Вы находитесь на странице: 1из 150

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................ 5
1. ОСОБЕННОСТИ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА И РЕСУРСНОЙ
СОСТАВЛЯЮЩЕЙ ПРОМЫСЛОВЫХ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
ЗАПАДНОГО СЕГМЕНТА АРКТИЧЕСКИХ МОРЕЙ РОССИИ ..................... 7
1.1. Морфологическая характеристика и особенности распространения
наиболее представительных видов Арктических бурых водорослей............. 7
1.2. Основной химический состав бурых водорослей и биологическая
активность компонентов ................................................................................... 10
1.2.1. Основной химический состав .............................................................. 10
1.2.2. Минеральные вещества ........................................................................ 11
1.2.3. Органические вещества ........................................................................ 13
1.2.3.1. Липидно-пигментный комплекс................................................. 13
1.2.3.2. Полифенольные соединения ....................................................... 16
1.2.3.3. Азотсодержащие вещества ......................................................... 18
1.2.3.4. Структурные и запасные углеводы ............................................ 19
1.2.3.5. Целлюлозная составляющая биомассы бурых водорослей ..... 21
1.3. Методы выделения компонентов биомассы бурых водорослей ... 26
1.4. Выводы. Постановка цели и задач исследования ........................... 31
2. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ......................................................................... 34
2.1. Объект исследований и маршруты экспедиционных работ ................ 34
2.2. Отбор и консервация проб ....................................................................... 36
2.3. Оборудование и реактивы ....................................................................... 36
2.4. Анализ морской воды на точках отбора проб ....................................... 38
2.5. Исследования микроструктуры талломов водорослей ......................... 39
2.6. Исследование химического состава биомассы водорослей ................. 39
2.6.1. Исследование общего химического состава ...................................... 39
2.6.2. Исследование минерального состава бурых водорослей ................. 39
2.6.3. Определения элементного состава биомассы бурых водорослей ... 40
2.6.4. Исследование жирнокислотного состава водорослей....................... 40

2
2.6.5. Определение содержания пигментов .................................................. 42
2.6.6. Определение содержания полифенолов ............................................. 42
2.6.7. Исследование аминокислотного состава ............................................ 42
2.6.8. Анализ углеводной фракции ................................................................ 43
2.6.8.1. Определение легко- и трудно гидролизуемых полисахаридов43
2.6.8.2. Определение моносахаридного состава .................................... 44
2.7. Исследование водорослевой клетчатки ................................................. 45
2.7.1. Определение содержания целлюлозы................................................. 45
2.7.2. ИК-спектроскопичекий анализ водорослевой клетчатки ................. 45
2.7.3. Рентгенографический анализ ............................................................... 45
2.8. Медико-биологическая характеристика экстрактов бурых
водорослей .......................................................................................................... 46
2.8.1. Определение антиоксидантной активности экстрактов ................... 46
2.8.2. Исследование биологической активности.......................................... 47
2.9. Исследование сорбционных характеристик водорослевой
целлюлозы........................................................................................................... 48
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ФРАКЦИОННОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА
БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ) ....................... 52
3.1. Макро- и микроэлементный состав биомассы ...................................... 52
3.2. Изучение состава органической компоненты биомассы водорослей . 59
3.2.1. Липидно-пигментный комплекс.......................................................... 60
3.2.2. Полифенольные соединения ................................................................ 64
3.2.3. Азотсодержащие вещества .................................................................. 65
3.2.4. Структурные и запасные углеводы ..................................................... 69
4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ СЕЛЕКТИВНОГО
РАЗДЕЛЕНИЯ БИОМАССЫ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ НА ФРАКЦИИ
КОМПОНЕНТОВ .................................................................................................. 75
4.1. Разработка методологии разделения биомассы бурых водорослей .... 75
4.2. Динамика изменения морфологической структуры тканей водоросли в
ходе обработок ................................................................................................... 77

3
4.3. Характеристика состава и свойств сверхкритического флюидного
экстракта липидно-пигментного комплекса ................................................... 80
4.4. Извлечение и характеристика фракции водорастворимых веществ ... 85
4.5. Извлечение альгиновых кислот .............................................................. 87
4.6. Выделение и характеристика представительных образцов
водорослевой клетчатки .................................................................................... 88
5. ОЦЕНКА ПОТРЕБИТЕЛЬСКИХ СВОЙСТВ НОВЫХ ПРЕПАРАТОВ
ИЗ ВОДОРОСЛЕВОЙ БИОМАССЫ ................................................................ 101
5.1. Медико-биологическая характеристика фракций водорослевого
липидно-пигментного комплекса ...................................................................... 101
5.2. Сорбционная характеристика водорослевой клетчатки ........................ 104
5.2.1. Факторы, влияющие на процесс сорбции ......................................... 104
5.2.2. Структурная характеристика водорослевой клетчатки ................... 105
5.2.3. Механизм сорбционных процессов на поверхности водорослевой
клетчатки ........................................................................................................... 107
5.2.4. Исследование влияния факторов на сорбционную емкость
водорослевой клетчатки по отношению к тяжелым металлам ................... 113
5.2.5. Исследование сорбционной емкости по отношению к патогенным
микроорганизмам ............................................................................................. 120
ВЫВОДЫ ........................................................................................................... 122
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................. 124

4
ВВЕДЕНИЕ

Арктические бурые водоросли в ряду аквакультур обладают целым


рядом особенностей. Они содержат ценные биологически активные
вещества, такие как полифенолы, пигменты, альгиновые кислоты, маннит и
другие. Единственным местом европейской части России, в котором ведется
добыча и переработка арктических бурых водорослей в промышленных
масштабах является регион Западного сегмента Арктики: Баренцево и Белое
моря, акватории островных и прибрежных территорий. При этом,
промышленную ценность представляют водоросли рода ламинариевых
(Laminaria digitata и Saccharina latissima) и фукусовых (Ascophillum nodosum
и Fucus vesiculosus).
Как известно, арктические бурые водоросли характеризуются высоким
содержанием полисахаридов, в связи с чем, они широко используются в
качестве сырья для производства маннита, фукоидана и различных солей
альгиновой кислоты. Соответственно, большинство применяемых
технологий переработки бурых водорослей, в основном, направлены на
извлечение полисахаридной составляющей. При этом целый ряд ценных
компонентов биомассы, такие как липидно-пигментный комплекс,
полифенольная фракция и водорослевая клетчатка становятся отходами
переработки бурых водорослей. Это обуславливает необходимость
разработки новых, современных методов комплексной переработки
биомассы бурых водорослей, основанных на принципах ―зеленой химии‖ и
позволяющих получать, помимо углеводной составляющей, другие ценные
компоненты, такие как химически не загрязненные препараты липидно-
пигментного и полифенольного комплекса, а также энтеросорбент -
водорослевую клетчатку.
Между тем, стоит отметить отсутствие современных систематических
исследований химического состава арктических бурых водорослей. Текущие

5
климатические тенденции характеризуются увеличением средней
температуры воды, что приводит к изменениям в биосинтезе водорослевых
компонентов и, как следствие, к изменению их химического состава
Поэтому, целью исследований является развитие научных основ
современных способов разделения биомассы бурых водорослей на целевые
группы компонентов с комплексной характеристикой их химического
состава и структуры.

6
1. ОСОБЕННОСТИ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА И РЕСУРСНОЙ
СОСТАВЛЯЮЩЕЙ ПРОМЫСЛОВЫХ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ
ЗАПАДНОГО СЕГМЕНТА АРКТИЧЕСКИХ МОРЕЙ РОССИИ
(ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Морфологическая характеристика и особенности


распространения наиболее представительных видов Арктических бурых
водорослей

Видовой состав альгофлоры Баренцева и Белого морей достаточно


разнообразен. ―По систематическому составу флора водорослей Баренцева
моря представляет собой обедненную флору северной части Атлантического
океана‖ [1]. ―Эндемичных родов и видов не наблюдается. В пределах
Баренцева моря выделяется две фитогеографические зоны: бореальная и
арктическая. Условная граница между зонами проходит от мыса Святой Нос
на северо-запад к Шпицбергену‖ [2]. Необходимо отметить, что от
Мурманского побережья на север и северо-восток и на юг – к Белому морю
идет обеднение видового состава [2].
Среди арктических водорослей наиболее важными по обилию зарослей
с высокой биомассой и промышленной ценностью являются бурые
водоросли [3]. В Баренцевом и Белом морях главные виды бурых водорослей,
образующие их основные запасы — это Saccharina latissima (Linnaeus)
C.E.Lane, C.Mayes, Druehl & G.W.Saunders), Laminaria digitata (Hudson)
J.V.Lamouroux, Fucus vesiculosus (Linnaeus) и Ascophyllum nodosum (Linnaeus)
LeJolis (рисунок 1.1). У берегов архипелага Шпицберген доминирующими
видами бурых водорослей являются l.digitata, s.latissima и alaria esculenta [4].
Ламинариевые и фукусовые водоросли образуют обширные плантации
у побережий Белого и Баренцева морей. Белое море является единственным
водоемом на европейском Севере России, где производится промышленная
заготовка водорослей. По данным 2012 года, запасы бурых водорослей в

7
а б

в г
Рисунок 1.1. Изображения талломов бурых водорослей: а) fucus vesiculosus;
б) laminaria digitata; в) ascohpyllum nodoosum г) saccharina latissima

Белом море стабильны и для ламинариевых водорослей достигают 531


тыс. тонн, фукусовых – 143 тыс.тонн по всем районам [5].
Запасы бурых водорослей в Белом море в хорошем состоянии и
позволяют изымать ежегодно по всем районам до 36 тыс. тонн ламинариевых
водорослей, а фукусовых – до 6,4 тыс.тонн, при этом на сегодняшний день
изымается лишь до 10 % от выделенных лимитов [6-8]. Кроме того,
водорослевые сообщества обладают очень высокой продуктивностью и
восстанавливают сообщество, выбранное на 70 % всего за 2-3 года. Все это

8
показывает ресурсную оправданность, перспективность и универсальность
разработок в сфере комплексной переработки биомассы бурых водорослей.
Структура тканей бурых водорослей характеризуется
многоклеточными слоевищами в форме пластинок, состоящих из одного и
более слоев клеток (паренхиматозная или тканевая структура) (рисунок 1.2).
Для бурых водорослей характерна дифференциация тканевых структур и
наличие проводящих систем. ―Эпидермальные клетки бурых водорослей
снаружи покрыты кутикулой. Толщина кутикулы у C.barbata составляет
2,5x103 нм. Предполагают, что в этом слое локализованы ферменты,
контролирующие образование слизи, выполняющей защитные функции‖ [9].

Рисунок 1.2. Макроструктура ткани слоевища бурых водорослей,


восстановленных в воде [10]

Жесткая клеточная стенка, состоящая в основном из целлюлозы и


альгиновых кислот, образует твердый скелет, на нем формируются липидно-
углеводные слои, для обеспечения данной системе свойств мембраны с
избирательной проницаемостью [11] (рисунок 1.3). Скелет, в свою очередь,
окружает протопласт, в котором различают ядро и цитоплазму с
включенными в нее особыми органоидами - пластидами. Самые важные из
них - хлоропласты, содержащие хлорофилл. В клетке также имеются

9
заполненные жидкостью полости - вакуоли, которые содержат растворенные
питательные вещества, минеральные соли и газы [12].

Рисунок 1.3. Строение клеточной стенки бурых водорослей [11]

―Талломы водорослей можно определить как анизотропные тела,


имеющие неодинаковое строение в разных направлениях. Анизотропия
проявляется в наличии регулярных капиллярных ходов между замкнутыми,
полупроницаемыми перегородками в областях с относительно одинаковыми
свойствами – растительными клетками‖ [10]. С точки зрения экстракции этой
сложной матрицы, на полноту и скорость экстракции будет сильно влиять
степень деструкции клеток.

1.2. Основной химический состав бурых водорослей и биологическая


активность компонентов
1.2.1. Основной химический состав

Основной химический состав арктических бурых водорослей может


быть представлен следующими группами компонентов: минеральные
вещества, в том числе микроэлементы; органические вещества: липидно-
пигментный комплекс (жирные кислоты, пигменты), полифенольные
вещества, азотсодержащие вещества (белки и свободные аминокислоты),

10
структурные углеводы (альгиновые кислоты, фукоидан, целлюлоза),
запасные углеводы (маннит, ламинаран) (рисунок 1.4).

Рисунок 1.4. Основной химический состав бурых водорослей

1.2.2. Минеральные вещества

Водоросли содержат большое количество макро- и микроэлементов, в


том числе необходимых для человека [13]. Содержание золы в бурых
водорослях составляет в среднем 20—35 %масс [14]. Для сравнения,
наземные растения содержат лишь 5˗10 %масс золы [13].
Макрофиты содержат почти все элементы, распространенные в
морской воде. Их соотношения в водорослях значительно варьируются у
различных видов. Водоросли обладают избирательной кумулятивной
способностью, в результате чего в их слоевищах накапливается
разнообразный комплекс микроэлементов, причем концентрация некоторых
из них в тканях в десятки (кальций), сотни (бром, хром) и тысячи (йод, цинк,
барий) раз превышает их содержание в морской воде [15]. Минеральные
вещества в биомассе находятся в виде солей и органических комплексов. К
ним относятся водорастворимые соли (КСl, K2SO4) и нерастворимые соли
(СаSО4, СаСО3). Анионный и катионный состав минеральных веществ

11
существенно изменяется в зависимости от стадии развития и условий
произрастания водоросли. Отмечаются большие сезонные колебания
содержания золы, а также составляющих ее компонентов — йода и калия
[16]. Значительная часть поглощенного йода оказывается в составе
йодаминокислот, хотя обычно находится в основном в виде йодидов.
Механизмы накопления металлов водорослями до конца не изучены, но
чаще всего их связывают с высоким содержанием полисахаридов, для
которых характерны ионообменные процессы, активно протекающие у
альгиновых кислот и других полисахаридов водорослей [15]. Механизм
накопления элементов из морской воды в водорослях имеет не только
биохимическую, но и физико-химическую природу. Так, в работах Камнева
[9] и Иванова [17] показана способность обмениваться некоторыми
элементами с водой даже у отмерших водорослей.
Несмотря на наличие в водорослях большого количества полезных
веществ, не стоит забывать о том, что они концентрируют в своих тканях не
только полезные микро- и макроэлементы, но и токсичные тяжелые металлы.
Тяжелыми металлами по определению являются элементы с атомной массой
в 5 и более раз больше чем у воды, они токсичны даже при низких
концентрациях [18]. Одними из наиболее часто встречающихся, опасных
тяжелых металлов являются свинец, кадмий и ртуть. Способность к
накоплению тяжелых металлов делает бурые водоросли хорошим
биоиндикатором загрязнения акваторий, в которых они произрастают [19-
23]. Особенно это актуально при оценке экологического состояния
арктических морей, где последствия природных и техногенных процессов,
трансграничный перенос экотоксикантов приводит к тяжелым последствиям.
Таким образом, содержание минеральных веществ в биомассе
водорослей варьируется в широких пределах и зависит не только от
таксономической принадлежности, но и от климатических и
гидрохимических факторов. Между тем, вещества органической фракции
существуют в тесном взаимодействии с минеральными веществами, по

12
большей части за счет ионообменных процессов, образуя органо-
минеральные комплексы. Существование подобных соединений в
значительной степени влияет на формирование и свойства органической
составляющей биомассы и, соответственно, на способы еѐ разделения.

1.2.3. Органические вещества

Основными представителями компонентов органической


составляющей биомассы бурых водорослей являются структурные и
запасные полисахариды, белки и аминокислоты, полифенолы и компоненты
липидно-пигментного комплекса.

1.2.3.1. Липидно-пигментный комплекс

Липиды. Липиды – широкая группа соединений, включающая в себя


жиры, воска, стеролы, жирорастворимые витамины (A, D, E, K), моно-, ди- и
триацилглицеролы, диглицериды, фосфолипиды и другие соединения. В то
время как масла высших растений, как правило, состоят из насыщенных и
ненасыщенных жирных кислот, содержащих 16 и 18 атомов углерода,
водоросли содержат кислоты с цепочками от 14 до 22 атомов углерода [24].
Мурата и Наказо (2001) [25] утверждают, что основной источник
липидов водорослей – фосфолипиды, в то время как исследования Бхаскар
[26] и Хотимченко [27], напротив, полагают, что основным классом являются
гликолипиды, а уже за ними следуют нейтральные липиды и фосфолипиды.
Содержание липидов в бурых водорослях зависит от вида, географического
положения, сезона, температуры, солености воды и интенсивности
солнечного света. Кроме того, некоторые исследователи сообщают, что
содержание липидов в водорослях, произрастающих в холодных регионах,
выше, чем у водорослей тропических регионов [28, 29]. В среднем их

13
содержание невелико и составляет 1-5%масс [30-32], жирные кислоты, как
правило, составляют 20-50 %отн от общего содержания липидов [33].
Липиды морских водорослей содержат существенное количество
длинноцепочечных полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), основными
компонентами которых являются омега-3 жирные кислоты.
Эйкозапентаеновая (EPA, 20:5, n-3) и докозагексаеновая кислоты (DHA, 22:6,
n-3) – две наиболее важные кислоты морских липидов, вместе с их
прекурсором - α-линоленовой кислотой (ALA, 18:3, n-3) и докозапентаеновой
кислотой (DPA, 22:5, n-3). Эйкозапентаеновая и докозагексаеновая кислоты
обычно образуются из α-линоленовой в результате элонгации и десатурации
[24]. Обнаружено, что эти две кислоты вызывают существенные
биохимические и физиологические изменения в организме. Помимо того, эти
соединения выступают как структурный компонент клеток и мембран
органелл и играют существенную роль в понижении содержания липидов в
крови. Они также оказывают антиатеросклеротическое, антивоспалительное,
гипотензивное и иммуномодулирующее действие [34, 35]. Основным
источником данных кислот являются морские продукты, в частности,
одноклеточный фитопланктон и морские водоросли. Наземные растения не
способны синтезировать данные соединения. Помимо выше перечисленных
кислот, в бурых водорослях содержится стеаридоновая кислота (С18:4, n-3),
положительно влияющая на иммунную систему человека [36], а также
ненасыщенные и полиненасыщенные омега-6 жирные кислоты.
Водоросли вида F.vesiculosus и L.digitata в большом количестве
содержат миристиновую и пальмитиновую кислоты, а также ценные моно- и
полиненасыщенные жирные кислоты.
Пигменты. Всего в водорослях существует три основных группы
пигментов: хлорофиллы, каротиноиды и фикобилипротеины. Бурые
(Phaeophytes), красные (Rhodophytes) и зеленые (Chlorophytes) водоросли
разделены на три класса в соответствии с преобладающими в них
пигментами, так, основными пигментами бурых водорослей являются

14
фукоксантин и хлорофилл с. Кроме того, водоросли всех трех классов
содержат пигмент хлорофилл а [37].
Хлорофиллы – это жирорастворимые пигменты, представляют собой
комплекс ионов магния с порфириновым кольцом, участвуют в процессе
фотосинтеза. Хлорофилл а поглощает видимый свет в голубой и красной
областях (максимумы поглощения 430 и 662 нм), хлорофилл с, как правило,
поглощает в оранжевой и красной области видимого спектра (585 и 630-638
нм) [38]. Молекула хлорофилла неустойчива, и воздействие на нее слабых
кислот, солнечного света или кислорода воздуха, приводит к быстрому
окислению с образованием целого ряда продуктов деградации [39]. Известно,
что при приготовлении и потреблении пищи, содержащей хлорофилл,
последний преобразуется в феофитин, пирофеофитин и феофорбид. Эти
производные показывают антимутагенные свойства и могут играть большую
роль в предотвращении раковых заболеваний [40]. Содержание хлорофилла в
бурых водорослях может достигать 0,02 мг/г, что значительно меньше, чем в
микроводорослях.
Каротиноиды – наиболее широко распространенные в природе
пигменты, они присутствуют во всех водорослях, высших растениях и
многих фотосинтетических бактериях. Данные соединения имеют цвет от
красного до оранжевого и желтого. Каротиноиды – линейные полиены,
которые функционируют как поглотители световой энергии, так и как
антиоксиданты, инактивирующие реакционно-способные формы кислорода,
образующиеся в результате воздействия света и воздуха [41].
Содержание каротиноидов в бурых водорослях невелико и может
достигать порядка 0,2-0,3 мг/г. Каротиноиды наиболее интенсивно
поглощают в голубой области спектра, однако, фукоксантин поглощает в
зеленой области (400-560 нм) [42]. Некоторые каротиноиды защищают
центры фотосинтетических реакций от избыточного света, являясь
фотопротекторами [43]. Каротиноиды делятся на две группы: каротины,
содержащие только молекулы углерода и водорода, и ксантофиллы,

15
содержащие кислород [44]. Бета-каротин – основной и чаще всего
единственный каротиноид, содержащийся в значительных количествах в
биомассе бурых водорослей [45, 46]. Основным ксантофиллом бурых
водорослей является фукоксантин, вторым по содержанию является
виолаксантин, также были обнаружены антераксантин и зеаксантин [37]. В
работах [44, 47] показано также наличие неоксантина и фукоксантинола как
незначительных составляющих.
Фукоксантин – это ксантофилл с уникальной структурой, содержащий
необычную алленовую связь и 5,6-моноэпоксид в своей молекуле [48].
Исследования показывают, что фукоксантин демонстрирует противораковую
активность, в частности, он вызывал ингибирование роста клеток
человеческой лейкемии с последующим их апоптозом [49, 50]. Кроме того, в
работе [50] показано, что фукоксантин может выступать в качестве пищевой
добавки для препятствия ожирению.
Фукоксантин и каротиноиды проявляют антиоксидантную активность
[51, 52] и противовоспалительное действие [53], каротиноиды также
являются провитаминами витамина А.

1.2.3.2. Полифенольные соединения

Одной из наиболее значительных групп соединений, определяющих


фармакологическое значение водорослей, являются полифенолы. Бурые
водоросли накапливают большое количество полифенольных соединений,
главным образом, флороглюцина (1,3,5-тригидроксибензола) и его
полимеров – флоротаннинов [54], в то время, как полифенолы наземных
растений образуются из галловой и эллаговой кислот. Флоротаннины
представляют собой весьма разнородную группу молекул, различаясь
структурой и степенью полимеризации, в связи с чем, обладают различными
видами биологической активности [55]. Молекулярная масса полифенолов
варьируется в широком диапазоне от 126 Да до 650 кДа [56]. Лекарственная

16
значимость полифенолов связана с их структурой, в особенности, со
степенью полимеризации, где олигофенолы обычно считаются более
активными, чем высокополимеризованные соединения, однако, на
сегодняшний день, взаимосвязь между степенью полимеризации и
биологической активностью достоверно не установлена. Молекулярный
скелет некоторых флоротаннинов состоит из 8 фенольных колец, тогда как
наземные растения продуцируют таннины, состоящие только из 3 – 4 колец
[57].
Адаптационная способность бурых водорослей обусловлена высоким
содержанием флоротаннинов, которые выполняют защитную функцию в
клеточной стенке [58, 59]. Выраженные антиоксидантные свойства
полифенолов проявляются в защите организмов от повреждения активными
формами кислорода. Изучение неочищенных экстрактов водорослей
показало, что восстанавливающая способность и способность к уменьшению
активности гидроксильных радикалов для некоторых видов водорослей
выше, чем у стандартного антиоксиданта (α-токоферола). Также
исследования показали, что антиоксидантная активность повышается с
увеличением содержания фенольных компонентов [60, 61]. Данный факт
подтверждается в работе [57], где сообщается, что антиоксидантная
активность флоротаннинов в 10 раз выше чем у аскорбиновой кислоты и α-
токоферола. В работе [62] показан синергетический эффект действия
полифенолов совместно с витамином Е. В дополнение к этому,
флоротаннины обладают противовоспалительными, противоаллергенными и
антибактериальными свойствами, например, антистафилококковой
активностью [59, 63-66].
Установлено, что концентрация полифенолов значительно варьируется
в пределах вида водорослей. Так, содержание полифенолов в бурых
водорослях некоторых видов может достигать более 20 %масс [67], тогда как
у других видов их содержание может быть близко к нулю.

17
Концентрация полифенолов в водорослях зависит как от места
произрастания, так и от сезона сбора. Исследование содержания
полифенолов в бурых водорослях Fucus Vesiculosus и Ascophyllum nodosum
Белого и Баренцева морей проводили в Мурманским морским биологическим
институте КНЦ РАН и в работе [58] показано, что максимальное содержание
полифенолов (18,6 %масс от а.с.м.) наблюдается у водорослей вида Fucus
Vesiculosus, произрастающих в Белом море. В водорослях Баренцева моря,
общее содержание полифенолов составило 15,4 %масс. Содержание
полифенольных компонентов у вида Ascophyllum nodosum немногим меньше
и практически не зависит от места отбора (14,6 %масс в Белом море и 14,8
%масс в Баренцевом).

1.2.3.3. Азотсодержащие вещества

Основными азотсодержащими веществами бурых водорослей являются


белки, свободные аминокислоты и небелковый азот. Белки состоят из
различных аминокислот и их пищевая и фармацевтическая ценность
определяется их аминокислотным составом [68, 69]. Белки бурых водорослей
содержат все незаменимые для человека аминокислоты, за исключением
триптофана. Их применяют в фармакологической и косметической отраслях
(триптофан, лейцин, изолейцин, валин), пищевой промышленности
(глутаминовая кислота, фенилаланин), в качестве корма для животных
(метионин, лизин, треонин) и других целей.
Содержание аминокислот подвержено сильным сезонным изменением.
Наибольшее содержание аминокислот наблюдается в весенний период, а
наименьшее - в осенний [70]. В среднем содержание белков в биомассе
бурых водорослей колеблется от 5 до 15 % сухого вещества. В белках бурых
водорослей обнаруживают от 15 до 24 аминокислот [70,71] с небольшими
количественными колебаниями. В бурых водорослях содержится

18
значительное количество свободных аминокислот, легко усваиваемые
организмом, а так же моно- и дийодаминокислоты [71].

1.2.3.4. Структурные и запасные углеводы

Морские водоросли содержат большое число полисахаридов, включая


структурные и запасные [25,72]. Данные соединения широко используются в
качестве стабилизаторов, загустителей, эмульгаторов и т.д. [73, 74]. Общая
концентрация полисахаридов в водорослях может варьироваться в диапазоне
от 4 до 76 %масс от абсолютно сухого вещества.
Наряду с обычными, свойственными высшим растениям углеводами, в
клетках водорослей обнаружено много специфических соединений, которые
обладают способностью к комплексообразованию, характеризуются
биологической активностью и легко трансформируются в физиологически
активные метаболиты. В фармакологическом отношении наиболее интересны
ламинаран, фукоидан, маннит, альгиновая кислота и целлюлоза,
составляющие десятки процентов массы крупных водорослей.

Таблица 1.1. Содержание углеводов в биомассе бурых водорослей, %масс


Структурные углеводы Запасные углеводы
Альгиновые Целлюлоза Фукоидан Маннит Ламинаран
кислоты
15-40 3-6 5-20 1- 28 5 - 10

Структурные углеводы составляют основную массу всех углеводов,


входящих в состав водорослей, на их долю приходится до 55 % сухой
биомассы водоросли (Таблица 1.1) [75]. К структурным углеводам относятся
альгиновые кислоты, целлюлоза и фукоидан. Они проявляют значительную
биологическую активность — вирусоцидную, противомикробную,
антикоагулянтную, осморегулирующую [75, 76].
Альгиновая кислота. Это смесь полисахаридов, состоящих из остатков
О-маннуроновой и L-гулуроновой кислот. Альгинаты находятся в основном в
19
клеточных стенках. При экстрагировании обычно в раствор переходит
главным образом О-маннуроновая кислота, а L-гулуроновая остается в
клеточных стенках и маскируется целлюлозой. Альгиновые кислоты и их
соли альгинаты широко применяются в пищевой промышленности,
биотехнологии и медицине. Альгинаты (соли альгиновой кислоты) считаются
одними из лучших сорбентов тяжелых металлов и радиоизотопов [77].
Содержание альгиновых кислот в бурых водорослях колеблется от 15 до 40
%, в зависимости от сезона сбора и таксономической принадлежности [75].
Целлюлоза. Бурые водоросли содержат целлюлозу, несколько
отличающуюся от обычной, поэтому ее называют альгулезой. В водорослях
доля целлюлозы варьируется от 2 до 17 %масс. Например, содержание
водорослевой целлюлозы у l.digitata достигает 3,7 %масс, у L.saccharina —
5,7 %масс. Рентгеноструктурный анализ показал, что она находится в
кристаллической форме и дает четкие рентгенограммы целлюлозы с β-1,4-
глюко-пиранозной связью [78].
Фукоидан применяется в фармацевтической промышленности и
медицине, поскольку является эффективным антикоагулянтом. Наибольшее
количество этого полисахарида, до 20 % от сухой массы, содержится у
фукусовых. У ламинариевых его содержание обычно не превышает 5 %масс
[75].
К основным запасным углеводам относятся: маннит и ламинаран.
Маннит находит разнообразное техническое и медицинское
применение. Он используется в производстве таблеток, как антисептический
порошок для присыпки ран, как заменитель сахара при диабете [79, 80].
Содержание маннита в макрофитах подвержено сильным колебаниям и
зависит от вида водоросли, сезона сбора и даже части слоевища, из которого
он извлекается, и находится в пределах 1-28 %масс от массы сухого
вещества.
Ламинаран встречается почти во всех бурых водорослях. Известны две
формы ламинарана, различающиеся по способности к растворению в воде.

20
Нерастворимая форма ламинарана с молекулярным весом около 3500
относится к растворимой форме с молекулярным весом 5300, как
амилопектин к амилозе. При гидролизе освобождается только один
моносахарид—глюкоза, соединенная β-1,3-связью [75].

1.2.3.5. Целлюлозная составляющая биомассы бурых водорослей

В процессе промышленного получения альгиновых кислот из


водорослевого сырья на одной из технологических стадий остается
водорослевая клетчатка. Еѐ выход может достигать порядка 20 % от массы
водоросли [81]. На сегодняшний день, она является отходом производства
биологически активных веществ из бурых водорослей. Основным
компонентом водорослевой клетчатки является целлюлоза, содержащая
остаточные количества компонентов: нерастворимые белки, соли,
альгиновые кислоты, нерастворимые формы ламинирана и фукоидана,
низкомолекулярные продукты деструкции водорослевых компонентов.
Водорослевая целлюлоза несколько отличается от целлюлозы высших
растений, поэтому получила названия «эуцеллюлоза» или «альгулеза» [82,
83] и характеризуется преобладанием кристаллической фракции Iα [84]. В
водорослях доля целлюлозы варьируется от 2 до 17 %масс. Например,
содержание водорослевой целлюлозы у Laminaria digitata составляет 3,7
%масс, а у Saccharina latissima – 5,7 %масс [78]. Альгулеза растворяется
реактивом Швейцера и образует с хлорцинкйодом типичные для целлюлозы
качественные цветные реакции. При гидролизе она дает 80 % глюкозы, в то
время как гидролиз древесной целлюлозы образует 88 % глюкозы. Альгулеза
является глюканом с β-1,4 - связью в макромолекуле [81].
Среди макро водорослей выделяется 3 основных группы в зависимости
от состояния целлюлозы, входящей в состав еѐ клеточных стенок [85].
Первая группа – преобладающим компонентом клеточных стенок является
целлюлоза с высокой степенью кристалличности. Примерами могут

21
послужить водоросли видов cladophora, chaetomorpah, rhozoclinium и
microdyction [85, 86]. Вторая группа (в которую входит большая часть
водорослей): целлюлоза в небольших количествах, с низкой степенью
кристалличности, случайно направленными цепочками и структурой схожей
со структурой целлюлозы II [85]. Примерами в данном случае могут
послужить водоросли видов Enteromorpha sp cristal (кристалличность 36 %) и
Ulva sp. (кристалличность 53 %) [87]. Третий тип характеризуется очень
низким содержанием целлюлозы в клеточной стенке, например в водорослях
видов Vaucheria и Spirogyra [85].
Целлюлоза - важнейший представитель полисахаридов, одного из
классов природных полимеров, макромолекулы которых построены из
элементарных звеньев (остатков) различных моносахаридов, соединенных
между собой ацетальной (гликозидной) связью [88]. Макромолекула
целлюлозы состоит из остатков глюкозы - моносахарида, углеродный скелет
молекулы которого содержит шесть атомов углерода. При этом элементарное
звено имеет структуру шестичленного кислородсодержащего гетероцикла, а
в образовании гликозидной связи между элементарными звеньями наряду с
альдегидной группой, расположенной у первого углеродного атома одного
элементарного звена, принимает участие гидроксильная группа у четвертого
углеродного атома соседнего звена. Строение макромолекулы целлюлозы
изображается формулой, предложенной Хеуорсом (рисунок 1.5) [89-91].

