АЗЕРБАЙДЖАНСКАЯ РЕСПУБЛИКА

На правах рукописи

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПОЛУЧЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ

IN VITRO, ЗАЩИЩЕННОМ И ОТКРЫТОМ ГРУНТЕ КЛОНОВЫХ
ПОДВОЕВ ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР И ВИНОГРАДА

Специальность: 3103.07 - Растениеводство

Отрасль науки: аграрные науки

ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
доктора философии

Соискатель: _________________Сулейманова Севиль Джаваншир кызы

Научный руководитель: ________________доктор аграрных наук, профессор

Кухарчик Наталья Валерьевна

Баку - 2021
1
 ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.…………………............................................................................. 4
I ГЛАВА. СОСТОЯНИЕ ИЗУЧАЕМОГО ВОПРОСА НА
СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ…………………………………………….......... 11
1.1. Клональное микроразмножение плодовых культур 11
и винограда в условиях in
vitro...........................................................................
1.1.1. Преимущества клонального микроразмножения................................... 11
1.1.2. Этапы клонального микроразмножения растений................................. 12
1.2. Стерилизация эксплантатов в процессе клонального
микроразмножения плодовых культур и винограда........................................ 13
1.3. Питательные среды для клонального микроразмножения плодовых
культур и винограда............................................................................................ 19
1.3.1. Регуляторы роста....................................................................................... 25
1.3.2. Антибиотики и антиоксиданты................................................................ 38
1.4. Выбор эксплантата для введения в культуру in vitro .............................. 40
1.5. Условия культивирования эксплантатов in vitro...................................... 41
1.6. Адаптация микрорастений к условиям ex vitro......................................... 44
II ГЛАВА. УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ........... 46
2.1. Место и условия проведения исследований............................................... 46
2.2. Объекты исследований................................................................................. 48
2.3. Методы исследований.................................................................................. 51
2.3.1.Методика лабораторных работ и исследований при
микроразмножении плодовых культур и винограда in vitro.......................... 53
2.3.2. Методика адаптации растений ex vitro....................................................6 67
2.3.3. Методика адаптации растений-регенерантов подвоев плодовых
культур в открытом грунте................................................................................. 69
III ГЛАВА. ОСОБЕННОСТИ ВВЕДЕНИЯ, РАЗМНОЖЕНИЯ И
УКОРЕНЕНИЯ ПОДВОЕВ ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР В УСЛОВИЯХ
IN VITRO.............................................................................................................. 71
3.1. Особенности введения в культуру in vitro подвоев плодовых культур.. 71
3.1.1. Эффективность использования антибиотиков для оздоровления
72
эксплантатов от инфекций различной этиологии............................................
3.2. Сравнительная оценка эффективности питательных сред при
введении в культуру in vitro и микроразмножении ........................................ 78
3.3. Ризогенез клоновых подвоев плодовых культур in vitro........................ 95
IV ГЛАВА. ОСОБЕННОСТИ ВВЕДЕНИЯ, РАЗМНОЖЕНИЯ И

2
УКОРЕНЕНИЯ СОРТОВ ВИНОГРАДА В КУЛЬТУРЕ IN VITRO................ 109
4.1. Особенности введения в культуру in vitro винограда сортов народной
селекции Мадраса и Баян Ширей..................................................................... 111
4.2. Микроразмножение сортов винограда Мадраса и Баян 114
Ширей...............
4.3. Особенности ризогенеза винограда сортов Мадраса и Баян Ширей...... 116
V ГЛАВА. МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ-
РЕГЕНЕРАНТОВ НА ЭТАПЕ АДАПТАЦИИ................................................ 122

VI ГЛАВА. АГРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПОДВОЕВ,

ВЫРАЩЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO, ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ
В ОТКРЫТОМ ГРУНТЕ..................................................................................... 131
VII ГЛАВА. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ РАЗРАБО-
ТАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ
ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР MAXMA 14, GF 677, MYROBALAN 29C,
GARNEM 15 И OHF 87....................................................................................... 140
ВЫВОДЫ……...................................................................................................... 145
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
РЕЗУЛЬТАТОВ................................................................................................ 146
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ........................................ 147
ПРИЛОЖЕНИЯ................................................................................................... 169
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ................... 200

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. На

сегодняшний день одной из актуальных задач садоводческой отрасли
Азербайджана является недостаток здорового высококачественного
посадочного материала отечественного производства. В 2019-м году в
республике произведено 2748 тысяч саженцев плодовых культур и 156 120
саженцев винограда, что недостаточно для закладки новых и замены
существующих садов и виноградников. Основным лимитирующим фактором
увеличения производства двухкомпонентных саженцев плодовых культур
является отсутствие технологии размножения здоровых клоновых подвоев,
3
поскольку семенные подвои не удовлетворяют современные требования к
посадочному материалу: являются переносчиками системных болезней, в том
числе вирусных; не позволяют закладывать насаждения с высокой плотностью
посадки и нормированной высотой.
Перспективным методом, реально позволяющим решить эту проблему,
является метод культуры тканей (культура in vitro), который дает возможность
получить в короткие сроки наиболее адаптированный к местным почвенно-
климатическим условиям, характеризуемый генетической однородностью,
свободный от вирусов здоровый посадочный материал [83, c.47-54; 81, с.182-
188; 94, 193c.; 98, с.328-337; 135, с.161-166; 177, с.87-99]. Во многих развитых
странах технология микроразмножения растений методом in vitro является
неотъемлемой частью системы питомниководства. Такие крупные
производители посадочного материала, как “Agriforest Biotech LTD” (Канада),
“Agro Millora Catalana” (Испания), “Toros-Agripark”, “Vitroplant”, “Beta Fidan”
(Турция) используют этот метод для производства  саженцев многих культур, в
том числе плодовых. В России к настоящему времени метод культуры in vitro
применяется в основном при размножении редких и уникальных форм
и сортов растений, в селекции и т.д. [15, с.11-28; 51, c.32-34].
В Азербайджане производственная практика микроклонального
размножения плодовых растений и винограда практически отсутствует или
находится на раннем этапе развития. Причины отсутствия применения в
производстве довольно перспективного метода не новы: высокие требования
относительно начальных капиталовложений, отсутствие профессиональных
кадров в этой отрасли, слабая отработка или отсутствие технологий получения
посадочного материала многих культур и сортов, адаптированных для
выращивания в Азербайджане. Однако в последнее время в стране делаются все
необходимые шаги для развития сельского хозяйства, в том числе
плодоводства и виноградарства. Одно из приоритетных направлений -
биотехнология растений, в том числе технология микроклонального
размножения. Создаются лаборатории биотехнологии растений при научно-
4
исследовательских институтах, улучшается кадровый потенциал, за счет
финансирования обучения кадров за рубежом, организуются международные
конференции [51, c.32-34].
Перспективными для условий Азербайджана культурами являются
косточковые и семечковые плодовые культуры и виноград, недостаточная
площадь насаждений которых, в первую очередь, определяется отсутствием
высококачественного посадочного материала.
Целью исследования явилась разработка технологии размножения в
культуре in vitro клоновых подвоев косточковых плодовых культур, груши и
местных сортов винограда, а также определение адаптивного потенциала
оздоровленных растений подвоев и саженцев в открытом грунте в условиях
Азербайджана.
Задачи исследования:
- оценка особенностей пролиферации клоновых подвоев на этапах
введения в культуру in vitro, микроразмножения, укоренения и адаптации;
- разработка усовершенствованной технологии размножения in vitro
клоновых подвоев косточковых плодовых культур и груши;
- разработка технологии размножения in vitro местных сортов винограда;
- оценка адаптивного потенциала полученных in vitro клоновых подвоев в
открытом грунте и возможности их выращивания по интенсивной технологии;
- определение совместимости выращенных in vitro подвоев с
хозяйственно значимыми сортами косточковых культур и определение
сезонного роста и развития саженцев.
Методы исследования: Процесс введения в культуру, пролиферации,
ризогенеза и первоначальной адаптации проводили по методикам
микроразмножения растений Республиканского Унитарного Предприятия
«Институт плодоводства» Национальной Академии Наук Беларуси
(Н.В.Кухарчик, М.С.Кастрицкая, С.Э.Семенас и др., 2016) [70, 208c.] и
Института Физиологии растений и генетики Национальной Академии Наук
Украины (Ф.Л. Калинин, Г.П. Кушнир, В.В. Сарнацкая, 1992) [44, 232c.], с
5
нововведениями, касающимися схемы стерилизации эксплантатов, состава
питательных сред и условий культивирования.
Первое поле плодового питомника было заложено по новой для
Азербайджана технологии двустрочной системы выращивания подвоев на
черной светонепроницаемой мульчирующей пленке (И.С.Курбанов,
С.Д.Сулейманова, А.А.Гаджиев, 2016) [51, с.32-34]. Агробиологическое
изучение подвоев плодовых культур в открытом грунте, проводилось по
методике Кубанского Государственного Аграрного Университета
(Т.Н.Дорошенко, Л.Г.Рязанова, А.В.Рындин, 2015) [41, 62c.].
Объектами исследования служили клоновые подвои косточковых и
семечковых плодовых культур (GF 677, Myrоbаlan 29C, MaxMa 14, Garnem 15,
OHF 87), сорта винограда народной селекции (Мадраса и Баян Ширей).
Основные положения работы, выносимые на защиту:
- основные показатели, определяющие высокую эффективность
инициации культуры in vitro, микроразмножения и ризогенеза клоновых
подвоев косточковых плодовых культур (GF 677, Myrobalan 29C, MaxMa 14,
Garnem 15), груши (OHF 87), сортов винограда местной селекции (Мадраса и
Баян Ширей): причины контаминации эксплантатов и использование
антибиотиков для ее элиминации, питательные среды для всех этапов
культивирования in vitro, генотипов подвоев и сортов винограда;
- впервые разработанная для условий Азербайджана технология
размножения в культуре in vitro клоновых подвоев косточковых плодовых
культур и груши;
- впервые полученные в условиях in vitro стерильные культуры местных
сортов винограда Мадраса и Баян ширей;
- двустрочная система выращивания на мульчирующей пленке клоновых
подвоев косточковых культур, полученных методом культуры in vitro,
обеспечивающая хорошую адаптацию (95 %) в открытом грунте, равномерный
рост подвоев и достижение размеров, необходимых для окулировки;

6
 - сезонный рост и развитие саженцев, выращенных с применением
техники in vitro, позволяющий получать в условиях Азербайджана, стандартные
саженцы миндаля, черешни, сливы, нектарина, груши и др.
Научная новизна исследования. Впервые в условиях Азербайджана
апробирован и модифицирован весь цикл биотехнологических работ по
выращиванию в культуре in vitro клоновых подвоев косточковых плодовых
культур (GF 677, Myrabolan 29C, MaxMa 14, Garnem 15), груши (OHF 87),
сортов винограда народной селекции (Мадраса и Баян Ширей). Определены
факторы контаминации эксплантатов при введении в культуру in vitro,
выделены оптимальные питательные среды, типы эксплантатов, получена
стерильная культура 7 генотипов. Для культивируемых форм подвоев плодовых
культур и сортов винограда установлена эффективность микроразмножения в
зависимости от используемых питательных сред, пассажей. Впервые для
условий Азербайджана разработана технология размножения в культуре in vitro
клоновых подвоев косточковых культур и груши и определены основные
параметры адаптации полученных in vitro растений в условиях теплиц,
защитных сеток и открытого грунта.
Получены новые данные о сезонном росте и развитии клоновых подвоев,
размноженных в культуре in vitro, и саженцев косточковых плодовых культур,
выращенных с использованием биотехнологий, при применении новой для
Азербайджана двустрочной системы выращивания на мульчирующей пленке в
открытом грунте.
Практическая значимость исследования. Полученные результаты
являются ценным вкладом в развитие питомниководства и плодоводства
Азербайджана. Разработанная технология размножения в культуре in vitro
клоновых подвоев косточковых плодовых культур и груши, включает схему
производства оздоровленного посадочного материала клоновых подвоев in
vitro; ускоренное размножение (техника введения в культуру in vitro,
питательные среды, микроразмножение, укоренение, адаптация). Разработанная
технология не имеет аналогов в Республике Азербайджан, ее использование
7
экологически безопасно и позволяет получать оздоровленный посадочный
материал клоновых подвоев высокого качества. Данные о росте и развитии
клоновых подвоев и саженцев косточковых плодовых культур при
использовании новой для Азербайджана двустрочной системы посадки на
мульчирующей пленке в открытом грунте, позволяют регулярно получать в
условиях Азербайджана стандартные саженцы миндаля, черешни, сливы,
нектарина.
Апробация и внедрение результатов диссертационного исследования.
Основные результаты диссертации опубликованы в 14 работах, в том числе 6 –
в изданиях, включённых в перечень Высшей Аттестационной Комиссии при
Президенте Азербайджанской Республики, 2 - в издании, включённом в
систему РИНЦ (RSCI) и в перечень Высшей Аттестационной Комиссии при
Министерстве Науки и Высшего Образования Российской Федерации, 1 - в
издании, включенном в систему Index Copernicus Int., 4 - в материалах
конференций (Международная научно-практическая конференция "Проблемы
обеспечения продовольственной безопасности независимого азербайджанского
государства и повышения конкурентоспособности аграрной сферы" (г.Баку,
2018), Республиканская научно-практическая конференция "Академик Джалал
Алиев и генетические ресурсы биологического разнообразия" (г.Гянджа, 2018),
Конференция молодых ученых и студентов "Innovations in Biology and
Agriculture to Solve Global Challenges" (г.Баку, 2018), Международная научно-
практическая конференция (г.Новосибирск, РФ, 2019) "Экспериментальные и
теоретические исследования в современной науке"). Кроме того, Ученым
Советом Научно Исследовательского Института Плодоводства и Чаеводства
МСХА утверждены и рекомендованы в печать (протокол №15, 13.12.2019)
разработанные автором "Методические указания по проведению лабораторных
работ при микроразмножении плодовых и ягодных культур in vitro"
(опубликовано) и "Технология размножения оздоровленного посадочного
материала клоновых подвоев с использованием биотехнологических методов
(микроклональное размножение)" (приложение 5).
8
 Внедрение результатов диссертационного исследования осуществлялось
в ООО "Azerting" и ООО "Zerdabi ETB" (приложение 4).
Название организации, где была выполнена диссертационная работа:
Научно Исследовательский Институт Плодоводства и Чаеводства
Министерства Сельского Хозяйства Республики Азербайджан,
Республиканское Унитарное Предприятие «Институт Плодоводства»
Национальной Академии Наук Беларуси.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 7 глав,
выводов, рекомендаций по практическому использованию результатов
исследования, списка использованной литературы и приложений. Работа
включает 30 таблиц и 31 рисунок. Структура диссертации: титульный лист и
оглавление объемом 3 страницы и 4965 знаков, введение объемом 7 страниц
и 11881 знаков, первая глава объемом 35 страниц и 60599 знака, вторая глава
объемом 25 страниц и 38712 знаков, третья глава объемом 38 страниц и
49435 знака, четвертая глава объемом 13 страниц и 15760 знаков, пятая глава
объемом 9 страниц и 11390 знаков, шестая глава объемом 9 страниц и 10070
знаков, седьмая глава объемом 5 страниц и 5438 знаков, выводы объемом 1
страница и 1304 знака, рекомендации по практическому использованию
результатов объемом 1 страница и 579 знаков, список использованной
литературы, включающий 183 наименования объемом 22 страницы,
приложения объемом 31 страница, перечень сокращений и условных
обозначений объемом 1 страница. Общий объем диссертации состоит из 200
страниц машинописного текста. Общая текстовая часть диссертации (без
таблиц, рисунков, графиков, списка использованной литературы и
приложений) состоит из 117 страниц машинописного текста и 210 133 знака.

9
 I ГЛАВА. СОСТОЯНИЕ ИЗУЧАЕМОГО ВОПРОСА
НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ

1.1. Клональное микроразмножение плодовых культур и винограда в

условиях in vitro
1.1.1. Преимущества клонального микроразмножения

1. Растение, выращенное из меристемы, является свободным от

вирусов [26, 142c.; 30, 160с.; 48, 13с.; 135, с.161-166; 177, с.87-99; 179, с.1447-
1451], так как апикальные ткани даже зараженных вирусами растений
практически не содержат вирусных частиц и, соответственно, не передают их
при введении в культуру in vitro [2, с.34-38; 81, с.182-188; 83, с.47-54; 88, 92с.].
Содержание вирусов в больном растении снижается по направлению к
интенсивно растущей верхушке побега, а собственно апикальная меристема
может быть совершенно свободной от вирусной инфекции [30, 160с.; 88, 92с.;
179, с.1447-1451]. Таким образом, минимально возможный размер эксплантата,
его стерилизация, асептическое (стерильное) культивирование на стерильных
питательных средах исключает инфицирование получаемых растений
нематодами и бактериальными патогенами [45, 489c.; 71, 13с.; 177, с.87-99].
2. Безвирусные плодовые саженцы, полученные методом in vitro,
меньше поражаются болезнями [83, с.47-54; 177, с.87-99].
3. Урожайность и качество меристемных саженцев выше.
Специалистами отмечено, что с размноженных культурой ткани маточных
растений получают в 2 раза больше саженцев, причем их качество выше, чем у
подвоев, полученных с материнских растений, размноженных традиционными
способами [33, с.52-53; 48, 13с.; 75, с.146-155; 81, с.182-188; 83, с.47-54].
4. Растения, полученные методом in vitro, генетически однородны и
идентичны материнскому растению. Из чего следует, что используя этот метод
можно от одного материнского эксплантата получить в короткие сроки
максимальное число однородных растений. Например, при размножении

10
подвоев традиционными способами требуется 2-3 года [32, с.63-66], при
использовании клонального микроразмножения этот период можно сократить
до одного года, и при этом возможно оздоровление [135, с.161-166].
5. Используя в качестве эксплантатов меристемы, существует
возможность тиражирования (размножения) трудноразмножаемых растений
[44, 232с.; 45, 489с.].
6. Размножение растений в течение всего года [72, с.3-18].
7. Возможность обмена растительным материалом без риска переноса
патогенов как внутри страны, так и в международном масштабе [15, с.11-28;
170, с.1176-1180].
Во всем мире маточники закладываются саженцами, размноженными
методом in vitro. Высокое качество таких маточников оправдывает затраты.
Минаев В.А. [62, 101c.] считает, что применение биотехнологических подходов
в питомниководстве повышает вероятность получения здоровых растений на
100%-ов, в короткие сроки увеличивает коэффициент размножения в 5-10 раз,
дает возможность получить стандартный посадочный материал плодовых и
ягодных культур при уровне рентабельности от 115 до 200%, в зависимости от
конкретного вида растения.

1.1.2. Этапы клонального микроразмножения растений

Ученые Деберг и Мейн [116, с.69-75] в процессе микроразмножения

растений выделяли так называемый нулевой этап, отведенный для подготовки
донорных растений к выделению эксплантатов. Так, на нулевом этапе растения
выращивали в теплицах при условиях низкой влажности воздуха и
иррегулярного полива. Такие условия были не очень подходящими для роста и
развития растений, но в тоже время достигалось резкое понижение количества
инфицированных растений. За две недели до назначенного времени введения в
культуру, с целью профилактики от всякого рода инфекционных болезней,
проводили химическую обработку донорных растений.

11
 В целом процесс клонального микроразмножения можно разделить на 4
этапа [26, 142с.; 35, 50с.; 44, 232с.; 76, 416с.; 89, 56с.]:
1-й этап - Введение в культуру in vitro. На этом этапе проводится отбор
эксплантатов, поэтапная санация и высаживание стерильных эксплантатов на
заранее автоклавированную питательную среду. Основной задачей здесь
является получение активно растущей стерильной культуры.
2-й этап - Собственно микроразмножение. Целью этого этапа является
получить максимальное число микропобегов.
3-й этап - Укоренение микропобегов и получение полностью
сформированных растений.
4-й этап - Поэтапная адаптация растений-регенерантов к условиям
закрытого и открытого грунта.
Каждый конкретный сорт растения требует подбора индивидуальной
схемы стерилизации, состава питательной среды и условий культивирования.

1.2. Стерилизация эксплантатов в процессе клонального

микроразмножения плодовых культур и винограда

Положительный результат всего процесса клонального

микроразмножения во многом зависит от качества стерилизации на первом
этапе введения в культуру in vitro. Стерилизующий агент, используемый при
стерилизации, должен обеспечить полное освобождение от инфекций
различной патологии при незначительном повреждении тканей, а также не
подавлять последующее развитие эксплантатов в культуре in vitro.
В качестве стерилизующих агентов обычно используют соединения ртути
[55, 25с.; 136, с.175-177; 137, с.18-26; 138, с.37-45; 177, с.87-99], гипохлорид
кальция и натрия [6, с.19-23; 9, с.10-16; 98, с.328-337; 137, с.18-26; 145, с.117-
126] и другие соединения хлора [112, с.362-368], нитрат серебра [22, с.84-90; 38,
204с.; 145, с.117-126] и, последнее время, наночастицы серебра [103, с.103-110;

12
123, с.121-127; 142, 4с.; 160, с.159-161; 161, с.16-21] и озон [111, с.194-200; 171,
с.31-37].
С целью профилактики грибных и бактериальных инфекций эксплантаты
предварительно выдерживают в растворе фунгицида [118, с.575-581].
При подборе основного стерилизующего агента и длительности
экспозиции необходимо учитывать особенности эксплантата. Если
растительная ткань эксплантата тонкая, то для сохранения ее жизнеспособности
необходимо снижать концентрацию и активность стерилизатора.
К примеру, 0,1% хлорид ртути (HgCl2) для каждой культуры показывает
свою эффективность в различных экспозициях. Так, Майорова Ю.А. [55, 25с.] в
процессе введения в культуру in vitro гибридов вишни установила, что 0,1 %
хлорид ртути с экспозицией 8 мин. дает наиболее высокий процент
жизнеспособных эксплантатов. Иранские ученые определили, что
использование HgCl2 (0,1%) в течение 6 минут при стерилизации эксплантатов
подвоя GF677 также дает хороший результат [136, с.175-177]. Khan N. и др.
[138, с.37-45] поверхностную дезинфекцию виноградных эксплантатов
проводили хлоридом ртути в экспозиции 7 минут.
Часто используется ступенчатая стерилизация, при которой применяется
два или три стерилизатора. К примеру, Magyar-Tаbori K. и др. [141, с.910-913]
апексы побегов яблони для начала выдерживали 2 сек в 70%-ом спирте, после
чего погружали на 15 мин в 0,1-0,2% раствор сулемы.
Данный прием был использован и Ломовской Л.В. [53, с.13-15], где она
рекомендует использовать в последовальном порядке 3%-ую перекись
водорода, 96 %-ый этиловый спирт и 0,01 %-ый раствор сулемы.
Проведенные исследования, целью которых был подбор эффективного
стерилизующего агента для ввода в культуру in vitro сортов сливы домашней,
показали, что наибольшим выходом жизнеспособных эксплантатов (82%)
выделился вариант с обработкой 0,1%-ым йодидом ртути (HgJ2) при
экспозиции 30 сек. [49, 9с.].
Ртутьсодержащие препараты высокотоксичны и поэтому в качестве
13
альтернативы часто используют серебросодержащие (нитрат серебра) и
хлорсодержащие (гипохлорит натрия или кальция) стерилизаторы.
К примеру, Arıcı Ş.E. [6, с.19-23] для стерилизации эксплантатов подвоев
косточковых плодовых культур GF 677, Garnem 15, Myrabolan 29C, MaxМa 14,
MaxМa 60 использовала 15% гипохлорид натрия с добавлением 1-2 капель
Tween в течение 20 мин. Другие исследователи Nasri A. и др. [152, с.144-153]
для стерилизации эксплантатов Myrabolan использовали 12% гипохлорид
натрия в экспозиции 10 мин.
Медведева Н.И. и др. [61, 13с.] для стерилизации эксплантатов винограда
предлагают хлорсодержащую «Белизну» из расчета 1 литр препарата на 2,5
литров воды с последующим использованием в качестве основного
стерилизатора йодида ртути 0,1% в экспозиции 4,5 мин.
Череватая Т.М. [93, с.58-64] предлагает ступенчатую стерилизацию
винограда обработкой 60% этанолом (20 сек.) и применением в качестве
стерилизующего агента 2% раствора гипохлорита кальция (5 мин.), который по
результатам исследования сокращает уровень контаминации до 5-6% при
высоком уровне приживаемости - 85-90%.
Турецкие ученые в своем исследовании на первом этапе стерилизации
эксплантаты подвоев Маxма-14 и GF-677 выдерживали в 70% этиловом спирте
в течение 1 мин, после чего 3 раза промывали в стерильной воде. Далее
эксплантаты помещали в 20% раствор Доместоса на 3-5 мин, после чего
повторно трехкратно промывали в стерильной воде [9, с.10-16].
Вместо сулемы, Корнацкий С.А. [47, 24с.] предлагает использовать йод,
являющийся более безопасным в концентрации 0,01%.
Бартиш И.В. и др. [22, с.84-90] для высокой эффективности стерилизации
эксплантатов груши рекомендуют использование нитрата серебра в
концентрации 0,1-0,3%.
Архангельская Г.П. [18] предлагает схему, где стерилизацию
растительных эксплантатов осуществляют путем обработки их 96%-ным
этанолом, после чего в течение 30-60 мин выдерживают в 0,1-1,0%-ном
14
растворе беномила, далее дополнительно обрабатывают 6-10%-ным раствором
тексанита в течение 15-30 мин.
Doric D., Mihaljevic I. и др. указывают на хороший потенциал нитрата
серебра, гипохлорита кальция и хлорида ртути при стерилизации эксплантатов
вишни сорта «Облачинская» [118, с.575-581; 145, с.117-126].
По результатам исследования Shabani Z. и др. лучшим стерилизатором
для эксплантатов Myrobalan 29C является 10%-ный гипохлорит натрия в
экспозиции 30 мин. [166, с.57-64].
Hepaksoy S. [10, с.447-451] эксплантаты подвоя GF 677 выдерживала в 4%
растворе гипохлорита натрия в течение 20 мин, с последующей трехкратной
промывкой стерильной водой в ламинар-боксе.
Для сливы сорта Stanley самый высокий процент жизнеспособных
эксплантатов (97%) был зафиксирован при дезинфекции эксплантатов 2%-м
гипохлоритом натрия в течение 15 минут и 0,1% хлоридом ртути в течение 7
минут [137, с.18-26].
Максимальному приживлению в условиях in vitro эксплантатов подвоя
Gisela 5 (70%) способствовала обработка 0,1% хлоридом ртути в течение 5
минут [177, с.87-99].
Исследования Батукаева А.А. и др. [23, с.241-246] показали, что раствор
2%-го гипохлорита натрия при экспозиции 10 мин оказался эффективным при
стерилизации эксплантатов винограда, что позволяло существенно снизить их
зараженность.
Сотрудники Белгородской сельскохозяйственной академии (РФ)
разработали способ поверхностной стерилизации эксплантатов и апикальных
почек винограда in vitro, включающий стерилизацию эксплантатов и
апикальных почек растений 0,5%-ым спиртовым раствором хлоргексидина в
течение 5 мин и промыванием 5-6 раз стерильной дистиллированной водой в
течение 1 часа [92].
Медведева Н.И. и др. [61, 13с.] установили, что добавление натриевой
соли цифотаксима (5 мг на 300 мл воды) в последнюю порцию стерильной воды
15
для промывки эксплантатов от стерилизующего агента, снижает риск
инфицирования эксплантатов на 35-40%.
Kalkışım Ö. и др. [13, с.77-84] предлагают стерилизацию эксплантатов
черной шелковицы начинать с обработки 0,5%-м раствором фунгицида с
добавлением нескольких капель Tween-20 в течение 15 мин, после чего
стерилизовать эксплантаты 70%-м этанолом с последующей трехкратной
промывкой и 0,1%-м хлоридом ртути с последующей пятикратной промывкой.
Бугаенко Л.А. и Иванова-Ханина Л.В. [27, с.73-82] для стерилизации
эксплантатов сортов винограда Каберне Совиньон и Фрумоасе албэ
использовали 70% этанол (35 секунд) и 50% Брадофен (Benzoxonium chloride)
(12 минут), а Abido A.I.A. и др. [98, с.328-337] для стерилизации эксплантатов
винограда сорта Мускат Александрийский применяли 0,52% и 0,78%-ный
гипохлорит натрия в экспозициях 15 и 20 мин., соответственно.
Хорошие результаты получены при применении нитрата серебра в
концентрации от 0,1 до 1,0%. Дорошенко Н.П. [38, 204с.] установила, что для
стерилизации эксплантатов винограда оптимален нитрат серебра в
концентрации 0,8%, а экспозиция обработки зависит от типа эксплантата.
Основываясь на этом, Ребров А.Н. и др. [71, 13с.], проводя исследования по
введению в культуру in vitro перспективных селекционных сортов винограда,
установили, что стерилизация эксплантатов винограда 70%-ым этанолом в
течение 60 секунд и 0,8%-ным азотнокислым серебром в течение 7 минут дает
наилучшие результаты.
Ученые Всероссийского НИИ виноградарства и виноделия им.
Я.И.Потапенко предлагают следующую схему стерилизации эксплантатов
винограда при вводе в культуру in vitro: для начала эксплантаты обрабатывают
этиловым спиртом в течение 30-40 секунд, далее 0,8% водным раствором
азотнокислого серебра (AgNO3) в экспозиции 7 минут для зеленых, 10 минут
для вызревших побегов, с дальнейшим пятикратным промыванием
эксплантатов в стерильной воде [77, 3с.].

16
 Kayhan F. [14, 74с.], в своем исследовании, эксплантаты винограда
выдерживала в 70% этаноле в течение 40 сек, далее в растворе 20%
гипохлорита натрия с 0,1%-м Tween-20 в течение 15-20 мин., после чего
эксплантаты трехкратно промывала в стерильной воде.
Дорошенко Н.П. [38, 204с.] перед извлечением меристем из глазков
винограда стерилизовала их 10,0%-ным гипохлоритом кальция в течение 30
мин., в результате чего был получен высокий выход здоровых эксплантатов и
их успешное дальнейшее развитие.
Некоторые исследователи указывают на возможность стерилизации
исходного материала озоном (О3), который имеет очень сильное
антибактериальное действие. У него очень короткий период полураспада в воде
и почве, окисляет другие соединения, растворяется в двухатомном
молекулярном кислороде не оставляя токсичные остатки. По результатам
проведенных исследований [111, с.194-200; 171, с.31-37] озон обеспечивает
высокую жизнеспособность (от 57 до 93%) эксплантатов независимо от их типа
и разновидности растения.
В последнее время в качестве бактерицида внимание исследователей
привлекают наночастицы серебра [103, с.103-110; 123, с.121-127; 142, 4с.; 160,
с.159-161; 161, с.16-21]. В связи с высоким загрязнением древесных растений,
особенно плодовых, а также неблагоприятного воздействия хлорида ртути на
окружающую среду, раствор наночастиц серебра (NS) рассматривают
альтернативой этому токсичному стерилизатору. Так, Arab M.M. и др. [103,
с.103-110] провели два отдельных эксперимента по оценке потенциала
наночастиц серебра в качестве стерилизатора в процессе микроразмножения
Garnem 15 (GxN15). В первом эксперименте эксплантаты погружали в раствор
из наночастиц серебра приготовленный в 5-и различных контетрациях (0, 50,
100, 150 и 200 ppm) на 3, 5 и 7 мин. В другом эксперименте NS (наночастицы
серебра) добавляли в питательную среду MS, куда высаживали эксплантаты
Garnem 15. По результатам исследования погружение в 100 и 150 ppm NS и
добавление NS непосредственно в питательную среду значительно снизило
17
внутренние и внешние загрязнения по сравнению с контролем (без NS).
Использование NS в питательной среде было более эффективным для
элиминации от грибковых и бактериальных патогенов, чем погружение.
Высокие концентрации NS имели неблагоприятное влияние на
жизнеспособность отдельных эксплантатов Garnem 15.
Таким образом, для стерилизации исходного материала необходимо
выбирать подходящий стерилизующий агент, устанавливать его оптимальную
концентрацию и экспозицию для каждого отдельного растительного объекта.

1.3. Питательные среды для клонального микроразмножения

плодовых культур и винограда

Учеными со всего мира было разработано множество питательных сред,

среди которых самыми универсальными считаются среда Мурасиге-Скуга
(Murashige-Skoog) [149, с.473-497], среда Гамборга (Gamborg) [131, с.372-375],
среда Уайта (White) [180, 240с.], среда Драйвера-Куниюки (Driver-Kuniyuki)
[119, с.506-509], среда Кворина-Лепуавра (Quoirin-Lepoivre) [157, с.437-442] и
т.д. (таблица 1.3.1). Исследователи очень часто используют модифицированные
составы этих сред. Модифицирование сред достигается внесением в основной
минеральный состав различных добавок: аминокислот, регуляторов роста,
витаминов [31, 272c.; 44, 232c.].
Наиболее часто используется питательная среда Murashige-Skoog (MS)
[149, с.473-497], которая изначально была разработана для культуры табака, но
содержит настолько идеально сбалансированный состав, что подходит для
микроразмножения очень многих растений.
В среде Гамборга (Gamborg) [131, с.372-375] общая концентрация солей
ниже, чем в среде МS, но больше содержание нитратного азота.
Среда Уайта (White) [180, 240с.] часто используется в модификациях, так
как в оригинальной прописи уровень солей К и Na довольно низок для роста
каллуса и его пролиферации.

18
 Таблица 1.3.1
Прописи основных питательных сред используемых в
микроклональном размножении растений
Состав питательной среды, мг/л
Quoirin-
Компонент Gamborg Knud- Murashige & Harvais
White Lepoivre
(В5) son Skoog İA
(QL)
Ca(NO3)2*4H2O 1000.0 400.0 300 833,8
(NH4)2SO4 134.0 500.0
KNO3 2500 1900.0 200.0 80 1900
CaCl2*2H2O 150.0 440.0 -
NH4NO3 - 1650.0 400.0 400
KH2PO4 - 250.0 170.0 200.0 270
KCl - 100.0 65
MgSO4*7H2O 250.0 250.0 370.0 200.0 720 360.4
FeSO4*7H2O 28.0 25.0 27.95 27.8
(FeSO4)3 2.5
Na2H2PO4*2H2O 169.6 16.5
Na2SO4 200
Na2 ЭДТА 37.3 37.3 37.3
Хелат железа 5 ml
CoCl2*6H2O 0.025 0.025 0.02 0.025
ZnSO4*7H2O 8.6 0.5 3.0 8.6
H3BO3 3.0 6.2 0.5 1.5 6.2
MnSO4*4H2O 13.2 7.5 22.3 0.5 7.0 -
MnSO4*H2O - - - - 0.76
CuSO4*5H2O 0.025 0.025 0.5 0.001 0.025
Na2MoO4*2H2O 0.25 0.25 0.04
MoSO3 0.0001
Kl 0.75 0.83 0.1 0.75 0.8
Глицин - 2.0 3.0 0.25
Мезоинозит 100.0 100.0 100.0
Никотиновая кисл. 1.0 0.5 5.0 0.5 0.5
Тиамин 10.0 0.1 5.0 0.1 0.5
Пиридоксин 1.0 0.5 0.5 0.1 0.5
6-БАП 1.2-2.0 1.2-2.0
Аскорбин. кисл. 10.0 10.0 1.5
г/л
Сахароза 20 20 30 20 30
Агар 6 6 6 6 6 6

pH среды 4.8-5.2 5.7 6.0-6.4

Таким образом, в клональном микроразмножении растений на разных

этапах используются различные питательные среды и их модификации.

