микроскопический метод исследования. Важным условием успешного использования этого метода является правильное приготовление мазка из исследуемого материала или бактериальной культуры. Культурой называются микроорганизмы, выращенные на питательных средах в лабораторных условиях.
Техника приготовления мазка
Для работы необходимо иметь чистые и обезжиренные предметные и
покровные стекла. Новые стекла кипятят 15-20 мин в 2-5% растворе соды или мыльной воде, споласкивают водой и помещают в слабую хлороводородную кислоту, затем тщательно промывают водой.
Стекла, бывшие в употреблении и загрязненные красителями или
иммерсионным маслом, можно обработать двумя способами: 1) погрузить на 2 ч в концентрированную серную кислоту или хромовую смесь, а затем тщательно промыть; 2) кипятить 30-40 мин в 5% растворе соды или щелочи. Необработанные стекла можно обезжирить, натерев их мылом, а затем очистить от него сухой тканью.
Внимание! Если стекло хорошо обезжирено, то капля воды растекается
на нем равномерно, не распадаясь на мелкие капли.
Хранят стекла в сосудах с притертыми пробками в смеси Никифорова
(равные объемы спирта и эфира) или в 96% спирте. Из растворов стекла извлекают пинцетом.
Внимание! При работе стекла держат пальцами за грани.
Материал для исследования наносят на предметное стекло
бактериальной петлей, иглой или пастеровской пипеткой. Чаще всего применяют бактериальную петлю (рис. 7), сделанную из платиновой или нихромовой нити длиной 5-6 см. Петлю закрепляют в петледержателе или впаивают в стеклянную палочку. Конец проволоки сгибают в виде кольца размером 1×1,5 или 2×3 мкм. Рис. 7. Игла и петли для посева. 1 - игла; бактериальные петли: 2, 3 - петли приготовлены неправильно; 4 - петля приготовлена правильно
Внимание! Правильно приготовленная петля при погружении в воду и
извлечении оттуда сохраняет водную пленку.
Перед приготовлением мазка рабочую часть петли прожигают в
пламени горелки в вертикальном положении: сначала саму петлю, а затем металлический стержень. Эту манипуляцию проводят и после окончания посева.
Приготовление мазка из культуры, выращенной на жидкой
питательной среде. Обезжиренное предметное стекло прожигают в пламени горелки и охлаждают. На предметное стекло, помещенное на подставку (чашку Петри, штатив), наносят культуру. Пробирку с культурой держат большим и указательным пальцами левой руки. Петлю держат в правой руке. Не выпуская петли, мизинцем правой руки прижимают пробку к ладони и осторожно вынимают ее из пробирки. Движения должны быть плавными и спокойными. Горло пробирки обжигают в пламени горелки. Вводят петлю в пробирку. Охлаждают петлю о стенку пробирки и затем погружают ее в культуру. Вынимают петлю, не касаясь ею стенок пробирки. Закрывают пробку, предварительно проведя ее через пламя горелки. Ставят пробирку в штатив. Петлей наносят культуру на предметное стекло, круговыми движениями равномерно распределяя ее. Затем петлю прожигают в пламени горелки. Мазок оставляют для высыхания.
Внимание! Мазок должен быть равномерно растертым, тонким и
небольшим (с двухкопеечную монету). Приготовление мазка из культуры, выращенной на плотной питательной среде. На подготовленное предметное стекло наносят пастеровской пипеткой или петлей каплю изотонического раствора натрия хлорида (0,9%). Культуру осторожно снимают петлей с агара в пробирке или чашке Петри и эмульгируют в капле на стекле. Приготовленный мазок должен быть равномерным и не густым. При его высыхании на предметном стекле остается слабый налет.
Высушивание мазка
Мазок высушивают на воздухе при комнатной температуре. В случае
необходимости его можно высушить около пламени горелки, держа стекло в горизонтальном положении за края большим и указательным пальцами мазком вверх.
