Enzimología Clínica

(Tema 17)

Enzimologí
Enzimología Clí
Clínica.T-
nica.T-17
1. Los enzimas como catalizadores.
• Estructura y naturaleza de los enzimas
• Comportamiento cinético de los enzimas

2.-
2.- Medida de la actividad enzimá
enzimática.
• Fundamento.
• Factores que modifican la actividad enzimática.
• Medida de la actividad enzimática de muestras clínicas
• Instrumentación. Optimización de las condiciones de medida.
• Sistemas acoplados.

3.-
3.- Los enzimas como marcadores de lesió
lesión tisular.
• Enzimas como marcadores de daño celular
• Distribución tisular de los enzimas
• Patrón isoenzimático.

4.-
4.- Enzimas séséricos de importancia diagnó
diagnóstica clí
clínica.
• Transaminasas (ALT, AST)
• α−Amilasa
• Creatín fosfoquinasa (CPK)
• Fosfatasa ácida (ACP)
• Fosfatasa alcalina (ALP)
• Gama glutamil transpeptidasa (GGT)
• Láctico deshidrogenasa (LDH)
• 5’-nucleotidasa (NTP)

1
1. Los enzimas como catalizadores.
• Naturaleza proteica de los enzimas

1. Los enzimas como catalizadores.

™ El que una reacción discurra más o
menos aprisa está en función no solo del
estado energético de los compuestos
antes y después sino también del propio
mecanismo de la reacción.

™ Durante el curso de la reacción es

necesaria la formación de intermedios
reactivos cuyo nivel energético es
superior a la energía media de las
moléculas de los reactivos, lo que en la
práctica hace que la formación de esos
intermediarios suponga una barrera
energética que impide que la reacción
avance.

™ Cuanto mayor es el nivel energético

de los intermedios reactivos tanto
menor es la velocidad.

2
1.2 Velocidad de una reacció
reacción

La velocidad de una reacción (S → P) se define como:

v= -d[S]/dt = d[P]/dt

S→P

Δ [S]
ΔT

Δ [P]
ΔT

1.3 El Comportamiento ciné

cinético de las
reacciones catalizadas por enzimas

3
1.4 Velocidad de una reacció
reacción catalizada por un enzima.
La velocidad de una reacción catalizada por un enzima con cinética enzimática michaeliana
es proporcional a la concentración de substrato, pero es saturable y alcanza un máximo.
Reacción no
enzimática

“Actividad“
Actividad“ y “cantidad”
cantidad” de un enzima en una muestra.

• Actividad de un enzima: moles transformados por unidad de tiempo. Se

expresa en Unidades Internacionales (μmoles transformados/seg).
• Actividad específica de un enzima: actividad enzimática por masa de
enzima (μmoles/seg/mg proteína)
• Concentración: cantidad de enzima por unidad de volumen, o en su defecto
cantidad de actividad enzimática por unidad de volumen

En bioquímica clínica se recurre a expresar la cantidad de enzima de una muestra en

forma de Unidades de actividad enzimá
enzimática por ml.
ml.

4
 2.- La medida de la cantidad de un enzima en una muestra.
2.-

• Fundamento.
• Optimización de las condiciones de medida.
• Medida de la actividad enzimática de muestras clínicas
• Instrumentación.
• Sistemas acoplados

2.1 Medida de la “cantidad”

cantidad” de enzima presente en una muestra:

™ Medida de la cantidad de enzima (proteína) presente

en la muestra. Se utilizan métodos inmunológicos
™ Medida de la actividad catalítica correspondiente al
enzima presente en la muestra. Se utilizan métodos
espectrofotométricos

