74

УДК 663.13/.252.41: 579.07.001.76

Насонов Андрей Иванович, к.б.н., с.н.с. лаборатории генетики и микробиологии, nasoan@mail.ru, тел.: 89024075973;
Супрун Иван Иванович, к.б.н., зав. лабораторией генетики и микробиологии, supruni@mail.ru, тел.: 89180180288; 
Агеева Наталья Михайловна, д.т.н., гл.н.с. лаборатории виноделия, ageyeva@inbox.ru, тел.: 89184682525;
Токмаков Сергей Вячеславович, к.б.н., н.с. лаборатории генетики и микробиологии, ad-a-m@mail.ru,
тел.: 89094530093;
Прах Антон Владимирович, к.с.-х.н., н.с. лаборатории виноделия; тел.: 89615258670; kubansad@kubannet.ru;
Степанов Илья Владимирович, м.н.с. лаборатории генетики и микробиологии, ivstepanof@gmail.com,
тел.: 89184763165;
Лободина Елена Вадимовна, м.н.с. лаборатории генетики и микробиологии, alyona2255@yandex.ru, тел.: 89898379877
Федеральное государственной бюджетное научное учреждение «Северо-Кавказский федеральный научный центр садоводства,
виноградарства, виноделия», Россия, Краснодарский край, 350901, Краснодар, ул. 40-летия Победы, 39

Комплексный подход в поиске новых перспективных штаммов

дрожжей-сахаромицетов для высокотехнологичного виноделия
В современной технологии производства вина существенным условием является использование в бродильном
процессе чистых культур дрожжей, которые представляют собой хорошо изученные и апробированные, с известными
технологическими свойствами, расы сахаромицетов. Сейчас на рынке существует множество коммерческих препаратов
винных дрожжей, исключительно зарубежного производства. Однако актуальным является вопрос поиска и селекции новых
рас дрожжей с учётом использования генофонда аборигенных популяций Saccharomyces cerevisiae для создания оригинальных
вин географического наименования. В рамках проведённой работы из двух винодельческих хозяйств Новороссийского района
ЗАО «Абрау-Дюрсо» и ЗАО «Мысхако» было выделено около 60 моноспоровых изолятов аборигенных дрожжей. Источником
изолятов служило спонтанно сброженное в лабораторных условиях сусло из асептически отобранных гроздей винограда.
Из всей выборки изолятов было выделено три морфотипа, одни из которых был представлен только на винограднике
ЗАО «Мысхако». Селективный тест на «дикие» дрожжи, выявил принадлежность морфотипа №2 к роду Saccharomy-
ces. Молекулярно-генетический анализ изолятов-сахаромицетов с помощью SSR-маркеров выявил их генетическую
неоднородность и подтвердил принадлежность к этому таксону. Микровинодельческое тестирование аборигенных
сахаромицетов показало их высокую бродильную активность, а виноматериалы по результатам дегустационной оценки
отличались высоким качеством.
Ключевые слова: Saccharomyces; моноспоровые изоляты; виноград (Vitis vinifera L.); сорт Шардоне; SSR-маркеры;
генотипирование; микровиноделие.

Nasonov Andrey Ivanovich, Cand. Biol. Sci., Senior Staff Scientist, Laboratory of Genetics and Microbiology;
Suprun Ivan Ivanovich, Cand. Biol. Sci., Head of Laboratory, Laboratory of Genetics and Microbiology;
Ageeva Natalia Mikhailovna, Dr. Tech. Sci., Chief Staff Scientist, Laboratory of winemaking;
Tokmakov Sergey Vyacheslavovich, Cand. Biol. Sci., Staff Scientist, Laboratory of genetics and microbiology;
Prakh Anton Vladimirovih, Cand. Agric. Sci., Staff Scientist, Laboratory of winemaking;
Stepanov Ilya Vladimirovich, Junior Staff Scientist, Laboratory of Genetics and Microbiology;
Lobodina Elena Vadimovna, Junior Researcher, Laboratory of Genetics and Microbiology
Federal State Budget Scientific Institution North-Caucasian Federal Scientific Center for Horticulture, Viticulture and Wine-Making, 39
Sorokoletia Pobedy Str., 350901 Krasnodar, Krasnodar Kraj, Russia