Рисунок 1.5. Строение макромолекулы целлюлозы по Хеуорсу [90]

Для целлюлозы, как кристаллизующегося полимера, характерно


явление полиморфизма, то есть способности образовывать кристаллиты с
различными параметрами элементарной ячейки. В настоящее время имеются

22
сведения о шести полиморфных модификациях целлюлозы [92]. Согласно
принятым представлениям, нативная целлюлоза относится к структурной
модификации "целлюлоза I" [92].
―Целлюлоза I – модель структуры нативной целлюлозы, атомное
строение которой изучалось многие годы, она является модификацией,
которая встречается в природных материалах: хлопке, рами, большинстве
древесных целлюлоз и водорослях. В целлюлозе I выделяют две
кристаллические фазы, которые были названы целлюлозами Iα и Iβ‖ (рисунок
1.6) [84]. Их обнаружили в 1984 году Atalla и VanderHart [93]. Фаза Iβ
преобладает в высших растениях [94], в то время как низкосимметричная
фаза Iα преобладает в более примитивных организмах (бактерии, водоросли)
[95]. При этом 100 % содержание какой либо фазы не обнаружено ни в одной
нативной целлюлозе. Наивысший процент фазы Iα (∼70 %) обнаружен в
бактериальной целлюлозе. Доля целлюлозы Iα варьируется от 64 % в
целлюлозе валония и бактериальной целлюлозе до 20 % в рами и хлопковой
[96].
Структура фазы Iα (рисунок 1.6) описывается одноцепочечной
триклинной элементарной ячейкой с параметрами: 𝑎 = 6,74 Å, 𝑏 = 5,93 Å, 𝑐 =
10,36 Å, 𝛼 = 117°, 𝛽 = 113°, 𝛾 = 81°, с соответствует пространственной
группой симметрии Р1 [98]. Структура Iβ-целлюлозы (рисунок 1.6)
описывается двухцепочечной моноклинной элементарной ячейкой с
параметрами: 𝑎 = 8,01 Å, 𝑏 = 8,17 Å, 𝑐 = 10,36 Å, 𝛼 = 90°, 𝛽 = 90°, 𝛾 = 97,3° с
пространственной группой симметрии Р21 [92]. Каждая цепочка Iβ имеет
винтовую ось симметрии второго порядка, что накладывает требование
идентичности на смежные глюкозидные остатки этой цепочки.
У целлюлозы Iα два типа водородных связей, как и в случае целлюлозы
Iβ, определяются типом связей с участием гидроксильных групп O(6)H и
O(2)H. Так, сетка A характеризуется наличием сильной внутримолекулярной
водородной связи O(2)H…O(6) в обоих глюкопиранозных циклах и сильной
межмолекулярной связи второго пиранозного остатка O(6)H…O(3). В сетке

23
Рисунок 1.6. Пространственные (с учетом групп симметрии)
модели Iα- и Iβ-целлюлозы [97] (1)

―B‖ наиболее прочной является внутримолекулярная водородная связь


O(6)H…O(1). Количественное соотношение сеток A и B для модификации Iα
оценено как 55:45. Схожесть целлюлоз Iα и Iβ состоит в том, что плоскости
глюкопиранозных звеньев в цепях совпадают, а цепи, «сшитые»
водородными связями, образуют двумерные структуры – листы, которые в
кристаллах собраны в стопки. Важным обстоятельством является отсутствие
существенных межмолекулярных взаимодействий между листами [94, 99,
100].
Сосуществование двух полиморфов, с различной термодинамической
стабильностью, влияет на реакционную способность целлюлозы.
Реакционная способность выше у метастабильной целлюлозы Iα поэтому она
будет участком первичной реакции.
Таким образом, с учетом характера образования межмолекулярных
связей в микрофибриллах целлюлозы и соотношению схем образования
связей, можно предположить, что в сорбционных процессах проходящих за
счет –ОН групп целлюлозы могут участвовать лишь 20 % –ОН групп у
третьего атома углерода для целлюлозы Iβ, а для целлюлозы Iα – 45 % –ОН
групп у третьего и 45 % –ОН групп у второго атома углерода. В связи с чем,
вероятно, целлюлоза Iα гораздо в большей степени способна к химическому
связыванию тяжелых металлов за счет комплексообразования и ионного
обмена с участием групп –ОН.

24
Поскольку большинство синтетических сорбентов отличаются высокой
стоимостью, приоритетным направлением становится использование
материалов природного происхождения [101] каковым может стать
водорослевая клетчатка.
Основным компонентом водорослевой клетчатки является целлюлоза,
структура и свойства которой будут обуславливать еѐ обменно-
адсорбционную способность.
Анализ литературных данных выявил недостаточную изученность
структуры и химических свойств целлюлозы арктических бурых водорослей.
Так, по литературным данным преобладающей кристаллической фазой
водорослевой целлюлозы является Iα, в то же время ряд исследователей
показывают наличие в водорослях значительного количества целлюлозы II.
Стоит отметить, что воздействия химических реагентов могут также
приводить к структурным преобразованиям целлюлозы, что так же вносит
неясность в структуру целлюлозы, входящей в состав клетчатки. При этом
сорбционная способность данного биополимера во многом определяется его
кристаллической структурой.
Так как водорослевую клетчатку можно отнести к сорбентам
целлюлозного типа, то для исследования этого препарата применимы
подходы и методы, используемые при исследовании целлюлоз.
Группы компонентов биомассы арктических бурых водорослей, такие
как липидно-пигментный комплекс, полифенольные соединения,
структурные и запасные углеводы представляют значительный интерес для
промышленности, ввиду широкого спектра потребительских свойств. При
этом, фукусовые водоросли характеризуются наибольшим содержанием
компонентов полифенольного и липидно-пигментного комплексов, среди
промышленно значимых арктических водорослей.
Рассмотрение литературных данных о химическом составе бурых
водорослей показало, что содержание различных компонентов в биомассе
варьируется в широких пределах и зависит не только от таксономической

25
принадлежности и сезона отбора, но и от условий произрастания
(температура, химический состав воды, продолжительность светового дня,
гидродинамические режимы и т.п.).
Современные климатические тенденции к увлечению средней
температуры воздуха, приводят не только к изменению температуры воды,
но и к изменению еѐ химического состава из-за таяния льдов, что,
несомненно, значительно влияет на процессы биосинтеза компонентов
биомассы водорослей. При этом, в литературе отсутствуют данные о
современных систематических исследованиях состава арктических бурых
водорослей. Между тем, при разработке современной методологии
разделения биомассы арктических бурых водорослей необходимо учитывать
данные климатические тенденции изменения индивидуального и группового
состава биомассы бурых водорослей. В связи с этим, встает необходимость
глубокого изучения индивидуального компонентного состава каждой группы
веществ и исследование тенденций в накоплении данных соединений
исследуемыми макрофитами западного сегмента Арктики.

1.3. Методы выделения компонентов биомассы бурых водорослей

Большинство применяемых технологий переработки бурых


водорослей, в основном, направлены на извлечение полисахаридной
составляющей. Основными недостатками методов являются
многостадийность и нерациональное использование сырья, когда некоторые
компоненты, такие как липидная фракция, полифенолы или клетчатка,
становятся отходами производства. Другим недостатком этих способов
является использование токсичных и дорогостоящих органических
растворителей для обезжиривания биомассы и получения препаратов
липофильных веществ. Переработка продуктов и получение биологически
активных веществ с использованием органических растворителей (гексан,
хлороформ и др.) может привести к загрязнению не только окружающей

26
среды, но и получаемых препаратов, остаточными количествами
растворителя [102, 103]. Органические растворители дороги,
низкоселективны, а законодательные ограничения к их наличию в продуктах
ужесточаются [104]. Более того, использование подобных растворителей
может привести к химическому изменению и потере полезных свойств таких
веществ как жирные кислоты и пигменты [105, 106].
Традиционные схемы извлечения биологически активных веществ из
биомассы бурых водорослей основываются на использовании экстракции
сухих или замороженных водорослей различными растворителями (вода,
спирты, ацетон, гексан, хлороформ). Теоретический анализ литературных
данных позволяет нам представить последовательность стадий обработки
биомассы в виде следующей принципиальной схемы (рисунок 1.7).

Рисунок 1.7. Принципиальная схема переработки бурых водорослей

27
На первой стадии проводится процесс извлечения низкомолекулярных
веществ (маннит, минеральные вещества, липиды, пигменты) и для этого
чаще всего используется водно-спиртовая экстракция (концентрация спирта
86-96 %) при температуре 65-75 0С [107-112].
Из спиртового экстракта отгоняется этанол и из остатка выделяют
маннит и липидный концентрат. Выделение липидов из этанольного
экстракта может быть осуществлено не только за счет упаривания
последнего, но и с помощью последовательной экстракцией гексаном
(хлорофилл) и хлороформом (фукоксантин) для получения препаратов
липидов [112]. Некоторые технологии получения липидов предусматривают
предварительное обезжиривание биомассы апротонными растворителями
(гексан или хлороформ) и улучшения доступности клеточных стенок
водорослей к последующему действию реагентов [113-115].
В технологии [116] на первой стадии водоросли обрабатывают водно-
спиртовой смесью с добавлением масла, для получения маннита и масляного
экстракта липидов бурой водоросли. Первой стадией экстракции в некоторых
случаях так же может быть кислотная экстракция с последующим
извлечением маннита [117] или суммы водорастворимых углеводов [118]. В
работе [119] показана возможность получения густого экстракта фукуса
пузырчатого, который представляет собой липидно-пигментный комплекс,
полученный экстрагированием водоросли на первой стадии в аппарате
Сокслета смесью метиленхлорида с этанолом.
На второй стадии извлекают водорастворимые полисахариды
разбавленным раствором минеральных кислот [107, 111, 114] или водой
[120]. Далее экстракт нейтрализуют и упаривают.
Подавляющее большинство рассмотренных технологий
предусматривают получение альгинатов из водорослевого шрота [107, 116,
117, 120]. Для этого проводят экстракцию раствором карбоната или
гидрокарбоната натрия в течение 4-8 часов при температуре 65-75 0С.

28
В качестве примера практической реализации отдельных стадий
представленной схемы можно рассмотреть технологическую схему
переработки бурых водорослей, применяемую на АО ―Архангельском
опытном водорослевом комбинате‖ (рисунке 1.8). Основными выделяемыми
группами соединений являются маннит и альгиновые кислоты.
Очевидно, что на сегодняшний день остается актуальным вопрос о
новых способах переработки биомассы бурых водорослей с использованием
принципов ―зеленой химии‖.

Рисунок 1.8. Схема переработки бурых водорослей

Одним из современных методов экстракции, соответствующих


принципам ―зеленой химии‖ является сверхкритическая флюидная
технология. Она развивается как альтернативный метод гетерофазной
экстракции, на замену традиционным методам с их недостатками
(длительное время экстракции, большой расход экстрагентов, высокие
температуры) [121-123].
Потребности в химически не загрязненных и неизмененных препаратах
липидно-пигментного комплекса стимулируют развитие сверхкритических
флюидных технологий в области экстракции жирорастворимых веществ из
растительных матриц [124-125] и в частности из микро- и макро водорослей

29
[126]. Извлечения данной группы компонентов из биомассы водорослей
возможно с использованием метода сверхкритической флюидной экстракции
[127, 128]. Применение данного метода - одна из возможностей в приведении
процессов экстракции к принципам "Зеленой химии".
Сверхкритическое состояние вещества определяется как состояние, при
котором вещество находится при условиях выше его критической
температуры (Ткр) и критического давления (Ркр). В этих условиях плотность
флюида приближена к плотности жидкости, вязкость как у газов, а
способность к диффузии средняя между газом и жидкостью. Благодаря этим
свойствам сверхкритический флюид способен легко проникать в пористые
матрицы и хорошо транспортировать вещества из них. Важным свойством
сверхкритических флюидов является то, что растворяющая способность
флюида является функцией его плотности, которая зависит от температуры и
давления [129-131].
Высокая экологичность самого технологического процесса
определяется тем, что углекислый газ не является токсичным веществом, а из
экстракта он практически полностью удаляется на последних этапах
технологического цикла, причем для этого не требуется проведения каких-
либо дополнительных мероприятий.
Диоксид углерода является наиболее часто используемым
сверхкритическим флюидом, благодаря своим сравнительно мягким
сверхкритическим параметрам. При проведении экстракционных процессов в
среде сверхкритического диоксида углерода сводится к минимуму
окислительная деструкция экстрагируемых веществ, в виду отсутствия
кислорода. Следовательно, значительно повышается предел варьирования
температур при экстракции легкоокисляемых компонентов, по сравнению с
традиционной жидкостной экстракцией. Все это делает сверхкритическую
флюидную экстракцию перспективным направлением при переработке
биомассы бурых водорослей.

30
1.4. Выводы. Постановка цели и задач исследования

Анализ литературных данных по видовому разнообразию,


морфологическим особенностям, химическому составу, биологической
активности и методам выделения составляющих биомассы арктических
водорослей позволяет сделать следующие выводы:
1) Промысловые запасы арктических бурых водорослей в Западном
сегменте Арктики сосредоточены в Баренцевом и Белом морях и
представлены следующими видами: Saccharina latissima, Laminaria digitata,
Fucus vesiculosus и Ascophyllum nodosum.
2) Уникальный состав биологически активных веществ арктических
водорослей, обладающих антиоксидантными, противомикробными,
противоопухолевыми и др. свойствами позволяет рассматривать данный
возобновляемый биоресурс как источник получения ценных лечебно-
профилактических препаратов таких как:
- компоненты липидно-пигментного комплекса (пигменты и жирные
кислоты, в т.ч. омега-3 и омега-6), некоторые из которых не синтезируются
высшими растениями;
- полифенольный комплекс, в значительной степени накапливаемый
арктическими бурыми водорослями;
- полисахаридный комплекс и перспективный энтеросорбент
водорослевая целлюлоза.
3) Содержание различных компонентов в биомассе варьируется в
широких пределах и зависит не только от таксономической принадлежности
и сезона отбора, но и от условий произрастания. Современные
климатические тенденции к увеличению средней температуры воздуха
значительно влияют на процессы биосинтеза компонентов биомассы
водорослей. При этом, в литературе отсутствуют систематические данные о
современных исследованиях химического состава арктических бурых
водорослей. В связи с этим, встает необходимость глубокого изучения

31
индивидуального компонентного состава каждой группы веществ и
исследование тенденций в накоплении данных соединений исследуемыми
макрофитами западного сегмента Арктики в современных климатических
условиях.
4) Существующие технологии не позволяют реализовать ресурсный
потенциал бурых водорослей в полной мере и на сегодняшний день многие
компоненты зачастую являются отходами производства углеводов.
Следовательно, остается актуальным вопрос разработки новых
ресурсосберегающих методов переработки бурых водорослей с
использованием принципов ―зеленой химии‖.
5) Химический состав водорослевой клетчатки и характеристика
структуры еѐ основного компонента – водорослевой целлюлозы,
свидетельствуют о том, что она может проявлять сорбционные свойства по
отношению к тяжелым металлам и патогенным микроорганизмам и может
выступать в качестве энтеросорбента. Реакционная способность волокнистых
сорбентов зависит от структуры и свойств, входящей в их состав целлюлозы.
Для более полного понимания сорбционных процессов проходящих на
поверхности водорослевой клетчатки необходима комплексная
характеристика структуры и свойств еѐ основного компонента - целлюлозы.

Целью исследований является развитие научных основ современных


способов разделения биомассы бурых водорослей на целевые группы
компонентов с комплексной характеристикой их химического состава и
структуры.
Для выполнения поставленной цели необходимо решить следующие
задачи:
1) отбор, анализ и комплексная характеристика проб промысловых
видов арктических бурых водорослей, с различных районов Белого и
Баренцева морей;

32
2) исследование состава минеральной фракции макрофитов
западного сегмента Арктики и выявление тенденции в накоплении данных
веществ;
3) получение новых данных об индивидуальном компонентном
составе веществ органической фракции биомассы бурых водорослей;
4) разработка новой методологии разделения биомассы бурых
водорослей с выделением целевых групп компонентов общей химической
природы;
5) характеристика индивидуального состава выделенных
препаратов липидно-пигментного комплекса и исследование их
биологической активности;
6) исследование структуры и свойств водорослевой целлюлозы, как
потенциального энтеросорбента.

33
2. МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

2.1. Объект исследований и маршруты экспедиционных работ

Объектом исследований послужили 44 образца 4 видов бурых


водорослей (2 вида ламинариевых (Saccharina latissima и Laminaria digitata) и
2 - фукусовых (Fucus vesiculosus и Ascophyllum nodosum)).
Отбор проб арктических бурых водорослей осуществлялся во время
экспедиций «Арктический плавучий университет» в летний период 2012,
2013 и 2014 годах на борту научно-исследовательского судна «Профессор
Молчанов».
Временные периоды и маршруты экспедиционных работ (рисунок 2.1):
1 экспедиция: 1 июня – 10 июля 2012 года. Маршрут: Архангельск —
Белое море — Баренцево море — Печорское море — Белое море —
Архангельск.
2 экспедиция: 1 – 25 июня 2013 года. Маршрут: Архангельск — Белое
море — Баренцево море — Гренландское море — архипелаг Шпицберген —
Белое море — Архангельск.
3 экспедиция: 1 – 30 июня 2014 года. Маршрут: Архангельск — Белое
Море — архипелаг Шпицберген — Баренцево Море — Архангельск.
Районы исследований и отбора проб [132] располагались как на
крайних северных точках территорий Западного сегмента Арктики
(Архипелаг Земля Франца-Иосифа, Архипелаг Новая Земля, Архипелаг
Шпицберген), так и в умеренной арктической зоне (акватории Белого моря)
(рисунок 2.1).
В каждой точке отбирали количественные пробы растений,
фиксировали глубину и описывали характер дна, уклон и тип берега.

34
2012 а 2013 а 2014 а

2012 б 2013 б 2014 б


Рисунок 2.1. Карта отбора проб бурых водорослей: в Баренцевом море (а), Белом море (б), 1 – остров Русский Кузов; 2 – остров Большой Соловецкий;
3 – остров Сосновец; 4 – мыс Канин Нос; 5 – остров Скотт-Келти; 6 – залив Русская Гавань; 7 – Оранские острова; 8 – мыс Желания;
9 – залив Ис-Фьорд; 10 – залив Конгс-Фьорд (Нью Олесунн).
2.2. Отбор и консервация проб

Ламинариевые водоросли отбирали с глубины от 2 до 6 м при помощи


оригинальной ручной драги (рисунок 2.2), которую опускали на дно, и с
помощью лезвия в передней части устройства срезали растения. Последние
цепляются за металлические шипы, установленные в задней части
конструкции.
Фукусовые водоросли отбирали вручную на литоральной зоне с
глубины до полуметра во время отлива, либо с использованием драги во
время прилива.
Свежесобранные водоросли очищали от эпифитов, песка, различных
моллюсков и других загрязнений, отделяли органы прикрепления.
Пробы сушили до достижения воздушно-сухого состояния в
сушильном шкафу при температуре 30±1 °С [20]. Далее образцы измельчали,
отбирали фракцию от 0,1 до 1,0 мм, усредняли и хранили в герметичной
стеклянной таре в темном помещении.

Рисунок 2.2. Ручная драга для отбора водорослей

2.3. Оборудование и реактивы

При выполнении исследований были использованы реактивы,


характеристики которых указаны в таблице 2.1 и приборы, описанные в
таблице 2.2.

36
Таблица 2.1. Характеристика использованных реактивов
Название реактива Характеристика
Изопропанол >99,9 % Компонент-Реактив, Россия
Этанол ректификат, концентрация 95 %, Россия
Метанол >99,8 %, Merck, Германия
Соляная кислота ХЧ, Россия
Серная кислота ч.д.а., концентрация 95,68 %, Россия
Азотная кислота ХЧ, Россия
Уксусная кислота 80 %, Россия
Трифторуксусная кислота 99,8 %, Sigma Aldrich
Ацетон ч.д.а., Вектон, Россия
Хлороформ х.ч. Компонент-Реактив, Россия
Гексан 1 сорт, Криохром, Россия
ацетонитрил 0 сорт, Криохром, Россия
Этилендиамин ч, Россия
Реактива Folin-Ciocalteu Sigma-Aldrich, США
Гидроксид натрия х.ч., Нева Реактив, Россия
Карбонат натрия х.ч., Нева Реактив, Россия
Нонадекановая кислота Аналит. Стандарт, Sigma-Aldrich, США
Метиловый эфир гептадекановой
Аналит.стандарт, Sigma-Aldrich, США
кислоты
Хлорофилл α Аналит.стандарт, Sigma-Aldrich, США
Бета каротин Аналит.стандарт, Sigma-Aldrich, США
Сульфат меди ч.д.а., Нева Реактив, Россия
Натрий металлический ч.д.а., Нева Реактив, Россия
Метиленовый синий ч.д.а., Нева Реактив, Россия
Cd(NO3)2∙4H2O ч.д.а. , Россия
Pb(NO3)2 ч.д.а., Россия
Оксид кадмия ч.д.а., Нева Реактив, Россия
ацетат аммония ч.д.а., Merck, Германия
микрокристаллическая целлюлоза ТУ-9199-001-07508109-2004 ФГУП ―ПО
(МКЦ) Прогресс‖, Россия
1,1-дифенил-2-пикрилгидразина 97 %, Sigma-Aldrich, США

37
Таблица 2.2. Приборы и оборудование
Название Страна производитель
Система аналитической
Waters, США
сверхкритической флюидной экстракции ASFE
Полупрепоративная система SFE-5000 Thar Technologies, США
Лабораторный монитор фаз SPM 20-2P Waters, США
Аминокислотный анализатор Biochrom 30+ Biochrom, Великобритания
ВЭЖХ система LC-30 ―Nexera‖ Shimadzu, Япония
Газовый хроматограф 7820A GC System Maestro Agilent, США
Хроматографическая система LC-20 Prominence Shimadzu, Япония
Газовый хромато-масс спектрометр QP-2010 Plus Shimadzu, Япония
Элементный анализатор ЕА3000 EuroVector, Италия
Анализатор ртути MercurAA Analytik Jena, Германия
Последовательный волнодисперсионный
Shimadzu, Япония
рентгенофлуоресцентный спектрометр XRF-1800
Электронный сканирующий микроскоп SEM
Carl Zeiss, Германия
Sigma VPZEISS
Дифрактометр ДРОН-6 НПП «Буревестник», Россия
Система анализа площади поверхности и пористости
Micromeritics, США
твердых материалов ASAP 2020
Атомно-абсорбционный спектрометр АА-7000 Shimadzu, Япония
ИК-Фурье-спектрометр Vertex 70 Shimadzu, Япония
Атомно-адсорбционный спектрометр ContrAA 700 Analytic Jena, Германия
Однолучевой спектрофотометре СПЕКОЛ 1300 Shimadzu, Япония
Спектрофотометр Specord 250 Plus Shimadzu, Япония
Аналитическая центрифуга ProteomLab XL-A Beckman, США
Электронные аналитические весы MS204S Mettler Toledo, Швейцария
Роторный испаритель ИР-1ЛТ Labtex, Россия
Системы капиллярного электрофореза Agilent 7100 Agilent, США

2.4. Анализ морской воды на точках отбора проб

В точках отбора проб водорослей определяли термохалинные


характеристики воды (температура и соленость). Содержание основных
катионов (натрия, магния, кальция, калия, аммония) в морской воде
определяли методом капиллярного зонного электрофореза с использованием
системы капиллярного электрофореза Agilent 7100 [133].

38
2.5.Исследования микроструктуры талломов водорослей1

Образец водоросли был заморожен в дистиллированной воде с


добавлением азида натрия на месте отбора, для исключения влияния
микроорганизмов на ультраструктуру клеточных стенок. Для определения
влияния стадий комплексной обработки биомассы водорослей на
ультраструктуру водорослей образец подвергали экстракции
(сверхкритическая флюидная экстракция, кислотная экстракция).
Материал для микроскопического исследования представлял собой
срезы и сколы образцов водорослей, на различных стадиях экстракции.
Срезы готовили из лиофильно высушенного сырья.
Снимки получали на сканирующем электронном микроскопе SEM
Sigma VPZEISS (ускоряющее напряжение 20 кВ, детектор InLens).

2.6. Исследование химического состава биомассы водорослей


2.6.1. Исследование общего химического состава

Общий химический состав (содержание золы, альгиновых кислот,


маннита) водорослей исследовали по общепринятым методикам [132]. Выход
сухих веществ в экстрактах определяли гравиметрическим методом, после
упаривания экстракта при 105 0С.

2.6.2. Исследование минерального состава бурых водорослей1

Качественный и количественный минеральный состав биомассы


водорослей был исследован методом рентгенофлуоресцентного анализа на
волнодисперсионном рентгенофлуорисцентном спектрофотометре XRF-1800
по результатам двух параллельных определений, с коэффициентом вариации

1
Химический анализ проводили в центре коллективного использования научным оборудованием ―Арктика‖
САФУ
39
не более 6 %. Условия определения: напряжение 40 кВ, сила тока 95 мА,
лампа с родиевым анодом, с использованием кристаллов анализаторов LiF,
Ge, PET, TAP; детекторы сцинтилляционный и полупроводниковый,
экспликация 40 с, в атмосфере вакуума. Результат выражали в процентах
массовых.
Концентрацию ртути определяли методом атомной адсорбции (метод
холодного пара), на атомно-адсорбционном спектрометре Mercury АА
Analitic Jena по стандартной методике [134]. Сущность метода заключается в
измерении величины поглощения луча света определенной (резонансной)
длины волны от источника, проходящего через атомный пар.

2.6.3. Определения элементного состава биомассы бурых водорослей1

Элементный состав биомассы водорослей определяли на элементном


анализаторе EuroEA – 3000 с относительной погрешностью не более 5 %.
Условия определения: CHNS-конфигурация, высокотемпературное сжигание
пробы в присутствии кислорода с последующим газохроматографическим
разделением и детектированием продуктов сгорания при помощи
высокочувствительного катарометрического детектора. Температура печи
980 0С, температура детектора 115 0С, время окисления 6,6 секунд, давление
120 кПа. Относительная погрешность не более 5 %. Результат выражали в
процентах массовых.

2.6.4. Исследование жирнокислотного состава водорослей1

Экстракция липидов. Экстракцию липидов осуществляли по методике


Блайя и Дайера [135]. Навеску измельченных водорослей с массой
(1,0 ± 0,1) г помещали в коническую колбу объемом 50 мл и добавляли 4 мл
дистиллированной воды. Затем в колбу добавляли 15 мл смеси хлороформ-
метанол в соотношении 1:2 и перемешивали в течение 5 минут. Затем

40
поочередно добавляли 5 мл хлороформа и 5 мл воды и перемешивали смесь
после добавления каждого компонента в течение 5 минут. Далее раствор
фильтровали и оставляли на несколько минут для расслоения водного и
хлороформного слоев. Отбирали хлороформный слой, выпаривали досуха в
роторном испарителе, остаток перерастворяли в 0,5 мл гексана и хранили при
температуре -20 °С.
Получение метиловых эфиров жирных кислот. Этерификацию жирных
кислот осуществляли по методике Карро [136]. В пробирку Эппендорфа
помещали 200 мкл экстракта, добавляли 0,5 мл 1 % метилата натрия и
нагревали 5 минут при 55 °С. Затем смесь охлаждали, прибавляли 0,5 мл 5 %
раствора HCl в метаноле (раствор приготовлен путем пропускания
газообразной хлороводородной кислоты через метанол) и нагревали еще 5
минут при 55 °С. После охлаждения получившийся раствор перенесли в
виалу объемом 4 мл, добавили 2 мл дистиллированной воды и провели
трехкратную экстракцию 0,5 мл гексана. Экстракты объединяли, дважды
промывали дистиллированной водой (по 0,5 мл), выпаривали в токе азота и
взвешивали. Затем метиловые эфиры жирных кислот растворяли в 0,4 мл
гексана и хранили при температуре -20 °С.
Для проверки полноты этерификации в навеску водоросли до
экстракции вносили 0,5 мл гексанового раствора, содержащего 2 мг
нонадекановой кислоты. Для количественного анализа жирных кислот в
раствор с метиловыми эфирами жирных кислот вносили 100 мкл гексанового
раствора, содержащего 1 мг метилового эфира гептадекановой кислоты.
Газохроматографический метод анализа метиловых эфиров жирных
кислот. Хроматографический анализ выполняли на газовом хроматографе
Agilent Technologies 7820A GC System Maestro. Для разделения использовали
колонку HP-INNOWAX, 60 м × 0,25 мм × 0,50 мкм. Газ носитель – азот.
Детектор – пламенно-ионизационный. Начальная температура – 80 0С (5
минут). Конечная температура – 250 0С (47 минут). Скорость подъема 2,5
град/мин. Объем пробы – 2 мкл. Деление потока – 10:1. Температура

41
испарителя – 280 0С. Температура детектора – 300 0С. Частота опроса
детектора 20 Гц. Поток поддувочного газа для детектора (азот) – 23 мл/мин.
Скорость газа-носителя в колонке – 2 мл/мин. Поток воздуха 300 мл/мин,
водорода 30 мл/мин. Общее время анализа – 120 мин.

2.6.5. Определение содержания пигментов

Пигменты экстрагировали из перемолотых водорослей ацетоном в


аппарате Сокслета [137]. Разделение ацетонового экстракта бурых
водорослей производили с помощью жидкостной хроматографии на ВЭЖХ
системе LC-30 ―Nexera‖ (Колонка Luna C-18 (Phenomenex), элюент: 80 %
ацетонитрил, 20 % изопропанол, скорость потока 1 мл/мин, температура
0
35 С, детектирование на 450 нм) с последующим детектированием
пигментов при 665 и 440 нм на фотометрическом детекторе. Относительное
значение стандартного отклонения при анализе не превышает 10 %.
Результат выражали в мг/г.

2.6.6. Определение содержания полифенолов

Суммарное содержание полифенольной фракции определяли


колориметрическим методом с применением реактива Folin-Ciocalteu [138]. В
качестве стандарта использовали флороглюцин. Относительное значение
стандартного отклонения при анализе не превышает 5 %. Результат
выражали в процентах массовых.

2.6.7. Исследование аминокислотного состава1

Аминокислотный состав определяли ВЭЖХ методом [139] на


аминокислотном анализаторе Biochrom 30+ после полного кислотного
гидролиза пептидных связей раствором 6М соляной кислоты, в соответствии

42
с ГОСТ [140] с относительной погрешностью не более 7 %. Результат
выражали в процентах массовых.
Метод заключается в разделении смеси аминокислот на ионообменной
колонке, с последовательным вымыванием аминокислот пятью литиево-
цитратными буферными растворами с увеличением ионной силы и pH от
первого к последнему. Далее проводится постколоночная дериватизация
раствором нингидрина, образующим интенсивную окраску аминокислот и
последующим фотометрическим детектированием цветных продуктов.
Условия определения: тип колонки Peek, длинна 200 мм, диаметр 4,6 мм,
буферный раствор на основе цитрата лития, скорость подачи буферного
раствора 31,2 мл/ч, скорость подачи нингидрина 25 мл/ч. Относительное
значение стандартного отклонения при анализе не превышает 10 %.

2.6.8. Анализ углеводной фракции

Влажность, содержание альгиновых кислот и маннита было определено


стандартным методом по ГОСТ [132]. Моносахаридный состав биомассы
бурых водорослей определяли методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ) [20] и методом газовой хроматографии с масс
детектированием (ГХ-МС).

2.6.8.1. Определение легко- и трудно гидролизуемых полисахаридов

Для гидролиза легкогидролизуемых полисахаридов использовали


обработку 2 % раствором соляной кислоты при температуре 100 ºС в течение
3 часов. Для гидролиза трудногидролизуемых полисахаридов использовали
обработку 80 % серной кислотой при 20 ºС в течение 1 часа и последующий
гидролиз 3 % серной кислотой в течение 3 часов при 100 ºС. Для определения
концентрации редуцирующих веществ в гидролизатах применяли метод,
основанный на реакции окисления сахаров медно-щелочным раствором, в

43
результате которой двухвалентная медь переходит в одновалентную. Далее
косвенно, титриметрически определяют количество выделившейся меди.
Относительное значение стандартного отклонения при анализе не превышает
10 %. Результат выражали в процентах массовых.

2.6.8.2. Определение моносахаридного состава1

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Анализ


[141] моносахаридного состава водорослей проводится после
двухступенчатого гидролиза биомассы: раствором концентрированной
серной кислоты (72 %) при температуре 30 оС в течение 60 минут, а затем
раствором разбавленной серной кислоты (4 %) при температуре 121 оС в
течение 60 минут [142]. Стандарты моносахаридов подвергали гидролизу в
тех же условиях, что и образцы водорослей. Непосредственно
хроматографический анализ проводится с использованием системы LC-20
Prominence (Shimadzu, Япония). Разделение проводили при температуре
75 °С на колонке HI-PLEX Pb, 300x7, 7 мм (Agilent, США). Относительное
значение стандартного отклонения при анализе не превышает 10 % [142].
Метод газовой хромато-масс спектрометрии. Летучие компоненты
проб были проанализированы на газовом хроматомасс-спектрометре GC-MS
QP2010Ultra (Shimadzu) после гидролиза обезжиренных образцов водорослей
2М раствором трифторуксусной кислоты в течение 8 часов при 100 оС и
последующей дериватизацией до ацетатов полиолов [20]. Обезжиривание
водорослей проводится по методике Блайя и Дайера [135]. Условия
хроматографирования: Колонка капиллярная DB-17MS, диаметр 0,25 мм,
толщина неподвижной фазы 0,25 мкм, длина колонки 30 м, температура
устройства ввода 230 ºС, газ-носитель – гелий, поток через колонку 1 мл/мин.
Относительное значение стандартного отклонения при анализе не превышает
10 %.

