Вы находитесь на странице: 1из 43

РОССИЙСКАЯ ФЕДЕРАЦИЯ (19) (11) (13)

RU 2 578 160 C1
(51) МПК
A61K 39/12 (2006.01)
A61K 39/295 (2006.01)

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА
ПО ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ

(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ПАТЕНТУ


(21)(22) Заявка: 2015111368/10, 31.03.2015 (72) Автор(ы):
Логунов Денис Юрьевич (RU),
(24) Дата начала отсчета срока действия патента:
Шмаров Максим Михайлович (RU),
31.03.2015
Тутыхина Ирина Леонидовна (RU),
Приоритет(ы): Зубкова Ольга Вадимовна (RU),
(22) Дата подачи заявки: 31.03.2015 Щебляков Дмитрий Викторович (RU),

R U
Щербинин Дмитрий Николаевич (RU),
(45) Опубликовано: 20.03.2016 Бюл. № 8 Должикова Инна Вадимовна (RU),
Джаруллаева Алина Шахмировна (RU),
(56) Список документов, цитированных в отчете о
поиске: US 20100047282A1, 25.02.2010. US Артемичева Наталья Михайловна (RU),
20110217328 A1, 08.09.2011. Zaire ebolavirus Тухватулин Амир Ильдарович (RU),

2 5 7 8 1 6 0
isolate Ebola virus/H.sapiens-wt/SLE/2014/ Пантюхов Владимир Борисович (RU),
Makona-EM124.1, complete genome, ENA Сыромятникова Светлана Ивановна (RU),
Sequence: KM233045.1 от 27.07.2014. RU Шатохина Ирина Викторовна (RU),
2130318 C1, 20.05.199. Борисевич Сергей Владимирович (RU),
Народицкий Борис Савельевич (RU),
Адрес для переписки: Гинцбург Александр Леонидович (RU)
119270, Москва, Фрунзенская наб., 38/1, кв. 136,
Коваленко В.В. (73) Патентообладатель(и):
федеральное государственное бюджетное
учреждение "Федеральный научно-
исследовательский центр эпидемиологии и
C 1

C 1
микробиологии имени почетного академика
Н.Ф. Гамалеи" Министерства
здравоохранения Российской Федерации"
(ФГБУ "ФНИЦЭМ им.Н.Ф.Гамалеи"
2 5 7 8 1 6 0

Минздрава России) (RU)

(54) ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЕ СРЕДСТВО И СПОСОБ ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ДЛЯ


ИНДУКЦИИ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИММУНИТЕТА ПРОТИВ ВИРУСА ЭБОЛА (ВАРИАНТЫ)
(57) Реферат:
Изобретения относятся к области стоматита, содержащего кассету со вставкой
иммунологии и вирусологии и касаются модифицированного гена GP вируса Эбола
иммунобиологического средства (варианты) и /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank
способа его использования (варианты). ID KM233045.1 с последовательностью,
Представленное иммунобиологическое средство выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант
может быть получено на основе аденовируса 2). Кроме того, иммунобиологическое средство
R U

человека пятого серотипа, содержащего кассету может быть получено на основе двух вирусов
со вставкой модифицированного гена GP вируса везикулярного стоматита, один из которых
Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 содержит кассету со вставкой
GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, немодифицированного гена GP вируса Эбола
выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант /H.sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID
1). Также иммунобиологическое средство может AF086833.2 с последовательностью SEQ ID NO 3,
быть получено на основе вируса везикулярного а другой содержит кассету со вставкой

Стр.: 1
модифицированного гена GP вируса Эбола неделю. Представленные изобретения более
/H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank эффективно индуцируют иммунный ответ против
ID KM233045.1 с последовательностью, вируса Эбола в сравнении с аналогичными
выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, причем средствами вследствие введения конструкций на
указанные конструкции взяты в эффективных основе двух разных векторов, что позволяет
соотношениях (вариант 3). Способы получить более мощную индукцию иммунного
использования охарактеризованных ответа, чем иммунизация одним и тем же
иммунобиологических средств для индукции вектором. Охарактеризованные решения могут
специфического иммунитета к вирусу Эбола быть использованы в качестве специфического
реализуются путем их введения в организм профилактического средства против заболеваний,
млекопитающих в эффективном количестве вызванных вирусом Эбола. 8 н.п. ф-лы, 12 ил., 5
однократно или последовательно конструкциями табл., 15 пр.
на основе разных векторов с интервалом в 1