Comprehensive approach to identification of new promising

saccharomyces strains for adanced winemaking
An essential requirement in contemporary wine production is the use of pure yeast cultures in the fermentation process. These pure
cultures are well-studied and certified Saccharomyces races with well-known technological properties. There are many commercial wine
yeast preparations on the market nowadays, all of which are exclusively foreign-made. Therefore, a pressing issue in creating unique
wines with geographical status is search and selection of new yeast races using the gene pool of aboriginal Saccharomyces cerevisiae
populations. Within the framework of the study, about 60 monospore isolates of native yeast were isolated from ZAO Abrau-Dyurso and
ZAO Myskhako wineries in the Novorossiysk region. Spontaneously fermented in lab conditions must from aseptically selected grapes
served as the source for the isolates. Of the entire isolate sample, three morphotypes were identified, one of which was present only in
the vineyard of ZAO Myskhako. A selective test for "wild" yeast revealed Saccharomyces genus affiliation of the morphotype № 2. The
molecular-genetic analysis of the Saccharomyces isolates done by SSR-markers revealed their genetic heterogeneity and confirmed
their affiliation with this taxon. Micro-winemaking testing of aboriginal saccharomycetes showed their high fermentation activity. Tasting
assessment results confirmed the high quality of the base wines.
Key words: Saccharomyces; monospore isolates; grapes (Vitis vinifera L.); Chardonnay; SSR markers; genotyping; micro-
winemaking.

Дрожжи-сахаромицеты широко ис-
пользуются в хозяйственной деятельно-
сти человека, в большинстве бродильных
процессов, в том числе и при виноделии.
Ферментативные виды дрожжей рода
Saccharomyces встречаются в неболь-
ших количествах на винограде, преоб-
ладающими микроорганизмами поверх-
ности винной ягоды являются апикулят-
ные дрожжи (в основном Hanseniaspora
uvarum) и другие окислительные виды.
Оценка микробного состава виноградного
сусла позволила выявить различные груп-
пы микроорганизмов, оказавшиеся в нём в
процессе переработки винограда, из вино-
градной грозди или винодельческого обо-
рудования. Подавляющее большинство
принадлежит мицелиальным грибам, да-
лее следуют дрожжи и бактерии. Значение
виноградника или винодельни в качестве
источника дрожжей зависит от различных
факторов, таких как климатические усло-
вия, географическое положение и возраст
виноградника, пестицидные обработ-
ки, разнообразие сортов и др. Динамика
дрожжевого состава, возникающая по ходу
спонтанного брожения сусла, представля-
ет собой «производственную» сукцессию,
когда один вид, род или даже семейство
дрожжей сменяют друг друга в силу суще-
ствующих между ними антагонистических
или конкурентных взаимосвязей. Обычно
на начальных этапах брожения присутству-
ют дрожжи рода Hanseniaspora, которые
сменяются – Brettanomyces, далее всех
конкурентов сменяют спиртоустойчивые
дрожжи – виды рода Saccharomyces [1-4].
В современной технологии произ-
водства вина существенным условием
является добавление в бродильный про-
цесс чистых культур дрожжей, которые
представляют собой хорошо изученные и
апробированные, с известными технологи-
ческими свойствами, расы сахаромицетов.
Добавление таких культур является гаран-