Внимание! При высокой температуре может произойти нарушение
структуры клеток.
Фиксация мазка
Мазки фиксируют после полного высыхания с целью: 1) закрепить
микроорганизмы на стекле; 2) обезвредить материал; 3) убитые микроорганизмы лучше воспринимают окраску. Фиксированный мазок называется препаратом.
Способы фиксации. 1. Физический - в пламени горелки: стекло берут
пинцетом или большим и указательным пальцами и троекратно проводят через верхнюю часть пламени горелки в течение 6 с.
2. Химический - в жидкости: клеточные элементы в мазках из крови и
мазках-отпечатках при действии высоких температур разрушаются, поэтому их обрабатывают одной из фиксирующих жидкостей: а) метиловым спиртом- 5 мин; б) этиловым спиртом - 10 мин; в) смесью Никифорова - 10-15 мин; г) ацетоном - 5 мин; д) парами кислоты и формалина - несколько секунд.
Окраска препаратов
После фиксации приступают к окраске препарата.
Окраску препаратов производят на специально оборудованном столе,
покрытом линолеумом, пластиком, стеклом и т. д. На столе необходимы сосуд с дистиллированной водой; подставка из двух трубочек или палочек, соединенных резиновыми трубками с обеих сторон (для размещения препаратов); пинцеты, цилиндры, пипетки, фильтровальная бумага, набор красителей, емкость для их слива. Стол для окраски должен находиться рядом с водопроводным краном.
Отношение микроорганизмов к красителям называется их
тинкториальными свойствами. В микробиологии широко используют анилиновые красители. Большинство микроорганизмов лучше воспринимает основные красители.
Наиболее употребительны следующие красители: красные (фуксин
Все красители выпускают в виде аморфных или кристаллических
порошков. Из них готовят насыщенные спиртовые и феноловые растворы, а затем для работы используют водно-спиртовые или водно-феноловые растворы красителей. Если при окраске используют концентрированные растворы красителей, то препарат предварительно накрывают фильтровальной бумагой, на которую наносят краситель. При этом кусочки красителя остаются на бумаге.
Внимание! Каплю красителя наносят пипеткой так, чтобы он покрыл
весь препарат.
Простой метод окраски
Препарат помещают на подставку для окраски, исследуемым
материалом вверх. Пипеткой наносят на него раствор красителя. По истечении указанного времени краситель осторожно сливают, препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. При простом методе используют один краситель. Метиленовым синим и щелочным синим Леффлера окрашивают препарат в течение 3-5 мин, фуксином Пфейффера - 1-2 мин (см. рис. 4).
На окрашенный и высушенный препарат наносят каплю иммерсионного
масла и микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Сложные методы окраски
Окраска по Граму (универсальный метод). Наиболее
распространенным методом дифференциальной окраски является окраска по Граму.
В зависимости от результатов окраски все микроорганизмы делят на две
группы - грамположительные и грамотрицательные. Грамположительные бактерии содержат в клеточной стенке магниевую соль РНК, которая образует комплексное соединение с йодом и основным красителем (генциановым, метиловым или кристаллическим фиолетовым). Этот комплекс не разрушается при действии спирта, и бактерии сохраняют фиолетовый цвет.
Грамотрицательные бактерии не способны удержать основной
краситель, так как не содержат магниевой соли РНК. Под действием спирта краситель вымывается, клетки обесцвечиваются и окрашиваются дополнительным красителем (фуксином) в красный цвет.
1. На препарат накладывают бумажку по Синеву и наносят несколько
капель воды или раствор генцианового фиолетового. Окрашивают 1-2 мин. Снимают бумагу или сливают краситель.
2. Не промывая водой, наносят раствор Люголя до почернения (1 мин),
затем краситель сливают.
3. Не промывая водой, наносят 96% спирт до отхождения красителя (30-
60 с). Можно опустить препарат в стаканчик со спиртом на 1-2 с.
4. Промывают препарат водой.
