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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO


DEPARTAMENTO DE PATOLOGIA

PROJETO DE PESQUISA PARA PÓS – GRADUAÇÃO

Efeitos do Metil Jasmonato no tratamento do tumor


quimicamente induzido e por implantação subcutânea de
células de melanoma B16F10

Orientador: Prof. Dr. Sérgio Zucoloto

Ribeirão Preto
2010
INTRODUÇÃO

METIL JASMONATO E CANCER

A família dos Jasmonatos consiste em Cis-Jasmonato, Metil Jasmonato (MeJa) e Ácido


Jasmonico. São ácidos graxos, do ciclo das pentanonas, encontradas em plantas do Reino
Unido. Participam da classe dos hormônios de stress das plantas, semelhantes aos
salicilatos (COHEN e FLESCHER, 2009). Estudos mostram que o Jasmonato exógeno
exerce efeito sobre um amplo espectro de processos fisiológicos. Recentemente, foram
apresentadas algumas evidencias de que o MeJa, apresenta atividade anticancerígena em
células humanas, quando observado “in vitro” e “in vivo”. Especificamente, suprime o
crescimento de cultura de células de neuroblastoma humano, induzindo apoptose celular
(TONG, et. al. 2008). Promovendo a indução do inibidor de protease, que é acumulado em
resposta a ferimentos e ataques de patogenicidade (FINGRUT e FLESCHER, 2002). Ao
estudar o processo de sinalização celular, observa-se que o MeJa promove uma diminuição
da fluidez de membrana e ativação das vias extrínseca e intrínseca da apoptose,
aumentando a população de células apoptóticas nas fases G0/G1 e fase S da divisão celular
(YERUVA; ELEGBEDE; CARPER, 2008). O metabolismo bioenergético celular e as
mitocôndrias têm sido reconhecidos como alvo potencial dos agentes anticancerígenos
graças ao número relevante de peculiaridades existentes nesse grupo de células. Os
Jasmonatos participam dessa classe de agentes e interagem diretamente com as
mitocôndrias (GOLDIN, 2008). Apresentaram ação seletiva para células de linfócitos
cancerígenas, não afetando as mitocôndrias de linfócitos normais de humanos (COHEN e
FLESCHER, 2009). Evidencias mostram que o processo de angiogênese geral tenha
ligação não somente ao crescimento tumoral, mas que também desempenha um importante
papel no processo de formação e desenvolvimento de metástases (PINHO, 2005). Neste
âmbito, a antiangiogênese é reconhecida como componente importante da atividade
antitumoral de muitos agentes citotóxicos de uso clinico. Isso faz despertar um grande
interesse na exploração de drogas citostáticas como inibidoras da angiogênese
(MURRAY,).
Estudos demonstram que os efeitos do MeJa sobre a angiogênese, apresentam-se como um novo mecanismo
de ação antitumoral desta substância, e que as doses que produzem o comprometimento funcional da rede
vascular dos tumores são de cem a mil vezes menores do que aquelas que resultam em efeito citotóxico direto
sobre as células tumorais. Induzida por tumor, a formação de novos capilares a partir de vasos sanguíneos já
existentes (angiogênese) é de fundamental importância para seu crescimento e sua propagação metastática.
Com isso, alem de agente antitumoral promissor, o MeJa passa a figurar, como umas das moléculas com
potencial terapêutico, inibindo o processo de angiogênese.

OBJETIVO
O presente estudo tem por objetivo, testar parâmetros de toxicidade ao uso do Metil
Jasmonato no tratamento do câncer. Estudar os mecanismos envolvidos no processo de
inibição da angiogênese tumoral, bem como os fatores quimiopreventivos ao
desenvolvimento de células neoplásicas.

MATERIAIS E MÉTODOS

ANIMAIS
CAMUNDONGOS
Camundongos sob condições de controle livre de patógeno de linhagem Balb/c
padrão (24-28g), e de linhagem C57BL/6J padrão (24-28g) serão fornecidos pela Faculdade
de Medicina da Universidade de São Paulo. Sendo mantidos sob ciclos de luz/escuridão de
12/12h em temperatura controlada (23 ± 1 oC). Serão acondicionados em grupos de cinco
animais por caixa, totalizando 15 camundongos Balb/c e 45 camundongos C57BL/6J
recebendo alimentação na forma de ração padrão e água de torneira ad libitum. Todos os
animais serão mantidos segundo as normas da Comissão de Ética em Experimentação
Animal da FMRP-USP.