№ 3 2018
75
тией получения вина соответствующего
качества и обеспечивает необходимую
технологичность процесса с возможностью
контроля всех его условий. Сейчас на рын-
ке существует множество коммерческих
препаратов винных культур дрожжей ис-
ключительно зарубежного производства.
Однако актуальным является вопрос поис-
ка и селекции новых рас дрожжей с учётом
использования генофонда аборигенных
популяций S. cerevisiae для создания ори-
гинальных вин географического наимено-
вания [2, 5-7].
Целью исследования являлся поиск
новых перспективных штаммов дрожжей-
сахаромицетов для высокотехнологичного
производства вина с использованием ком-
плекса различных методов, позволяющих
выделить и идентифицировать абори-
генные изоляты винных дрожжей, а так-
же охарактеризовать их винодельческие
свойства.
Объекты и методы исследований.
Отбор образцов производили в 2016 году
перед валовым сбором урожая в вино-
дельческих хозяйствах Новороссийского
района ЗАО «Абрау-Дюрсо» и «Мысхако».
Выделение аборигенных винных дрож-
жей в культуру, генетическую и техноло-
гическую оценку изолятов проводили в
лаборатории генетики и микробиологии
НЦ «Сортоизучения и селекции» и лабора-
тории виноделия НЦ «Виноделие» ФГБНУ
СКФНЦСВВ.
Схема отбора, условия проведения
спонтанного сбраживания, выделение и
посев моноспоровых изолятов дрожжей
проводили, как описано в работах [6, 8].
Посев и пересев дрожжевых изолятов осу-
ществляли на дрожжево-пептонный агар,
следующего состава: 10 г дрожжевого экс-
тракта, 20 г пептона, 20 г агар-агара, 20 г
глюкозы на 1 л воды. Компоненты среды
производства НИЦФ, Россия. Элективный
тест проводили с использованием среды
Lysine Medium Base (Himedia, Индия). Изо-
ляты, не способные расти на элективной
среде, относили к роду Saccharomyces. По-
лученные штаммы винных сахаромицет-
ных дрожжей использовали для изучения
винодельческих характеристик, а также
для генетических исследований.
Выделение ДНК, условия проведения
ПЦР и фрагментного анализа выполняли
согласно рекомендациям [5]. Для анализа
полиморфизма длин амплифицируемых
фрагментов при SSR-генотипировании
использовали фрагментный анализ на ав-
томатическом генетическом анализаторе
ABIprism 3130. Полученные данные визуа-
лизировали в программе GeneMapper v4.1.
(Applied Biosystems, FosterCity, California).
Для получения экспериментальных
образцов виноматериалов стерильное ви-
ноградное сусло сбраживали исследуе-
мыми штаммами дрожжей, в течение 7–11
суток. По окончании полного сбраживания
сахаров виноматериалы были проанализи-
рованы и продегустированы дегустацион-
ной комиссией ФГБНУ СКФНЦСВВ.
Обсуждения результатов. В рамках
№ 3 2018
Рис. Основные морфологические типы изолятов, выделенных из спонтанно сброженого сусла сорта
винограда Шардоне винодельческих хозяйств ЗАО «Абрау-Дюрсо» и ЗАО «Мысхако»
исследования в 2016 году было отобрано жей-сахаромицетов по 8 SSR-маркерам.
два образца винограда Шардоне и из каж- Используемые маркеры показали доста-
дого проведено спонтанное сбраживание. точную полиморфность, за исключением
Из спонтанно сброженого сусла образцов SSR-маркера ScSAAT1, давшего только
винограда из разных хозяйств было по- один продукт длиной 260 пн для всех
лучено около 60 моноспоровых изолятов изолятов. SSR-анализ выявил неодно-
дрожжей. Их морфолого-культуральный родность изученной выборки дрожжей-
анализ показал неоднородность дрож- сахаромицетов, большинство изолятов
жевой микрофлоры. На основе оценки имело уникальный фингерпринт хотя бы
ряда морфологических характеристик по- по одному из маркеров. Из всей проана-
лученных гигантских колоний дрожжей лизированной генотипированием выбор-
было выделено 3 основных морфотипа ки два изолята Д-1-14 и Д-2-27 имели
(рис.). Первый морфотип отличался круп- идентичный SSR-фингерпринт. Причём эти
ными размерами (67-71 мм), неправильной изоляты были выделены из спонтанного
формой, плоским профилем, кремовым сбраживания образцов винограда разных
окрасом, матовой поверхностью, край мог хозяйств. Такой результат может говорить
быть различным. Вариант 2 имел размер либо о наличии изолятов-клонов, либо о
