SELECCIÓN DE CONDICIONES DE CULTIVO QUE INTERVIENEN EN LA

PRODUCCIÓN DE BIOSURFACTANTES POR PENICILLIUM SP. EN

PRESENCIA DE FENANTRENO.

M. Antonia Luna Velasco

CINVESTAV-IPN
Fernando García Esparza
CINVESTAV-IPN
J. Alfredo Salazar Montoya
CINVESTAV-IPN
R. Olivia Cañizares Villanueva
CINVESTAV-IPN
M. del Carmen González Chávez
Colegio de Posgraduados en Ciencias Agrícolas
Refugio Rodríguez Vázquez (*)
Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Dpto. Biotecnología y Bioingeniería.
Ingeniero Químico Industrial, ESIQUIE-IPN. Maestra en Ciencias en Química Orgánica, Dpto. de
Química del CINVESTAV-IPN. Ph. D. Forest & World Sciences, Colorado State University, Fort
Collins, Colorado E.U.A. Profesor Investigador Titular, Dpto. Biotecnología y Bioingeniería del
CINVESTAV-IPN. Integrante del Sistema Nacional De Investigadores Nivel-II.

(*) Av. Instituto Politécnico Nacional 2508, Col. San pedro Zacatenco, México D. F. CP. 07360
Tel. +55 5061 3316, Fax +55 5061 3313. e-mail: rerovaz@yahoo.com.mx

RESUMEN

El hongo filamentoso Penicillium sp. fue aislado previamente de un sitio contaminado con
hidrocarburos y se encontró que tiene la habilidad de sintetizar un agente emulsificante
extracelular, cuando se desarrolla en presencia de glucosa y fenantreno como fuentes de carbono.
El objetivo de este estudio fue seleccionar las condiciones de cultivo que influyen en la producción
del biosurfactante y remoción de fenantreno por este hongo.
El compuesto emulsificante presente en el medio de cultivo libre de células, formó emulsiones
estables con el diesel (compuesto hidrofóbico). Se observó que cuando este hongo se desarrolla
en presencia de 300 ppm de fenantreno, se obtiene el mejor índice de actividad emulsificante
(E24= 40%). La producción del biosurfactante por Penicillium sp., fue afectada por la polipeptona y
el sulfato de amonio, observándose un efecto significativo negativo (p<0.0001) por la polipeptona y
un efecto significativo positivo (p<0.0031) por el sulfato de amonio. De acuerdo con la correlación
de variables entre biomasa y la producción del biosurfactante, se observó una correlación negativa
(p<0.0177), por lo que la producción del biosurfactante no está asociada a la biomasa producida.

Palabras clave: biosurfactantes, emulsificación, Penicillium sp., fenantreno

INTRODUCCCIÓN

La producción y el uso de biosurfactantes son de especial importancia por sus aplicaciones

medioambientales en el mejoramiento de la biodisponibilidad de compuestos hidrofóbicos. Algunos
microorganismos (principalmente cepas de bacterias y levaduras) son capaces de producir
biosurfactantes (Banat et al., 2000), que como agentes solubilizantes, dispersantes y
emulsificantes, pueden mejorar el uso de sustratos hidrofóbicos por los microorganismos y
consecuentemente la detoxificación de este tipo de compuestos.
Los reportes sobre la producción de biosurfactantes por hongos son escasos (Ban y Sato, 1993;
Muriel et al., 1996; Spoeckner et al., 1999; Paraszkiewiez, 2002; Camargo de Morais et al., 2003).
Sin embargo, los hongos filamentosos pueden representar una excelente alternativa para inducir la
producción de biosurfactantes, ya que se puede aprovechar su capacidad de desarrollarse y
tolerar altas concentraciones de HAPs como lo han mostrado las cepas aisladas de suelos
contaminados con PAHs (Chávez-Gómez et al., 2003) y las cepas aisladas de residuos orgánicos
(Pérez-Armendáriz et al., 2004). Además en cuestión de aplicaciones biotecnológicas los hongos
filamentosos ofrecen ciertas ventajas sobre otro tipo de microorganismos, debido a que presentan
movimiento de las hifas a través del suelo y se facilita el acceso con los hidrocarburos, no siendo
limitado para un ambiente hidrofóbico (como puede ser con las bacterias (April, et al., 2000)
En investigaciones anteriores se ha observado que la cantidad, calidad y tipo de biosurfantante
producido por los microorganismos, dependen de las condiciones de cultivo nutricionales y
ambientales, así como del microorganismo que lo produce (Cameotra y makkar, 1998). Por lo que
es importante estudiar las condiciones de cultivo que favorezcan la producción de biosurfactantes
y la remoción de fenantreno por Penicillium sp., con el fin de potencializar su capacidad de
degradar HAPs y determinar sus mecanismos de degradación.