44
2.7. Исследование водорослевой клетчатки
2.7.1. Определение содержания целлюлозы

Навеску растительного материала помещали в колбу далее соединяли с


притертым обратным холодильником и приливали смесь из 75 мл 80 %
уксусной кислоты и 5 мл азотной кислоты (уд. вес 1,4). Содержимое колбы
кипятили при осторожном подогревании в течение 20 минут, далее
фильтровали. Клетчатку на фильтре промывали спиртом, затем эфиром,
высушивали и взвешивали [143]. Содержание целлюлозы рассчитывали в
процентах по отношению к исходной навеске на абсолютно сухое вещество.

2.7.2. ИК-спектроскопичекий анализ водорослевой клетчатки

Запись инфракрасных спектров воздушно-сухих образцов клетчатки


производилась на ИК-Фурье-спектрометре Vertex 70 (Bruker, Germany). Для
записи использовалась приставка однократного нарушенного полного
внутреннего отражения GladiATR (PikeTech., USA) с алмазной призмой.
Условия записи спектров: диапазон от 4000 до 400 см-1, разрешение 4 см-1,
128 параллельных сканирований образца.
По окончании измерения производилась ATR-коррекция, необходимая
для компенсации длинноволнового отражения. Программными методами
производилась разметка пиков и расшифровка спектра.

2.7.3. Рентгенографический анализ2

Образцы прессовали в таблетки без связки и рентгенографировали на


дифрактометре ДРОН-6 на монохроматизированном кристаллом
пиролитического графита Fe-K излучении в интервале углов рассеяния от 3
до 145.

2
Исследование проводилось на кафедре физики твердого тела ПетрГУ
45
Степень кристалличности целлюлозы определяли методом Руланда.
Погрешность результата составляет не более 5 %. Установленная
посредством рентгенографических исследований степень кристалличности
характеризует долю молекул, имеющих регулярную упаковку, от полного
числа молекул, участвующих в рассеянии [144, 145].
Для аморфно-кристаллических целлюлозных объектов также
рассчитывали размеры областей кристалличности. Для расчета размеров
областей когерентного рассеяния (ОКР) использовали формулу Шеррера
[146]:
0.94
ш  (1),
Dhkl  cos
где βш – ширина максимума, определяемая из рентгенограммы; λ –
длина волны рентгеновского излучения; Dhkl – искомый эффективный размер
области кристалличности в направлении нормали к отражающим плоскостям
с индексами hkl;  – угол скольжения падающих лучей. Контуры линий
аппроксимировали функциями Гаусса и Коши. В качестве эталонных
объектов использовали образцы отожженных металлов: меди и алюминия.
Для определения относительного содержания различных фаз
целлюлозы в составе целлюлозной кристаллической составляющей образцов
использовался метод полнопрофильного анализа рентгенограмм
поликристаллов [147], реализованный в программе «Метод Ритвельда»
программного комплекса PDWin – 4.0 НПО «Буревестник» [148].

2.8. Медико-биологическая характеристика экстрактов бурых


водорослей
2.8.1. Определение антиоксидантной активности экстрактов

Анализ проводили спектрофотометрически по методу с


использованием DPPH (2,2-дифенил-1-пикрилгидразил). Два мл 0,3 мМ
раствора DPPH в этаноле смешивали с 2 мл разбавленного этанольного

46
экстракта и измеряли снижение оптической плотности растворов при длине
волны 515 нм. В качестве стандарта для сравнения величины
антиоксидантной активности использовали BHA (бутилгидроксианизол).
Величина антиоксидантной активности выражается через EC50 (концентрация
экстракта (мкг/мл), при которой происходит 50 %-ное ингибирование
свободного радикала DPPH в реакционной среде).

2.8.2. Исследование биологической активности3

Определение антисептических свойств. Антисептическую активность


исследовали в отношении аэробных бактерий (Ps. aeruginosa, St. aureus, Kl.
pneumoniaе, Str. pyogenes A, Str. pneumoniaе, Str. faecaflis, Esherichia coli, Bac.
subtilis, Proteus vulgaris), грибов рода Сandida (C. albicans, С. tropicalis) и
нитчатых грибов родов Aspergillus и Mucor. В качестве испытуемого
субстрата использовали водную суспензию фракций 5 пг/мл. Каплю
суспензии наносили на поверхность посева бактериальной взвеси в
концентрации 500 млн. бактерий на мл в объеме 1 мл на поверхность
питательной среды в стандартной чашке Петри. Для культивирования
бактерий использовали мясо-пептонный агар, гноеродные кокки сеяли на
кровяной агар, дрожжеподобные грибы – на среду Сабуро. Оценку
чувствительности производили спустя сутки инкубации посева бактерий и
дрожжеподобных грибов в термостате при 37 °С; посевы плесеней
выдерживали при комнатной температуре 4 дня.
Определение фунгицидных свойств. Для определения
фунгистатического эффекта использовали штаммы грибов С. aldicans, С.
tropicalis, Aspergillus и Mucor. В качестве контроля использовали фитотон.
Определение иммуномодулирующих свойств. Для изучения влияния
субстанций на фагоцитарную активность нейтрофильных лейкоцитов

3
Исследование проводили в Институте Физиологии природных адаптаций УРО РАН, Медицинской
компанией ―Биокор‖
47
человека использовали стандартный опыт определения фагоцитоза частиц
латекса нейтрофилами цитратной крови человека с использованием
суспензий концентрацией 5 пг/мл. Опыты повторяли 10 раз с каждой из
испытуемых субстанций.

2.9. Исследование сорбционных характеристик водорослевой


целлюлозы

Определение удельной поверхности водорослевой клетчатки по


методу низкотемпературной адсорбции азота4. Анализ проводили на
приборе ASAP 2020. Суть метода состоит в анализе сорбции газа твердым
телом при постоянной криогенной температуре и постепенном повышении
давления. Образец исследуемого вещества предварительно очищается путем
нагрева в вакууме либо путем продувки в динамической газовой атмосфере.
После очистки в ячейку с образцом подается небольшое количество газа -
адсорбата, молекулы которого конденсируются на поверхности образца,
постепенно образуя монослой. По количеству газа, ушедшего на образование
монослоя, зная поперечное сечение его молекул и массу образца, можно
судить о величине удельной поверхности этого материала. Удельную
площадь поверхности выражали в м2/г, удельный объем пор выражали в
см3/г.
Метод определения сорбционной емкости по отношению к
метиленовому синему. Для определения осветляющей способности по
метиленовому синему пользовались стандартной методикой по ГОСТ 4453-
74 [149], основанной на фотоколориметрическом определении
светопропускания раствора метиленового голубого до и после обработки
сорбентом. Результат выражали в мг/г в.с. клетчатки. Удельная площадь
поверхности сорбента была рассчитана согласно методике. Навеску образца
массой 1,0 г залили 100 мл раствора метиленового голубого (40 мг/л),

4
Исследование проводили на кафедре Химии и химической технологии САФУ
48
выдерживали 24 часа. Затем раствор профильтровывали и в отработанном
растворе спектроскопически определяли остаточное содержание красителя
[150].
Исследование сорбционной емкости по отношению к тяжелым
металлам. В рамках данной работы была исследована сорбционная
способность очищенной и не очищенной водорослевой клетчатки к ионам
Cd2+, Pb2+, Cr3+ и Ag+ методом Киплинга. Суть этого метода состоит в
следующем: к известной навеске адсорбента добавляют пробу раствора с
известной концентрацией адсорбтива, полученную суспензию встряхивают в
термостате до установления адсорбционного равновесия (обычно в течение
нескольких часов) и отбирают образец раствора для исследования [151].
В качестве объекта сравнения был использован образец
активированного угля марки ―Медисорб‖ и МКЦ.
Эксперименты проводили с растворами солей Cd(NO3)2∙4H2O,
Pb(NO3)2, К2Cr(SO4)2*12H2O и AgNO3 с концентрациями ионов металлов 35-
700 мг/л и 300-4800 мг/л, 60-1000 мг/л и 60-1000 мг/л, соответственно.
В ходе эксперимента в колбу вносили навески сорбентов массой 1,0 г и
добавляли 100 мл раствора соли. Колбы помещали в термостатирующее
устройство с магнитным перемешиванием. По окончании времени сорбции
отбирали пробу раствора с отстоявшегося сорбента. Равновесную
концентрацию ионов металла определяли на атомно-абсорбционном
спектрометре [151].
Зависимость сорбционной емкости от времени контакта фаз. В
эксперименте использовали растворы с концентрацией ионов металлов Cd2+
35 мг/л, и Pb2+ 600 мг/л. В колбы вносили навеску сорбента массой 0,5 г и
добавляли 500 мл раствора соли. Сорбцию проводили в термостатирующем
устройстве (27±1 °C) с магнитным перемешиванием. pH раствора сорбата
соответствовал pH водного раствора исследуемой соли. Время сорбции: 2,5,
5, 10, 15, 60, 240, 480, 1440 минут. По истечении времени отбирали пробу

49
раствора, которую анализировали на остаточное содержание ионов металла
методом атомно-абсорбционной спектроскопии.
Зависимость сорбционной способности от температуры. К навеске
сорбента массой 0,1 г добавляли 100 мл раствора соли и помещали колбу в
перемешивающее устройство с термостатированием. Эксперименты
проводили при температурах 27±1, 32±1, 37±1, 42±1, 47±1 °С. Время сорбции
- 120 минут. pH раствора сорбата соответствовал pH водного раствора
исследуемой соли.
Зависимость сорбционной способности от рН раствора. В 100 мл
раствора соли задавали уровень рН (1,5-5) добавкой концентрированной
азотной кислоты. Верхний уровень рН соответствует водному раствору соли.
Навеску сорбента 1,0 г помещали в колбы и добавляли 100 мл раствора соли.
Сорбцию проводили в термостатирующем устройстве (27 °C) с магнитным
перемешиванием. Время сорбции – 120 минут.
Метод измерения концентрации тяжелых металлов в растворах1
Определение тяжелых металлов в растворах проводили по методике М-
03-505-119-03 [152]. Для анализа использовали атомно-адсорбционный
спектрометр ContrAA 700 (Analytic Jena, Германия) с пламенным
атомизатором. Горючий газ – смесь ацетилен-воздух, скорость потока 60л/ч.
Длина щели горелки 100 мм. Источник излучения – высокоинтенсивная
ксеноновая лампа сплошного спектра. В качестве диспергирующего
устройства выступал двойной Эшелле монохроматор и CCD-детектор. Запись
спектра проводили по трем центральным пикселям, коррекция
неселективного поглощения осуществляли по соседним 50 пикселям.
Рабочие длины волн 228 нм для Cd и 283 нм для Pb. Результаты анализа
выражали в мг/л.
Исследование сорбционной емкости по отношению к
микроорганизмам3. Использован подход с непосредственным подсчетом
содержания микроорганизмов в засеянном объеме фильтрованной через
испытуемый объем взвеси микроорганизмов. К 1,0 г образца добавляли 4 мл

50
физиологического раствора и 1 мл микробной взвеси, содержащей 10000
бактерий в физиологическом растворе. Пробирки с частицами клетчатки и
бактериями встряхивали в течение 1 минуты и оставляли стоять при
комнатной температуре в течение 30 мин. Сорбционная способность
субстанций оценена по разнице содержания микроорганизмов до и после
контакта с водными суспензиями испытуемых субстанций. Над осадочную
часть испытывали путем посева шпателем 0,1 мл на плотные питательные
среды для подсчета количества колоний. Известно, что колония является
потомством 1 микробной клетки. Для бактерий использовали стандартный
мясо-пептонный агар, для дрожжеподобных грибов применяли сахарный
мясо-пептонный агар Сабуро. Посевы бактерий выдерживали при 37 ОС в
течение 1 суток, посевы дрожжеподобных грибов - 3 суток. Исследования
дублированы с каждой культурой 10 раз.

51
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ФРАКЦИОННОГО ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА
БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ)

3.1. Макро- и микроэлементный состав биомассы

Анализ литературных источников показал недостаточную изученность


минерального состава арктических бурых водорослей. Как отмечалось ранее,
минеральные вещества в биомассе находятся в виде солей и органических
комплексов. К ним относятся водорастворимые (КСl, K2SO4) и
нерастворимые соли (СаSО4, СаСО3), а так же органо-минеральные
соединения.
Избыточные количества металлов связываются различными
соединениями клеточной стенки. Например, в исследовании проведенном
Некрасовой с соавторами [153] показано, что накопление Cu2+, Cd2+, Ni2+
гидрофитами происходит различными фракциями соединений. В связывании
Cu2+ участвуют как белковые, так и небелковые фракции, связывание Ni2+
происходит преимущественно белками, тогда как Cd2+ накапливается
полисахаридами. При этом накопление ионов металлов белковой фракцией
связывают со специфичными белками-металлотионеинами, богатыми
цистотеином и сульфатными группами.
В работе Амининой [154] исследован процесс экстракции минеральных
веществ (Ca, Na, K, Mg, Fe, Mn, Cu, Ni, Co, Zn, Sr, Pb, As) из биомассы бурых
водорослей. Результаты показывают, что обработка водоросли пищевыми
растворителями (вода, растворы кислот и этилового спирта) позволяет
извлечь из них элементы пропорционально их концентрации в водоросли.
Анализ показал, что состав экстрактов зависит от вида обработки водорос-
лей. Например, кальция, железа, марганца, цинка и стронция больше
содержится в кислом экстракте, натрия и меди — в спиртовом экстракте.
Причем основное количество меди присутствует в составе липидной
фракции. Из токсичных элементов, кадмия больше всего концентрируется в

52
кислом экстракте, а мышьяка и свинца — в спиртовом. При
концентрировании и разделении спиртового экстракта большее количество
свинца переходит в водную фракцию. Мышьяк присутствует в составе как
липидной фракции, так и во фракции водорастворимых соединений. При
рассмотрении остатков водорослей после кислотной экстракции, то в них
также обнаружилось меньше всего кальция, цинка, стронция и кадмия.
Вероятно, эти металлы в основном связаны с полисахаридами и максимально
удаляются при обработке водорослей раствором кислоты. Обработка
водорослей раствором этилового спирта приводит к удалению значительного
количества мышьяка, но к увеличению в водорослевых остатках
концентраций железа и свинца по сравнению с исходным сырьем, на
основании чего, был сделан вывод, что последние два элемента, скорее всего,
входят в состав трудно растворимых белковых соединений [154].
Важным свойством полифенолов является способность образовывать
комплексы с ионами тяжелых металлов. Ионы металлов в живых организмах
играют огромную роль, обеспечивая функционирование ферментных систем
клетки и участвуя в создании мембранных потенциалов. Типы и
устойчивость комплексных соединений флавоноидов зависят от
расположения гидроксильных групп в молекуле флавоноида, размера и
заряда ионов, а так же других факторов. Литературные данные об
устойчивости комплексных соединений кверцетина с металлами
свидетельствуют о прочности этих соединений [155, 156]. С увеличением
радиуса иона металла устойчивость соединений увеличивается.
Взаимодействие флавоноидов с металлами в биологической среде связано,
прежде всего, с ферментативными реакциями [157] и, вероятно, избыточные
количества металлов полифенолами не связываются.
Одним из наиболее активных водорослевых полимеров, связывающих
тяжелые металлы, являются альгиновые кислоты. Так, Тунаковой с
соавторами установлен ряд катионов в порядке возрастания их сродства к
альгиновой кислоте, т.е., если в ней крепче связывается какой-то катион, то

53
другой катион, имеющий меньшее сродство к альгиновой кислоте,
вытесняется из соединения. ―Катионы свинца, меди, бария, стронция имеют
большее сродство к альгиновой кислоте, чем, например, катионы натрия.
Поэтому катионы свинца будут вытеснять из альгината натрия катионы
натрия, а сами крепко связываться с альгиновой кислотой. В результате
исследований ионно-обменной способности альгиновой кислоты металлы по
сорбируемости на ней расположили в общий ряд: Ва > РЬ > Сu > Sr > Cd > Са
> Zn > Ni > Со > Мn >Fе >Mg‖ [158].
Таким образом, защитные механизмы гидробионтов заставляют
избыток минеральных веществ находиться в связанном состоянии, прежде
всего в комплексе с полисахаридами и белками, в клеточной стенке
макрофитов. Исходя из этого, чем выше минерализация биомассы, тем
больше водорослевых компонентов находятся в связанном состоянии в виде
органо-минеральных комплексов. В связи с чем, для исследования
особенностей накопления минеральных веществ бурыми макрофитами
западного сегмента Арктики, была произведена оценка элементного состава
и общей зольности образцов.
Основными факторами, влияющими на содержание минеральных
элементов в водорослях являются: гидрологические, гидрохимические и
гидродинамические параметры состояния вод, а так же широта района
произрастания, определяющая длину дня и температурный режим вод [75].
Так, произрастание водорослей в зонах опреснения воды ведет к снижению
уровня накопления солей в тканях из-за их выщелачивания. Растения,
развивающиеся в сублиторали, всегда содержат больше солей, чем растущие
на литорали.
Солѐность (общая минерализация) является одной из основных
характеристик водных масс. Особую роль она играет в формировании
биологической продуктивности морей и океанов, так как многие организмы
очень восприимчивы к незначительным еѐ изменениям. Исходя из этого,
очень важно знать гидрохимические особенности точек отбора проб

54
макрофитов (таблица 3.1). Соленость водных масс Баренцева моря
значительно отличается от солености водной массы Белого моря, на которую
сильное опресняющее воздействие оказывает континентальный сток.
Следовательно, в этих морях создаются различные условия определяющие
рост и развития водорослей. Исходя из этого, мы можем проследить
зависимость между соленостью воды и массовой долей минеральных
веществ в водорослях (таблица 3.2).

Таблица 3.1. Характеристика морских вод прибрежной зоны в точках отбора проб
водорослей в Белом и Баренцевом морях
Катионный состав морской воды, г/л
Точка отбора Соленость, ‰ pH Na+ Mg+ K+ 2+
Ca
Баренцево море
Остров Скотт-Келти 33,0 8,4 нд н/д н/д н/д
Мыс Желания 34,2 8,2 н/д н/д н/д н/д
Залив Русская Гавань 34,5 8,3 7,4 0,7 0,25 0,33
Оранские остров 34,3 8,3 9,6 1,1 0,37 0,41
Мыс Канин Нос*) 29,1 8,3 10,5 1,5 0,56 0,58
Белое море
Остров Сосновец*) 28,9 8,3 8,8 1,0 0,36 0,28
Остров Большой Соловецкий 25,0 8,1 6,7 0,7 0,30 0,17
Остров Русский кузов 23,8 8,1 8,9 0,9 0,45 0,37
*) точки являются зонами смешения водных масс Белого и Баренцев моря

Для ламинариевых водорослей очевидна тенденция к увеличению


содержания минеральных веществ с увеличением солености воды (таблица
3.2). Для Fucus vesiculosus такая тенденция не прослеживается, возможно, из-
за особенностей произрастания в литоральной зоне [159]. Содержание
минеральных веществ в биомассе ламинариевых водорослей значительно
выше, чем в фукусовых, – 23,1-43,2 %масс и 20,9-25,1 %масс соответственно
(таблица 3.2). При этом наибольшая зольность у ламинариевых водорослей
наблюдается в самых северных точках отбора проб (остров Скотт-Келти,
архипелага Земля Франца-Иосифа) и в горле Белого моря (остров Сосновец),
где значения зольности в среднем 40 %масс. Из ламинариевых водорослей к
накоплению минеральных веществ более подвержена Laminaria digitata.
Содержание различных элементов для двух семейств бурых
водорослей (ламинариевые и фукусовые) значительно отличается. Эта

55
тенденция к различной степени накопления большинства элементов
сохраняется в каждой точке отбора проб. При этом внутри одного семейства
характерны сравнительно близкие значения содержания макро- и
микроэлементов.

Таблица 3.2. Влияние солености морской воды на зольность водорослей*)


Средняя соленость Среднее содержание минеральных веществ
Область воды в точках отбора бурых водорослях, %масс
проб, ‰ S.latissima L.digitata F.vesiculosus
Баренцево
34,0 30,8 29,5 22,6
море
Белое
24,4 25,5 27,7 23,4
море
*) при расчете средней солености и средних значений содержания минеральных веществ точки отбора проб в зоне
смешения водных масс Белого и Баренцева морей не учитывались (мыс Канин нос и остров Сосновец).
Среднее содержание минеральных веществ ± 5 %отн, средняя соленость воды ± 0,5 %отн

Такие элементы как железо, магний, кальций, сера, кремний и


алюминий в большей степени накапливаются фукусовыми водорослями, а
накопление йода, титана, калия и хлора более выражено в ламинариевых
водорослях (таблица 3.3). Сильных различий в накоплении брома, хрома,
натрия, фосфора, стронция, цинка и меди между ламинариевыми и
фукусовыми водорослями не наблюдается и концентрации этих элементов в
разных образцах водорослей отличается незначительно. Единственное, что
следует отметить, это сильное превышение содержания фосфора в
ламинариевых водорослях, отобранных в крайней северной точке маршрута
экспедиции (остров Скотт-Келти, архипелага Земля Франца-Иосифа).
Из минеральных элементов наибольшую ценность представляют
биогенные микро- и макроэлементы: калий, магний, кальций, железо,
марганец, селен и др. Но наиболее важный элемент, содержащийся в бурых
водорослях – йод [160].

56
Таблица 3.3. Содержание макро и микро элементов в биомассе бурых водорослей, %масс
Вид во- Элемент Золь-
Точка отбора проб
доросли I Br Fe Cr Ti Mg Na Ca K Cl S P Si Sr Zn Cu Al Pb ность, %
Баренцево море
l.s. 0,33 0,11 0,05 0,03 0,03 0,79 5,09 1,46 9,95 13,98 1,23 0,31 0,33 0,06 0,01 0,01 0,07 следы 30,0
Русская гавань l.d. 0,27 0,08 0,04 0,3 0,02 0,62 3,33 1,02 9,83 11,62 1,18 0,27 0,17 0,06 0,01 0,01 0,03 следы 26,8
f.v. 0,02 0,04 0,17 0,02 0,02 1,11 3,83 1,56 4,54 6,96 2,32 0,31 0,82 0,04 0,01 0,01 0,22 следы 20,9
l.s. 0,18 0,18 0,06 Н.п.о. 0,02 0,83 5,09 1,66 11,78 15,85 1,28 0,34 0,30 0,10 0,01 0,002 0,04 0,0002 29,4
Оранские острова l.d. 0,42 0,11 0,04 Н.п.о. 0,04 0,73 3,66 1,36 11,96 14,77 1,20 0,31 0,35 0,10 0,01 0,002 0,03 0,0008 29,3
f.v. 0,09 0,08 0,26 Н.п.о. 0,02 1,18 4,84 1,43 7,36 11,41 2,19 0,40 0,93 0,07 0,01 0,002 0,11 следы 23,2
l.s. 0,62 0,15 0,06 0,05 0,05 0,90 6,14 1,98 18,90 21,23 1,23 0,95 0,25 0,09 0,01 0,002 0,06 следы 41,1
О-в Скотт-Келти
l.d. 0,34 0,20 0,07 0,05 0,03 1,20 6,66 2,19 19,78 22,76 1,83 1,12 0,21 0,10 0,02 0,01 0,04 следы 39,1
l.s. 0,22 0,06 0,06 0,03 0,02 0,79 4,43 1,24 6,90 10,88 1,13 0,29 0,27 0,05 0,02 0,02 0,06 0,0004 24,2
l.d. 0,36 0,07 0,05 0,03 0,09 0,81 3,38 1,20 6,75 8,95 1,43 0,31 0,15 0,07 0,01 0,01 0,03 0,0007 23,4
Мыс Желания
f.v. 0,03 0,07 0,21 0,03 0,02 1,14 4,07 2,29 4,54 7,76 2,20 0,35 1,12 0,06 0,01 0,01 0,25 Н.п.о. 23,3
l.s. 0,15 0,06 0,03 0,03 0,02 0,74 3,98 1,36 7,05 10,58 0,70 0,19 0,12 0,05 0,01 0,01 0,03 Н.п.о. 23,1
Мыс Канин нос
l.d. 0,31 0,12 0,06 0,03 0,03 0,99 5,02 1,68 10,63 13,76 1,64 0,30 0,25 0,11 0,01 0,02 0,05 Н.п.о. 32,3
Белое море
l.s. 0,21 0,15 0,04 0,04 0,02 1,17 6,04 2,06 15,01 18,41 1,63 0,32 0,13 0,07 0,007 0,01 0,01 0,0003 43,2
l.d. 0,24 0,09 0,05 0,03 0,02 0,97 4,21 1,47 10,49 12,85 1,77 0,27 0,14 0,08 0,009 0,02 0,01 следы 31,5
о. Сосновец
f.v. 0,09 0,07 0,04 0,03 0,01 1,59 7,26 1,39 5,97 12,66 2,78 0,27 0,19 0,07 0,02 0,01 0,03 0,0012 32,7
a.n. 0,10 0,14 0,10 Н.п.о. 0,01 1,20 4,60 1,92 6,41 9,76 2,98 0,29 0,51 0,11 0,02 0,01 0,04 Н.п.о. 21,2
l.s. 0,20 0,10 0,04 0,03 0,02 0,86 4,58 1,47 7,59 10,71 1,10 0,34 0,20 0,07 0,004 0,01 0,02 0,0002 21,6
l.d. 0,20 0,10 0,04 0,03 0,02 0,85 3,96 1,54 8,99 11,13 1,67 0,27 0,13 0,09 0,008 0,01 0,01 0,0006 25,1
о. Б.Соловецкий
f.v. 0,06 0,07 0,10 0,03 0,01 1,44 5,75 1,53 5,16 8,81 2,32 0,23 0,39 0,07 0,004 0,02 0,06 следы 25,1
a.n. 0,06 0,18 0,10 Н.п.о. 0,01 1,42 4,06 2,21 5,43 5,61 3,29 0,30 0,56 0,09 0,006 0,01 0,08 Н.п.о. 19,6
l.s. 0,28 0,08 0,03 Н.п.о. 0,02 0,68 4,06 1,07 9,67 13,52 0,87 0,27 0,13 0,06 0,005 0,01 0,03 Н.п.о. 29,4
l.d. 0,22 0,14 0,05 Н.п.о. 0,02 0,98 4,59 1,86 11,40 14,36 1,84 0,39 0,51 0,16 0,004 0,002 0,04 Н.п.о. 30,3
о. Русский Кузов
f.v. Н.п.о. 0,07 0,08 Н.п.о. 0,01 1,76 8,75 1,79 5,52 14,02 2,50 0,23 0,34 0,08 0,004 0,002 0,06 Н.п.о. 22,4
a.n. 0,02 0,12 0,09 Н.п.о. 0,01 1,41 5,03 2,96 5,33 7,99 3,65 0,27 0,49 0,13 0,006 0,002 0,06 Н.п.о. 21,2
l.s. 0,13 0,13 0,04 0,03 0,01 0,81 5,28 1,38 11,76 15,05 1,34 0,39 0,10 0,07 0,004 0,002 0,01 Н.п.о. 19,9
l.d. 0,15 0,11 0,03 0,03 0,01 1,05 5,56 1,42 11,76 13,65 2,12 0,47 0,15 0,11 0,005 0,002 0,02 Н.п.о. 29,2
о. Б.Соловецкий *)
f.v. Н.п.о. 0,09 0,08 0,02 0,01 1,06 5,29 1,84 4,50 6,44 2,47 0,31 0,52 0,11 0,004 0,004 0,08 Н.п.о. 22,6
a.n. Н.п.о. 0,12 0,06 0,03 0,01 1,52 5,63 2,72 4,95 7,24 3,66 0,34 0,39 0,14 0,007 0,01 0,05 Н.п.о. 23,7
* образцы отобранные в июне 2011г. Остальные образцы отобраны в 2012 году.
Н.п.о. – ниже предела обнаружения
В отличие от наземных растений и животных, которые содержат
незначительные количества йода, в водорослях обнаруживаются
значительные количества этого вещества [161]. В нашем исследовании были
обнаружены концентрации йода от 0,148 до 0,619 %масс для ламинариевых
водорослей и от 0 до 0,102 %масс для фукусовых (таблица 3.3). В образцах
исследованных ламинариевых водорослей различий между накоплением
йода не обнаружено, а из двух фукусовых водорослей накопление йода более
выражено в образцах Ascophyllum nodosum. Однако следует отметить, что
среднее содержание йода в образцах ламинариевых водорослей из Баренцева
моря в 1,5 раза выше, чем в образцах, отобранных в Белом море (0,321 и
0,225 %масс соответственно). Это можно объяснить более высокой
соленостью Баренцева моря по сравнению с Белым (таблица 3.1). В работе
Коровкиной и др. [162] так же отмечена положительная зависимость между
соленостью и содержанием йода.
Несмотря на то, что существуют литературные данные о
положительной зависимости между содержанием ионов Mg2+, Ca2+, K+ и Na+
в воде и накоплением этих элементов в водорослях [15], в ходе наших
исследований эти тенденции не выявлены.
Распределение макро- и микроэлементов в бурых водорослях,
обладающих богатым минеральным составом, зависит в большей степени от
семейства, к которому принадлежит водоросль, чем от места произрастания.
Экологическое состояние мест произрастания бурых водорослей
оценивалось по содержанию в биообразцах тяжелых металлов: свинца и
ртути (таблица 3.3). Наиболее опасным для человека элементом, из
рассматриваемых в нашей работе, является ртуть [18].
По результатам проведенного анализа образцов бурых водорослей
установлено наличие лишь следов ртути, что соответственно не превышает
нормативных показателей [163].
Свинец так же является токсичным тяжелым металлом, часто
встречающимся в зонах, подверженных антропогенному воздействию. В

58
большинстве образцов данный элемент не был найден, однако в некоторых
образцах были обнаружены концентрации от 0,0002 до 0,0012 %масс
(таблица 3.3), что, впрочем, является слабым превышением естественного
фона.
Подобные результаты по содержанию свинца и ртути, в образцах
бурых водорослей из акватории Белого моря, были получены в ходе
исследования Подкорытовой и др. в 2009 году [20].
Таким образом, изучен состав минеральной фракции арктических
бурых водорослей. Исследование тенденций накопления минеральных
веществ биомассой бурых водорослей показало значительное влияние
солености и катионного состава морской воды на общую минерализацию и
макро- и микроэлементный состав макрофитов. Установлено, что
Беломорские водоросли характеризуются меньшим количеством
минеральных веществ в биомассе, в сравнении с макрофитами из Баренцева
моря, что несомненно сказывается на содержании органо-минеральных
комплексов в органической фракции. Можно утверждать, что органические
компоненты Баренцевоморских макрофитов в большей степени связаны в
комплексы с металлами. Соответственно, Беломорские макрофиты
представляют большую промышленную ценность.

3.2. Изучение состава органической компоненты биомассы


водорослей

Влияние природно-климатических факторов в условиях


изменяющегося климата высоких широт проявляется в изменении
количественного и качественного состава органической составляющей
биомассы водорослей.

59
3.2.1. Липидно-пигментный комплекс

Пигменты. В данном исследовании экспериментально определено


суммарное содержание хлорофиллов и каротиноидов. Содержание
хлорофиллов варьируется от 0,005 до 0,045 %масс от абсолютно сухой массы
водорослей, а содержание каротиноидов - от 0,005 % до 0,0250 %масс.
Наибольшим содержанием пигментов характеризуются виды l.digitata и
f.vesiculosus. При этом, при движении с севера на юг прослеживается
тенденция к увеличению содержания как хлорофилла, так и каротиноидов
(рисунок 3.1, 3.2).
Таким образом, фукусовые водоросли являются более ценными
источниками хлорофилла и каротиноидов, чем ламинариевые. Хотя бурые
водоросли сравнительно бедны пигментами, они могут являться
перспективным источником данных биологически активных веществ, ввиду
высоких урожаев и высокой степени возобновляемости данного вида сырья.