19
 Nas M.N. и др. [151, с.189-200] для микроразмножения фундука
разработали питательную среду, которая по составу и концентрации макро и
микроэлементов идентична химическому составу ядер фундука. В сравнении с
контрольным вариантом (WPM) коэффициент размножения на разработанной
авторами среде был выше на 23%, а микропобеги длиннее в 3 раза.
Sevgin N. [17, 72с.] в своем исследовании по укоренению подвоя для
косточковых плодовых культур GF 677 и некоторых сортов миндаля в культуре
in vitro выявила, что самый высокий показатель укоренения (64%) был получен
на среде Nas and Read Medium (NRM).
Для микроразмножения подвоя для сливы Mirobolan Dwarf лучшей
средой оказалась среда Кворина-Лепуавра (QL) при добавлении 1,0 мг/л 6-
бензиламинопурина [155, с.153-158].
Иранские ученые Kamali K. и др. [136, с.175-177] считают, что для
микроразмножения подвоя GF 677 идеальна модифицированная среда Кнопа.
Целью исследования Arab M.M. и др. [104, с.81-87] было оценить влияние
питательных сред Мурасиге-Скуга (MS) и Кворина-Лепуавра (QL), а также
концентрации цитокининов, а именно 6-бензиладенина (БА) и 6-
бензиламинопурина (БАП) на пролиферацию in vitro подвоя Garnem 15.
Результаты исследования показали, что питательная среда MS превосходит
питательную среду QL по всем показателям. На среде MS с добавлением 1 мг/л
БАП было получено максимальное число побегов (8,5 шт. на эксплантат), а на
среде MS с добавлением 1,25 мг/л БА было получено 7,75 шт. микропобегов на
эксплантат. Самые высокие микропобеги (2,10 см) были получены на среде MS
без содержания гормонов. Результаты этого исследования показали, насколько
значимой является корреляция между уровнем гормона и высотой микропобега
и массой образовавшегося каллуса, так как увеличение уровней BAP и BA в
средах MS и QL привело к значительному уменьшению роста микропобегов и
увеличению объема каллуса.
Целью исследования Fallahpour M. и др. [124, с.57-64] было определение
наилучшего минерального и гормонального состава питательных сред для
20
микроразмножения подвоя Gisela 5 (Prunus cerasus × P. canescens).
Стерилизованные эксплантаты высаживали на 3 разные питательные среды MS,
DKW и WPM содержащие бензиладенин (БА) в концентрации 0.5, 1 или 2 мг/л
в сочетании с кинетином в концентрации 0 или 0.5 мг/л. Среды WPM и DKW с
содержанием 2 мг/л БА оказались наиболее эффективными.
Схожий эксперимент провели исследователи Erfani М. и др. [121, с.101-
109], где целью исследования была оптимизация технологии размножения
подвоя Garnem в условиях in vitro. Пазушные почки успешно вводили в
культуру, высаживая их на среду MS. На стадии пролиферации исследовали
эффективность трех культуральных сред - MS, DKW и WPM с добавлением 0.5,
1 и 2 мг/л БА. Результаты показали, что лучшей средой для пролиферации
оказалась среда DKW, содержащая 2 мг/л ИМК. Наибольшая средняя длина
побегов наблюдалась на среде WPM, содержащей 0.5 мг / л БА.
Матушкина О.В. и Пронина И.Н. [58, c.31-37; 59, с.77-81; 68, с.27-29]
считают, что оптимальной средой для культивирования in vitro яблони и груши
является среда Кворина-Лепуавра (QL). По их мнению, снижение концентрации
макроэлементов в данной среде в 2 и 4 раза, позволяет продлить длительность
беспересадочного культивирования до 9 месяцев у подвоев яблони 76-6-6, 76-8-
13, ПБ 9 с сохранением всех эксплантатов, в отличие от подвоя 76-6-13, у
которого 100% сохранность наблюдается при разбавлении питательной среды
только в 4 раза, в то время как на полной среде происходит их гибель.
Эти же ученые получили патент на питательную среду для
микроразмножения яблони и груши, где в качестве базовой среды для
пролиферации микропобегов используется водорастворимый препарат "Мастер
марки 3.11.38+4" [57].
При клональном микроразмножении большинства сортов винограда
обычно используют питательную среду Мурасиге-Скуга (жидкую или
агаризованную) и среду Кемпбела и Дурзана (таблица 1.3.2) [44, 232c.].
Таблица 1.3.2
Среда Кемпбела и Дурзана
21
 Компонент Количество, мг/л Компонент Количество, мг/л
NH4NO3 800 Na2 ЭДТА 37,3
KNO3 340 ZnSO4*4H2O 8,6
KH2PO4 170 H3BO3 6,2
KCl 65 MgSO4*4H2O 16,9
CoCl2*6H2O 0,025 Мезоинозит 500
CuSO4*5H2O 0,025 Тиамин 5
Na2MoO4*2H2O 0,25 Сахароза, г/л 30
Kl 0,83 Агар-агар, г/л 8
MgSO4*7H2O 370 pH-среды 5,8
FeSO4*7H2O 27,8

Однако для некоторых сортов необходимо экспериментально подбирать

оптимальный состав среды с учетом их физиологических особенностей.
В последнее время все чаще проводятся исследования по оптимизации
питательных сред с использованием нейронных сетей [134, 13с.; 144, с.309-317;
153, с.19-33] и искусственного нейросетевого генетического алгоритма [105,
19с.; 106, 17с.; 181, 13с.]. К примеру, основной целью исследования Arab M.M.
и др. [105, 19с.] было моделирование и оптимизация новой питательной среды
для укоренения подвоя G×N15 в условиях in vitro с использованием
искусственного нейросетевого генетического алгоритма (artifcial neural network-
genetic algorithm - ANN-GA). Микропобеги культивировали на
модифицированной среде Линсмаера-Скуга (LS) с добавлением в различных
концентрациях тиамина (0,4; 1,6; 2,8 и 4 мг/л) и Fe-EDDHA (100; 150 и 200
мг/л). В качестве ауксина использовали ИМК в концентрации 1 мг/л. В ходе
исследования с использованием ANN-GA было оценено влияние пяти ионных
макроэлементов (NH4+, NO3-, Ca2 +, K + и Cl−) на пять параметров роста -
число корней (RN), длину корней (RL), процент корнеобразования (R%),
свежий (FW) и сухой вес (DW). Значения корреляции между наблюдаемыми и
прогнозируемыми значениями были получены для всех пяти параметров роста
и составили 0,88; 0,88; 0,98; 0,94 и 0,87, соответственно. Оптимизированная с
помощью метода ANN-GA среда LS для укоренения Garnem 15 содержала
оптимизированные количества 1 мг/л ИМК, 200 мг/л Fe-EDDHA и 1,6 мг/л
тиамина. Эффективность этой среды сравнивалась с другими стандартными
22
средами для укоренения Prunus, и результаты показали, что оптимизированная
среда более эффективна, чем другие.
Некоторые ученые в процессе микроразмножения растений предлагают
использовать иммерсионные биореакторы [111, с.194-200; 152, с.144-153]. Так,
Nasri A. и др. [152, с.144-153] в своей статье описали эффективный, по их
мнению, способ микроразмножения Prunus cerasifera с использованием
временых иммерсионных биореакторов RITA. Для начала, одноузловые
черенки клонового подвоя для Myrobalan 29C успешно дезинфицировали 12%
-ным гипохлоритом натрия в течение 10 мин. Высокие проценты
микроразмножения и укоренения были получены на средах MS + 1 мг/л БАП +
1 мг/л ИМК на время 20 мин /12 часов и на жидкой среде MS + 1 г/л
активированного угля, соответственно. При акклиматизации растений была
зафиксирована выживаемость растений-регенерантов более 80%.
Также сегодня актуальной остается проблема поиска и изучения новых,
экономически выгодных желирующих агентов, которые положительно влияют
на рост и развитие эксплантатов.
Зеленянской Н.Н. и др. [43, с.53-57] была установлена возможность
использования пищевых крахмалов - кукурузного, картофельного и
пшеничного (в концентрации 70г/л) для приготовления питательных сред в
культуре винограда in vitro. Экспериментально было доказано, что
вышеназванные желирующие агенты способствуют улучшению показателей
приживаемости, пролиферации пазушных почек, росту и развитию
инициальных эксплантатов; по биометрическим показателям развития
микроклоны винограда на исследуемых типах питательных сред превосходят
контрольные (агар) в 2 и более раз.
В своих исследованиях Упадышев М.Т. [90] вместо агара использовал
гомополисахарид, что привело к улучшению показателя пролиферации в 1,2-2,3
раза.
Aka Kaçar и др. [5, с.161-166] в своем исследовании, целью которого
являлось микроразмножение подвоев МахМа в культуре in vitro, изучали
23
влияние различных гельобразующих веществ (агар -7 г/л, agarjel - 5 г/л, phytagel
- 3 г/л) и различных значений pH среды (5,0; 5,7; 6,2) на биометрические
показатели полученных микрорастений и на пролиферацию в целом. Лучшие
показатели размножения были достигнуты на питательной среде с добавлением
agarjel и значением pH - 6.2.
По своей структуре питательные среды могут быть твёрдыми,
полутвердыми, жидкими и двухслойными. По мнению Прониной И.Н. [68,
158c.], использование жидкой питательной среды на этапе ризогенеза повышает
укореняемость на 16,0-16,7 %, за счет свободного движения содержащихся в
среде элементов. Однако, в практике в основном используются агаризованные,
т.е. твердые питательные среды.

1.3.1. Регуляторы роста

Было проведено множество исследований по изучению влияния на

эксплантаты типов и концентраций цитокининов и ауксинов в той или иной
питательной среде. Научные исследования в этом направлении продолжаются и
из года в год разрабатываются еще более эффективные составы питательных
сред, где главная цель повысить эффективность размножения той или иной
культуры в условиях in vitro [121, с.101-109; 124, с.57-64; 125, с.490-498; 134,
13с.; 139, с.25-30; 141, с.910-913; 143, с.8613-8624].
В культуре растительных тканей выделено четыре класса регуляторов
роста: ауксины, цитокинины, гиббереллины и абсцизовая кислота [31, 272с.; 44,
232с.; 70, 208с.; 82, 42с.] (таблица 1.3.1.1).
По мнению основоположницы советской биотехнологии Р.Г. Бутенко [31,
272с.], правильный подбор и сочетание регуляторов роста является одним из
основных обстоятельств, определяющих результат технологии
микроклонального размножения растений в целом.

24
 Так, по мнению Fira Alexandru и др. [128, с.480], яблони некоторых
сортов успешно размножаются при добавлении бензиламинопурина (БАП) в
концентрации 7 мг/л.
Skirvin R.M. и др. [168, с.183-197] для микроразмножения подвоя яблони
М9 добавляли в среду Linsmaier & Skoog одновременно два регулятора роста -
2,0 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИМК.
В исследованиях Guney M. [132, с.569-575] для микроразмножения
подвоя Myrobalan 29C лучшей средой оказалась среда MS содержащая 2 мг/л
БАП и 0,05 мг/л ГК3, на которой было получено наибольшее количество (14,3)
побегов. Однако самые длинные побеги (2,0 см) были получены при
исключении ГК3 из среды MS, и снижении концентрации БАП до 1 мг/л.
Таблица 1.3.1.1
Основные регуляторы роста и их влияние на растение

Хранение раствора
Хранение порошка

Концентрация, мг/л
Молярный вес

Растворитель

Влияние на
Название Тип
растение

Абсцизовая Гормон EtOH/1N

0.1- Без роста
кислота растения 264.3 KOH -20°C -20°C
10.0
2-карбоксифенил
Ауксин, 0.1- Ауксин
3-фенилпропан 268.26 Вода 2-8°C -20°C
ингибитор 10.0 ингибитор
1,3-дион (CPD)
3,6-дихлор-o-
EtOH/ 0.01-
анисовая кислота Гербицид 221 2-8°C -20°C Каллус
Вода 10.0
(Дикамба)
Гибберелловая Гормон EtOH/ 1N 0.01- Удлинение
кислота (GA3) растения 346.4 KOH 2-8°C 2-8°C междоузлий
5.0
Рост побегов
DMSO/1
Тидиазурон 0.1- и листьев,
Цитокинин 220.2 N 2-8°C -20°C таблицы 1.3.1.1
продолжение 10.0 укорачивание
KOH
междоузлий
2,4-дихлорфенокси EtOH/1N 15-30°C 0.01-
Ауксин 221 2-8°C Каллус
уксусная кислота KOH 6.0
Индолил-3- Ауксин 175.2 EtOH/1N -20°C -20°C 0.01- Корни, каллус
уксусная кислота KOH 3.0
25
 (İAA)
Индолил-3-
EtOH/1N 0.1-
масляная кислота Ауксин 203.2 2-8°C -20°C Корни, каллус
KOH 10.0
(IBA)
Индолил-3-
0.1-
масляная кислота Ауксин 241.3 Вода 2-8°C -20°C Корни, каллус
10.0
калия (IBA-K)
3-индолилпропио- 0.1-
Ауксин 189.21 1N KOH -20°C -20°C Корни, каллус
новая кислота (IPA) 10.0
Нафтилуксусная 0.1-
Ауксин 186.2 1N KOH 15-30°C 2-8°C Каллус
кислота (NAA) 10.0
Утолщение
Аденин сульфат, Теплая 50-
Цитокинин 404.4 15-30°C 2-8°C побегов и
дигидрат вода 250
листьев
Разрастание
6-Бензиламино- 0.1-
Цитокинин 225.3 1N KOH 15-30°C 2-8°C побегов и
пурин (BAP) 5.0
листьев
6- (γ, γ- Разрастание
1.0-
диметилаллилами Цитокинин 203.2 1N KOH -20°C -20°C побегов и
30.0
но)пурин (2ip) листьев
Разрастание
0.1-
Кинетин Цитокинин 215.2 1N KOH -20°C -20°C побегов и
5.0
листьев
Разрастание
0.1-
Мета-Тополин Цитокинин 241.25 1N KOH -20°C -20°C побегов и
10.0
листьев
Разрастание
0.01-
Зеатин Цитокинин 219.2 1N KOH -20°C -20°C побегов и
5.0
листьев

По результатам исследования Shabani Z. и др. [166, с.57-64] наибольшее

количество микропобегов Myrobalan 29C было получено на среде MS с 2 мг/л
БАП, а 100%-ное укоренение на среде DKW с 1 мг/л НУК.
Изучалось влияние ИМК отдельно и в сочетании с мио-инозитолом на
укоренение in vitro подвоев CAB-6P (Prunus cerasus L.) и Gisela 6 (Prunus
cerasus×Prunus canescens). Для подвоя CAB-6P наилучшие результаты по
укоренению были получены на среде MS с 2 мг/л ИМК, максимальная длина
корня (30,57 мм) была получена с 1 мг/л ИМК. Мио-инозитол подавлял влияние
ИМК на длину корней. Для подвоя Gisela 6 включение 2 мг/л ИМК с 0,5 мг/л
мио-инозитола в культуральную среду MS значительно увеличивало число
корней (9,91), максимальная длина которых достигалась при самых низких
концентрациях ИМК и мио-инозита (0,5 мг/л) [162, с.613-619].
26
 Также изучалась эффективность мио-инозитола в концентрации 10 и 100
мг/л в среде MS и тиамина в концентрации 0; 1,6; 2,8 и 4 мг/л в среде LS в
процессе микроразмножения подвоя GF 677. Мио-инозитол в концентрации 10
мг/л помог предотвратить нежелательное расширение листьев у микропобегов
подвоя, а тиамин в концентрации 1.6 мг/л оказался высокоэффективным при
укоренении микропобегов [165, с.275-280].
Бензиладенин (БА) стимулирует высокий процент пролиферации у
микрочеренков подвоя Garnem [139, с.25-30]. Кроме того он также стимулирует
повышенное развитие каллуса у микрочеренков Gizela5 [99, с.57-64] и Garnem
15 [104, с.81-87], затрудняет корнеобразование in vitro у подвоев Maxma 14 и
F12-1 [110, с.145-150].
Способность к укоренению in vitro подвоя для груши OHF333
исследовали с использованием индолилмасляной кислоты (ИМК) (0; 0,5 и 1,0
мг/л), путресцина (160 мг/л) с использованием 4 различных способов
укоренения. Самый высокий процент укоренения (49,5%), количество (4,09) и
длина корней (2,26 см) были получены при культивировании микрочеренков на
среде содержащей ИМК и путресцин в течение на 35 дней [122, с.1424-1427].
По мнению Papakosta E. [154, с.320-323] лучшей питательной средой для
укоренения дикой груши является среда MS с содержанием ИМК в
концентрации 0,5мг/л.
Максимальный процент укоренения in vitro (100%) для подвоя Gisela5
был достигнут на среде MS обогащенной 0,5 мг/л ИМК [167, с.2617-2624].
Уругвайские ученые, изучая эффективность различных регуляторов роста
на этапе микроразмножения подвоя яблони CG41, установили, что наивысший
коэффициент размножения наблюдался при использовании регулятора роста
тидиазурон из семейства цитокининов. Однако, тидиазурон, используемый в
последующих пассажах, вызывал мутации эксплантатов и деформации листьев
проростков. Поэтому его применение должно чередоваться с другими
регуляторами роста [113, с.569-576].

27
 Ромаданова Н.В. и др. [73, с.142-149] в результате своих исследований,
объектами которых служили перспективные сорта яблони и клоновые подвои, в
том числе М9, ММ106, а также дикорастущие формы яблони, установили, что
наиболее благоприятной для введения в культуру является питательная среда
Мurashige & Skoog + 0,5 мг/л БАП + 0,01 мг/л ИМК+ 1 мг/л ГК 3 + 1 мг/л АК
(аскорбиновая кислота). Для дальнейшего этапа микроразмножения
использовалась среда Мurashige & Skoog + 0,5мг/л БАП + 0,01 мг/л ИМК.
Целью исследования Aghaye R.N.M. и Yadollahi А. [100, с.131-138] было
изучение микроразмножения подвоя миндаля GF 677 в условиях in vitro.
Авторы культивировали эксплантаты подвоя на среде MS, содержащей БАП в
концентрации 0,1; 0,6; 1; 1,5 и 2 мг/л. По результатам их исследования самые
высокие показатели количества и длины побегов оказались на среде MS с 1
мг/л БАП.
Изучение влияния концентрации бензиладенина (БА) на результат
микроразмножения in vitro подвоя Garnem стало целью исследования других
иранских ученых Rezaei А. и Hosseipour В. [158, с.41-47]. В данном
исследовании концентрация БА в среде существенно влияла как на количество
побегов, так и на длину микропобегов Garnem. Максимальное количество (4,03
побега на эксплантат) и максимальная длина микропобегов (3,54 см)
наблюдались на среде MS с 2 мг/л БА.
Лукичевой Л.А. [54, с.57-62] на этапе введения в культуру некоторых
сортов вишни и сливы лучшие результаты были получены на питательной
среде MS-1 с добавлением 1,1 мкМ БАП, на втором этапе максимальный
коэффициент размножения наблюдался на питательной среде MS-2,
дополненной для вишни 2,2 мкМ БАП и для сливы 4,4 мкМ БАП, а
максимальная частота ризогенеза была отмечена при использовании
питательной среды MS-3, дополненной ауксинами в зависимости от культуры и
сорта.
В большинстве работ по микроразмножению подвоя косточковых
культур GF, в качестве источника цитокинина авторы используют
28
бензиламинопурин (БАП) в концентрации от 0,1 до 3 мг /л [6, с.19-23; 10, с.447-
451; 136, с.175-177]. Ahmad T. и др. [101, с.331-338] установили, что
концентрация БАП 0,6 мг/л на этапе микроразмножения вызывало наибольшее
количество побегов у данного подвоя.
Цель исследования Kose S., Canli F.A. [139, с.25-30] заключалась в оценке
влияния двух различных цитокининов, точнее бензиладенина (БА) и
тидиазурона (TDZ), и их концентраций на размножение в условиях in vitro
подвоя Garnem (P. persica x P. dulcis). Высокий процент пролиферации был
получен на средах с содержанием 1,25 мкМ и 10 мкМ БА - 70,0% и 68,1%,
соответственно. Наибольшее количество побегов, а именно 2,54; 2,14 и 2,77 шт.
на один эксплантат было получено при концентрациях в среде 5; 10 и 20 мкМ
БА.
В исследовании по микроразмножению Morus nigra L. лучшие результаты
по всем параметрам на этапе пролиферации были получены на среде MS с
содержанием 2 мг/л БАП, 0,1 мг/л тидиазурон и 0,25 мг/л НУК [13, s.77-84].
В другом исследовании [110, с.145-150] было установлено, что
использование БА стимулирует развитие каллуса и затрудненное образование
корней в процессе микроразмножения подвоев Maxma 14 и F12-1. Увеличение
концентрации БА, приводило к значительному увеличению каллуса и на
микропобегах подвоев Garnem 15 [104, с.81-87] и Gisela 6 [99, с.57-64].
Пугачёв Р.М. [69, 18с.] утверждает, что слива хорошо размножается в
культуре in vitro в среде с содержанием 0,5-0,75 мг/л БАП и 0,1 мг/л ИМК.
В работе с китайской сливой (Prunus salicina) самые длинные побеги
микрорастений отмечались на среде WPM с содержанием 0,2 мг/л
бензиладенина, 0,3 мг/л кинетина, 0,05-0,1 мг/л индолилмасляной кислоты и 1,0
г/л гидролизата казеина [183, с.214-218].
Вишня степная дает высокий коэффициент пролиферации при
добавлении в среду 1,0 мг/л БА и 0,1 мг/л ИМК [173, с.351-355].
Кухарчик Н.В. и др. [70, 208с.] подбирали питательную среду для
введения в культуру подвоев для черешни ОВП-2, ВСЛ-2, Gisela 5, Damil,
29
Измайловский. Они использовали модифицированную среду МS с
дополнением 6-БА (0,2 и 1,0 мг/л) и ИМК (0,2 и 0,6 мг/л). Лучшие результаты
отмечались на среде с добавлением 0,5 мг/л 6-БА (53,4% хорошо развитых
эксплантатов). В тоже время образование каллуса на данной среде наблюдали
на 4,4% чаще, чем на среде с добавлением 1,0 мг/л 6-БА (50,0% хорошо
развитых эксплантатов).
Целью исследования Arıcı Ş.E. [6, с.19-23] было модифицирование
питательной среды МS для получения высокого процента размножения в
культуре in vitro подвоев для косточковых плодовых культур. Самый высокий
коэффициент хорошо развитых эксплантатов для подвоя Myrobalan 29С был
отмечен на среде с добавлением 1,0 мг/л БАП и 0,2 мг/л НУК, для подвоя
MaxMa 60 на среде с 2,0 мг/л БАП и 0,02 мг/л НУК, для подвоя MaxMa 14 на
среде с 2,0 мг/л БАП, 0,2 мг/л НУК и 0,5 мг/л ГК3.
Güler S., Eşitken A. [9, с.10-16] хорошие результаты микрорамножения
подвоев MaxMa 14 и GF 677 получили добавляя в среду МS 1,5 мг/л ИМК и 0,1
мг/л ГК3.
Hepaksoy S. [11, с.67-80] в своем исследовании по размножению в
культуре in vitro подвоя MaxMa14 использовала среду МS (Murashige & Skoog)
с различными гормональными концентрациями. Показатель жизнеспособности
эксплантатов на этапе введения в культуру на среде MS + 1 мг/л БА + 0,1 мг/л
ИМК составил 41,67%; на среде MS + 1 мг/л БА + 0,1 мг/л ИМК + 0,1 мг/л ГК 3
составил 43,33%, т.е. добавление ГК3 в концентрации 0,1 мг/л повысило
показатель жизнеспособности эксплантатов.
Fidancı A. и др. [127, с.409-412] в своем исследовании по размножению в
условиях in vitro подвоев для черешни Gisela 5, MaxMa 14 в качестве
эксплантатов использовали верхушечные и боковые почки. На этапе введения в
культуру авторы использовали среду MS+0.1 мг/л ГК3+0.1 мг/л НУК.
Микропобеги укореняли на среде 1/2 MS+1 мг/л ИМК. В результате уже через
три недели было зафиксировано 95-100% полностью сформировавшихся
микрорастений.
30
 В работе Kamali K. и др. [136, с.175-177] с подвоем GF 677 лучшие
результаты на этапе пролиферации достигались при добавлении в среду Кнопа
1,0 мг/л БАП, на этапе укоренения на среде Linsmaier & Skoog с 0,3 мг/л НУК.
В другой исследовательской работе по укоренению того же подвоя GF
677 лучший коэффициент укоренения был получен на 1/2 Murashige & Skoog с
дополнением 3 мг/л ИМК [101, с.331-338].
Muna A.S. и др. [148, с.203-208] изучали влияние на микроразмножение
подвоев для черешни MaxMa 14 питательной среды Murashige & Skoog с
различными концентрациями и комбинациями из 2-х цитокининов
(бензиладенин и кинетин) и 3-х ауксинов (ИМК, НУК и ИУК). По результатам
исследования, среда МS + 4,44µМ БА + 0,49µМ ИМК оказалась самой
подходящей для микроразмножения черенков. С целью укоренения черенки
высаживали на питательные среды MS + 0,5 µМ НУК, МS + 2,45 µМ НУК, МS
+ 0,5 µМ ИМК, МS + 2,45 µМ ИМК и МS с половинчатым содержанием
макроэлементов. Самый высокий коэффициент укоренения был отмечен на
среде МS с дополнением 2,45 µМ ИМК (95%). Также было отмечено, что
добавление кинетина в среду для укоренения вызывало удлинение побега и
корней.
В работе по клональному микроразмножению подвоя для черешни Gizela
5 на этапе укоренения в среду МS было добавлено 0; 1; 2; 4; и 6 мг/л НУК. В
результате самое лучшее укоренение (92,88%) было получено на среде МS с 6
мг/л НУК [7, с.117-121].
Dejampour J. и др. [117, с.928-931] разработали методику
микроклонального размножения подвоя HS314 (миндаль, персик). Стерильные
эксплантаты пазушных почек вводили в культуру на модифицированную среду
DKW с добавлением 100 мг/л флороглюцинола и 0,5 мг/л БАП. На этапе
пролиферации эксплантаты пересаживали на ту же среду, но уже с
содержанием различных концентраций БАП (0,5; 1; 2 мг/л) и ИМК (0,1; 0,5
мг/л). Максимальное количество микропобегов наблюдалось на среде с
содержанием 2 мг/л БАП. Для укоренения использовалась среда DKW с
31
добавлением 0,5; 1; 2, 4 мг/л ИМК. Самые лучшие показатели численности и
длины корней были отмечены на среде с добавлением 2 мг/л ИМК. Процент
укоренения был улучшен с 66% до 85% путем уменьшения на половину
концентрации солей в среде DKW. В результате укорененные растения-
регенеранты были перенесены в условия in vivo и были с успехом
адаптированы к нестерильным условиям окружающей среды.
Ученые Zhou H. и др. [182, с.79-87] для введения в культуру in vitro
подвоя для культуры персика Nemaguard использовали питательную среду МS,
в которую были добавлены гормоны 3,55 µМ 6-БА и 7,38 µМ ИМК. Для
укоренения была использована среда ½ MS без цитокининов с добавлением
0,49; 2,46; 4,92 или 7,38 µМ ИМК, 3% сазарозы и 0,5% агара. На среде с
концентрацией 4,92 и 7,38 µМ ИМК было подучено 100%-ое укоренение.
Было изучено экзогенное применение ГК3 как стимулятора адвентивного
корнеобразования черешни. Установлено, что с применением ГК 3 процент
корнеобразования составил 80%, тогда как в контрольном варианте этот
показатель составлял 37% [129, с.127-133].
Fallahpour M. и др. [124, с.57-64] считают, что среда WPM, содержащая 2
мг/л ИМК наиболее эффективна для укоренения микрочеренков подвоя Gisela 5
(93,7%), по сравнению с MS (53,1%) и DKW (14,0%).
По мнению Erfani M. и др. [121, с.101-109] лучшей средой для укоренения
микрочеренков подвоя Garnem является среда ½MS с добавлением 2 мг/л ИМК.
В опытах по укоренению подвоя для персика PR 204-84 на этапе
укоренения была использована среда МS дополненная 5 µМ ИМК. В качестве
углеводов в среду добавляли сахарозу и глюкозу в одинаковых концентрациях
(0; 44; 88; 176; и 352 µМ), где с применением 88 µМ было достигнуто 100%-ое
укоренение [130, с.629-631].
Для микропобегов винограда сорта Мускат Александрийский лучшей
средой для укоренения оказалась среда MS с добавлением 1,0 мг/л ИМК + 0,5
мг/л НУК (укоренение – 83%, количество корней на побег – 3,4 шт, длина корня
- 4,5 см) [98, с.328-337].
32
 Среда MS + 1,0 мг/л НУК была лучшей для укоренения микрочеренков
винограда сорта Перлетт, где процент укореняемости составил 73,33%, при
средней длине корней 4,43 см [135, с.161-166].
Исследования Батукаева А.А. и др. [23, с.241-246] выявили, что наиболее
результативно развитие введенных в культуру in vitro эксплантатов винограда
проходит на питательной среде с добавлением 0,5-1,0 мг/л БАП. А для
скорейшего вытягивания стеблей микропобегов в среду необходимо
добавление 1,0 мг/л ГК3 и 0,5 мг/л БАП.
Прониной И.Н. [65, с.141-142] было изучено влияние длительности
воздействия ИМК на ризогенную активность подвоев для яблони 54-118 и
ММ106. Для активации процесса ризогенеза микропобеги в течение 4; 7 и 10
дней высаживали на агаризованную питательную среду 1/2МS с ИМК в
концентрациях 2,0; 2,5 и 3,0 мг/л, после чего пересаживали на среду свободную
от гормонов. Начало корнеобразования отмечалось уже через 10 дней при 4-х
дневном воздействии и всех концентрациях индуктора ризогенеза, а при 7 и 10-
дневном – только лишь через 16 дней. Через 4 недели культивирования
укореняемость достигала 83-100 %.
Также было установлено, что добавление в среду 50 мг/л аденинсульфата
приводит к повышению укореняемости микропобегов и улучшению качества
корневой системы [68, 158с.].
Magyar-Tаbori K. и др. [141, с.910-913] установили, что микропобеги
яблони сорта Royal Gala очень хорошо укореняются (76%) если на
предшествующем этапе культивировать их на среде с 1,0 мг/л БА на
протяжении 4 недель.
По мнению ученых, максимальное количество микропобегов подвоя для
сливы на этапе пролиферации достигается при добавлении в среду 0,5 мг/л
ИМК [159, с.19-23], а максимальная укореняемость микропобегов вишни
достигается на среде 1/2 MS + 2мг/л ИМК [173, с.351-355].

33
 Vaez-Livari B. и др. [178, с.171-178] считают, что лучшим гормоном для
корнеобразования у подвоя косточковых культур GF является индолилуксусная
кислота (ИУК) в концентрации 0,5 мг/л.
Hepaksoy S. [10, с.447-451] установила, что подвой GF 677 лучше
размножается на среде Murashige & Skoog с добавлением 2,0 мг/л БАП, 0,1 мг/л
НУК и 0,1 мг/л ГК3. Наилучшие результаты на этапе корнеобразования дало
применение среды MS с 1,0 и 1,5 мг/л нафтилуксусной кислоты (НУК).
Пугачёв Р.М. [69, 18с.] считает, что самая подходящая среда для
укоренения сливы является среда Quoirin-Lepoivre (Кворина-Лепуавра) с
половинчатым содержанием макро и микроэлементов c добавлением 0,001 мг/л
эпибрассинолида и 0,5-1,0 мг/л ИМК. К тому же культивирование
микрорастений в темноте в течение 2- недель также является обстоятельством,
увеличивающим эффективность укоренения.
Бугаенко Л.А. и Иванова-Ханина Л.В. [27, с.73-82] в результате
исследований установили, что укореняемость микрочеренков винограда сорта
Фрумоаса албэ выше на среде с концентрацией ИУК 0,5 мг/л. Отмечено
формирование интенсивно растущего побега, имеющего 4-6 хорошо развитых
корней длиной 32,7 ± 0,8 мм. При дальнейшем повышении концентрации ИУК
в среде происходило ингибирование роста растений, формировались
утолщенные и укороченные корни. Также было установлено, что
культивирование микрочеренков винограда сорта Каберне Совиньон на
вариантах среды с концентрацией ИУК 0,5-1,0 мг/л способствовало
формированию хорошо развитой корневой системы.
Naija S. и др. [150, с.83-91] изучали влияние полиаминов на процесс
укоренения in vitro подвоя для яблони ММ106. Использованные в исследовании
путресцин, спермидин, циклогексиламин и аминогуанидин повышали
укореняемость. А вот дифторометилорнитин в сочетании с индолилуксусной
кислотой очень сильно тормозил процесс ризогенеза.
Для микроразмножения 2 сортов иранского винограда Soltanin и Sahebi
была использована питательная среда МS различными гормональными
34
добавками: А (1,0 мг/л БА), В (1,5 мг/л БА), С (1,0 мг/л ИМК+1,5 мг/л БА), Д
(1,0 мг/л Тиазолидиндион). На питательных средах В и С автор получил
наибольшее количество побегов с одного апекса (3,8-5,4 шт.). Далее побеги
дважды субкультивировались на среде MS с 1,0 мг/л Тиазолидиндиона (TZD) +
1,5 мг/л ГК3. Полученные микрорастения укоренялись на среде MS с 1,0 мг/л
ИМК [97, с.5229-5232].
Dzazio P.M. и др. [120, с.759-764] в работе с подвоем для винограда 420-А
изучали воздействие различных концентраций БА и кинетина (0,1; 1,0; 5,0; 10,0
µМ) в составе различных питательных сред. На этапе введения в культуру
использовались среды MS (Murashige & Skoog); МS/2; МS/4; МS/8; WPM, на
этапе микроразмножения МS; МS/2; WPM, на этапе укоренения МS/2 и МS/2 с
добавлением 1,0 г/л активного угля. По результатам исследования, для подвоя
винограда 420-А на этапе введения в культуру лучший результат был отмечен
на среде МS + 1,0 µМ БА, а на этапе микроразмножения большее количество
побегов получено на среде МS/2.
Ekbiç H.B. и др. [8, с.65-70] размножали виноград сорта Изабелла на
среде Murashige & Skoog с добавлением 0; 1,0; 2,0; 3,0 и 4,0 мг/л БАП. Каждые
3 недели эксплантаты пересаживали на свежую питательную среду. Всего было
проведено 5 пассажей. На этапе укоренения вместо БАП добавляли ИМК в
концентрациях 0; 0,5; 1,0; 2,0 и 4,0 мг/л. По результатам исследования большее
количество побегов на всех 5 пассажах было получено на среде МS + 1,0 мг/л
БАП. Лучшие показатели укоренения и развития микрорастений были
получены на среде MS + 2,0 мг/л ИМК.
Tantos A. и др. [174, с.16-21] была изучена эффективность триаконтанола
при добавлении его в питательную среду на этапах введения и укоренения
эксплантатов подвоя яблони JTE-E4 и подвоя черешни Probocskai в
концентрации 2,0; 5,0; 10,0 и 20,0 мг/л. Авторы наблюдали увеличение
количества побегов на фазе размножения. В этом же исследовании эффект
триаконтанола был улучшен добавлением 0,5 мг индолил-3-масляной
кислоты/л.
35
 В разные годы Дорошенко Н.П. и др. [37, с.170-174; 39, c.26-27; 40, 21с.]
изучали эффективность универсальных регуляторов роста при
микроклональном размножении винограда. Так, по результатам их
исследований, установлено положительное влияние универсального регулятора
роста Эмистим [39, c.26-27; 40, 21с.], на повышение приживаемости меристем
на этапе ввода и регенерационной способности на этапе собственно
микроразмножения, что способствовало ингибированию вирусов и
оздоровлению растений от вирусной инфекции, стимулированию роста
растений на этапе микрочеренкования. Также учеными были представлены
результаты испытания регулятора роста полифункционального действия
Мелафен [37, с.170-174; 40, 21с.], введение которого в состав питательной
среды способствовало улучшению морфогенеза растений в культуре in vitro:
содействовало повышению приживаемости и развитию микрочеренков,
сокращению в среднем в 1,5-3 раза цикла развития микрочеренков, регенерации
их в растения.
Фартзинова И.М. [91] при приготовлении питательной среды для
микроразмножения яблони вместо обычных регуляторов роста предлагает
использовать настойку лимонника (15-20 капель/л) и экстракт родиолы (10-30
капель/л).
Казахские ученые Долгих С. и Нурдинова А. [36, c.44-46] на этапе
пролиферации перед посадкой на стерильную питательную среду
микрорастения подвоя яблони базальной частью опускали в стерильный
раствор женьшеня (1%) на 1 минуту, в результате чего коэффициент
размножения на этапе пролиферации повысился в среднем на 25%.
Майорова Ю.А. [55, 25c.] установила, что добавление 0,5-1,0 мг/л
биоянтарной кислоты в питательную среду для микроразмножения
существенно повышает коэффициент размножения вишни (до 20,4).
По мнению Упадышева М.Т. [90], сиреневая, феруловая, л-кумаровая
кислоты стимулируют побегообразование, а галловая, хлорогеновая кислоты и
флоридзин - корнеобразование (ризогенез).
36
 Беседина Е.Н. и др. [25, 24c.; 26, 142с.] в своих исследованиях по
микроразмножению подвоев яблони доказали эффективность добавления в
питательную среду фуролана и соли янтарной кислоты (сукцинат калия). По
мнению авторов, эти препараты могут быть отличной заменой классическим
регуляторам роста.
Последнее время в питательные среды вводят относительно
малоизвестное соединение, флороглюцин (1,3,5-тригидроксибензол), которое
является продуктом распада флоридзина, обладает характеристиками,
способствующими росту растения. Флороглюцин увеличивает образование
побегов и соматический эмбриогенез некоторых садовых и зерновых культур.
При добавлении в среду для укоренения вместе с ауксином флороглюцин
дополнительно стимулирует укоренение [107, с.331-335; 175, с.1-16].
Судя по обзору литературных источников, единого мнения авторов о
комбинации и концентрации регуляторов роста в питательной среде, даже для
одной и той же культуры, нет.

1.3.2. Антибиотики и антиоксиданты

Помимо регуляторов роста в питательную среду для борьбы с

сапрофитной микрофлорой вводятся антибиотики.
Бунцевич Л.Л. и др. [29] считают, что антибиотик гризеофульвин (500
мг/л) очень эффективен для санации эксплантатов подвоя для яблони ММ 106.
Было также выявлено положительное действие препаратов цефотаксим,
эмистим, мелафен на первых трех этапах клонального микроразмножения
винограда [40, 21с.].
Используя цефотаксим (0,1-0,5 мг/л) и канамицин (10 мг/л) возможно
добиться полной элиминации от посадочной и средовой инфекции при
микроразмножении вишни [55, 25с.].
Корнацкий С.А. [47, 24с.] предлагает добавлять в питательную среду
протеиновую добавку гидролизат казеина (0,5-1,0 г/л) для того, чтобы ускорить

37
развитие патогенов для последующего отбора стерильных эксплантатов.
Известен также способ, при котором на этапе введения растений в
культуру in vitro в среду добавляется антибиотик нистатин в концентрации 25-
100 мг/л [20].
В качестве антиоксидантов, которые чаще всего добавляют
непосредственно в питательную среду, используют аскорбиновую кислоту,
глютатион, дитиотриэтол, поливинилпирролидон. А, в роли адсорбента
используется активированный уголь [126, с.181-185].
По мнению Skirvin R.M. и др. [168, с.183-197] микроразмножение подвоя
яблони М9 лучше проходит на среде Linsmaier & Skoog. А для предотвращения
окислительных процессов, вследствие которых, среда темнеет,
морфогенетическая активность угнетается, автор рекомендует добавлять в
питательную среду антиокислители (поливинилпирролидон, глютатион,
хлорогенцинол) или адсорбенты (активированный уголь).
Antonopoulou C. и др. [102, с.559-561] изучали воздействие аскорбиновой
кислоты на укоренение подвоев GF 677 в культуре in vitro. Аскорбиновую
кислоту добавляли в 4 различных концентрациях (0; 0,1; 1,0 и 10,0 мг/л).
Изучив результаты исследования, авторы сделали вывод, что аскорбиновая
кислота не оказывает никакого влияния на укоренение.
Дорошенко Н.П. [38, 204c.] в своих исследованиях изучала влияние
питательной среды, в которую были добавлены различные антиоксиданты и
антибиотики, на ростовые процессы эксплантатов. Было установлено, что
добавленный в питательную среду активированный уголь и бициллин в
концентрации 0,1 мг/л снижает гибель эксплантатов из-за отсутствия некроза.
Также было установлено, что активированный уголь и бициллин (0,1 мг/л)
стимулирует образование большего числа листьев.
Анализ литературных источников позволяет сделать вывод что, любое
растение требует индивидуального подхода, и что, для каждого отдельного
сорта необходимо подбирать собственный состав питательной среды для
микроразмножения.
38
 1.4. Выбор эксплантата для введения в культуру in vitro

Возможность и успешность прохождения всех этапов микроразмножения

определяется, главным образом, генотипом растения - источника эксплантатов.
Выбирая эксплантат, принимают во внимание метод микроразмножения,
время года, стадию развития растения-донора. Кроме этого необходимо
учитывать, что:
 у эксплантатов, взятых в вегетационный период, процент
жизнеспособности выше;
 наземная часть, так и внутренняя часть растения, менее инфицирована;
 чем меньше эксплантат, тем выше процент получения здорового
растения;
 эксплантаты, взятые из верхушечной почки, отличаются высокой
регенерацией [89, 56с.].
Учитывая вышесказанное обычно, в качестве эксплантатов для введения
в культуру in vitro используют верхушечные, пазушные, боковые почки и их
меристемы, взятые в вегетационный период.
Изоляция эксплантата. Чрезвычайно важным моментом является
фенологическое состояние объекта в момент вычленения эксплантата. Для этой
цели лучше всего подходят только начавшие рост побеги длиной от 1,0 до 3,0
см. При этом не имеет значения, были ли взяты такие побеги прямо на
материнском дереве в открытом грунте в момент начала вегетации (первая
декада мая), или же однолетние побеги были срезаны в середине марта и
поставлены на распускание в помещении в сосудах с водой [70, 208с.]. Так, в
исследовании с подвоем для косточковых плодовых культур GF 677 изучалась
зависимость укоренения in vitro от сроков взятия эксплантатов. Эксплантаты
брали с пятилетнего подвоя GF 677 в период начала вегетации и период
активного роста (февраль, март, апрель и июнь). По результатам исследования,
самый высокий процент укоренения был у эксплантатов, введенных в культуру
в феврале (53,5%) и марте (49,7%), то есть в период начала вегетации [169, с.15-

39
18]. Однако, Choudhary R. и др. [114, с.462-467] в процессе разработки
протокола микроразмножения миндаля в качестве эксплантатов использовали
спящие пазушные почки.
Размер эксплантатов также имеет немаловажное значение. Учеными
установлено, что чем меньше размер эксплантата, тем выше процент получения
здорового, безвирусного растения. Образовательная ткань в точках роста
отличается отсутствием вирусов. Однако, Калинин Ф.Л. и др. [44, 232с.]
утверждают, что жизнеспособность меристем без листовых примордиев
размером 0,1-0,2 мм составляет всего 1-10 %. Увеличивая размер эксплантата
до 10 мм, процент возможной инфицированности возрастает, но вместе с тем
процент жизнеспособных растеньиц намного выше.
Таким образом, учёные едины во мнении, что такие показатели, как
генотип растений, происхождение эксплантата, сроки изоляции, размер
эксплантатов оказывают безусловное влияние на результативность
микроразмножения.