MATERIALES Y MÉTODOS

MICROORGANISMO Y CONDICIONES DE CULTIVO

Penicillium sp. fue aislado de un sitio contaminado con hidrocarburos (Chávez-Gómez et al.,
2003). La cepa se conservó en agar papa dextrosa a 4 °C y se resembró cada mes. El inóculo de
las unidades experimentales, se preparó tomando micelio conservado y se incubó en medio
Wunder modificado (Wunder et al., 1997). Los experimentos se realizaron en matraces de 125 mL
con 30 mL de medio de cultivo Wunder modificado, que consiste de lo siguiente: 5 glucosa.H2O, 1
(NH)2SO4, 0.5 MgSO4. 7 H2O, 0.875 KH2PO4, 0.125 K2HPO4, 0.1 CaCl2.H2O, 0.1 NaCl, 0.0001
-1
FeSO4, 0.05 MnCl2.4H2O y 2 polipeptona, todo en gL , se incubaron a 30 °C por cuatro días con
agitación orbital. El inóculo de biomasa a cada unidad experimental fue de 0.04 g equivalentes en
peso seco.

EFECTO DE DIFERENTES CONCENTRACIONES DE FENANTRENO SOBRE EL

DESARROLLO DE PENICILLIUM SP

Se realizaron experimentos con diferentes concentraciones de fenantreno (50, 100, 200, 300, 400,
500 y 600 ppm) en matraces de 125 ml con 30 ml de medio de cultivo Wunder modificado, se
incubaron con agitación orbital a 120 rpm, temperatura de 28°C y por un tiempo de 4 días.
Testigos abióticos. Con el fin de evitar interferencias por efectos abióticos, se corrieron al mismo
tiempo muestras con diferentes concentraciones de fenantreno (50,100, 200, 300, 400, 500 y 600
ppm) y sin el inóculo del hongo. La remoción de fenantreno abiótica se restó a cada uno de los
tratamientos, esto asegura que la remoción es por efecto del hongo.
Testigos sin fenantreno. Se realizó con las mismas condiciones en ausencia de fenantreno

SELECCIÓN DE CONDICIONES DE CULTIVO QUE INFLUYEN EN LA PRODUCCIÓN DE

BIOSURFACTANTES POR PENICILLIUM SP.

Las variables consideradas para estudiar su efecto sobre la producción del biosurfactante por
Penicicillium sp fueron las fuentes de nitrógeno (Polipeptona y (NH4)2SO4), sal de magnesio y
velocidad de agitación.
4
Para determinar el efecto de estas variables se realizó un diseño factorial 2 . Cada factor se
manejó a dos niveles, altos y bajos. Los valores naturales correspondientes a cada valor
codificado, se muestran en la tabla 1.
 Tabla 1: Valores naturales y codificados de los factores del diseño
experimental 24

FACTOR VALOR CODIFICADO

-1 +1
-1 -1
Polipeptona (gl ) 2 4 gl
-1
Sultato amonio (gl ) 1 1.5
-1
Sulfato magnesio (gl ) 0.2 0.5
Velocidad agitación (rpm) 100 200

Cada experimento se realizó con tres repeticiones. Las condiciones de cultivo fueron: temperatura
de 30 °C, tiempo de incubación de 4 días, 30 ml de Medio Wunder modificado con 5 g/l de glucosa
y 300 ppm de fenantreno.