5. Докрашивают фуксином Пфейффера 3 мин, промывают водой и
высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Окраска по Цилю - Нильсену (для кислотоустойчивых бактерий).
Этот метод применяют для выявления бактерий туберкулеза и проказы, имеющих в оболочке клеток большое количество липидов, воска и оксикислот. Бактерии кислото-, щелоче- и спиртоустойчивы. Для увеличения проницаемости клеточной стенки первый этап окрашивания проводят при подогревании.
1. Фиксированный препарат покрывают фильтровальной бумагой и
наносят фуксин Циля. Удерживая стекло пинцетом, препарат подогревают над пламенем горелки до отхождения паров. Добавляют новую порцию красителя и подогревают еще 2 раза. После охлаждения снимают бумагу и промывают препарат водой.
раза в раствор или наливая кислоту на стекло, затем несколько раз промывают водой. 3. Окрашивают водно-спиртовым раствором метиленового синего в течение 3-5 мин, промывают водой и высушивают.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы.
Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются в красный цвет, остальные
- в синий (см. рис. 4).
Окраска по Ожешко (выявление спор). 1. На высушенный на воздухе
мазок наливают несколько капель 0,5% раствора хлороводородной кислоты и подогревают до образования паров. Препарат высушивают и фиксируют над пламенем.
2. Окрашивают по способу Циля - Нильсена. Кислотоустойчивые споры
окрашиваются в розово-красный, а бактериальная клетка - в голубой цвет (см. рис. 4).
Окраска по Бурри - Гинсу (выявление капсулы). Этот метод назван
негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.
1. На предметное стекло наносят каплю черной туши, разведенной в 10
раз. В нее вносят каплю культуры. Ребром шлифовального стекла делают мазок, так же как мазок крови, и высушивают.
2. Фиксируют химическим способом спиртом или сулемой. Осторожно
промывают водой.
3. Окрашивают фуксином Пфейффера 3-5 мин. Осторожно промывают и
высушивают на воздухе.
Внимание! Фильтровальной бумагой не пользоваться, чтобы не
повредить препарат.
Микроскопируют с помощью иммерсионной системы. Фон препарата
черный, клетки - красные, капсулы - неокрашенные (см. рис. 4).
Прижизненная окраска микроорганизмов
Для изучения живой культуры используют чаще всего метиленовый
синий и другие красители в больших разведениях (1:10000). Каплю исследуемого материала смешивают на предметном стекле с каплей красителя и накрывают покровным стеклом. Микроскопируют с помощью объектива 40×.
Изучение подвижности микроорганизмов
Для исследования используют культуру бактерий, выращенных в жидкой питательной среде, или взвесь бактерий в изотоническом растворе натрия хлорида.
Метод раздавленной капли. На предметное стекло наносят пипеткой
каплю культуры и покрывают ее покровным стеклом. Чтобы не образовывалось пузырьков воздуха, покровное стекло подводят ребром к краю капли и резко опускают его. Для предохранения препарата от высыхания его помещают во влажную камеру.
Влажная камера представляет собой чашку Петри, на дне которой
находится влажная фильтровальная бумага. На бумагу кладут две спички и на них помещают препарат. Чашку закрывают крышкой.
Микроскопируют при увеличении объектива 40х в темном поле (см.
главу 2).
Метод висячей капли (рис. 8). Для приготовления препарата
необходимы стекло с лункой, покровное стекло и вазелин. Края лунки покрывают тонким слоем вазелина.
Рис. 8. Камера с висячей каплей
На покровное стекло наносят каплю культуры. Затем осторожно
накрывают покровное стекло стеклом с лункой так, чтобы капля оказалась в центре. Склеившиеся стекла быстро переворачивают покровным стеклом вверх. Капля находится в герметической камере и сохраняется долгое время. При микроскопии сначала при малом увеличении (8×) находят край капли, а затем проводят изучение препарата при большом увеличении.
Контрольные вопросы 1. Как приготовить бактериальную петлю?
