Вы находитесь на странице: 1из 24

Технологии получения геномных

данных

Гудков Денис, к.х.н.


начальник научно-организационного отдела
ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России
gudkovdenis@gmail.com
+7(985) 663 5138
Области применения генетики
▪ Диагностика в терапии онкологических, сердечно-сосудистых и
других заболеваний
▪ Ранняя диагностика моногенных заболеваний
▪ Планирование семьи и пренатальная диагностика (диагностика
хромосомных заболеваний плода по крови матери)
▪ Фармакогенетика
▪ Генетика питания
▪ Спортивная генетика
▪ Профилактика
Потребительская генетика

Количество клиентов (приблизительно), млн.


Растёт интерес популярной
геномики (спорт, питание,
происхождение, здоровье)

Время
Khan, R. & Mittelman, D. Consumer genomics will change your
life, whether you get tested or not. Genome Biol. 19, 120 (2018).
Современные молекулярные исследования
Тенденции:
▪ Растёт мультимодальность
исследований («омикс» –
данные)
▪ Растёт объём информации,
получаемый с одного «омикс»-
направления
▪ Растёт роль компьютерных
технологий в процессе
обработки данных
▪ Появляются новые «омикс»-
направления
▪ Материя рассматривается
«системно»
Постгеномная эра только начинается?
▪ Прочтение ДНК не равно расшифровке самого генома, смысл определяется
контекстом
▪ Геном – не вместилище генов, его работа, как целого мало понятна
▪ Другие «омиксы» – не за пределами генома, многие особенности биосистем,
такие как взаимодействие белков, структура и сетевая динамика,
определяются контекстом генома
▪ Организм – “клеточное государство” со многими геномами
▪ Вся популяция и даже один организм, в этом смысле, содержит “метагеном
своих клеток”
▪ Разочарование в геномоцентрическом детерминизме только
подчёркивает исходный тезис
Медицинские биоинформационные технологии
Миниатюризация прикроватных тестов (РОС) до
микро- и наносистем, совместимых с человеком

Использование ИИ при создании лекарств (AtomNet)

«…AtomNet не может изобрести


новый препарат или даже сказать
наверняка, будет ли комбинация двух
молекул эффективным лекарством.
Но зато он может предсказать,
насколько вероятно определенное
соединение сработает против
определенной болезни.»
Молекулярные средства диагностики

Молекулярные поверхности
Основные исторические события в развитии технологий
Полный геном теперь доступен в клинике
Стоимость генома человека
Развитие геномных технологий

Геномный центр, 2000 год Геномный центр, 2019 год

Геном человека: Геном человека:


15 лет 3 сут.
300 млн. $ 2.5-10 тыс. $
Производители оборудования для генетических исследований

Illumina Inc., США BGI Genomics CO LT., Китай


• капитализация 44.2 млрд.$ • капитализация 25.2 млрд.$
• продажи 2018 – 3.3 млрд.$ • доход 2018 – 0.387 млрд.$
• к концу 2018 продано 13000 приборов • к концу 2018 продано 1100
(в России – 120), включая 600 NovaSeq приборов (30% – в Китае, в
• мировой лидер в области России – 5)
оборудования для геномных
исследований

QIAGEN, Германия
Pacific Biosciences Inc., США Thermo Fisher Scientific Inc., США
• капитализация 8.7 млрд.$
• капитализация 0.7 млрд.$ • капитализация 114.9 млрд.$
• доход 2018 – 0.190 млрд.$
• с 2018 г. – часть Illumina • Продажи Life Sciences 2018 –
6.27 млрд.$ (рост 9%)
• оборудование NGS – 2%
Технология секвенирования Illumina

Подготовка библиотек Кластеризация на проточной ячейке


• Фрагментация ДНК • Взаимодействие с якорями по принципу 3’- …-5’
комплиментарности 5’- G T A T T T T C G G C A C A G
• Репарация концов
• Мостиковая амплификация A G
• Лигирование адаптеров A
C
• Образование кластеров (сначала образуются T T
• Амплификация C T G
кластеры с разнонаправленными фрагментами,
которые вымываются после добавления
рестриктазы) Секвенирование методом синтеза
• Встраивание меченного нуклеотида
1 2 3 4 5 6 7 8 9 (добавляются все 4-е буквы), удаление
TG TACGAT… несвязавшихся оснований
• Детекция сигнала
• Удаление метки, блокирующей цепь
Принцип детекции сигнала
Технология секвенирования BGI
Технология секвенирования cPAS
Амплификация по принципу
«катящегося кольца», 300-500 копий
ДНК Адаптер
Фрагментированная ДНК Пробы (-A, -C, -T, -G)
Наношарики
Добавление проб
Лигирование Якорь