MÉTODOS ANALÍTICOS

Determinación de biomasa.- En todas las muestras se separó el micelio del medio de cultivo por
filtración, al micelio se le extrajo el fenantreno residual con diclorometano. La biomasa se
determinó en peso, después de secarse a 105 °C por 24 horas.
Fenantreno residual.- Al medio libre de células y al micelio se les realizaron extracciones con
diclorometano. Ambos extractos, se evaporaron en rota-vapor y posteriormente se resuspendieron
en acetona grado HPLC. El fenantreno residual se analizó por cromatografía de líquidos de alta
resolución (HPLC) (Lambert et al. 1994). Para determinar el porcentaje de remoción de
fenantreno, se realizó una curva estándar con las mismas condiciones de detección y
posteriormente se realizan los cálculos correspondientes.
Indice de actividad emulsificante.- (E24).- A 4 mL de medio de cultivo libre de células, se le
adicionaron 6 ml de diesel y se agitó mecánicamente (vortex) a alta velocidad por dos minutos.
Las medidas se realizan después de 24 horas. El índice de emulsión (E24) es igual a la altura de la
capa de emulsión, dividida por la altura total y el resultado se multiplica por 100 para obtener una
medida en porcentaje (Cooper y Goldenberg, 1987)
Tensión superficial.- Se midió al medio de cultivo libre de células, utilizando un tensiómetro
modelo 2141, Analite.
El análisis de varianza de los resultados obtenidos en este diseño experimental, se analizaron
mediante el programa estadístico Desing-Expert 6.0.6.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Efecto de diferentes concentraciones de fenantreno sobre el desarrollo de Penicillium sp.

En la figura 1 se presenta el efecto de la concentración de fenantreno sobre el desarrollo de
Penicillium sp. En esta se observa que a partir de 100 ppm de fenantreno se presentan efectos
inhibitorios en un 50% aproximadamente (p<0.05) sobre el desarrollo de Penicillium sp., sí se
compara con el testigo (sin fenantreno). Este efecto es por la presencia del compuesto hidrofóbico,
el cual no es fácilmente biodisponible, por lo que produce supresión en el desarrollo de los
microorganismos y un cambio en el metabolismo (Alexander, 1999).
 6

Biomasa (g/l)
3

0
0 50 100 200 300 400 500 600

Concentración de fenantreno (ppm)

Inicial Final

Figura 1. Efecto de diferentes concentraciones de fenantreno en el crecimiento

de Penicillium sp.

En la figura 2 se presenta la remoción de fenantreno, actividad emulsificante y tensión superficial,

correspondientes a los tratamientos con diferentes concentraciones de fenantreno. Con relación a
tensión superficial no se observaron cambios de este parámetro en el medio de cultivo de los
tratamientos, como se ha encontrado en otros estudios, en los cuales reportan deltas de hasta 40
mN/m en el cambio de tensión superficial (Lang, 2002). Sin embargo, algunos tratamientos
formaron emulsiones estables, cuando se determinó el índice de actividad emulsificante (E24) al
medio de cultivo. El tratamiento con 300 ppm de fenantreno presentó mayor actividad
emulsificante (E24 de 40%). Estos resultados coinciden con lo reportado por Trebau de Acevedo y
Mclnerney (1996); Paraszkiewicz et al. (2002), quienes realizaron estudios con diferentes
microorganismos y determinaron que estos producen un agente emulsificante en el medio de
cultivo, el cual forma emulsiones estables con compuestos hidrofóbicos, pero no disminuye la
tensión superficial del medio de cultivo.
La remoción de fenantreno incrementa conforme incrementa su concentración en el sistema, sin
embargo a 600 ppm se observó que empieza a disminuir la remoción del hidrocarburo. Este
comportamiento se puede atribuir al estrés ocasionado por la alta concentración del hidrocarburo y
como consecuencia de éste, ocurre un cambio en la velocidad del metabolismo del hongo. El cual
pasa por un período de aclimatación en donde se presenta menor biotransformación (King et al,
1998; Rittmann y McCarty, 2001).