1.5. Условия культивирования эксплантатов in vitro

Под понятием условия культивирования подразумеваются уровень и

продолжительность освещения, спектральный состав света, температура и
влажность воздуха [94, 193с.]. Все эти параметры для каждой культуры
подбираются индивидуально.
Источник света является одним из наиболее важных факторов,
контролирующих развитие растений. Качество света (спектральный состав),
интенсивность света (поток фотонов) и фотопериод оказывают глубокое
влияние на морфогенез и рост растения, а также на содержание хлорофилла в
растительной клетке.
Традиционным источником света, используемым в культуральных
комнатах биотехнологической лаборатории, являются флуоресцентные
(люминесцентные) лампы (FL), спектральный состав которых близок к

40
естественному, а тепловое излучение невелико. Но энергопотребление при
использовании FL является дорогостоящим и создает широкий диапазон длин
волн, ненужных для развития растений. С появлением технологии светодиодов
(LED) был достигнут впечатляющий прогресс. Многие ученые в ходе своих
исследований подтвердили, что светодиодный свет больше подходит для
морфогенеза и роста растений, чем FL [108, с.93-103].
По мнению многих ученых, на первых двух этапах микроклонального
размножения растений освещенность в климатической комнате (или камере) не
должна превышать 2500-3000 Лк, а фотопериод должен составлять 16/8 часов
[26, 142c.; 56, 155c.; 94, 193с.].
Немаловажен и спектральный состав света. Спектры, обычно
используемые для культивирования in vitro, - это белый, красный, синий и
смешанные тона синего и красного.
Большую работу по изучению влияния спектра освещения на развитие
растений in vitro проделали итальянские ученые Muleo R. и Morini S. [146,
с.364-370; 147, с.1838-1846]. Они выявили, что дифференциация боковых почек
и развитие новых побегов ММ106 (подвой яблони) в культуре in vitro
регулируются изменением спектрального состава света [146, с.364-370]. Ими
было установлено, что у растений находящихся при красном спектре
освещения степень апикального доминирования снижается, степень ветвления
побегов усиливается. При синем спектре освещения, наоборот, степень
апикального доминирования повышается, степень ветвления побегов
понижается [147, с.1838-1846].
В исследованиях по изучению влияния светодиодных ламп на
культивирование in vitro было установлено, что красный спектр света
светодиодных ламп влияет на удлинение побегов и стеблей, изменения в
анатомии растений [156, с.147-153; 164, с.273-282], синий спектр влияет на
биосинтез хлорофилла, открытие устьиц и фотосинтез [156, с.147-153].
Сочетание синего и красного светодиодов использовалось для исследований во
многих областях фотобиологических исследований, таких как фотосинтез и
41
синтез хлорофилла [176, с.85-92].
Кроме всего вышесказанного, существует мнение, что этиоляция
(содержание растений в условиях темноты) положительно влияет на ростовые
движения растений [56, 155c.; 66, с.76-81]. К примеру, содержание
эксплантатов яблони в темноте на протяжении 2-х недель способствовало
большему образованию придаточных побегов на 10-40% [56, 155c.].
В работе Прониной И.Н. [66, c.76-81] отмечено, что этиоляция
микропобегов в начальный период укоренения в течение 5-10 суток оказывала
положительное влияние на ризогенез клоновых подвоев яблони и клоновых
подвоев и сортов груши.
Другими учеными [34, c.73-85; 95, c.35-39] установлено, что действие
этиоляции на рост корневой системы подвоев яблони зависит от сортовой
принадлежности, от способа и продолжительности этиоляции, температурного
режима и состава питательной среды.
К факторам, контролирующим развитие микрорастений in vitro, также
относятся температура и влажность воздуха.
Температура в культуральной комнате подбирается с учетом потребности
культивируемого растения. Обычно микрорастения содержатся 16 часов (днём)
° °
при температуре +20...+25 С и 8 часов (ночью) при температуре +18...+22 С
[70, 208c.; 96, 49с.].
К примеру, для хорошего развития и размножения микрорастений
винограда обычно оптимальной является температура +23...+25°С [19, c.116-
119; 28, 8c.]. Но результаты исследований Реброва A.Н. и др. [71, 13c.]
показали, что введенные в культуру in vitro эксплантаты винограда отличаются
высокой регенерационной способностью при содержании их в условиях
+24...+27°С.
Влажность воздуха играет большую роль на этапе адаптации
микрорастений и в зависимости от этапа адаптации составляет 65–100 % [70,
208c., 96, 49с.].

42
 Таким образом, условия культивирования микрорастений должны
подбираться индивидуально и напоминать условия природного ареала
произрастания культивируемого растения.

1.6. Адаптация микрорастений к условиям ex vitro

Адаптация растений-регенерантов к нестерильным условиям
окружающей среды (условия ex vitro) является заключительным этапом
микроразмножения растений. Это стрессовый этап для микрорастений,
неприспособленных к обычным условиям среды, где оптимальные параметры
развития надземной части и корневой системы влияют на успешность
акклиматизации растений [95, с.35-39].
В процессе адаптации полученных in vitro растений к условиям ex vitro
используется большое разнообразие субстратов. По мнению Leite G.B. и др.
[140, с.977-982] вермикулит в качестве субстрата идеален для укоренения
микрорастений подвоев для груши Bartlett и OHF 97. На данном субстрате
микрорастения сформировывали сильную разветвленную корневую систему с
хорошо развитыми корневыми волосками.
Было изучено влияние различных субстратов (вулканический шлак,
перлит, торф и смесь из равных частей песок – садовая почва - удобрение) на
развитие растений-регенерантов подвоев для черешни Gizella 5 и Gizella 6 на
этапе акклиматизации. Самое лучшее морфологическое развитие (корни,
листья, стебель) показали растения, высаженные в торф [12, с.23-34].
Для адаптации микрорастений винограда, Батукаев М.С. [24, с.201-205]
использовал цеолитовый субстрат, который имеет полноценный состав
элементов минерального питания. Наблюдалось очень хорошее формирование
корневой и надземной части растений.
Белорусские ученые [95, с.35-39] изучали морфологические показатели
развития растений-регенерантов подвоя яблони 54-118 при адаптации ex vitro
на 3-х различных субстратах - ионообменный субстрат Биона-111, агроперлит,
торф. Хорошие результаты были получены на субстратах Биона-111 и
43
агроперлит. Единственное отличие - это коэффициент развития корневой
системы, который на Бионе-111 был значительно выше (5,72±0,69). Вследствие
этого, авторы, принимая во внимание очень высокую стоимость ионообменного
субстрата Биона-111, для адаптации растений-регенерантов подвоя яблони 54-
118 предлагают использовать более дешевый агроперлит, который позволяет
получить высокий процент адаптированных растений-регенерантов (70,44%).
Также изучалось влияние субстрата Биона-111 и Биона-111+AQUASORB
3005 KB на адаптацию к нестерильным условиям предварительно укорененных
в условиях in vitro растений некоторых сортов винограда. Было установлено,
что на длину корневой системы растений-регенерантов значимо влиял только
сорт винограда [74, с.128-131].
Микрорастения фисташки адаптировали в тепличных условиях на
субстрате торф + перлит + вермикулит, в соотношении 1:1:1, в результате чего
было получено 85% адаптированных растений [109, с.353-358].
Подорожный В.Н. и Майорова Ю.А. [63] получили высокий процент
адаптированных растений вишни ex vitro при высадке их в стерильный перлит,
расположенный над нестерильным почвенным субстратом. При этом перлит
увлажнялся раствором минеральных солей и покрывался пленкой.
Некоторые ученые предлагают адаптировать микрорастения на
гидропонике [115, с.133-139] с плавающими лотками или на гидропонной
установке «Минивит», заполненной жидкой питательной средой, применив
которые были получены 100 %-ные результаты на этапах пролиферации и
ризогенеза [64, с.43-48].
Беседина Е. [25, 24c.] установила положительное влияние
модифицированного чернозема с добавлением раствора 1/2 MS на
приживаемость (90%) и дальнейшее развитие микрорастений некоторых
подвоев яблони.
Таким образом, для растений-регенерантов каждой отдельной культуры и
каждого отдельного сорта необходимо разрабатывать свою технологию
адаптации к условиям окружающей среды, которая является самым
44
ответственным и заключительным этапом микроразмножения в целом.
II ГЛАВА. УСЛОВИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Место и условия проведения исследований

Исследования проводились в лабораторных и полевых условиях.

Лабораторные работы проводились в биотехнологических лабораториях НИИ
Плодоводства и Чаеводства MСХ Азербайджана (Губинский район, поселок
Зардаби, 2017-2019 гг.) и РУП “Института Плодоводства” НАН Беларуси
(г.Минск, аг. Самохваловичи, 2017 г.), Полевые исследования велись на 1-м и 2-
м поле плодового питомника НИИ Плодоводства и Чаеводства MСХ
Азербайджана (2016-2019 гг.).
Губа-Хачмазская зона расположена на северо-востоке республики. С
востока она омывается водами Каспийского моря, а с запада и юго-запада
окружена горной цепью Большого Кавказа. Высота опытного участка над
уровнем моря 350 м. Почвенный покров представлен луговыми –лесными и
коричневыми почвами. Почва имеет аллювиальную и пролювиальную
структуру. Грунтовые воды протекают на глубине 5 м и поэтому культуры
сельского хозяйства здесь развиваются очень хорошо.
Климат полувлажный, умеренно-теплый. По данным (таблица 2.1.1,
рисунок 2.1.1), составленным по результатам учетов и наблюдений Губинской
гидрометеостанции, среднегодовая температура за годы исследований
составила 11,8°C.
Таблица 2.1.1
Средняя месячная и годовая температура, °C
годоваяСредняя

Годы МЕСЯЦЫ

I II III IV V VI VII VIII IХ Х ХI ХII

2016 0,5 3,6 6,3 12,4 16,0 20,5 22, 24,8 17,3 9,4 4,9 -0,4 11,5
45
 7
2017 0,1 -0,6 5,3 10,2 15,9 19,2 24, 24,4 19,8 11,4 7,0 3,6 11,7
3
2018 0,1 2,3 5,8 10,8 18,1 21,1 26, 21,8 18,7 13,7 6,1 3,6 12,3
0
Среднее 0,23 1,7 5,8 11,1 16,6 20,2 24, 23,6 18,6 11,5 6,0 2,2 11,8
3
Причем разница между среднегодовой температурой 2016-го (11,5°C) и
2018-го (12,3°C) годов составляет 0,8°C. Самыми холодными месяцами были
декабрь 2016-го и февраль 2017-го годов, когда среднемесячная температура
составляла -0,4 и -0,6°C, соответственно. Самые высокие среднемесячные
температуры наблюдались в августе 2016-го (24,8°C) и 2017-го (24,4°C) года,
максимальная - в июле 2018-го (26,0°C) года.

Рисунок 2.1.1. Температура воздуха за годы исследований (2016-2018 гг)

В годы исследований максимальное количество осадков (таблица 2.1.2,

рисунок 2.1.2) выпало в 2016-м году (среднегодовое 57,6 мм), минимальное
количество - в 2017-м году (среднегодовое 38,0 мм).
Таблица 2.1.2
Месячные и годовые осадки, мм
Средняя

Годы МЕСЯЦЫ

46
 I II III IV V VI VII VII IХ Х ХI ХII
I

2016 70, 33,8 100,3 68,7 50,7 41,9 60, 11,1 58,9 129,5 49,7 16,0 57,6
5 5
2017 34, 29,6 23,7 35,5 98,3 79,6 3,6 3,4 37,7 44,1 45,8 20,6 38,0
3
2018 42, 42,7 60,6 29,8 32,4 40,0 7,0 37,2 15,8 35,8 62,4 20,6 40,7
4 5
Среднее 49, 35,3 61,5 44,6 60,4 53,8 23, 17,2 37,4 69,8 52,6 19,0 45,4
0 7 5

В целом за годы исследований среднее количество выпавших осадков

составило 45,45 мм. Если рассмотреть данные в таблице 2 по временам года, то
большее количество осадков выпало осенью (159,8 мм) и весной (166,5 мм),
меньшее количество - зимой (103,3 мм) и летом (94,7 мм).

Рисунок 2.1.2. Количество осадков за годы исследований (2016-2018 гг.)

2.2. Объекты исследований

Клоновые подвои косточковых и семечковых плодовых культур GF 677,

Myrobalan 29C, MaxMa 14, Garnem 15, OHF 87, сорта винограда народной
селекции Мадраса и Баян Ширей.
Garnem 15 (P.amygdalus x P.persica) [80, с.42-46; 85, с.73-75] - kлон,
полученный в Испании от скрещивания испанского миндаля Garfi и
47
североамериканского персика Nemared. Garnem зарегистрирован Европейским
Сообществом Сорта Растений под номером 16363. Этот подвой идеален для
сортов миндаля, персика и нектарина и демонстрирует отличную
совместимость с привоем. Растения в питомнике растут очень хорошо и их сила
роста сходна с подвоями GF 677. Растения имеют вертикальный рост с
небольшим опущением или без него в течение первого вегетационного
периода. Листья крупные и красные, с характеристиками сходными с листьями
миндаля и персика. Устойчив к условиям засухи и плохим почвам; уровень
устойчивости к хлорозу железа ниже, чем у GF 677; низкая устойчивость к
нехватке кислорода вызванной заболачиванием; хорошая приспособляемость в
случаях пересадки. Растения, привитые на этот подвой, лучше развиваются, чем
растения, привитые на GF 677, и нуждаются в летней обрезке, чтобы избежать
чрезмерного роста побегов и затенения внутри кроны, что негативно влияет на
размер и качество плодов. Подвой устойчив к основным видам корневой
нематоды, поражающей сливу, включая Meloidogine arenaria, M.hispanica,
M.incognita и M.javanica. Восприимчив к поражению корневой нематоды
Pratylencus vulnus. Восприимчивый к Agrobacterium tumefaciens. Garnem может
заменить GF677 в почвах зараженных нематодами, но его устойчивость к
заболачиванию и известняковым почвам ниже, чем у GF 677 .
Подвой GF6 77 (Prunus persica х Prunus amygdalus) [16, 78с.; 80, с.42-46;
85, с.73-75] - гибрид P.persica и P.amygdalus, отобран INRA, Grande Ferrede,
Bordeaux (Франция). Хороший подвой для персика, сливы и миндаля. Имеет
отличную производительность. Подвой сильный, устойчив к известковым
почвам (более 11% активной извести) и условиям засухи, чувствителен к
заболачиванию (но в меньшей степени, чем сеянцы персика). Подходит для
плохих почв и устойчив к болезням. Достаточно устойчив к Fusicoccum и
Coryneum, средне чувствителен к Verticilium и Phytophtora cactorum, очень
чувствителен к Stereum purpureum, Agrobacterium tumefaciens, Armillaria mellea
и к корневым нематодам. Подвой показывает отличную совместимость с
привоями и высокую урожайность. Это наиболее часто используемый подвой
48
для персика и нектарина в европейских странах. Деревья, привитые на этот
подвой, нуждаются в летней обрезке, чтобы контролировать рост побегов. Это
стандартный подвой для бедных, сухих и известковых почв, а также для
тяжелых почв.
Подвой Myrobalan 29C (Prunus cerasifera L.) [16, 78с.; 86, с.127-133].
Клон выбран из потомства Prunus cerasifera в Калифорнии (США). Подвой для
слив и большинства сортов абрикоса. Подходит для всех типов почв, хорошо
адаптируется к сухим и тяжелым грунтам с низкой проницаемостью. Умеренно
устойчив к Agrobacterium tumefacens, Verticillium и Leptonecrosis, восприимчив
к Pseudomonas syringae и устойчив к корневым нематодам (Meloidogyne spp).
Устойчив к известняковым почвам (8-9% активной извести). Подходит для
пересадки. Все сорта сливы демонстрируют отличную совместимость с
подвоем и высокую эффективность урожая. У сортов сливы этот подвой
снижает силу роста на 15-20% по сравнению с подвоем Myrobalan B. Сосущая
активность корней обычно низкая.
Подвой MaxMa 14 - гибрид Prunus mahaleb x Prunus avium [1, 180с.; 163,
с.185-192] получен в Орегоне (США). Растения в питомнике обладают средней
силой роста. Имеют хорошо развитую корневую систему. Совместимость с
сортами черешни хорошая. Растения, привитые на этот подвой, примерно на
20% более развиты, чем растения, привитые на CAB 6P, и примерно на 30%
меньше, чем растения, привитые на саженцы вишни. Подвой подходит для почв
с хорошим дренажом и для полузасушливых районов с высокой потребностью
в испарении и низким уровнем осадков; устойчив к известковым почвам, не
подходит для тяжелых почв. Средняя восприимчивость к Phytophtora cactorum
и Verticillium dahlae; чувствителен к Armillaria mellea, устойчив к Pseudomonas
syringae и Agrobacterium tumefaciens. Все сорта черешни, привитые на
MахMа14, показывают более раннее вступление в плодоношение, более
высокую урожайность и лучшее качество фруктов по сравнению с сортами,
привитыми на семенные подвои. Подходит для закладки интенсивных и
суперинтенсивных садов (600-800 деревьев / га).
49
 Подвой OHF 87 (ФАРОЛД® 87) происходит из серии скрещивания
сортов Оулд Хоум и Фармигдейл. Характеризуется хорошей совместимостью с
сортами груши Вильямс красный, Конферанс и, как правило, с любыми
сортами груш; высоко устойчив к хлорозу; устойчив к бактериальным
болезням; толерантность к высоким температурам выше, чем у айвы.
Характеризуется высокой зимостойкостью. Обеспечивает снижение высоты
дерева до 70 % от классической (полукарлик).
Мадраса [4, с.560-588] - один из лучших винных сортов винограда
азербайджанской народной селекции. Лист средней величины, округлый,
глубокорассеченный. Лист снизу не опушенный. Цветок обоеполый. Гроздь
средней величины или крупная, ширококонической формы, ветвистая, средней
плотности. Гроздь весит максимум  140 г.  Ягода средней величины весом 100-
135 г (100 ягод). Цвет кожицы темно-синий. Кожица ягоды сверху покрыта
восковым налетом. Мякоть ягоды очень сочная, светло зеленого окраса, кисло-
сладкая. Кусты средней силы роста. Сорт винограда Мадраса слабоустойчив
к милдью, оидиуму и серой гнили. Неустойчив к морозу. Виноград
сравнительно засухо- и хлорозоустойчив.
Баян Ширей [4, с.560-588] - также является местным азербайджанским
винным сортом позднего созревания. Кусты сильнорослые. Листья крупные,
пятилопастные, снизу не опушенные. Цветок обоеполый. Грозди
цилиндрической и цилиндроконической формы, среднекрупные. Цвет ягод
зеленовато-желтый, сверху они покрыты восковым налетом. Мякоть сочная.
Сорт винограда Баян Ширей среднеустойчив к милдью и оидиуму. Неустойчив
к морозу и засухе.

2.3. Методы исследований

Исследования проводились в четыре последовательных этапа:

 первый этап - введение в культуру, размножение и укоренение растений
методом in vitro;

50
 второй этап - адаптация растений-регенерантов к нестерильным условиям
среды;
 третий этап - высадка полученных подвоев на первое поле питомника;
 четвертый этап - прививка, получение здорового посадочного материала.
Схема проведенных исследований поэтапно показана на рисунке 2.3.1.

I этап - Микроразмножение растений

Введение в Микроразмно Адаптация в
Укоренение
культуру жение лабораторных условиях

II этап - Адаптация растений-регенерантов к нестерильным

условиям окружающей среды
Адаптация в условиях теплицы Адаптация под теневой сеткой

III этап - Высадка адаптированных растений на I-ое поле

плодового питомника

IV этап - Выращивание саженцев

Рисунок 2.3.1. Схема проведения исследований

На первом этапе, были подобраны оптимальные схемы стерилизации

эксплантатов, оптимальные составы питательных сред, композиции ростовых
веществ для стимулирования ризогенеза, оптимальный состав субстратов и
условий культивирования в условиях лаборатории.
На втором этапе был продолжен процесс адаптации растений-
51
регенерантов уже к условиям нестерильной среды в теплице и под теневой
сеткой.
Исследования третьего и четвертого этапов были направлены на изучение
дальнейшего развития растений-регенерантов, в частности подвоев
косточковых плодовых культур, на первом поле для окулировки, которое было
заложено по новой для Азербайджана технологии.
2.3.1. Методика лабораторных работ и исследований при

микроразмножении плодовых культур и винограда in vitro

Процесс введения в культуру, пролиферации, ризогенеза и

первоначальной адаптации проводили по методикам микроразмножения
растений Института Физиологии растений и генетики НАН Украины (Ф.Л.
Калинин, Г.П. Кушнир, В.В. Сарнацкая, 1992) [44, 232с.] и РУП Института
плодоводства НАН Беларуси (Н.В.Кухарчик, М.С.Кастрицкая, С.Э.Семенас и
др., 2016) [70, 208с.] с нововведениями, касающимися схемы стерилизации
эксплантатов, состава питательных сред и условий культивирования (глава 3).
В лабораторных исследованиях использовалось следующее
оборудование:
- автоклав HMC HİRAYAMA - HV 110 L;
- дистиллятор P. Selecta DİSTİLLER L-4B;
- термостат Nuve FN 055;
- весы аналитические Presica XB 220A;
- весы технические Presica BJ 6100D
- мешалка магнитная с температурным режимом Velp Scientifica;
- ламинарный бокс NUVE MN 090;
- микроскоп BEL;
- PH Metr SELECTA 2006;
- комби-шейкер N-Biotek – NB 101 MC.
Работа в лаборатории требует соблюдения строгих правил
стерильности и техники безопасности.

52
 Стерильность в лабораторных работах
Один из факторов обусловливающих результативность размножения
растений в культуре in vitro. Инструменты (скальпели, пинцеты) и бумажные
матрасики, завернутые в пергаментную бумагу или алюминиевую фольгу,
заранее стерилизовали в термостате при температуре +210°С в течении 20
минут, питательную среду автоклавировали при давлении 1 атм. и температуре
+121°С также в течение 20 минут.
Перед началом работ все поверхности (включая пол) в стерильной
комнате обрабатывали раствором Доместоса или другого хлорсодержащего
препарата. Ламинар-боксы протирали 95%-ным спиртом, вносили заранее
простерилизованные инструменты, бумажные матрасики, питательные среды и
включали бактерицидную лампу на 20-30 минут. Перед работой в ламинарном
боксе исследователь тщательно вымывал руки с мылом, переодевался в
стерильный халат, сменную обувь, надевал шапочку и одноразовую маску и
перчатки. Во время работы в ламинарном боксе проводилась постоянная
дезинфекция рук спиртом путем протирания или опрыскивания, избегали
движений руками над стерильными открытыми сосудами с питательной средой
и матрасиками с эксплантатами. Кроме этого, после каждой манипуляции
инструменты погружали в стакан с 95%-м спиртом, после чего обжигали в
пламени спиртовой горелки. Во избежание повреждения тканей
микрорастений, инструменты использовали только после их полного
охлаждения.
Все манипуляции с микропобегами производили максимально быстро,
так как всегда существует риск занесения инфекции извне.
Характерные особенности эксплантатов
В качестве эксплантатов для введения в культуру in vitro использовали
верхушечные и боковые почки неодревесневших побегов клоновых подвоев
косточковых плодовых культур GF 677, Myrobalan 29C, MaxMa 14, Garnem 15,
OHF 87 и сортов винограда Мадраса и Баян Ширей и их меристемы.
Так, для введения в культуру in vitro с растений с доказанной сортовой
53
принадлежностью срезали верхушки побегов с 4-5 почками. Побеги очищали от
листьев, заворачивали во влажную ткань и немедля доставляли в лабораторию.
Далее уже в лаборатории побеги разрезали на сегменты величиной 1-1,3 см с
одной верхушечной или пазушной почкой, которые после тщательной
стерилизации высаживали (помещали) в вертикальном или слегка наклонном
положении по одному в культуральные сосуды с питательной средой. Если в
качестве эксплантатов использовали меристему, то при помощи пинцета и
скальпеля под бинокулярным микроскопом из каждой почки вычленяли конус
нарастания (меристема) с несколькими листовыми примордиями и
незамедлительно высаживали на питательную среду.
Стерилизация эксплантатов
В данном процессе, в зависимости от особенностей растительного
материала, использовалась одна из схем стерилизации представленных в
таблице 2.3.1.1 [82, 42с.]:
Таблица 2.3.1.1
Варианты схем стерилизации растительного материала
при введении в культуру in vitro
Вариант Схема стерилизации
I Промывка проточной водой (1,5 часа), обработка фунгицидом 0,2%
бенлатом (20 мин), обработка 30%-ной перекисью водорода (10 мин),
промывка в стерильной воде 3 раза (по 5 мин)
II Промывка проточной водой (1 час), обработка фунгицидом 0,2%
бенлатом (20-30 мин), обработка 70%-м спиртом (1 мин), промывка
стерильной водой, обработка 33%-ной перекисью водорода (10 мин),
промывка стерильной водой 3 раза (по 10 мин)
III Промывка проточной водой (1 час), обработка 70%-м спиртом (3 сек),
промывка проточной водой, обработка 0,1%-ным хлоридом ртути HgCl2
(2-3 мин), промывка стерильной водой 3 раза (по 5 мин)
IV Промывка проточной водой (10-15 мин), обработка раствором фунгицида
(20-30 мин), промывка проточной водой, обработка 5%-ным
гипохлоридом натрия (20-30 мин), промывка стерильной водой 3 раза (по
5 мин)
V Промывка проточной водой (10-15 мин), обработка раствором фунгицида
Caputan (20-30 мин), промывка проточной водой, обработка 5%-ным
гипохлоридом натрия (20-30 мин), обработка растворенной хлорной
54
 таблеткой (1 табл/500 мл воды)
VI Промывка проточной водой (10-15 мин), обработка 70%-ным раствором
этанола (20 сек), обработка 0,1%-ным раствором нитрата серебра (15
мин), промывка стерильной водой 3 раза (по 5 мин)

Протокол стерилизации эксплантатов [82, 42с.]:

1. У растений с доказанной сортовой принадлежностью срезают молодые
побеги и очищают от всех листьев. Перед внесением в лабораторию
опрыскивают 70% этанолом.
2. а. Неодревесневшие побеги разделяют на сегменты величиной 1-1,3 см с
одной верхушечной или пазушной почкой;
б. С побегов срезают все почки с верхним слоем коры.
3. Эксплантаты группируют по толщине и собирают в баночки по 25-30 штук в
каждую.
4. В баночки наливают воду и добавляют 1-2 капли мыльного раствора,
взбалтывают, оставляют на 10 минут. Далее эксплантаты промывают под
проточной водой в течение 5-7 минут.
5. Эксплантаты заливают заранее приготовленным раствором фунгицида (30 г
фунгицида / 970 мл воды). Баночки закручивают крышками и для
продолжительного взбалтывания устанавливают на шейкер-ротатор на 20-25
минут. По истечении времени эксплантаты повторно промывают под
проточной водой в течение 10 минут до полного очищения от фунгицида. Все
эти манипуляции проводят в нестерильных условиях.
6. Дальнейшие работы ведутся в стерильных условиях ламинарного бокса. В
ламинарный бокс заранее ставят сосуд с раствором стерилизующего агента,
предварительно автоклавированные баночки со стерильной водой и пробирки с
питательной средой, простерилизованные пинцеты и скальпели, бинокулярный
микроскоп.

55
7. Баночки с эксплантатами тщательно опрыскивают 70% спиртом со всех
сторон и вносят в ламинарную кабину.
8. Эксплантаты заливают раствором основного стерилизующего агента,
активно перемешивают.
9. По истечении времени стерилизации эксплантаты пинцетом вынимают из
раствора стерилизующего агента и помещают в баночки со стерильной водой.
Проводится трехкратная промывка эксплантатов стерильной водой по 3-5
минут каждая.
10. а. Эксплантаты оставляют в последней порции стерильной воды и по
одному высаживают в пробирки с питательной средой;
б. При помощи пинцета и скальпеля под бинокулярным микроскопом из
каждой почки вычленяется меристема и незамедлительно высаживается на
питательную среду.
Состав питательной среды [82, 42с.] имеет немаловажное значение и в
значительной степени определяет эффективность клонального
микроразмножения. Растительные ткани и среды для культивирования клеток
обычно состоят из всех или некоторых из следующих компонентов:
макроэлементы, микроэлементы, витамины, аминокислоты или другие азотные
добавки, сахар(а), другие плохо изученные органические добавки, отвердители
или системы поддержки и регуляторы роста.
Макроэлементы представлены шестью основными элементами: азот (N),
фосфор (P), калий (K), кальций (Ca), магний (Mg) и сера (S), которые
необходимы для роста растительных клеток или тканей. Для достижения
максимальной скорости роста оптимальная концентрация каждого
питательного вещества значительно варьирует в зависимости от вида растения.
Для нормального роста растительных клеток питательные среды должны
содержать не менее 25-60 мМ неорганического азота. Растительные клетки
растут только на нитратах. Тем не менее, у большинства видов растений
значительно лучшие результаты достигаются, когда среда содержит источник
нитрата и аммонийного азота. Для роста клеток некоторых видов растений
56
требуется аммоний или другой источник восстановленного азота. Обычно
нитраты используются в диапазоне 10-40 мМ; типичные концентрации аммония
находятся в диапазоне от 2 до 20 мМ. Однако концентрации аммония,
превышающие 8 мМ, могут ингибировать рост клеток определенных видов.
Клетки могут нормально расти на питательной среде, содержащей аммоний в
качестве единственного источника азота, если одна или несколько кислот цикла
трикарбоновых кислот (например, цитрат, сукцинат или малат) также
включены в питательную среду в концентрациях приблизительно 10 мМ. При
совместном использовании нитратных и аммонийных источников азота,
следует учитывать, что ионы аммония потребляются гораздо раньше и быстрее,
чем нитрат ионы.
Калий (K) необходим для роста клеток растений. Большинство сред
содержат K в форме нитратов, сульфатов или хлоридов в концентрациях 20-30
мМ. Оптимальные концентрации фосфора (P), магния (Mg), серы (S) и кальция
(Ca) находятся в диапазоне 1-3 мМ. Более высокие концентрации этих
питательных веществ могут потребоваться, если существует недостаток в
других питательных веществах.
К необходимым для роста растительных клеток и тканей микроэлементам
относятся железо (Fe), марганец (Mn), цинк (Zn), бор (B), медь (Cu) и молибден
(Mo). При приготовлении питательных сред обычно используются хелатные
формы железа и цинка. Железо может быть наиболее важным из всех
микроэлементов. Существует возможность использования в питательных
средах цитрат и тартрата железа, но эти соединения очень трудно растворяются
и дают осадок. Для решения этой проблемы Murashige и Skoog использовали
хелат железа - этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA).
Кобальт (Co) и йод (I) также могут быть добавлены в определенные
среды, но для этих элементов не установлены строгие требования влияния на
рост клеток. Натрий (Na) и хлор (Cl) также используются в некоторых средах,
но не являются необходимыми для роста клеток. Медь и кобальт обычно

57
добавляют в питательные среды в концентрациях 0,1 мкМ, Fe и Мо при 1 мкМ,
I при 5 мкМ, Zn при 5-30 мкМ, Mn при 20-90 мкМ и В при 25-100 мкМ.
Источники углерода и энергии. Предпочтительным углеводом в
питательной среде для растительных клеток является сахароза. В некоторых
случаях сахароза может быть заменена глюкозой и фруктозой, причем глюкоза
столь же эффективна, как сахароза, но фруктоза менее эффективна.
Существуют научные результаты использования в качестве углеводов лактозы,
галактозы, рафинозы, мальтозы и крахмала. Концентрация сахарозы в
питательных средах обычно составляет от 2 до 3 процентов. Использование
автоклавированной фруктозы может ингибировать рост клеток.
Углеводы должны в обязательном порядке добавляться в питательную
среду, так как было выделено лишь несколько линий растительных клеток,
которые полностью аутотропны, то есть способны обеспечить свои
собственные потребности в углеводах путем ассимиляции СО 2 во время
фотосинтеза.
Витамины. В природе растения синтезируют витамины, необходимые
для их роста и развития. Витамины необходимы растениям в качестве
катализаторов в различных обменных процессах. Когда растительные клетки и
ткани выращиваются в условиях in vitro, недостаток некоторых витаминов
может стать ограничивающим фактором в росте клеток.
Для культивирования клеток и тканей   наиболее часто используемые в
средах витамины - тиамин (B1), никотиновая кислота, пиридоксин (B6) и мио-
инозит.
Тиамин является одним из витаминов, который необходим для роста всем
клеткам. Тиамин обычно используется в концентрациях от 0,1 до 10,0 мг/л.
Никотиновую кислоту и пиридоксин так же часто добавляют в
питательные среды для стимулирования роста клеток, но для многих видов они
не являются необходимостью. Никотиновую кислоту обычно используют в
концентрации 0,1-5,0 мг/л; пиридоксин - в концентрации 0,1-10,0 мг/л.

