Practica 5.

Técnicas de preparación y Esterilización del material que se

usa en Microbiología.

INTRODUCCIÓN

OBJETIVO

METODOLOGÍA
a) Preparación y esterilización de material de vidrio y PDA
1. Lavar material con detergente líquido, enjuagar con abundante agua de la llave y
al final con agua destilada.
2. Secar el material de vidrio de preferencia en horno, si no es posible secar al aire.
3. En las pipetas poner un filtro de algodón en la boquilla y envolver con papel
destraza.
4. Envolver las cajas de Petri y pipetas (investigar)
5. Formar hisopos e introducirlos en un tubo o frasco y tapar.
6. Identificar con nombre y marcar el volumen en el papel de las pipetas.
7. Introducir el material a un horno previamente calentado a 180ºC a 220ºC, esperar
a que la temperatura se estabilice nuevamente y a partir de este momento dejar 2
horas.
8. Preparar medio PDA: 200 g de papa, 16 gramos de dextrosa, y en caso de ser
sólido 16 gramos de agar, todo lo anterior para un litro. Poner a ebullir los 200
gramos de papa en 500 ml de agua durante 20 minutos. Filtrar y llevar el
volumen a 1 litro.

b) Comparación de la esterilización por calor seco y calor húmedo.

1. Rotular uno de los tubos conteniendo un aplicador contaminado con la palabra
Horno y el otro con la palabra Autoclave, anotando además el nombre del
alumno o número de equipo, para su identificación.
2. Esterilizar los cultivos por el método correspondiente, según el rótulo, en ambos
casos a una temperatura de 121 °C y un tiempo de 15 minutos.
3. Después de este período, sacar los tubos y añadirles, en condiciones asépticas,
PDA estéril. Incubar a 37 °C, por 24-48 horas.
4. Después de este período observar si hubo o no desarrollo en los tubos, el cual se
manifiesta mediante turbidez del medio.
5. Anotar los resultados y sacar conclusiones en cuanto al poder de penetrabilidad
del calor seco y del calor húmedo.

c) Comprobación de esterilidad del área aséptica

1. Lavar y desinfectar la mesa, delimitar el área de trabajo y encender el mechero
para crear una zona aséptica. Etiquetar dos cajas de Petri con PDA con los
siguientes datos: a) No. Equipo, día, mes, año, PDA, área aséptica a 10 cm; b)
No. Equipo, día, mes, año, PDA, área aséptica 15 cm.
2. Colocar las 2 cajas de Petri con PDA a 10cm y a 15cm de distancia del mechero
y dejarlas destapadas durante 30 minutos mientras se realizan las actividades de
vaciado y siembra.
3. Después de los 30 minutos de exposición, sellar e incubar invertidas a 37ªC
durante 24 horas.
 4. Al finalizar la incubación revisar, registrar resultados y guardar en refrigeración
para su posterior eliminación.

d) Comprobación de esterilidad de la técnica aséptica

1. Separar dos de las cajas Petri que se esterilizaron previamente y etiquetar con los
siguientes datos: a) No. equipo, día, mes, año, PDA, control de vaciado 1:
aséptica 10 cm; b) No. equipo, día, mes, año, PDA, control de vaciado 2:
aséptica 15 cm.
2. En condiciones de asepsia y de acuerdo a lo marcado por la etiqueta vaciar el
agar PDA contenido en los tubos.
3. Dejar solidificar.
4. Sellar e incubar invertidas a 37ªC durante 24 horas.
5. Al finalizar la incubación revisar, registrar resultados y guardar en refrigeración
para su posterior eliminación

e) Comprobación de la efectividad de la esterilización.

1. Tomar una de las cajas restantes que se vaciaron y ya se encuentran solidificadas
y frías y marcar sobre el reverso de la caja una línea que la divida en dos partes
iguales. Etiquetar cada una de las partes con los siguientes datos: a) No. equipo,
mes, día, año, PDA, bio-indicador no estéril; b) No. Equipo, mes, día, año, PDA,
bio-indicador estéril.
2. A partir del tubo de caldo PDA que fue inoculado antes de la esterilización con
una asada de la suspensión de esporas de Aspergillus Niger, inocular mediante
una estría recta la región que corresponde a “bio-indicador estéril”. Etiquetar de
la misma manera el tubo correspondiente.
3. Inocular en condiciones de asepsia el tubo de caldo PDA sin inocular con
indicador biológico con una asada de la suspensión de esporas de Aspergillus
Niger. Resuspender y tomar una asada a partir del tubo e inocular mediante una
estría recta la región que corresponde a “bio-indicador no estéril”. Etiquetar de la
misma manera el tubo correspondiente.
4. Sellar las cajas e Incubar los dos tubos y las cajas invertidas a 37º C durante 48
horas. Al finalizar la incubación revisar, registrar resultados y guardar en
refrigeración para su posterior eliminación

CUESTIONARIO
1. ¿Qué significa esterilización?
2. ¿Mencione en qué casos se utiliza el calor seco y el calor húmedo para la
esterilización?
3. ¿Qué función tiene la mezcla sulfocrómica en la limpieza del material de vidrio?
4. Definir ¿qué es el punto térmico mortal?
5. ¿Qué es la esterilización por tindalización?
6. ¿Por qué es importante un buen lavado del material de vidrio antes de esterilizarlo?
7. ¿Por qué se recomienda que al final del lavado de material de vidrio se utilice agua
destilada?
8. Indique cuando menos 4 métodos de esterilización y en que casos los emplearía.
9. ¿Cuándo se emplean soluciones ácidas o básicas para la limpieza de material de
vidrio?
10. ¿Por qué deben taparse con algodón los tubos, matraces y pipetas y por qué deben
envolverse o cubrir con papel, cuándo este material va a ser esterilizado?
11. Dibujar y describir un Autoclave y un Horno de calor seco.
12. ¿Qué tipo de material se puede esterilizar en el Horno de calor seco y en el
Autoclave? Dar ejemplos.
13. ¿Cuál es la temperatura y el tiempo que se requieren para lograr la esterilización en
el Horno de calor seco?
14. ¿Por qué es necesario ajustar el tiempo y la temperatura para lograr la esterilización?
15. ¿En qué consisten los métodos de Arnoldización y Pasteurización?