Открыть Электронные книги
Категории
Открыть Аудиокниги
Категории
Открыть Журналы
Категории
Открыть Документы
Категории
Классификация сред
Потребность в питательных веществах и свойствах среды у разных видов микроорганизмов
неодинакова. Это исключает возможность создания универсальной среды. Кроме того, на выбор
той или иной среды влияют цели исследования.
В настоящее время предложено огромное количество сред* в основу классификации
которых положены следующие признаки.
1. Исходные компоненты. По исходным компонентам различают натуральные и
синтетические среды.
Натуральные среды готовят из продуктов животного и растительного происхождения. В
настоящее; время разработаны среды, в которых ценные пищевые продукты (мясо и др.) заменены
непищевыми: костной и рыбной мукой, кормовыми дрожжами, сгустками крови и др. Несмотря на
то, что состав питательных сред из натуральных продуктов очень сложен и меняется в
зависимости от исходного сырья, эти среды нашли широкое применение.
К средам такого типа относятся овощные или фруктовые соки, ткани животных, молоко,
отвары мяса, вытяжки почвы, различные части растений, клетки микроорганизмов.
На натуральных средах хорошо развиваются многие микроорганизмы, поскольку такие
среды содержат все компоненты, необходимые для их роста и развития. Однако эти среды имеют
сложный, непостоянный химический состав и мало пригодны для изучения обмена веществ
микроорганизмов, так как в них трудно учесть потребление ряда компонентов и образование
продуктов метаболизма. Натуральные среды используются главным образом для поддержания
культур микроорганизмов, накопления биомассы и для диагностических целей.
Синтетические среды готовят из определенных химически чистых органических и
неорганических соединений, взятых в точно указанных концентрациях и растворенных в дважды
дистиллированной воде. Важное преимущество этих сред в том, что состав их постоянен
(известно, сколько и какие вещества в них входят), поэтому эти среды легко воспроизводимы.
Они широко используются при исследовании обмена веществ, физиологии и биохимии
микроорганизмов.
Наряду с натуральными и синтетическими выделяют полусинтетические среды.
Главными компонентами полусинтетических сред являются соединения известного химического
состава – углеводы, соли аммония или нитраты, фосфаты и др. Однако в них всегда включаются
вещества неопределенного состава, такие как дрожжевой, почвенный, кукурузный экстракт или
гидролизат казеина. Эти среды находят широкое применение в промышленной микробиологии
для получения аминокислот, витаминов, антибиотиков и других важных продуктов
жизнедеятельности микроорганизмов.
2. Состав. Среды делят на простые и сложные.
К простым относят мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), бульон и
агар Хоттингера, питательный желатин и пептонную воду.
Сложные среды готовят, прибавляя к простым средам кровь, сыворотку, углеводы и
другие вещества, необходимые для размножения того или иного микроорганизма.
3. Консистенция (физическое состояние, степень плотности). Среды бывают жидкие,
полужидкие, плотные и сыпучие.
Жидкие среды применяют для накопления биомассы или продуктов обмена, для
исследования физиологии и биохимии микроорганизмов.
Сыпучие среды применяют главным образом в промышленной микробиологии для
культивирования некоторых продуцентов физиологически активных соединений. К таким средам
относятся, например, разваренное пшено, отруби и др.
Плотные среды используют для выделения чистых культур, определения количества
жизнеспособных микроорганизмов, хранения культур в коллекциях, для накопления биомассы и
др.
Плотные и полужидкие среды готовят из жидких, к которым для получения среды
нужной консистенции прибавляют обычно агар-агар желатин или силикагель (кремнекислый
гель).
Агар-агар - полисахарид, получаемый из определенных сортов морских водорослей. Он не
является для микроорганизмов питательным веществом и служит только для уплотнения среды. В
воде агар плавится при 80-100° С, застывает при 40-45° С. Поэтому на агаризованных средах
можно культивировать микроорганизмы при относительно высокой температуре.
Желатин - белок животного происхождения, это экстракт, получаемый из субстратов,
богатых коллагеном – белком костей, хрящей, сухожилий, чешуек.
При 25-30° С желатиновые среды плавятся, поэтому культуры на них обычно выращивают
при комнатной температуре. Плотность этих сред при рН ниже 6,0 и выше 7,0 уменьшается, и они
плохо застывают. Некоторые микроорганизмы используют желатин как питательное вещество -
при их росте среда разжижается. Это свойство желатина ограничивают его применение в качестве
уплотняющего средства.
Силикагель используют как твердую основу для синтетических сред строго определенного
состава.
Кроме того, в качестве плотных сред применяют свернутую сыворотку крови, свернутые
яйца, картофель, среды с селикагелем.
4. Назначение:
а) основные (общеупотребительные) среды служат для культивирования большинства
патогенных микробов. Это МПА, МПБ, бульон и агар Хоттингера, пептонная вода;
б) специальные среды служат для выделения и выращивания микроорганизмов, не
растущих на простых средах. Например, для культивирования стрептококка к средам прибавляют
сахар, для пневмо- и менингококков - сыворотку крови, для возбудителя коклюша - кровь;
в) элективные (избирательные) среды служат для выделения определенного вида
микробов, росту которых они благоприятствуют, задерживая или подавляя рост сопутствующих
микроорганизмов. Так, соли желчных кислот, подавляя рост кишечной палочки, делают среду
элективной для возбудителя брюшного тифа. Среды становятся элективными при добавлении к
ним определенных антибиотиков, солей, изменении рН.