около 55 мм, приподнятый профиль и ха- их высокой генетической близости, однако
рактерную форму, сочетавшую дольчатость более однозначный результат может дать
и «лучи» (см. рис.). Третий морфотип имел только использование большего набора
наименьший размер (30 мм), плоский про- SSR-маркеров.
филь и волнистый край. Морфологический Для оценки хозяйственно цен-
вариант №1 оказался уникальным для об- ных признаков выделенных изолятов-
разца винограда Шардоне из ЗАО «Мысха- сахаромицетов изучили динамику броже-
ко», в то время как морфотипы 2 и 3 встре- ния, а также получили виноматериалы с их
чались в обоих хозяйствах (табл. 1). использованием. В табл. 3 представлена
Оценка изолятов с помощью электив- динамика брожения, которая показывает
ного теста на «дикие» дрожжи, показал эффективное брожение и отсутствие «не-
присутствие как несахаромицетов, так и добродов». Количество остаточных не-
дрожжей из рода Saccharomyces в спон- сброженных сахаров было минимальным и
танном сбраживании обоих образцов ви- составляло 0,1-0,4 г/100 см3. Выделенные
нограда. Однако сахаромицетов оказалось изоляты могут быть рекомендованы при
больше в отборе из ЗАО «Абрау-Дюрсо» производстве столовых вин без остаточно-
(9 изолятов), чем в образце из Таблица 1
ЗАО «Мысхако» (6 изолятов). Морфотипический состав моноспоровых изолятов
Доля изолятов, отнесенных к роду микрофлоре, дрожжей и доля сахаромицетов в винной
полученной спонтанным сбраживанием
Saccharomyces, от общего коли- образцов винограда сорта Шардоне из различных
чества полученных моноспоровых винодельческих хозяйств Новороссийского района
изолятов по результатам селек- Кол-во изолятов, шт. Доля
тивного посева составила от 20 до Винодельче- всех
Мор-
Saccharo- Saccharo- фотип
32 % (табл. 1). Сравнение резуль- ское хозяйство myces, %
дрожжей myces*
татов морфотипического анализа «Абрау-Дюрсо» 28 9 32 2, 3
и элективного теста, показало, что «Мысхако» 30 6 20 1, 2, 3
все сахаромицеты имели призна-
ки морфотипа №2. Примечание: *- по результатам элективного теста
Для выяс-
нения степени Таблица 2
ДНК-фингерпринты для некоторых изученных изолятов
близости полу- аборигенных винных дрожжей рода Saccharomyces
ченных изолятов
с а х а р о м и ц е т о в Изолят C4 C11 YPL009c ScAAT2 ScSAAT1 ScAAT3 C5 ScYOR267C
было проведе- Д-1-4 105/107 213 309 225 260 295 328 295
но генотипиро- Д-1-6 105/107 214 300 225 260 328 289 289
вание на основе Д-1-25 107/109 192 306 220 260 328 277 278/307
SSR-локусов. В Д-2-5 107/109 192 300 220 260 295 277 277
табл. 2 приведе- Д-2-6 105/107 192 300/333 225 260 328 295 257
ны примеры SSR- Д-2-27 105/107 213 309 225 260 295 328 295
фингерпринтов 7
штаммов дрож- Д-2-30 107/109 192 300 220 260 295 277 328
 76
Таблица 3 Таблица 4
Динамика сахаров в процессе сбраживания Дегустационные характеристики вин, полученных с использованием
виноградного сусла исследуемыми изолятами аборигенных изолятов винных дрожжей
винных дрожжей, г/100 см3 Оценка,
Изолят Органолептическая характеристика виноматериала балл
Время брожения, сутки
Изолят Д-1-2 цветочный сортовой аромат, вкус чистый, свежий, горчинка 85
1 2 5 6 7 8 9
Д-1-2 22,0 16,0 7,3 7,0 6,2 2,4 0,4 Д-1-6 аромат тонкий цветочный, тона персика, яблок, вкус чистый гар- 88
моничный, мягкий
Д-1-6 20,5 14,1 7,5 6,5 5,7 2,0 0,2
Д-1-14 яркий цветочно-фруктов. аромат, персик 92
Д-1-14 20,5 13,4 6,5 6,2 5,4 4,3 0,1 Д-1-20 яркий цветочно-фруктов. аромат, персик 92
Д-1-20 21,0 14,7 7,1 6,5 5.7 2,0 0,2 Д-2-3 тонкий аром с фруктовыми тонами, гармоничный вкус 88
Д-2-3 21,0 14,3 7,0 6,6 6,2 3,7 0,4 Д-2-5 горчинка, резкое послевкусие 83
Д-2-5 21,5 14,3 6,5 6,2 5,4 4,8 0,4 Д-2-6 тонкий аромат с фруктовыми тонами, гармоничный чистый вкус 85
Д-2-6 19,0 11,5 6,1 6,0 5,8 2,4 0,4 Д-2-13 яркий аромат, но вкус свежий разлаженный 80
Д-2-26 свежесть, горчинка, резкое послевкусие 78
Д-2-13 18,5 10,9 5,6 5,6 5,4 3,2 0,4
Д-2-27 яркий цветочно-фруктов. аромат, гармоничный округлый вкус с 90
Д-2-26 17,5 10,1 5,8 5,4 4,4 3,3 0,4 тонами сливок
Д-2-27 17,5 10,1 6,0 5,5 4,7 3,6 0,4 Оеноферм тонкий аромат с цветочными тонами, гармоничный, чистый 90