METIL JASMONATO
O Metil Jasmonato ou metil, composto de origem vegetal, (1R, 2R)-3-Oxo-2-(2Z)-
2-pentenil-cyclopentanoacetato (metildihidroxijasmonato 96% Sigma Aldrich – Missouri –
USA), fórmula: C13H22O3 e peso molecular de 226.31, será diluído para uso em n-hexano ou
etanol absoluto (Merck) e analisado por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de
massa (CG-MS), como descrito (MUELLER et al., 2006). Amostras de material biológico
associado a MeJa serão extraídas com n-hexano P.A., na proporção de 1:10 v/v. A extração
líquido-líquido será conduzida sob agitação em vórtex Phoenix AP56 durante 1min, depois
a amostra será centrifugada por 5 min a 10.000 rpm em uma microcentrífuga. A fração
orgânica contendo o MeJ será coletada e seca sob fluxo de nitrogênio, o extrato seco será
redissolvido em etanol absoluto e analisado por cromatografia gasosa acoplada à
espectrometria de massa (CG-MS). O espectro obtido será comparado com relatos de
literatura (Schmelz et al., 2003; Mueller et al, 2006). O MeJa, 3 mg/mL será incorporado à
nanopartículas lipídicas a um volume de 500 µL de suspensão de LDE (40 mg de
fosfatidilcolina, 20 mg de oleato de colesterol, 1mg de trioleína e 0,5 mg de colesterol secos
a vácuo, por 16h, a 4ºC). A mistura será agitada à temperatura ambiente por 15 minutos, e
incubada a 4ºC por 72h. A preparação será então dialisada duas vezes contra 200 ml
tampão estéril. A emulsão dialisada será analisada por CG-MS, para determinação da
quantidade de metiljasmonato remanescente na preparação.

DESENHO EXPERIMENTAL

Serão utilizados os mesmos animais para mais de um modelo experimental, sendo


distribuídos de acordo com cada protocolo a ser seguido. Os animais serão randomicamente
escolhidos e divididos em grupos de modo que haja uma evolução progressiva no tempo de
exposição à droga.

TESTE DO MICRONÚCLEO
Para este teste, serão distribuídos três grupos compostos por cinco animais cada
(camundongos Balb/c), machos, pesando entre 24 e 28g. O MeJa será aplicado via
intraperitoneal, sendo 100µl diariamente usando-se seringa descartável com agulha para
insulina. O grupo I receberá o MeJa a 10%. O grupo II a 100% (puro) e o grupo III
avaliado como grupo controle, recebendo apenas veículo (PBS). Será coletado sangue
periférico (veia caudal) e confeccionado duas lâminas de esfregaço de cada animal para
analise do micronúcleo, nos intervalos de 24 e 48 horas, 7 e 28 dias. As lâminas serão
fixadas em metanol por 5 minutos e coradas com Giemsa após 24 horas da fixação. Para
cada lâmina serão contadas 1000 reticulócitos, totalizando 2000 células por animal, em
objetiva de imersão, e a freqüência de células micronucleadas deverá ser registrada.

TESTE DO COMETA
O tratamento dos animais seguirá o mesmo protocolo realizado no teste do
micronúcleo descrito acima, seguindo mesmos animais, mesma dosagem e mesmo período
de tratamento e intervalos de coleta. O sangue periférico será coletado pela veia caudal. As
amostras de sangue serão submetidas ao ensaio do cometa, no qual os eritrócitos serão
lisados, seu DNA relaxado e submetido à eletroforese. O material será fixado e corado com
Brometo de Etídeo. Para obtenção do escore de acordo com o dano encontrado, serão
contadas 100 células por animal em microscópio de fluorescência.

INDUÇÃO QUÍMICA DE LESÕES PRÉ-NEOPLÁSICAS NA MUCOSA COLÔNICA E


ADMINISTRAÇÃO INTRAPERITONEAL DO MEJA.

Grupos de 5 animais cada serão selecionados. Os animais (camundongos linhagem


C57BL/6J padrão 24-28g) receberão 4 sucessivas instilações intraretal de 100µl de solução
de MNNG (Sigma-Aldrich) (5mg/ml), 2 vezes por semana durante 2 semanas, a 3 cm da
margem anal, utilizando uma sonda metálica de 5 cm. Para este experimento, serão
necessários 30 animais, distribuídos em 6 grupos. O MeJa será administrado via
intraperitoneal em solução com volume final de 100 µl/dia, seguindo o esquema descrito na
tabela abaixo:
Grupo (5 animais cada) Concentração da droga Sacrifício Total de animais
1 MeJa 10 %
2 MeJa 100 % 7 dias 15
3 Controle neg. (PBS)
4 MeJa 10 %
5 MeJa 100 % 28 dias 15
6 Controle neg. (PBS)