Жидкие элективные среды называют средами накопления. Примером такой среды служит
пептонная вода с рН 8,0. При таком рН на ней активно размножается холерный вибрион, а другие
микроорганизмы не растут;
г) дифференциально-диагностические среды позволяют отличить (дифференцировать)
один вид микробов от другого по ферментативной активности, например среды Гисса с
углеводами и индикатором. При росте микроорганизмов, расщепляющих углеводы, изменяется
цвет среды;
д) консервирующие среды предназначены для первичного посева и транспортировки
исследуемого материала; в них предотвращается отмирание патогенных микроорганизмов и
подавляется развитие сапрофитов. Пример такой среды - глицериновая смесь, используемая для
сбора испражнений при исследованиях, проводимых с целью обнаружения ряда кишечных
бактерий.
Приготовление питательных сред
Основные питательные среды
Наиболее распространенной жидкой средой является мясо-пептонный бульон. Он
готовится на мясной воде
Мясная вода. Мелко нарубленное мясо, освобожденное от жира и сухожилий, смешивают с
двойным по весу количеством воды (500 г+1 л воды), настаивают 24 часа при комнатной
температуре, фильтруют через кусок полотна и тщательно отжимают мясо, оставшееся на нем.
Мясная вода представляет собой красноватую жидкость кислой реакции. Она содержит
растворимые белковые вещества (альбумины), экстрактивные вещества и некоторые соли.
Мясную воду кипятят до свертывания белка и фильтруют через бумажный фильтр. При
необходимости сохранить мясную воду ее разливают по флаконам или бутылкам и стерилизуют в
автоклаве при 120° в течение 20 минут (см. стр. 74). В настоящее время также широко
применяется способ горячей экстракции фарша без замачивания его в холодной воде. Мясной
фарш с водой прогревают 1/2 часа, не доводя до кипения, а затем уже кипятят 1 час. Этим методом
лучше пользоваться в летнее время.
Приготовление мясо-пептонного бульона. Бульон готовят из мясной воды, к которой для
повышения питательных свойств прибавляют пептон (1%) и хлористый натрий (0,5%), т. е. на 1 л
мясной воды берут 10 г пептона и 5 г хлорида натрия. Смесь кипятят 10—15 минут при
постоянном помешивании. При этом пептон и соль растворяются. Полученный бульон имеет
кислую реакцию, при которой большинство патогенных микробов не дает роста.
Необходимо поэтому сделать реакцию слабо щелочной.
Приготовление мясо-пептонного агара. К мясо-пептонному бульону прибавляют от 2 до
4% (в зависимости от сорта) мелко нарезанного агар-агара и кипятят до полного растворения.
Затем дают остыть до 50° и прибавляют для просветления яичный белок (на 1 л агар берут
взбитый и размешанный с небольшим количеством воды белок одного яйца), хорошо взбалтывают
и помещают на 4—5 минут в автоклав. Белок во время кипячения свертывается и увлекает за
собой взвешенные частицы. Полученную мутную жидкость фильтруют в горячем виде через вату,
смоченную горячей водой. Можно обойтись и без яичного белка, но агар получается недостаточно
просветленным. Горячий профильтрованный агар разливают в пробирки по 5— 8 мл или в колбы
по 50—500 мл и стерилизуют в автоклаве 20 минут при 120—125°. После стерилизации пробирки
с еще жидким агаром следует положить почти горизонтально, чтобы агар застыл в скошенном
положении с большой поверхностью, или дать ему застыть в виде столбика.
Среда Эндо. Готовится непосредственно перед употреблением. К 100 мл мясо-пептонного
агара (pH 7,6) стерильно добавляют 1 г химически чистой лактозы, растворенной в 5 мл
стерильной воды, охлаждают до 70° и добавляют смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного
фуксина и 1,25 мл свежеприготовленного 10% раствора сернистокислого натрия, взбалтывают и
разливают по чашкам. Для подсушивания открытые чашки помещают на 30 минут в термостат при
37°.
На среде Эндо кишечная палочка дает колонии красного цвета с металлическим оттенком, а
бактерии тифозно-паратифозной и дизентерийной группы — бесцветные колонии (см. рис. 77 на
вклейке).
Сухие питательные среды
Применение сухих питательных сред приобретает все большее практическое значение.
Стандартность, простота хранения, транспортировки и изготовления делают сухие питательные
среды весьма удобными для работы.
Сухие питательные среды представляют собой светло-желтые гигроскопические порошки
без комков, с влажностью до 10%. В сухом месте, в хорошо закупоренной посуде их можно
хранить длительное время. Они должны хорошо растворяться в дистиллированной воде при
комнатной температуре в концентрации 1,5—6%.
Фильтрование и разливка питательных сред
Жидкие питательные среды и расплавленную желатину фильтруют либо через складчатый
фильтр из фильтровальной бумаги, предварительно смоченной водой, либо через фильтровальное
полотно, накладываемое на стеклянную воронку. Практичнее пользоваться полотняными
фильтрами, ибо они могут служить долгое время, тогда как бумажные фильтры употребляются
лишь однократно. Для фильтрования агаровых сред применяют ватно-марлевый фильтр. Агар
наливают на фильтр горячим. После фильтрования питательные среды разливают в посуду
(флаконы, пробирки).