0,05
s.latissima l.digitata f.vesiculosus a.nodosum
0,04
Содержание хлорофилла, %масс

0,03

0,02

0,01

0,00

точка отбора проб


Рисунок 3.1. Содержание хлорофилла в образцах бурых водорослей

60
0,0250
S.latissima l.digitata f.vesiculosus a.nodosum

Содержание каротиноидов , %масс


0,0200

0,0150

0,0100

0,0050

0,0000

Точка отбора пробы


Рисунок 3.2. Содержание каротиноидов в образцах
бурых водорослей

Состав жирнокислотной фракции


В соответствии с данными, полученными при экстракции
традиционным методом, исследуемые образцы водоросли вида L.digitata
содержат жирные кислоты 0,35 %масс от массы воздушно-сухого образца
водоросли, а водоросли вида F.vesiculosus – 1,61 %масс.
Согласно данным, полученным методом газовой хроматографии
(таблицы 3.4 и 3.5) исследуемые образцы содержат кислоты разной степени
насыщенности, основными компонентами являются миристиновая,
пальмитиновая и олеиновая жирные кислоты. Экспериментально
подтверждено, что основными насыщенными жирными кислотами
рассмотренных водорослей являются миристиновая и пальмитиновая.
Причем, если содержание пальмитиновой кислоты в l.digitata выше, чем в
f. vesiculosus на 30 %, то содержание миристиновой кислоты выше в
f.vesiculosus (таблица 3.4 и 3.5). Эти типы водорослей характеризуются
высоким содержанием олеиновой кислоты (32,7 %отн для f.vesiculosus и 17,1
%отн для l.digitata). Кроме того, в обоих видах водорослей обнаружено

61
относительно высокое содержание ω-3 и ω-6 полиненасыщенных жирных
кислот – линолевой, α-линоленовой, стеаридоновой, арахидоновой и
эйкозапентановой кислот. В целом, соотношение жирных кислот в образцах
обоих видов довольно схоже с литературными данными [20, 31, 164].
На рисунке 3.3 представлен пример хроматограммы жирнокислотного
состава пробы fucus veiculosus.
.

Рисунок 3.3. Хроматограмма полного ионного тока метиловых эфиров


жирных кислот водоросли вида Fucus vesiculosus
1 – С 14:0; 2 – С 16:0; 3 – С 16:1; 4* – С 17:0; 5 – С 18:0; 6 – С 18:1; 7 – С 18:2;
8 – С 19:0; 9 – С 18:3; 10 – С 18:4; 11 – С 20:4; 12 – С 20:5 *- внутренний стандарт

Суммарное содержание ПНЖК в f.vesiculosus 40,5 %отн (ω-3 – 17,8


%отн, ω-6 – 22,7 %отн), в l.digitata – 49,9 %отн (ω-3 – 33,2 %отн,
ω-6 – 16,7 %отн) (таблица 3.4 и 3.5). Хотя суммарное содержание ПНЖК в
l.digitata выше, чем в f.vesiculosus на 10 %отн, при этом абсолютное
содержание жирных кислот в f.vesiculosus в 3 раза выше, что делает
f.vesiculosus гораздо более ценным источником ПНЖК.

62
Таблица 3.4. Процентное соотношение жирных кислот в водоросли вида Fucus
vesiculosus
Содержание жирных кислот, %отн
Жирная кислота По литературным данным
Экспериментально
[20] [164] [31]
Миристиновая C14:0 10,2 ± 0,9 14,4 ± 0,5 10,8 20,3
Пентадекановая C15:0 0,4 ± 0,03 не обн 0,3 не обн
Пальмитиновя С 6:0 13,3± 1,4 16,4 ± 1,1 8,2 18,3
Пальмитоленовая С16:1 (n-7) 0,8± 0,8 0,9 ± 0,1 4,9 2,2
Олеиновя С18:1 (n-9) 32,0 ± 1,9 29,9 ± 2,6 26,8 21,8
Линолевая С18:2 (n-6) 12,7 ± 12,0 8,6 ± 0,3 12,0 9,7
α-Линолновая С18:3 (n-3) 4,8 ± 0,5 4,9 ± 0,8 2,6 5,2
Стеаридоновая С18:4 (n-3) 3,8 ± 2,7 4,9 ± 0,5 2,2 4,9
Эйкосеновая 20:1 (n-9) 0,5 ± 0,1 не обн 0,7 не обн
Арахидоновая 20:4 (n-6) 10,0 ± 1,3 10,6 ± 0,5 7,1 8,7
Эйкозапентаеновая 20:5 (n-3) 8,0 ± 1,8 5,6 ± 0,5 не обн 4,7
Эук вая 22:1 (n-9) 0,7 ± 0,1 не обн 0,8 не обн
Σ(НЖК) 23,9 ± 2,3 4,0 ±1,1 22,7 41,1
Σ(МНЖК) 34,7 ± 2,3 31,5 ± 2,4 36,4 4,1
Σ(ПНЖК) 40,5± 4,5 34,6 ± 1,3 39,7 35,5
* Σ(НЖК) – сумма насыщенных жирных кислот, Σ(МНЖК) – сумма мононенасыщенных жирных кислот,
Σ(ПНЖК) – сумма полиненасыщенных жирных кислот, «не обн» – не обнаружено

Таблица 3.5. Соотношение жирных кислот в водоросли вида laminaria digitata


Содержание жирных кислот, %отн
Жирная кислот По литературным данным
Экспериментально
[20] [31]
Миристиновая C14:0 7,3 ± 0,3 10,5 8,9
Пентадекановая C15:0 0,2 ± 0,1 не обн не обн
Палмитиновая С16:0 19,4 ± 0,6 29,8 19,8
Пальмитоленовая С16:1 (n-7) 2,6 ± 0,2 2,0 не обн
Олеинвая С18:1 (n-9) 17,1 ± 0,3 13,6 14,3
Линолевая С18:2 (n-6) 8,8 ± 0,2 4,6 не обн
α-Линоленовая С18:3 (n-3) 8,5 ± 1,6 5,5 7,9
Стеаридоновая С18:4 (n-3) 11,1 ± 0,1 9,0 19,8
Арахидоновая 20:4 (n-6) 7,9 ± 0,6 8,7 8,0
Эйкозапентаеновая 20: (n-3) 13,6 ± 1,1 12,5 8,3
Σ(НЖК) 26,9 ± 2,0 41,3 ± 5,2 29,4
Σ(МНЖК) 19,7 ± 0,5 17,8 ± 0,9 18,1
Σ(ПНЖК) 49,9 ± 3,4 40,9 ± 4,5 51,5
* Σ(НЖК) – сумма насыщенных жирных кислот, Σ(МНЖК) – сумма мононенасыщенных жирных
кислот, Σ(ПНЖК) – сумма полиненасыщенных жирных кислот, «не обн» – не обнаружено

Таким образом, уточнен жирнокислотный состав арктических бурых


водорослей, установлено, что наиболее перспективным источником
комплекса жирных кислот арктических бурых водорослей, из

63
рассмотренных, является F.vesiculosus, поскольку этот вид характеризуется
наиболее высоким содержанием данных соединений.

3.2.2. Полифенольные соединения

На рисунке 3.4 показано общее содержание полифенолов в образцах


бурых водорослей видов F.vesiculosus и A.nodosum в зависимости от места
произрастания.
В основном, наибольшее содержание полифенолов обнаружено у вида
F.vesiculosus, произрастающего в Белом море в акватории о. Бол. Соловецкий
и о. Русский Кузов (19,2 % и 16,5 %, соответственно). Вид A.nodosum так же
содержит полифенолов, но в меньшем количестве.
Установлено, что содержание полифенолов в бурых водорослях вида
L.digitata и s.latissima мало, наибольшее количество найдено у вида L.
digitatа, произрастающего в Лонгиире (0,1 %масс) и у острова Скотт-Келти
(0,1 %масс).
Наиболее ценным видом из арктических промысловых бурых
водорослей, для получения полифенольной фракции, является фукус
пузырчатый, отобранный в Белом море.
Показано, что арктические бурые водоросли могут служить
перспективным источником выделения полифенолов. Наиболее ценным
видом из арктических бурых водорослей, для получения полифенолов,
является Fucus vesiculosus, отобранный в Белом море.

64
Fucus vesiculosus Ascophyllum nodosum

Содержание полифенолов, % масс.


20,0
18,0
16,0
14,0
12,0
10,0
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0

Рисунок 3.4. Содержание полифенолов в фукусовых водорослях

3.2.3. Азотсодержащие вещества

На рисунке 3.5 показано общее содержание аминокислот в образцах


бурых водорослей. Суммарное содержание аминокислот варьируется в
широких пределах от 3,9 до 10,1 %масс, и при этом в гораздо большей
степени зависит от условий произрастания, нежели от таксономической
принадлежности образца.
Многие аминокислоты синтезируются в организме, некоторые же,
необходимые для синтеза белков аминокислоты, не синтезируются в
организме и должны поступать с пищей. Такие аминокислоты называют
незаменимыми. К ним относятся: аргинин, валин, гистидин, изолейцин,
лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан, фенилаланин. Аргинин и
гистидин являются незаменимыми только для детей первого года жизни; в
организме взрослого человека они синтезируются. В образцах бурых
водорослей было обнаружено 20 аминокислот, в том числе все незаменимые
аминокислоты.
В таблицах 3.6, 3.7, 3.9, 3.10 показан аминокислотный состав
изученных образцов бурых водорослей. Доля заменимых аминокислот
варьируется от 55,4 %отн до 67,7 %отн, при этом средняя доля заменимых

65
аминокислот для ламинариевых водорослей 60,1 %отн, а для фукусовых
62,8 %отн.

Рисунок 3.5. Содержание аминокислот в образцах бурых водорослей, %мас

Основная доля аминокислот во всех образцах бурых водорослей


приходится на аспаргиновую кислоту (5,3-9,0 %отн) глутаминовую кислоту
(8,8-22,8 %отн), аланин (7,4-15,0 %отн). В исследованных образцах
соотношение основных аминокислот примерно одинаково, значительно
отличается лишь их суммарное содержание. Доля аминокислот от
суммарного их содержания слабо зависит от места произрастания,
исключением являются фосфосерин и таурин, доля которых в значительной
степени варьируется. В фукусовых водорослях содержится значительно
большее количество глутаминовой кислоты, чем в ламинариевых, доли
остальных аминокислот в фукусовых и ламинариевых водорослях имеют
близкие значения. По результатам анализов количество общего азота в
биомассе варьируется в широких пределах от 0,6 до 1,8 %масс. Общее
содержание белка, которое сильно коррелирует с содержанием общего азота
в биомассе (таблица 3.8).

66
Таблица 3.6. Доля аминокислот от их суммарного содержания в образцах
saccharina latissima
Доля аминокислот в % от общего содержания
Залив Остров Мыс Остров остров Остров
Аминокислта Орански Мыс
Русская Скотт- Желани Соснове Большой Русский
е острова Нос
Гавань Келти я ц Соловецкий Кузов
Заменимые аминокислоты
фосфосерин 1,1 0,4 1,6 0,5 1,1 1,3 0,6 0,5
таурин 1,9 6,3 0,8 0,8 3,0 7,4 1,8 5,8
аспаргиновая к-та 5,4 7,9 6,2 6,0 6,8 7,9 6,7 5,7
Серин 3,7 4,4 4,2 4,1 4,9 4,0 4,2 4,7
Глутаминовая к-та 11,3 12,1 11,5 9,3 9,2 12,5 9,6 11,5
Пролин 8,3 5,7 7,8 7,9 5,9 5,6 5,4 8,0
Глицин 4,9 5,8 5,5 5,2 5,9 5,6 5,6 4,6
Аланин 13,7 10,8 13,6 1,2 8,9 9,2 7,7 15,5
Цистатионин 1,0 1,5 1,0 1,0 0,4 0,2 0,5 1,0
Тирозин 3,1 2,2 2,6 3,1 3,3 2,1 2,7 2,6
Сумм. доля
61,9 60,3 60,1 59,5 55,4 61,3 59,6 64,5
зам.АК
Незаменимые аминокислоты
Фнилаланин 4,3 5,1 4,8 4,5 5,7 5,0 5,4 3,9
Метионин 0,8 1,3 0,9 1,8 0,7 1,8 0,8 1,3
Лизин 4,3 4,5 4,5 4,5 5,1 4,5 4,5 4,3
Гистидин 1,2 1,4 1,3 1,2 1,5 1,5 1,6 1,2
Аргинин 3,3 3,9 3,9 4,1 4,1 3,8 3,9 3,5
Треонин 5,6 5,1 4,9 5,7 5,2 5,2 5,0 4,9
Валин 5,4 6,0 6,2 6,5 7,6 5,6 6,6 5,6
Изолейцин 4,4 4,5 4,5 4,6 5,4 4,1 4,9 3,9
Лейцин 7,4 7,8 7,3 7,5 8,8 7,2 7,4 7,0
Сумм. доля
38,1 39,7 37,9 40,5 44,7 38,9 40,1 35,5
незам.АК

Таблица 3.7. Доля аминокислот от их суммарного содержания в образцах l.digitata


Доля аминокислот в % х от общего содержания
Залив Остров Мыс остров Остров
Аминокислота Оранские Мыс Остров
Русская Скотт- Жела Большой Русский
острова Нос Сосновец
Гавань Келти ния Соловецкий Кузов
Заменимые аминокислоты
фосфосерин 1,4 1,0 1,4 0,8 1,2 1,3 0,5 1,0
таурин 2,5 3,7 0,8 4,5 4,9 2,8 8,6 8,5
аспаргиновая к-та 6,2 6,6 7,0 6,6 7,2 7,2 7,9 7,2
Серин 4,3 4,5 4,7 4,7 4,9 4,8 4,6 4,5
Глутаминовая к-та 10,5 9,7 11,4 9,7 8,8 8,5 9,3 9,4
Пролин 6,6 6,0 6,2 6,1 5,6 5,5 6,8 5,0
Глицин 5,1 5,2 6,0 5,5 5,4 5,2 5,2 5,1
Аланин 14,8 14,3 12,0 12,6 10,4 13,2 10,0 12,6
Цистатионин 0,6 0,7 0,3 0,8 0,7 1,0 0,9 0,6
Тирозин 2,7 2,7 2,5 2,8 3,0 2,9 2,5 2,2
Сумм. доля
зам.АК 61,6 60,4 59,3 58,8 58,3 57,8 60,0 60,7
Незаменимые аминокислоты
Фенилаланин 4,4 4,5 4,9 4,7 4,5 4,9 4,9 4,7
Метионин 0,9 1,2 0,9 1,2 1,1 1,2 0,7 0,9
Лизин 4,7 4,9 5,5 5,1 5,2 5,2 4,9 4,9
Гистидин 1,4 1,5 1,6 1,5 1,6 1,8 1,7 1,7
Аргинин 3,9 4,0 4,0 4,5 4,0 4,0 4,2 3,8
Треонин 5,3 5,5 5,5 5,4 5,8 6,0 5,7 5,2
Валин 6,2 6,3 6,4 6,5 6,7 6,7 6,1 6,2
Изолейцин 4,4 4,4 4,6 4,5 4,7 4,7 4,4 4,4
Лейцин 7,3 7,3 7,6 7,6 7,7 7,8 7,4 7,3
Сумм. доля
незам.АК 38,4 39,6 40,7 41,2 41,7 42,2 40,0 39,3

67
Таблица 3.8. Содержание общего азота в образцах бурых водорослей
Содержание общего азота, %
Баренцево море Белое море
Вид Залив Остров Остров Остров
Оранские Мыс Мыс Остров
Русская Скотт- Большой Русский
острова Желания Нос Сосновец
гавань Келти Соловецкий Кузов
S.latissima 1,8 1,8 2,2 1,0 0,6 1,5 0,6 1,8
L.digitata 1,7 1,6 1,1 1,4 1,3 1,5 0,9 1,7
F.vesiculosus 1,8 1,6 - 1,3 - 1,4 0,7 1,0
A.nodosum - - - - - 1,3 1,5 1,1

Таблица 3.9. Доля аминокислот от их суммарного содержания в образцах fucus vesiculosus


Доля аминокислот в процентах от общего содержания
Аминокислота Залив Русская Оранские Мыс Остров остров Большой Остров Русский
Гавань острова Желания Сосновец Соловецкий Кузов
Заменимые аминокислоты
фосфосерин 0,8 0,5 0,9 1,3 1,5 1,9
таурин 0,4 3,1 1,2 2,9 1,7 2,1
аспргиновая кислота 7,2 6,8 7,3 8,1 9,4 8,2
Серин 3,6 3,3 3,9 4,2 3,9 4,5
Глутаминовая кислота 3,1 27,5 20,4 14,9 20,0 15,1
Пролин 6,2 5,6 7,3 7,9 6,3 7,3
Глицин 4,7 4,5 4,9 4,9 4,7 5,3
Аланин 6,8 6,4 6,9 7,1 6,2 7,3
Цистатионин 0,4 0,4 0,5 0,4 0,4 0,4
Тирозин 1,0 1,7 2,2 2,7 1,6 2,1
Суммарная доля
заменимых 64,0 67,7 62,2 60,5 63,2 58,5
аминокислот
Незаменимые аминокислоты
Фенилаланн 4,0 3,7 4,3 4,4 4,3 5,0
Метионин 0,9 0,9 1,1 1,3 1,2 0,9
Лизин 4,8 4,2 5,1 5,4 4,8 5,6
Гистидин 1,3 1,3 1,4 1,4 1,5 1,7
Аргинин 4,8 3,8 5,2 4,4 4,1 4,7
Треонин 4,7 4,3 4,6 5,3 5,0 5,4
Валин 5,2 4,7 5,5 5,9 5,2 6,1
Изолейцин 3,9 3,6 4,0 4,3 3,8 4,4
Лейцин 6,4 5,8 6,7 7,2 6,8 7,7
Суммарная доля
незаменимых 36,0 32,3 37,9 39,5 36,2 41,4
аминокислот

Традиционно считается, что коэффициент пересчета общего азота в


белок для растений равен 6,25 [165]. Использование данного коэффициента
возможно лишь при условии, если белок в образце содержит 16 % азота, а
содержание небелкового азота незначительно. Таким образом, эта цифра для
водорослей сильно завышена. Несмотря на это, некоторые авторы
продолжают ею пользоваться [166, 167]. Для компенсации присутствия
небелкового азота в арктических бурых водорослях необходим другой
подход. В работе [168] был предложен средний фактор пересчета для бурых
водорослей 5,38. В нашем исследовании фактор пересчета варьируется от 5
до 6 и в среднем для s.latissima и f.vesiculosus равен 5,6±0,4, для l.digitata –
68
5,4±0,4. В образцах a.nodosum содержится наибольшее количество
небелкового азота, поэтому фактор пересчета сильно отличается и равен
4,5±0,3.

Таблица 3.10. Доля аминокислот от их суммарного содержания в образцах a.nodosum


Доля аминокислот в процентах от общего содержания
Аминокислота
Остров Сосновец остров Большой Соловецкий Остров Русский Кузов
Заменимые аминокислоты
фосфосерин 1,3 1,5 0,9
таурин 2,9 1,7 2,1
аспаргинова кислота 8,1 9,4 8,8
Серин 4,2 3,9 4,5
Глутаминовая кислота 14,9 20,0 15,1
Проли 7,9 6,3 7,3
Глицин 4,9 4,7 5,3
Аланин 7,1 6,2 7,3
Цистатионин 0,4 0,4 0,2
Тирозин 2,7 2,6 2,1
Суммарная доля
1,6 64,2 62,3
заменимых аминокислот
Незаменимые аминокислоты
Фенилаланин 4,4 4,5 5,0
Метионин 1,3 1,2 0,9
Лизин 5,4 4,8 5,6
Гистидин 1,4 1,5 1,7
Аргинин 4,4 4,1 4,7
Треонин 5,3 5,0 5,4
Валин 5,9 5,4 6,1
Изолейцин 4,3 3,8 4,4
Лейцин 7,2 6,8 7,7
Суммарная доля незаменимых
аминокислот
38,4 35,1 37,7

Таким образом, изучен индивидуальный аминокислотный состав


арктических промысловых бурых водорослей, определено превалирующее
содержание аспаргиновой и глутаминовой кислот в фукусовых водорослях и
аланина и глутаминовой кислоты в ламинариевых. Дана количественная
характеристика соотношения аминокислот и показана возможность
рассмотрения бурых водорослей, как источника аминокислот для
фармакологической, косметической и пищевой промышленностей.

3.2.4. Структурные и запасные углеводы

Для анализа углеводного состава биомассы применяют несколько


различных подходов. Возможно использование методики фракционной
экстракции раствором разбавленной соляной кислоты с последующим
69
гравиметрическим определением отдельных фракций [20]. Недостаток
способа – большая длительность и трудоемкость процесса. Другим приемом
является кислотный гидролиз биомассы с последующим
хроматографическим определением отдельных моносахаридов [169]. Такой
подход, однако, не дает надежных сведений о содержании альгиновых
кислот, ввиду высокой устойчивости к гидролизу [170]. Поэтому, для
определения содержания альгиновых кислот используют титриметрический
метод. Для определения содержания моносахаридов в гидролизатах может
быть использован метод ВЭЖХ [171] и метод ГХ-МС [20]. Гидролиз проб
перед ГХ-МС анализом проводится 2М трифторуксусной кислотой, в
отличии от гидролиза 72 % серной кислотой, а затем 4 % при проведении
пробоподготовки к ВЭЖХ методу. В последнем случае кислотный гидролиз
может внести сильную погрешность в содержание моносахаридов, ввиду
существенных различий в скорости гидролиза легкогидролизуемых (ЛГП) и
трудногидролизуемых (ТГП) полисахаридов, входящих в состав водоросли.
Это неминуемо приводит к деградации моноз, высвобожденных в результате
гидролиза ЛГП.
В данном исследовании была проведена идентификация и
количественное определение моносахаридного состава арктических бурых
водорослей методами ВЭЖХ и ГХ-МС.
Основными моносахаридами, образующимися при гидролизе биомассы
бурых водорослей являются глюкоза, фукоза, а так же многоатомный спирт
маннит. По выходу фукозы при гидролизе можно судить о содержании
фукоидана, глюкозу при гидролизе в основном образуют ламинаран и
целлюлоза [169].
В таблице 3.11 приведены данные о содержании нейтральных сахаров
и маннита, определенные методом ВЭЖХ, ГХ-МС и спектрофотометрии, а
так же расчетное значение содержания фукоидана, в биомассе бурых
водорослей.

70
Маннит. Количество маннита варьируется от 4,2 до 24,8 %масс.
Наибольшим содержанием характеризуются ламинариевые водоросли.
Данные по содержанию маннита, полученные в ходе
спектрофотометрического анализа в среднем на 20 %отн ниже данных
ВЭЖХ. Это может быть связано со значительными различиями в
пробоподготовке. Так, при гидролизе образца для ВЭЖХ помимо свободного
маннита выделяются и ранее химически связанные молекулы маннита.
Глюкоза. Содержание глюкозы в образцах варьируется от 4,0 до
15,7 %масс. Наибольшим содержанием глюкозы характеризуются
ламинариевые водоросли, ввиду присутствия в их тканях ламинарана. При
определении глюкозы двумя методиками (ВЭЖХ и ГХ-МС) были получены
сопоставимые результаты, различающиеся, в среднем, на 10 %отн, однако, в
некоторых случаях результаты, полученные методом ВЭЖХ сильно
отличались, в меньшую сторону. Вероятно, это связано с частичной
деградацией глюкозы в ходе пробоподготовки, как и в случае с фукозой.
Фукоза. Содержание фукозы в образцах варьируется от 0,3 до 5,1 %масс.
Данные двух видов анализа (ВЭЖХ и ГХ-МС) не согласуются. При проведении
анализа методом ВЭЖХ в некоторых пробах фукоза не была обнаружена. Наиболее
вероятное объяснение этому факту заключается в жестких условиях гидролиза в
ходе пробоподготовки к ВЭЖХ анализу, приводящему к полному распаду данного
моносахарида. Моносахариды, образующиеся в результате гидролиза
водорастворимых легкогидролизуемых углеводов, такие как, например, фукоза,
могут быть утрачены частично или даже полностью. Вследствие этого, можно
сделать вывод о том, что ВЭЖХ анализ подходит лишь для определения
моносахаридного состава биомассы лишенной водорастворимых углеводов, ввиду
существенных различий в скорости гидролиза водорастворимых и нерастворимых
в воде углеводов. Для моносахаридного анализа такого объекта как водоросли
предпочтительнее метод ГХ-МС с предварительным гидролизом 2М
трифторуксусной кислотой.

71
Таблица 3.11. Углеводный состав биомассы Арктических бурых водорослей
Содержание в водоросли, % масс
Широта Глюкоза Фукоза Маннит
Точка отбора Вид Сум Фукоид
**** ГХ- ВЭ ГХ- ВЭ ВЭ
Спект ма** ан ***
МС ЖХ МС ЖХ ЖХ
о.Скотт-Келти 80,39 s.l.* 12,2 - 0,5 1,6 9,5 12,0 25,2 1,2
(Земля Франца-
l.d.* 10,1 6,0 0,7 1,3 8,8 11,5 21,9 0,8
Иосифа)
78,54 s.l. 14,2 15,2 0,2 - 21,8 24,4 48,9 0,9
зал. Исфьорд
f.v.* 5,0 6,4 2,5 3,8 7,2 9,4 20,9 6,1
Зал. Лонгфьорд 78,22 s.l. 15,7 15,0 0,8 11,7 18,6 24,2 26,8 2,0
77,00 s.l. 13,1 12,7 1,0 - 13,7 1,7 31,9 2,4
м.Желания
(о.Новая Земля) l.d. 10,2 10,6 0,5 0,4 13,8 18,0 30,7 1,3
f.v. 5,2 6,3 3,0 5,1 7,5 9,7 23,0 7,2
77,00 s.l. 14,2 7,6 0,9 0,4 15,6 12,5 27,6 2,2
Оранские о-ва
l.d. 12,1 14,4 0,3 1,6 6,8 8,9 22,0 0,7
Залив Русская 76,22 s.l. 10,1 8,8 1,2 1,4 15,5 20,1 25,4 2,8
Гавань (о.Новая l.d. 9,9 8,1 0,9 2,0 11,6 5,0 19,4 2,0
Земля) f.v. 5,6 6,7 3,1 0,9 4,3 5,7 14,5 7,5
мыс Нос (п-ов 68,56 s.l. 12,4 13,9 1,1 - 16,0 20,8 38,9 2,5
Канин) l.d 12,4 14,8 1,0 1,2 18,0 23,4 38,2 2,4
о.Сосновец 66,49 s.l. 10,1 11,0 1,0 1,6 18,5 24,0 35,2 2,4
(горло Белого l.d. - 9,8 1,0 1,5 19,9 23,9 - 2,4
моря) a.n.* 4,0 4,6 3,2 2,6 3,2 4,2 11,4 7,6
65,11 s.l. 12,6 13,0 1,1 - 19,1 24,8 45,5 2,5
l.d. 12,4 11,3 1,0 1,0 18,0 23,6 36,9 2,3
о.Б.Соловецкий
f.v 5,2 6,5 5,1 6,9 7,7 10,0 21,4 11,2
a.n. 4,1 5,5 4,2 4,8 6,8 8,9 17,3 10,1
64,96 s.l. 14,2 12,0 1,2 2,4 17,5 22,7 41,2 2,9
о.Русский Кузов l.d. 11,4 9,4 0,6 0,5 13,7 17,8 30,8 3,8
2012 г. f.v. 5,1 4,5 5,0 6,1 7,6 9,9 20,7 12,0
a.n. 4,5 5,2 4,9 4,0 4,9 6,4 16,9 11,7
64,96 s.l 12,3 13,5 0,9 0,5 19,8 23,2 39,4 2,2
о.Русский Кузов l.d. 11,4 9,6 0,9 0,7 18,0 23,3 35,7 2,1
2013 г. f.v. 6,4 6,9 4,1 3,6 5,1 6,6 17,1 9,8
a.n. 6,3 7,3 3,5 1,5 5,4 7,2 18,5 8,4
* s.l. – saccharina latissima, l.d. – laminaria digitata, f.v. – fucus vesiculosus a.n. – ascophyllum nodosum.
** - для расчѐта суммы использовались данные ГХ для глюкозы и фукозы, данные ЖХ для маннита
*** - содержание фукоидана - расчетная величина, равная содержанию фукозы (определѐнное методом
ГХ-МС) деленное на 0,42
**** - географическая широта района произрастания водорослей, град с.ш.

Единственный полисахарид, при гидролизе образующий фукозу, в


макро количествах - фукоидан. По выходу фукозы можно судить о
содержании в биомассе фукоидана. Существует расчетный метод
определения содержания фукоидана, позволяющий избежать трудоемкой
фракционной экстракции с последующим гравиметрическим определением
[172]. Расчет содержания фукоидана по данному методу заключается в
делении содержания фукозы на коэффициент 0,5 (в методе принято
содержание фукозы в фукоидане 50 %). Однако, по новым литературным

72
данным, фукоидан при гидролизе дает от 31,1 до 52,1 % фукозы [173-177], в
зависимости от источника, но в среднем эта цифра составляет 42 %. Исходя
из этого, содержание фукоидана, в процентах от массы водоросли, может
быть посчитано как, содержание фукозы деленное на коэффициент 0,42.
Расчетные значения содержания фукоидана варьируются от 0,8 до 12,2 %. В
фукусовых водорослях содержится наибольшее количество фукоидана (от
6,1 % до 12,2 %). В пробе фукуса, отобранной на самой северной точке (зал.
Исфьорд, арх. Шпицберген), из рассмотренных, содержание фукоидана было
минимальным, а в самой южной точке (о. Б.Соловецкий) - максимальное.
Наименьшее содержание фукоидана наблюдается в пробах l.digitata (0,7-3,8
%масс).
Альгиновые кислоты. Содержание альгиновых кислот варьируется от
16 до 29 %масс. Наибольшим содержанием последних характеризуется
a.nodosum, а наименьшим, из рассмотренных, s.latissima. На гистограмме
содержания альгиновых кислот (рисунок 3.6) точки отбора проб указаны
таким образом, что для Белого и Баренцева морей самая северная точка
расположена слева (Земля Франца-Иосифа), а самая южная - справа (о.
Русский Кузов), для проб, отобранных в 2012 году.
35
Saccharina latissima Laminaria digitata Fucus vesiculosus Ascophyllum nodosum
Содержание альгиновых кислот, %

30
25
20
15
10
5
0

Точка отбора проб

Рисунок 3.6. Содержание альгиновых кислот в


биомассе бурых водорослей
Изучен групповой и индивидуальный химический состав бурых
водорослей и выявлены особенности в накоплении различных соединений
исследуемыми макрофитами западного сегмента Арктики. Рассмотренные
73
арктические бурые водоросли являются богатым источником разнообразных
уникальных биологически активных веществ. Содержание различных
компонентов в биомассе варьируется в широких пределах и зависит не
только от таксономической принадлежности и сезона отбора, но и от условий
произрастания. На основании экспериментальных данных основной
химический состав биомассы арктических бурых водорослей можно
представить в виде таблицы (таблица 3.12).
Таблица 3.12. Содержание биологически активных веществ в биомассе
арктических бурых водорослей, %масс
№ Семейство
Группа компонентов
п/п Ламинариевые Фукусовые
1 Минеральные вещества 23-43 21-25
2 Липидно-пигментный комплекс:
- хлорофилл до 0,05 до 0,05
- каротиноиды до 0,025 до 0,025
- жирные кислоты До 0,35 До 1,61
3 Азотсодержащие вещества 4-9 5-10
4 Полифенольные вещества 0-0,1 0,5-19,0
5 Углеводы:
-альгиновые кислоты 16-26 24-29
-маннит 13-25 4-10
Как было показано ранее, бурые водоросли являются ценным
источником углеводов, таких как альгиновые кислоты и маннит.
Традиционно для получения углеводов используют ламинариевые
водоросли. Однако, стоит отметить, что фукусовые водоросли накапливают
значительные количества жирных кислот и компонентов полифенольного
комплекса, в связи с чем, являются перспективным источником данных
групп соединений. Следовательно, при разработке современной методологии
разделения биомассы арктических бурых водорослей, основывающейся на
принципах зеленой химии, следует учитывать необходимость выделения
липидно-пигментного комплекса, полифенольного комплекса и водорослевой
клетчатки. Относительно высокое содержание компонентов липидно-
пигментного комплекса позволяет предположить целесообразность
применения метода сверхкритической флюидной экстракции для извлечения
жирных кислот и пигментов.