Детекция
Проточная ячейка
Удаление терминатора и краски
Подготовка библиотек Формирование наношариков
• Фрагментация ДНК • Создание наношариков ДНК
• Репарация концов • Загрузка наношариков на проточную ячейку
Секвенирование cPAS
• 50-150 циклов
(несколько миллиардов заряженных участков на
• Лигирование адаптеров • для парноконцевых чтений –
ячейке, присоединение за счет
дополнительная стадия синтеза
• Амплификация электростатических сил, к каждому участку
второй цепи методом MDA (phi29-
присоединяется один наношарик, заполнение
• Получение циклической ДНК полимераза)
около 90%)
Технология секвенирования QIAGEN

Подготовка библиотек Амплификация на шариках


• Фрагментация ДНК • Взаимодействие с якорями по принципу
• Репарация концов комплиментарности
• Лигирование адаптеров • Образование продукта: шарики с 100-200 тыс.
нуклеотидов
• Амплификация

Удаление Детекция Добавление нуклеотидов


блокировки • Флуоресценция • Блокированы с 3’-конца
S. Goodwin et. al. Coming of age: ten years of next-generation • Часть нуклеотидов мечена
sequencing technologies Nature Reviews Genetics, 17, 333–351 (2016) флуорофорами
Технология секвенирования Thermo Fisher

Подготовка библиотек Амплификация на шариках


• Фрагментация ДНК • Взаимодействие с якорями по принципу
• Репарация концов комплиментарности

• Лигирование адаптеров • Образование продукта: шарики с 100-200 тыс.


нуклеотидов
• Амплификация

Детекция – изменение Добавление нуклеотидов


проводимости (pH) • Блокировка и красители отсутствуют

S. Goodwin et. al. Coming of age: ten years of next-generation


sequencing technologies Nature Reviews Genetics, 17, 333–351 (2016)
Другие технологии

Технология Pacific Biosciences


• Секвенирование в реальном времени
Технология Oxford Nanopore
• Полимераза пришита к дну ячейки
• ДНК движется через нанопору за счёт дока ионов и разницы
• Нуклеотиды мечены различными флуоресцентными красителями
потенциалов
• Происходит синтез комплиментарной цепи
• При прохождении нуклеотидов через определённые участки
• При встраивании нуклеотида выделяется свет, который поры меняется сила тока, которая фиксируется детектором
фиксируется детектором
Сравнение технологий
Платформа/задача BGI Illumina Ion Torrent/ PacBio Oxford QIAGEN
Proton Nanopore

Секвенирование de + + - ++ +++ -
novo (редкая задача)
Полногеномное +++ +++ ++ (для небольших + - -
ресеквенирование геномов)
Экзомное секвенирование +++ +++ ++ - - -
Ампликонное секвенирование +++ +++ ++ - - +++ (для
клиники – в
онкологии)
Анализ экспрессии ++ ++ +++ (сквозные - - -
транскрипты – в
онкологии)
ДНК-белковые +++ +++ ++ - - -
взаимодействия (ChIP-seq) и
др.
Метагеномика, анализ ++ ++ + +++ +++ -
разнообразия микробных
сообществ
Объём получаемых данных
Сравнение платформ
GeneStudio S5
Показатель MGISEQ-200 Next Seq 550 MGISEQ-2000 HiSeq 2500
Prime
Производитель BGI Illumina Thermo Fisher BGI Illumina
Чтения Одно/ парноконцевые Парноконцевые Одноконцевые Одно/ парноконцевые Парноконцевые
Длина прочтения max 2x 100 2x 150 1x 200 (чип 550) 2x 150 2x 125
Количество прочтений за запуск 300 млн. 400 млн. 125 млн. 3 млрд. 4 млрд.
Производительность за запуск 60 Гб 120 Гб 25 Гб 1080 Гб (мин.) 1000 Гб (макс.)
Количество полных геномов
- 1 - 12 11
человека за запуск (>Q30)
Количество экзомов человека за
10 12 4 190 180
запуск (>Q100)
Исходное количество ДНК, min 0.5 нг 100 нг 1 нг 0.5 нг 100 нг
Баркоды 128 384 384 128 384
Качество данных Q30  85% Q30  75% Q30  75% Q30  85% Q30  80%
Время секвенирования 48 ч 29 ч 8.5 ч 72 ч 144 ч
Цена за комплект оборудования 21 млн. руб. 43 млн. руб. 30 млн. руб. 65 млн. руб. 96 млн. руб.
Стоимость 1Гб 3 тыс. руб. 4 тыс. руб. 7 тыс. руб. 1.5 тыс. руб. 2 тыс. руб.
Необходимость станции
Нет Да (cBot) Да (Ion Chef) Нет Да (cBot)
пробоподготовки
Возможность работы с чипами Нет Да Нет Нет Нет
Сравнение данных Illumina vs BGI
E704 - MGISEQ 2000 E704 - Illumina
Clean bases 101 372 006 060 94 370 553 940
Identified bases 2 922 954 259 2 866 922 198
Mapping rate 99,85% 99,93%
Unique rate 90,83% 87,20%
Duplicates rate 8,61% 12,26%
Average Depth 32,75 30,48
Технологии генетического скрининга, используемые в РФ в
медицинской (околомедицинской) практике
Производительность (в среднем один
Цель исследования Технология
аналитический цикл)
Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Низкая (10-15 маркеров на пациента/ 2-3 рабочих дня)
+ рестрикционный анализ
ПЦР в реальном времени (Real-Time
Анализ и подтверждение отдельных Средняя (до 30-50 маркеров/ 2-3 рабочих дня)
ПЦР)
генетических маркеров (мутации,
полиморфизмы) Масс-спектрометрическое
Высокая (100-200 маркеров/рабочая неделя)
минисеквенирование
Очень высокая (до 2,5 миллионов маркеров на 4
Анализ на высокоплотных ДНК чипах
пациентов/ 3 рабочих дня)