58
 Мио-инозит обычно входит в состав многих витаминных растворов. Он
стимулирует рост определенных клеточных культур. Его присутствие в
питательной среде несущественно, но в небольших количествах мио-инозит
стимулирует рост клеток у большинства видов.
Другие витамины, такие как биотин, фолиевая кислота, аскорбиновая
кислота, пантотеновая кислота, витамин Е (токоферол), рибофин и
аминобензойная кислота входят в состав некоторых питательных сред для
культивирования клеток. Потребность растительных клеток в этих витаминах
незначительна и их недостаток или отсутствие не считаются факторами,
ограничивающими рост растительных клеток. Эти витамины, как правило,
добавляют в питательную среду только тогда, когда концентрация тиамина
ниже желаемого уровня.
Аминокислоты или другие азотные добавки. Хотя культивируемые
клетки обычно способны синтезировать все необходимые аминокислоты, для
дальнейшей стимуляции роста клеток можно в питательную среду добавлять
некоторые аминокислоты или смеси аминокислот. Использование аминокислот
особенно важно для создания клеточных культур и культур протопластов.
Аминокислоты обеспечивают клетки растений доступным источником азота,
который, как правило, поглощается клетками быстрее, чем неорганический
азот.
Наиболее распространенными источниками органического азота,
используемыми в питательных средах, являются смеси аминокислот (например,
гидролизат казеина), L-глутамин, L-аспарагин и аденин.
Казеиновый гидролизат обычно используется в концентрациях от 0,05%
до 0,1%. Когда аминокислоты добавляются отдельно, необходимо соблюдать
осторожность, поскольку они могут ингибировать рост клеток. Примерами
аминокислот, включенных в питательные среды для усиления роста клеток,
являются глицин в концентрации 2 мг/л, L-глутамин до 8 мМ, L-аспарагин в
концентрации 100 мг/л, L-аргинин и L-цистеин в концентрации 10 мг/л, и L-
тирозин в концентрации 100 мг/л. L-тирозин предназначен для стимуляции
59
морфогенеза в клеточных культурах, но только в агаровой среде. Дополнение
питательной среды аденинсульфатом может стимулировать рост клеток и
значительно усиливать образование побегов.
Отвердители или системы поддержки. Агар является наиболее часто
используемым гелеобразующим агентом для приготовления полутвердых и
твердых сред для культивирования тканей растений. Агар имеет несколько
преимуществ перед другими желирующими агентами. Во-первых, когда агар
смешивается с водой, он образует гель, который плавится при температуре
приблизительно 60-100°C и затвердевает при температуре приблизительно
45°C; таким образом, агаровые гели стабильны при всех типичных
температурах инкубации. Кроме того, агаровые гели не вступают в реакцию с
компонентами среды и не перевариваются растительными ферментами.
Устойчивость агарового геля контролируется концентрацией и маркой агара,
используемого в питательной среде, и показателем pH среды. Концентрации
агара, обычно используемые в питательных средах растительных клеток,
находятся в диапазоне от 0,5% до 1,0%; эти концентрации дают твердый гель
при уровнях рН, типичных для питательных сред растительных клеток.
Другим гелеобразующим агентом, обычно используемым для
коммерческих, а также исследовательских целей, является геллановая камедь.
Это продукт бактериальной ферментации, его следует использовать в
концентрации 1,25-2,5 г/л, в результате чего получается прозрачный гель,
который позволяет своевременно обнаружить загрязнение (инфицирование).
Альтернативные методы поддержки включают использование
перфорированного целлофана, фильтровальных бумажных мостов,
фильтровальных бумажных фитилей, пенополиуретана и полиэфирного
волокна. Растут ли эксплантаты лучше всего на агаре или на других
вспомогательных веществах - это индивидуальный фактор и зависит только от
вида растений.
Регуляторы роста. Соотношение ауксина и цитокинина определяет тип и
степень органогенеза в культурах растительных клеток. Как ауксин, так и
60
цитокинин обычно добавляют в питательные среды для достижения
морфогенеза, хотя соотношение гормонов, необходимых для индукции корней
и побегов не всегда одинаково. Существует значительная изменчивость среди
родов, видов и даже культурных сортов в отношении типа и количества
ауксина и цитокинина, необходимых для индукции морфогенеза.
Основные ауксины, используемые в питательных средах - индолил-3-
уксусная кислота (ИУК, англ. IAA), индолил-3-масляная кислота (ИМК, англ.
IBA), 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-Д, англ. 2,4-D) и α-
нафтилуксусная кислота (НУК, англ. NAA). Единственный встречающийся в
природе ауксин, обнаруженный в растительных тканях - это индолил-3-
уксусная кислота. Другие синтетические ауксины, которые используются в
культуре растительных клеток - это 4-хлорфеноксиуксусная кислота или
хлорфеноксиуксусная кислота (4-ХФУК., англ. 4-CPA, PCPA), 2,4,5-
трихлорфеноксиуксусная кислота - 2,4,5-T, 3,6-дихлор-2-метоксибензойная
кислота (дикамба) и 4-амино-3,5,6-трихлорпиколиновая кислота (пиклорам).
Ауксины различаются по своей физиологической активности и по
степени, в которой они движутся через ткани, связаны с клетками или
метаболизируются. Было показано, что встречающаяся в природе индолил-3-
уксусная кислота обладает меньшей физиологической активностью, чем
синтетические ауксины. Хотя 2,4-D, 2,4,5-T, PCPA и пиклорам часто
используются для индукции быстрой пролиферации клеток, длительное
воздействие или высокие концентрации этих ауксинов, в частности 2,4-D,
приводит к подавлению морфогенетического эффекта.
Ауксины, как правило, включают в состав питательной среды для
стимуляции образования каллуса и роста клеток, для инициации корней и, в
меньшей степени, побегов, для индукции соматического эмбриогенеза и
стимуляции роста из верхушек побегов.
Цитокинины, используемые в питательных средах (таблица 1.3.1) - 6-
бензиладенин - БА (англ. BA) или 6-бензиламинопурин – БАП (англ. ВАP), 6-
(γ-γ-диметилаллиламино)пурин (2iр), кинетин и зеатин. Зеатин и 2iр считаются
61
природными цитокининами, в то время как ВА и кинетин являются
синтетическими цитокининами. Другое встречающееся в природе соединение -
аденин, имеет основную структуру, сходную со структурой цитокининов, и в
некоторых случаях проявляет цитокининоподобную активность. Многие
растительные ткани имеют абсолютную потребность в специфическом
цитокинине для осуществления морфогенеза, тогда как некоторые ткани
считаются цитокинино-независимыми, то есть для органогенеза не требуются
цитокинин или специфический цитокинин.
Цитокинины обычно добавляют в питательную среду, чтобы
стимулировать деление клеток, индуцировать образование побегов и
пролиферацию пазушных почек, а также ингибировать образование корней.
Тип морфогенеза, который происходит в культуре растительной ткани, в
значительной степени зависит от соотношения и концентраций ауксина и
цитокинина, присутствующих в среде.
Инициирование корней проростков, эмбриогенез и инициация каллуса
обычно происходят, когда отношение ауксина к цитокинину высокое, тогда как
пролиферация адвентивных и пазушных почек происходит, когда соотношение
низкое. Концентрации ауксинов и цитокининов так же важны, как и их
соотношение.
Гиббереллины и абсцизовая кислота являются двумя другими
регуляторами роста, иногда используемыми в питательных средах. Культуры
растительных тканей обычно можно стимулировать к росту без ГК 3 (англ. GA3)
или АБК (англ. ABA), хотя некоторым видам могут потребоваться эти гормоны
для ускорения роста.
Как правило, ГК3 добавляют в питательную среду, чтобы стимулировать
рост клеточных культур низкой плотности, ускорить рост каллуса и удлинить
малорослые или слабые ростки.
Абсцизовую кислоту обычно добавляют в питательную среду для
ингибирования или стимуляции роста каллуса (в зависимости от вида), для

62
усиления пролиферации побегов или почек и для ингибирования последних
стадий развития эмбрионов.
Приготовление питательной среды
Для начала готовили маточные растворы макро- и микроэлементов,
регуляторов роста входящих в состав питательной среды, так как
использование стандартных решений уменьшает количество повторяющихся
операций, связанных с подготовкой носителя, и, следовательно, сводит до
минимума вероятность ошибки человека или эксперимента. Кроме того, в
работе с культурой ткани прямое взвешивание компонентов среды (например,
микроэлементов и гормонов), количество которых требуется только в
миллиграммах или микрограммах в конечном составе, не может быть
выполнено с достаточной точностью. Для этих компонентов подготовка
концентрированных маточных растворов и последующее разбавление в
конечном носителе является стандартной процедурой. Кроме того,
концентрированные растворы некоторых материалов более стабильны и могут
храниться дольше, чем более разбавленные растворы.
Витамины готовили в виде 100-х или 1000-х маточных растворов и
хранили в морозильной камере (-20°С). Если нет холодильной или морозильной
камеры витаминные растворы следует готовить сразу перед использованием.
Исходные растворы витаминов можно безопасно хранить в холодильной камере
в течение 2-3 месяцев. После истечения этого срока необходимо приготовить
новый раствор.
При приготовлении маточных растворов регуляторов роста учитывали
следующее: ауксины - нафтилуксусная кислота (НУК, англ. NAA) и 2,4-
Дихлорфеноксиуксусная кислота (англ. 2,4-D) считаются стабильными и могут
храниться при +4°C в течение нескольких месяцев; индолилуксусную кислоту
(ИУК, англ. IAA) следует хранить при температуре -20°C. Исходные растворы
ауксина обычно готовят при 100x-1000x конечных желаемых концентрациях.
Раствор НУК и 2,4-Д можно хранить в течение нескольких месяцев в
холодильнике или приблизительно один год при температуре -20°C. Обычно
63
ИУК и 2,4-Д растворяют в небольшом объеме 95% этилового спирта или КОН
и затем доводят до нужного объема дистиллированной водой; НУК можно
растворить в небольшом количестве NaOH или KOH, которые также можно
использовать для растворения 2,4-Д и ИУК.
Цитокинины также считаются стабильными и могут храниться при
температуре -20°С. Исходные растворы цитокининов обычно готовятся в
концентрациях от 100-х до 1000-х. Многие из цитокининов трудно растворить и
для их растворения требуется несколько капель/мл HCL, NaOH или KOH.
Условия хранения большинства готовых растворов уже указаны. Тем не
менее, можно сделать некоторые дополнения. Для удобства часто исходные
растворы разделяют на аликвоты, достаточные для приготовления от 1 до 10
литров среды. Эти аликвоты хранятся в небольших флаконах или пластиковых
пробирках, пакетах в морозильной камере. Эта процедура устраняет неудобство
необходимости оттаивать большой объем замороженного сырья каждый раз,
когда готовится среда. Был сделан вывод, что подогревание в микроволновой
печи является удовлетворительным и быстрым способом оттаивания
концентрированного раствора.
Для приготовления питательных сред очень часто используют хелатную
форму железа. Когда pH питательной среды поднимается выше отметки 6.2,
железо становится менее доступным для растения. Хелаты представляют собой
электрически заряженные органические молекулы, которые удерживают
железо, но выделяют железо в растение, даже если показатель рН питательной
среды высок. Не все хелаты действуют одинаково, лучший для высвобождения
железа хелат с максимальным значением рН (9.0) ˗ железо-EDDHA
(содержание железа 6%), который мы и использовали в своих исследованиях.
Все маточные растворы питательных сред готовили по нижеследующему
протоколу. Использовали высококачественные химические препараты
производства Duchefa (Голландия).
Протокол приготовления маточного раствора [82, 42с.]:
1. На магнитную мешалку ставят сосуд с 400 мл дистиллированной воды.
64
2. В воду помещают магнитный перемешивающий элемент (якорь),
устанавливают необходимое число оборотов.
3. На технических весах взвешивают необходимое количество химического
элемента и высыпают в сосуд с дистиллированной водой. Магнитный якорь
вращается до полного растворения химического элемента.
4. Объем раствора в сосуде доводят дистиллированной водой до 1 литра.
5. Готовый раствор наливают в бутыль или другую стеклянную тару с
крышкой; надписывают (химический элемент, имя лаборанта, дата
приготовления) и нумеруют.
В таком порядке готовят отдельные маточные растворы для всех солей, а
также хелата железа и витаминов входящих в состав питательной среды.
Маточные растворы гормонов готовили по таблице 2.3.1.2 [82, 42с.].
Таблица 2.3.1.2
Приготовление маточных растворов гормонов роста

Гормон Миллиграмм Миллилитр Растворитель*

БАП 50 500 КОН+стерил. Вода
НУК 50 500 NaOH+ стерил. Вода
ИМК 5 500 KOH/EtOH+ стерил. вода
2-ip 50 50 NaOH+ стерил. Вода
ГК3 5 500 EtOH+ стерил. Вода

Для полного растворения гормонов использовали щелочь или этиловый

спирт, после чего разбавляли и доводили до необходимого объема
дистиллированной водой.
Стерилизация питательной среды
Среды для культивирования растительных тканей обычно стерилизуют
автоклавированием при +121°С и 1,5-2 атм. Время, необходимое для
стерилизации, зависит от объема среды в сосуде. По возможности
рекомендуется распределять носитель в небольших аликвотах, потому что
многие ингредиенты носителя разрушаются при длительном воздействии тепла
и давления. Если количество среды мало, то ее можно стерилизовать путем
нагревания в микроволновой печи в течение 5 минут или дольше, в
65
зависимости от таких факторов, как мощность микроволнового излучения, тип
сосуда и объем среды.
В своих исследованиях стерилизацию питательных сред проводили в
автоклаве HMC HİRAYAMA (HV 110 L) при давлении 1,0 атм и температуре
+121°С в течение 20 минут.
Условия культивирования растений in vitro освещение 2,5-3 тыс.
Люкс, температура +21...+25С, фотопериод 16/8 часов. Если быть точными,
микрорастения MaxMa 14 содержали в культуральной комнате при температуре
+20...+21С, Myrobalan 29C при температуре +24...+25С, микрорастения GF
677 и Garnem 15 содержали при температуре +22...+24С, микрорастения OHF
87 при температуре +24...+25С, микрорастения винограда сортов Мадраса и
Баян ширей при температуре +23...+24С.
Эксплантаты культивировали в пробирках размером 160×16 мм с
объёмом питательной среды 3,0 мл, при микроразмножении, в основном,
использовали стеклянные баночки с закручивающейся крышкой с объемом
питательной среды 60 - 80 мл и пробирки (для винограда) размером 200×22 мм
с объёмом питательной среды 10 мл.
Оценивая результативность технологии микроклонального размножения
учитывали [26, 142с.; 44, 232с.; 70, 208с.]:
 жизнеспособность и уровень регенерации эксплантатов (отношение
числа жизнеспособных и регенерировавших эксплантатов к числу
высаженных);
 коэффициент размножения (отношение полученных микропобегов
к числу исходных);
 число листьев;
 число укоренившихся микрорастений;
 число корней;
 процент укореняемости.
Укоренившиеся полноценные микрорастения переносили в
66
культуральные комнаты для первичной адаптации.

2.3.2. Методика адаптации растений ex vitro

Адаптация растений-регенерантов подвоев после культуры in vitro

проводилась в 4 этапа:
I-ый этап адаптации ex vitro (длительность 14–20 дней). Растения,
укорененные в условиях in vitro, при адаптации высаживали на кокосовый
субстрат (кокопит). Корни растений промывали в слабом растворе
перманганата калия для удаления остатков среды. Регенеранты высаживали в
кассеты с диаметром ячейки 4–5 см или мини-парники 450×200×70,
заполненные субстратом. Для создания высокой влажности (около 100 %),
кассеты с растениями накрывали полиэтиленовой плёнкой до тех пор, пока не
появлялись молодые листочки. Через 2 недели пленку приоткрывали, а затем
снимали. Полив проводили дистиллированной водой. Первый этап адаптации
проводили в условиях культуральных комнат. Условия адаптации: освещение
2,5–3,0 тыс. люкс, температура +20…+25С, фотопериод 16/8 часов.
Кокосовый субстрат для адаптации получают из высушенной кокосовой
кожуры. Кокосовый субстрат является отличной средой для выращивания
растений in vitro.  Отсутствие высокой термообработки и жестких химических
промывок обеспечивает субстрат популяцией полезных микроорганизмов.
Кокосовый субстрат содержит триходерму, природный агент ускоряющий рост
растений. Также он имеет высокое содержание лигнина / целлюлозы, что
является идеальной средой для жизнедеятельности полезных микроорганизмов.
Кокосовый субстрат обладает высокой влаго- и воздухоёмкостью, очень легкий
по сравнению с обычной почвой, поэтому идеально подходит для адаптации
растений-регенерантов in vitro.
Характеристика: 1) экологически чистый продукт; 2)
сбалансированный питательный состав; 3) высокая влаго- и воздухоёмкость; 4)

67
сохраняет свою структуру даже при очень высокой влажности; 5) хорошие
характеристики дренажа; 6) длительный срок использования.
Применение: 1) декоративное цветоводство: субстрат для размножения
цветочно-декоративных культур в теплицах; 2) плодоводство: горшочки для
адаптации к условиям ex vitro или для черенкования плодово-ягодных культур;
3) кокосовые таблетки (функции подобны торфяным таблеткам) – это
экологически чистый субстрат, состоящий на 30% из кокосовых стружек, 70%
кокосового волокна и кокосового торфа. Кислотность этого субстрата рН=5,5-
6,5; 4) удобренный компостом кокосовый торф используется наряду с
органическими удобрениями в садоводстве и цветоводстве; 5) разложившийся
кокосовый торф также используется для выращивания овощей в тепличных
условиях; 6) кокопит в стерилизованном состоянии используется при
выращивании грибов. Он может выступать альтернативой моховому торфу [50,
с.402-419].
II-ой этап адаптации (постадаптация) проводили на торфяном субстрате
(длительность 35–45 дней). Адаптированные на первом этапе растения подвоев
по мере роста рассаживали в большие емкости со свежим субстратом (торф и
песок (3:1) или торф и перлит (5:1), объемом 500 мл). После пересадки на
второй этап адаптации растения подкармливали ½ раствором макро- и
микросолей по прописи Мурасиге-Скуга [149, с.473-497]. Условия адаптации:
теплица.
III-ий этап адаптации проходил под теневой сеткой в течение минимум 10
дней.
IV-ый этап адаптации состоял из высадки растений-регенерантов на
первое поле питомника и их последующей адаптации к условиям открытого
грунта.

2.3.3. Методика адаптации растений-регенерантов подвоев плодовых

культур в открытом грунте

68
 Первое поле плодового питомника заложено по новой для Азербайджана
технологии - двустрочной системе выращивания подвоев на черной
светонепроницаемой мульчирующей пленке (И.С.Курбанов, С.Д.Сулейманова,
А.А.Гаджиев, 2016) [51, с.32-34; 86, с.127-133]. Ширина гряд и расстояние
между грядами составляет 50 см. Для хорошего развития подвоев, полученных
методом in vitro, предусмотрена соответствующая система полива и
фертигации – капельное орошение.
Агрохимические показатели почвы опытного участка представлены в
таблице 2.3.3.1.
Таблица 2.3.3.1
Агрохимические показатели почвы опытного участка (2018 г)

Органическое вещество, %
Механический
состав
Влагоёмкость, %

Песо Ил Глин
Глубина, СС

К, К/га
F, кг/га

Ca, %

к а
N, %

рН

0-30 0,018 7,0 - 69,3 0,54 6,4 0,82 2,25 30,95 66,8
30-60 0,011 8,0 - 60,8 0,59 6,5 0,86 3,6 26,9 69,5

Высадка растений в 1 поле питомника проведена в оптимальное для

приживаемости растений время: апрель – начало мая. Агробиологическое
изучение подвоев плодовых культур в открытом грунте проводилось по
методике ФГБОУ ВО Кубанского государственного аграрного университета
(Т.Н.Дорошенко и др., 2015) [41, 62с.]. Окулировка высаженных подвоев
проведена в августе в соответствии со схемой, представленной в таблице
2.3.3.2.
Таблица 2.3.3.2
Схема окулировки подвоев косточковых культур
Подвой Привой Количество учетных
растений, шт
CF677 Guara По 10 растений в 3-х
69
 Ferraduel кратной повторности (30)
Ferragnes
Guayox 35
Garnem Guayox 30
Guara
MaxMa14 Regina
Ziraat 0900
Yellow Drogan
Myrobalan29C Black Diamond
Black Amber

III ГЛАВА. ОСОБЕННОСТИ ВВЕДЕНИЯ, РАЗМНОЖЕНИЯ И

УКОРЕНЕНИЯ ПОДВОЕВ ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР В УСЛОВИЯХ
IN VITRO

3.1. Особенности введения в культуру in vitro подвоев плодовых

культур

Для введения в культуру in vitro клоновых подвоев выделена следующая

последовательность: неодревесневшие побеги разделяли на сегменты
величиной 1,5-2,0 см с одной верхушечной или пазушной почкой, в мыльном
растворе очищали от поверхностной грязи и промывали проточной водой в
течение 10-15 минут. После этого, с целью освобождения эксплантатов от
возможной грибной инфекции, эксплантаты по 30-35 штук собирали в баночки
и заливали раствором фунгицида. Баночки закручивали крышками и для
продолжительного взбалтывания устанавливали на шейкер на 20-25 минут.
Далее эксплантаты повторно промывали проточной водой в течение 10 минут
до полного очищения от фунгицида.
В ламинарный бокс заранее ставили сосуд с подготовленным раствором
основного стерилизатора, проавтоклавированные при 1,5 атм. и температуре
+121°С в течение 20-25 минут баночки со стерильной водой и пробирки с
питательной средой, инструменты и бумажные матрасики, простерилизованные

70
в термостате в течение 20 минут при температуре +210°С. Для последующего
шага стерилизации эксплантаты заливали раствором основного стерилизатора,
периодически взбалтывали. По истечении времени экспозиции эксплантаты
промывали в 3-х порциях стерильной воды. Эксплантаты вынимали из баночек
с последней порцией стерильной воды по 3-4 штуки и выкладывали на
стерильные салфетки, чтобы устранить излишнюю влагу. Далее при помощи
пинцета и скальпеля обновляли срезы сегментов и немедля высаживали в
пробирки с питательной средой.

3.1.1. Эффективность использования антибиотиков для оздоровления

эксплантатов от инфекций различной этиологии

На питательной среде для культуры in vitro имеются все благоприятные

условия для развития патогенной микрофлоры как привнесенной с
эксплантатами растений, так и находящейся там при неправильной подготовке
среды (рисунок 3.1.1.1) [21, с.60].

Рисунок 3.1.1.1. Контаминация эксплантатов на этапе введения

в культуру in vitro

Как правило, эксплантаты растений для введения in vitro берут в

маточных насаждениях плодовых культур, выращиваемых в открытом грунте,
где могут быть такие заболевания, как корневой рак (Bacterium
71
tumefaciens Smith and Townsend), бактериальный некроз (Pseudomonas
syringae Van Hall) и др. [42, с.3-15; 88, 92с.]. В связи с этим процессу
стерилизации эксплантатов должно уделяться особое внимание, так как от
этого зависит весь последующий цикл микроразмножения. Для повышения
эффективности данного процесса, помимо стерилизаторов, входящих в
основную схему стерилизации, используют антибиотики [29]. Это касается в
первую очередь внутренней инфекции эксплантатов.
Первым этапом элиминации бактериальных и грибковых патогенов у
эксплантатов, вводимых in vitro, является определение их родовой и видовой
принадлежности [21, с.60; 42, с.3-15; 133, 6с.]. Это позволяет предположить
спектр используемых антибиотиков, их концентрации и кратность применения.
Так, причиной контаминации эксплантатов на питательных средах обычно
являются эпифитные дрожжи и грибы Cryptococcus laurentii, Cryptococcus
album, Rhodotorula glutinis, Penicillium cyclopium (рисунок 3.1.1.2), а также ряд
неидентифицированных объектов, занесённых из окружающей среды [42, с.3-
15].

Cryptococcus Rhodotorula Cryptococcus Penicillium

laurentii glutinis album cyclopium
Рисунок 3.1.1.2. Эпифитные дрожжи и грибы, выделенные из
контаминированных питательных сред

Учитывая все вышесказанное, было проведено исследование по изучению

влияния традиционных антибиотиков и антибиотиков нового поколения на
уровень контаминации эксплантатов на питательной среде, а также на рост и
развитие растений, рассмотрена возможность освобождения от бактериальных
72
или грибных патогенов эксплантатов, заражённых в процессе пассажирования.
При оценке результативности использования антибиотиков учитывали:
уровень бактериального, грибного заражения и интенсивность регенерации
эксплантатов (отношение числа регенерировавших эксплантатов к числу
высаженных).
С целью изучения влияния традиционных антибиотиков цефтриаксон,
тетрациклин, нистатин на результативность введения в культуру подвоев
MaxMa 14, GF 677, Myrobalan 29C [87, с.75-78] эксплантаты брали у растений с
доказанной сортовой принадлежностью. Верхушечные и боковые почки
очищали от поверхностной грязи в мыльном растворе в течение десяти минут,
после чего тщательно промывали под проточной водой. В ламинарной кабине
эксплантаты стерилизовали раствором 5%-го гипохлорита натрия (5 мл
стерилизующего агента на 95 мл дистиллированной воды) в течение 20-30 мин.
Далее эксплантаты промывали в течение 3-5 минут в 3-х порциях стерильной
воды. Стерильные эксплантаты высаживали в пробирки с питательной средой
(МS + 1,0 мг/л 6-БАП + 2,5 мг/л тиамин + 250 мг/л инозитол). Антибиотики,
заранее растворенные в стерильной воде с помощью медицинского шприца
(0,5; 10; 100; 200 мг/л) вводили в пробирки с посаженными на питательную
среду эксплантатами. Учет состояния эксплантатов проводили через 30 дней
после введения в культуру in vitro. Результаты исследования предоставлены в
таблице 3.1.1.1.
Таблица 3.1.1.1
Влияние антибиотиков на результативность введения в культуру in vitro
Эксплантатов, %
Посажено эксплантатов,

MaxMa14 GF677 Myrobalan

Инфицировано

Инфицировано

Инфицировано
Без инфекции

Без инфекции
Без инфекции
шт.

Антибиотик, концентрация

73
1 Нистатин 0,5 мг/л 100 33,0 67,0 60,0 40,0
92,0 8,0
2 Нистатин 10 мг/л 100 45,0 55,0 60,0 40,0
80,0 20,0
3 Нистатин 100 мг/л 100 89,0 11,0 95,0 5,0
61,0 39,0
4 Нистатин 200 мг/л 100 31,0 69,0 77,0 23,0
40,0 60,0
5 Цефтриаксон 0,5 мг/л 100 40,0 60,0 60,0 40,0
80,0 20,0
6 Цефтриаксон 10 мг/л 100 33,0 67,0 80,0 20,0
72,0 28,0
7 Цефтриаксон 100 мг/л 100 56,0 44,0 61,0 39,0
75,0 25,0
8 Цефтриаксон 200 мг/л 100 33,0 67,0 38,0 62,0
100, 0,0
0
9 Тетрациклин 100 мг/л 100 25,0 75,0 38,0 62,0 100, 0,0
0
10 Тетрациклин 200 мг/л 100 33,0 67,0 49,0 51,0 100, 0,0
0
Как видно из таблицы 3.1.1.1 [87, с.75-78], для клонового подвоя МахМа
14 максимальное число прижившихся и нормально развивающихся (75%)
микрорастений отмечено в варианте с использованием антибиотика
тетрациклин в концентрации 100 мг/л. В целом, кроме вариантов с добавлением
цефтриаксона и нистатина в концентрации 100 мг/л, остальные изучаемые
концентрации антибиотиков положительно влияют на жизнеспособность
эксплантатов клонового подвоя МахМа 14.
Для эксплантатов клонового подвоя GF 677 лучший результат (62%
здоровых эксплантатов) показал антибиотик цефтриаксон 200 мг/л и
тетрациклин 100 мг/л.
Самый высокий процент здоровых эксплантатов (60%) для эксплантатов
подвоя Myrobalan 29C зафиксирован в варианте с антибиотиком нистатин 200
мг/л. Этот антибиотик оказался единственным из протестированных
препаратов, который значительно повысил жизнеспособность данных
эксплантатов.
Исходя из результатов исследования [87, с.75-78], можно сделать вывод,
что морфогенетическая реакция эксплантатов клоновых подвоев на
антибиотики зависит от их сортовой принадлежности. Так, на эксплантаты
Myrobalan 29C антибиотики, в основном, оказали ингибирующее влияние, а на
жизнеспособность эксплантатов клонового подвоя МахМа 14 все изучаемые
74
концентрации антибиотиков, кроме цефтриаксона 10 мг/л и нистатина 100 мг/л,
оказали положительное влияние. Для подвоев Мyrobalan 29C максимальное
количество жизнеспособных эксплантатов (60% здоровых эксплантатов)
показал 4-й вариант среды с антибиотиком нистатин 200 мг/л. Максимальное
количество хорошо развитых микропобегов подвоя GF 677 наблюдалось на
питательных средах с антибиотиками тетрациклин 100 мг/л и цефтриаксон 200
мг/л (62% здоровых эксплантатов в обоих вариантах) [87, с.75-78].
В продолжение изучения влияния антибиотиков на результат введения в
культуру in vitro, было проведено изучение воздействия антибиотиков нового
поколения: амоксициллина, биотаксима, ксенаквина, сумамеда и макропена в
концентрации 400-500 мг/л. В качестве стандарта использовали ранее
изученный антибиотик нистатин (200 мг/л).
Эксплантаты клоновых подвоев для косточковых культур MaxMa 14, GF
677, Garnem 15 и Myrobalan 29C брали с учетом 60 штук на каждый вариант.
Процедуры стерилизации, приготовления питательной среды и введения
антибиотиков в питательную среду проводились так же, как и в опыте с
традиционными антибиотиками.
Учет состояния эксплантатов проходил через 30 дней после введения в
культуру in vitro. При оценке результативности применения новых
антибиотиков учитывали соотношение числа регенерировавших эксплантатов
(в %) к числу высаженных. Результаты изучения эффективности антибиотиков
нового поколения приведены в таблице 3.1.1.2.
Таблица 3.1.1.2
Эффективность антибиотиков нового поколения при введении
в культуру in vitro
Доля регенерировавших эксплантатов
подвоев после первого пассажа, %
Посажено

Антибиотик, концентрация
МахМа1 Garnem1 Myrobalan
GF677
4 5 29C

75
 штэксплантатов,
Контроль (без
1 50 10 10 45
антибиотиков)
Амоксициллин, 400
2 60 25 20 20 75
мг/л
3 Биотаксим, 500 мг/л 60 70 30 30 85
4 Ксенаквин, 400 мг/л 60 0 5 5 10
5 Сумамед, 500 мг/л 60 55 25 25 30
6 Макропен, 400 мг/л 60 0 0 0 10
Нистатин 200 мг/л
7 60 40 20 0 75
(стандарт)

Высокую долю регенерировавших эксплантатов во всех вариантах

показал антибиотик биотаксим (500 мг/л). Процент жизнеспособных
эксплантатов на среде с введённым биотаксимом для подвоев Myrobalan 29C и
МахМа 14 составил 85% и 70%, соответственно. В вариантах с подвоями СF
677 и Garnem 15 также лучшие результаты зафиксированы с использованием
биотаксима (500 мг/л) - 30% жизнеспособных эксплантатов.
Достаточно высокая доля жизнеспособных эксплантатов подвоя
Мyrobalan 29C отмечена и в вариантах с использованием амоксициллина (400
мг/л) и нистатина (200 мг/л) – 75%.
Применение антибиотиков макропен и ксенаквин оказало подавляющее
действие на развитие эксплантатов, количество жизнеспособных эксплантатов
по всем подвоям составило 6 и 12%, соответственно, и поэтому введение их в
питательную среду оказалось нецелесообразным.
Исходя из результатов исследования, при введении в культуру in vitro
эксплантатов подвоев косточковых плодовых культур MaxMa 14, GF 677,
Garnem 15, Myrobalan 29C рекомендуется добавлять в среду антибиотик
биотаксим, в концентрации 500 мг/л. Он обладает наиболее лучшим и

76
стабильным санирующим эффектом, позволяет получать высокий процент
жизнеспособных эксплантатов подвоев на первом пассаже. Антибиотики
макропен и ксенаквин вносить в питательную среду нецелесообразно, так как
они оказывают подавляющее действие на рост растений.
С другой стороны, в таблице 3.1.1.2 можно проследить и другую
закономерность. Наиболее зараженными подвоями оказались GF 677 и Garnem
15, для которых эффективность введения в культуру in vitro без использования
антибиотиков только 10%, а при использовании антибиотиков остается низкой
– 30 % в лучшем варианте. В тоже время для подвоев МахМа 14 и Myrobalan
29C количество стерильных эксплантатов при введении составляет 50 и 45 %
соответственно без использования антибиотиков, 70 и 85 % в лучшем варианте
использования антибиотика биотаксим (500 мг/л).
Таким образом, анализ данных, полученных при добавлении
антибиотиков цефтриаксон, тетрациклин, нистатин, в концентрациях 0,5; 10;
100; 200 мг/л, показал, что на санацию питательной среды и общее развитие
микрорастений подвоев GF 677, Myrobalan 29C наилучшее действие оказали
антибиотик нистатин в концентрации 200 мг/л, тетрациклин в концентрации
100 мг/л, цефтриаксон в концентрации 200 мг/л. Для подвоя MaxMa 14 хорошие
результаты получены во всех вариантах, кроме вариантов с антибиотиками
цефтриаксон 10 мг/л и нистатин 100 мг/л. Также было установлено, что
нистатин 200 мг/л и тетрациклин 100 мг/л положительно влияют на рост
экспериментальных растений [87, с.75-78].
При введении в культуру in vitro эксплантатов подвоев косточковых
плодовых культур MaxMa 14, GF 677, Garnem 15, Myrobalan 29C рекомендуется
добавлять в среду антибиотик нового поколения биотаксим в концентрации 500
мг/л, так как он обладает лучшим стерилизующим эффектом, который
позволяет получить высокий процент жизнеспособных эксплантатов подвоев на
первом пассаже. Антибиотики макропен и ксенаквин вносить в питательную
среду нецелессобразно, так как они оказывают подавляющее действие на рост
растений.
77
 3.2. Сравнительная оценка эффективности питательных сред при

введении в культуру in vitro и микроразмножении

Исследования проводили с целью оценки эффективности развития

эксплантатов на питательных средах с различным гормональным составом.
В исследовании по введению в культуру in vitro клоновых подвоев для
черешни МахМа 14, для сливы Myrobalan 29C, для миндаля и персика GF 677,
Garnem 15 и груши OHF 87 было использовано 7 модифицированных
питательных сред:
I среда (контроль) - классическая питательная среда Мурасиге и Скуга
(MS) [149, с.473-497], по прописи указанной в таблице 1.3.1 (глава 1);
II среда - MS с дополнением 0,5 мг/л БАП и 0,2 мг/л ИМК;
III среда - MS с дополнением 1,0 мг/л БАП, 0,5 мг/л кинетина, 0,5 мг/л
ИУК, 2,5 мг/л тиамина, 250,0 мг/л инозитола;
IV среда - MS с дополнением 0,6 мг/л БАП, 0,01 мг/л НУК, 2,0 мг/л
тиамина, 1,0 мг/л никотиновой кислоты, 2,0 мг/л глицина, 100,0 мг/л инозитола;
V среда - MS с дополнением 0,6 мг/л БАП, 0,01 мг/л НУК, 0,1 мг/л
тиамина, 0,5 мг/л никотиновой кислоты, 2,0 мг/л глицина, 0,5 мг/л пиридоксина
и 100,0 мг/л инозитола;
VI среда – среда Драйвера и Куниюки (DKW) [119, с.506-509], с
дополнением 0,6 мг/л БАП, 0,01 мг/л ИМК, 2,0 мг/л тиамина, 1,0 мг/л
никотиновой кислоты, 2,0 мг/л глицина, 100,0 мг/л инозитола;
VII среда – среда Гамборга (Gamborg) [131, с.372-375], по прописи,
указанной в таблице 1.3.1 (глава 1), с дополнением витаминно-минерального
комплекса "Vinalacimmunitum".
При оценке результативности инициации in vitro учитывали: уровень
регенерации эксплантатов (отношение числа регенерировавших эксплантатов к
числу высаженных).
Для введения в культуру in vitro использовали верхушечные и боковые

78
почки клоновых подвоев, с учетом 20 штук на каждый вариант питательной
среды, при трехкратной повторности. Результаты исследования представлены в
таблице 3.2.1.
В ходе исследования более высокая приживаемость и интенсивное
развитие эксплантатов (таблица 3.2.1) наблюдалось для подвоя MaxMa 14 на
среде VI – 85,2 % (контроль - 74,3%), для подвоя Myrobalan 29C (рисунок 3.2.1),
с незначительной разницей в результатах, на средах V и VI - 92,5 и 90,0%,
соответственно (контроль 75%), для подвоев GF 677, Garnem 15, OHF 87 на
среде IV - 95,0 - 93,3 - 91,6%, соответственно (контроль - 75,0 - 83,3 - 74,0%,
соответственно). Таким образом, на модифицированных нами питательных
средах эксплантаты характеризовались наивысшей приживаемостью и
развитием, что позволило повысить эффективность этапа введения в культуру
на 10 - 12 %.
Кроме того, обычно длительность первого этапа процесса
микроразмножения, а точнее нулевого пассажа, составляет 20-21 день, но
благодаря правильному сочетанию и концентрации гормонов и витаминов в
среде этот срок удалось сократить.
Таблица 3.2.1
Влияние питательной среды на развитие эксплантатов
на этапе введения в культуру in vitro
Количество жизнеспособных,
эксплантатов,
% от высаженных
29CMyrobalan

Питательная среда
Garnem 15
MaxMa 14

OHF 87
GF 677

МS + 1,2 мг/л БАП +

0,1 мг/л тиамин + 0,5 мг/л
I
пиридоксин + 100,0 мг/л
(Kонтроль 74,3 75,0 75,0 83,3 74,0
инозитол + 2,0 мг/л глицин +
)
0,5 мг/л никотиновая кислота +
10,0 мг/л аскорбин. Кислота
МS + 0,5 мг/л БАП +
II 76,0 86,6 75,0 80,0 75,0
0,2 мг/л ИМК
III МS + 1,0 мг/л БАП + 0,5 мг/л 82,4 79,2 85,0 80,0 78,3
79
 кинетин + 0,5 мг/л ИУК + 2,5
мг/л тиамин + 250,0 мг/л
инозитол
МS+0,6 мг/л БАП+0,01 мг/л
НУК + 2,0 мг/л тиамин +1,0
IV мг/л никотиновая кислота + 2,0 82,0 82,3 95,0 93,3 91,6
мг/л глицин + 100,0 мг/л
инозитол
МS+0,6 мг/л БАП+0,01 мг/л
НУК + 0,1 мг/л тиамин +0,5
мг/л никотиновая кислота + 2,0
V 82,0 92,5 91,6 78,3 89,0
мг/л глицин + 0,5 мг/л
пиридоксин+100,0 мг/л
инозитол
DKW + 0,6 мг/л БАП + 0,01
мг/л ИМК + 2,0 мг/л тиамин
VI
+1,0 мг/л никотиновая кислота 85,2 90,0 81,6 75,0 73,0
+ 2,0 мг/л глицин + 100,0 мг/л
инозитол
Gamborg + витаминно-
VII
минеральный комплекс 45,3 52,0 55,0 50,0 50,0
"Vinalacimmunitum"

Так, эксплантаты показали очень интенсивное развитие на

вышеуказанных средах и уже на 14-й день после введения в культуру in vitro
(рисунок 3.2.1) были полностью сформированы и готовы к следующему этапу
микроразмножения.