74
4. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТЕЙ СЕЛЕКТИВНОГО
РАЗДЕЛЕНИЯ БИОМАССЫ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ НА ФРАКЦИИ
КОМПОНЕНТОВ

4.1. Разработка методологии разделения биомассы бурых водорослей

Существующие технологии переработки биомассы водорослей в


основном направлены на извлечение углеводной составляющей, а именно
альгиновых кислот и маннита. При этом, как было отмечено в разделе 3,
арктические бурые водоросли могут быть ценным источником таких
компонентов как липидно-пигментный комплекс, полифенольный комплекс
и водорослевая целлюлоза. Между тем, анализ литературных данных и схем
реализованных на действующих производствах показывают, что данные
компоненты являются отходами производства. Очевидно, что на
сегодняшний день остается актуальным вопрос ресурсосберегающей
переработки бурых водорослей, с использованием современных технологий и
получением полного спектра химически не трансформированных препаратов
биологически активных веществ.
Групповая и индивидуальная характеристика химического состава
(раздел 3) позволяет предложить следующую схему разделения биомассы
арктических бурых водорослей (рисунок 4.1), основанную на
последовательном разделении растительной матрицы путем использования
растворителей различающихся протолитическими свойствами.
Исходя из анализа природы основных компонентов липидно-
пигментного комплекса водоросли Fucus vesiculosus (раздел 3), в котором
показано преобладание полярных соединений, очевидна невозможность
достижения высокого выхода целевых компонентов при сверхкритической
флюидной экстракции без использования полярного сорастворителя.
В качестве первой стадии комплексной схемы предлагается
сверхкритическая флюидная экстракция бинарным растворителем

75
сверхкритический диоксид углерода - этанол. На данной стадии происходит
выделение липидно-пигментного комплекса, содержащего жирные кислоты,
хлорофилл и каротиноиды.
На второй стадии экстракции извлекается комплекс водорастворимых
веществ (маннит, ламинаран, фукоидан, полифенолы) методом кислотной
экстракции.

Рисунок 4.1. Предлагаемая схема разделения биомассы


арктических бурых водорослей

На третьей стадии из остатка после кислотной экстракции проводится


выделение альгиновых кислот обработкой раствором 1,5 % NaHCO3 при
50 ОС в 2 стадии, каждая стадия по 60 минут, гидромодуль 1:20.
Волокнистый остаток – водорослевая клетчатка проходит 4х
ступенчатую очистку в воде при 90 0С, в течение 60 минут.

76
4.2. Динамика изменения морфологической структуры тканей
водоросли в ходе обработок

Для изучения морфологической структуры таллома бурой водоросли на


микроуровне нами применен метод электронной микроскопии с
использованием микроскопа SEM Sigma VPZEISS. На рисунках 4.2-4.3
изображены снимки поверхности и срезов таллома водоросли f.vesiculosus на
различных стадиях химической переработки (исходная, обработанная
сверхкритическим флюидом, обработанная сверхкритическим флюидом с
последующей экстракцией раствором соляной кислоты).
Как видно на снимках (рисунок 4.2), срез таллома исходных
водорослей имеет плотную, слоистую структуру. На поверхности
наблюдается незначительная складчатость. После стадии сверхкритической
флюидной экстракции клетки расправляются и на срезе таллома хорошо
наблюдаются отдельные ткани (эпидермальные клетки, проводящие системы
и т.п.). Поверхность таллома становится гораздо более развитой (рисунок 4.3)
и гидрофильной, за счѐт истончения липидных мембран клеток.
Таким образом, клеточная структура бурых водорослей подвергается
значительным изменениям в ходе сверхкритической флюидной экстракции,
что приводит к увеличению доступности для растворителей отдельных
участков структуры и, как следствие, к увеличению степени экстракции
биологически активных веществ на последующих стадиях обработки.

77
а

Рисунок 4.2. Изображение среза таллома водоросли: а) исходной водоросли;


б) обработанной сверхкритическим флюидом; в) обработанной сверхкритическим
флюидом и далее обработанной раствором соляной кислоты

78
а

в
Рисунок 4.3. Изображение поверхности таллома водоросли: а) исходной водоросли; б)
обработанной сверхкритическим флюидом; в) обработанной сверхкритическим флюидом
и далее обработанной раствором соляной кислоты

79
4.3. Характеристика состава и свойств сверхкритического флюидного
экстракта липидно-пигментного комплекса

Проведенные предварительные исследования и литературные данные


[104, 178-181] позволили определить параметры сверхкритической
флюидной экстракции, обеспечивающие высокий выход экстракта:
водоросли перемолотые (фракция 0,03-0,2 мм), влажность сырья 9 %масс
(воздушно сухое сырье), температура 60 °С, давление 300 атмосфер, время
экстракции 60 мин, расход сверхкритического флюида 6 мл/мин, состав
флюида: сверхкритический СО2, (расход 5,65 г/мин (5,4 мл/мин)) +
сорастворитель этанол с расходом 10 %об от флюида (0,6 мл/мин
(0,47 г/мин)). Сверхкритическую обработку биомассы проводили в
проточном аппарате ASFE (Waters, США).
Показано, что использование сорастворителя (метанола, этанола,
изопропанола, ацетона и гексана) значительно увеличивает выход экстракта с
31 %отн без использования сорастворителя, до 95 %отн. При этом
наибольший эффект извлечения компонентов из растительной матрицы
наблюдается для системы сверхкритический СО2 – этанол (рисунок 4.4а) с
долей сорастворителя во флюиде 10 %об (рисунок 4.4б).

а б
Рисунок 4.4. Зависимость выхода жирных кислот от вида (а) и доли (б)
сорастворителя в сверхкритическом флюиде

80
Для исследования сверхкритического экстракта водоросли Fucus
vesiculosus (как наиболее предпочтительной для выделения компонентов
жирнокислотного комплекса) была проведена экстракция с условиями,
установленными в ходе предварительных исследований. Выход экстракта
составил 6,4 %масс от массы водоросли, в т.ч. выход жирных кислот
2,2 %масс от массы водоросли (100 % от содержания ЖК, определенного
методами, предусматривающими экстракцию органическими
растворителями). Суммарный выход компонентов в сверхкритическом
экстракте представлен в таблице 4.1.

Таблица 4.1. Характеристика состава сверхкритического экстракта водоросли


F.vesiculosus
Компонент Выход от массы водоросли, мг/г водоросли
Жирные кислоты 21,9
Полифенолы 20,2
Маннит 7,2
Прочие компоненты 14,7

С целью исследования состава жирнокислотной фракции,


различающейся по степени насыщения, предложена схема разделения
сверхкритического экстракта, основанная на различиях протолитических
свойств компонентов (рисунок 4.5).
Полученный экстракт содержал этанольный раствор (фракция I) и
осадок, не растворимый в этаноле при нормальных условиях (фракция II).
Фракцию I концентрировали на роторном испарителе до малого объема и
далее термостатировали при -15 °С, в течение суток, в результате чего она
разделялась на маслянистый осадок (фракция III) и надосадочную жидкость
(фракция IV).
Поскольку жирные кислоты при обычных условиях растворимы в
этаноле, данное явление, по всей видимости, может быть объяснено тем, что
в водорослях жирные кислоты находятся не только в свободном, но и в
связанном виде в составе фосфолипидов, гликолипидов и других соединений,
растворимость которых в этаноле может существенно различаться.

81
Рисунок 4.5. Схема фракционирования сверхкритического экстракта

На рисунках 4.6 и 4.7 представлены образец хроматограммы общего


ионного тока для фракции 1 сверхкритического экстракта и масс-спектры
идентифицированных компонентов. Согласно литературным данным [182,
183] для ПНЖК наблюдается большая растворимость в спиртах при низких
температурах по сравнению с насыщенными и мононенасыщенными
кислотами. Поэтому для получения фракций, обогащенных данными
группами соединений фракция 1 подвергалась термостатированию при -15 °С
в течение суток. Подобная обработка приводит к образованию маслянистого
осадка (фракция 3) и надосадочной жидкости – раствор компонентов в
холодном этаноле (фракция 4).

82
Рисунок 4.6. Хроматограмма общего ионного тока для фракции 1 водоросли вида
F.vesiculosus и масс-спектры компонентов: 1 – С 14:0; 2 – С 16:0; 3 – С 16:1; 4 – С 18:0;
5 – С 18:1; 6 – С 18:2; 7 – С 18:3; 8 – С 18:4; 9 – С 20:4; 10 – С 20:5

Рисунок 4.7. Масс-спектры компонентов фракции 1 водоросли вида F.vesiculosus:


1 – С 14:0; 2 – С 16:0; 3 – С 16:1; 4 – С 18:0; 5 – С 18:1; 6 – С 18:2; 7 – С 18:3; 8 – С 18:4;
9 – С 20:4; 10 – С 20:5

83
Соотношение фракций в экстракте, их состав и антиоксидантная
активность представлены в таблице 4.2. Жирнокислотный состав фракций
представлен в таблице 4.3.

Таблица 4.2. Состав фракций сверхкритического экстракта Fucus vesiculosus


Фракция Доля Содержание компонентов в фракциях сверхкритического АОА*, ммоль экв.
экстракта фракции в флюидного экстракта, %отн BHA на 1г а.с.
СКЭ, %отн ЖК Полифенолы Маннит Прочие компоненты экстракта
Фракция 2 17 77±4 1,7±0,1 13,6±0,8 7,7±5,8 0,03±0,01
Фракция 3 31 40±2 4,2±0,2 16,4 ±0,8 39,1±4,3 0,35±0,02
Фракция 4 52 171±8 64,3±3,2 7,7±0,4 11,5±3,3 3,71±0,20

Согласно полученным данным, фракция 1 содержит 62 %отн жирных


кислот, полученных в ходе сверхкритической экстракции. При этом она
характеризуется соотношением жирных кислот близким к их соотношению в
исходной водоросли, что свидетельствует об отсутствии избирательности в
накоплении жирных кислот в данной фракции.

Таблица 4.3. Жирнокислотный состав фракций экстрактов


Доля жирных кислот от их общего содержания во
Жирная кислота фракциях, %отн
Фракция I Фракция II Фракция III Фракция IV
Миристиновая C14:0 9,6 ± 1,4 6,5 ± 0,9 8,6 ± 1,3 11,8 ± 1,8
Пальмитиновая С16:0 15,4 ± 2,3 10,5 ± 1,6 13,9 ± 2,1 13,1 ± 2,0
Пальмитолеиновая С16:1 (n-7) 0,7 ± 0,1 0,6 ± 0,1 0,7 ± 0,1 1,2 ± 0,2
Стеариновая С18:0 3,3 ± 0,5 1,6 ± 0,2 1,9 ± 0,3 0,8 ± 0,1
Олеиновая С18:1 (n-9) 37,0 ± 5,6 6,1 ± 6,9 36,3 ± 5,4 18,3 ± 2,7
Линолевая С18:2 (n-6) 14,2 ± 2,1 16,6 ± 2,5 14,7 ± 2,2 11,1 ± 1,7
α-Линоленовая С18:3 (n-3) 4,6 ± 0,7 6,0 ± 0,9 6,7 ± 1,0 10,3 ± 1,0
Стеаридоновая С18:4 (n-3) 1,9 ± 0,3 1,3 ± 0,2 2,7 ± 0,4 11,4 ± 1,7
Арахидоновая 204 (n-6) 7,8 ± 1,2 6,6 ± 0,9 8,0 ± 1,2 7,6 ± 1,1
Эйкозапентаеновая 20:5 (n-3) 5,6 ± 0,8 4,3 ± 0,6 6,5 ± 0,9 14,4 ± 2,2
Σ НЖК 28,3 ± 4,2 18,6 ± 2,8 24,4 ± 3,7 25,7 ± 3,9
Σ МНЖК 37,7 ± 5,7 46,7 ± 7,0 37,0 ± 5,6 19,5 ± 2,2
Σ ПНЖК 34,0 ± 5,1 34,8 ± 5,2 38,6 ± 5,8 54,8 ± 8,2

Нерастворимая в спирте фракция (фракция 2) характеризуется


наивысшим содержанием жирных кислот (76,6 % от массы фракции) по
сравнению с другими фракциями и обладает повышенным относительным
содержанием олеиновой и линолевой кислот 46,1 %отн и 16,7 %отн,

84
соответственно. С другой стороны, данная фракция содержит существенно
меньше насыщенных жирных кислот.
Нерастворимая в холодном этаноле фракция (фракция 3)
характеризуется высоким содержанием жирных кислот (40,1 % от массы
фракции), при этом, относительное содержание НЖК, МНЖК и ПНЖК
соответственно 24,4 %отн, 37,0 %отн, 38,6 %отн - примерно такое же
соотношение наблюдается в экстрактах, полученных методом Блайя-Дайера.
Основным компонентом фракции, растворимой в холодном этаноле
(фракция 4), являются полифенольные соединения, содержание которых
достигает 64,3 %отн (что составляет 96 %отн от суммы полифенолов
полученных в ходе сверхкритической экстракции). Тем не менее, в данной
фракции содержится 16,5 %отн жирных кислот и она характеризуется
высоким относительным содержанием ПНЖК (54,8 %отн) и низким
содержанием МНЖК (19,5 %отн), в сравнении как с классическим
экстрактом, так и с другими фракциями сверхкритического экстракта. Таким
образом, изменение температуры растворителя позволило получить
фракцию, обогащенную полиненасыщенными жирными кислотами и
полифенолами.

4.4. Извлечение и характеристика фракции водорастворимых веществ

Водную экстракцию проводили при постоянном перемешивании, при


оптимальных условиях, обеспечивающих наибольший выход экстракта
(60 0C, соотношение сухие вещества:растворитель = 1:20, 3 стадии по 60
минут) (литературные данные) (таблица 4.4).
Таблица 4.4. Литературные данные по оптимальным условиям экстракции бурых
водорослей
Экстракция Оптимальные условия Ссылка на патент
Темпера Гидромод Количество Время,
ура, 0C уль стадий мин
Водная 40-60 20 2-3 180-24 [113, 120, 184-186]
Кислотная 60 20 2-3 180-300 [107, 117, 118, 187-
190]
85
С помощью рассмотренных методов экстракции (водный, кислотный,
водно-спиртовый, ферментативный) из водорослей в той или иной степени
извлекаются полифенольная фракция, водорастворимые полисахариды
(ламинаран, фукоидан), маннит, белки, свободные аминокислоты и
минеральные вещества (таблица 4.5).
Наибольшего выхода экстракции (68,2 %масс) удалось достичь при
кислотной обработке биомассы после сверхкритической флюидной
предобработки. При этом выход маннита и полифенолов на том же уровне,
что и при водной экстракции после сверхкритической флюидной
предобработки (96,0 %отн и 85,0 %отн от максимально возможного,
соответственно) и значительно выше, чем при ферментативной экстракции
(75,2 %отн и 63,4 %отн, соответственно). В остатке после кислотной
экстракции содержится наименьшее количество редуцирующих веществ (2,5
%масс). Кислотная экстракция в значительной степени активируется
сверхкритической предобработкой субстрата. Выход экстракта
увеличивается с 51 %масс, до 68 %масс, выход полифенолов увеличивается с
64,8 %отн до 85,0 %отн, выход легкогидролизуемых полисахаридов
незначительно снижается с 63,3 %отн до 59,7 %отн, выход маннита
увеличивается (с 81,0 %отн до 92,4 %отн). Стоит отметить, что часть маннита
и полифенолов экстрагируются в ходе сверхкритической обработки
(2,0 %масс и 1,6 %масс).
Наибольшие выходы экстракции без сверхкритической флюидной
предобработки достигаются при использовании воды в качестве
растворителя (таблица 4.5). Однако, для того что бы извлечь липидно-
пигментный комплекс необходима предварительная обработка биомассы и
наиболее предпочтительный для таких целей метод - сверхкритическая
флюидная экстракция. Можно сделать вывод о том, что при обработке
биомассы сверхкритическим диоксидом углерода со спиртовым
сорастворителем происходит активация поверхности субстрата, что вызывает
повышение выхода при дальнейшей экстракции кислотным раствором.

86
Таблица 4.5. Сравнительная характеристика методов экстракции бурых водорослей
Содержание веществ в экстрактах, % В
Водный Водно-спирт Кислотный Ферментатив исходной
Параметры
ный водоросли
Абс отн Абс отн Абс отн Абс отн , %масс
Без предварительной сверхкритической флюидной экстракции
ЛГП 9,1 65,5 7,5 54,0 8,8 63,3 8,5 61,2 13,9
Маннит 10,6 100,0 - - 8,5 81,1 7,0 67,6 10,5
Полифенолы 14,0 98,2 8,4 59,2 9,2 64,8 15,2 100,0 14,2
Выход экстракции по сухим
70,3 53,2 51,0 63,9 -
в-вам в экстракте
С предварительной сверхкритической флюидной экстракцией
ЛГП 7,5 54,0 8,0 57,6 8,3 59,7 8,3 59, 13,9
Маннит 7,8 74,3 7,1 70,3 9,7 92,4 7,6 75,2 10,5
Полифенолы 12,3 87,6 9,2 64,8 11,9 85,0 9,0 63,4 14,2
Выход экстракции по сухим
56,5 49,5 68,2 66,7 -
в-вам в экстракте

Параметры Содержание веществ в остатках после экстракции, % В


Водный Водно-спирт Кислотный Ферментатив исходной
ный водоросли
Абс он Абс отн Абс отн Абс отн , %масс
Без предварительной сверхкритической флюидной экстракции
Остаток массы после 39,0 40,7 40,1 33,0 39,0 40,7 40,1 33,0 -
экстракции, отн%
ТГП 7,2 100,0 - - 7,2 100,0 - - 6,9
Зольность - - - - - - - - 22,4
С предварительной сверхкритической флюидной экстракцией
Остаток массы после 41,0 45,6 25,2 35,5 41,0 45,6 25,2 35,5 -
экстракии, отн%
ТГП 5,9 85,5 - - 5,9 85,5 - - 6,9
Зольность 4,0 18,4 6,0 26,8 4,0 18,0 6,0 26,8 22,4

4.5. Извлечение альгиновых кислот

Стадия извлечения альгиновых кислот являлась объектом изучения


многих исследователей [107, 112, 113, 116, 184, 186, 188, 189]. Исходя из
этого, в данной работе, она не подвергалась модификациям. Анализ
литературных данных и технологий, реализованных на производствах
показали, что оптимальными условиями выделения альгиновых кислот
являются: экстракция раствором 1,5 % NaHCO3 при 60 ОС в 2 стадии, каждая
стадия по 60 минут, гидромодуль 1:20.
Таким образом, на основании данных о химическом составе бурых
водорослей предложена методология разделения их биомассы, новизна
которой заключается в применении принципов ―зеленой химии‖ для
последовательного разделения растительной матрицы.

87
4.6. Выделение и характеристика представительных образцов
водорослевой клетчатки

Водорослевая клетчатка (ВК) содержит в себе целлюлозу и остаточные


количества веществ, выделяемых в ходе комплексной схемы переработки
бурых водорослей (полисахариды, альгинаты, пигменты, полифенолы,
белки). Содержание данных компонентов в клетчатке может варьироваться в
широких пределах, что приводит к дополнительной погрешности при
получении значений параметров, характеризующих еѐ физико-химические
свойства.
Выделить представительные образцы ВК возможно при
многостадийной очистке еѐ от сопутствующих компонентов, прежде всего
полисахаридной составляющей, горячей водой. Использование более
жестких условий очистки (применение растворов щелочей и кислот)
приводит к полной или частичной деградации водорослевой целлюлозы, что
вероятно связано с особенностями еѐ структуры и физико-химических
свойств. Очистку клетчатки проводили в 6 стадий водой при температуре
кипения с гидромодулем 1:30, время – 60 минут. Полученную данным
способом целлюлозную массу высушивали в сушильном шкафу при
температуре 30 ОС до воздушно-сухого состояния либо лиофильно далее
измельчали и фракционировали.
В промывных водах анализировали содержание сухих веществ,
альгиновых кислот и легкогидролизуемых полисахаридов. Установлено, что
в результате обработок горячей водой из клетчатки экстрагируется 480±25 мг
сухих веществ на 1 г клетчатки для L.digitata и 385±20 мг сухих веществ на
1 г клетчатки для F.vesiculosus (рисунок 4.8). Вероятно, более низкая степень
удаления побочных компонентов из клетчатки F.vesiculosus является
следствием химической связанности некоторых полисахаридов.
Сумма проэкстрагированных ЛГП составляет немногим более 40±2
мг/г клетчатки для обоих видов бурых водорослей (рисунок 4.8).

88
По результатам исследований видно, что в клетчатке L.digitata
содержится больше остаточных альгинатов (210±10 мг/г клетчатки), чем в
клетчатке F.vesiculosus (145±10 мг/г клетчатки), что, вероятно, объясняется
более высокими концентрациями альгиновых кислот в исходной водоросли
L.digitata.

а б

в
Рисунок 4.8. Содержание веществ в водном экстракте
при очистке клетчатки (нарастающим итогом): а) сухих веществ;
б) ЛГП; в) альгиновых кислот
Динамика извлечения водорастворимых веществ, в том числе
альгиновых кислот и ЛГП, свидетельствует о необходимости
четырехкратной обработки клетчатки горячей водой для получения
представительных образцов. Таким образом, получен продукт с

89
фиксированным составом, который далее подвергали химическому и
структурному анализу и исследованию сорбционных характеристик.
В целлюлозной матрице клетчатки остается значительное количество
примесей (белки, альгиновые кислоты, ЛГП) (таблица 4.6), затрудняющие
установление структурных и физико-химических особенностей водорослевой
целлюлозы. Очистка ВК приводит в удалению альгиновых кислот и ЛГП.
На рисунках 4.9 и 4.10 представлены снимки полученных образцов
клетчатки l.digitata и f.vesiculosus. Анализируя данные снимки можно
сказать, что отчетливо видны микрофибриллы целлюлозы в образцах
очищенной клетчатки. Толщина микрофибрилл составляет 30 нм, при этом
она совпадает со средней толщиной микрофибрилл у высших растений [191].
Также можно отметить значительное увеличение развитости поверхности
образцов в ходе очистки, что подтверждается результатами анализа удельной
поверхности водорослевой клетчатки методом низкотемпературной
адсорбции азота (таблица 4.6), очевидно, это связано с удалением
альгиновых кислот, покрывавших поверхность клетчатки.

90
а

б
Рисунок 4.9. Водорослевая клетчатка
fucus vesiculosus: а) не очищенной; б) очищенной

91
а

б
Рисунок 4.10. Водорослевая клетчатка
L.digitata: а) не очищенной; б) очищенной

92
Химический состав ВК представлен в таблице 4.6. Элементный состав
очищенной клетчатки представлен в таблице 4.7.
Из представленных данных видно, что основным компонентом
очищенной клетчатки является целлюлоза: 580±30 и 320±15 мг/г для
L.digitata и F.vesiculosus, соответственно. В ходе очистки из целлюлозной
матрицы полностью удаляются остаточные количества альгиновых кислот и
легкогидролизуемых полисахаридов (ЛГП). Содержание белка в очищенной
клетчатке довольно высоко: 350±35 и 260±26 мг/г для L.digitata и
F.vesiculosus соответственно, при этом лишь незначительная часть белка
извлекается в ходе очистки (удаляется порядка 10 %отн от содержания
белков). Остаточные белки нерастворимы как в воде, так и в разбавленных
растворах кислот и щелочей. Исходя из этого, можно сделать вывод, что
данные белки, возможно, химически связаны с другими компонентами
водорослей либо участвуют в образовании механической ткани водорослей, в
связи с чем, они приобретают гидрофобные свойства.
Содержание минеральных веществ в очищенной клетчатке невелико:
35±2 и 42±2 мг/г для L.digitata и F.vesiculosus, соответственно. Их
присутствие обусловлено наличием в водорослевой биомассе солей, а также
способностью полисахаридов химически связывать различные металлы.

Таблица 4.6. Компонентный состав водорослевой клетчатки


Содержание компонентов, мг/г в.с. клетчатки
Тип клетчатки Целлюл Альгиновы Минеральны
ЛГП Белки
оза е кислоты е вещества
L.digitata* 305±20 210±5 41±2 170±20 71±4
F.vesiculosus* 205±10 145±6 40±1 170±20 68±3
L.digitata (очищенная) 580±30 Н.п.о. Н.п.о. 350±35 35±2
F.vesiculosus(очищенная) 320±15 Н.п.о. Н.п.о. 260±26 42±2
*- клетчатка получена в ходе комплексной переработки биомассы водорослей по предложенной схеме

93
Таблица 4.7. Элементный состав очищенной водорослевой клетчатки
Содержание элемента, %отн
Тип клетчатки
N C H S
клетчатка F.vesiculosus 2,89±0,29 46,86±3,28 5,74±0,40 2,52±0,18
клетчатка L.digitata 4,68±0,47 45,77±3,20 7,07±0,49 2,72±0,19
очищенная клетчатка F.vesiculosus 4,77±0,48 49,21±3,44 5,62±0,39 0,74±0,05
очищенная клетчатка L.digitata 6,54±0,65 45,84±3,21 6,65±4,67 1,12±0,08

а б
Рисунок 4.11. ИК-спектры образцов клетчатки после обработки водой:
а – Fucus vesiculosus, б – Laminaria digitata
Клетчатку после очистки водой анализировали методом ИК-Фурье-
спектроскопии, полученные данные представлены на рисунке 4.11.
В целом, полученные спектры для Fucus vesiculosus и Laminaria digitata
весьма схожи. В спектрах обоих образцов наблюдаются полосы поглощения
при 3300-3200 см-1 и 2950-2850 см-1, что соответствует валентным
колебаниям ОН-групп и связей С-Н, соответственно. Наиболее
интенсивными являются полосы в районе 1030 см-1, соответствующие
колебаниям связей C-C, C-OH, C-H, что характерно для полисахаридов,
вероятно для целлюлозы. Полоса поглощения при 1158 см-1 может
соответствовать С-О-С колебаниям в молекулах полисахаридов. Кроме того,
для образца водоросли Fucus vesiculosus наблюдаются полосы поглощения
1247 см-1 и 821 см-1, предположительно, отвечающие колебаниям связей S=O
и C-O-S, что, означает наличие в образце клетчатки следов фукоидана. Также
наблюдается интенсивная полоса около 1614 см-1, которая может
соответствовать колебаниям связей O-C-O карбоксильного иона, что
характерно для солей альгиновой кислоты.

94
Для образца клетчатки, полученного из водоросли Laminaria digitata
наблюдается полоса поглощения 898 см-1, которая, с одной стороны, может
отвечать C-O-C, C-C-O и C-C-H колебаниям, характерным для
полисахаридов, а с другой стороны, может означать присутствие
полисахаридов с β-гликозидной связью. Полосы поглощения при 1644, 1370,
1315 см-1 типичны для глюканов с 1-3 связью, что может свидетельствовать о
наличии в образце целлюлозы и ламинарана.
Исследование свойств и структурных особенностей водорослевой
целлюлозы
Как было отмечено ранее, реакционная способность любого сорбента
целлюлозного типа определяется его надмолекулярной структурой [192, 193].
Макромолекулы целлюлозы образуют в микрофибрилле области с различной
степенью упорядоченности: кристаллические, характеризующиеся высокой
степенью упорядоченности, и аморфные, распределение которых по длине
микрофибриллы носит статистический характер. Количественно
соотношение между кристаллической и аморфной фазами можно
охарактеризовать степенью кристалличности.
Для изучения структуры полученных образцов использовался
рентгеноструктурный анализ. На рисунке 4.12 приведены кривые
распределения интенсивности рассеяния образцов водорослевой клетчатки,
отснятых в геометриях на отражение и прохождение (просвет).
Как следует из рисунка 4.12, рентгенограммы образцов Fucus
vesiculosus содержат только следы отражений кристаллической целлюлозы, в
то время как на рентгенограммах образцов Laminaria digitata отражения от
кристаллической целлюлозы выражены четко.
Степень кристалличности рассчитывалась из рентгенограмм,
полученных в геометриях на отражение и просвет. Состав кристаллической
составляющей оценивался из рентгенограмм, полученных на отражение.
Полученные результаты представлены в таблице 4.8.

95
Рисунок 4.12. Рентгенограммы образцов: Fucus vesiculosus, образцы 1, 3, 5: а – съемка на
отражение; в – на просвет; Laminaria digitata, образцы 2, 4, 6: б – съемка на отражение; г –
на просвет. Теоретически рассчитанные рентгенограммы целлюлоз: ─ I; ─ Iβ; ─ ЦII.
*отражения, не характерные для полиморфных фаз целлюлозы

Таблица 4.8. Степень кристалличности (СК) и концентрации фаз целлюлозы в


кристаллической компоненте (↑↑ -параллельная ориентация целлюлозных цепочек,
↑↓- антипараллельная.), %отн
Вид водоросли
Тип образца Fucus vesiculosus Laminaria digitata
СК ↑↑ Iβ↑↓ Iβ↑↑ ЦII↑↓ СК ↑↑ Iβ↑↓ Iβ↑↑ ЦII↑↓
Водоросль после
16 66 - - 34 28 - 40 - 60
экстракции водой
Клетчатка
24 63 - - 37 42 37 51 - 12
неочищенная
Клетчатка очищенная 19 42 - - 58 40 28 51 - 21

96
Из данных, представленных в таблице 4.8, следует, что в исходных
образцах Laminaria digitata степень кристалличности выше почти вдвое, чем
в исходных образцах Fucus vesiculosus – 28 % и 16 %отн, соответственно. В
составе кристаллической компоненты этих образцов преобладает целлюлоза
I – триклинная модификация с одним целлобиозным остатком на
элементарную ячейку и параллельной ориентацией целлюлозных цепочек (60
и 66 %отн, соответственно). В образце Laminaria digitata наблюдается
наличие целлюлозы Iβ – моноклинной модификации с двумя целлобиозными
остатками на элементарную ячейку и антипараллельной ориентацией
целлюлозных цепочек.
Существует лишь несколько публикаций, в которых представлены
данные о существовании природной целлюлозы II [194,195]. Стоит также
отметить работу [85], авторы которой сообщают о наличии в составе
водорослей целлюлоз с низкой степенью кристалличности, близких по
строению к целлюлозе II, но таковой не являющейся. Таким образом, мы
предполагаем, что в состав исследуемых образцов входит не целлюлоза II, а
производное целлюлозы с неустановленной структурой схожей с целлюлозой
II.
Целлюлоза, содержащаяся в образцах клетчаток, обладает большей
степенью кристалличности по сравнению с исходными водорослями, что
особенно заметно для целлюлозы клетчатки из водоросли вида Laminaria
digitata. Данный образец содержит I и Iβ формы целлюлозы (37 % и 51 %
соответственно), а также небольшое количество схожего с целлюлозой II
производного. Клетчатка водоросли вида Fucus vesiculosus характеризуется
меньшей по сравнению с Laminaria digitata степенью кристалличности (24 %
и 42 %, соответственно) и преобладающим компонентом в ней является
метастабильная целлюлоза I.
Полученные в ходе обработки горячей водой целлюлозы обладают
несколько меньшей степенью кристалличности по сравнению с клетчатками.
Также, для обоих образцов наблюдается уменьшение содержания I-
97
целлюлозы и увеличение содержания целлюлозы II. Вероятно, такой способ
обработки мог вызвать частичный переход I-целлюлозы в более стабильную
форму.
Размеры областей когерентного рассеяния (кристаллитов) удалось
определить только в тех случаях, когда линии различных фаз не
перекрываются. Результаты расчета приведены в таблице 4.9.
На рисунке 4.13 указаны направления, вдоль которых из ширины
отражений рассчитывались размеры областей кристалличности Dhkl.

Рисунок 4.13. Ориентация осей элементарной ячейки


целлюлозы и некоторые кристаллографические направления

Таблица 4.9. Размеры кристаллитов в некоторых направлениях в решетке


исследованных образцов.
Направление f.v. l.d. Клетчатка Клетчатка l.d. Клетчатка Клетчатка f.v.
размера области исходная исходная l.d. очищенная f.v. очищенная
кристалличности
о п о о п о п о о п
[hkl] (hkl) фаза
110 110 Iβ - - - - - 87 100 - - -
110 110 ЦII 50 52 35 48 49 48 40 45 40 90
010 020 ЦII - 57 - - - - - - - -
100 200 Iβ 21 - - 38 33 39 48 27 33 49
001 004 - - - - - - - - - 83
Dhkl, Å;Dhkl =

Растворы целлюлоз бурых водорослей в кадоксене характеризуются


низкой вязкостью (на уровне 100 мл/г), степень полимеризации также
невелика - 120 ± 20 и 200 ± 40 ед. для F.vesiculosus и L.digitata
соответственно, в то время как, в соответствии с литературными данными
[90, 92, 196, 197] для целлюлоз высших растений характерны значения на
уровне нескольких тысяч единиц (до 15 000 для хлопковой целлюлозы). По
этим параметрам целлюлозы водорослей схожи с регенерированной
целлюлозой. Высокое медное число (11,1 и 6,3 г/мл для F.vesiculosus и
98
L.digitata, соответственно) может указывать как на высокую степень
окисленности целлюлоз, так и на низкую степень полимеризации (СП). В
ходе комплексной схемы водоросли не подвергались значительному
воздействию окислительных реагентов, следовательно, данными значениями
медного числа можно также подтвердить довольно низкую СП в сравнении с
техническими и даже регенерированными древесными целлюлозами.
Сравнительная характеристика целлюлозы представлена в таблицах
4.10 и 4.11.
Таблица 4.10. Сравнительная характеристика водорослевой целлюлозы с
целлюлозами высших растений
Целлюлоз Вязкость Медное
Тип целлюлозы ы в сырье, СП, ед раствора, число, Источник
%масс г/мл г/100г
Хвойная древесная 40-60 7000- - 2,4
Лиственная древесная 37-56 10000 - -
Еловая сульфитная Литературные
- 1250 570 3,5
беленая данные [90, 92,
Регенерированная - 300 190 197, 198]
Хлопковая 97-99 15000 - 0,3
Льняная 70-80 9000 - -
Водорослевая f.v. 8±1 120±20 100±25 11,1±0,2 Эксперименталь
Водорослевая l.d. 8±1 200±40 125±25 6,3±0,2 ные данные
В соответствии с литературными данными [92, 199-203] не
существует природных целлюлоз, которые бы содержали только I или Iβ
форму целлюлозы. Тем не менее, для хлопковой и микрокристаллической
целлюлоз преобладающей является моноклинная модификация Iβ. В состав
целлюлозы древесины также входят обе формы, однако, в соответствии с
данными 13С ЯМР-анализа, соотношение I/Iβ выше для древесин хвойных
пород [201, 204]. Что касается технических целлюлоз, то, в соответствии с
данными, представленными в работе [199], для небеленой бисульфитной
целлюлозы ели преобладающей является Iβ-форма, в то время как в составе
беленой и небеленой сульфатной целлюлоз сосны превалирует I-форма. В
целлюлозе бурых водорослей I-форма может как преобладать, так и
находиться в равном соотношении с Iβ-формой, что согласуется с
полученными нами данными.