5
 2.1 Medida de la actividad enzimá
enzimática.
S→P

™ La velocidad de una reacción se puede Δ [S]

expresar bien como moles de substrato ΔT
consumidos, o bien como moles de producto
formado por unidad de tiempo:
v= Δ [S]/ Δ T = Δ [P]/Δ T
Δ [P]
™La formación de producto o desaparición del ΔT
compuesto de partida puede monitorizarse
espectrofotométricamente midiendo cambios
en la absorción óptica de la solución que
contiene los substratos y el enzima ™1 Unidad de actividad
enzimá
enzimática se define
como aquella cantidad de
enzima capaz de
transformar 1 μmol de
Color substrato por minuto.
minuto
Tiempo

2.2 Medida de la actividad enzimá

enzimática...
ΔV≈0
™Las condiciones experimentales para la
medida de la actividad enzimática deben ser
tales que el grado de conversión de substratos
sea pequeño en términos relativos, de manera
que su concentración global apenas cambie.
™Si la concentración de substrato está por
encima de la Km (> 5x), el enzima estará
actuando a su velocidad máxima; aun
habiéndose consumido una fracción del
substrato, la velocidad de reacción del enzime Si [S] >> KM
verá muy poco afectada.
™Si las condiciones de velocidad máxima de la V ≈ Vmax
reacción se mantienen durante la duración del
ensayo, existirá una relación lineal entre la Si [S]= constante
velocidad de reacción y la actividad
enzimática. V ≈ cte.

6
2.3 Medida de la actividad enzimá
enzimática de muestras bioló
biológicas.
™ Por ejemplo, la actividad LDH se mide mediante la reacción:
Piruvato + NADH → Lactato + NAD+

™ Cada mol de piruvato que es convertido en lactato consume un mol de

NADPH, que se transforma en NAD+, por lo que la velocidad de la
reacción es equivalente a la velocidad de formación de lactato, de NAD+
o a la desaparición de piruvato o de NADPH

Δ [S]
ΔT

S→P

Δ [P]
ΔT

™ El NADH absorbe luz de 340 nm, cosa que el NAD+ no hace.

La absorbancia a 340 nm es proporcional a la concentración
de NADH (Ley de Beer), y cambios en la absorbancia a 340
nm se corresponde a cambios en la concentración de NADH.

Absorbancia = ε x concentración x
Absorbancia

recorrido óptico de la luz

A ∝ concentració
concentración (molar)
NAD(P)H

NAD(P)+

7
™ A medida que avanza la reacción y el piruvato se convierte en lactato, hay
un consumo de NADPH, y como consecuencia de ello una disminución en la
absorbancia a 340. La velocidad de la reacción se mide por la variación de la
absorbancia con el tiempo con un espectrofotómetro.

Δ Absorbancia 340 nm Ä
Moles consumidos de NAD(PH)/seg Ä
Absorbancia a 340 nm

actividad enzimática

Tiempo

2.3 Medida de la actividad enzimá

enzimática de muestras bioló
biológicas.

™ En primer lugar se preparan los reactivos y se mezclan en una cubeta de

espectrofotómetro, de manera que las concentraciones de los
substratos (Piruvato y NADH) estén por encima de sus respectivos KM.
™ El enzima se añade al añadir la muestra de suero.
™ Se mide entonces la velocidad de reacción como moles consumidos de
NADPH por minuto.
™ Se expresa este valor en Unidades de Actividad Enzimática (IU)
™ Se refiere dichas unidades al volumen que se había añadido de suero
™ Se expresa el resultado final como Unidades de actividad enzimá
enzimática
por ml de suero.

8
3.-
3.- Los enzimas como marcadores de lesió
lesión tisular (I)

3.1 Caracterí
Características de los enzimas utilizados como marcadores:

• Los enzimas que se utilizan en el diagnóstico son enzimas intracelulares,

cuya concentración en plasma es muy baja.
• Su relación concentración plasma/concentración tejidos es < 1:1000
• La presencia de niveles elevados de enzimas en el suero implica que ha
habido lesión (muerte?) celular lo que permite la salida a la circulación
de enzimas normalmente confinados en el interior de las células.
• La cantidad de actividad enzimática medible depende de su liberación al
medio, de la estabilidad del enzima, de su velocidad de eliminación.
• Se trata de enzimas (o isoenzimas) que se expresan mayoritariamente en
un determinado tejido, pudiendo servir de marcador tisular específico.