Garnem 15 (IV) GF 677 (IV) Myrobalan 29C (V)

Рисунок 3.2.1. Морфологическое развитие эксплантатов, введенных в
культуру in vitro (на 14-й день)

Среда VII (Gamborg + витаминно-минеральный комплекс) для инициации

подвоев оказалась наименее подходящей, эксплантаты на этой среде
развивались очень медленно, некоторые из них остановились в развитии
(рисунок 3.2.2) [84, с.33-38].
80
 Среда DKW (VI) Среда Gamborg (VII)
Рисунок 3.2.2. Состояние эксплантатов подвоя МаxМа 14 на 7-ой день
после изоляции (среда VI, VII)

Если рассматривать результаты исследования в целом, то можно сделать

вывод, что все варианты сред, за исключением среды Гамборга, можно
использовать для инициации данных подвоев в условиях in vitro. Так,
небольшая разница, которая существует между результатами исследования (I-
VI варианты) связана в большей степени с инфицированностью эксплантата
(пробелы в стерилизации), нарушением правил ассептики во время работы в
ламинаре и невозможностью заранее распознать погибшую почку.
В связи с этим, учитывая высокую стоимость регуляторов роста,
целесообразно эксплантаты вначале вводить в культуру на среды без
содержания гормонов роста, так как уже через неделю, можно будет судить о
степени их инфицированности и жизнеспособности. Только после визуального
осмотра пробирки с питательной средой и высаженным эксплантатом и
подтверждения, что среда без каких-либо помутнений и разводов, эксплантаты
пересаживаются на свежую питательную среду, содержащую гормоны роста
для активации процесса их развития в культуре in vitro.
Необходимо также отметить, что на всех средах более интенсивное
развитие наблюдалось у верхушечных почек, они раньше (на 1 - 2 дня) и
активнее тронулись в рост, что еще раз доказывает влияние местоположения
эксплантата на исходном растении на результат инициации культуры in vitro.
На втором этапе (микроразмножение) были определены особенности
пролиферации некоторых подвоев плодовых культур на первых пассажах
81
микроразмножения в зависимости от гормонального состава питательной среды
Мурасиге и Скуга (MS) [149, с.473-497].
Было изучено 8 различных вариантов комбинаций и концентраций
гормонов роста [3, с.74-76]:
1. 1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК 5. 1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3
2. 1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 6. 1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3
3. 2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК 7. 2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3
4. 2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 8. 2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3
Объектами исследования служили микрочеренки подвоев MaxMa 14,
Myrobalan 29C, GF 677, Garnem 15 и OHF 87 со второго пассажа. На третьем
пассаже микрочеренки высаживали на новые модифицированные среды, с
учетом 30 штук на каждый вариант (3 баночки по 10 микрочеренков). Оценку
результативности проведенного исследования (таблица 3.2.2) производили
через 3 недели.
Установлено, что коэффициент размножения клоновых подвоев, в
зависимости от гормонального состава среды варьировал незначительно,
однако существенно различался в зависимости от генотипов подвоев (таблица
3.2.2).
Таблица 3.2.2
Коэффициент размножения (КР) в зависимости от гормонального
состава питательной среды

Подвой Концентрация гормонов в питательной среде КР

1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК (контроль) 4.57±0.60
1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 5.39±0.54
2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК 4.44±0.55
2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 4.75±0.99
Myrоbаlan 29C
1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.55±0.56
1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.69±0.55
2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.13±0.20
2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.13±0.60
MaxMa 14 1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК (контроль) 4.21±0.33
1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 4.32±0.43
2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК 4.76±0.78
2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 4.80±0.64
1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.00±0.64
82
 1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.44±0.53
2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.44±0.53
2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.83±0.97
1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК (контроль) 4.76±0.63
1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 4.36±0.52
2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК 4.00±0.62
2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 4.00±0.52
GF 677 1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.43±0.68
1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.14±0.29
2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.03±0.46
2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК 4.11±0.18
продолжение
3 таблицы 3.2.2
1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК (контроль) 1.49±0.15
1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 1.70±0.14
2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК 1.77±0.18
2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 1.65±0.60
Garnem 15
1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 1.87±0.11
1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 1.55±0.17
2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 1.61±0.18
2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 1.65±0.15
1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК (контроль) 4.35±0.62
1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 4.25±0.52
2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК 4.04±0.62
2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК 4.00±0.45
OHF 87
1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.30±0.68
1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.26±0.20
2,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.02±0.36
2,0 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК +0,5 мг/л ГК3 4.21±0.18

Максимальный показатель коэффициента размножения отмечен у подвоя

Myrоbаlan 29C – 5,39 на питательной среде, содержащей 1,0 мг/л БАП+0,2 мг/л
НУК. Минимальная интенсивность размножения отмечена у подвоя Garnem
(1,49) на среде, содержащей 1,0 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК. В среднем для
подвоев показаны следующие коэффициенты размножения: Myrоbаlan 29C - от
4,13 до 5,39, MaxMa 14 - от 4,21 до 4,83, GF 677 - от 4,0 до 4,76, Garnem 15 - от
1,49 до 1,87, OHF 87 - от 4,0 до 4,35 [3, с.74-76].
Применение различных концентраций гормонов в средах повлияло и на
морфологическое развитие микрочеренков. Так, на средах с содержанием 1 мг/л
БАП в развитии микрочеренков MaxMa 14 не наблюдалось какого-либо
отклонения, тогда как на среде с содержанием 2,0 мг/л БАП наблюдалось
образование каллуса. Кроме того, повышенное содержание в средах
83
нафтилуксусной кислоты (НУК) в концентрации 0,2 мг/л способствовало более
интенсивному размножению, но при этом подавляло рост микрочеренков. На
средах с содержанием НУК в концентрации 0,02 мг/л микрочеренки показали
более хороший рост. Среды с содержанием гибберреловой кислоты (ГК 3)
положительно повлияли на рост микрочеренков подвоев MaxMa 14 и Myrоbаlan
29C, однако не оказали никакого влияния на коэффициент размножения.
Результаты по всем вариантам для подвоя Garnem 15 и для подвоя GF 677 были
схожи (таблица 3.2.2).
Учитывая то, что исследуемые комбинации и концентрации гормонов не
дали желаемого результата, а именно высокого коэффициента размножения и
интенсивного морфологического развития микрочеренков, было решено
продолжить исследование и провести сравнительную оценку этих сред по всем
подвоям с модифицированными нами средами, показавшими наивысшие
результаты на этапе введения в культуру (таблица 3.2.3).
Таблица 3.2.3
Коэффициент размножения (КР) подвоев на модифицированных
питательных средах
Коэффициент размножения (КР)

Питательная среда MaxMa Myrobalan Garnem

GF 677 OHF 87
14 29C 15

МS+1,0 мг/л БАП+0,02

I 4.21±0.33 4.57±0.60 4.76±0.63 1.49±0.15 4.35±0.62
мг/л НУК (контроль)
МS+0,6 мг/л БАП+0,01
мг/л НУК + 2,0 мг/л
тиамин +1,0 мг/л
II 4,75±0,45 6,02±0,25 5,82±0,23 6,03±0,27 6,27±0,32
никотиновая кислота +
2,0 мг/л глицин + 100,0
мг/л инозитол
МS+0,6 мг/л БАП+0,01
мг/л НУК + 0,1 мг/л
III тиамин +0,5 мг/л
никотиновая кислота + 4,32±0,33 6,17±0,52 4,20±0,42 5,32±0,24 5,32±0,23
2,0 мг/л глицин + 0,5 мг/л
пиридоксин+100,0 мг/л
инозитол
IV DKW + 0,6 мг/л БАП + 6,02±0,42 5,99±0,48 4,60±0,50 5,0±0,30 5,0±0,45
84
 0,01 мг/л ИМК + 2,0 мг/л
тиамин +1,0 мг/л
никотиновая кислота +
2,0 мг/л глицин + 100,0
мг/л инозитол
Для этого микрочеренки объектов исследования со второго пассажа,
пересаживали (третий пассаж) на модифицированные среды, с учетом 30 штук
на каждый вариант (3 баночки по 10 микрочеренков). Оценку результативности
проведенного исследования (таблица 3.2.3) производили через 3 недели.
Как видно из таблицы 3.2.3, среды, которые показали высокий результат
на этапе введения в культуру, позволили получить сравнительно высокий
результат и на этапе микроразмножения. Так, максимальные показатели
коэффициента размножения микрочеренков подвоев по вариантам питательных
сред I - IV составили 5,82 - 6,27.
Проведем сравнительную оценку коэффициентов размножения подвоев:
- Myrobalan 29C на среде МS + 1,0 мг/л BAP + 0,2 мг/л НУК имел
максимальный коэффициент размножения 5,39, на среде МS + 0,6 мг/л БАП +
0,01 мг/л НУК + 0,1 мг/л тиамин + 0,5 мг/л никотиновая кислота + 2,0 мг/л
глицин + 0,5 мг/л пиридоксин + 100,0 мг/л инозитол этот показатель составил
6,17.
- MaxMa 14 на среде MS + 2,0 мг/л BAP + 0,2 мг/л НУК + 0,5 мг/л ГК3
имел максимальный коэффициент размножения 4,83, тогда как на среде DKW +
0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л ИМК + 2,0 мг/л тиамин + 1,0 мг/л никотиновая кислота
+ 2,0 мг/л глицин + 100,0 мг/л инозитол коэффициент размножения составил
6,02.
- GF 677 на среде MS + 1,0 мг/л BAP + 0,02 мг/л НУК имел максимальный
коэффициент размножения 4,76, а на среде МS + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л НУК
+ 2,0 мг/л тиамин + 1,0 мг/л никотиновая кислота + 2,0 мг/л глицин + 100,0 мг/л
инозитол этот показатель составил 5,82.
- Garnem 15 на среде MS + 1,0 мг/л BAP + 0,02 мг/л НУК + 0,5 мг/л ГК3
имел максимальный коэффициент размножения всего 1,87, тогда как на среде
МS + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л НУК + 2,0 мг/л тиамин + 1,0 мг/л никотиновая
85
кислота + 2,0 мг/л глицин + 100,0 мг/л инозитол этот подвой показал очень
хороший коэффициент размножения - 6,03.
- OHF 87 на среде MS + 1,0 мг/л BAP + 0,02 мг/л НУК показал
коэффициент размножения 4,35, тогда как на среде МS + 0,6 мг/л БАП + 0,01
мг/л НУК + 2,0 мг/л тиамин + 1,0 мг/л никотиновая кислота + 2,0 мг/л глицин +
100,0 мг/л инозитол этот показатель составил 6,27.
Полученные микрочеренки имели хорошо сформированный листовой
аппарат и рост, что еще раз доказывает, что мы правильно подобрали
гормональный и витаминный состав питательных сред.
Таким образом, разработанный нами состав питательных сред в
ощутимой степени повысил коэффициент размножения микрочеренков подвоев
плодовых культур на этапе микроразмножения, что, безусловно, окажет
положительный результат на исход всего процесса микроразмножения данных
подвоев в культуре in vitro.
Продолжив пассажирование микрочеренков подвоев, мы наблюдали
тенденцию, уменьшения коэффициента размножения с каждым последующим
пассажем и на примере подвоя OHF 87 пришли к выводу, что коэффициент
размножения in vitro подвоев изменяется не только в зависимости от типа
питательной среды, генотипа, но и от длительности пассажирования in vitro
(таблица 3.2.4).
Таблица 3.2.4
Коэффициент размножения (КР) подвоя OHF 87 в зависимости от пассажа
Питательная среда Пассаж КР
МS + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л НУК 2 2,50
МS + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л НУК 3 6,25
МS + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л НУК 4 5,18
МS + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л НУК 5 2,92
МS + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л НУК 6 2,70

При использовании модифицированной среды МS в течение 6 пассажей

коэффициент размножения данного подвоя колебался от 2,5 до 6,22 (таблица
3.2.4). Причем, на первых этапах культивирования подвоя (2 пассаж)

86
коэффициент размножения был минимальным. Лучшие показатели
размножения подвоя отмечены на 3 (в среднем 6,22 микропобега в
конгломерате) и 4 (в среднем 5,18 микропобегов в конгломерате) пассажах,
снижение эффективности размножения зафиксировано с 5 пассажа. В связи с
этим, начиная с 5 пассажа, растения-регенеранты пересаживали как для
дальнейшего размножения, так и для укоренения.
Для укоренения использовали растения-регенеранты длиной не менее 2
см, все микрочеренки, не достигшие такого размера высаживали на
питательные среды для размножения (рисунок 3.2.3).

Конгломерат
микрочеренков

Микрочеренки
после разделения
конгломерата

Микрочеренки,
отобранные для
укоренения

Рисунок 3.2.3. Разделение микрочеренков OHF 87 для высадки на

питательные среды для размножения и для укоренения

Такая постановка опытов определяется тем, что микрочеренки маленьких

размеров характеризуются слабым ризогенезом как в культуре in vitro, так и
87
при традиционном черенковании. Для проведения работ по предложенной
схеме одновременно готовили 2 типа питательных сред: для микроразмножения
(среда, содержащая цитокинин 6 бензиламинопурин) и для укоренения (среда,
содержащая в качестве основного индуктора корнеобразования,
индолилмасляную кислоту). Конгломераты микрорастений разделяли на
микрочеренки и, в соответствии с их длиной, высаживали на одну из
подготовленных питательных сред.
Количество микрочеренков, пригодных для ризогенеза различалось по
пассажам от 52,8 % на пятом пассаже до 69,9 % на четвертом пассаже, в
среднем, количество черенков, пригодных для ризогенеза было более 60 %
(таблица 3.2.5).
Таблица 3.2.5
Морфометрические параметры подвоя OHF 87 в зависимости от пассажа
Пассаж Количество черенков
посажено на получено на текущем пассаже
всего, из них
предыдущем
≤ 2,0 см ˃ 2,0 см
шт.
пассаже, шт. шт. % шт. %
2 38 99 41 41,4 58 58,6
3 36 221 87 39,4 134 60,6
4 44 219 66 30,1 153 69,9
5 79 246 116 47,2 130 52,8
сумма/среднее 197 785 310 39,5 475 60,5

На пассаже перед укоренением недостаточный рост микрочеренков

оказался довольно-таки серьезной проблемой. Так как уже после 5-7 пассажей
продолжать микроразмножение при тенденции понижения коэффициента
размножения с каждым последующим пассажем не имеет смысла. Но
высаживать на укоренение микрочеренки очень маленького роста тоже не
эффективно, так как они будут иметь слабый ризогенез, что приведет к
большим потерям на этапах укоренения и адаптации, тем самым поставив под
вопрос исход всего процесса микроклонального размножения.
По литературным источникам мы знаем о положительном воздействии
активированного угля в процессе микроклонального размножения в условиях
88
in vitro [38, 204c.; 126, с.181-185; 168, с.183-197]. Основываясь на этом, мы
решили изучить влияние данного адсорбента на развитие, в частности на
активацию роста (вытягивание стеблей) микрочеренков на этапе
микроразмножения.
В качестве объектов исследования были взяты микрочеренки подвоев
Garnem 15, Myrobalan 29C, MaxMa 14 с 5-го пассажа и 3 модифицированные
среды МS, подробный состав которых предоставлен в таблице 3.2.6.
Таблица 3.2.6
Прописи модифицированных сред MS для активации роста
микрочеренков
МS для МS для Жидкая среда MS
Размножения вытягивания и для вытягивания и
Химическая формула (контроль) активного роста активного роста
I II III
мг/л мг/л мг/л
NH4NO3 500 500 1650
KNO3 2000 2000 3800
Ca(NO3)2. 4H2O 1200 1200 2000
KH2PO4 170 170 3400
MgSO4. 7H2O 370 370 889
CaCl2. 2H2O - - 1000
FeSO4. 7H2O 33,8 33,8 67,6
Na2EDTA 45,4 45,4 90,8
Zn(NO3)2. 6H2O 22,43 22,43 22,7
MnSO4. H2O 30,28 30,28 274,74
CuSO4. 5H2O 0,25 0,25 0,5
NiSO4. 6H2O 0,00053 0,00053 -
H3BO3 4,8 4,8 8,92
Na2MoO4. 2H2O 0,39 0,39 0,5
Thiamine HCl 2 2 0,8
Nicotinic Acid 1 1 -
Glycine 2 2 -
Myo – Inositol 100 100 200
BAP 0,6 0,2 0,1
NAA 0,01 0,01 -
IBA - - 0,02
г/л
Agar 6 6 -
Sucrose 30 30 30
Активированный уголь - 2 3
Цель исследования: сравнить три разных состава модифицированной
питательной среды, две из которых с активированным углем, причем одна из
89
них в твердом состоянии, а вторая в жидком. На 6-м пассаже микрочеренки
длиной 1-1,1 см высаживали на новые модифицированные среды, с учетом 30
штук на каждый вариант (3 баночки по 10 микрочеренков).

Рисунок 3.2.4. Процесс вливания жидкой питательной среды с

активированным углем на твердую среду MS с высаженными
микрочеренками

Для III-го варианта жидкую автоклавированную питательную среду с

активированным углем в концентрации 3 г/л доливали на твердую среду MS с
высаженными микрочеренками, как показано на рисунке 3.2.4. Данный процесс
совершали в стерильных условиях ламинарной кабины. Оценку
результативности исследования производили через 3 недели (таблица 3.2.7).
Таблица 3.2.7
Средняя длина стебля микрочеренков подвоев на различных
модификациях питательной среды MS
Garnem 15 MaxMa 14 Myrobalan
Питательная среда
29C
I MS для микроразмножения 1,2±0,5 1,34±0,23 1,13±0,42
(контроль)
II MS для микроразмножения + 3,2±0,52 2,8±0,7 2,5±0,23
2 г/л актив. Уголь
III Жидкая MS+3 г/л актив. Уголь 2,8±0,23 2,7±0,11 2,65±0,45

Как видно по результатам исследования (таблица 3.2.7),

оптимизированные питательные среды II и III позволили стимулировать
90
развитие и активировать рост микрочеренков, получить регенеранты с хорошо
развитым листовым аппаратом (4-7 парами листьев), пригодные для
дальнейшего пассажирования и пересадки на питательные среды для
ризогенеза (рисунок 3.2.5). По сравнению с контрольным вариантом (1,2 см)
средний рост микрочеренков подвоя Garnem 15 на питательной среде MS с 2 г/л
активированного угля (II) составил 3,2 см (рисунок 3.2.5), на жидкой
питательной среде MS с 3 г/л активированного угля (III) 2,8 см. Средний рост
мирочеренков подвоя MaxMa14 в контрольном варианте составил 1,34 см,
тогда как во втором варианте были получены микрочеренки со средним ростом
2,8 см, в третьем варианте - 2,7 см. Аналогичные результаты получены и по
подвою Myrobalan 29С: контрольный вариант - 1,13 см, второй вариант (MS с 2
г/л активированного угля) - 2,5 см, третий вариант (жидкая среда MS с 3 г/л
активированного угля) - 2,65 см.

Рисунок 3.2.5. Морфологические изменения у регенерантов подвоя

Garnem 15 на среде MS с 2 г/л активированного угля (II)

За время исследования, кроме активации роста и развития листового

аппарата у микрочеренков, было установлено еще несколько показателей
положительного воздействия активированного угля на регенеранты in vitro.
Во-первых, второй вариант среды MS с добавлением 2 г/л
активированного угля вызвал довольно-таки сильное корнеобразование у
микрочеренков подвоя MaxMa 14 (рисунок 3.2.6), где среднее число корней -
6,0 шт, а самый длинный корень - 6,5 см. В дальнейшем эти микрорастения,
минуя этап ризогенеза, переносили на адаптацию, результат которой был
положительным.
91
 Рисунок 3.2.6. Корнеобразование регенерантов MaxMa 14
на среде MS с 2 г/л активированного угля (II)

Во-вторых, активация роста микрочеренков при добавлении жидкой

питательной среды MS с 3 г/л активированного угля (III) происходила намного
быстрее. Чтобы подтвердить свои наблюдения, мы в условиях ламинарной
кабины долили жидкую среду MS с 3 г/л активированного угля (III) в баночки с
питательной средой MS и микрочеренками с первого варианта. Уже через 7-10
дней регенеранты в зависимости от подвоя достигали средней длины стебля
2,2-2,6 см, что еще раз доказывает положительное воздействие данной среды на
удлинение стеблей растений-регенерантов.
Таким образом, установлены оптимальные питательные среды для
введения в культуру in vitro клоновых подвоев и их размножения. Более
высокая приживаемость и интенсивное развитие эксплантатов наблюдалось для
подвоя MaxMa 14 [84, с.33-38] на среде VI (DKW + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л
ИМК + 2,0 мг/л тиамин +1,0 мг/л никотиновая кислота + 2,0 мг/л глицин +
100,0 мг/л инозитол) – 85,2 % (контроль - 74,3%), для подвоя Myrobalan 29C, с
незначительной разницей в результатах, на средах V (МS+0,6 БАП+0,01 НУК +
0,1 мг/л тиамин +0,5 мг/л никотиновая кислота + 2,0 мг/л глицин + 0,5 мг/л
пиридоксин+100,0 мг/л инозитол) и VI (DKW + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л ИМК
+ 2,0 мг/л тиамин +1,0 мг/л никотиновая кислота + 2,0 мг/л глицин + 100,0 мг/л
инозитол) - 92,5 и 90,0%, соответственно (контроль 75%), для подвоев GF 677,
Garnem 15, OHF 87 на среде IV (МS+0,6 БАП+0,01 НУК + 2,0 мг/л тиамин +1,0
мг/л никотиновая кислота + 2,0 мг/л глицин + 100,0 мг/л инозитол) - 95,0 - 93,3

92
- 91,6%, соответственно (контроль - 75,0 - 83,3 - 74,0%, соответственно). Таким
образом, на модифицированных нами питательных средах эксплантаты
характеризовались наивысшей приживаемостью и развитием, что позволило
повысить эффективность этапа микроразмножения на 10 - 12 %.
Установлено, что коэффициент размножения подвоев, в зависимости от
гормонального состава среды варьировал незначительно, однако существенно
различался в зависимости от генотипов подвоев. Максимальный показатель
коэффициента размножения отмечен у подвоя Myrabolan 29C – 5,39 на
питательной среде, содержащей 1 мг/л БАП+0,2 мг/л НУК. Минимальная
интенсивность размножения отмечена у подвоя Garnem 15 (1,49) на среде,
содержащей 1 мг/л БАП+0,02 мг/л НУК. В среднем для подвоев показаны
следующие коэффициенты размножения: Myrоbаlan 29C - от 4,13 до 5,39,
MaxMa 14 - от 4,21 до 4,83, GF 677 - от 4,0 до 4,76, Garnem 15 - от 1,49 до 1,87,
OHF 87 - от 4,0 до 4,35 [3, с.74-76].
Среды, которые показали высокий результат на этапе введения в
культуру, позволили получить сравнительно высокий результат и на этапе
микроразмножения. Максимальные показатели коэффициента размножения
микрочеренков подвоев по вариантам питательных сред I - IV составили 5,82 -
6,27.
Было установлено, что коэффициент размножения in vitro подвоев
изменяется не только в зависимости от типа питательной среды, генотипа, но и
от длительности пассажирования in vitro. На примере подвоя OHF 87 показано,
что при использовании модифицированной среды MS в течение 6 пассажей
коэффициент размножения колебался от 2,5 до 6,22.
Количество микрочеренков, пригодных для ризогенеза также различалось
по пассажам от 52,8 % на пятом пассаже до 69,9 % на четвертом пассаже, в
среднем, количество черенков, пригодных для ризогенеза составило 60,5 %.
Отмечено, что добавление активированного угля в концентрации 2-3 г/л в
питательную среду на пассаже предшествующем этапу укоренения, повышает
количество микрочеренков пригодных для ризогенеза на 40-45 %.
93
 Оптимизированные питательные среды MS для микроразмножения с
содержанием 2 г/л активированного угля и жидкая модифицированная MS с
содержанием 3 г/л активированного угля позволили стимулировать развитие и
активировать рост микрочеренков, получить регенеранты с хорошо развитым
листовым аппаратом (4-7 парами листьев), пригодные для дальнейшего
пассажирования и пересадки на питательные среды для ризогенеза.
Среда MS с добавлением 2 г/л активированного угля вызвала довольно-
таки сильное корнеобразование у микрочеренков подвоя MaxMa 14, где
среднее число корней - 6,0 шт, а самый длинный корень - 6,5 см (в дальнейшем
эти микрорастения, минуя этап ризогенеза, перенесли на адаптацию, результат
которой был положительным).
Активация роста микрочеренков при добавлении жидкой питательной
среды MS с 3 г/л активированного угля происходила намного быстрее. Уже
через 7-10 дней у регенерантов в зависимости от подвоя отмечена длина стебля
2,2-2,6 см (среднее), что еще раз доказывает положительное воздействие
данной среды на удлинение стеблей растений-регенерантов.

3.3. Ризогенез клоновых подвоев плодовых культур in vitro

Развитие корней у растений в культуре in vitro определяется, в первую

очередь, генотипом (способность к образованию корней в культуре in vitro, как
правило, коррелирует с укореняемостью черенков традиционными методами).
Большое влияние на ризогенез оказывает состав питательной среды:
минеральные компоненты на этапе укоренения и в пассажах предшествующих
укоренению; источник и концентрация углеводов; плотность среды;
концентрация и соотношение биологически активных веществ и способ их
воздействия на эксплантат (введение в состав среды, обработка микрочеренков,
предварительное замачивание микрочеренков в растворах БАВ); степень
развития микрочеренка и механические повреждения оснований черенка, и ряд
других факторов. Это свидетельствует о сложности процесса ризогенеза и
94
трудности управления им, тем не менее, как показывают экспериментальные
данные, при таком большом количестве факторов, влияющих на эффективность
укоренения, существует широкий спектр возможностей оптимизации
ризогенеза.
Fidancı А. и др. [127, с.409-412] в своем исследовании по
микроразмножению в условиях in vitro подвоев для черешни Gisela 5, MaxMa
14 микропобеги укореняли на среде 1/2 MS + 1,0 мг/л ИМК. В результате уже
через три недели было зафиксировано 95-100% полностью сформировавшихся
микрорастений.
В работе Kamali K. и др. [136, с.175-177] с подвоем GF 677 лучшие
результаты на этапе укоренения достигались на среде Линсмайера и Скуга с 0,3
мг/л НУК.
В другой исследовательской работе по укоренению того же подвоя GF
677 лучший коэффициент укоренения был получен на 1/2 MS с дополнением
3,0 мг/л ИМК [100, с.131-138].
Muna A.S. и др. [148, с.203-208] с целью целью укоренения микрочеренки
MaxMa14 высаживали на питательные среды МS + 0,5 µМ НУК, МS + 2,45 µМ
НУК, МS + 0,5 µМ ИМК, МS + 2,45 µМ ИМК и МS с половинчатым
содержанием макроэлементов. Самый высокий коэффициент укоренения был
отмечен на среде MS с дополнением 2,45 µМ ИМК (95%). Также было
отмечено, что добавление кинетина в среду для укоренения вызывало
удлинение побега и корней.
Из литературных источников было выявлено, что среда Гамборга
(Gamborg) ранее не использовалась в процессе микроразмножения in vitro
подвоев для косточковых плодовых культур Myrobаlan 29C, MaxMa 14, GF 677
и Garnem 15.
Целью первого исследования на этапе укоренения являлось изучение
воздействия безгормональной питательной среды Gamborg на морфологическое
развитие микрорастений некоторых подвоев косточковых культур на этапе
укоренения in vitro.
95
 Исследования проведены в лаборатории биотехнологии НИИ
плодоводства и чаеводства Министерства Сельского Хозяйства Азербайджана,
путем постановки опытов в лабораторных условиях (2018-2019 гг.).
Объекты исследования - подвои для косточковых плодовых культур
Myrobalan 29C, MaxMa 14, GF 677 и Garnem 15, среда Gamborg + витаминно-
минеральный комплекс.
Предыдущий укоренению пассаж размножения проходил:
для Myrobalan 29C - на среде MS + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л НУК +
витамины;
для GF 677 - на модифицированной среде MS + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л
НУК + витамины;
для Garnem 15- на модифицированной среде MS + 0,6 мг/л БАП + 0,01
мг/л НУК + витамины;
для MaxMa14 - на среде DKW + 0,6 мг/л БАП + 0,01 мг/л ИМК +
витамины.
На этапе укоренения растения-регенеранты от каждого подвоя
высаживали на безгормональную среду Гамборга + витаминно-минеральный
комплекс с учетом 30 штук на каждый вариант (3 баночки по 10
микрочеренков). Растения содержали в культуральной комнате в условиях
стандартного фотопериода 16/8 часов, температурой +21...+24ºС. Учитывали
процент укоренения, наличие каллуса, количество и длину корней. Результаты
исследования приведены в таблице 3.3.1.
Как видно из таблицы, состав среды Гамборга для растений-регенерантов
подвоев Myrobаlan 29C и GF 677 совершенно не подошел, полностью подавил
ризогенез, растения остановились в развитии и через некоторое время погибли
[80, с.42-46].
Таблица 3.3.1
Результативность укоренения in vitro подвоев косточковых культур на
безгормональной питательной среде Гамборга
Подвой Укоренение,% Количество Длина Каллус, %
96
 корней, шт корней, мм
Myrobalan 29C 0 0 0 0
GF 677 0 0 0 0
Garnem 15 55 4,9 7,3 0
MaxMa 14 100 9,65 16,3 0

Для регенерантов подвоя Garnem 15 результат укоренения на среде

Гамборга был следующим: укоренение - 55%, среднее число корней - 4,9 шт,
средняя длина корней - 7,3 мм. Кроме этого, сами растения, хотя и не трогались
в рост, их листовая пластина увеличилась в размерах [80, с.42-46].
Лучший результат укоренения (100%) на среде Гамборга, без
использования регуляторов роста, показали микрорастения подвоя MaxMa 14.
Среднее число корней при этом составило 9,65 шт, а их средняя длина 16,3 мм.
Кроме высокого процента укоренения, сильных корней отмечено хорошее
удлинение стеблей и увеличение площади листовых пластин [80, с.42-46]. Но
следует отметить, что корнеобразование на данной среде было очень
длительным и достигало 35-40 дней, тогда как обычно на этап укоренения
отводится примерно 20-25 дней.
Минеральный состав питательной среды по прописи Мурасиге-Скуга
(Murashige-Skoog, MS) является, по мнению многих исследователей, более
подходящим для ризогенеза плодовых растений. Однако, высокая
концентрация азота в данной питательной среде может способствовать
избыточному росту побегов и листьев, в ущерб корневой системе.
Оптимизация ризогенеза в культуре in vitro возможна и при изменении
концентрации или соотношения форм азота в питательной среде. По мнению
Е.В. Колбановой [46, с.252-264], среды с полной концентрацией макросолей по
прописи Мурасиге-Скуга не всегда подходят для ризогенеза. По её данным,
снижение содержания в средах аммонийного (NH 4NO3) и нитратного (KNO3)
азота в 2 и 3 раза увеличивает регенерационную способность сортов
крыжовника.

97
 Матушкин С.А. считает, что концентрация KNO3 и NH4NO3  должна
составлять 6,7 мкМ [60, c.37-42]. Ряд исследователей рекомендуют снижать
содержание аммонийного азота на этапе ризогенеза винограда in vitro [61,13с.].
Для оптимизации ризогенеза считается необходимым проводить пассаж,
предшествующий укоренению побегов, на питательной среде с содержанием 6-
БАП – 0,2–0,25 мг/л. Это связано с необходимостью получения побегов длиной
более 1,5 см, которые в последующем используют для укоренения [47, 24с.].
Укореняемость микропобегов зависит от числа пассажей размножения,
предшествующих укоренению, добавления экзогенных ауксинов. При
добавлении ИМК в питательную среду, оптимум концентраций для
регенерантов сливы находится в пределах 0,5–1,0 мг/л. Корнацкий С.А. [47,
24с.] отмечает, что побеги сорта Скороспелка красная укоренялись на 100,0%
после всех изученных пассажей на среде с ИМК в концентрации 0,5 мг/л.
Сравнительное изучение индукторов укоренения (ИМК, ИУК, НУК) выявило
высокую эффективность ИУК в концентрации 6,0 мг/л. НУК в изученном
интервале концентраций оказалась непригодной для укоренения побегов.
Увеличение концентрации ИМК более 1,0 мг/л вызывало интенсивное
каллусообразование в зоне ризогенеза, а также появление гипертрофированных
корней, что было помехой при пересадке микрорастений в субстрат.
Лебедев В.Г. с соавторами [52, с.307-314] также отмечали, что одна из
проблем при размножении алычи in vitro – низкая укореняемость при
использовании стандартных методик – 0,5 и 1,0 мг/л ИМК или НУК, при
которых наблюдалось интенсивное образование каллуса на основании побегов.
Применение двух ауксинов в низких концентрациях одновременно
способствовало развитию корней без образования каллуса. Оптимальным
вариантом для укоренения алычи гибридной можно считать сочетание НУК и
ИМК в концентрациях 0,1 мг/л, при котором наблюдались высокая частота
укоренения (94 %), количество корней на побег (3,5) и их умеренная длина (20
мм).

98
 С целью оценки результативности ризогенеза подвоев косточковых
культур Myrobalan 29C, MaxMa 14, Garnem 15, GF 677 и подвоя для груши OHF
87 в условиях in vitro были изучены следующие питательные среды и условия
культивирования:
I вариант (контроль). Питательная среда с макро- и микросолями по
прописи Мурасиге-Скуга (MS) [149, с.473-497] с добавлением регуляторов
роста - 0,1 мг/л БАП и 0,5 мг/л ИМК, витаминов - 1 мг/л В1 (тиамин), 0,5 мг/л В6
(пиридоксин), 0,5 мг/л РР (никотиновая кислота), 2 мг/л глицин и 100 мг/л
мезоинозит. Условия культивирования микрорастений in vitro: освещение 2,5-3
тыс. люкс, фотопериод 16/8 часов, температура +22...+25С.
II вариант. Питательная среда с макро- и микросолями по прописи
Мурасиге-Скуга (MS) [149, с.473-497] с добавлением регуляторов роста - 0,1
мг/л БАП и 0,5 мг/л ИМК, витаминов - 1 мг/л В1 (тиамин), 0,5 мг/л В6
(пиридоксин), 0,5 мг/л РР (никотиновая кислота), 2 мг/л глицин и 100 мг/л
мезоинозит. Условия культивирования микрорастений in vitro: 10 дней без
освещения, 10 дней с освещением 2,5-3 тыс. люкс, фотопериод 16/8 часов,
температура +22...+25С.
III вариант. Питательная среда с макро- и микросолями по прописи
Мурасиге-Скуга (MS) [149, с.473-497] с добавлением регуляторов роста - 0,5
мг/л ИМК и 0,1 мг/л НУК, витаминов – 1 мг/л В1 (тиамин), 0,5 мг/л В6
(пиридоксин), 0,5 мг/л РР (никотиновая кислота), 2 мг/л глицин и 100 мг/л
мезоинозит. Условия культивирования микрорастений in vitro: 10 дней без
освещения, 10 дней с освещением 2,5-3 тыс. люкс, фотопериод 16/8 часов,
температура +22...+25С.
IV вариант. Питательная среда с макро- и микросолями по прописи
Мурасиге-Скуга (MS) [149, с.473-497] с добавлением регуляторов роста - 1 мг/л
ИМК и 0,1 мг/л НУК, витаминов - 2 мг/л В1 (тиамин), 1,0 мг/л РР (никотиновая
кислота), 2 мг/л глицин и 100 мг/л мезоинозит. Условия культивирования

99
микрорастений in vitro: 10 дней без освещения, 10 дней с освещением 2,5-3 тыс.
люкс, фотопериод 16/8 часов, температура +22...+25С.
V вариант. Питательная среда с макро- и микросолями по прописи
Драйвера-Куниюки (DKW) [119, с.506-509] с добавлением регуляторов роста 1
мг/л ИМК и 0,01 мг/л НУК, витаминов - 2 мг/л В 1 (тиамин), 1 мг/л РР
(никотиновая кислота), 2 мг/л глицин и 100 мг/л мезоинозит. Условия
культивирования растений in vitro: освещение 2,5-3 тыс. люкс, температура
+22...+24 С, фотопериод 16/8 часов.
Во всех питательных средах в качестве хелата железа использовали
FeEDDTA.
Микрочеренки подвоев высаживали на модифицированные питательные
среды Мурасиге-Скуга (MS) [149, с.473-497] и Драйвера-Куниюки (DKW) [119,
с.506-509], с учетом 50 штук на каждый вариант (5 баночек по 10
микрочеренков). Длительность процесса укоренения составила 21-25 дней.
Результативность исследования учитывали по проценту укорененных
микрочеренков, среднему числу образовавшихся корней (шт) и их средней
длине (см) (таблица 3.3.2).
Исходя из результатов исследования предоставленных в таблице 3.3.2,
для корнеобразования у подвоя MaxMa 14 самой подходяйщей средой
оказалась среда DKW c 1,0 мг/л ИМК и 0,01 мг/л НУК (вариант V). На этой
среде доля укоренившихся растений-регенерантов подвоя составила 82,0%,
тогда как на средах I-IV данный показатель варьировал от 32% до 64%.
Максимальное число корней (4,2 шт) растений-регенерантов подвоя MaxMa14
также было получено на среде DKW: в первом варианте этот показатель
составил 2,02 шт, во втором варианте - 3,8 шт, в третьем варианте – 3,0 шт, а в
четвертом варианте - 3,8 шт. Средняя длина корней микрорастений менялась в
зависимости от состава питательной среды и варьировала от 0,95 см (вариант I)
до 4,3 см (V).

100
 Таблица 3.3.2
Влияние состава питательных сред и условий культивирования на укоренение
подвоев плодовых культур в условиях in vitro
Укореняемость, % Среднее число корней, шт Средняя длина корней, см

Myrobalan 29C

Myrobalan 29C

Myrobalan 29C
Условия

MaxMa14

MaxMa14

MaxMa14
Garnem

Garnem

Garnem
OHF87

OHF87

OHF87
GF677
GF677

GF677
Варианты культиви
-рования

I MS + 0,1 мг/л БАП + 0,5 мг/л 32, 36,0 40, 0 0 2,0 1,8 1,3 0 0 0,9 0,54 0,8 0 0
ИМК + 1,0 мг/л В1 + 0,5 мг/л В6 0 0 2 5 5
освещен
+ 0,5 мг/л РР + 2 мг/л глицин
ие
+100 мг/л мезоинозит
(контроль)
II MS + 0,1 мг/л БАП + 0,5 мг/л 10 дн. 58, 43,3 44, 0 0 3,8 2,2 1,8 0 0 1,0 1,0 1,7 0 0
ИМК + 1,0 мг/л В1 + 0,5 мг/л В6 темнота 0 0 2
+ 0,5 мг/л РР + 2 мг/л глицин + /
100 мг/л мезоинозит 10 дн.
освещен
ие
II MS + 0,5 мг/л ИМК + 0,1 мг/л 10 дн. 56, 50,0 14, 14, 27, 3,0 2,1 1,5 2,8 4,7 1,7 1,03 1,8 1,3 1,5
I НУК + 1,0 мг/л В1 + 0,5 мг/л В6 темнота 0 0 0 0
+ 0,5 мг/л РР + 2 мг/л глицин + /
100 мг/л мезоинозит 10 дн.
освещен
ие
I MS + 1,0 мг/л ИМК + 0,1 мг/л 10 дн. 64, 80,0 88, 80, 80, 3,8 4,0 3,7 4,7 6,5 3,8 3,5 2,9 3,2 2,9
V НУК + 2,0 мг/л В1 + 1,0 мг/л РР темнота 0 0 0 0
+ 2 мг/л глицин + 100 мг/л /
мезоинозит 10 дн.
101
 освещен
ие
V DKW + 1,0 ИМК мг/л + 0,01 10 дн. 82, 70,0 0 0 0 4,2 5,2 0 0 0 4,3 3,0 0 0 0
НУК мг/л + 2,0 мг/л В1 + 1,0 темнота 0
мг/л РР + 2 мг/л глицин + 100 /
мг/л мезоинозит 10 дн.
освещен
ие

102

102
 Оптимальное укоренение микрорастений подвоя Myrobalan 29C (80,0 %)
отмечено на среде MS при использовании ИМК в концентрации 1,0 мг/л и НУК
в концентрации 0,1 мг/л.
Минимальный процент укоренения зафиксирован на среде MS с 0,1 мг/л
БАП и 0,5 мг/л ИМК при культивировании в условиях фотопериода 16/8 часов,
тогда как в условиях 10 дневной этиоляции и 10 дневного освещения этот
показатель составил 43,3%. Неплохой процент укоренения наблюдался и на
среде DKW - 70%. На среде MS с добавлением 0,5 мг/л ИМК и 0,1 мг/л НУК
доля укоренившихся растений-регенерантов составила всего 50%.
Самое большее количество корней отмечено на среде DKW с
индукторами ризогенеза 1,0 мг/л ИМК и 0,01 мг/л НУК (5,2 шт), тогда как в
варианте показывающем наивысший процент укореняемости (вариант IV)
среднее количество корней составило 4,0 шт. Максимальная длина корней
зафиксирована на среде MS (вариант IV) с добавлением 1,0 мг/л ИМК и 0,1 мг/л
НУК. Минимальные показатели корнеобразования микрорастений подвоя
Myrobalan 29C отмечены в контрольном варианте MS (вариант I) с добавлением
0,1 мг/л БАП и 0,5 мг/л ИМК (рисунки 3.3.1 - 3.3.4).

Рисунок 3.3.1. Растения-регенеранты клонового подвоя Myrobalan 29C на

этапе ризогенеза
Для подвоя Garnem 15 лучшая укореняемость наблюдалась в варианте IV
(88,0%), что превышает показатель укореняемости в контрольном варианте
(40,0%) на 48,0%. Также между этими вариантами исследования наблюдалась
существенная разница в среднем количестве корней и их длине. Так, на среде
IV среднее количество новообразовавшихся корней на одно микрорастение
103
составило 3,7 шт, а их средняя длина 2,9 см, тогда как в контрольном варианте
зафиксировано 1,3 шт корней, средняя длина которых составляла 0,8 см.
Питательная среда DKW полностью ингибировала процесс ризогенеза у
микрочеренков подвоя Garnem 15 (табл. 3.3.2, рисунки 3.3.2 - 3.3.4).
Для подвоев GF 677 и OHF 87 оптимальный состав питательной среды,
как и для подвоя Garnem 15 включает минеральный состав по прописи MS,
дополненный ауксинами для корнеобразования 1,0 мг/л ИМК + 0,1 мг/л НУК
(IV вариант).