99
Таблица 4.11. Сравнение структурных характеристик водорослевой целлюлозы,
целлюлоз высших растений и микроцеллюлозы
Преобладающая Степень Ссылка
Объект
структура кристалличности, %
Природная целлюлоза (литературные данные)
Микрокристаллическая целлюлоза Iβ↑↑, моноклинная 68
[199]
Хлопковая целлюлоза Iβ↑↓, моноклинная 66-75
Бамбук Iβ, моноклинная 85 [200]
Сосна лучистая I, триклинная -
[201, 204]
Каштан посевной Iβ, моноклинная -
Техническая целлюлоза (литературные данные)
Небеленая бисульфитная целлюлоза Iβ↑↑, Iβ↑↓,
70-81
из древесины ели моноклинная
Небеленая сульфатная целлюлоза из
I↑↑, триклинная 78 [199]
древесины сосны
Беленая сульфатная целлюлоза из
I↑↑, триклинная 75-81
древесины сосны
Целлюлоза водорослей (литературные данные)
Целлюлоза Chaetomorpha antennina I↑↑ 66 [202]
Целлюлоза Sargassum tenerrimum I↑↑ 66
Целлюлоза Dictyota dichotoma I↑↑+Iβ↑↓ 67
Экспериментальные данные
Целлюлоза Fucus vesiculosus I↑↑ 19 -
Целлюлоза Laminaria digitata I↑↑+Iβ↑↓ 40 -
Исследование состава водорослевой клетчатки показало, что основным
еѐ компонентом является целлюлоза. Установлено, что полученные в
соответствии с комплексной схемой переработки водорослей образцы
целлюлоз представляют собой аморфные структуры с включениями
кристаллических областей, преобладающей модификацией в которых
является I-форма (Fucus vesiculosus) и Iβ-форма (Laminaria digitata), при
этом в кристаллической фазе целлюлозы обоих образцов наблюдается
значительное количество целлюлозы, близкой к форме целлюлоза II.
Исследуемые образцы водорослей l.digitata и f.vesiculosus относятся ко
второму типу. Как уже отмечалось в обзоре литературы, к такому типу
относятся водоросли, содержащие в составе клеточной стенки целлюлозу в
небольших количествах, с низкой степенью кристалличности, случайно
направленными цепочками и структурой схожей со структурой целлюлозы II
[85]. Состав водорослевой клетчатки, а также структура и свойства еѐ
основного компонента – водорослевой целлюлозы, указывают на то, что
водорослевая клетчатка может проявлять сорбционные свойства и являться
энтеросорбентом.
100
5. ОЦЕНКА ПОТРЕБИТЕЛЬСКИХ СВОЙСТВ НОВЫХ
ПРЕПАРАТОВ ИЗ ВОДОРОСЛЕВОЙ БИОМАССЫ

5.1. Медико-биологическая характеристика фракций водорослевого


липидно-пигментного комплекса3

Поскольку жирные кислоты и полифенолы обладают


противовоспалительными, иммуномодулирующими и бактерицидными
свойствами, а полифенолы известны высокой антиоксидантной активностью,
высокое содержание этих компонентов во второй и четвертых фракциях СКФ
экстракта водоросли Fucus vesiculosus (раздел 4, табл. 4.2) побудило нас
провести оценку их биологической активности.
Антисептические свойства. Результаты исследования
бактериостатических свойств представлены в таблице 5.1.
Бактериостатическая активность по отношению к госпитальным штаммам,
практически устойчивым к антисептикам (синегнойной палочке Ps.
aeruginosa и золотистому стафилококку St. aureus) низкая у обеих
испытуемых фракций. Бактерицидная способность фракции IV достаточно
значима.
Таблица 5.1. Бактериостатический эффект испытуемых субстанций
Штаммы Фракция II Фракция IV Фитотон
Ps. aeruginosa 6/12 17/39 11/22
St. aureus 3/6 8/16 5/10
Kl. pneumonia 15/30 32/66 31/62
Str. pyogenes A 18/36 44/88 34/78
Str. pneumonia 19/38 36/72 36/72
Str. faecaflis 21/42 34/68 33/66
Esherichia coli 14/28 35/70 35/70
Bac. subtilis 11/22 42/84 32/64
Proteus vulgaris 13/26 41/82 38/76
Средний % 24,0 ± 3,9 58,5 ± 5,3 52,0 ± 3,6
Средний %, исключая
31,7 ± 2,5 75,7 ± 2,1 69,7 ± 2,8
госпитальные штаммы
Средний % для грамм+ 30,4 ± 3,5 62,0 ± 2,7 57,6 ± 4,7
Средний % для грамм- 20,0 ± 3,4 63,7 ± 3,2 54,0 ± 3,4

101
Фунгицидные свойства. Фунгистатический эффект испытуемых
субстанций представлен в таблице 5.2.
Таблица 5.2. Фунгистатический эффект испытуемых субстанций
Штаммы Фракция II Фракция IV Фитотон
С. aldicans 12/24 32/ 64 12/24
С. tropicalis 15/30 36/72 17/34
Aspergillus 17/34 26/52 19/38
Mucor 19/38 29/58 117/34
Среднее,% 31,5±3,3 61,5±2,8 32,5±2,9

Субстанции обладают достаточно значимым фунгицидным влиянием


на испытуемые штаммы дрожжеподобных грибов рода Candida albicans и
tropicalis. Торможение роста грибов по наличию отсутствия почкования и
формирования мицеллярных структур четко выражено у четвертой
субстанции, несколько более заметное относительно дрожжеподобных
грибов, чем нитчатых плесеней (соответственно 68,0±2,3 и 55,0±2,8; р<0,05).
Иммуномодулирующие свойства. Как видно из представленных данных
(таблица 5.3), не установлено влияния испытуемых субстанций на
фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови человека.
Напротив, регистрируется заметное снижение активности фагоцитов в
присутствии фракции II. Возможно, что это связано с влиянием жирных
кислот, поскольку известно, что пропионат (С3), бутират (С4) и валериат (С5),
тормозят фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов, нарушая
хемотакисис и генерацию активных форм кислорода, ингибируют выработку
оксида азота и подавляют экспрессию молекул межклеточной адгезии.

Таблица 5.3. Фагоцитарное число и % активных фагоцитов


Показатель Фракция II Фракция IV Контроль
Фагоцитарное число 2,8 ± 0,1 2,3 ± 0,1 2,5 ± 0,1
% активных фагоцитов 46,5 ± 2,2 57,9 ± 2,1 52,6 ± 1,9

В связи с этим, было проведено исследование с целью выяснения


влияния испытуемых субстанций на формирование превентивной
воспалительной реакции, отражающей направленный хемотаксис

102
иммунокомпетентных клеток и их взаимодействие в формировании реакции
врожденного иммунитета. В качестве модели использовали
внутрибрюшинное введение испытуемых субстанций беспородным белым
мышам (самцы). Результаты представлены в таблице 5.4.
Как видно из представленных данных, под влиянием испытуемых
субстанций увеличивается содержание клеток в составе перитонеального
экссудата (р<0,001). Введение второй фракции увеличивает содержание
моноцитов (р<0,001) и лимфоцитов в составе экссудата (р<0,01); четвертая
фракция оказывает влияние на концентрации нейтрофильных лейкоцитов и
дендритных клеток (р<0,05-0,01).

Таблица 5.4. Содержание клеток и состав цитограммы перитонеального экссудата


мышей через 48 часов после внутрибрюшинного введения испытуемых субстанций
Показатель Фракция II Фракция IV Контроль
Общее кол-во клеток, 109/мл 19,5 ± 0,8 19,5 ± 0,6 8,6 ± 0,5
Нейтрофилы, % 12,2 ± 0,8 36,1 ± 0,9 27,2 ± 0,6
Моноциты/макрофаги, % 34,9 ± 0,7 27,1 ± 0,6 26,5 ± 0,4
Лимфоциты, % 50,9 ± 0,6 26,9 ± 0,7 36,9 ± 0,6

Известно, что одним из основных условий снижения уровня


воспаления является удаление из очага нейтрофилов и токсических
составляющих. Основным способом инактивации нейтрофилов является их
фагоцитоз макрофагами. С этих позиций особый интерес представляют
выявленные со стороны нейтрофильной инфильтрации под влиянием
фракции IV морфологические изменения (повышение активности
эндонуклеаз, расщепление хроматина), характерные для апоптоза
нейтрофилов, наступают уже через 24 часа после инфильтрации
нейтрофилами участка воспаления и максимально выражены через 48 часов.
Проведенные исследования биологической активности различных
фракций липидно-пигментного комплекса бурой водоросли вида Fucus
vesiculosus позволили выявить бактерицидные, фунгицидные,
антиоксидантные и иммуномодулирующие свойства полученных препаратов,
связанные с наличием в них жирных кислот, включая полиненасыщенные
103
омега-3 и омега-6 кислоты, а также полифенольных соединений.
Наибольший спектр биологической активности проявляет фракция,
растворимая в холодном спирте (фракция IV), что, вероятно, связано с
одновременным наличием в ней относительно больших количеств ПНЖК и
полифенолов.

5.2. Сорбционная характеристика водорослевой клетчатки


5.2.1. Факторы, влияющие на процесс сорбции

Из перечня тяжелых металлов наибольшую опасность для окружающей


среды и человеческого организма представляют свинец, кадмий [18, 205].
Они, находясь в избыточных количествах в окружающей среде, проявляют
свойства экотоксикантов [206]. В связи с этим, проведены исследования
сорбции солей свинца, хрома, кадмия и серебра на водорослевой клетчатке, а
также красителя метиленового синего. В качестве объекта сравнения
использовали МКЦ, как энтеросорбент на основе целлюлозы, и
активированный уголь, как один из наиболее распространенных
энтеросорбентов [207, 208].
Ввиду того, что определяющими параметрами гетерогенного
сорбционного процесса являются температура, водородный показатель среды
продолжительность контакта сорбента и жидкой фазы [209-211], в работе
исследовано влияния данных факторов на сорбционную способность
исследуемых объектов. При этом диапазон температур охватывает
температуру 37 0С, что соответствует условиям применения энтеросорбентов.
Диапазон исследуемых pH охватывает как кислую область, характерную для
желудка, так и нейтральную область соответствующую среде кишечника.
Говоря о времени поглощения токсичных веществ, необходимо учитывать,
что в большей части случаев, абсорбируемые слизистой оболочкой желудка и
кишечника отравляющие и лекарственные вещества доступны для действия
адсорбентов лишь в течение 60-120 минут с момента отравления [212, 213].

104
5.2.2. Структурная характеристика водорослевой клетчатки

Важными структурными характеристиками любого сорбента являются


его удельная поверхность, объем пор и размеры пор. Процесс адсорбции
является гетерофазным и данные параметры будут определять скорость
протекания процессов.
В таблице 5.5 представлена характеристика водорослевой клетчатки
(очищенной и неочищенной) в сравнении с МКЦ и активированным углем.

Таблица 5.5. Структурные характеристики водорослевой клетчатки

Удельная площадь Объем Суммарный Адсорбция


Тип сорбента поверхности, м2/г мезопор, объем пор, метиленового
см3/г см3/г синего, мг/г
Аппаратно** Расчетно***
L.digitata 0 67±3 0 0 61±3
F.vesiculosus 0 66±3 0 0 60±3
L.digitata
50±5 143±5 0,11±0,01 0,12±0,01 130±5
(очищенная )
F.vesiculosus
20±2 79±3 0,04±0,01 0,04±0,01 72±3
(очищенная)
Активированный
уголь 160±16 89±4 0,21±0,02 0,32±0,03 81±4
―Медисорб‖
1,4±0,1
МКЦ 1,4±0,1* 1,5±0,2* - 0,0024*
*- литературные данные [214, 215]
**-выполнено на анализаторе ASAP 2020
***- расчет произведен из сорбционной емкости по отношению к метиленовому синему по
формуле: , где – адсорбция (в граммах) растворенного вещества в расчете
на 1 г твердого вещества, - число Авогадро, 6,02·1023 моль-1, – площадка, занимаемая
одной молекулой растворенного вещества, 130 Å , – молекулярная масса растворенного
2

вещества, 319,9 г/моль.

Удельная поверхность является одним из факторов, влияющих на силу


взаимодействия твердого тела с окружающей средой, будь то газ, жидкость
или другое твердое тело. Из представленных данных видно, что в результате
очистки водорослевая клетчатка приобрела сравнительно развитую
поверхность и пористую структуру с преобладанием мезопор (таблица 5.5).

105
а б

Рисунок 5.1. Размер пор для клетчатки F.vesiculosus (а) и L.digitata (б)

Объем пор и площадь поверхности сопоставимы с параметрами


некоторых активированных углей. Данное явление можно объяснить тем, что
до очистки поверхность клетчатки, вероятно, была покрыта слоем
альгиновых кислот, заполняющих пористую структуру, что подтверждается
микрофотографиями поверхности водорослевой клетчатки до и после
очистки (раздел 4.1, рисунки 4.2 и 4.3). В ходе очистки клетчатка
освобождается от альгиновых кислот. Клетчатка водоросли L.digitata
обладает гораздо более развитой поверхностью и большим объемом пор, чем
клетчатка F.vesiculosus. Это может быть связано с тем, что морфология
тканей ламинариевых водорослей сложнее, чем у фукусовых, так как в
тканях ламинариевых присутствуют проводящие ткани – так называемые
трубчатые нити, которые, возможно, и дают такое значительное увеличение
объема мезопор после очистки. Средний размер пор для клетчатки
F.vesiculosus составляет 11 нм, для L.digitata – 13 нм (рисунок 5.1).
С объемом мезопор связана способность материала сорбировать
крупные органические молекулы, такие как молекулы метиленового синего.
Как видно из представленных результатов, сорбционная способность по
отношению к упомянутому красителю у очищенной клетчатки значительно
превосходит эту характеристику для неочищенной клетчатки (для клетчатки

106
L.digitata данный показатель увеличивается в 2 раза). При этом для клетчатки
водоросли L.digitata характерны гораздо более высокая сорбционная емкость
по отношению к метиленовому синему: 130±10 мг/г и 72±3 мг/г для
очищенной клетчатки L.digitata и F.vesiculosus, соответственно, что,
вероятно, связано со значительным объемом мезо пор.

5.2.3. Механизм сорбционных процессов на поверхности


водорослевой клетчатки

Исследования природы сорбции ионов металлов целлюлозными


материалами позволяют сделать вывод о том, что в качестве активных групп
полимеров могут выступать –СOOН [216-221], –ОН [216-218, 221-224], –СО
[220, 221, 225] группы. При этом, как отмечалось в разделе 1.2.2.5 с учетом
характера межмолекулярных связей внутри микро фибрилл целлюлозы, в
сорбционных процессах проходящих за счет –ОН групп целлюлозы могут
участвовать 20 % –ОН групп у третьего атома углерода для целлюлозы Iβ, а
для целлюлозы Iα – 45 % –ОН групп у третьего и 45 % –ОН групп у второго
атома углерода.
Возможными механизмами связывания ионов металлов
целлюлозосодержащими материалами исследователи отмечают
комплексообразование с участием –ОН [222-224] и –СО [226-228] групп,
ионный обмен с комплексообразованием для –СOOН [220] групп, ионный
обмен с участием карбоксильных и гидроксильных [216-218, 229] групп и
адсорбция физического характера [230, 231]. Взаимодействие целлюлозы с
металлом может осуществляться как с участием негидратированных [232,
233] так и гидратированных катионов [234], а также гидроксокомплексов с
образованием [219] или без образования [235] водородных связей.
Карбоксильные и аминогруппы белков вносят намного меньший вклад в
сорбцию ионов тяжелых металлов по сравнению с полисахаридами [236].

107
По литературным данным, в процессе сорбции происходят изменения
спектральных характеристик функциональных групп, участвующих в
связывании тяжелых металлов [237-240]. При исследовании ИК-спектров до
и после сорбции могут наблюдаться как смещение полосы поглощения, так и
изменения еѐ интенсивности.
Для идентификации функциональных групп, участвующих в
сорбционных процессах была проведена запись ИК-спектров исследуемых
образцов в области 4000-900 см-1 до и после проведения сорбции, на примере
ионов Pb2+ (концентрация 1200 мг/л, время 120 минут, температура 37 °С, рН
водного раствора соли). Результаты получены для образцов очищенной и
неочищенной клетчатки F.vesiculosus, очищенной и неочищенной клетчатки
L.digitata и МКЦ (рисунок 5.2, таблица 5.6).
3338,78

0,03

601,79
2924,09

1033,85
1053,13

Abs
1627,92
1616,35
2854,65

0,015
1107,14
1516,05
1456,26
1745,58

1157,29
1373,32

705,95
1247,94

4000 3000 2000 1500 1000


1/cm

Рисунок 5.2. Типичный ИК спектр водорослевой клетчатки f.vesiculosus

Максимум в области 3270-3280 см-1 указывает на наличие


гидроксильных групп, участвующих в меж- и внутримолекулярных
108
водородных связях. По полученным данным (таблица 5.6) отмечается
падение интенсивности поглощения в данной полосе, что свидетельствует об
участии данной группы в сорбционном процессе.
В области 1610 см-1 наблюдается валентное асимметричное колебание
связи С=О в карбоксилат-анионе, а также наблюдается максимум в области
1420-1450 см-1. В результате сорбции происходит взаимное смещение полос
поглощения данной связи, а также падение интенсивности (до 50 % от
начального), что свидетельствует о ее участии в процессе связывания
металлов.

Таблица 5.6. Полосы поглощения и интенсивности абсорбции ИК спектра


функциональных групп водорослевой клетчатки до и после сорбции ионов свинца
Волновое число, см-1 Интенсивность абсорбции
Сорбент Группа
До сорбции После сорбции До сорбции После сорбции
C-O-C 1105 1105 0,007 0,006
неочищенная

-NH 1520 1520 0,004 0,004


Laminaria
digitata

1456 1454 0,005 0,002


-СООН
1651 1634 0,011 0,008
-СН3, -СН2- 2922 2920 0,012 0,006
-ОН 3339 3337 0,025 0,018
C-O-C 1159 1159 0,002 0,001
неочищенная
F.vesiculosus

-NH 1520 1520 0,003 0,003


1456 1454 0,005 0,002
-СООН
1614 1614 0,019 0,014
-СН3, -СН2- 2924 2922 0,019 0,013
-ОН 3345 3333 0,045 0,027
C-O-C 1107 1107 0,014 0,010
-NH 1520 1520 0,005 0,005
Laminaria
digitata

1454 1427 0,004 0,002


-СООН
1643 1634 0,015 0,010
-СН3, -СН2- 2928 2920 0,007 0,005
-ОН 3343 3339 0,027 0,020
C-O-C 1107 1107 0,007 0,005
F.vesiculosus

-NH 1516 1516 0,005 0,005


1456 1454 0,006 0,003
-СООН
1628 1614 0,015 0,010
-СН3, -СН2- 2924 2855 0,020 0,009
-ОН 3341 3339 0,037 0,036
C-O-C 1103 1103 0,028 0,017
1429 1429 0,008 0,005
МКЦ

-СООН
1636 1631 0,005 0,004
-СН3, -СН2- 2899 2897 0,013 0,008
-ОН 3332 3332 0,044 0,040

109
Идентифицировать амино-группы можно по полосе в области
1510 см-1. Как видно из табличных данных, ни сдвига, ни падения
интенсивности, в данном случае нет, что можно объяснить отсутствием
участия аминокислот и белков в комплексообразовании с ионами металла,
вероятно, в силу стерических затруднений и химической связанности этих
групп. Вместе с этим, нерастворимость остаточных водорослевых белков в
горячей воде и разбавленных растворах щелочей и кислот указывает на
незначительное количество свободных гидрофильных групп (карбоксильные
и аминогруппы) на поверхности молекул. Что так же может указывать на то,
что они связаны или доступ к ним стерически затруднен и они не могут
участвовать в реакциях связывания тяжелых металлов. Белки в составе
водорослевой биомассы, как правило, находятся в связанном состоянии,
например, могут входить в состав клеточной стенки, где находятся в
комплексе с альгинатами. Помимо этого, известна способность полифенолов
образовывать прочные комплексы с белками, как за счет водородных связей
(обратимо), так и за счет ковалентных связей (необратимо).
Из общего сравнения спектров до и после сорбции сильных
структурных изменений не отмечается. Зато очевидно изменение
интенсивности поглощения связей и функциональных групп, что указывает
на различную степень их участия в связывании ионов тяжелых металлов.
Основными единицами, ответственными за протекание процесса сорбции
можно считать карбоксильные и гидроксильные группы. Таким образом, для
неочищенных образцов водорослевой клетчатки высокая способность к
сорбции ионов тяжелых металлов обусловлена, в первую очередь,
целлюлозной составляющей, при этом белковые соединения вносят лишь
незначительный вклад в сорбционную емкость водорослевой клетчатки.
Изменение кислотности среды оказывает влияние на форму
макромолекул, что в свою очередь, может повлиять на характер протекания
сорбционных процессов. Так же, необходимо учитывать, что целлюлозы
высших растений и МКЦ относятся к жесткоцепным полимерам, которые

110
практически не подвержены подобным деформациям макромолекул, в
отличие от водорослевой целлюлозы, являющейся гибко цепным полимером
(на основании значения степени кристалличности).
Радиуса иона и, следовательно, плотность заряда в значительной
степени влияют на склонность ионов к адсорбции. С увеличением плотности
заряда иона увеличивается сила притяжения к противоположно заряженным
микроучасткам сорбента [209, 241, 242]. Ион кадмия имеет радиус 0,099 нм,
ион свинца - 0,126 нм, ион серебра одновалентного - 0,126 нм и ион хрома
двухвалентнтого - 0,126 нм, поэтому сорбционная емкость сорбентов по
отношению к исследуемым катионам теоретически должна располагаться в
следующем ряду Pb2+>Ag+>Cd2+>Cr3+.
Процессы физической и химической адсорбции различаются по
величине энергии взаимодействия сорбата с сорбентом (40-400 кДж/моль для
химической и 10-40 кДж/моль для физической), которую можно установить
исследованием температурной зависимости сорбционного процесса.
Протекание хемосорбции с малым тепловым эффектом может
свидетельствовать о параллельном протекании процесса, требующего
подвода энергии извне (например, диссоциации молекул адсорбата на
поверхности). Не всегда можно провести четкую границу между
адсорбциями особенно при слабой хемосорбции, также как и вообще между
физическим и химическим взаимодействиями. Зачастую процесс
физического характера предшествуют химическим процессам [243]. Высокие
значения теплот всегда свидетельствуют о химических процессах, однако
низкие значения не всегда говорят о физической адсорбции [244].
При анализе литературных данных установлено, что тепловой эффект
процесса адсорбции сильно различается даже для одинаковых сорбентов. И
это может быть связано с целым комплексом процессов. В работе [245]
представлены результаты по сорбции ТМ на, различного вида,
полисахаридных сорбентах (таблица 5.7). Так, процесс адсорбции ионов Cd,
Cu, Fe, Ni, Zn является экзотермическим (-ΔH варьируется от 11,37 кДж/моль

111
(Zn) до наибольшего 42,23 кДж/моль (Сu)). Аналогичные результаты были
получены и при использовании древесной и хлопковой целлюлозы, льняного
волокна как сорбентов. Невысокие величины энтальпии автор объясняет
сложным характером протекающего процесса. Авторами [246] показано, что
процесс адсорбции ионов хрома на еловых опилках является экзотермичным
с величиной ΔH = −11,6±0,3 кДж/моль. При исследовании адсорбции ТМ
стеблями кукурузы [247] прослеживается экзотермический характер
процесса извлечения ионов Zn, Cd, Mn. Эндотермический эффект при
адсорбции ионов ТМ также обнаружен в ряде работ. Так, при использовании
сорбентов на основе кожуры чечевицы, пшеницы и риса [223] для излечения
ионов меди получены значения энтальпии ΔН = 15,373; 18,791; 10,054
кДж/моль, что указывает на эндотермичность процесса. В работе [234]
положительные значения изменения энтальпии показаны для сорбентов из
скорлупы лесного ореха и миндаля. Автор также объяснил возрастание
адсорбции при более высоких температурах активацией поверхности
сорбента и/или увеличением пор. На комплексный характер адсорбции ТМ
указывает и другой ряд авторов [218, 220, 248-250].

Таблица 5.7. Литературные данные по изменению энтальпии сорбционных


процессов тяжелых металлов на волокнистых сорбентах
Сорбент Ион металла ΔН, кДж/моль Ссылка
Отруби пшеничные Cd2+ -38,53 [251]
Cr6+ 22,51 [252]
Cd2+ 22,17 [253]
Pb2+ 11,55 [234]
Pyezoensis Ueda Cu2+ 47,07 [254]
Laminaria japonica Cu2+ 15,89 [254]
Скорлупа лесного ореха Cd2+ 12,21 [234]
Pb2+ 21,41 [234]
Стебли кукурузы Cd2+ -24,27 [247]
Кожура чечевицы Cu2+ 15,37 [223]
Кожура пшеницы Cu2+ 18,79 [223]
Кожура риса Cu2+ 10,05 [223]
Стебли топинамбура Сd2+ -14,09 [245]
Шерстяное волокно Сd2+ 19,03 [245]

112
Таким образом, основными факторами, влияющими на процесс
сорбции тяжелых металлов из растворов целлюлозными сорбентами,
являются время контакта фаз, температура, pH и тип сорбируемого иона.
Составляющими данного процесса могут быть хемосорбция, адсорбции за
счет физических сил, комплексообразование, адсорбции на поверхности и
порах тел, ионный обмен, а также хелатообразование. Для исследования
удельной сорбционной емкости, времени установления равновесия и
установления механизма адсорбционных процессов на водорослевой
клетчатке исследуем влияние основных факторов сорбционного процесса.

5.2.4. Исследование влияния факторов на сорбционную емкость


водорослевой клетчатки по отношению к тяжелым металлам

Влияние продолжительности контакта фаз


Для определения времени достижения адсорбционного равновесия в
данной работе проведена сорбция катионов металлов из растворов
соответствующих солей водорослевой клетчаткой (очищенной и
неочищенной) и активированным углем во времени. По полученным данным
построены зависимости удельной адсорбции от времени при заданной
концентрации ионов металла в растворе (рисунок 5.3).
Анализируя полученные результаты можно сказать, что для
исследованных матриц сорбционное равновесие по отношению к ионам
кадмия и свинца наступает через 60 минут после начала контакта фаз.
Динамика установления сорбционного равновесия свидетельствует о
возможности использования данных препаратов в качестве энтеросорбентов,
поскольку в большей части случаев, абсорбируемые слизистой оболочкой
желудка и кишечника отравляющие и лекарственные вещества доступны для
действия адсорбентов лишь в течение 60-120 минут с момента отравления
[212, 213].

113
а б

в г
Рисунок 5.3. Зависимость удельной адсорбции ионов Cd2+ (а), Pb2+ (б), Ag+ (в) и
Cr3+(г) от времени контакта фаз. Сорбент: 1 – F.vesiculosus неочищенная,
2 - L.digitata неочищенная, 3 - L.digitata очищенная водой, 4 - F.vesiculosus
очищенная водой, 5 - уголь марки Медисорб, 6 - МКЦ

Влияние температуры на сорбционную способность. С целью


установления влияния температуры на сорбционную способность
водорослевой клетчатки, МКЦ и активированного угля по отношению к
ионам металлов было проведено исследование по методике, представленной
в разделе 2.3.2. Температурный диапазон в ходе эксперимента использовали
27-47 °С.
На основе экспериментальных данных были получены коэффициенты
уравнения изотермы Ленгмюра и вычислены термодинамические
характеристики сорбционных процессов (таблица 5.8). Зависимости
предельной удельной адсорбции от температуры представлены на рисунке
5.4.
114
а б

в г
Рисунок 5.4. Зависимость предельной удельной сорбции
от температуры для ионов Cd2+ (а), Pb2+ (б), Ag+(в) и ионов Cr3+(г).
Сорбент: 1 – F.vesiculosus очищенная водой, 2 - L.digitata очищенная водой,
3 - L.digitata неочищенная, 4 - F.vesiculosus неочищенная, 5 - активированный уголь
марки Медисорб, 6 - МКЦ

Таблица 5.8. Изменение энтальпии сорбционных процессов, кДж/моль


F.v. L.d. F.v. L.d. Уголь
МКЦ
неочищенная неочищенная очищенная очищенная Медисорб
Сорбция Cd2+
67,7±3,4 26,4±1,3 24,9±1,2 26,9±1,3 -19,2±1,0 4,44±0,2
2+
Сорбция Pb
9,1±0,5 7,4±0,4 49,3±2,5 37,8±1,9 -8,9±0,4 -7,6±0,4
+
Сорбция Ag
25,9±1,3 18,5±0,9 53,5±2,7 25,1±1,3 -18,9±0,9 37,0±1,9
Сорбция Cr3+
32,8±1,6 38,9±1,9 29,4±1,5 62,6±3,1 -20,6±1,0 -7,0±0,4

115
Значения предельной удельной адсорбции, определенные для
водорослевой клетчатки, активированного угля и МКЦ (рисунок 5.4),
подтверждают, что водорослевая клетчатка эффективно связывает ионы
тяжелых металлов. Процесс адсорбции ионов Cd2+ , Pb2+, Cr3+ и Ag+ на
водорослевой клетчатке является эндотермическим, то есть для него
необходим подвод внешней энергии для активации процесса (таблица 5.8). В
отличие от активированного угля и МКЦ, на которых адсорбция идет с
выделением тепла.
Относительно механизма адсорбции можно предположить, что по
величинам поглощаемой теплоты (24-67 кДж/моль для Cd2+ и 37-49
кДж/моль для Pb2+), процессы на водорослевой клетчатке могут проходить с
преобладанием хемосорбции. Но для некоторых образцов изменение
энтальпии мало (<10 кДж/моль для сорбции ионов свинца образцами не
очищенной клетчатки), что указывает на связывание ионов ТМ за счет
слабых электростатических сил.
В ходе экспериментов выявлен четкий максимум при 37 °С для
образцов водорослевой клетчатки, при этом, сорбционная способность МКЦ
угля уменьшается с увеличением температуры (рисунок 5.4).
Характер зависимости предельной удельной адсорбции от температуры
может указывать на тот или иной характер протекания [209-211, 241]. Для
процессов хемосорбции и ионного обмена характерно увеличение
сорбционной емкости сорбента с ростом температуры, поскольку
хемосорбция является эндотермическим процессом, следовательно, наличие
максимума можно объяснить наличием сорбционных центров с различными
энергиями активации [241, 255].
Влияние pH на сорбционную способность. На основе
экспериментальных данных были получены коэффициенты уравнения
изотермы Ленгмюра. Зависимости предельной удельной адсорбции от рН
представлены на рисунке 5.5. Как видно на рисунке, увеличение основности
среды приводит к увеличению сорбционной емкости образцов.