200

150

100

50

0
0 50 100 200 300 400 500 600

concentración de fenantreno (ppm)

E24 (%) Tensión superficial (mN/m) Remoción de fenantreno (ppm)

Figura 2. Efecto de diferentes concentraciones de fenantreno en la remoción de

fenantreno, actividad emulsificante y tensión superficial.
Selección de variables que influyen en la producción de biosurfactantes por Penicillium sp.
Los factores estudiados que influyeron en la producción de biosurfactantes por Penicillium sp.
-1
fueron las fuentes N, mostrando que a valores bajos de polipeptona (2 gl ) se produce un efecto
-1
altamente significativo positivo (p<0.0001) y a valores altos de (NH4)2SO4 (1.5 gl ) se presenta un
efecto significativo positivo (p<0.0031) sobre actividad emulsificante (E24) en el medio de cultivo.
En otros trabajos sobre producción de biosurfactantes se ha reportado que el efecto de la
limitación de la fuente de N se correlaciona con un incremento en la producción de biosurfactantes
por algunos microorganismos, Guerra-santos et al. (1984); Spoeckner et al. (1999) y las
concentraciones de N que presentaron efecto sobre la producción de biosurfactantes por
Penicillium sp. se consideran limitantes.
En la remoción de fenantreno estos factores se comportaron de la misma manera que en E24.
Además la velocidad de agitación y el sulfato de magnesio también influyeron significativamente
-
en esta respuesta, mostrando que a valores bajos de ambos factores (100 rpm (p<0.0003) y 0.2 gl
1
(p<0.0001), respectivamente) se produce un efecto positivo en la remoción de fenantreno por
Penicillium sp.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

Con base en los resultados obtenidos se concluyó que la concentración de fenantreno presenta
efectos inhibitorios en el desarrollo de este hongo, sin embargo se observó una correlación
negativa entre la producción de biomasa, actividad emulsificante en el medio de cultivo y remoción
de fenantreno por Penicillium sp. Cuando el hongo se desarrolla en presencia de 300 ppm de
fenantreno, se favorece la inducción del biosurfactante por el hongo. No se observaron cambios en
la tensión superficial del medio de cultivo, por lo que es muy probable que el biosurfactante
producido por Penicillium sp. sea de alto peso molecular. También se concluye que la limitación de
las fuentes de nitrógeno en el medio de cultivo favorece la producción del biosurfactante por
Penicillium sp.

Se recomienda optimizar las variables que intervinieron en la producción de biosurfactante por

Penicillium sp. y con estas condiciones producirlo en un volumen mayor. Posteriormente realizar la
extracción del biosurfactante del medio de cultivo, purificación y su caracterización. Lo anterior es
con el fin de conocer cuales son las propiedades del biosurfactante y así definir el campo de
aplicación biotecnológica al que se puede destinar el compuesto sintetizado por Penicillium sp.

AGRADECIMIENTOS

Los autores expresan su agradecimiento al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología por el

soporte económico para la realización de este trabajo.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Alexander, M. (1999). Biodegradation and bioremediation. (ed) Academic press. P. 98.