3 Los enzimas como marcadores de lesió

lesión tisular (II)

¿por qué
qué aumenta su nivel en plasma...?:
• Necrosis de los tejidos
• Aumento del catabolismo celular (reparación tisular, cáncer)
• Aumento concentración intracelular (inducción)
• Obstrucción en la salida exocrina (α-amilasa)

9
 3 Los enzimas como marcadores de lesió
lesión tisular (III)

3.2 Distribució
Distribución tisular de la actividad enzimá
enzimática de enzimas
con significació
significación clí
clínica

Transaminasas en distintos tejidos

60 AST/GOT

50 ALT/GPT
Unidades/g

40
AST: mitocondria y citosol
30 ALT: citosólica

20
10
0
Hígado Corazón Músculo Cerebro Riñón Páncreas Pulmón Hematíes

10
 Actividad tisular fosfatasa ácida

1200

1000
Unidades/g

800

600

400

200

0
Próstata Riñón Páncreas

Fosfatasa alcalina en tejidos

60
Duodeno
50
Hueso
Unidades/g

40
Hígado
Riñón
30

20

10 Próstata

11
 Creatín fosfoquinasa en tejidos
2500
M.esquel.
2000
Unidades/g

1500

1000
Cerebro
500 Miocardio
M. liso Riñón Hígado
0

Láctico deshidrogenasa en tejidos

M. esquel
160
Hígado
140 Miocardio
120
Riñón
Unidades/g

100 Ganglios
80
Páncreas
60
Eritrocitos
40 Pulmón
20

12
 3.-
3.- Los enzimas como marcadores de lesió
lesión tisular (IV)

3.3 Patró
Patrón isoenzimá
isoenzimático de algunos enzimas con significació
significación clí
clínica

Estructura de la CPK y sus isoenzimas:

isoenzimas:

CPK1 = b2 CPK2 = mb CPK3 = m2

Cerebro corazón m. esquelético

- +
3 2 1

Muestra suero

La CPK está constituida por dos subunidades. Existen dos tipos de subunidades.
diferentes, lo que explica la existencia de tres isoformas son distintas. En los
los tejidos está presente una isoforma distinta.

13
 Estructura de LDH y sus isoenzimas:
isoenzimas:

LDH1 = α4 La LDH está constituida por cuatros subunidades.

Existen dos tipos de subunidades. diferentes, lo
LDH2 = α3β1 que explica la existencia de 5 isoformas son
distintas que poseen una movilidad electroforética
LDH3 = α2β2 diferente que permite distinguirlas. En los los
LDH4 = α1β3 tejidos está presente una isoforma distinta.

LDH5 = β4 - +
5 4 3 2 1

Distribución de los isoenzimas de

láctico deshidrogenasa en tejidos
200
Unidades/g

150
100
50
0
Pulmón
Páncreas
Riñon
M. esquel

4
Eritrocitos

)α 3β
(1
)α 2
Miocardio

(2 2β β3
)α )α 4
Hígado

(3 (4 )β
(5

14
 Patrón isoenzimático de la LDH de suero en infarto de
miocardio y en hepatitis aguda

3.-
3.- Los enzimas como marcadores de lesió
lesión tisular (II)

Magnitud del dañ

daño celular
• Citoplasmático: LDH, ALT, CPK, AP
• Organelas (mitocondrial, microsomal): AST, γGT, 5’ nucleotidasa

Localizació
Localización del dañ
daño celular
• Muy pocos enzimas son específicos de un solo tejidos. Alternativas:
•medida de más de un enzima (p. ej. “perfil hepático”)
•isoenzimas

Alteraciones inespecí
inespecíficas de enzimas sé
séricos.
• Factores dependientes de la edad y sexo
• Factores atribuibles a la conservación de las muestras

15
4.-
4.- Enzimas sé
séricos de importancia diagnó
diagnóstica clí
clínica (I).