Анализ известных или поиск новых Капиллярное секвенирование по


Средняя (несколько генов/рабочая неделя)
патогенных вариантов в пределах Сэнгеру
групп целевых генов (таргетное Секвенирование нового поколения
секвенирование) Высокая (панели до 100 генов/ 3 рабочих дня)
(NGS)
Анализ известных или новых
патогенных вариантов в пределах Секвенирование нового поколения
Высокая (от 2 за 3 рабочих дня, до 96 за 2 недели, в
кодирующей последовательности всех (NGS)
зависимости от типа секвенатора)
генов (анализ экзомов, экзомное
секвенирование)

Анализ известных или новых Высокая (от 1 недели до 1 месяца, в зависимости от


Секвенирование нового поколения
патогенных вариантов во всем геноме типа секвенатора). В реальной медицинской практике
(NGS)
(геномное секвенирование) почти не востребовано!
Области медицинского применения генетики
Медицинские задачи Технология Практическая реализация

Государственные лаборатории при


Моногенные заболевания ПЦР, ПЦР в реальном времени генетических центрах и частные
лаборатории

Мультифакториальные заболевания
Ограниченный спектр в большом числе
ПЦР в реальном времени, масс-
частных лабораторий, развернутое
Фармакогенетический анализ спектрометрия, ДНК-чипы, NGS
профилирование в рамках частных и
секвенирование
государственных научных центров
Спортивная генетика

Капиллярное секвенирование, NGS На базе ГНЦ онкологической


Онкогенетика
секвенирование специализации и частных лабораторий

Перинатальная и предимплантационная Государственные и частные ЭКО


ДНК-чипы, NGS секвенирование
диагностика (планирование семьи) лаборатории, перинатальные центры

Профилактика – генетическая Геномные центры при НИИ


паспортизация (оценка генетических ДНК-чипы, NGS секвенирование соответствующей специализации,
рисков развития заболеваний, коррекции частные медицинские центры и научно-
терапии, нутригенетических факторов) производственные фирмы
Сопутствующие расходные материалы, оборудование

Сбор, консервация,
хранение и Выделение и Подготовка Количественный
транспортировка очистка библиотек анализ
биоматериала

Биоинформатичес
NGS-
кая обработка
результатов исследование
Сопутствующие расходные материалы, оборудование

Первое правило геномных


исследований: Trash-in –
Trash-out

▪ Не стоит экономить на расходных материалах


▪ Автоматизация рутинных процессов (выделение нуклеиновых кислот,
пробоподготовка)
▪ Контроль процедур забора, транспортировки, хранения биоматериала
▪ Качественные расходные материалы для выделения, пробоподготовки
▪ Корректный подбор пробоподготовки и покрытия позволит получить нужные
данные и сэкономить деньги
Спасибо за внимание

Гудков Денис, к.х.н.


начальник научно-организационного отдела
ФГБУ ФНКЦ ФХМ ФМБА России
gudkovdenis@gmail.com
+7(985) 663 5138

Вам также может понравиться