Укореняемость, %
90
80
I
70
60 II
50 III
40 I
30 V
20
10
0
MaxMa14 Myrobalan 29C Garnem GF677 OHF87

Рисунок 3.3.2. Укореняемость микрочеренков подвоев плодовых культур

в 5-и вариантах питательных сред

Среднее количество корней, шт

7
6 I
5 II
4 III
3 IV
2
V
1
0
MaxMa14 Myrobalan 29C Garnem GF677 OHF87

Рисунок 3.3.3. Среднее количество корней микрорастений подвоев

плодовых культур образовавшихся в 5-и вариантах питательных сред

104
 Средняя длина корней, см
4.5
4
I
3.5
3
II
2.5 III
2 IV
1.5 V
1
0.5
0
MaxMa14 Myrobalan 29C Garnem GF677 OHF87

Рисунок 3.3.4. Средняя длина корней микрорастений подвоев плодовых

культур образовавшихся в 5-и вариантах питательных сред
Доля укоренившихся растений-регенерантов клонового подвоя GF 677
составила 80,0% (на 25 день после посадки на питательную среду с
регуляторами корнеобразования), среднее число образовавшихся корней у
каждого микрорастения - 4,7 шт, средняя их длина 3,2 см; для подвоя для
груши OHF 87 - доля укоренившихся растений-регенерантов 80,0%, среднее
число образовавшихся корней 6,5 шт, средняя их длина 2,9 см. Такое развитие
корневой системы максимально для изученных клоновых подвоев и должно
обеспечивать высокий уровень адаптации растений-регенерантов в
нестерильных условиях, на субстратах, резко отличающихся по физическим и
химическим параметрам от питательных сред. Необходимо также отметить, что
среды I, II и V полностью ингибировали корнеобразование у микрочеренков
данных подвоев (рисунки 3.3.2 - 3.3.4).
Кроме всего вышесказанного, в ходе исследования было установлено
(сравнивая результаты I-го и II-го вариантов), что корнеобразование
микрочеренков подвоев косточковых плодовых культур Myrobalan 29C, MaxMa
14, Garnem 15, GF 677 и подвоя для груши OHF 87 лучше происходит при
условиях 10 дневной этиоляции с последующим культивированием при
нормальном освещении 2-3 кЛк и фотопериоде 16/8 часов. Так, уже на 7-10-й
день после посадки на среду для укоренения и культивирования в условиях

105
этиоляции у 98% микрочеренков подвоя OHF 87 наблюдалось набухание
оснований, а на 12-14 день появление корешков (рисунок 3.3.5).

Рисунок 3.3.5. Микрочеренки подвоя для груши OHF 87 на среде

для укоренения на 14-й день после посадки
На примере подвоя OHF 87 была изучена эффективность укоренения в
зависимости от пассажа культивирования in vitro на модифицированной
питательной среде МS, дополненной 1,0 мг/л ИМК и 0,1 мг/л НУК.
Таблица 3.3.3
Результативность ризогенеза подвоя OHF 87 в зависимости от пассажа
Пассаж Питательная Число Число укоренившихся
среда микропобегов, шт микропобегов,
Шт %
2 МS +1,0мг/л 43 31 72
3 55 45 82
ИМК + 0,1
4 76 52 68
5 мг/л НУК 42 29 69
6 63 44 70
Сумма/среднее 279 201 72,2

Показано, что при посадке на питательную среду для укоренения

растений-регенерантов размером 2-5 cм, в среднем, укоренялось 72,2 %
растений-регенерантов. Существенного изменения эффективности укоренения
клонового подвоя для груши OHF 87 в зависимости от пассажа не отмечено - от
68 % на четвертом пассаже до 82 % на третьем пассаже (таблица 3.3.3).
Таким образом, состав питательной среды Гамборга (Gamborg) [131,
с.372-375] для растений-регенерантов подвоев Myrobаlan 29C и GF 677
совершенно не подошел, полностью подавил ризогенез, растения остановились
106
в развитии и через некоторое время погибли. Для регенерантов подвоя Garnem
15 результат укоренения на среде Гамборга был следующим: укоренение - 55%,
среднее число корней - 4,9 шт, средняя длина корней - 7,3 мм. Кроме этого,
сами растения, хотя и не трогались в рост, их листовая пластина увеличилась в
размерах [80, с.42-46].
Лучший результат укоренения (100%) на питательной среде Гамборга, без
использования регуляторов роста, показали микрорастения подвоя MaxMa 14.
Среднее число корней при этом составило 9,65 шт, а их средняя длина 16,3 мм
[80, с.42-46]. Кроме высокого процента укоренения, сильных корней отмечено
хорошее удлинение стеблей и увеличение площади листовых пластин. Но
корнеобразование на данной среде было очень длительным и достигало 35-40
дней, тогда как обычно на этап укоренения отводится примерно 20-25 дней.
Для корнеобразования у подвоя MaxMa 14 самой подходяйщей средой
оказалась модифицированная питательная среда DKW [119, с.506-509] c 1,0
мг/л ИМК и 0,01 НУК. На этой среде доля укоренившихся растений-
регенерантов составила 82,0%. Максимальное число корней (4,2 шт) растений-
регенерантов подвоя MaxMa 14 также было получено на среде DKW.
Оптимальное укоренение микрорастений подвоя Myrobalan 29C (80,0 %)
отмечено на модифицированной питательной среде MS [149, с.473-497] при
использовании ИМК в концентрации 1,0 мг/л и НУК в концентрации 0,1 мг/л.
Самое большее количество корней отмечено на модифицированой среде DKW
[119, с.506-509] с индукторами ризогенеза 1,0 мг/л ИМК и 0,01 мг/л НУК (5,2
шт), а максимальная длина корней зафиксирована на среде MS с добавлением
1,0 мг/л ИМК и 0,1 мг/л НУК.
Для подвоя Garnem 15 лучшая укореняемость наблюдалась на
модифицированной питательной среде MS с добавлением 1,0 мг/л ИМК и 0,1
мг/л НУК, где доля укоренившихся растений-регенерантов составила 88,0%,
что превышает показатель укореняемости в контрольном варианте (40,0%) на
48,0%. Также между этими вариантами исследования наблюдалась
существенная разница в среднем количестве корней и их длине. Так, на среде
107
MS + 1,0 мг/л ИМК + 0,1 мг/л НУК среднее количество новообразовавшихся
корней на одно микрорастение составило 3,7 шт, а их средняя длина 2,9 см,
тогда как в контрольном варианте зафиксировано 1,3 шт корней, средняя длина
которых составляла 0,8 см.
Для подвоев GF 677 и OHF 87 оптимальный состав питательной среды
включает минеральный состав по прописи питательной среды MS,
дополненный ауксинами для корнеобразования 0,1 мг/л НУК + 1,0 мг/л ИМК.
Доля укоренившихся растений-регенерантов клонового подвоя GF 677 на этой
среде составила 80,0% (на 25 день после посадки на питательную среду с
регуляторами корнеобразования), среднее число образовавшихся корней у
каждого микрорастения - 4,7 шт, средняя их длина 3,2 см; для подвоя для
груши OHF 87 - доля укоренившихся растений-регенерантов 80,0%, среднее
число образовавшихся корней 6,5 шт, средняя их длина 2,9 см. Такое развитие
корневой системы максимально для изученных клоновых подвоев и должно
обеспечивать высокий уровень адаптации растений-регенерантов в
нестерильных условиях, на субстратах, резко отличающихся по физическим и
химическим параметрам от питательных сред.
Было установлено, что корнеобразование микрочеренков подвоев
косточковых плодовых культур Myrobalan 29C, MaxMa 14, Garnem 15, GF 677 и
подвоя для груши OHF 87 лучше происходит при условиях 10 дневной
этиоляции с последующим культивированием при нормальном освещении 2-3
кЛк и фотопериоде 16/8 часов.
Кроме того, существенного изменения эффективности укоренения
подвоев плодовых культур в условиях in vitro в зависимости от пассажа не
наблюдалось.

IV ГЛАВА. ОСОБЕННОСТИ ВВЕДЕНИЯ, РАЗМНОЖЕНИЯ И

УКОРЕНЕНИЯ СОРТОВ ВИНОГРАДА В КУЛЬТУРЕ
IN VITRO
108
 Введение в культуру in vitro местных азербайджанских сортов винограда
обусловлено необходимостью начала работ по оздоровлению винограда от
системных болезней, в первую очередь бактериальных, вирусных и
фитоплазменных. Сбор и сохранение уникального генофонда винограда
Азербайджана в культуре in vitro является первым шагом для начала данных
исследований, поскольку многочисленными теоретическими и практическими
исследованиями доказано, что культура in vitro полностью освобождает
растения от грибных и бактериальных инфекций и способствует элиминации
вирусных болезней. Кроме того, в культуре in vitro возможно проведение работ
по термо- и хемотерапии, позволяющих полностью удалить вирусы из
эксплантатов [78, с.761-764].
Сохранение винограда в естественной среде обитания (in situ) является в
настоящее время основным способом создания коллекций. Основные
недостатки таких коллекций (повреждения при неблагоприятных погодных
условиях, риски переопыления, необходимость в больших земельных площадях
и значительных материальных человеческих ресурсах) могут нивелироваться
при хранении генетических коллекций в культуре тканей in vitro при
нормальной (+20...+25°С) и минимальной (+2...+5°С) вегетации, а так же
криоконсервации. Данные способы хранения способствуют снижению затрат и
площадей на содержание коллекций, позволяют быстро размножать,
адаптировать и использовать в работе хранящиеся генотипы, обмениваться
материалом без карантинных процедур. Повышенное внимание в настоящее
время уделяется сохранению стародавних местных сортов растений, которые
приобрели свои отличительные признаки в результате многолетнего
выращивания и сопутствующего отбора в конкретной местности, а также
сортов собственной селекции. Данные генотипы, как правило, имеются только
в определенных зонах и требуют особых мер для сохранения. Основными
проблемами при сохранении местных сортов и сортов собственной селекции
является отсутствие данных о введении в культуру in vitro данных форм,
особенностях режимов их культивирования и депонирования.
109
 Вирусные заболевания вызывают снижение урожая, качества ягод и
зачастую гибель растения винограда. У винограда диагностируется большое
количество вирусных и вирусоподобных патогенов, которые вызывают
серьезные заболевания. Патогены винограда, вызывающие заболевания,
приносящие наибольший экономический ущерб разделены на 5 групп в
зависимости от визуальных симптомов и способов переноса вирусов:
A. Grapevine degeneration complex
1. Arabis mosaic virus (Nepovirus, ArMV)
2. Grapevine chrome mosaic virus (Nepovirus,GCMV)
3. Grapevine fanleaf virus (Nepovirus, GFLV)
4. Raspberry ringspot virus (Nepovirus, RpRSV)
5. Strawberry latent ringspot virus (Sadwavirus, SLRV)
6. Tomato black ring virus (Nepovirus, TBRV)
B. Grapevine leafroll complex
7. Grapevine leafroll-associated virus 1 (Ampelovirus, GLRaV 1)
8. Grapevine leafroll-associated virus 2 (Closterovirus, GLRaV 2)
9. Grapevine leafroll-associated virus 3 (Ampelovirus, GLRaV 3)
10. Grapevine leafroll-associated virus 4 (Ampelovirus, GLRaV 4)
11. Grapevine leafroll-associated virus 5 (Ampelovirus, GLRaV 5)
12. Grapevine leafroll-associated virus 6 (Ampelovirus, GLRaV 6)
13. Grapevine leafroll-associated virus 7 (GLRaV 7)
C. Grapevine rugose wood complex
14. Grapevine virus A (Vitivirus, GVA)
15. Grapevine virus B (Vitivirus, GVB)
16. Grapevine rupestris stem pitting associated virus (Foveavirus, GRSPV)
D. Grapevine fleck disease
17. Grapevine fleck virus (Maculovirus, GFkV)
E. Grapevine diseases caused by phytoplasmas
18. Grapevine flavescence dorée phytoplasma
19. Grapevine bois noir and other yellows phytoplasmas
110
 4.1. Особенности введения в культуру in vitro винограда сортов

народной селекции Мадраса и Баян Ширей

Целью исследования было подобрать самый подходящий эксплантат для

введения в культуру in vitro, показывающий наивысший процент
жизнеспособности. Для введения эксплантатов винограда в культуру in vitro
использовалась питательная среда MS, модифицированная под культуру
винограда (таблица 4.1.1).
Таблица 4.1.1
Пропись питательной среды для введения винограда в культуру in vitro

Макро- и микросоли Концентрация, мг/л

В
NH4NO3 1650,0
MgSO47H2O 370,0
KH2PO4 170,0
KNO3 1900,0
CaCl22H2O 440,0
Na2ЭДTA 37,3
FeSO47H2O 27,8
H3BO3 6,2
MnSO44H2O 22,3
ZnSO44H2O 8,6
KJ 0,83
Na2MoO42H2O 0,25
CuSO45H2O 0,025
CoCl25H2O 0,025
Пиридоксина гидрохлорид (витамин В6) 0,8
Тиамина гидрохлорид (витамин В1) 0,8
Никотиновая кислота (витамин РР) 1,0
БАП 1,1
Мезоинозит( г) 10
Сахароза ( г) 30

культуру in vitro вводили сорта винограда Мадраса и Баян Ширей. Для этого
весной с молодых побегов виноградной лозы с доказанной сортовой
принадлежностью срезали кончики побегов с 3-4 почками (рисунок 4.1.1). В
качестве эксплантатов использовали верхушечные и боковые почки, а также
меристемы, выделенные из этих почек.

111
 Рисунок 4.1.1. Эксплантаты винограда

Стерилизация эксплантатов проводилась по следующей схеме:

- мыльный раствор, с последующей промывкой под проточной водой - 10 мин;
-раствор фунгицида Caputan 50WP (30 г фунгицида / 970 мл Н 2О), с
последующей промывкой под проточной водой - 20-30 мин;
- раствор 5%-го гипохлорида натрия (15 мл препарата / 85 мл Н2О) - 20-30 мин;
- трехкратная промывка стерильной водой - по 5 мин.
После окончания стерилизации эксплантаты высаживали в пробирки с
автоклавированной питательной средой. Если в культуру вводилась меристема,
то при помощи пинцета и скальпеля под бинокулярным микроскопом из
каждой почки вычленялась меристема и незамедлительно высаживалась на
автоклавированную питательную среду (рисунок 4.1.2).

Рисунок 4.1.2. Боковые почки (а) и меристема (с примодиями) (б)

винограда сорта Мадраса, введенные в культуру in vitro

112
 Данные по результативности инициации культуры in vitro представлены в
таблице 4.1.2 [79, с.154-158].
Таблица 4.1.2
Показатели жизнеспособности эксплантатов сортов винограда Мадраса и
Баян Ширей при введении в культуру in vitro
Количество эксплантатов
Сорт Мадраса Сорт Баян Ширей
Тип эксплантата
Введенных Жизнеспособных Введенных Жизнеспособных
шт. шт. % шт. шт. %
Меристема 60 40 66,7 60 40 66,7
верхушечная
60 40 66,7 60 40 66,7
почка
боковая почка 100 70 70,0 70 70 100,0
сумма/среднее 220 150 68,2 190 150 78,9

Все типы эксплантов оказались пригодными для инициации культуры in

vitro. Высокая регенерационная способность на этапе введения в культуру in
vitro наблюдалась при использовании в качестве эксплантата боковых почек -
для сорта Мадраса 70,0%, Баян Ширей - 100,0%. Выход жизнеспособных
эксплантатов, введенных в культуру in vitro из меристемы и верхушечной
почки и для сорта Мадраса, и для сорта Баян Ширей составил 66,7% [79, с.154-
158; 172, с.102].
Установлено и влияние генотипа на эффективность инициации культуры
in vitro. В среднем по типам эксплантатов сорт Мадраса характеризовался
несколько меньшей регенерационной способностью (68,2 %) [79, с.154-158;
172, с.102].
На первом пассаже вели наблюдения за развитием введенных типов
эксплантатов: меристема, верхушечная почка, боковая почка. Конгломераты
микропобегов винограда формировали микрорастения высотой от 1,5 см до 3,5
см (рисунок 4.1.3).

113
 сорт Мадраса сорт Баян Ширей
Рисунок 4.1.3. Растения-регенеранты винограда через 20 суток после
введения в культуру in vitro

Развитие эксплантатов в значительной степени зависело от сортовой

принадлежности винограда. Развитый листовой аппарат характерен для сорта
Мадраса [79, с.154-158; 172, с.102].

4.2. Микроразмножение сортов винограда Мадраса и Баян Ширей

После 3 недель культивирования в условиях in vitro меристемы

переносили на свежую питательную среду для микроразмножения MS + 1,0
мг/л БАП + 0,5 мг/ ИМК. Через 3 недели микрорастения вновь высаживали на
свежую питательную среду с тем же гормональным составом (рисунок 4.2.1).
При оценке результативности данного этапа учитывали число и длину
образовавшихся микропобегов (таблица 4.2.1).

Таблица 4.2.1
Число образовавшихся микропобегов Мадраса и Баян Ширей
на 3-м пассаже (среднее)
Сорт Число побегов Длина побегов
Мадраса 3,67 2,42
Баян Ширей 3,83 2,04

114
 По результатам исследования для сорта Мадраса среднее число побегов
составило 3,67 шт, длина 2,42 см, а для сорта Баян Ширей среднее число
побегов составило 3,83 шт, длина побегов 2,04 см (таблица 4.2.1).

Рисунок 4.2.1. Сорта винограда на этапе микроразмножения in vitro

Кроме этого на данном этапе было установлено, что избыточное

использование регуляторов роста, в данном случае БАП, приводит к
каллусообразованию, что оказывает негативное влияние на последующее
корнеобразование.
Ekbiç H.B. и др. [8, с.65-70] размножали виноград сорта Изабелла на
среде MS с добавлением 0; 1,0; 2,0; 3,0 и 4,0 мг/л БАП. Каждые 3 недели
микрочеренки пересаживали на свежую питательную среду. Всего было
проведено 5 пассажей. По результатам исследования большее количество
побегов на всех 5 пассажах было получено на среде MS + 1,0 мг/л БАП.
Так, в используемой нами питательной среде повышение концентрации
БАП до 2,0 мг/л оказалась избыточной, в результате чего у регенерантов
наблюдалось мощное каллусообразование, что послужило основанием для
снижения концентрации БАП до 1,0 мг/л (рисунок 4.2.2).

115
 Рисунок 4.2.2. Калусообразование у сортов винограда в культуре in vitro

4.3. Особенности ризогенеза винограда сортов Мадраса и Баян

Ширей

Укоренение винограда в культуре in vitro, как и для клоновых подвоев

определяется минеральным и гормональным составом питательной среды,
морфологическим развитием растений-регенерантов сортов. Культура
винограда в среднем достаточно хорошо укореняется, как в естественных
условиях, так и на искусственных питательных средах. Тем не менее,
получение корневой системы высокого качества (разветвленной, без каллусных
тканей у основания корней) требует определения подходящих питательных
сред и условий культивирования.
Бугаенко Л.А. и Иванова-Ханина Л.В. [27, с.73-82] в результате
исследований установили, что укореняемость микрочеренков винограда сорта
Фрумоаса албэ выше на среде с концентрацией ИУК 0,5 мг/л. Отмечено
формирование интенсивно растущего побега, имеющего 4-6 хорошо развитых
корней длиной 32,7 ± 0,8 мм. При дальнейшем повышении концентрации ИУК
в среде происходило ингибирование роста растений, формировались
утолщенные и укороченные корни. Также было установлено, что
культивирование микрочеренков винограда сорта Каберне Совиньон в варианте
среды с концентрацией ИУК 0,5-1,0 мг/л способствовало формированию
хорошо развитой корневой системы.

116
 Aazami M.A. [97, с.5229-5232] микрорастения иранских сортов винограда
Soltanin и Sahebi укоренял на среде MS с 1,0 мг/л ИМК.
Dzazio P.M. и др. [120, с.759-764] на этапе in vitro укоренения подвоя
винограда 420-А использовал ½ МS и ½ МS + 1,0 г/л активного угля.
Как видно, мнения авторов о составе питательной среды для укоренения
микрочеренков винограда, на которой возможно будет получить высокий
процент укореняемости и, наконец, полноценное, полностью сформированное
растение, расходятся. Тот факт, что для каждого отдельного сорта необходимо
подбирать индивидуальный состав питательной среды, стало основным
обстоятельством проведения исследования, целью которого было подобрать
самую подходящую комбинацию и концентрацию регуляторов роста на этапе
укоренения для получения полноценных растений сортов винограда народной
селекции Мадраса и Баян Ширей.
В качестве объектов исследования служили микрочеренки местных
сортов винограда Мадраса и Баян Ширей, а также модифицированная
различными концентрациями ауксинов и цитокининов среда Мурасиге и Скуга
(MS) в 9 вариантах.
Варианты использованных в питательной среде концентраций ауксинов и
цитокининов:
1. 0,5 мг/л ИМК 7. 0,5 мг/л ИМК +0,5мг/л 2 iP
2. 1,0 мг/л ИМК 8. 1,0 мг/л ИМК +0,5 мг/л 2 iP
3. 2,0 мг/л ИМК 9. 2,0 мг/л ИМК +0,5 мг/л 2 iP
4. 0,5 мг/л ИМК+0,5 мг/л БАП
5. 1,0 мг/л ИМК +0,5 мг/л БАП
6. 2,0 мг/л ИМК +0,5 мг/л БАП

В связи с тем, что полученные на этапе микроразмножения побеги на

следующем этапе укоренения образуют пазушные побеги, такие показатели,
как число побегов и листьев, длина побегов учитывали и на этапе укоренения.
Так, при оценке результатов этапа укоренения микрорастений винограда сортов
Мадраса и Баян Ширей на питательных средах с использованием 9 различных
гормональных комбинаций и концентраций учитывали: число побегов (шт),

117
длину побегов (см), число листьев на побегах (шт), процент укоренения
(процент получения полноценного растения, %), число корней (шт) и их длину
(см). Результаты исследования представлены в таблицах 4.3.1, 4.3.2 и на
рисунках 1-10 (приложение 1).
Таблица 4.3.1
Показатели микрорастений сортов Мадраса и Баян Ширей
на этапе укоренения
Число Длина Число листьев,
побегов, шт побегов, см шт

Мадраса

Мадраса

Мадраса
Варианты

Баян
Ширей

Ширей
Баян

Баян
Ширей
1
0,5 мг/л ИМК (контроль) 1,1 1,30 1,38 3,02 2,12 4,4
2
1,0 мг/л ИМК 1,0 1,0 2,46 3,25 4,1 5,13
3
2,0 мг/л ИМК 1,23 1,33 1,68 2,67 1,75 4,16
4
0,5 мг/л ИМК + 0,5 мг/л БАП 2,11 1,90 1,86 1,71 2,31 3,3

5 1,0 мг/л ИМК + 0,5 мг/л БАП 1,12 2,11 1,74 1,9 1,70 3,45
6
2,0 мг/л ИМК + 0,5 мг/л БАП 1,24 1,89 1,25 2,07 3,22 3,8
7
0,5 мг/л ИМК + 0,5 мг/л 2iP 1,6 1,43 1,93 2,04 3,82 3,45

8 1,0 мг/л ИМК + 0,5 мг/л 2iP 1,12 1,15 2,09 1,71 2,67 2,8
9
2,0 мг/л ИМК + 0,5 мг/л 2iP 1,33 1,1 2,06 1,2 2,58 2,70

Как видно из таблицы 4.3.1, самое большее количество аксиллярных

побегов было получено для сорта Мадраса (2,11 шт) в 4-м варианте МS + 0,5
мг/л ИМК + 0,5 мг/л БАП (рисунок 2, приложение 1), а для сорта Баян Ширей
(2,11 шт) в 5-м варианте МS + 1,0 мг/л ИМК + 0,5 мг/л БАП (рисунок 8,
приложение 1). Необходимо отметить, что в целом на этапе укоренения
побегообразование микрорастений сорта Мадраса по сравнению с
микрорастениями сорта Баян Ширей было ниже.

118
 По длине побегов и активности листообразования микрорастения сорта
Мадраса также уступали микрорастениям Баян Ширей. Так, самые длинные
побеги (3,25 см) и активное листообразование (5,13 шт) отмечены у сорта Баян
Ширей во 2-м варианте на среде МS с добавлением 1,0 мг/л ИМК (рисунок 6,
приложение 1).
Также в ходе исследования было выявлено, то обстоятельство, что среды
ингибирующие побегообразование обоих сортов, положительно влияли на
вытягивание побегов в длину. Так, для сортов Мадраса и Баян Ширей во 2-м
варианте на среде МS с добавлением 1,0 мг/л ИМК (рисунок 1, рисунок 6,
приложение 1) отмечено минимальное количество побегов (1,0 шт) и
максимальная длина побега 2,46 и 3,25 см, соответственно.
Оценивая корнеобразование обоих сортов (таблица 4.3.2) установлено,
что самый высокий процент укоренения для сорта Мадраса был получен на
среде с содержанием 2,0 мг/л ИМК - 84% (рисунок 2, приложение 1), а для
сорта Баян Ширей на среде с содержанием 1,0 мг/л ИМК - 82% (рисунок 6,
приложение 1).
Максимально длинный корень зафиксирован в 1-м варианте (рисунок 6,
приложение 1) для сорта Баян Ширей (3,9 см) и во 2-м варианте (рисунок 1,
приложение 1) для сорта Мадраса (3,47 см) с содержанием 0,5 мг/л и 1,0 мг/л
ИМК, соответственно.
По количественному показателю большее количество корней и для сорта
Мадраса (7,6 шт) и для сорта Баян Ширей (6,83 шт) образовалось на
питательной среде МS + 2,0 мг/л ИМК (рисунок 2, рисунок 7, приложение 1).
Максимальная средняя длина образовавшихся in vitro корней для
микрорастений сорта Мадраса (3,34 см) зафиксирована на среде МS с
содержанием 1,0 мг/л ИМК (рисунок 1, приложение 1), а для микрорастений
сорта Баян Ширей (2,33 см) на среде МS + 1,0 мг/л ИМК + 0,5 мг/л БАП
(рисунок 8, приложение 1).
Таблица 4.3.2
Показатели корнеобразования у микрорастений сортов Мадраса и
119
 Баян Ширей на этапе укоренения
Варианты Укоренение Самый Средняя Среднее
,% длинный длина число
корень, см корней, см корней,
шт

Мадраса

Мадраса

Мадраса

Мадраса
Баян

Баян

Баян

Баян
Ширей

Ширей

Ширей

Ширей
1 0,5 мг/л ИМК (контроль) 10,0 80,0 0,5 3,9 0,34 1,93 0,2 3,7

2 1,0 мг/л ИМК 83,0 82,0 3,47 2,96 3,34 2,29 2,6 5,2

3 2,0 мг/л ИМК 84,0 80,0 0,47 2,67 0,27 1,63 7,6 6,8
3
4 0,5 мг/л ИМК + 0,5 мг/л БАП 10,0 0 0,21 0 0,17 0 0,44 0

5 1,0 мг/л ИМК + 0,5 мг/л БАП 18,0 65,0 0,08 2,84 0,08 2,33 0,10 0,8
9
6 2,0 мг/л ИМК + 0,5 мг/л БАП 49,0 62,0 1,64 2,4 1,24 1,71 2,78 1,3
3
7 0,5 мг/л ИМК + 0,5 мг/л 2iP 25,0 0 0,84 0 0,61 0 0,60 0

8 1,0 мг/л ИМК + 0,5 мг/л 2iP 32,0 30,0 2,09 0,31 1,40 0,23 1,0 0,4

9 2,0 мг/л ИМК + 0,5 мг/л 2iP 60,0 70,0 2,36 2,23 0,24 1,31 0,33 3,8

Судя по результатам исследования, среда с содержанием 0,5 мг/л ИМК +

0,5 мг/л БАП (рисунок 7, приложение 1) и среда с содержанием 0,5 мг/л ИМК +
0,5 мг/л 2ip (рисунок 9, приложение 1) полностью ингибировали процесс
корнеобразования у микрорастений сорта Баян Ширей (таблица 4.3.2).
В целом, оптимальные результаты по укоренению in vitro обоих сортов
винограда получены на среде MS с содержанием 1,0 мг/л ИМК (рисунок 1,
рисунок 6, приложение 1), за исключением количества корней, максимальное
количество которых (таблица 4.3.2), было получено на среде с содержанием 2,0
мг/л ИМК (рисунок 2, рисунок 7, приложение 1). Данная среда (MS + 1,0 мг/л
ИМК) позволила получить растения с хорошими морфометрическими
показателями. Побеги достигали 3 см и более, каждое микрорастение имело 3 -
5 междоузлий и хорошо развитую листовую систему. Корни растений в культуре
in vitro были светлыми, каллус у основания отсутствовал, количество
120
придаточных корешков на 1 растение составляло 3 – 5 штук. Данные
характеристики микрорастений позволили провести их пересадку для
адаптации.
Таким образом, впервые начаты исследования по введению в культуру
in vitro местных азербайджанских сортов винограда [79, с.154-158; 172, с.102].
Для сортов Мадраса и Баян Ширей показана высокая результативность
инициации культуры in vitro. Для сорта Мадраса максимальной
жизнеспособностью характеризовалась боковая почка (70,0%),
результативность использования меристемы и верхушечной почки
незначительно ниже (66,7%). Для сорта Баян Ширей максимальное количество
регенерировавших эксплантатов отмечено у боковой почки (100.0%), при
использовании меристем и верхушечной почки – 66.7% [79, с.154-158; 172,
с.102]. Показано существенное влияние питательной среды на развитие
растений-регенерантов (высокие концентрации цитокинина 6-БА вызывают
формирование каллуса у основания побегов микрочеренков) и необходимость
дальнейшего подбора биологически активных веществ для получения высоких
коэффициентов размножения сортов Мадраса и Баян Ширей в культуре in vitro.
Исследования по изучению особенностей ризогенеза винограда местных,
адаптированных к условиям Азербайджана сортов Мадраса и Баян Ширей,
показывают, что основными факторами, влияющими на интенсивность и
качество укоренения, являются концентрация и вид ауксина в питательной
среде. Так, оптимальной средой для укоренения in vitro обоих сортов винограда
оказалась среда MS с содержанием 1,0 мг/л ИМК, за исключением численности
корней, максимальное количество которых, было получено на среде MS с
содержанием 2,0 мг/л ИМК.

V ГЛАВА. МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ РАЗВИТИЕ РАСТЕНИЙ-

РЕГЕНЕРАНТОВ НА ЭТАПЕ АДАПТАЦИИ

121
 Перенос растений из условий in vitro в условия ex vitro - заключительная
и наиболее стрессовая стадия для пробирочных растений, определяющая успех
всей работы. На этом этапе часто погибает до 80 % посадочного материала,
поскольку растения in vitro должны адаптироваться к нестерильным условиям
ex vitro, существенно отличающимся от условий культивирования в пробирке
(повышенная влажность, дефицит углекислого газа). Кроме того, в
нестерильных условиях транспирация микрорастений должна быть
контролируемой.
Корни, образованные в культуре in vitro, анатомически отличаются от
корней ex vitro. Они содержат меньшее количество крахмальных зерен, низкое
содержание лигнина. Поверхность корней, образовавшихся в культуре in vitro,
и их апексы густо покрыты волосками. На этой стадии вероятно образование
многочисленных каллусных клеток. В процессе адаптации in vitro корни теряют
волоски, останавливаются в росте. Такие корни способны поглощать
питательные вещества из почвы, быстро расти, и из них ex vitro развиваются
новые корни. Новые корни имеют широкую зону всасывания, большое
количество волосков, а каллусные клетки между волосками отсутствуют,
однако, эти корни не могут обеспечить растение всей необходимой водой, но в
период адаптации для преодоления этого создается повышенная влажность.
Для листьев, образованных в культуре in vitro характерно слабое развитие
кутикулы, эпикутикулярного воска. Плохо развиты проводящие сосуды
ксилемы, отсутствуют транспирационные потоки, обеспечивающие растения
водой. Устьичный аппарат не функционирует в условиях in vitro. Это все
является специфической реакцией организма растения на условия избыточной
влажности в культуральном сосуде. После пересадки в грунт в связи с
уменьшением атмосферной влажности в растении налаживаются системы
поддержания тургора и функционирования устьиц. В связи с изменением
условий водообмена, наращиванием листовой массы возникает необходимость
эффективной доставки и рационального расхода влаги. В связи с этим
наблюдается изменение параметров проводящих элементов: увеличение их
122
количества, линейной длины члеников, уменьшение диаметра просвета
сосудов. Таким образом, выживаемость в первую очередь зависит от
способности растения выдерживать низкую влажность. Поскольку листовые
пластинки пробирочных растений лишены эпикутикулярного слоя воска, то
они подвержены очень быстрому обезвоживанию при пересадке их из условий
in vitro в условия ex vitro, что приводит к гибели адаптируемых растений.
В пробирочных условиях фотосинтетическая активность ограничена,
питание носит фотомиксотрофный характер (за счет сахарозы питательной
среды). В процессе адаптации к условиям ex vitro происходят изменения в
фотосинтетической активности листа, в частности в содержании хлорофиллов,
увеличение содержания которых, в листьях микрорастений улучшает их
приживаемость в процессе адаптации.
В связи с морфофизиологическими особенностями регенерантов после
культуры in vitro для успешной адаптации в нестерильных условиях
рекомендуют ряд дополнительных мероприятий, способствующих улучшению
процесса адаптации растений и повышению их приживаемости в нестерильных
условиях [24, с.201-205; 38, 204с.; 61, 13с.; 93, с.58-64; 135, с.161-166]: при
подготовке растений к переносу в почву освещенность повышать до 10000 Лк;
на последних стадиях перед высадкой растения помещать на среду без
регуляторов роста сроком на 3 недели; создавать при адаптации условия
повышенной влажности, с последующим приоткрыванием пленки над
адаптируемыми регенерантами; открывать пробирки на несколько дней,
обрабатывать растения фунгицидами (0,2% р-р бенлата), создавать растениям
искусственный период покоя в течение 40–60 дней перед высадкой в
нестерильные условия, выдерживая их в холодильной камере при температуре
+5…+6ºС. После вынужденного покоя растения, перенесенные в почву в
культуральные камеры, начинают интенсивный рост, активнее перестраивая
систему транспирации, становясь менее зависимыми от патогенной
микрофлоры.

123
 Существует целый ряд внешних факторов, оказывающих влияние на
адаптационный процесс растений:
- Гормональный состав сред для пролиферации микрорастений. По
наблюдениям О.В. Матушкиной, И.Н. Прониной и др. регенеранты подвоев
яблони, полученные на среде с кинетином имели хорошо развитые листовые
пластинки, лучше адаптировались и имели высокую выживаемость, чем
растения, полученные со среды с 6-БА, а для подвоев груши, лучше
применение 6-БА [59, с.77-81; 67, с.27-29]. Использование в средах для
микроразмножения дополнительных соединений (салициловой кислоты,
триаконтинола, эмистима) способствовали лучшей адаптации растений к
условиям ex vitro в связи с влиянием их на синтез растительных пигментов
(хлорофилла и каротиноидов).
- Среда для ризогенеза. Растения, укорененные на жидкой среде, лучше
приживались, чем на среде, содержащей агар, у них образовывалось больше
добавочных корней и корневых волосков. При пересадке в почвенный субстрат
такие корни не повреждались, как у растений, выращенных на агаризированной
среде, при отмывании корней от агара [34, с.73-85]. Пониженное содержание
нитратов в средах способствовало увеличению площади листьев при адаптации
[31, 272с.]. Применение регуляторов роста-адаптагенов в среде для ризогенеза –
0,01 мг/л эпибрассинолида, 0,01 и 0,05 мг/л янтарной кислоты – способствовало
повышению приживаемости растений вишни при переносе в нестерильные
условия [55, 25с.].
Существуют различные мнения о влиянии степени развития корней на
адаптацию. В одних исследованиях [128, с.480] приживаемость повышалась,
когда адаптировались растения, корневая система которых состояла из 3–4
корней длиной 4–7 см с боковыми ответвлениями, другие авторы [12, с.23-34]
отмечали, что корни длиннее 1–2 см при пересадке в горшки повреждаются.
Однозначного ответа на вопрос об оптимальном сроке адаптации ex vitro
для подвоев косточковых культур нет. Одни исследователи [130, с.629-631]
рекомендуют проводить эту работу весной (в конце февраля, а лучше в марте –
124
начале апреля), когда отмечали рост надземной части и удовлетворительная
адаптация пробирочных растений к новым экологическим условиям. Другие
[127, с.409-412] рекомендуют весенне–летний период (март-июнь), когда время
адаптации сокращалось до 4–5 недель (в осенне–зимний период древесные
растения проходили адаптацию за более длительный срок – 6–7 недель). В
работах под руководством Е.Н. Джигадло [35, 50с.] установлено, что
оптимальным сроком для адаптации вишни являлся зимний период. Попытки
адаптировать растения в летне-осенний период удовлетворительных
результатов не дали.
Часто используемые субстраты для перенесения растений в условия ex
vitro представляют собой стерильные смеси низового торфа и речного песка
или перлита в соотношении 3:1 или 1:1 , а также субстраты, не подвергавшиеся
термической или химической стерилизации:
1) Торфяной субстрат – смесь торфа и перлита в соотношении 5:1. По
данным производителя торфяной питательный грунт представляет собой
верховой торф, насыщенный следующими элементами: азот (N) – 170-270,
фосфор (Р2О5) – 110-190, калий (К2О) – 200-340 мг/100 г. Значение pH водной
вытяжки из торфяного субстрата – 5,5-6,5 (рН 5,5-6,5).
2) Агроперлит – продукт измельчения и термической обработки горной
породы вулканического происхождения. Перлит хорошо удерживает кислород
и имеет хорошее продольно-капиллярное распределение влаги, но имеет
низкую поглотительную способность, поэтому при разведении растений
на перлите или субстрате, в котором, он доминирует, субстрату необходимо
частое увлажнение.
3) Кокосовый субстрат - получают из высушенной кокосовой
кожуры. Кокосовый субстрат является отличной средой для выращивания
растений in vitro.  Отсутствие высокой термообработки и жестких химических
промывок обеспечивает субстрат популяцией полезных микроорганизмов.
Кокосовый субстрат содержит триходерму, природный агент ускоряющий рост
растений. Также он имеет высокое содержание лигнина / целлюлозы, что
125
является идеальной средой для жизнедеятельности полезных микроорганизмов.
Кокосовый субстрат обладает высокой влаго- и воздухоёмкостью, очень легкий
по сравнению с обычной почвой, поэтому идеально подходит для адаптации
растений-регенерантов in vitro.
В наших исследованиях адаптация растений-регенерантов к условиям ex-
vitro проходила в четыре этапа:
- адаптация в лабораторных условиях;
- адаптация в условиях теплицы;
- адаптация под теневой сеткой;
- адаптация в условиях открытого грунта.
Первичная адаптация растений производилась в условиях культуральной
комнаты при освещенности 2,5 – 3 тыс. люкс, температуре +21...+25 оС и
фотопериоде 16/8 часов. Растения высаживались в минитеплички с интервалом
не менее 3 см или в пластиковые кассеты с ячейками (рисунок 5.1). В качестве
субстрата в процессе первичной адаптации использовался кокопит (кокосовый
субстрат).
Кассеты с растениями накрывали полиэтиленовой пленкой или
пластиковой крышкой, создавая условия повышенной влажности до тех пор,
пока они не начинали трогаться в рост. Через неделю пленку приоткрывали,
постепенно понижая влажность и приучая растения к условиям культуральной
комнаты. Полив производили дистиллированной водой.
Оценивая влияние субстрата на развитие растений, были проведены
биометрические измерения следующих морфологических показателей
растений: 1) количество адаптированных растений-регенерантов (%); 2) длина
стебля (см); 3) длина корней (см).
Опыты проводились в 3-кратной повторности.