•Aspartato aminotransferasa (AST/GOT)

•Valores normales: < 40U/ml
•Aumento importante: Infarto e miocardio, hepatitis, traumatismos
•Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia, hemólisis

•Alanina aminotransferasa (ALT/GPT)

•Valores normales: < 50 U/ml
•Aumento importante: Shock, hepatitis
•Aumento moderado: cirrosis, mononucleosis, ictericia,
• α-amilasa
• Valores normales: <50U/ml
•Aumento importante: pancreatitis aguda y crónica, cáncer de páncreas.
•Aumento moderado: parotiditis, algunos carcinomas, procesos parapancreáticos
(gastritis, úlcera duodenal, peritonitis, obstrucción intestinal.

4.-
4.- Enzimas sé
séricos de importancia diagnó
diagnóstica clí
clínica (II).

•Creatín fosfoquinasa (CPK)

•Valores normales: < 160U/ml en varones y <130U/ml en mujeres
•Aumento importante: Infarto de miocardio (isoenzima CPK-1)
•Aumento moderado: miopatías, distrofia muscular, accidente cerebro-vascular

•Fosfatasa ácida (ACP)

• Valores normales: < 2 U/ml
• Aumento importante: hipertrofia o cáncer de próstata (isoenzima prostático),
hiperparatiroidismo, Hodkin, enf. Paget
• Aumento moderado: enf. Gaucher, insuficiencia renal aguda, hepatitis, ictericia
obstructiva

• Fosfatasa alcalina (ALP)

• Valores normales: 85-190U/ml en el adulto. Hasta 500U/ml en niños en desarrollo
• Aumento importante: ictericia obstructiva, colelitiasis, neoplasia de vías biliares, cirrosis, hepatomas
• Aumento moderado: neoplasias óseas osteogénicas, osteomalacia, enf. Paget, hiperparatiroidismo

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4.-
4.- Enzimas sé
séricos de importancia diagnó
diagnóstica clí
clínica (III).

• Gamaglutamil transpeptidasa (GGT)

•Valores normales: < 35U/ml en varones y <25U/ml en mujeres
•Aumento importante: Hepatitis vírica, obstrucción biliar, metástasis hepáticas, enf. alcohólica
•Aumento moderado: infecciones que afectan al hígado (citomegalovirus, mononucleosis infecciosa)

•Láctico deshidrogenasa (LDH)

• Valores normales: < 120-230 U/ml
• Aumento importante: infarto de miocardio (LDH1), hepatitis víricas (LDH4, LDH5)
• Aumento moderado: hemólisis, accidente cerebro-vascular, distrofia muscular

• 5´ nucleotidasa (NTP)
• Valores normales: <9U/ml en el adulto.
• Aumento importante: colestasis intra o extrahepática, enfermedades hepatobiliares, cáncer hepático
• Aumento moderado:

Enzimas séricos en la enfermedad cardiaca

• Creatín fosfoquinasa (CPK) < 160 U/L (Isoenzima “mb”)

• Láctico deshidrogenasa (LDH) < 120-230 U/L; isoenzima 1
(15-25%).
• Aspartato aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L

Tras el infarto, hay una liberación de proteínas intracelulares de las células

dañadas. La primera en ser detectada es la troponina (5-10 h post infarto),
seguida de la CK-MB (pico a 1 día), y finalmente la LDH, cuyo máximo se alcnza
den los 2-3 días post infarto

17
Enzimas séricos en la enfermedad hepática

• Alanina aminotransferasa (ALT; GPT) < 50 U/L

• Aspartato aminotransferasa (AST; GOT) < 40 U/L
• Lactato deshidrogenasa < 90 U/L (isoenzima 5)
• γ glutamil transpeptidasa (GGT) < 50 U/L
• Fosfatasa alcalina < 70 U/L
• Fosfatasa ácida < 0.6 U/L
• 5’ nucleotidasa < 5 U/L

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