116
а б

в г
Рисунок 5.5. Зависимость предельной удельной сорбции от pH для: а - ионов
кадмия, б – ионов свинца, в – ионов серебра, г – ионов хрома (3+). Сорбент:
1 – клетчатка F.vesiculosus очищенная, 2 - клетчатка L.digitata очищенная,
3 - клетчатка L.digitata не очищенная, 4 - клетчатка F.vesiculosus не очищенная,
5 - активированный уголь марки ―Медисорб‖, 6 - МКЦ

Изменение рН системы сорбент-раствор сопровождается протеканием


двух процессов, оказывающих влияние на процесс сорбции. Один из
процессов связан с изменением состояния ионов металла в растворе [256,
257]. При низких знаяениях рН металлы существуют преимущественно в
виде ионов, и сорбция в данном случае подчиняется закономерностям
ионного обмена. При увеличнии основности начинаются процессы гидролиза
приводящие к появлению в растворе гидроксокомплексов, при этом, сорбция
металлов на активных центрах сорбента будет происходить не только за счет
ионного обмена, но и процессов комплексообразования [256, 258]. Тем не
менее, согласно литературным данным [259], для свинца и кадмия в

117
использованном нами диапазоне рН не наблюдается образование
гидроксокомплексов и эти металлы находятся в растворе в виде ионов
(рисунок 5.5). Следовательно, повышение сорбционной емкости
обуславливается лишь изменениями упорядоченности внутренней структуры
водорослевой целлюлозы в результате взаимодействий электростатической
природы. В то же время, для ионов хрома наблюдается образование
гидроксокомплексов с повышением pH раствора и при pH=5 ионы хрома
почти на 95 % находятся в состоянии Cr3(OH)43+ (рисунок 5.6), что
обуславливает преимущественные процессы комплексообразования при
связывании хрома водорослевой клетчаткой.
Водорослевая клетчатка представляет собой полиэлектролит,
сорбционными центрами которого являются карбоксильные группы
примесей и гидроксильные группы водорослевой целлюлозы. Кроме того, в
ее структуре присутствуют серосодержащие группы. По мере возрастания
основности среды увеличивается суммарный отрицательный заряд
поверхности водорослевой клетчатки за счет увеличения степени
диссоциации сорбционных центров водорослевой клетчатки [241, 242].
Реакционные центры макромолекул становятся более доступными для
адсорбата, ввиду отталкивания одноименно заряженных участков цепи
полимера, в результате чего собрционная емкость сорбента возрастает. В то
время как в кислой среде происходит сокращение макромолекулы в объеме.
Избыток ионов водорода приводит к экранированию заряда поверхности
макромолекулы сорбента протонами из раствора и снижению количества
продиссоциировавших сорбционных центров вследствие чего, потенциал
двойного слоя снижается [241, 242].

118
а б

в
Рисунок 5.6. Схема распределения форм металлов в зависимости
от рН раствора для ионов кадмия (а), свинца (б) и хрома (в) [259]

Таким образом, показано, что очищенная ВК обладает мезопористой


структурой со средним размером пор 13 нм для L.digitata и 11 нм для
F.vesiculosus и объемом пор 0,11±0,01 и 0,040±0,01 см3/г соответственно.
Площадь поверхности и объем пор сопоставимы с теми же характеристиками
активированных углей.
Очищенная водорослевая клетчатка проявляет высокую сорбционную
активность, в сравнении с широко используемым энтеросорбентом –
активируемым углем и микрокристаллической целлюлозой, по отношению к
ионам исследованных тяжелых металлов. Наибольшая активность отмечается
при температуре 37 оС, что соответствует внутренней среде человеческого
организма. Установлено, что механизм сорбции тяжелых металлов

119
водорослевой клетчаткой имеет эндотермический характер с преобладанием
хемосорбционных процессов, основными реакционными центрами являются
карбоксильные и гидроксильные группы. В исследованном диапазоне pH
наибольшая активность проявляется в не подкисленных водных растворах
исследуемых солей, что соответствует среде кишечника. Исследование
динамики процесса сорбции показывает высокую скорость установления
сорбционного равновесия – менее 60 минут.

5.2.5. Исследование сорбционной емкости по отношению к


патогенным микроорганизмам3

Ввиду того, что непосредственный положительный эффект


энтеросорбентов на человеческий организм заключается не только в
связывании тяжелых металлов, но и с сорбцией микроорганизмов,
необходимо исследовать сорбционную емкость исследуемых субстанций по
отношению к патогенной микрофлоре.
В таблице 5.9 представлены результаты подсчета микроорганизмов до
контакта (контроль) и после контакта с суспензией клетчатки (1г на 5 мл
физ.раствора).
По представленным результатам видно, что все испытуемые
субстанции адсорбируют микроорганизмы, сокращая их концентрации на
32-72 %отн. При этом стоит отметить, что не очищенные образцы
водорослевой клетчатки проявляют наиболее значительные сорбционные
свойства по отношению к испытываемым микроорганизмам.
Грамотрицательные бактерии (кишечная палочка) статистически
достоверно сорбируется более эффективно, чем грамположительные. Менее
эффективно сорбируются дрожжеподобные грибы. В среднем сорбционная
способность не очищенных образцов водорослевой клетчатки выше на
26 ± 2 % для L.digitata и 22±1 %отн. для F.vesiculosus. При этом очищенная
клетчатка L.digitata и F.vesiculosus проявляет сорбционную активность на

120
одном уровне с испытуемым активированным углем марки ―Медисорб‖ и на
5-10 %отн выше, чем у МКЦ, что показывает перспективность ее
использования в качестве энтеросорбента.

Таблица 5.9. Содержание микроорганизмов суспензии после контакта с сорбентом


Сорбент St.epidermis Esherichia coli Bac. Subtilis C.albicans
Абс, %отн* Абс, %отн* Абс, %отн* Абс, %отн*
ед. ед. ед. ед.
Контроль 235±19 0 278±20 0 266±16 0 230±20 0
МКЦ 164±25 -32 155±25 -44 167±25 -37 152±30 -34
Уголь акт. 126±18 -48 132±16 -54 150±18 -46 140±16 -39
L.digitata 74±22 -70 70±22 -85 99±23 -63 106±27 -54
F.vesiculosus 72±22 -71 81±22 -72 62±25 -54 102±26 -55
L.digitata 132±17 -45 135±19 -52 123±17 -44 134±19 -52
очищенная
F.vesiculosus 145±18 -39 143±18 -49 153±17 -43 167±16 -32
очищенная
* - в графе указано снижение содержания микроорганизмов в суспензии
после контакта с сорбентом

Совокупность вышеупомянутых фактов указывает на то, что


очищенная водорослевая клетчатка является перспективным
энтеросорбентом.

121
ВЫВОДЫ

1. Выполненные комплексные исследования компонентного


химического состава, ареалов произрастания и видового разнообразия
арктических бурых водорослей свидетельствуют о перспективности
использования их биомассы для получения широкого спектра биологически
активных веществ медицинского и фармакологического назначения, в том
числе липидов, полифенолов и водорослевой клетчатки.
2. Исследование минерального состава биомассы бурых водорослей
выявило значительное влияние солености и катионного состава морской
воды на общую минерализацию, макро- и микроэлементный состав
макрофитов и образование органо-минеральных комплексов.
3. Изучен групповой и индивидуальный компонентный состав
веществ органической фракции биомассы бурых водорослей. Показано, что
состав липидно-пигментного комплекса характеризуется значительным
содержанием жирных кислот, включая полиненасыщенные омега-3
(Эйкозапентаеновая 5-8 %отн и стеаридоновая 4-5 %отн) и омега-6
(линолевая 9-13 %отн и арахидоновая 10-11 %отн) кислоты и
полифенольных соединений (2-19 %масс).
4. Исследованы структурные особенности водорослевой
целлюлозы. Показано, что она обладает низкой степенью кристалличности:
12 % и 39 % для F.vesiculosus и L.digitata, соответственно. Установлено, что
целлюлоза бурых водорослей содержит кристаллические фазы Iα, Iβ и II,
причем доминирующей формой является метастабильная целлюлоза Iα – ее
содержание составляет 55-56 %.
5. На основании экспериментальных данных о химическом составе,
структуре и протолитических свойствах компонентов бурых водорослей
предложена методология разделения их биомассы, новизна которой
заключается в применении принципов ―зеленой химии‖ (сочетание

122
сверхкритической флюидной и жидкостной экстракции) для
последовательного разделения растительной матрицы.
6. Проведенные исследования биологической активности
различных фракций липидно-пигментного комплекса бурой водоросли вида
Fucus vesiculosus позволили выявить бактерицидные, фунгицидные,
антиоксидантные и иммуномодулирующие свойства полученных препаратов,
связанные с наличием в них полиненасыщенных жирных кислот и
полифенолов.
7. Изучены сорбционные свойства водорослевой клетчатки.
Показано, что очищенная водорослевая клетчатка обладает мезопористой
структурой со средним размером пор 13 нм для L.digitata и 11 нм для
F.vesiculosus и объемом пор 0,11±0,01 и 0,040±0,01 см3/г соответственно.
Механизм сорбции тяжелых металлов водорослевой клетчаткой имеет
эндотермический хемосорбционный характер (энергии активации 20-70
кДж/моль), основными реакционными центрами являются карбоксилбные и
гидроксильные группы водорослевой целлюлозы. Сравнительная
характеристика сорбционных свойств МКЦ, активированного угля и
исследуемых образцов водорослевой клетчатки показывает значительно
большую эффективность водорослевых сорбентов (сорбционная емкость на
50-200 % выше) по отношению к исследуемым ионам тяжелых металлов.
8. Установлено, что очищенная водорослевая клетчатка проявляет
сорбционную активность по отношению к патогенным микроорганизмам на
одном уровне с испытуемым активированным углем и на 5-10 % выше, чем у
МКЦ, что показывает перспективность ее использования в качестве
энтеросорбента.

123
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Блинова Е.И. Водоросли-макрофиты и травы морей европейской


части Росси (флора, распространение, биология, запасы, марикультура). -
Москва: Изд-во ВНИРО. – 2007. - 114 с.
2. Воскобойников Г.М. Механизмы адаптации, регуляции роста и
перспективы использования макрофитов Баренцева моря: дисс. докт. биол.
наук. – Мурманск. – 2006. – 45 с.
3. Флора и фауна Белого моря: иллюстрированный атлас / под ред.
Цетлина А.Б. М.: КМК. – 2010. - 471 с.
4. Nielsen R., Kristiansen A., Mathiesen L., Mathiesen H. Distributional
index of the benthic marine macroalgae of the Baltic Sea area //
ActaBotanicaFennica. - 1995. - № 155. - Р. 1-70.
5. Государственный доклад о состоянии и об охране окружающей
среды в Российской Федерации в 2013 году [электронный ресурс]. Режим
доступа: http://ecogosdoklad.ru/2013/wwwBio1_4_5.aspx (дата обращения
21.03.2017).
6. Пронина О.А. Современная методика оценки и состояние состояние
запасов промысловых водорослей Белого моря // Тезисы докладов VIII съезда
Гидробиологического общества РАН (Калининград, 16-23 сент 2001г.): в 3т.
– Калининград: ГО РАН. - 2001. - Т.1. - С.66-67.
7. Мельник Р.А. Современное состояние зарослей и динамика запасов в
ламинариевых сообществах в районе островов Большая и Малая Муксалма /
Сборник тезисов докладов научно-практической конференции по водным
ресурсам, включая биологические ресурсы, Соловецкого архипелага (6-8
июня 2014, поселок Соловецкий). – Архангельск: САФУ. - 2014. - С. 40-42.
8. Семушин А.В. и др. Ресурсный потенциал водных экосистем
Соловецкого архипелага / Сборник тезисов докладов научно-практической
конференции по водным ресурсам, включая биологические ресурсы,

124
Соловецкого архипелага (6-8 июня 2014, поселок Соловецкий). –
Архангельск: САФУ. - 2014. - С. 50-53.
9. Камнев А.Н. Структура и функции бурых водорослей. – М.: Изд-во
МГУ. – 1989. – 200 с.
10. Вафина Л.Х. Обоснование комплексной технологии переработки
бурых водорослей при получении функциональных пищевых продуктов:
дисс. канд.хим.наук. – Москва. - 2010. – 290 с.
11. Davis T.A., Volesky B., Mucci A. A review of the biochemistry of
heavy metal biosorption by brown algae // Water Research. – 2012. – № 37. –
P. 4311-4330.
12. Лемеза Н.А. Альгология и микология. Практикум: учеб. пособие. –
М.: Высшая школа. – 2008. – 203 с.
13. Ruperez P. Mineral content of edible marine seaweeds // Food
Chemistry. – 2002. – № 79. – P. 23-26.
14. Цзи Мин-хоу, Чжан Янь-са. Хаян лойчжао // РЖХ – 1962. – Т. 5. -
№ 4. – С. 101-103.
15. Гудимов А.В. Мидия Mytilus edulis L. Промысловые и
перспективные для использования водоросли и беспозвоночные Баренцева и
Белого морей. – Апатиты: Изд-во КНЦ РАН. – 1998. – С. 529-581.
16. Ли Ай-цзе, Сунь Чжоу-тянь. Шуйгань сюэбао // РЖХ. – 1966. – №3.
– С. 62-67.
17. Иванов В.Г. и др. Обмен и накопление Zn водорослями // материалы
3го Всесоюзного совещания по морской альгологии – макрофитобентосу. –
Киев: Наук. думка. – 1979. – С. 51-52.
18. Давыдова С.Л., Тагасов В.И. Тяжелые металлы как
супертоксиканты XXI века: учеб. пособие. – М.: Изд-во РУДН. – 2002. –
140с.
19. Conti M. E. et. al. Baseline trace metals in seagrass, algae, and mollusks
in a southern tyrrhenian ecosystem (Linosa Island, Sicily) // Archives of
Environmental Contamination and Toxicology. – 2010. – № 58. – P. 79–95.

125
20. Подкорытова А.В., Кадникова И.А. Качество, безопасность и
методы анализа продуктов из гидробионтов. Вып. 3. Руководство по
современным методам исследований морских водорослей, трав и продуктов
их переработки. – М.: Изд-во ВНИРО. – 2009. – 108 с.
21. Almela C. et al. Heavy metal, total arsenic, and inorganic arsenic
contents of algae food products // Journal of Agriculture and Food Chem. – 2002. –
№ 50. – P. 918-923.
22. Sam C.Y. Determination of toxic and trace elements in algae by
instrumental neutron activation analysis // Journal of Radioanalytical and Nuclear
Chemistry. – 1999. – Vol.240. - №1. – P. 95-100.
23. Romari's-Hortas V. et al. Characterization of Edible Seaweed Harvested
on the Galician Coast (Northwestern Spain) Using Pattern Recognition Techniques
and Major and Trace Element Data // Journal of Agriiculture and Food Chemistry.
– 2010. – № 58. – P. 1986-1992.
24. Narayan B. et al. Physiological effects of eicosapentaenoic acid (EPA)
and docosahexaenoic acid (DHA) — a review // Food Reviews International. –
2006. – № 22. - P. 291-307.
25. Murata M., Nakazoe J. Production and use of marine algae in Japan //
Japan Agricultural Research Quarterly. – 2001. – № 35. – P. 281-290.
26. Bhaskar N., Hosokawa M., Miyashita K. Comparative evaluation of fatty
acid composition of different Sargassum (Fucales, Phaeophyta) species harvested
from temperature and tropical waters // J. Aquat. Food. Prod. Technol. – 2004. –
№ 3. – P. 53-70.
27. Khotimchenko S.V. Lipids from the marine alga Gracilaria verrucosa //
Chem Nat Compd. – 2005. – № 41. – P. 285-288.
28. Sanchez-Machado D.I. et. al. An HPLC method for the quantification of
sterols in edible seaweeds // Biomedical Chromatography. – 2004. – № 18. –
P. 183-190.
29. Khotimchenko S.V. Fatty acid composition of seven Sargassum species
// Phytochemistry. – 1991. –Vol. 30. – № 8. – P. 2639-2641.

126
30. Муравьева Е.А. Комплексная технология получения экстрактивных
БАВ из бурых водорослей Белого моря // Рыбная промышленность. – 2010. –
№3. – С. 54-57.
31. Fleurence J. et al . Fatty acids from 11 marine macroalgae of the French
Brittany coast // Journal of Applied Phycology. – 1994. – № 6. – P.527-532.
32. Bharat K. R. et al. Fatty acid content in seaweeds from the Baltic Sea
and the Indian Ocean // Oceanologia. – 1997. – Vol.39. – N 3. – P.279-287.
33. Gosch B.J. et. аl. Total lipid and fatty acid composition of seaweeds for
the selection of species for oil-based biofuel and bioproducts // GCB Bioenergy. –
2012. – № 4. – P. 919-930.
34. Maeda H et al. Fucoxanthin from edible seaweed, Undaria pinnatifida,
shows antiobesity effect through UCP1 expression in white adipose issues //
Biochem Biophys Res Commun. – 2005. – № 332. – P. 392-397.
35. Khan M.N.A. et al. Isolation of two anti-inflammatory and one
proinflammatory polyunsaturated fatty acids from the brown seaweed Undaria
pinnatifida // J. Agric. Food Chem. - 2007. – № 55. – P. 6984-6988 .
36. Ishihara K. Inhibition of icosanoid production in MC/9 mouse mast cells
by n-3 polyunsaturated fatty acids isolated from edible marine algae // Biosci
Biotechnol Biochem. – 1998. – № 62. – P. 1412-1415.
37. Rowan K.S. Photosynthetic pigments of algae. Cambridge university
press. –1989. – 334 p.
38. Weiqi Fu et al. UPLC-UV-MSE analysis for quantification and
identification of major carotenoid and chlorophyll species in algae // Analytical
and Bioanalytical Chemistry. – 2012. – № 404. – P.3145-3154.
39. Cubas C., Gloria Lobo M., Gonzalez M. Optimization of the extraction
of chlorophylls in green beans (Phaseolus vulgaris L.) by N,N-dimethylformamide
using response surface methodology // Journal of Food Composition and Analysis.
– 2008. –Vol. 21. – №2. – P.125-133.

127
40. Chernomorsky S., Segelman A., Poretz R.D. Effect of dietary
chlorophyll derivatives on mutagenesis and tumor cell growth // Tera Carc Mut. –
1999. – № 19. – P. 313-322.
41. von Elbe J.H., Schwartz S.J. Colorants. – New York: Marcel Dekker. –
1996. – 300 p.
42. Stewart W.D.P. Algal Physiology and Biochemistry. – University of
California Press. – 1974. – 989 p.
43. Demmig-Adams B., Adams W. Photoprotection and other responses of
plants tohigh light stress // Annual Review of Plant Biology. – 1992. – № 43. –
P.599-626.
44. Haugan J.A., Liaaen-Jensen S. Isolation and characterisation of four
allenic (6'S)-isomers of fucoxanthin // Tetrahedron Letters. – 1994. – № 35. –
P. 2245.
45. Strain R.E. An ascitic fluid bank // The American Journal of Surgery. –
1944. – Vol. 63. – №1. – P.1-2.
46. Jensen A. Tocopherol determination in seaweeds / Proceedings of the
Fifth International Seaweed Symposium. – 1966. - Vol. 3. – P. 281-286.
47. Nietsche L. Determination of carotenoids in brown algal // Food
Chemistry. – 1974. – № 1. – P.34-42.
48. Maeda H., Hosokawa M., Sashima T., Miyashita K. Antiobesity effect of
fucoxanthin from edible seaweeds and its multibiological functions // ACS
Symposium Series. – 2008. – № 993. – P. 376-388.
49. Hosokawa M., Wanezaki S., Miyauchi K., Kunihara H., Kohno H.,
Kawabata J., Odashima S., Takahashi K. Apoptosis inducing effect of fucoxanthin
on human leukemia cell line HIL-60 // Food Sci Technol Res. – 1999. – № 5. –
P. 243-246.
50. Miyashita H., Hosokawa M. Beneficial health effects of seaweed
carotenoid, fucoxanthin // Marine nutraceuticals and functional foods. – 2008. -
Vol. 1. – P. 297-320.

128
51. Nomura T. et al. Proton-donativeanti oxidant activity of fucoxanthin
with 1,1-diphenil-2-picryhidrazin (DPPH) // Biochemestry and Molecular Biology
International. – 1997. – № 42. – P.361-370.
52. Jan X.J. et al . Fucoxanthin as the major antioxidant in Hizikiafusi
formis, a common edible seaweed // Biosci. Biotechnol. Biochem. – 1999. – № 63.
– P. 605-607.
53. Shiratori K. et. al. Effects of fucoxanthin on lipolysaccharide-induced
inflammation in vitro and in vivo // Exp. Eye Res. – 2005. – № 81. – P.422-428.
54. Van Alstyne K.L. A comparison of three methods for quantifying brown
algal polyphenolic compounds // Journal of Chemical Ecology. – 1995. – № 21. –
P .45-58.
55. Burtin P. Nutritional value of seaweeds // Electron J. Environ. Agric.
Food Chem. – 2003. – № 2. – P. 498-503.
56. Shekhar U. et al. Application of novel extraction technologies for
bioactives from marine algae // Journal of Agricultural and Food Chemistry. –
2013. – № 61. – P. 4667-4675.
57. Chojnacka K. et. al. Biologically active compounds in seaweed extracts
– the prospects for the application // The Open Conference Proceedings Journal. –
2012. – № 3. – P.20-28.
58. Клиндух М.П., Облучинская Е.Д. Сравнительное исследование
химического состава бурых водорослей Fucus vesiculosus и Ascophyllum
nodosum // Вестник МГТУ. – 2013. – Т. 16. - Вып. 3. – C. 466-471.
59. Gupta S. Bioactive potential and possible health effects of edible brown
seaweeds // Trends in Food Science and Technology. – 2011. – № 22. –
P. 315-326.
60. Ganesan P., Kumar C.S., Bhaskar N. Antioxidant preperties of methanol
extract and its solvent fractions obtained from selected Indian red seaweeds //
Bioresour Technol. – 2008. – № 99. – P.2717-2723.

129
61. Kumar C.S., Ganesan P., Bhaskar N. In vitro antioxidant activities of
three selected brown seaweeds of India // Food Chem. – 2008. – № 107. –
P. 707-713.
62. Le Tutour B. Antioxidative activities of algal extracts, synergistic effect
with vitamin E // Phytochemistry. – 1990. – № 29. – P.3759-3765.
63. Zubia M. Payri C., Deslandes E. Alginate, mannitol, phenolic
compounds and biological activities of two range-extending brown algae,
Sargassum mangarevense and Turbinaria ornata (Phaeophyta: Fucales), from tahiti
(French Polynesia) // Journal Applied Phycology. – 2008. – № 20. – P. 1033-1043.
64. Lee S.-H., Jeon Y.-J. Anti-diabetic effects of brown algae derived
phlorotannins, marine polyphenols through diverse mechanisms // Fitoterapia. –
2013. – № 86. – P.129-136.
65. Li Y.-X., Wijesekara I., Li Y. Phlorotannins as bioactive agents from
brown algae // Process Biochemistry. – 2011. – № 46. – P.2219-2224.
66. Kim S.-K., Himaya S. W. A. Medicinal effects of phlorotannins from
marine Brown Algae // Advances in Food and Nutrition Research. – 2011. – № 64.
– P. 97-108.
67. Ragan M.A., Glombitza K.W. Phlorotannins, brown algal polyphenols,
in Progress in Phycological Research. - Bristol: Biopress Ltd. – 1986. - №1. –
P.129-241.
68. FAO/WHO/UNU. Energy and protein requirements / Report of a joint
FAO/WHO/UNU Expert Consultation // World Health Organization Technical
Report Series / – WHO. – Switzerland: Geneva. – 1985. - 100P.
69. Becker E. W. Micro algae as a source of protein // Biotechnology
Advances. – 2007. – № 25. – P. 207-210.
70. Ericson L.E., Sjostrom A.G.M. Amino acids in marine Laminaria
saccharina, Fucus vesiculosus, Sphaceiaria arctica // Acta. Chem. Scand. – 1962. –
№ 6. – P. 305 – 309.
71. Барашков Г.К. Сравнительная биохимия водорослей. – М.: Пищ.
Промышленность. - 1972. – 336 с.

130
72. Kumar C.S., Ganesan P., Suresh P.V., Bhaskar N. Seaweeds as a source
of nutritionally beneficial compounds — a review // J Food Sci Technol. – 2008. -
№ 45. - P. 1–13.
73. McHugh D.J. Production and utilization of products from commercial
seaweeds // FAO Fisheries Technical Paper. - 1987. - № 288. - P. 1-189.
74. Tseng C.K. Algal biotechnology industries and research activities in
China // Journal Applied Phycology. - 2001. - № 13. - P. 375-380.
75. Клочкова Н.Г., Березовская В.А. Водоросли камчатского шельфа.
Распространение, биология, химический состав. – Владивосток: Дальнаука. –
1997. – 155 с.
76. Lewis G., Stanly N., Guist G. Commercial production and applications
of algal hydrocolloids. – Seattle: University of Washington. - 1988. - 248 p.
77. Hoppe H.A., Levring T., Tanaka Y. Marine algae in pharmaceutical
science. – Berlin – New York. 1979. – 351 p.
78. Frei E., Preston R. D. Configuration of alginic acid in marine brown
algae// Nature. - 1962. - № 196. - P.130-134.
79. Freile-Pelegrin Y., Morales L.J. Antibacterial activity in Marine Algae
from the Coast of Yucatan. Mexico // Bot. Marina. - 2004. - № 47. - P. 140-146.
80. Гурин И.С., Ажгихин И.С. Биологически активные вещества
гидробионтов – источник новых лекарств и препаратов. - М.: Наука. - 1981. -
186 с.
81. Барашков И.К. Химия водорослей. – М.: Изд-во Академии наук
СССР. - 1963. – 340 с.
82. Зинова А.Д. О некоторых особенностях флоры Белого моря // Тр.
Всесоюз. гидробиол. о-ва. – 1950. – Т. 2. – С. 231–252.
83. Титова Л.М. Исследование кинетики процесса экстрагирования в
технологии комплексной переработки цитрусовых / Л.М. Титова,
И.Ю. Алексаян // Вестник АГТУ. – 2013. – № 1 (56). – С. 35-38.

131
84. Horii F., Hirai A., Kitamura R. CP/MAS 13C NMR spectra of the
crystalline components of native celluloses // Macromolecules. - 1987. - № 20. -
Р. 2117–2120.
85. Nicolai E., Preston R. D. Cell-Wall Studies in the Chlorophyceae.
A General Survey of Submicroscopic structure in Filamentous Species // Proc. R.
Soc. London B. - 1952. - P. 140-244.
86. Mihranyan A., Liagostera A. P., Karmhag R., Stromme M., & Ragnar
Ek. Moisture sorption by cellulose powders of variying crystallinity // International
Journal of Pharmaceutics. - 2004. - № 269. - P. 433-442.
87. Jmel M. A., Messaoud G. B., Marzouki M. N., Mathlouthi M.,
Smaali I.,Physico-chemical characterization andenzymatic functionalization of
Enteromorpha sp. cellulose // Carbohydrate Polymers. - 2016. - № 135. -
P. 274-279.
88. Гальбрайх Л.С. Целлюлоза и ее производные // Соросовский
образовательный журнал. – 1996. - №11. – С. 47-53.
89. Карманов А.П. и др. Физические свойства bulk-and-wise –
полимеров // Химия древесины. – 1991. - №1. – С. 69-73.
90. Фенгел Д., Вегенер Г. Древесина (химия, ультраструктура,
реакции): пер. с англ. – М.: Лесная промышленность. - 1988. – 512 с.
91. Богомолов Б.Д. Химия древесины и основы химии
высокомолекулярных соединений. – М.: Лесная промышленность. - 1973. –
400 с.
92. Алешина Л.А. и др. Современные представления о строении
целлюлоз (обзор) // Химия растительного сырья. – 2001. - №1. – С. 5-36.
93. Atalla H. Rajai. Native cellulose: a composite of two distinct crystalline
forms // Science. – 1984. - № 223. – P.283-285.
94. Nishiyama Y. et al. Neutron Crystallography, Molecular Dynamics, and
Quantum Mechanics Studies of the Nature of Hydrogen Bonding in Cellulose Iβ //
Biomacromolecules. – 2008. - V.9. - №11. – Р.3133-3140.

132
95. Wada M., Okano T. Localization of Iα and Iβ phases in algal cellulose
revealed by acid treatment // Cellulose. – 2001. - № 8. – P.183-188.
96. Yamamoto H., Horii F. In Situ crystallization of bacterial cellulose I.
Influence of polymeric additives, stirring and temperature on the formation
celluloses Iα and Iβ as revealed by cross polarisation/magic angle spinning
(CP/MAS) 13C NMR spectroscopy // Cellulose. - 1994. - № 1. - Р. 57-66.
97. Грунин Ю.Л. и др. Особенности структурной организации и
сорбционных свойств целлюлозы // Высокомолекулярные соединения. - 2015.
- Серия А. - Том 57. - №1. - с.46-55.
98. French A., Johnson G. Cellulose and the twofold screw axis: modeling
and experimental arguments // Cellulose. – 2009. - № 16 – P. 959-973.
99. Nishiyama Y. et al. Crystal structure and hydrogen bonding system in
cellulose Iα from synchrotron X-ray and neutron fiber diffraction // Journal of
American Chemical Society. - 2003. - V. 125. - №47. - P. 14300-14306.
100. Nishiyama Y. Structure and properties of the cellulose microfibril //
Journal of Wood Science. – 2009. - № 55. – P.241-249.
101. Лукьянов А.Н., Кононова О.Н. Неоднородные сорбенты. –
Красноярск: Сибирский федеральный университет. - 2012. – 190 с.
102. Zaidul I.S.M. et al. Supercritical carbon dioxide (SC–CO2) extraction
and fractionation of palm kernel oil from palm kernel as cocoa butter replacers
blend // Journal of Food Engineering. - 2006. – Vol.73. - №3. – P. 210–216.
103. Zaidul I.S.M. Supercritical carbon dioxide (SC–CO2) extraction of
palm kernel oil from palm kernel // Journal of Food Engineering. – 2007. – № 79.
– P. 1007–1014.
104. Mendes R.L., Nobre B.P., Cardoso M.T. et al. Supercritical carbon
dioxide extraction of compounds with pharmaceutical importance from microalgae
// Inorganica Chimica Acta. – 2003. – № 356. – P. 328–334.
105. Jaren-Galan M., Nienaber U., Schwartz S.J. Paprika (Capsicum annu-
um) oleo-resin extraction with supercritical carbon dioxide // Journal of
Agricultural and Food Chemistry. - 1999. - № 47. - P. 3558–3564.