126
 Рисунок 5.1. Сорт винограда Баян Ширей на этапе адаптации ex vitro
(слева - сразу после посадки, справа - через 2 недели после посадки)

В результате исследований, была проведена оценка адаптации клоновых

подвоев плодовых культур и сортов винограда ex vitro (таблица 5.1).
Исходя из данных в таблице 5.1 самый высокий процент адаптированных
растений показал подвой Garnem 15 (86,4%). Подвой GF 677 отличился
хорошим формированием стебля 3,8 см и самыми длинными корнями 3,54 см.

Рисунок 5.2. Растение-регенерант (Garnem 15) после первичной адаптации

Таблица 5.1
127
 Морфологические показатели развития подвоев на этапе адаптации
Сорт Показатель Субстрат для адаптации
Кокопит

Доля адаптированных растений, % 85,00,21

МахМа14 Средняя длина стебля, см 3,50,39
Длина корневой системы, см 2,540,05
Доля адаптированных растений, % 78,30,75
Myrobalan 29C Средняя длина стебля, см 2,90,65
Длина корневой системы, см 2,060,08

Доля адаптированных растений, % 72,50,28

GF 677 Средняя длина стебля, см 3,80,31
Длина корневой системы, см 3,540,13
Доля адаптированных растений, % 86,40,23
Garnem 15 Средняя длина стебля, см 2,80,43
Длина корневой системы, см 3,10,09

Доля адаптированных растений, % 750,26

OHF 87 Средняя длина стебля, см 2,60,31
Длина корневой системы, см 2,680,11
Доля адаптированных растений, % 550,22

Mадраса Средняя длина стебля, см 2,20,36

Длина корневой системы, см 2,70,09

Доля адаптированных растений, % 630,45

Баян Ширей Средняя длина стебля, см 2.40,21

Длина корневой системы, см 3,40,13

В целом кокосовый субстрат оказал положительное влияние на

морфологическое развитие растений-регенерантов. Субстрат способствовал
интенсификации ростовых процессов надземной и корневой части растений.
Также отмечена хорошая активность корневой системы на субстрате:
образование большого количества боковых и придаточных корешков и

128
удлинение корневой системы, что в свою очередь способствовало хорошему
развитию надземной части растения (рисунок 5.2).
Данная тенденция отмечалась и через 45 дней адаптации, когда
прижившиеся растения переносили в теплицу (2-ой этап адаптации) и
пересаживали в горшочки в нестерильный торфяной субстрат (смесь торфа и
агроперлита в соотношении 5:1).
В условиях теплицы (рисунок 5.3) растения-регенеранты содержали при
температуре +20...+23°С, периодически поливали и подкармливали
удобрениями. При достижении растениями роста 30-35 см, хорошего развития
стеблей и листового аппарата их выносили под теневую сетку.
Вынос растений-регенерантов из теплицы под теневую сетку (3-й этап
адаптации) производили не ранее конца апреля - начала мая. Адаптация под
теневой сеткой - это промежуточная адаптация между адаптацией в условиях
закрытого (теплица) и открытого грунта (поле). Она необходима для того,
чтобы некоторое время защитить растения от прямых лучей солнца и адаптация
к условиям окружающей среды прошла без потерь. Процесс адаптации
растений под теневой сеткой занимает минимум 10 дней (рисунок, приложение
2).
Далее растения высаживали на первое поле питомника, заложенного по
разработанной нами технологии двустрочного выращивания подвоев, подробно
описанной в главе VI.

129
 Рисунок 5.3. Второй этап адаптации растений-регенерантов подвоев в
условиях защищенного грунта (теплица)

VI ГЛАВА. АГРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПОДВОЕВ,

ВЫРАЩЕННЫХ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO, ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В

ОТКРЫТОМ ГРУНТЕ

Объектами исследования являются адаптированные растения клоновых

подвоев плодовых косточковых культур, полученные методом культуры in vitro
и адаптированные в нестерильных условиях с закрытой корневой системой: GF
677, Garnem 15, MaxMa 14 и Myrobalan 29С.

130
 Работа выполнена на первом поле опытного питомника на территории
Научно-Исследовательского Института Плодоводства и Чаеводства
Министерства Сельского Хозяйства Азербайджанской Республики. Территория
института находится в низменной части Губа-Хачмазской экономической зоны
Азербайджанской Республики. Исследования проводились в 2018-2019 гг. Для
решения поставленной задачи использовали полевой метод исследования.
Губа-Хачмазская зона расположена на северо-востоке республики. С
востока она омывается водами Каспийского моря, а с запада и юго-запада
окружена горной цепью Большого Кавказа. Высота опытного участка над
уровнем моря 350 м. Почвенный покров представлен лугово-лесными и
коричневыми почвами. Почва имеет аллювиальную и пролювиальную
структуру. Грунтовые воды протекают на глубине 5 м. Климат полувлажный,
умеренно-теплый. Подробная информация о среднегодовой температуре и
количестве выпавших осадков за годы исследования предоставлена в главе II.
Первое поле для окулировки площадью 0,13 га заложено по современной
технологии двустрочного выращивания подвоев на мульчирующей пленке [51,
с. 32-34]. Ранее эта технология применялась для выращивания ягодных культур,
особенно земляники. Мы модифицировали эту технологию и применили для
закладки питомника. По нашим наблюдениям, мульчирование и двустрочное
деление гряды показывает высокую экономическую эффективность и
представляет большую перспективу для производства.
Положительные качества мульчирования почвы давно доказаны
практикой: оно обеспечивает сохранение влаги в почве, экономию воды,
удобрений и гербицидов, защищает почву от пересыхания, морозов и т.д.
В своих опытах придерживались следующей технологии двустрочного
выращивания подвоев [51, с. 32-34]:
Учитывая результаты агрохимического анализа почвы опытного участка,
предоставленные в таблице 2.3.3.1 (глава 2), почву заранее (в конце марта)
удобрили органическим удобрением в виде гранулированного птичьего помета
из расчета 300 грамм на 1 м2 участка, а также хлоридом калия (40%) из расчета
131
20 грамм на 1 м2 участка. Далее провели вспашку почвы фрезой, после чего
тщательно выровняли ее поверхность. Участок разбили на 64 гряды. Каждая
гряда полностью накрывалась черной светонепроницаемой пленкой и
закреплялась с боков. Затем специальным аппаратом на пленке в два ряда
прожигали отверстия диаметром 7 см. Высадка растений-регенерантов в эти
отверстия производилась вручную. На каждую гряду в два ряда было высажено
220 растений-регенерантов. Опытное поле было оснащено системой капельного
орошения (рисунок 6.1).

Рисунок 6.1. Опытный участок (вид сверху)

Полученный в культуре in vitro и адаптированный в условиях
защищенного грунта посадочный материал подвоев косточковых культур с
закрытой корневой системой был высажен в первое поле питомника в апреле
2018-го года (рисунок 6.2). Растения успешно прошли адаптацию в открытом
грунте, где процент адаптированных подвоев на 3-й месяц после посадки
составил 95%.

132
 Рисунок 6.2. Посадка растений-регенерантов на опытном участке
(апрель 2018)
Важнейшими техническими показателями для подвоев,
обеспечивающими высокий процент приживаемости окулянтов, являются
высота растения и диаметр ствола на высоте 15 см в зоне будущей прививки,
наличие боковых побегов.
В результате изучения динамики роста и развития подвоев в первом поле
питомника было установлено, что растения начинают ветвиться уже в мае,
образование новых побегов и их активный рост завершается к началу сентября
(таблица 6.1).
Таблица 6.1
Средние показатели роста подвоев GF 677, MaxMa 14, Myrobalan 29С
и Garnem 15 (июль-август, 2018 г)
Высота растений, Число боковых Диаметр ствола,
Вариант
см побегов, шт мм
GF 677 87 4 7,5
MaxMa 14 78 - 8,0
Myrabolan 29C 78 7 8,3
Garnem 15 67,3 - 8,1
Растения подвоя GF 677 к середине периода вегетации по высоте
превышали требования стандарта (30-45 см), и в зависимости от вида и
качества посадочного материала данный показатель в опыте был от 80 до 120
см (таблица 6.1). Для растений подвоев MaxMa 14 и Myrobalan 29C этот
показатель составил 62-127 см и 60-110 см, соответственно.
Выращенные в культуре in vitro и в защищенном грунте растения,
предположительно, могут в первый год после посадки в открытый грунт

133
поражаться грибными патогенами. В наших исследованиях отмечено, что в
климатических условиях зоны подвой GF 677 подвержен поражению только
мучнистой росой. Учитывая это, было проведено опрыскивание препаратом с
действующим веществом пенконазол. Также для профилактики микоза и
хлороза у подвоев MaxMa 14 и Myrobalan 29C, растения были обработаны
препаратом с действующим веществом дифеноконазол. Других грибных и
бактериальных патогенов в первом поле питомника не отмечено.
Для детальной оценки особенностей роста подвоев, полученных in vitro и
их адаптивности к выращиванию в открытом грунте оценена динамика роста
клоновых подвоев MaxMa 14 и Myrobalan 29C (рисунок 6.3). Показан
равномерный рост подвоев в течение вегетационного периода, что возможно
определяется благоприятными условиями культивирования в открытом грунте,
регулярным поливом и фертигацией с использованием системы капельного
орошения и отсутствием аномалий у подвоев, полученных в культуре in vitro.
120

100 101
88 90
80 77
67
60 58
50
44
40 37
31
25
20 20

Рисунок 6.3. Динамика роста подвоев MaxMa14 и Myrobalan 29C

К моменту окулировки (август) диаметр штамба подвоев в месте
прививки составил в среднем для подвоя GF 677 - 8,03мм, Garnem 15 - 8,8 мм,
MaxMa 14 - 8,6 мм, Myrobalan 29C - 9,1 мм (рисунок 6.4). Приживаемость
окулировок составила 92%.

134
 9.2 9.1
9
8.8
8.8
8.6
8.6
8.4
8.2 8.03
8
7.8
7.6
7.4
CF677 MaxMa14 Myrobalan29C Garnem

Рисунок 6.4. Диаметр клоновых подвоев к моменту окулировки

Завершающим этапом работ по получению здорового посадочного

материала является выращивание саженцев. В наших исследованиях на
выращенные в культуре in vitro и адаптированные в открытом грунте клоновые
подвои косточковых плодовых культур были привиты различные сорта
миндаля, персика, черешни и сливы (таблица 6.2).
Целью данного этапа исследований явилась оценка совместимости
привойно-подвойных комбинаций, показателей роста саженцев на подвоях,
полученных по новой для республики технологии.
В результате полевых исследований (рисунок, приложение 3)
установлено отсутствие визуальных симптомов несовместимости привоев и
подвоев и высокий процент приживаемости окулировок.
Наиболее высокорослыми оказались саженцы, выращенные на подвое GF
677, до 214,6 см. Далее в порядке убывания следуют саженцы на Garnem 15 (до
176,2 см), Myrobalan 29C (до 149,03 см), MaxMa 14 (до 148,5 см) (рисунок 6.5,
рисунок 6.6).
Таблица 6.2
Показатели роста саженцев на подвоях GF 677, Garnem 15, MaxMa 14
и Myrobalan 29С (сентябрь, 2019 г.)
Подвой Привой (сорт) 1-летний саженец (окулировка 2018 г.)
135
 диаметр штамба, мм (среднее) высота
стволика, см
под над
(среднее)
окулировкой окулировкой

Guara (миндаль) 20,6 16,8 199,3

CF 677 Ferraduel (миндаль) 13,1 11,9 214,6
Ferragnes (миндаль) 13,1 11,8 194,2
Guayox 35 (персик) 15,8 13,1 154,1
Garnem 15 Guayox 30 (персик) 16,1 13,2 162,2
Guara (миндаль) 13,6 12,2 176,2
Regina (черешня) 18,5 13,9 139,5
Ziraat 0900 (черешня) 19,6 15,32 148,5
MaxMa 14 Yellow Drogan
18,8 14,1 139,1
(черешня)
Black Diamond (слива) 18,0 13,6 149,03
Myrobalan 29C
Black Amber (слива) 17,4 14,0 124,2

Отмечается и влияние привитого сорта на высоту саженцев. Так,

максимальной высотой характеризуются саженцы сорта Ferraduel на подвое CF
677 - 214,6 см. Минимальная высота зарегестрирована у сорта Black Amber на
подвое Myrobalan29C - 124,2 см.
Важным показателем, характеризующим качество саженцев, является
толщина стволика подвоя в месте прививки и ее соотношение с толщиной
привитого компонента (рисунок, приложение 3). Минимальной разницей в
диаметре привоя и подвоя в месте прививки характеризовались следующие
сорто-подвойные комбинации: CF 677 + Ferraduel; CF 677 + Ferragnes; Garnem
15 + Guara. Максимальная разница в диаметре привоя и подвоя в месте
прививки отмечена у всех сортов на подвое MaxMa 14 и у сорта Black Diamond
на подвое Myrobalan 29C (рисунок 6.7).

136
 Рисунок 6.5. Саженцы черешни сорта Ziraat 0900 на подвое Maxma 14

250

214.6
199.3
200 194.2
176.2
162.2
154.1
148.5 149.03
150 139.5 139.1
124.2

100

50

Рисунок 6.6. Высота однолетних саженцев косточковых культур на

клоновых подвоях, выращенных in vitro

137
 5.00 4.70
4.60
4.40
4.50 4.28

4.00 3.80
3.40
3.50
2.90
3.00 2.70

2.50

2.00
1.40
1.50 1.30
1.20

1.00

0.50

0.00

Рисунок 6.7. Соотношение толщины стволика подвоя в месте прививки с

толщиной привитого компонента

Таким образом, одними из перспективных для условий Азербайджана

культур являются косточковые плодовые, недостаточное количество которых, в
первую очередь, определяется отсутствием высококачественного посадочного
материала. Впервые для условий Азербайджана разработана технология
размножения в культуре in vitro клоновых подвоев косточковых культур и
определены основные параметры адаптации полученных in vitro растений в
условиях теплиц, защитных сеток и открытого грунта. Получены новые данные
о сезонном росте и развитие клоновых подвоев, размноженных в культуре in
vitro, и саженцев косточковых плодовых культур, выращенных с
использованием биотехнологий, при применении двустрочной системы
выращивания на мульчирующей пленке в открытом грунте.
Двустрочная система выращивания на мульчирующей пленке
обеспечивает хорошую адаптацию в открытом грунте клоновых подвоев
косточковых культур, выращенных in vitro. Количество адаптированных в
открытом грунте подвоев через 3 месяца после посадки составило 95%.

138
 В результате изучения динамики роста и развития подвоев в первом поле
питомника было установлено, что растения начинают ветвиться уже в мае,
образование новых побегов и их активный рост завершается к началу сентября.
Растения подвоя GF 677 к середине периода вегетации по высоте превышали
требования стандарта (30-45см), и в зависимости от вида и качества
посадочного материала данный показатель составил от 80 до 120 см. Для
растений подвоев MaxMa 14 и Myrobalan 29C этот показатель составил 62-127
см и 60-110 см, соответственно.
В климатических условиях зоны исследований подвои косточковых
плодовых культур подвержены поражению мучнистой росой и требуют
проведения защитных мероприятий.
Показан равномерный рост подвоев в течение вегетационного периода,
что возможно определяется благоприятными условиями культивирования в
открытом грунте, регулярным поливом и фертигацией с использованием
системы капельного орошения и отсутствием аномалий у подвоев, полученных
в культуре in vitro. К моменту окулировки все подвои достигли необходимых
размеров, диаметр штамба в месте прививки составил в среднем для подвоя GF
677- 8,03 мм, Garnem 15- 8,8 мм, MaxMa 14 – 8,6 мм, Myrobalan 29C – 9,1 мм.
Было установлено отсутствие визуальных симптомов несовместимости
привоев и подвоев и высокий процент приживаемости окулировок (92%).
Наиболее высокорослыми оказались саженцы, выращенные на подвое GF
677, до 214,6 см. Далее в порядке убывания следуют саженцы на Garnem 15 (до
176,2 см), Myrobalan 29C (до 149,03 см), MaxMa 14 (до 148,5 см). Важным
показателем, характеризующим качество саженцев, является толщина стволика
подвоя в месте прививки и ее соотношение с толщиной привитого компонента.
Минимальной разницей в диаметре привоя и подвоя в месте прививки
характеризовались следующие сорто-подвойные комбинации: CF
677+Ferraduel; CF 677+Ferragnes; Garnem 15+Guara. Максимальная разница в
диаметре привоя и подвоя в месте прививки отмечена у всех сортов на подвое
MaxMa 14 и у сорта Black Diamond на подвое Myrobalan 29C.
139
 VII ГЛАВА. ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ
РАЗРАБОТАННОЙ ТЕХНОЛОГИИ МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ПОДВОЕВ
ПЛОДОВЫХ КУЛЬТУР MAXMA 14, GF 677, MYROBALAN 29C,
GARNEM 15 И OHF 87

На основании проведенных исследований впервые для условий

Азербайджана разработана технология производства здорового посадочного
материала клоновых подвоев in vitro в условиях (приложение 5).
В технологии определены: схема производства оздоровленного
посадочного материала клоновых подвоев; оборудование лаборатории и
организация работ; отбор и визуальная оценка растений по симптомам
заражения заболеваниями; ускоренное размножение (введение в культуру in
vitro, питательные среды, микроразмножение, укоренение микропобегов,
адаптация пробирочных растений в нестерильных условиях). Разработанная
технология производства оздоровленного посадочного материала клоновых
подвоев не имеет аналогов в Республике Азербайджан.
Основные положения технологии размножения в культуре in vitro
клоновых подвоев косточковых плодовых культур и груши представлены в
главе 3 и обобщены в пошаговую технологию, которую можно использовать
для промышленного производства подвойного материала в биотехнологических
лабораториях (приложение 5).
Использование технологии экологически безопасно и позволяет
круглогодично получать оздоровленный посадочный материал клоновых
подвоев, отличающийся высоким качеством. Кроме того, разработанная
технология позволяет, при оснащении диагностическим оборудованием для
тестирования вирусных патогенов, начать переход на производство
сертифицированного, оздоровленного посадочного материала плодовых
культур класса А (супер-супер элита, супер-элита).
Вместе с тем была проведена экономическая оценка применения
разработанной технологии, а именно модифицированных нами питательных
140
сред, взяв за основание результаты исследования по укоренению подвоев
плодовых культур в условиях in vitro (глава 3, таблица 3.3.2). Был осуществлен
сравнительный анализ двух питательных сред для укоренения:
- контрольный вариант;
- вариант, показавший наивысшие показатели укоренения микрочеренков
подвоев плодовых культур.
Такая оценка может быть верной гарантией безошибочного выбора для
производства наиболее эффективных и экономически выгодных технологий
микроразмножения плодовых культур в условиях in vitro.
Для оценки экономической эффективности разработанной технологии
использовались следующие показатели: количество микрочеренков на
укоренении (шт), количество укорененных микрочеренков (шт), общие
производственные затраты (манат), стоимость реализованной продукции
(шт/манат), общий доход от продажи продукции (манат), себестоимость одного
растения (манат), чистая прибыль (манат), уровень рентабельности (%)
(таблица 7.1).
Уровень рентабельности хозяйственной (производственной) деятельности
определен по следующей формуле:

А
Р = *100%
В

А - чистая прибыль;
В - производственные затраты.
Полученные данные (таблица 7.1) дают основание сделать вывод, что
чем эффективнее состав питательной среды, тем ниже себестоимость растения,
выше рентабельность производства и, соответственно, прибыль. Это
происходит за счет высокого процента укореняемости микрочеренков на
модифицированной питательной среде. Так, для подвоя MaxMa 14 на
контрольной среде из 50 микрочеренков укоренилось всего 16 шт, при этом
себестоимость 1 растения составила 0,79 маната, рентабельность производства
141
26%, а чистая прибыль 3,30 манатов (при рыночной цене 1,0 манат), тогда как
на среде DKW с добавлением 1,0 мг/л ИМК и 0,01 НУК мг/л из 50
микрочеренков укоренилось 41 штук микрочеренков, рентабельность
производства составила 137,1%, а чистая прибыль на 20,4 маната выше, по
сравнению с контрольным вариантом и составила 23,71 манатов.
Таблица 7.1
Экономическая эффективность применения модифицированных
питательных сред

Уровень рентабельности, %
Чистая прибыль, манат
Название Варианты исследования

продукции, манатОбщий доход от продажи

штКоличество микрочеренков,

затраты, манатОбщие производственные

продукции, шт/манатСтоимость реализованной

микрорастений, штКоличество укорененных

манатСебестоимость растения,
подвоя

MaxMa14 MS + 0,1 мг/л БАП + 0,5 50 16 12,70 1,0 16,0 0,79 3,30 26,0
мг/л ИМК + 1,0 мг/л В1 +
0,5 мг/л В6 + 0,5 мг/л РР
+ 2 мг/л глицин +100мг/л
мезоинозит (контроль)
DKW + 1,0 ИМК мг/л + 50 41 17,29 1,0 41,0 0,42 23,71 137,1
0,01 НУК мг/л + 2мг/л В1
+ 1 мг/л РР + 2 мг/л
глицин + 100 мг/л
мезоинозит
GF 677 MS + 0,1 мг/л БАП + 0,5 50 0 9,50 0 0 0 0 0
мг/л ИМК + 1,0 мг/л В1 +
0,5 мг/л В6 + 0,5 мг/л РР
+ 2 мг/л глицин +100
мг/л мезоинозит
(контроль)
MS + 1,0 мг/л ИМК + 0,1 50 40 17,10 1,0 40,0 0,43 22,90 133,9
мг/л НУК + 2 мг/л В1 +
1мг/л РР + 2 мг/л глицин
+ 100 мг/л мезоинозит
Garnem15 MS + 0,1 мг/л БАП + 0,5 50 20 13,30 1,0 20,0 0,66 6,70 50,4
мг/л ИМК + 1мг/л В1 +
0,5 мг/л В6 + 0,5 мг/л РР
+ 2 мг/л глицин +100
мг/л мезоинозит
(контроль)
142
 продолжение таблицы 7.1
MS + 1мг/л ИМК + 0,1 50 44 17,86 1,0 44,0 0,41 26,14 146,4
мг/л НУК + 2 мг/л В1 + 1
мг/л РР + 2 мг/л глицин
+ 100 мг/л мезоинозит
Myroba- MS + 0,1 мг/л БАП + 0,5 50 18 12,92 1,0 18,0 0,72 5,08 39,3
lan 29C мг/л ИМК + 1мг/л В1 +
0,5 мг/л В6 + 0,5 мг/л РР
+ 2 мг/л глицин +100
мг/л мезоинозит
(контроль)
MS + 1 мг/л ИМК + 0,1 50 40 17,10 1,0 40,0 0,43 22,90 133,9
мг/л НУК + 2 мг/л В1 +
1мг/л РР + 2 мг/л глицин
+ 100 мг/л мезоинозит
OHF 87 MS + 0,1 мг/л БАП + 0,5 50 0 9,50 0 0 0 0 0
мг/л ИМК + 1мг/л В1 +
0,5 мг/л В6 + 0,5 мг/л РР
+ 2 мг/л глицин +100
мг/л мезоинозит
(контроль)
MS + 1мг/л ИМК + 0,1 50 40 17,10 1,0 40,0 0,43 22,90 133,9
мг/л НУК + 2мг/л В1 +
1мг/л РР + 2 мг/л глицин
+ 100 мг/л мезоинозит

Количество укорененных на контрольной среде микрочеренков подвоя

Garnem 15 составило 20 шт, где себестоимость одного растения 0,66 манатов,
доход от продажи 6,70 манатов, уровень рентабельности производства 50,4%. В
то время как, на модифицированной среде МS с добавлением 1,0 мг/л ИМК и
0,1 мг/л НУК число укоренившихся микрорастений 44 шт. Cебестоимость
одного растения составила 0,44 маната, что ниже по сравнению с контрольным
вариантом на 0,22 маната, чистая прибыль от продажи полученных растений-
регенерантов 26,14 манатов, что выше на 19,44 маната, чем в контрольном
варианте, рентабельность производства составила 146,4 %, что выше по
сравнению с контрольным вариантом на 96%.
Для подвоя Myrobalan 29C на контрольной среде из 50 микрочеренков
укоренилось всего 18 шт, при этом себестоимость одного растения составила
0,72 маната, уровень рентабельности производства 39,3%, а чистая прибыль
5,08 манатов, тогда как на среде МS с добавлением 1,0 мг/л ИМК и 0,1 мг/л
НУК из 50 микрочеренков укоренилось 40 штук, рентабельность производства
143
составила 133,9%, а чистая прибыль на 17,82 маната выше, по сравнению с
контрольным вариантом и составила 22,90 манатов.
Для подвоев GF 677 и OHF 87 на контрольной среде процент
укореняемости микрочеренков составил 0%, явные потери составили 9,50
манатов. На среде МS с добавлением 1,0 мг/л ИМК и 0,1 мг/л НУК процент
укореняемости микрочеренков данных подвоев составил 40% (40 шт),
себестоимость 1-го растения 0,43 маната, рентабельность производства 133,9%,
а чистая прибыль 22,90 манатов.
Как видно из результатов анализа, полученные впоследствие
модифицикации питательные среды оказались не только вегетативно
продуктивными, но и экономически эффективными.

144
 ВЫВОДЫ

1. Установлены основные показатели, определяющие высокую

эффективность инициации культуры in vitro, микроразмножения и ризогенеза
клоновых подвоев плодовых культур. Выделены оптимальные питательные
среды для микроразмножения в условиях in vitro клоновых подвоев,
обеспечивающие высокую результативность инициации (85,2- 95%); высокие
показатели коэффициента размножения (5,82-6,27) и процента укоренения (80 –
88 %).
2. Впервые введены в культуру in vitro сорта винограда народной
селекции Мадраса и Баян шире, показана высокая результативность инициации
(66,7 – 100,0 %) и ризогенеза (82 – 84%).
3. Впервые для условий Азербайджана разработана технология
размножения в культуре in vitro клоновых подвоев косточковых плодовых
культур и груши позволяющая круглогодично получать оздоровленный
посадочный материал, отличающийся высоким качеством.
4. Двустрочная система выращивания на мульчирующей пленке
обеспечивает хорошую адаптацию в открытом грунте клоновых подвоев
косточковых культур, выращенных in vitro (95 %).
5. В результате полевых исследований установлено отсутствие аномалий
у подвоев, полученных в культуре in vitro, визуальных симптомов
несовместимости привоев и in vitro подвоев и высокий процент приживаемости
окулировок (92%); получены стандартные саженцы 11 сорто-подвойных
комбинаций.

145
 РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Рекомендуется использовать разработанную технологию размножения в

культуре in vitro клоновых подвоев косточковых плодовых культур и груши в
современных питомниководческих хозяйствах, оснащенных
биотехнологическими лабораториями.
2. Рекомендуется использовать в питомниководческих хозяйствах страны
двустрочную систему выращивания подвоев косточковых культур на
мульчирующей пленке
3.  Рекомендуется использовать полученные данные в учебном процессе
высших учебных заведений сельскохозяйственного и биологического профиля.

146
 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Gilas bitkisi. İ.S. Qurbanov, E.M. Xankişiyeva, S.C. Süleymanova [və b.].
-Bakı: Elm və təhsil, - 2019. - 180 s.
2. Süleymanova, S.C., Balazadə, Ç.F. Bitkilərin mikroklonal çoxaldılmasının
əsas üsulları // - Gəncə: ADAU-nun elmi əsərləri, - 2019. №4, - s. 34-38.
3. Süleymanova, S.C., Əhmədli, N.M. Çəyirdəkli meyvə bitkiləri
calaqaltılarının mikroklonal çoxaldılması zamanı proliferasiyanın intensivliyinə
fitohormonların təsiri // - Bakı: Azərbaycan Aqrar Elmi, - 2018. №5, - s. 74-76.
4. Üzüm: innovativ becərmə texnologiyası, mühafizəsi və aqroekologiyası /
V.S.Səlimov, A.S.Şükürov, H.N.Nəsibov [və b.]. – Bakı: Müəllim, - 2018, - s. 560-
588.
5. Aka Kaçar, Y., Yılmaz, N., Yalçın Mendi, Y., Küden, A., Çetiner S. İn vitro
besi ortamında kullanılan değişik katılaştırıcı maddelerin ve farklı pH düzeylerinin
bazı kiraz anaçlarının çoğaltılması üzerine etkileri // I. Sert Çekirdekliler
Sempozyumu Bildirileri, - Yalova: - 25-28 Eylül, - 2001, - s. 161-166.
6. Arıcı, Ş.E., Bazı sert çekirdekli meyve anaçlarının doku kültürü ile
çoğaltılması // - İsparta: Süleyman Demirel Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, -
2008. 3(1), - s. 19-23.
7. Demiral, S., Ülger, S. Gisela-5 kiraz anacının doku kültürü ile çoğaltılması
üzerine bir araştırma // - Antalya: Akdeniz Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, -
2008. 21 (1), - s. 117- 121.
8. Еkbiç, H.B., Yılmaz, G.Ş., Ciğerli, S. Isabella (Vitis labrusca) üzüm
çeşidinin in vitro sürgün ucu kültürü ile çoğaltılması // - Ordu: Akademik Ziraat
Dergisi, - 2015. 4(2), - s. 65-70.
9. Güler, S., Eşitken, A. İn vitro şartlarda BBAR uygulamalarının GF-677 ile
MaxMa-14-ün köklenmesi üzerine etkisi // - Konya: Selcuk Journal of Agriculture
and Food Sciences, - 2017. 31 (3), - s. 10-16.

147
 10. Hepaksoy, S. GF677 (P.amygdalus X P.persica) klon anacının doku
kültüründe sürgünucu tekniği ile çoğaltılması // - İzmir: Ege Üniversitesi Ziraat
Fakültesi Dergisi, - 2017. 54(4), - s. 447-451.
11. Hepaksoy, S. MaxMa 14 kiraz anacının in vitro üretimi // - Anadolu:
Journal of Aegean Agricultural Research Institute, - 2004. 14 (2), - s. 67-80.
12. Hepaksoy, S., Tanrısever, A. Bazı kiraz anaçlarının mikroçoğaltımı
üzerinde araştırmalar. II. köklenme ve dış koşullara alıştırma // - İzmir: Ege
Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, - 2004. 41 (3), - s. 23-34.
13. Kalkışım, Ö. Kara dut (Morus nigra L.) bitkisinin in vitro çoğaltımı /
Ö.Kalkışım, A.Turan, F.N.Azeri [ve b.] // Gümüşhane Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü Dergisi, - Gümüşhane: - 2013. 3(2), - s. 77-84.
14. Kayhan, F., Kriyoprezervasyon yöntemlerinden vitrifikasyon tekniğinin
ekonomik olarak önemli üzüm çeşitlerinde uyğulanabilirliğinin araştırılması:
[Elektron resurs] / Pamukkale Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü. - Denizli, 2015. -
URL:http://acikerisim.pau.edu.tr/xmlui/bitstream/handle/11499/698/Fatma
%20Kayhan.pdf?sequence=1&isAllowed=y
15. Onay, A. Bitkilerin biyoteknolojik yöntemlerle ticari çoğaltımı: mevcut ve
gelecekteki durum / A.Onay, H.Yıldırım, V.Pirinç [ve b.] // Batman Üniversitesi
Yaşam Bilimleri Dergisi, - Batman: - 2012. 1(2), - s. 11-28.
16. Özbek, B., Bazı sert çekirdekli meyve anaçlarının in vitro çoğaltımı ve kök-
ur nematodlarına karşı dayanıklılıklarının araştırılması: [Elektron resurs] / Çukurova
Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü. - Adana, 2011. - URL: http://libratez.cu.edu.tr/
tezler/8567.pdf
17. Sevgin, N., Badem (Prunus dulcis (mill.) d.A weeb)’in in vitro
mikroçoğaltılması ve mikrosürgünlerin köklenmesini etkileyen bazı faktörlerin
araştırılması: [Elektron resurs] / Sütçü İmam Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü. -
Kahramanmaraş, 2010. - URL:
https://tez.yok.gov.tr/UlusalTezMerkezi/tezDetay.jsp ?
id=lpQV6PHCkKwgLjFuHNZ4Q&no=86NZfFMJxgw5FnelTAEzdg
18. Архангельская, Г.П., Способ стерилизации растительных
148
эксплантатов, Патент на изобретение RU 1790350, Российская Федерация /
Архангельская Г.П.: - 1990.
19. Бабаева, С.Х., Бободжанова, Х.И., Кухарчик, Н.В. Введение в
культуру in vitro сортов винограда таджикской селекции Зебо и Сангвор //
Материалы международной научной конференции «Биотехнология в
плодоводстве», - Самохваловичи, Минск: - 13-17 июня, - 2016, - с. 116-119.
20. Бабоша, А.В., Способ выращивания растений in vitro, Патент на
изобретение RU 2102870, Российская Федерация / Шнейдер А.Ю., Фирсукова
С.И.: - 1998.
21. Баргутин, А.Б., Феоктистов, Н.В., Пунина, Н.В. Определение видовой
принадлежности бактерий контаминирующих культуру древесных растений in
vitro // Тезисы IХ Международной конференции "Биология клеток растений in
vitro и биотехнология", - Звенигород: - 8-12 сентября, - 2008, - с. 60.
22. Бартиш, И.В. Микроклональное размножение груши (Pyrus communis
L.) in vitro / И.В. Бартиш, C.M. Меркулов, В.И. Корховой [и др.] // Физиология и
биохимия культурных растений, - Киев: - 1994. №1, - c. 84-90.
23. Батукаев, А.А., Шишхаева, М.Г., Батукаев, М.С. Оздоровление и
размножение винограда в культуре in vitro // Материалы международной
научно-практической конференции "Актуальные вопросы плодоводства и
декоративного садоводства в начале XXI века", - Сочи: - 22-26 сентября, - 2014,
- c. 241-246.
24. Батукаев, М.С. Совершенствование технологии адаптации растений
винограда in vitro в условиях in vivo // - Грозный: Вестник Чеченского
Государственного Университета, - 2010. № 1, - c. 201-205.
25. Беседина, Е.Н., Бунцевич, Л.Л., Стимуляторы роста нового поколения
и альтернативные структурообразователи питательных сред. Эффективность
адаптации микрорастений подвоев яблони ex vitro: [Электронный ресурс] /
Плодоводство и виноградарство Юга России. - Краснодар, 2015. - URL:
http://journal.kubansad.ru/pdf/15/05/17.pdf

149
 26. Беседина, Е.Н. Усовершенствование метода клонального
микроразмножения подвоев яблони in vitro: / диссертация на соискание ученой
степени кандидата с.-х. наук./ - Краснодар, 2015. – 142 с.
27. Бугаенко, Л.А., Иванова-Ханина, Л.В. Морфогенез винограда в
культуре in vitro // - Симферополь: Ученые записки Таврического
национального университета им. В.И.Вернадского, - 2011. №2, - с. 73-82.
28. Бунцевич, Л.Л., Костюк, М.А., Трошин, Л.П., Алзубайди, Х.К.И.,
Введение новых сортов винограда в культуру in vitro: [Электронный ресурс] /
Труды Кубанского ГАУ. – Краснодар, 2016. - URL:
https://cyberleninka.ru/article/n/vvedenie-novyh-sortov-vinograda-v-kulturu-in-vitro

29. Бунцевич, Л.Л., Способ клонального микроразмножения и

оздоровления подвоев яблони in vitro с использованием антибиотика
гризеофульвин, Патент на изобретение RU 2557387 С1, Российская Федерация /
Бунцевич Л.Л., Беседина Е.Н., Костюк М.А. [и др.]: - 2015.

30. Бутенко, Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и

биотехнологии на их основе / Р.Г. Бутенко. - Москва: ФБК-ПРЕСС, - 1999. - 160
с.
31. Бутенко, Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология
морфогенеза растений // Р.Г. Бутенко. - Москва: Наука, - 1964. - 272 с.
32. Верзилин, А.В., Иванов, Д.В. Трунов. Ю.В. Использование
биотехнологии для усовершенствования селекционного процесса клоновых
подвоев яблони с целью его ускорения // - Мичуринск: Сборник докладов и
сообщений XVIII Мичуринских чтений, - 1998. - с. 63-66.
33. Головин, С.Е. Основы обеспечения фитосанитарного качества
сертифицированного посадочного материала // Материалы международной
научно-практической конференции "Промышленное производство
оздоровленного посадочного материала плодовых, ягодных и цветочно-
декоративных культур", - Москва: ВСТИСП, - 20-22 ноября, - 2001, - с. 52-53.

150
 34. Деменко, В.И., Шестибратов, К.А., Лебедев, В.Г. Укоренение -
ключевой этап размножения растений in vitro // - Москва: Известия ТСХА, -
2010. №1, - с. 73-85.
35. Джигадло, Е.Н. Методические рекомендации по использованию
биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и
декоративными культурами / Е.Н. Джигадло. - Орёл: ГНУ ВНИИСПК, - 2005. -
50 с.
36. Долгих, С.Г., Нурдинова, А.Б. Оптимизация клонального
микроразмножения клоновых подвоев яблони // Материалы международной
научной конференции "Биотехнология в плодоводстве", - Самохваловичи,
Минск: - 13-17 июня, - 2016, - с. 44-46.
37. Дорошенко, Н.П., Жукова, Т.В. Препарат Мелафен в культуре
винограда in vitro // Материалы международной научно-практической
конференции "Научное наследие Я.И.Потапенко - основа современной науки о
винограде и вине", - Новочеркасск: - 15 августа, - 2014, - с. 170-174.
38. Дорошенко, Н.П. Особенности клонального микроразмножения
винограда / Н.П.Дорошенко. - Новочеркасск: ФГБНУ ВНИИВиВ им. Я.И.
Потапенко, -2014. - 204 с.
39. Дорошенко, Н.П., Ребров, А.Н. Влияние эмистима и калийного
лигногумата на регенерационную способность винограда in vitro // - Москва:
Виноделие и виноградарство, - 2009. №5, - с. 26-27.
40. Дорошенко, Н.П., Ребров, А.Н., Трошин, Л.П., Биотехнология
оздоровления и сохранения донских аборигенных сортов винограда:
[Электронный ресурс] / Научный журнал КубГАУ. – Краснодар, 2019. - URL:
https://cyberleninka.ru/article/n/biotehnologiya-ozdorovleniya-i-sohraneniya-
aborigennyh-donskih-sortov-vinograda/viewer
41. Дорошенко, Т.Н. Биоэкология и питомниководство плодовых культур:
учеб.-метод.пособие / Т.Н.Дорошенко, Л.Г.Рязанова, А.В.Рындин; - Краснодар:
Кубанский ГАУ, - 2015. – 62 с.

