Ingeniería en Alimentos

Ingeniería en Biotecnología
Microbiología General

Trabajo Práctico Nº 9

Cinética de Crecimiento

Unidad 6: Crecimiento microbiano

Profesora: Dra. Graciela Pose.

Auxiliares: Ing. Luisa Franchi

Lic. Marcela Pellegrini

Año calendario: 2010

Objetivos:
1. Que los alumnos se familiaricen con la dinámica de crecimiento de una
población bacteriana.
 Ingeniería en Alimentos
2. Que el alumno sea Ingeniería en Biotecnología
capaz de graficar una Microbiología General
curva de crecimiento,
así como de determinar
el tiempo de generación de un cultivo bacteriano.

Fundamento Teórico: Para construir una curva completa de crecimiento bacteriano

se necesita medir, a diferentes intervalos de tiempo regulares, el tamaño de la
población bacteriana del cultivo en crecimiento. Como este procedimiento llevaría
muchas horas, se ha diseñado el experimento solo para las fases lag y log. La
medición del tamaño de la población bacteriana se llevará a cabo por dos métodos:
I. Indirecto: utilizando el espectrofotómetro. Se mide la turbidez del cultivo
bacteriano a medida que aumenta la masa celular del mismo.
II. Directo: realizando recuento de células viables (UFC/ml), mediante la técnica
de diluciones seriadas.

Desarrollo experimental:

1) Preparar 5 juegos (t0, t40, t80, t120, t160) de Eppendorfs con solución fisiológica
estéril para realizar las diluciones seriadas correspondientes a los distintos
tiempos después de la inoculación. Rotular los tubos estériles desde 10-1 hasta
10-6.
2) Rotular las placas con Agar Nutritivo con el valor de la dilución que se siembran
(considerar el factor de dilución aportado por la alicuota que se toma de la
última dilución)
3) Inocular en medio estéril con un cultivo de fase logarítmica. Medir la DO de una
alícuota de cultivo. La absorbancia inicial a 550-600 nm debe ser cercana a 0.1
(Considerar que una DO de 0.1 equivale aproximadamente a 5.107 UFC/ml
para los cultivos de E.Coli) Utilizar una cubeta con medio de cultivo estéril
como blanco.
4) Realizar los cálculos para las diluciones seriadas del cultivo en estudio que
permitan, a partir de la siembra de 100 µ l de la última dilución, obtener entre
30 y 300 colonias. Sembrar con espátula de Drigalsky la superficie de una
placa de Petri.
5) Mantener el cultivo a 37ºC con agitación y a intervalos de 40 minutos, medir la
absorbancia del mismo a 550-600 nm asegurándose de resuspender
completamente las bacterias antes de tomar cada muestra.
6) Repetir lo indicado en el paso 4 para cada intervalo de tiempo.
7) Incubar a 37ºC durante 24-48 hs todas las cajas de Petri rotuladas con el
tiempo de inoculación y la dilución sembrada en cada caso.
8) Contar las colonias y realizar los cálculos necesarios para obtener la
concentración bacteriana en la muestra original.
9) Graficar:
a) Los log de las absorbancias en las ordenadas y los tiempos de
incubación en las abscisas.
b) Los log de los recuentos bacterianos en las ordenadas y los tiempos de
incubación en la abscisa.
c) Obtener el tiempo de generación del cultivo en las condiciones
ensayadas.