвергаются деградации
цитоплазматическими протеолитическими системами. Таким образом, в
клетках эукариот интенсивная протеолитическая деградация белков и
пептидов осуществляется как в лизосомах, так и в цитоплазме.
Деградации белков в лизосомах. Лизосомы являются классическим
компартментом протеолиза, они содержат множество неспецифических
протеиназ различного типа. Во внутриклеточные процессы деградации
белков в значительной степени вовлечены цистеиновые протеиназы, а
также аспартатные, сериновые, металлопротеиназы и их ингибиторы.
Лизосомы, которые находят почти во всех клетках эукариот, крайне
гетерогенны. Существует множество путей, которыми внутриклеточные
белки могут доставляться в лизосомы для последующего протеолиза.
Микро- и макроаутофагии не проявляют селективности и различные
белки, как и другие субстраты, захватываются и доставляются в лизосомы
с одинаковой скоростью. Эндоцитоз, напротив, высоко селективен как в
интернализации белков плазматических мембран, так в последующем
попадании их в лизосомы. Путь импорта белков с участием АТФ для
протеолиза в лизосомах также высокоселективен и поставляет только
цитозольные белки, содержащие пептидный мотив, который
биохимически родственен следующей последовательности аминокислот
Lys-Phe-Glu-Arg-Gln.
Деградация белков в цитоплазме. В отличии от лизосом цитоплазма
содержит протеиназы, высокоспецифичные по отношению к белкам,
которые отбираются в клетке для деградации. Открыты пути деградации
белков, в которых в различных комбинациях принимают участие
олигопептид убиквитин и убиквитиновая система, способная узнавать и
метить белки, подлежащие деградации, АТФ и полиферментный
комплекс, называемый протеасомой, который кроме нескольких типов
протеолитической активности обладает еще и АТФ-азной активностью, а
также шапероны, специфические белки, контролирующие свертывание
(фолдинг) полипептидных цепей, их миграцию и протеолиз. Изменение
скоростей синтеза и распада белков может играть решающую роль в
адаптационных процессах, связанных с дифференцировкой, ростом,
гормональными эффектами, питанием, атрофией и болезнями.
Прокариоты. Внутриклеточный селективный гидролиз белков,
направленный на поддержание низкого базального уровня регуляторных
белков и быстрое удаление мутантных, поврежденных и других опасных
для клетки белков, выполняется специфическими ферментами - АТР-
зависимыми протеиназами. Они объединяют в своей структуре АТРазные
и протеолитические компоненты и относятся к выявленному в 1990-х гг.
суперсемейству ААА+-белков. Исторически первой обнаруженной
энергозависимой протеиназой явилась Lon-протеиназа Escherichia coli. К
настоящему времени в бактериальных клетках выявлено четыре группы
АТР-зависимых протеиназ: Lon (подсемейство LonA), FtsH, ClpAP/XP и
HslUV/CodWX.