133
106. Crampon C., Boutin O., Badens E. Supercritical carbon dioxide
extraction of molecules of interest from microalgae and seaweeds // Industrial &
Engineeringand Chemistry Research. - 2011. - № 50. - P. 8941–8953.
107. Пат. 2233104 Российская Федерация, МПК7 А 23 L 1/30, А 23 L
1/337. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением
иодсодержащих полисахаридных продуктов / Аминина Н.М., Вишняевская
Т.И., Гургулева О.Н., Подкорытова А.В.;. заявитель и патентообладатель
Федеральное государственное унитарное предприятие Тихоокеанский
научно-исследовательский рыбохозяйственный центр ФГУП "ТИНРО-
Центр". - № 2002133172/13; заявл. 09.12.2002; опубл. 27.07.2004. – 3 с.
108. А. С. 1381925 СССР, МПК4 С 07 С 31/26. Способ получения
маннита из водорослей ламинарии. – 1987.
109. Пат. 2005485 Российская Федерация, МПК5 А 61 К 35/80. Способ
получения средства для лечения заболеваний кожи у животных /
Батраков С. Г., Тимофеев Б. А., Бондаренко С. В. и др.;. заявители и
патентообладатели Батраков С. Г., Тимофеев Б. А., Бондаренко С. В. и др. –
№ 4926615/15; заявл. 12.04.1991; опубл. 15.01.1994. – 3 с.
110. Пат. 93002017 Российская Федерация, МПК6 А 61 К 35/80. Способ
получения липидного концентрата из бурых водорослей / Батраков С.Г.,
Бондаренко С.В., Митрофанова Т.К., Сухоруков А.М.;. заявитель и
патентообладатель Батраков С.Г., Бондаренко С.В., Митрофанова Т.К.,
Сухоруков А.М. - № 93002017/14; заявл.10.03.1995; опубл. 10.03.1995. – 4 с.
111. Пат. 2240816 Российская Федерация, МПК7 A 61 K 35/80, A 61 K
31/715. Способ комплексной переработки бурых водорослей с получением
препаратов для медицины и косметологии / Шевченко Н.М., Имбс Т.И.,
Урванцева А.М. и др.; заявитель и патентообладатель Тихоокеанский
институт биоорганической химии Дальневосточного отделения РАН. –
№ 2003123744/15; заявл. 28.07.2003; опубл. 27.11.2004. – 3 с.
112. Пат. 2399298 Российская Федерация, МПК-2009 A 23 L
1/00.Способ переработки бурых водорослей / Герасименко Н.И.,

134
Бузарова Н.Г., Козловская Э.П.;. заявитель и патентообладатель
Тихоокеанский институт биоорганической химии дальневосточного
отделения Российской академии наук. – № 2009119267/13; заявл. 21.05.2009;
опубл. 20.09.2010. – 4 с.
113. Пат. 2194525 Российская Федерация, МПК7 A 61 K 35/80, A 61 K
31/734, A 61 P 39/00, A 61 P 1/10. Способ получения биологически активных
веществ из ламинарии для медицинских целей / В.А.Компанцев,
Н.Ш.Кайшева, И.И.Самокиш, Е.В.Компанцева; заявитель и
патентообладатель Пятигорская государственная фармацевтическая
академия. – № 2001119833/14; заявл. 16.07.2001; опубл. 20.12.2002. – 4 с.
114. Пат. 2135518 Российская Федерация, МПК6 C 08 B 37/00, C 08 B
37/18, C 07 H 1/08. Способ получения водорастворимых полисахаридов
бурых водорослей / Звягинцева Т.Н., Шевченко Н.М., Попивнич И.Б.;
заявитель и патентообладатель Тихоокеанский институт биоорганической
химии дальневосточного отделения Российской академии наук. -
№ 98111675/04; заявл. 17.06.1998; опубл. 27.08.1999, Бил. N 23. – 3 с.
115. Пат. 2132622 Российская Федерация, МПК6 A 23 L 1/0532, A 61 K
35/80. Способ переработки бурых водорослей / Некрасова В.Б.,
Никитина Т.В., Курныгина В.Т., Белозерских О.А.;. заявитель и
патентообладатель Товарищество с ограниченной ответственностью
"Фитолон". - № 98104941/13; заявл. 16.03.1998; опубл. 10.07.1999. – 4 с.
116. Пат. 2142812 Российская Федерация, МПК6 A 61 K 35/80, B 01 D
11/02. Способ комплексной переработки сухого сырья водорослей /
Герасименко Н.И., Фомин В.В., Вайштейн В.А., Каухова И.Е.,
Лимаренко Ю.А.;. заявитель и патентообладатель Товарищество с
ограниченной ответственностью "Научно- производственная фирма
"Фаркос". – № 98107768/14; заявл. 21.04.1998; опубл. 20.12.1999. – 3 с.
117. Пат. 2070808 Российская Федерация, МПК6 A 23 L 1/052, C 12 P
19/02, A 01 G 33/00, A 23 K 1/14. Способ комплексной переработки бурых
водорослей / Подкорытова А.В., Аминина Н.М., Зимина Л.С., Кушева О.А.,

135
Константинова Н.Ю.;. заявитель и патентообладатель Тихоокеанский
научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии. -
№ 5067045/13; заявл. 27.12.1996; опубл. 27.12.1996. – 3 с.
118. Пат. 2360545 Российская Федерация, МПК-2009 A 23 L 1/337.
Способ комплексной переработки бурых водорослей / Герасименко Н.И.,
Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н., Козловская Э.П.;. заявитель и
патентообладатель Тихоокеанский институт биоорганической химии
дальневосточного отделения Российской академии наук. - № 2008107376/13;
заявл. 26.02.2008; опубл. 10.07.2009. – 4 с.
119. Облучинская Е.Д. Технология комплексной переработки бурых
водорослей // Инновационный потенциал Кольской науки. – 2005. - №1 –
С. 280 – 284.
120. Пат. 2028153 Российская Федерация, МПК5 A 61 K 35/80. Способ
получения биологически активных веществ из ламинарии / Макарова Р.Н.,
Самокиш И.И., Компанцев В.А. и др.; заявитель и патентообладатель
Пятигорский фармацевтический институт. - № 4938465/14; заявл. 20.05.1991;
опубл. 09.02.1995. – 4 с.
121. Fitzgerald C., Callagher E. et al. Heart health peptides from macroalgae
and their potential use in functional foods // Journal of Agriculrual & Food
Chemistry. – 2011. – № 59. – P. 6829–6836.
122. Mustafa А. Pressurized liquid extraction as a green approach in food
and herbal plants extraction: A review // Analytica Chimica Acta. – 2011. –
№ 703. – P. 8–18.
123. Wijngaard H., Hossain M.B. Techniques to extract bioactive
compounds from food by-products of plant origin // Food Research International. –
2012. – № 46. – P. 505–513.
124. Garcia A., Lucas A.D., Rincon J. Supercritical carbon dioxide
extraction of fatty and waxy material from rice bran // Rincon et al. Journal of
American Oil Chemists Society. – 1996. – Vol.73. – P. 1127–1131.

136
125. Herrero M., Castro-Puyana M., Mendiola J.A. Compressed fluids for
the extraction of bioactive compounds // Trends in Analytical Chemistry. – 2013. –
№ 43. – P. 67–83.
126. Raventуs M., Duarte S., Alarcуn R. Application and possibilities of
supercritical CO2 extraction in food processing industry: an overview /
M. Raventуs, S. Duarte, R. Alarcуn // Food Science Technology International. –
2002. – Vol.8. - N 5. – P. 269–284.
127. Friedlienberg, M. H. G. Chlorophyll in seaweeds // Biochem. Etbiophis.
acta. – 1954. – Vol. 14. - N 1. – P. 136.
128. Supercritical fluid extraction of nutraceuticals and bioactive compounds
/ edited by Jose L.Martinez. – CRC Press. - 2008. – 420p.
129. Авакова О.Г. Водорослевая клетчатка как эффективный
энтеросорбент по отношению к соединениям тяжелых металлов // Материалы
междунар. конф. студ. и аспирантов по фундамент, наукам «Ломоносов -
2005». М.: Изд-во ХФ МГУ. - 2005. - Т.1. - С. 53.
130. Herrero M., Cifuentes A., Ibanez E. Sub- and supercritical fluid
extraction of functional ingredients from different natural sources: Plants, food-by-
products, algae and microalgae: A review // Food Chem. – 2006. – № 98. –
P.136-148.
131. Herrero M., Mendiola J. A., Ifuentes A., Ibanez E. Supercritical fluid
extraction: Recent advances and applications // J. Chromatogr. A. – 2010. –
№ 1217. – P.2495-2511.
132. ГОСТ 26185-84. Водоросли морские, травы морские и продукты
их переработки. Методы анализа. - Введ. 1985-01-01. - М.: Стандартинформ. -
2010. - 34 с.
133. ПНД Ф 14.1:2:4.167-2000 Количественный химиеский анализ вод.
Методика выполнения измерений массовых концентраций катионов калия,
натрия, лития, магния, кальция, аммония, стронция, бария в пробах
питьевых, природных, сточных вод методом капиллярного эфектрофореза с
использованием системы капиллярного электрофореза.

137
134. ГОСТ 26927-86. Сырье и продукты пищевые. Методы определения
ртути. – Введ. 1989-07-01. – М.: Изд-во стандартов. - 1989. – 16 c.
135. Bligh E.G., Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and
purification // Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. – 1959. – № 37.
– P. 911–917.
136. Carreau J. P., Dubacq J.P. Adaptation of a macro-scale method to the
micro-scale for fatty acid methyl transesterification of biological lipid extracts //
Journal of Chromatography. – 1978. – № 151. – P. 384-390.
137. Кутакова Н.А., Селянина С.Б., Селянина С.И. Анализ БАВ и
древесной зелени: методические указания к выполнению лабораторных
работ. – Архангельск: Изд-во АГТУ. - 2002. – 33 с.
138. ГОСТ ИСО 14502-1-2010. Чай. Метод определения общего
содержания полифенолов. - Введ. 2010-11-30. – М.: Стандартинформ. - 2012.
– 14 с.
139. Ultra physiological fluid chemical kit. Instructions for use. Cambridge
science park. – 2008. – 32 P.
140. ГОСТ 13496.21 – 87. Корма, комбикорма, комбикормовое сырьѐ.
Методы определения лизина и триптофана. – Введ. 1988-07-01. – М.:
Стандартинформ. - 2011. – 34 с.
141. ГОСТ 53766-2009. Продукция соковая. Определение сахарозы,
глюкозы, фруктозы и сорбита методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии. - Введ. 2009-01-01.- М.: Изд-во стандартов. - 2009. - 14 с.
142. Sluiter A., Hames B., Ruiz R., Scarlata C., Sluiter J., Templeton D.,
Crocker D. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass.
Technical Report. - 2012. – 50 P.
143. Белозерский А.Н., Проскуряков Н.И. Практическое руководство по
биохимии растений.- М.: Красный пролетарий. - 1951. - 388 с.
144. Алешина Л.А., Мелех Н.В., Логинов Д.В. Некоторые
перспективные материалы Северо-Запада Российской Федерации на основе

138
целлюлозы, углерода и силикатов: учебное пособие. - Петрозаводск: Изд-во
ПетрГУ. - 2012. – 209 с.
145. Thygesen A., Oddershede J., Lilholt H., Thomsen A. B., Stahl K. On
the determination of crystallinity and cellulose content in plant fibres// Cellulose. –
2005. – № 12. – Р. 563–576.
146. Алешина Л.А., Шиврин О.Н. Рентгеновский анализ кристаллов.
Теория и результаты дифракционных исследований. – Palmarium Academic
Publishing. – 2012. – 412 c.
147. Rietveld H. M. A Profile Refinement Method for Nuclear and Magnetic
Structures // Journal of Applied Crystallography. - 1969. – № 2. – P. 65-71.
148. Программа "Метод Ритвельда" № 2006610292 от 27.03.2006 //
Программ-ный комплекс PDWin – 4.0. НПО "Буревестник". – СПб. - 2004. –
24 c.
149. ГОСТ 4453-74. Уголь активный осветляющий порошкообразный.
Технические условия. – Введ. 1976-01-01. - М.: Изд-во стандартов. -1992. –
23 с.
150. Ягодин В. И. Изучение химического состава древесной зелени //
Методические основы / В. И. Ягодин, В. Н. Антонов. – Рига : Зинатне. - 1983.
– 240 с.
151. Kipling J.J. Adsorption from solutions of non-electrolytes. Academic
Press. London. - 1965. – 100 P.
152. М-03-505-119-03 Методика количественного химического анализа
металлов в питьевых, минеральных, природных и сточных водах и в
атмосферных осадках атомно-абсорбционным методом.
153. Некрасова Г.Ф., Малѐва М.Г., Новачек О.И. Роль белков в
связывании Cu, Cd, Ni листьями гидрофитов // Вестник Нижневартовского
государственного университета. - 2009. - №1. – с. 50-55.
154. Аминина Н.М., Вишневская Т.И. Исследование процесса
экстракции биогенных и токсичных элементов из бурых водорослей,

139
произрастающих в различных по загрязненности акваториях японского моря
// Известия ТИНРО. – 2011. - Том 164. – С. 40-45.
155. Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. -М.:
Высш. Школа. - 1974. -213 с.
156. Беликов B.B., Точкова Т.В. Реакции комплексообразования в
анализе флавоноидов // Фенольные соединения и их физиологические
свойства: Мат-лы I Всесоюзного симпозиума по фенольным соединениям. -
1973. - Алма-Ата: Наука. - С. 168-172.
157. Balogh-Hergovich E., Kaizer J., Speier G. Kinetics and mechanism of
the Cu (I) and Cu (II) flavonolate-catalyzed oxygenation of flavonol. Functional
quercetin 2,3-dioxygenase models // J. Molecular Catalysis A: Chemical. - 2000. -
Vol. 159. - P. 215-224.
158. Тунакова Ю. А., Мухаметшина Е.С., Шмакова Ю.А. Оценка
сорбционной ѐмкости биополимерных сорбентов на основе альгинатов в
отношении металлов // Вестник Казанского технологического университета. -
Казань. - 2011. - №1. – С. 150-152.
159. Саут Р. Основы альгологии: пер. с англ. / Р. Саут, А. М. Уиттик. –
Москва: Мир. - 1990. – 597 с.
160. Drum R. Medicinal uses of seaweeds [электронный ресурс]: Updated
from Gaia 2008 Conference Notes / Island Herbs. - 2008. Режим доступа: http://
www.ryandrum.com/seaweeds.htm (дата обращения 14.09.2016).
161. The Ultimate source for all nutrition and health related issues
[электронный ресурс]: Is it possible to cure common diseases with simple
nutrition. Режим доступа: http://www.lewrockwell.com/miller/miller20.html
(Дата обращения 28 июня 2015).
162. Коровкина Н.В. Богданович Н.И., Кутакова Н.А. Исследование
состава бурых водорослей Белого моря с целью дальнейшей переработки //
Химия растительного сырья. – 2007. – №1. – С. 59–64.

140
163. Санитарные правила и нормы СанПиН 2.3.2.1078-01
Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых
продуктов. Утв. 06.11.2001 г. – Москва. - 1987. – 36 с.
164. Rezanka T., Vyhnalek O. , Podojil M. Separation and identification of
lipids and fatty acids of the Mmarine alga fucus vesiculosus by TLC and GC-MS //
Folia Microbiologica. - 1988. - № 33. - P.309–313.
165. Jones D.B. Factors for converting percentages of nitrogen in foods and
feeds into percentages of protein // USDA (US Department of Agriculture)
Circular Series. – 1931. – № 183. – P. 1-21.
166. Ramos M.V. et al. Amino acid composition of some brazilian seawees
species // Journal of Food Biochemistry. - 2000. - Vol. 24. - №1. - P. 33-39.
167. Dawczynski C., Schubert R., Jahreis G. Amino acids, fatty acids, and
dietary fiber in edible seaweed products // Food Chemistry. - 2007. - Vol. 103. -
№3. - P. 891-899.
168. Lourenco S.O. et al. Amino acid composition, protein content and
calculation of nitrogen-to-protein conversion factors for 19 tropical seaweeds //
Phycology Research. - 2002. - Vol. 50. - №3. - P. 233-241.
169. Усов А.И., Смирнова Г.П., Клочкова Н.Г. Полисахариды
водорослей. Полисахаридный состав некоторых бурых водорослей Камчатки
// Биоорганическая химия. - 2001. - Т. 27. - №6. - С. 444-448.
170. Усов А.И. Альгиновые кислоты и альгинаты: методы анализа,
определения состава и установления строения // Успехи химии. - 1999. -
Т. 68. - С.1051-1061.
171. Sluiter A. et al. Determination of structural carbohydrates and lignin in
biomass / Technical Report. - 2012. - 50 P.
172. Larsen B. Handbook of phycological methods. Physiological and bio-
chemical methods. - Cambridge: Cambridge Univ. Press. - 1978. - P. 151-156.
173. Nakayasu S., Soegima R., Yamaguchi K. Biological activities of
fucose-containing polysaccharide ascophyllan isolated from the brown alga

141
Ascophyllum nodosum // Bioscience. Biotechnology. Biochemestry. - 2009. -
№ 73. - P.961–964.
174. Rioux L. E., Turgeon S. L., Beaulieu M. Characterization of
polysaccharides extracted from brown seaweeds // Carbohydrate Polymers. - 2007.
- № 69. - P.530–537.
175. Nardella A. Anticoagulant low molecular weight fucans produced by
radical process and ion exchange chromatography of high molecular weight fucans
extracted from the brown seaweed Ascophyllum nodosum // Carbohydrate
Research. - 1996. - № 289. - P.201–208.
176. Daniel R., Berteau O., Chevolot L. Regioselective desulfation of
sulfated L-fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk Pecten
maximus: application to the structural study of algal fucoidan (Ascophyllum
nodosum) // Eur. J. Biochem. - 2001. - № 268. - P.5617–5626.
177. Berteau O. et.al. An un-fractionated fucoidan from Ascophyllum
nodosum: extraction, characterization, and apoptotic effects in vitro //
Glycobiology. - 2002. - № 12. - P.273–282.
178. Reverchon E., De Marco I. Supercritical fluid extraction and
fractionation of natural matter // Journal of Supercritical Fluids - 2006. - № 38. -
P. 146–166.
179. Martinez J.L. Supercritical fluid extraction of nutraceuticals and
bioactive compounds. - CRC Press. - 2008. - 420 p.
180. Mendes R., Reis A., Palavra A. Supercritical CO2 extraction of
gamma-linoleic acid and other lipids from Arthrospira (Spirulina) maxima;
Comparison with organic solvent extraction // Food Chemistry. - 2006. - № 99. -
P. 57-63.
181. Choi K., Nakhost Z., Krukonis V., Karel M . Supercritical fluid
extraction and characterization of lipids from algae Scenedesmus obliquus // Food
Biotechnology. - 1987. - №1(2). - P. 263-281.

142
182. Kolb D.K., Brown J.B. Low temperature solubilities of fatty acids in
selected organic solvents // Journal of the American Oil Chemists' Society. - 1995.
- Vol. 32. - №6. - P. 357-361.
183. Foreman H.D., Brown J.B. Solubilities of the fatty acids in organic
solvents at low temperatures // Oil & Soap. - 1944. - Vol. 21. - №7. - P. 183-187.
184. Пат. 2240329 Российская Федерация, МПК7 C 08 B 37/00, A 23 L
1/0532. Способ получения биологически активного кислого
сульфатированного полисахарида из морских водорослей – фукоидана /
Дядицына А.М., Калинина Е.А., Евдокимова А.С.;. заявитель и
патентообладатель Государственное унитарное предприятие "Северное
отделение полярного научно-исследовательского института морского
рыбного хозяйства и океанографии", Дядицына А.М. - № 2001124124/13;
заявл. 29.08.2001; опубл. 20.11.2004. – 5 с.
185. Пат. 2247574 Российская Федерация, МПК7 A 61 K 35/80.
Средство, обладающее антикоагулянтным и иммунотропным действием /
Шевченко Н.М., Звягинцева Т.Н., Исаков В.В., Кузнецова Т.А. и др;.
заявитель и патентообладатель Тихоокеанский институт биоорганической
химии Дальневосточного отделения РАН. - № 2002135524/15; заявл.
26.12.2002; опубл. 10.03.2005. – 3 с.
186. Пат. 2385654 Российская Федерация, МПК-2009 A 23 L 1/337, A 23
L 1/0532. Способ переработки морских водорослей и функциональные
продукты (варианты) / Подкорытова А.В., Вафина Л.Х., Игнатова Т.А.;.
заявитель и патентообладатель Федеральное государственное унитарное
предприятие "Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного
хозяйства и океанографии" (ФГУП "ВНИРО"). - № 2008126415/13; заявл.
01.07.2008; опубл. 10.04.2010. – 5 с.
187. Пат. 2302429 Российская Федерация, МПК7 C 08 B 37/18, C 07 H
1/08, A 23 L 1/337, A 61 K 31/715, A 61 K 36/03. Способ получения фукоидана
из ламинарии / Врищ Э.А., Ковалев Н.Н., Эпштейн Л.М., Якуш Е.В. и др.;.
заявитель и патентообладатель Федеральное государственное унитарное

143
предприятие "Тихоокеанский научно-исследовательский рыбохозяйственный
центр". - № 2005132687/13; заявл. 24.10.2005; опубл. 10.07.2007. – 3 с.
188. Пат. 2041656 Российская Федерация, МПК5 A 23 L 1/337. Способ
получения пищевого полуфабриката из ламинариевых водорослей /
Подкорытова А.В., Ковалева Е.А., Аминина Н.М.;. заявитель и
патентообладатель Тихоокеанский научно-исследовательский институт
рыбного хозяйства и океанографии. - № 5015521/13; заявл. 23.10.1991; опубл.
20.08.1995. – 4 с.
189. Пат. 2251361 Российская Федерация, МПК7 A 23 L 1/337, A 23 L
1/0532. Способ получения сухого пищевого продукта из ламинариевых
водорослей / Подкорыова А.В.;. заявитель и патентообладатель Подкорытова
А.В. - № 2003120502/13; заявл. 09.07.2003; опубл. 10.05.2005. – 3 с.
190. Пат. 2315487 Российская Федерация, МПК-2006 A 23 L 1/30.
Биологически активный продукт из бурой водоросли, биологически активная
добавка к пище, безалкогольный напиток, парфюмерно-косметическое
средство / Шевченко Н.М., Имбс Т.И., Звягинцева Т.Н. Кусайкин М.И. и др.;
заявитель и патентообладатель Тихоокеанский институт биоорганической
химии дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО
РАН). - № 2006115454/13; заявл. 04.05.2006; опубл. 27.01.2008. – 6 с.
191. Болотова К.С., Чухчин Д.Г., Майер Л.В., Гурьянова А.А.
Морфологические особенности фибриллярной структуры растительной
бактериальной целлюлозы // Лесной журнал. - 2016. - № 6. - С.153-165.
192. Целлюлоза и ее производные: пер. с англ. В 2 томах. - т. 2 / Ред. Н.
Байклз, Л. Сегал. – М.: Мир. – 1974. – 511 с.
193. Комаров В.И. Деформация и разрушение волокнистых
целлюлозных бумажных материалов. – Архангельск: Изд-во АГТУ. – 2002. –
440 с.
194. Nyburg S.C. X–ray. Analysis of Organic Structures. L. F. Fieser and
M. Fieser. New York. - 1961. – 302 p.

144
195. Kuga S., Takagi R.M. Native folded-chain cellulose II // Polymer. -
1993. - № 34. - P. 3293-3297.
196. Никитин Н.И. Химия древесины и целлюлозы. – М.: Изд-во
Академии наук СССР. - 1962. – 711 с.
197. Косточко А.В., Шипина О.Т., Валишина З.Т., Гараева М.Р.,
Александров А.А. Получение и исследование свойств целлюлозы из
травянистых растений // Вестник Казанского технологического университета.
- 2010. - № 9. – С. 99-101.
198. Никитин В.М., Оболенская А.В., Щеголев В.П. Химия древесины
и целлюлозы: Учебное пособие для вузов. - Москва: Лесная
промышленность. - 1978. - 368 с.
199. Алешина Л.А., Мелех Н.В., Фофанов А.Д.Исследования структуры
целлюлоз и лигнинов различного происхождения // Химия растительного
сырья. - 2005. - № 3. - 31-59 с.
200. Sun Y.et al. Structural changes of bamboo cellulose in formic acid //
BioRes. - 2008. - № 3. - P. 297-315.
201. Newman R.H. Crystalline forms of cellulose in softwoods and
hardwoods // J. Wood Chem. Technol. - 1994. - № 14. - P. 451-466.
202. Siddhanta A.K. et al. Profiling of cellulose content in Indian seaweed
species // Bioresour. Technol. - 2009. - № 100. - P. 6669-6673 .
203. Алешина Л.А. Результаты рентгеноструктурного анализа
недревесных целлюлоз // Ученые записки Петрозаводского Государственного
университета. - 2011. - № 8. – С. 114-117.
204. Newman RH. Estimation of the relative proportions of cellulose I alpha
and I beta in wood by carbon-13 NMR spectroscopy // Holzforschung. - 1999. -
№ 53. - P. 335–340.
205. Будников Г.К. Тяжелые металлы в экологическом мониторинге
водных систем // Соросовский обр. жур. - 1998. - №5. – С.23-29.
206. Дабахов М.В., Дабахова Е.В., Титова В.И. Экотоксикология и
проблемы нормирования. – Н. Новгород.: Изд-во ВВАГС. - 2005. – 165 с.

145
207. Ardizzone S. Microcrystalline cellulose powders: structure, surface
features and water sorption capability / S. Ardizzone, F.S. Dioguardi, T. Mussini,
P.R. Mussini, S. Rondinini, B. Vercelli, A, Vertona // Cellulose. – 1999. - № 6. –
P. 57-69.
208. Muqing Yu. et al. Systematic studies on adsorption of 11 trace heavy
metals on thiol cotton fiber // Analitica Chimica Acta. – 2001. - № 428. -
P. 209-218.
209. Адамсон А. Физическая химия поверхностей: пер. с англ. -
М.: Мир. – 1979. – 568 с.
210. Кировская И.А. Адсорбционные процессы. – Иркутск: Изд-во
Иркутского университета. – 1995. – 304 с.
211. Джайлс Ч. и др. Адсорбция из растворов на поверхностях твердых
тел: Пер. с англ. // Под ред. Парфита Г., Рочестера К. – М.: Мир. - 1986. -
488 с.
212. Dillon E.C. Jr., Wilton J.H., Barlow J.C., Watson W.A. Large surface
area activated charcoal and the inhibition of aspirin absorption // Ann Emerg Med.
- 1989. - Vol. 18. - №5. - P. 547-552.
213. Николаев В.Г., Михаловский С.В., Гурина Н.М. Современные
энтерососрбенты и механизмы их действия // Эфферентная терапия. - 2005. -
Т. 11. - № 4. - С. 3-17.
214. Голышкин А.В., Мельников Д.П., Масютин Я.А. Сравнение
площади поверхности сухого и влажного лигноцеллюлозного сырья до и
после предобработки // Лесотехнический журнал. – 2015. - №1. – 152-159 с.
215. Авакова О.Г., Боголицын К.Г. Исследование сорбционной
способности водорослевой клетчатки по отношению к тяжелым металлам //
Материалы междунар. конф. студ. и аспирантов по фундамент, наукам
«Ломоносов - 2004». – М.: Изд-во ХФ МГУ. – 2004. – Т.1. – 80 с.
216. Ставицкая С.С. Сорбционные свойства «пищевых волокон» во
вторичных продуктах переработки растительного сырья // Журнал
прикладной химии. - 2001. - Т. 74. - № 4. - С. 575-578.

146
217. Farooq U. et al. Biosorption of heavy metal ions using wheat based
biosorbents – A review of recent literature // Bioresource Technology. - 2010. -
№ 101. - P. 5043-5053.
218. Demirbas А. Heavy metal adsorption onto agro-based waste materials:
A review // J. Hazard. Mater. - 2008. - № 157. - Р. 220 – 229.
219. Ghodbane I. Hamdaoui O. Removal of mercury (II) from aqueous
media using eucalyptus bark: kinetic and equilibrium studies // J. Hazard. Mater. –
2008. – № 160(2-3). - P. 301-309.
220. Qaizer S., Saleem A.R., Ahmad M.M. Heavy metal uptake by agro
based waste materials // Environ. Biotechnol. – 2007. – № 10. – P. 409-416.
221. Гельферих Ф. Иониты. Основы ионного обмена. – М.: Изд-во
иностр. лит-ры. - 1962. – 492 с.
222. Грунин Ю.Б., Иванова В. Л. Исследование состояния системы
целлюлоза - водный раствор электролита // Бум. пром-сть. - 1984. - № 11. -
С. 14-15.
223. Aydin H. et al. Removal of copper (II) from aqueous solution by
adsorption onto low-cost adsorbents // J. Environ. Management. - 2008. - № 87. -
P. 37–45.
224. Hо Y.S. et al. Kinetics of pollutant sorption by biosorbents: review //
Separ. Purif. Methods. – 2000. – V. 20. – №2. – P.189-232.
225. Malkoc E. Ni(II) removal from aqueous solutions using cone biomass
of Thuia orientalis // J. Hazard. Mater. – 2006. – № 137(2). - P. 899-908.
226. Грунин Л. Ю. и др. Исследование взаимодействий в системе
«целлюлоза – водный раствор электролита» // Бутлеровские сообщения. -
2012. - Т.30. - №5. - С. 103-107.
227. Kelly-Vargas К. et al. Biosorption of heavy metals in polluted water,
using different waste fruit cortex // Physics and Chemistry of the Earth. - 2012. -
№ 37. - P. 26–29.
228. Zhao G. et al. Sorption of heavy metal ions from aqueous solutions: a
review // The Open Colloid Sci. J. – 2011. - № 4. - P. 19-31.

147
229. Ngah W.S.W. Adsorption of copper on rubber (Hevea brasiliensis) leaf
powder: kinetic, equilibrium and thermodynamic studies // Biochem. Eng. J. –
2008. – № 39(3). – P. 521-530.
230. Garcia-Rosales G., Colin-Cruz A. Biosorption of lead by maize (Zea
mays) stalk sponge // Journal of Environmental Management. – 2010. - № 91. – P.
2079-2086.
231. Ofomaja A.E. et al. Effect of pH on cadmium biosorption by coconut
copra meal // J. Hazard. Mater. – 2007. – № 139(2). - P. 356-362.
232. Malkoc E. et al. Determination of kinetic and equilibrium parameters of
the batch adsorption of Cr(VI) onto waste acorn Quercus ithaburensis // Chem.
Eng. Processing. – 2007. – № 46(10). - P. 1020-1029.
233. Farinella N.V. et al. Grape bagasse as a potential biosorbent of metals
in effluent treatments // Bioresource Technol. – 2007. – № 98. – P. 1940-1946.
234. Bulut Y. et al. Adsorption studies on ground shells of hazelnut and
almond // J. Hazard. Mater. – 2007. – № 149(1). - P. 35-41.
235. Hanif M.A. et al. Nikel (II) biosorption by Casia fistula biomass //
J. Hazard. Mater. – 2007. – № 139(2). - P. 345-355.
236. Schiewer S., Wong M.H. Ionic strength effects in biosorption of metals
by marine algae // Chemosphere. - 2000. - № 41. - P. 271–282.
237. Lodeiro P., Barriada J.L., Herrero R., Sastre de Vicente M.E. The
marine macroalga Cystoseira baccata as biosorbent for cadmium(II) and lead(II)
removal: Kinetic and equilibrium studies // Environmental Pollution. – 2006. -
№ 142. – P. 264-273.
238. Mata Y.N., Blazquez M.L., Ballester A., Gonzalez F., Munoz J.A.
Characterization of the biosorption of cadmium, lead and copper with the brown
alga Fucus vesiculosus // Journal of Hazardous Materials. – 2008. - № 158. –
P. 316-323.
239. Sheng P.X. et al. Sorption of lead, copper, cadmium, zinc, and nickel
by marine algal biomass: characterization of biosorptive capacity and investigation
of mechanisms // J. of Colloid and Interface Sci. - 2004. - № 275. - P. 131-141.

148
240. Chen J.P., Yang L., Chemical modification of Sargassum sp. for
prevention of organic leaching and enhancement of uptake during metal
biosorption // Ind. Eng. Chem. Res. - 2005. - № 26. - P. 9931–9942.
241. Воюцкий С.С. Курс коллоидной химии: 2-е изд., перераб. и доп.
М.: Химия. - 1976. – 512 с.
242. Тенфорд Ч. Физическая химия полимеров: Пер. с англ. - М.: Наука.
– 1965. – 772 с.
243. Фролов Ю.Г. Курс коллоидной химии. Поверхностные явления и
дисперсные системы. Учебник для вузов. 2-е изд., перераб. и доп.// М.:
Химия. - 1988. - 464 с.
244. Карнаухов А.П. Адсорбция. Текстура дисперсных и пористых
материалов. – Новосибирск: Наука. Сиб. предприятие РАН. – 1999. – 470 с.
245. Физико-химические основы хемоорбции ионов d-металлов
модифицированными целлюлозосодержащими материалами: дис. докт. хим.
наук / Т.Е. Никифорова. – Иваново. - 2014. - 365 с.
246. Ahmad R. Sawdust: cost effective scavenger for the removal of
chromium (III) ions from aqueous solutions // Water Air Soil Pollut. – 2005. –
№ 163. – P. 169-183.
247. El-Sayed G.O. et al. Removal of Zn(II), Cd(II) and Mn(II) from
aqueous solutions by adsorption on maize stalks // The Malaysian J. Analyt. Sci. -
2011. - V.15. - №18. – P. 8-21.
248. Sud D. et al. Agricultural waste material as potential adsorbent for
sequestering heavy metal ions from aqueous solutions – A review // Bioresource
Technology. – 2008. – № 99. – P. 6017–6027.
249. Basso M.C. et al. Lignocellulosic materials as potential biosorbents of
trace toxic metals from wastewater // Chem. Res. – 2002. – № 41. – P. 3580-3585.
250. Gardea-Torresdey J.L. et al. Use of phytofiltration technologies in the
removal of heavy metals: a review // Pure Appl. Chem. - 2004. - № 76. -
P. 801-813.

149
251. Singh K.K. et al. Low cost bio-sorbent wheat bran for the removal of
cadmium from wastewater: kinetic and equilibrium studies // Biores. Technol. –
2006. – № 97. – P. 994-1001.
252. Singh K.K. et al. Removal of Cr(VI) from aqueous solutions using
wheat bran // Chem. Eng. J. – 2009. – № 151. – P. 113-121.
253. Nouri L. et al. Ultrasonication-assisted sorption of cadmium from
aqueous phase by wheat bran // J. Phys. Chem. A. – 2007. – № 111. –
P. 8456-8463.
254. Wang X.S. et al. A comparative study of removal of Cu(II) from
aqueous solutions by locally low-cost materials: marine macroalgae and
agricultural by-products // Desalination. – 2009. – № 235. – P. 146-159.
255. Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии: учебник для вузов. –
Л.: Химия. - 1984. – 368 с.
256. Юрьев В.И., Позин С.С., Скурихина Г.М. Изучение
адсорбционных и электрокинетических свойств сульфитной и сульфатной
целлюлоз по отношению к растворам солей алюминия // Тр. Ленингр.
лесотех. Акад. – 1960. - №91. – С. 11-19.
257. Айзенштадт А.М., Боголицын К.Г. Оценка возможности
использования системы на основе сульфатов железа в качестве медиатора в
косвенной оксредметрии // ИВУЗ Лесной журнал. – 2000. – №2. – С. 116-122.
258. Иванов А.В. и др. Сорбция ионов переходных металлов и свинца
на карбоксиметилцеллюлозном сорбенте СМ-52. Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2.
Химия. – 2003. – Т.44. - №6. – С. 412-416.
259. Nurchi V.M., Villaescusa I. Agricultural biomasses as sorbents of some
trace metals // Coordination Chemistry Reviews. – 2008. – № 252. –
P. 1178–1188.

150