April, T. M., Foght, J. M. and Currah, R. S. (2000) Hydrocarbon –degrading filamentous fungi
isolates from flare pit soils in Northern and Western Canada. C. J. Microbiol. 46:38-49.
Ban, T. and Sato, T. (1993) Aqueous microbial biosurfactant solutions exhibiting ultra-low
tension at oil-water interfaces. Dev. Petr. Sci. 39: 115-125.
Banat, I. M., Makka, R. S. and Cameotra S. S. (2000) Potential commercial aplications of
microbial surfactans. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:495-508.
 Camargo de Morais, M. M., Ramos, F. A. S., pimentel, B. C. M., de Morais, M. A. and Filho,
L. J. L: (2003) Production of an extracellular polysaccharide with emulsifier properties by
Penicillium citrinum. World J. Microbiol. Biotechnol. 19: 191-194.
Cameotra, S. S. and Makkar, S. R. (1998). Syntesis of biosurfactants in extreme conditions.
Appl. Microbiol. Biotechnol. 50: 520-529.
Cooper, D. G. and Goldenberg, B. G., (1987). Surface-active agents from two Bacillus
species. Appl. Environ. Microbiol. 53: 224-229.
Chávez-Gómez, B., Quintero, R. R., Rodríguez, V. R., Poggi, V. H., Esparza, G. F. and
Barrera, C. J. (2003). Removal of phenanthrene from soil by bacterial co-cultures and inoculum of
fungi pregrown of sugarcane vagase pith. Bioresource Technol. 89: 177-183.
Guerra-Santos, L. H., Kappeli, O. Fiechter, A. (1984). Pseudomonas aeroginosa
biosurfactant production in continuous culture with glucose as carbon source. Appl. Environ.
Microbiol. 48: 301-305.
King, B. R., Long, M. G. and Sheldon, K. J. (1998) Practical environmental bioremediation:
the field guide. (ed) Lewis Publisher. Washington, D.C.
Lambert, M. S., Sterner, O. K. and Anke, H. (1994). Identification of 1-hydroxypyrene by the
basidiomycete Crinepellis spitaria and identification of pyrenequinones and their hydroxylated
precursos in strai JK375. Appl. Environ. Microbiol. 60: 3597-3601.
Lang, S., (2002) Biological amphiphiles (microbial biosurfactans). Curr. Op. Coll. Interface
Sci. 7: 12-20
Muriel, M. J., Bruque, M. J., olías, M. J. and Jiménez-Sánchez, A. (1996) Production of
biosurfactans by Cladosporium resinae. Biotechnol. Lett. 18: 235-240.
Paraszkiewiez, K., Kanwal, A. and Dlugonski, J., (2002). Emulsifier production by esteroid
trnsforming filamentous fungus Curvularia lunata. Growth and product characterization. J.
Biotechnol. 92: 287-294.
Pérez-Armendariz, B., Rodríguez-Vázquez, R., Loera-Corral, O., Fernández-Linares, L. and
Esparza-García, F. (2004) Bioestimulation of microorganims from sugarcane bagasse pith for
renoval of weathered hydrocarbon from soil. Lett. Appl. Microbiol. 38: 373-377.
Rittmann, E. B. and Mccarty L. P. ( 2001). Environmental biotechnology: principles and
applications. (ed.) McGraw-Hill. New york. Pp. 107-108.
Rosenberg, E. (1986). Microbial surfactans. Crit. Rev. Biotechnol. 3:109-132.
Spoeckner, S., Wray, V., Nimtz, M. and Lang S. (1999) Glycolipids of the smut fungus
Ustilago maydis from cultivation on renewable resources. Appl. Microbiol. Biotechnol. 51: 33-39.
Trebau de Acevedo, G. and McInerney, M. J. (1996). Emulsifying activity in thermophilic and
extremely thermophlic microorganism. J. Ind. Microbiol. 16: 1-7
Wunder T., Marr J., Kremer S. (1997) 1-methoxypyrene and 1,6-dimethoxypyrene: Two
novel metabolites in fungal metabolism of polycyclic aromatic hydrocarbons. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 42: 636-641.