го сахара.
В табл. 4 представлена дегустаци-
онная характеристика полученных вин.
Установлено, что виноматериалы, приго-
товленные с применением большинства
экспериментальных штаммов дрожжей,
характеризовались высоким качеством и
имели дегустационные оценки на уровне
контроля и даже выше. Это изоляты Д-1-2,
Д-1-6, Д-1-14, Д-1-20, Д-2-3, Д-2-6, Д-2-
27. Следует отметить, что использование
первых 5 изолятов из 10 позволило полу-
чить виноматериалы с яркими сортовыми
ароматами, дополненными тонами, выра-
ботанными винными дрожжами.
Во многих исследованиях указывается
на участие в спонтанной ферментации как
различных штаммов Saccharomyces, так и
не сахаромицетных дрожжей, которые мо-
гут быть представлены в разных пропорци-
ях, варьирующихся от 3 до 100% штаммов
Saccharomyces [6, 7]. Сложность микро-
биологического состава бродящего сусла
определяется многокомпонентностью ми-
кробоценоза виноградного куста [8].
Популяционные исследования винных
дрожжей показали значительное внутри-
популяционное разнообразия. Различия
между популяциями обусловлено в основ-
ном сортовым составом виноградника, а не
их удалением друг от друга [8].
В ряде работ показано получение экс-
периментальных виноматериалов с высо-
ким качеством по ряду технологических
свойств при использовании местных изо-
лятов сахарамицетов [6, 9].
Выводы. Проведенная нами работа
показывает перспективность поиска но-
вых хозяйственно ценных изолятов вин-
ных дрожжей для высокотехнологичного
виноделия среди аборигенной дрожже-
вой флоры местных виноградников с ис-
пользованием комплексного подхода,
включающего методологию спонтанного
сбраживания, получения чистых культур,
их генетической идентификации и оценки
технологических свойств.
Исследование выполнено при финан-
совой поддержке РФФИ в рамках научного
проекта № 16-48-230347 р_а».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Pretorius, I. S. Tailoring wine yeast for the new
millennium: novel approaches to the ancient art of
winemaking / I. S. Pretorius // Yeast. – 2000. – №16.
– Р. 675–729.
2. Бурьян Н. И. Микробиология виноделия. –
Ялта, 2002. – 433 с.
3. Косюра, В. Т. Игристые вина. История, совре-
менность и основные направления производства / В.
Т. Косюра. – Краснодар, 2006. – 504 с.
4. Банницина, Т. Е. Применение дрожжей и про-
дуктов их переработки в пищевой промышленности
/ Т. Е. Банницина, Л. А. Туан, А. В. Канарский // Вест-
ник Воронежского государственного аграрного уни-
верситета. – 2015. – Т. 47. – №4. – С. 176–183.
5. Супрун, И. И. Апробация метода SSR-анализа
для ДНК-паспортизации коммерческих штаммов
винных дрожжей / И. И. Супрун, С. В. Токмаков, Н. М.
Агеева, А. И. Насонов // Политематический сетевой
электронный научный журнал Кубанского государ-
ственного аграрного университета. – 2017. – № 125.
– С. 151–163.
6. Schuller, D. Genetic diversity and population
structure of Saccharomyces cerevisiae strains isolated
from different grape varieties and winemaking regions
/ D. Schuller, F. Cardoso, S. Sousa, P. Gomes, A. C.
Gomes, M. A. Santos, M. Casal // PLoS ONE. – 2012. –
Vol.7. – №2. e32507. doi:10.1371/journal.pone.0032507.
7. Valero, E. Biodiversity of Saccharomyces yeast
strains from grape berries of wine-producing areas
using starter commercial yeasts / E. Valero, B. Cambon,
D. Schuller, M. Casal, S. Dequin // FEMS yeast research.
– 2006. – Vol. 7. – №. 2. – P. 317–329.
8. Агеева, Н. М. Исследование состава микро-
флоры винограда с целью идентификации при-
родных популяций Saccharomyces cerevisiae / Н. М.
Агеева, А. И. Насонов, А. В. Прах, И. И. Супрун, Е. А.
Сосюра // Вестник АПК Ставрополья. – 2017. – № 1
(25). – С. 115–119.
9. Агеева, Н. М. Влияние дрожжей-сахароми-
цетов, выделенных из спонтанной микрофлоры ви-
нограда, на химический состав красного столового
вина / Н. М. Агеева, М. Г. Марковский, А. В. Прах, А.И.
Насонов, И.И. Супрун Известия высших учебных за-
ведений. Пищевая технология. – 2017. – № 2-3 (356-
357). – С. 23–28.
Поступила 02.07.2018
©А.И.Насонов,
© 2018
©И.И.Супрун,
© 2018
©Н.М.Агеева,
© 2018
©С.В.Токмаков,
© 2018
©А.В.Прах,
© 2018
©И.В.Степанов,
© 2018
©Е.В.Лободина,
© 2018

№ 3 2018