42. Дунаева, С.Е., Оследкин, Ю.С. Бактериальные микроорганизмы,

151
ассоциированные с тканями растений в культуре in vitro: идентификация и
возможная роль // - Москва: Сельскохозяйственная биология, - 2015. №1,
- с. 3-15.
43. Зеленянская, Н.Н., Джабурия, Л.В., Теслюк, Н.И. Эффективные
желирующие компоненты для размножения винограда in vitro // - Краснодар:
Плодоводство и виноградарство Юга России, - 2010. 5(4), - с. 53-57.
44. Калинин, Ф.Л. Технология микроклонального размножения растений /
Ф.Л. Калинин, Г.П. Кушнир, В.В. Сарнацкая, - Киев: Наукова Думка, - 1992. -
232 с.
45. Кильчевский, А.В., Хотылева, Л.В. Генетические основы селекции
растений: [в 4-х томах] / А.В.Кильчевский, Л.В.Хотылева. - Минск: Беларус.
навука, - т.3. - 2012. - 489 с.
46. Колбанова, Е.В. Влияние стерилизующих соединений и питательной
среды на жизнеспособность и развитие меристематических верхушек сортов
крыжовника в культуре in vitro // - Самохваловичи, Минск: Плодоводство, -
2009. №21, - с. 252-264.
47. Корнацкий, С.А. Особенности клонального микроразмножения сливы
в системе производства оздоровленного посадочного материала: автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата с.-х. наук./ - Москва, 1991.
- 24 с.
48. Костюк, М.А., Бунцевич, Л.Л., Оздоровление плодовых и ягодных
культур от вирусных инфекций меристемным методом in vitro: [Электронный
ресурс] / Плодоводство и виноградарство Юга России. - Краснодар, 2016. -
URL: http://journalkubansad.ru/pdf/16/04/07.pdf
49. Костюк, М.А., Бунцевич, Л.Л., Стерилизация эксплантатов в
технологии производства оздоровленного посадочного материала сливы
домашней: [Электронный ресурс] / Плодоводство и виноградарство Юга
России. - Краснодар, 2017. - URL: http://journalkubansad.ru/pdf/17/02/15.pdf

152
 50. Красинская, Т.А., Кухарчик, Н.В. Основные характеристики
субстратов, применяемых в сельском хозяйстве // - Самохваловичи, Минск:
Плодоводство, - 2011. № 23, - с. 402-419.
51. Курбанов, И.С., Сулейманова, С.Д., Гаджиев, А.А. Изучение роста и
развития подвоев косточковых культур полученных методом in vitro // - Баку:
Аграрная наука Азербайджана, - 2016. №5, - c. 32-34.
52. Лебедев, В.Г. Оптимизация этапов клонального микроразмножения
при массовом производстве растений / В.Г.Лебедев, А.Б.Азарова, А.А.Алпатова
[и др.] // Плодоводство и ягодоводство России, - Москва: - 2011. №26, - с. 307–
314.
53. Ломовская, Л.В. Методы оздоровления и размножения перспективных
форм груши in vitro // - Москва: Достижения науки и техники АПК, - 2004. №3,
- c. 13-15.
54. Лукичева, Л.А. Влияние состава питательной среды и генотипа на
клональное микроразмножение вишни и сливы in vitro // Материалы
международной научной конференции "Биотехнология в плодоводстве", -
Самохваловичи, Минск: -13-17 июня, - 2016, - с. 57-62.
55. Майорова, Ю.А. Оптимизация этапов клонального микроразмножения
гибридов вишни на основе применения новых биологически активных веществ:
автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата
биологических наук./ - Краснодар, 2009. - 25 с.
56. Матушкина, О.В. Оптимизация процессов регенерации при
размножении клоновых подвоев и сортов яблони и груши in vitro: / диссертация
на соискание ученой степени кандидата с.-х. наук./ - Мичуринск, 2008. - 155 с.
57. Матушкина, О.В., Питательная среда для размножения яблони и
груши in vitro, Патент на изобретение RU 2486237, Российская Федерация /
Пронина И.Н.: - 2012.
58. Матушкина, О.В., Пронина, И.Н. Технология беспересадочного
культивирования яблони и груши in vitro // - Воронеж: Технологии пищевой и
перерабатывающей промышленности АПК - продукты здорового питания, -
153
2016. №5, - с.31-37.
59. Матушкина, О.В., Пронина, И.Н. Технология клонального
микроразмножения яблони и груши на основе использования новых
питательных сред // - Ялта: Сборник научных трудов ГНБС, - 2017. №144, - с.
77-81.
60. Матушкин, С.А. Влияние некоторых макроэлементов питательной
среды на пролиферацию смородины чёрной и крыжовника in vitro // Материалы
международной научно-методической конференции «Новые сорта садовых
культур: их достоинства и экономическая эффективность возделывания», -
Орел: - 10-28 февраля, - 2014, - с. 37-42.
61. Медведева, Н.И., Поливара, Н.В., Трошин, Л.П., Методические
рекомендации по микроклональному размножению винограда in vitro:
[Электронный ресурс] / Научный журнал КубГАУ. - Краснодар, 2010. - URL:
http://ej.kubagro.ru/2010/08/pdf/31.pdf
62. Минаев, В.А. Биологические особенности слаборослых клоновых
подвоев яблони при клональном микроразмножении: / диссертация на
соискание ученой степени кандидата с.-х. наук./ - Мичуринск, 2005. - 101 c.
63. Подорожный, В.Н., Майорова, Ю.А., Способ адаптации in vivo
плодовых и ягодных культур в двухслойном субстрате, Патент на изобретение
RU 2335119, Российская Федерация / Подорожный В.Н., Майорова Ю.А.: -
2008.
64. Плаксина, Т.В. Приемы адаптации растений-регенерантов к условиям
ex vitro // - Новоссибирск: Сибирский вестник с.-х. науки, - 2011. № 2, - с. 43-
48.
65. Пронина, И.Н. Влияние длительности воздействия ИМК на ризогенез
клоновых подвоев яблони in vitro // Материалы X международной конференции
"Биология клеток растений in vitro и биотехнология", - Казань: - 14-18 октября,
- 2013, - с. 141-142.

154
 66. Пронина, И.Н. Влияние этиоляции на ризогенную активность
микропобегов яблони и груши in vitro // - Москва: Плодоводство и
ягодоводство России, - 2011. № 26, - с. 76-81.
67. Пронина, И.Н., Матушкина, О.В., Исаев Р.Д. Клональное
микроразмножение в системе производства высококачественного посадочного
материала клоновых подвоев груши // - Москва: Достижения науки и техники
АПК, - 2014. №5, с. 27-29.
68. Пронина, И.Н. Оптимизация процесса ризогенеза подвоев и сортов
яблони и груши in vitro: / диссертация на соискание ученой степени кандидата
с.-х. наук./ - Мичуринск, 2008. -158 с.
69. Пугачёв, Р.М. Особенности размножения растений рода Prunus L. в
культуре in vitro: автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата с.-х. наук./ - Горки, 2003. - 18 с.
70. Размножение плодовых растений в культуре in vitro / Н.В.Кухарчик,
М.С.Кастрицкая, С.Э.Семенас [и др.]. - Минск: Беларусская навука, - 2016. -
208 с.
71. Ребров, А.Н., Дорошенко, Н.П., Трошин, Л.П., Алзубайди, Х.К.И.,
Введение в культуру in vitro новых перспективных столовых сортов винограда:
[Электронный ресурс] / Научный журнал КубГАУ. – Краснодар, 2016. - URL:
http://ej.kubagro.ru/2016/10/pdf/08.pdf
72. Решетников, В.Н., Спиридович, Е.В., Носов, А.М. Биотехнология
растений и перспективы ее развития // - Киев: Физиология растений и генетика,
- 2014. 46(1), - с. 3-18.
73. Ромаданова, Н.В. Введение в культуру in vitro и микроклональное
размножение перспективных сортов, клоновых подвоев и дикорастущих форм
яблони / Н.В.Ромаданова, С.А.Мишустина, Г.Н.Матакова [и др.] //
Исследования и результаты, - Алматы: - 2013. 3 (59), - с. 142-149.
74. Рундя, А.П., Гашенко, О.А., Шапорева, В.А., Гавриленко, Т.Н.
Использование ионообменных субстратов при адаптации растений винограда в
условиях ex vitro // Материалы международной научной конференции
155
"Биотехнология в плодоводстве", - Самохваловичи, Минск: - 13-17 июня, -
2016, - с. 128-131.
75. Самусь, В.А. Методика микроразмножения подвоев яблони in vitro /
В.А.Самусь, С.Э.Семенас, Н.В.Кухарчик [и др.] // Плодоводство, -
Самохваловичи, Минск: - 2006. 18 (2), - с. 146-155.
76. Сельскохозяйственная биотехнология / В.С. Шевелуха, Е.А.
Калашникова, С.В. Дегтярев [и др.]. - Москва: Высшая школа, - 1998. - 416 с.
77. Стандартная операционная процедура по стерилизации растительных
эксплантатов винограда при вводе в культуру in vitro сортов "Донской
ампелографической коллекции им. Я.И.Потапенко": [Электронный ресурс] /
Всероссийский НИИ виноградарства и виноделия имени Я.И.Потапенко. -
Новочеркасск, 2017. - URL: http://rusvine.ru/wp-content /uploads/ 2017/10/СОП-
11-1стерилизация.pdf
78. Сулейманова, С.Д. Биотехнология - основа получения безвирусного
посадочного материала винограда // Материалы международной научно-
практической конференции "Проблемы обеспечения продовольственной
безопасности независимого Азербайджанского государства и повышения
конкурентоспособности аграрной сферы", - Баку: - 1-2 июня, - 2018, - с. 761-
764.
79. Сулейманова, С.Д. Введение в культуру in vitro сортов винограда
народной селекции Мадраса и Баян Ширей // Материалы республиканской
научно-практической конференции "Академик Джалал Алиев и генетические
ресурсы биологического разнообразия", - Гянджа: - 30 июня, - 2018, - с. 154-
158.
80. Сулейманова, С.Д. Воздействие питательной среды Гамборга на
морфологическое развитие некоторых подвоев косточковых культур на этапе
укоренения in vitro // Материалы международной научно-практической
конференции "Экспериментальные и теоретические исследования в
современной науке", - Новосибирск: Сибак, - 20 апреля, - 2019, - с. 42-46.

156
 81. Сулейманова, С.Д. Клональное микроразмножение плодовых культур
в развитии // - Баку: Аграрная наука Азербайджана, - 2018. №3, - с. 182-188.
82. Сулейманова, С.Д. Методические указания по проведению
лабораторных работ при микроразмножении плодовых и ягодных культур in
vitro / С.Д.Сулейманова, Н.В.Кухарчик, - Баку: Муаллим, - 2020. - 42 с.
83. Сулейманова, С.Д. Микроклональное размножение плодовых культур
(обзор) // - Варшава: Восточно-европейский научный журнал, - 2016. №11, -
с.47-54.
84. Сулейманова, С.Д. Сравнительная оценка эффективности
питательных сред при введении в культуру in vitro подвоя МaксМa 14 // -
Гянджа: Сборник известий Гянджинского отделения НАНА, - 2019. 2(76),
- с. 33-38.
85. Сулейманова, С.Д. Технология получения клоновых подвоев GF677 и
Garnem применительно к Губа-Хачмазскому региону // - Москва: Аграрная
наука, - 2018. №3, - с. 73-75.
86. Сулейманова, С.Д. Технология получения клонового подвоя
Myrobalan 29C применительно к Губа-Хачмазскому региону // - Гянджа:
Сборник известий Гянджинского отделения НАНА, - 2018. 2(72), - с. 127-133.
87. Сулейманова, С.Д. Эффективность антибиотиков в оздоровлении
микроклонов подвоев MaxMa 14, GF677, Myrobalan 29C от инфекций
различной этиологии // - Москва: Аграрная наука, - 2019. №5, - с.75-78.
88. Технология получения оздоровленного посадочного материала
плодовых и ягодных культур: методические указания / под общей редакцией
И.М. Куликова. - Москва: ФГБНУ "Росинформагротех", - 2013. - 92 с.
89. Тимофеева, О.А. Клональное микроразмножение растений. Учебно-
методическое пособие / О.А. Тимофеева, Ю.Ю. Невмержицкая; - Казань:
Казанский федеральный университет, - 2012. - 56 с.
90. Упадышев, М.Т., Питательная среда для укоренения растений in vitro,
Патент на изобретение RU 2111653, Российская Федерация / Гуськов А.В.: -
1998.
157
 91. Фартзинова, И.М., Питательная среда для микроклонального
размножения подвоев яблони, Патент на изобретение RU 96116869, Российская
Федерация / Фартзинова И.М.: - 1998.
92. Холопцов, В.Ф., Способ поверхностной стерилизации эксплантатов и
апикальных почек земляники садовой, винограда, хурмы сорта "Королек" in
vitro, Патент на изобретение RU 2490871C1, Российская Федерация / Простенко
А.Н., Навальнева И.А.: - 2012.
93. Череватая, Т.М. Повышение регенерационных способностей
эксплантатов при клональном микроразмножении винограда // Материалы
научно-практической конференции "Современные достижения биотехнологии в
виноградарстве и других отраслях сельского хозяйства", - Новочеркасск: - 29-30
июня, - 2005, - с. 58-64.
94. Чивилева, В.В. Термо- и фотопериод в микроразмножении
косточковых культур: / диссертация на соискание ученой степени кандидата с.-
х. наук./ - Москва, 2003. -193 с.
95. Шапорева, В.А., Змушко, А.А., Колбанова, Е.В. Адаптация ex vitro
подвоя яблони 54-118 на различных субстратах // Материалы международной
научной конференции "Биотехнология в плодоводстве", - Самохваловичи,
Минск: - 13-17 июня, - 2016, - с. 35-39.
96. Широков, А.И., Крюков, Л.А., Основы биотехнологии растений.
Электронное учебно-методическое пособие: [Электронный ресурс] /
Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского. -
Н.Новгород, 2012. - URL: http://www.unn.ru/pages/elibrary/methodmaterial/files/
Metod_Shirokov_Kryukovpdf
97. Aazami, M.A. Effect of some growth regulators on “in vitro” culture of two
Vitis vinifera L. cultivars // - Bucharest: Romanian Biotechnological Letters, - 2016.
15(3), - p. 5229-5232.
98. Abido, A.I.A. In vitro propagation of grapevine (Vitis vinifera L.) Muscat
of Alexandria cv. for conservation of endangerment / A.I.A.Abido, M.A.M.Aly,

158
A.Sabah [et al.] // Middle-East Journal of Scientific Research, - Aleppo: - 2013.
13(3), - p.328-337.
99. Aghaye, R.N.M. İn vitro culture of Gisela 6 semi-dwarf rootstock /
R.N.M.Aghaye, A.Yadollahi, A.Moeini [et al.] // Journal of Biodiversity and
Environmental Sciences, - Dhaka: - 2013. №7, - р. 57–64.
100. Aghaye, R.N.M., Yadollahi, A. Micropropagation of GF677 rootstock // -
Ontario: Journal of Agricultural Science, - 2012. 4 (5), - p. 131-138.
101. Ahmad, T. Effect of culture media and growth regulators on
micropropagation of peach rootstock GF 677 / T.Ahmad, H.U.Rahman, C.H.Ahmad
[et al.] // Pakistan Journal of Botany, - Karachi: - 2003. 35(3), - р. 331-338.
102. Antonopoulou, C. The effect of Fe-EDDHA and of ascorbic acid on in
vitro rooting of the peach rootstock GF-677 explants / C.Antonopoulou, K.Dimassi,
I.Therios [et al.] // Acta Physiologiae Plantarum, - Heidelberg: - 2007. 29 (6), - р.
559-561.
103. Arab, M.M. Effects of antimicrobial activity of silver nanoparticles on in
vitro establishment of G×N15 (hybrid of almond×peach rootstock) / M.M. Arab, A.
Yadollahi, M. Hosseini-Mazinani [et al.] // Journal of Genetic Engineering and
Biotechnology, - Cairo: - 2014. №12, - p. 103–110.
104. Arab, M.M. Effects of nutrient media, different cytokinin types and their
concentrations on in vitro multiplication of G×N15 (hybrid of almond×peach)
vegetative rootstock / M.M. Arab, A. Yadollahi, S. Shokri [et al.] // Journal of
Genetic Engineering and Biotechnology, - Cairo: - 2014. №12, - p. 81–87.
105. Arab, M.M., Yadollahi, A., Eftekhari, M., Ahmadi, H., Akbari, M.,
Khorami, S.S., Modeling and optimizing a new culture medium for in vitro rooting of
G×N15 Prunus rootstock using Artifcial Neural Network-Genetic Algorithm:
[Electronic resource] / SCIENTIFIC REPORTS. - London, 2018. - URL:
https://www.nature.com/articles/s41598-018-27858-4.pdf
106. Arab, M.M., Yadollahi, A., Shojaeiyan A., Ahmadi, H., Artificial neural
network genetic algorithm as powerful tool to predict and optimize in vitro
proliferation mineral medium for G×N15 rootstock: [Electronic resource] / Frontiers
159
in Plant Science. - Laussane, 2016. - URL: https://www.frontiersin.org/articles/10.
3389 / fpls.2016.01526/full
107. Bairwa, V.K., Kachhwaha, S., Kothari, S.L. Phloroglucinol mediated
shoot bud elongation in Capsicum annuum L. // - Allahabad: National Academy
Science Letters, - 2012. №35, - p.331–335.
108. Bello-Bello, J.J., Perez-Santo, J.A., Cruz-Cruz C.A., Martinez-Estrada E.,
Light-Emitting Diodes: Progress in Plant Micropropagation: [Electronic resource] /
Intechopen Limited. - London, 2017. - URL:
https://cdn.intechopen.com/pdfs/54510.pdf
109. Benmahioul, B. Micropropagation and ex-vitro rooting of pistachio
(Pistacia vera L.) / B.Benmahioul, N. Dorion, M.Kaid-Harche [et al.] // Plant Cell,
Tissue and Organ Culture, - Dordrecht: - 2012. №2, - р. 353-358.
110. Canli, F.A., Demir, F. İn vitro multiplication and rooting of ‘F12-1’
(Prunus avium L.) and ‘Maxma 14’ (Prunus mahaleb L. × P. avium L.) rootstocks // -
New Delhi: Indian Journal of Horticulture, - 2014. №71, - p. 145-150.
111. Cardarelli, M. Influence of ozone treatments on in vitro propagation of
Aloe barbadensis in continuous immersion bioreactor / M.Cardarelli, M.Cardona,
C.M.Suarez [et al.] // Industrial Crops and Products, - Amsterdam: - 2014. № 55, - p.
194-200.
112. Cardoso, J.C., Teixeira da Silva, J.A. Micropropagation of gerbera in
culture medium sterilized with liquid chlorine dioxide (ClO2) // - Cham: In Vitro
Cellular & Developmental Biology, - 2011. №4, - p.362–368.
113. Castillo, A. In vitro micropropagation CG41 apple rootstock / A.Castillo,
D.Cabrera, Z.Rodriguez [et al.] // Acta Horticulturae, - Leuven: - 2015. №1083, - p.
569-576.
114. Choudhary, R. An efficient regeneration and rapid micropropagation
protocol for Almond using dormant axillary buds as explants / R.Choudhary,
R.Chaudhury, S.Malik [et al.] // Indian Journal of Experimental Biology, - New
Delhi: - 2015. №53, - p.462-467.

160
 115. Clapa, D. Rooting and ex vitro acclimatization in hydroculture by
floatation of some blackberry genotypes / D.Clapa, A.Fira, A.Dumitras [et al.] // The
Botanical Review, - New York: - 2011. 3 (3), - р. 133-139.
116. Debergh, P.C., Maene, L.J. Pathological and physiological problems
related to the in vitro culture of plants // - Paris: Parasitica, - 1984. № 40, - р. 69-75.
117. Dejampour, J. In vitro propagation of HS314 rootstock (P.amygdalus x
P.persica) / J.Dejampour, I.Majidi, S.Khosravi [et al.] // HortScience, - Alexandria: -
2011. 46 (6), - p.928–931.
118. Doriс, D. Use of in vitro propagation of ‘Oblačinska’ sour cherry in
rootstock breeding / D.Doric, V.Ognjanov, G.Barac [et al.] // Turkish Journal of
Biology, - Ankara: - 2015. №39. – p.575-581.
119. Driver J.A., Kuniyuki A.H. In vitro propagation of Paradox Walnut root
stock // - Alexandria: HortScience, - 1984. 18(4), - p. 506-509.
120. Dzazio, P.M., Biasi, LA., Zanette, F. Micropropagation of 420-A
Grapevine Rootstock // - Jaboticabal: Revista Brasileira-de-Fruticultura, - 2002.
24(3), - р. 759-764.
121. Erfani, M., Miri, S.M., Imani, A. In vitro shoot proliferation and rooting
of Garnem rootstock as influenced by basal media, plant growth regulators and
carbon sources // - Manchester: Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology, -
2017. 18(3&4), - p. 101-109.
122. Erturk U. The in vitro rooting performance of pear rootstock 'OHxF 333'
in different rooting procedures // - Helsinki: Journal of Food Agriculture and
Environment, - 2013. 11(3). – p. 1424-1427.
123. Fakhrfeshani, M., Bagheri, A., Sharifi, A. Disinfecting effects of nano-
silver fluids in Gerbera (Gerbera jamesonii) capitulum tissue culture // - Bursa:
Journal of Biological & Environmental Sciences, - 2012. №6, - p.121-127.
124. Fallahpour, M., Miri, S.M., Bouzari N. In vitro propagation of “Gizela 5”
rootstock as affected by mineral composition of media and plant growth regulator // -
Warsaw: Journal of Horticultural Research, - 2015. 23(1), - p. 57-64.

161
 125. Felek, W., Mekibib, F., Admassu, B. Micropropagation of peach, Prunus
persica (L.) BATSCH. cv. Garnem // - Cape Town: African Journal of
Biotechnology, - 2017. 16(10), - p. 490-498.
126. Fernando, S.C., Santha, E.S., Hewarathna, D.J.A. Activated coconut shell
charcoal as a component of tissue culture media of Cocos nucifera L // - Sri-Lanka:
Journal of the National Science Foundation of Sri-Lanka, - 2010. 38(3), - p. 181-185.
127. Fidancı, A., Burak, M., Erenoglu, B., Akchay, M.E. Determination of in
vitro propagation techniques of some clonal sweet and sour cherry rootstocks // 5th
International Cherry Symposium, - Bursa: - June 06-10, - 2005. - р. 409-412.
128. Fira, A., Clapa, D., Plopa, C. In vitro rooting and ex-vitro acclimation in
apple (Malus domestica) // - Cluj-Napoca: Bulletin of University of Agricultural
Sciences and Veterinary Medicine, - 2010. 67 (1), - p. 480.
129. Ford, Y.Y. Gibberellin A3 stimulates adventitious rooting of cuttings from
cherry (Prunus avium) / Y.Y.Ford, J.M.Taylor, P.S.Blake [et al.] // Plant growth
regulation, - Dordrecht: - 2002. 37 (2), - p. 127-133.
130. Fotopoulos, S., Sotiropoulos, T.E. In vitro propagation of the peach
rootstock: The effect of different carbon sources and types of sealing material on
rooting // - Dordrecht: Biologia Plantarum, - 2004. 48 (4), - р. 629-631.
131. Gamborg, O.L. The effect of amino acids ammonium of the growth of
plant cells in suspens culture // Journal of Plant Physiology, - 1975. №45, - p. 372-
375.
132. Guney, M. Development of an in vitro micropropagation protocol for
Myrobalan 29C rootstock // - Ankara: Turkish Journal of Agriculture and Forestry, -
2019. №43, - p.569-575.
133. Ismayilova, G.E., Namazov, N.R., Bakhshaliyeva [et al.], Antifungal
activity of substances obtained from different sources: [Electronic resource] /
International Journal of Advanced Research in Biological Sciences. - Tamil Nadu,
2019. - URL: http://ijarbs.com/pdfcopy/2019/june2019/ijarbs1.pdf
134. Jamshidi, S., Yadollahi, A., Ahmadi, H. [et al.], Predicting in vitro culture
medium macro-nutrients composition for pear rootstocks using regression analysis
162
and neural network models: [Electronic resource] / Frontiers in Plant Science. -
Laussane, 2016. - URL: www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2016.00274/full
135. Jamwal, M. In vitro regeneration of grape (Vitis vinifera L.) cv. Perlette.
M.Jamwal, B.Singh, N.Sharma [et al.] // World Journal of Agricultural Sciences, -
Aloppo: - 2013. 9(2), - p.161-166.
136. Kamali, K., Majidi, E., Zarghami, R. Micropropagation of GF-677
rootstocks (Prunus amygdalus x P. persica) // XI GREMPA Seminar on Pistachios
and Almonds, - Zaragoza: CIHEAM, - 28 october, - 2001, - p. 175-177.
137. Kassaye, E. Surface sterilization and in vitro propagation of Prunus
domestica L. cv. Stanley using axillary buds as explants // - Oklahoma: Journal of
Biotech Research, -2017. 8(1), - p. 18-26.
138. Khan, N. Optimizing the concentrations of plant growth regulators for in
vitro shoot cultures, callus induction and shoot regeneration from calluses of grapes /
N.Khan, M. Ahmed, I. Hafiz [et al.] // Journal International des Sciences de la Vigne
et du Vin, - Paris: - 2015. 49(1), - p. 37-45.
139. Kose, S., Canli, F.A. In vitro propagation of ‘Garnem’ (P. persica x P.
dulcis) rootstock // - London: Journal Plant Molecular Biology & Biotechnology, -
2015. 5(1), - p. 25-30.
140. Leite, G.B., Finardi, N.L., Fortes, G.R. Use of vermiculite as a substrate
and effect of light on in vitro rooting of pears, cv. Bartlett and clone OHF97 // -
Lavras: Ciencia e Agrotecnologia, - 2002. 26(5), - p. 977-982.
141. Magyar-Tаbori, K., Dobrаnszki, J., Hudаk, I. Effect of cytokinin content
of the regeneration media on in vitro rooting ability of adventitious apple shoots // -
Amsterdam: Scientia Horticulturae, - 2011. №129, - p. 910-913.
142. Mahna, N., Vahed, S.Z., Khani, S., Plant in vitro culture goes nano: Nano
silver-mediated decontamination of ex vitro explants: [Electronic resource] / Journal
of Nanomedicine & Nanotechnology. – Barcelona, 2013. - URL:
https://www.longdom.org/open-access/plant-in-vitro-culture-goes-nano-nanosilver-
mediated-decontamination-of-ex-vitro-explants-2157-7439.1000161.pdf

163
 143. Mansseri-Lamrioui, A. Proliferation and rooting of wild cherry: the
influence of cytokinin and auxin types and their concentration / A. Mansseri-
Lamrioui, A. Louerguioui, J. Bonaly [et al.] // African Journal of Biotechnology, -
Cape Town: - 2011. 10(43), - p. 8613-8624.
144. Mehrotra, S. Efciency of neural network-based combinatorial model
predicting optimal culture conditions for maximum biomass yields in hairy root
cultures / S. Mehrotra, O. Prakash, F. Khan [et al.] // Plant Cell Reports, - Heidelberg:
- 2013. №32, - p.309–317.
145. Mihaljevic, I. In vitro sterilization procedures for micropropagation of
„Oblacinska“ sour cherry / I.Mihaljevic, K. Dugalic, V.Tomas [et al.] // Journal of
Agricurtural Science, - Cambridge: - 2013. 58(2), - p. 117-126.
146. Muleo, R., Morini, S. Light quality regulates shoot cluster growth and
development of MM106 apple genotype in in vitro culture // - Amsterdam: Scientia
Horticulturae, - 2006. №108, - p. 364-370.
147. Muleo, R., Morini, S. Physiological dissection of blue and red light
regulation of apical dominance and branching in M9 apple rootstock growing in vitro
// - Tokyo: Journal of Plant Physiology, - 2008. №165, - p.1838-1846.
148. Muna, A.S. In vitro propagation of a semi-dwarfing cherry rootstock /
A.S.Muna, A.K.Ahmad, K.Mahmoud [et al.] // Journal of Plant Biotechnology,
PCTOC, - Cham: - 1999. 59 (3), - p. 203-208.
149. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and
bioassays with tobaceo tissue cultures // - Rockville: Physiologia Plantarum, - 1962.
15(3), - p. 473- 497.
150. Naija, S. Involvement of polyamines in the adventitious rooting of
micropropagated shoots of the apple rootstock MM 106 / S.Naija, N.Elloumi,
S.Ammar [et al.] // In Vitro Cellular and Developmental Biology-Plant, - Heidelberg:
- 2009. 45(1), - p. 83-91.
151. Nas, M.N., Read, P.E. A hypothesis for the development of a defined
tissue culture medium of higher plants and micropropagation of hazelnuts //
- Amsterdam: Scientia Horticulturae, - 2004. №101, - p. 189-200.
164
 152. Nasri, A. Large-scale propagation of Myrobolan (Prunus cerasifera) in
RITA® bioreactors and ISSR-based assessment of genetic conformity / A.Nasri,
E.Baklouti, A.B.Romdhane [et al.] // Scientia Horticulturae, - Amsterdam: - 2019.
№245, - p. 144-153.
153. Nezami-Alanagh, E. Predicting optimal in vitro culture medium for
Pistacia vera micropropagation using neural networks models / E.Nezami-Alanagh,
G.A.Garoosi, S.Maleki [et al.] // Journal of Plant Biotechnology, PCTOC, - Cham: -
2017. 129(1), - p. 19-33.
154. Papakosta E. The in vitro rooting of pear rootstock (Pyrus Communis
Pyraster) // - Bhopal: International Journal of Research in Agricultural Sciences, -
2016. 3(6), - p. 320-323.
155. Plopa, C. Factors influencing in vitro propagation of 'Mirobolan Dwarf'
plum rootstock / C. Plopa, I. Dutu, V. Isac [et al.] // Acta Horticulturae, - Leuven: -
2012. №968, - p. 153-158.
156. Poudel, P.R., Kataoka, I., Mochioka, R. Effect of red and blue light
emitting diodes on growth and morphogenesis of grapes // - Dordrecht: Plant Cell,
Tissue and Organ Culture, - 2008. 92(2), - p. 147–153.
157. Quoirin, M., Lepoivre, P. Improved media for in vitro culture of prunus
sp. // - Leuven: Acta Horticulturae, - 1977. №78, - р. 437-442.
158. Rezaei, A., Hosseipour, B. In vitro propagation and rooting of Garnem
rootstock // - Manchester: Plant Cell Biotechnology and Molecular Biology, - 2015.
16 (1-2), - p. 41-47.
159. Sadeghi, F. Optimizing culture media for in vitro proliferation and rooting
of Tetra (Prunus empyrean 3) rootstock / F.Sadeghi, A.Yadollahi, M.Jafarkhani [et
al.] // Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, - Cairo: - 2015. 13(1), - p.
19-23.
160. Safavi, K., Esfahanizadeh, M., Mortazaeinezahad, D.H., Dastjerd, H. The
study of Nano-Silver (NS) antimicrobial activity and evaluation of using NS in tissue
culture media // International Conference on Life Science and Technology, IPBCEE,
- Singapore: IACSIT Press, - 2011, - p. 159-161.
165
 161. Salisu, I.B. Study of antimicrobial activity of nano silver (ns) in tissue
culture media / I.B. Salisu, A. S.Abubakar , M.Sharma [et al.] // International Journal
of Current Research and Review, - Maharashtra: - 2014. 6 (13), - p. 16-21.
162. Sarropoulou, V., Dimassi-Theriou, K., Therios, I. Indole-3-butyric acid
and myo-inositol impacts on in vitro rooting of the cherry rootstocks CAB-6P and
Gisela 6 // - Cham: Biologia Plantarum, - 2013. № 57. - p. 613-619.
163. Sarropoulou, V., Dimassi-Theriou, K., Therios, I. Medium strength in
inorganics and PVP concentration effects on cherry rootstocks in vitro rooting // -
Prague: Horticultural Science, - 2015. №42, - p. 185-192.
164. Schuerger, A.C., Brown, C.S., Stryjewski, E.C. Anatomical features of
pepper plants (Capsicum annuum L.) grown under red light emitting diodes
supplemented with blue or far red light // - Oxford: Annals of Botany, - 1997. 79(3), -
p. 273–282.
165. Sepahvand, S. Effects of myo-inositol and thiamine on micropropagation
of GF677 (peach × almond hybrid) / S. Sepahvand, A.Ebadi, K.Kamali [et al.] //
Journal of Agricultural Science, - Cambridge: - 2015. № 4, - p. 275–280.
166. Shabani Z. Effect of media and regulators of plant growth on micro
propagation of Myrobalan 29C rootstock / Z.Shabani, E.G.Moghadam, B.Abedi [et
al.] // Journal of Horticulture and Forestry, - London: - 2015. 7(3), - p. 57-64.
167. Sharma, V., Thakur, M., Kumar, A. An efficient method for in vitro
propagation of Gisela 5 (Prunus cerasus X Prunus canescens) - clonal cherry
rootstock // - Tamilnadu: International Journal of Current Microbiology and Applied
Sciences, -2017. 6(8), - p. 2617-2624.
168. Skirvin, R.M. Apple (Malus x domestica Borkh.) / R.M.Skirvin,
M.Kouider, H.Joung [et al.] // Biotechnology in agriculture and Forestry, - New
Delhi: -1986. 9 (4), - p. 183-197.
169. Spahiu, E., Hodaj, H., Rama, P. The influence of season collection of
explants on micropropagation of peach rootstock GF-677 // - Tirana: Albanian
Journal of Agriculture Science, - 2013. 12 (1), - р. 15-18.

166
 170. Spiegel, S., Frison, E.A., Converse, R.H. Recent developments in therapy
and virus-detection procedures for international movement of clonal plant germ
plasm // - St.Paul: The American Phytopathological Society, Plant Disease, - 1993.
77(12), - p. 1176-1180.
171. Stanisavljevic, A. Sterilization of different explant types in
micropropagation of CAB-6p and Gisela 6 cherry rootstock / A.Stanisavljevic,
D.Bosnjak, I.Stolfa [et al.] // Poljoprivreda, - Osijek: - 2017. 23(2), - p. 31-37.
172. Suleimanova, S.J. Efficacy of introduction in culture in vitro of grapevine
of Azerbaijani varietes Madrasa and Bayan Shira // Innovations in Biology and
Agriculture to Solve Global Challenges, - Baku: - 31 october, - 2018. - p. 102.
173. Szczygieł, K., Wojda, T. Mikrorozmnażanie wisienki stepowej (Cerasus
fruticosa Pallas) // - Warsaw: Lesne Prace Badawcze, - 2010. 71 (4), - p. 351-355.
174. Tantos, A. Triacontanol - supported micropropagation of woody plants /
A.Tantos, A.Meszaros, N.Farkas [et al.] // Plant cell reports, - Berlin: - 2001. 20(1), -
p. 16-21.
175. Teixeira da Silva, J.A., Dobránszki, J., Ross, S. Phloroglucinol in plant
tissue culture // - Cham: In Vitro Cellular & Developmental Biology, - 2013. 49(1), –
p. 1-16.
176. Tennessen, D.J., Singsaas, E.L., Sharkey, T.D. Light emitting diodes as a
light source for photosynthesis research // - Dordrecht: Photosynthesis Research, -
1994. 39 (1), - p. 85-92.
177. Thakur, M. In vitro propagation of virus indexed Gisela-5 (Prunus cerasus
x Prunus canescens) - clonal cherry rootstock / M.Thakur, V.Sharma, D.P.Sharma [et
al.] // International Journal of Crop Science and Technology, - Ankara: - 2016. 2(2), -
p. 87-99.
178. Vaez-Livari, B., Salehi-Soghadi, Z. In vitro rooting of hybrid GF677
(Prunus dulcis x Prunus persica) // IV International Symposium on Pistachios
Almonds, - Tehran: ISHS Acta Horticulturae, - 22-25 may, - 2005, - p. 171-178.

167
 179. Wang, L.P. Distribution of apple stem grooving virus and apple chlorotic
leaf spot virus in infected in vitro pear shoots / L.P.Wang, N.Hong, G.P.Wang [et
al.] // Crop protection, - Kidlington, Oxford: - 2010. 29(12), - p. 1447-1451.
180. White, Ph.R. The cultivation of animal and plant cells / Ph.R.White. -New
York: The Ronald Press Company, -1954. - 240 p.
181. Yadollahi, A., Arab, M.M., Ahmadi, H., Efekhari, M., Maleki, M.,
Mathematical modeling and optimizing of in vitro hormonal combination for G×N15
vegetative rootstock proliferation using Artifcial Neural Network-Genetic Algorithm
(ANN-GA): [Electronic resource] / Frontiers in Plant Science. - Laussane, 2017. -
URL: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2017.01853/full
182. Zhou, H., Li, M., Zhao, X. Plant regeneration from in vitro leaves of the
peach rootstock "Nemaguard" (Prunus persica x P. davidiana) // - Dordrecht: Plant
Cell Tissue Organ Culture, - 2010. № 101, - p. 79-87.
183. Zou, Ying-Ning. Micropropagation of Chinese plum (Prunus salicina
Lindl.) using mature stem segments // - Cluj-Napoca: Notulae Botanicae Horti
Agrobotanici, - 2010. 38 (3), - p. 214-218.

168
ПРИЛОЖЕНИЯ

169
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

Атм Единица давления

ГК3 гибберреловая кислота
ИМК индолилмасляная кислота
ИУК индолилуксусная кислота
Лк Люкс, единица измерения освещенности
НУК нафтилуксусная кислота
DKW питательная среда Драйвера-Куниюки (Driver and
Kuniyuki Walnut Medium)
МS питательная среда Мурасиге-Скуга (Murashiqe-Skoog
Medium)
QL питательная среда Кворина-Лепуавра (Quoirin-
Lepoivre Medium)
WPM питательная среда Woody Plant Medium 
2 ip (изопрен-2-ил) аденин
6-БАП 6-бензиламинопурин
6-БА 6-бензиладенин

170