COLETA E PROCESSAMENTO DO CÓLON:


O cólon será cuidadosamente isolado e retirado. Serão lavados em salina e abertos
longitudinalmente pela borda mesentérica. Cerca de 4 centímetros do cólon serão
congelados a -80°C e 4 centímetros do cólon distal será estendido em placas de papelão
com a mucosa voltada para cima protegida com papel de seda e submerso em formalina
tamponada a 10% por um período mínimo de 24 horas. Após este período, os tecidos serão
retirados da formalina, recortados e processados. Já recortadas as peças serão desidratadas
por submersão em alcoóis de concentrações crescentes (70%, 80%, 90%, 100%) por um
período total de aproximadamente 5 horas. Posteriormente para diafanização do material, as
mesmas serão submersas em banhos de xilol 100% por aproximadamente 1 hora e 20
minutos. Em seguida as amostras serão submersas em banhos de parafina líquida em uma
temperatura de 60°C por um período de 4 horas, seguindo então para inclusão em blocos,
onde parte da amostra será incluída horizontalmente com a mucosa para baixo, e
verticalmente para obtenção de cortes longitudinais e transversais respectivamente. Os
blocos serão cortados em micrótomo para obtenção de cortes com 5 µm de espessura;
posteriormente serão montados em lâminas. As lâminas serão coradas com Hematoxilina de
Harris por 3 minutos e contracorada com a solução de Eosina Floxina alcoólica por 10
segundos. Para posterior desidratação, a lâmina será submersa em concentrações crescentes
de alcoóis e em seguida diafanizadas em xilol que é meio miscível de Entelan (Merck &
Co. Inc, SA) utilizado para montagem das lâminas.

INDUÇÃO SUBCUTÂNEA DE TUMOR POR INOCULAÇÃO DE CÉLULAS DE


MELANOMA E TUMOR DE COLON (CACO-2) E ADMINISTRAÇÃO DO MEJA

Células Caco-2: Os animais serão divididos em dois grupos contendo 5 animais


cada. Células Caco-2 (câncer colorretal) serão implantadas no tecido subcutâneo de
camundongos C57/BL6, na região dorsal, onde o crescimento tumoral será acompanhado a
cada 4 dias após a inoculação. Constatado o crescimento de massa tumoral, iniciar-se-á o
tratamento com a droga, onde o grupo 1 receberá doses de 100µl de MeJa (grupo tratado), e
o grupo 2 receberá 100 µl de PBS (grupo controle). O período de tratamento será de 4
aplicações em dias consecutivos (4 doses). A mensuração dos tumores será feita antes e
após o tratamento. Ao final do experimento (5º dia após primeira aplicação) os animais
serão sacrificados em câmara de CO2. O tumor e a pele da região serão coletadas,
processadas e incluídas em parafina e os blocos serão cortados serialmente, e usados para
coloração de imunoistoquimica. O procedimento de preparação do material será o mesmo
realizado com os cólons, no estudo da lesão química, descrito acima.
Células de tumor de Melanoma: O mesmo protocolo será utilizado para implantação
de células de tumor de Melanoma, com grupos de mesma quantidade de animais, mesmo
tempo de tratamento e mesmo material a ser analisado.

EUTANÁSIA DOS ANIMAIS

Todos os animais serão sacrificados em câmara de CO2 ao término de cada


protocolo realizado. As amostras/tecidos serão retiradas e encaminhadas para
processamento histológico, conforme descrito acima, seguindo as orientações e exigências
de cada metodologia.

REFERENCIAS:

COHEN, S.; FLESCHER, E. Methyl Jasmonate: a plant stress hormone as an anti-cancer


drug. Phytochemistry. 2009 Sep; 70 (13-14): 1600-9. Epub 2009 Aug 5.

TONG, Q.S.; JIANG, G.S.; ZHENG, L.D.; TANG, S.T.; CAI, J.B.; LIU, Y.; ZENG, F.Q.;
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19(6): 573-81, 2008.

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apoptosis in human cancer cells. Leukemia, 16, p. 608-616, 2002.

YERUVA, L. ELEGBEDE, J.A. CARPER, S.W. Methyl Jasmonate decreases membrane


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BRAVMAN, T.; BRONNER, V.; NOTCOVICH, A.; SHOSHAN-BARMATZ, V.;
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MURRAY, J. C. Angiogenesis Protocols. Methods in Molecular Medicine. Vol. 46. Edited


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FLESCHER, E. Jasmonates in cancer therapy. Cancer Letters 245 (2007) 1–10.

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