R U
2 5 7 8 1 6 0
C 1

C 1
2 5 7 8 1 6 0
R U

Стр.: 2
RUSSIAN FEDERATION (19) (11) (13)
RU 2 578 160 C1
(51) Int. Cl.
A61K 39/12 (2006.01)
A61K 39/295 (2006.01)

FEDERAL SERVICE
FOR INTELLECTUAL PROPERTY

(12) ABSTRACT OF INVENTION


(21)(22) Application: 2015111368/10, 31.03.2015 (72) Inventor(s):
Logunov Denis JUrevich (RU),
(24) Effective date for property rights:
SHmarov Maksim Mikhajlovich (RU),
31.03.2015
Tutykhina Irina Leonidovna (RU),
Priority: Zubkova Olga Vadimovna (RU),
(22) Date of filing: 31.03.2015 SHCHebljakov Dmitrij Viktorovich (RU),

R U
SHCHerbinin Dmitrij Nikolaevich (RU),
(45) Date of publication: 20.03.2016 Bull. № 8 Dolzhikova Inna Vadimovna (RU),
Dzharullaeva Alina SHakhmirovna (RU),
Mail address:
Artemicheva Natalja Mikhajlovna (RU),
119270, Moskva, Frunzenskaja nab., 38/1, kv. 136,
Tukhvatulin Amir Ildarovich (RU),
Kovalenko V.V.

2 5 7 8 1 6 0
Pantjukhov Vladimir Borisovich (RU),
Syromjatnikova Svetlana Ivanovna (RU),
SHatokhina Irina Viktorovna (RU),
Borisevich Sergej Vladimirovich (RU),
Naroditskij Boris Savelevich (RU),
Gintsburg Aleksandr Leonidovich (RU)

(73) Proprietor(s):
federalnoe gosudarstvennoe bjudzhetnoe
uchrezhdenie "Federalnyj nauchno-
issledovatelskij tsentr epidemiologii i
C 1

C 1
mikrobiologii imeni pochetnogo akademika N.F.
Gamalei" Ministerstva zdravookhranenija
Rossijskoj Federatsii" (FGBU "FNITSEM
im.N.F.Gamalei" Minzdrava Rossii) (RU)
2 5 7 8 1 6 0

(54) IMMUNOBIOLOGICAL AGENT AND METHOD FOR USE THEREOF TO INDUCE SPECIFIC IMMUNITY
AGAINST EBOLA VIRUS (VERSIONS)
(57) Abstract:
FIELD: immunology and virology. 1, SEQ ID NO 2 (version 2). Besides, immune-
SUBSTANCE: invention concerns immune- biological agent can be obtained based on two vesicular
biological agent (versions) and method of its use stomatitis virus, one of which contains a cartridge with
(versions). Immune-biological agent can be obtained insertion of unmodified gene GP Ebola virus /H.sapiens-
based on human adenovirus serotype 5 containing wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 with
cassette with insertion of modified gene GP of virus sequence SEQ ID NO 3, and other contains cartridge
Ebola /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 with insertion of modified gene GP Ebola virus
R U

GenBank ID KM233045.1 with sequence selected from /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank


SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (version 1). Also the ID KM233045.1 with sequence selected from SEQ ID
immune-biological agent can be obtained on basis of NO 1 , SEQ ID NO 2, wherein said structure are taken
vesicular stomatitis virus, containing a cassette with in effective ratios (version 3). Methods of using
insertion of modified gene GP Ebola virus /H.sapiens- described immune-biological agents for inducing
wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID specific immunity to Ebola are realised by introducing
KM233045.1 with sequence selected from SEQ ID NO into body in an effective amount once or series

Стр.: 3
structures based on different vectors of every 1 week. induction of immune response than immunisation same
Presented inventions more effectively induce immune vector.
response against Ebola virus in comparison with similar EFFECT: described solutions can be used as specific
facilities due to introduction of structures based on two preventive agent for diseases caused by Ebola virus.
different vectors, which enables to obtain more powerful 8 cl, 12 dwg, 5 tbl, 15 ex

R U
2 5 7 8 1 6 0
C 1

C 1
2 5 7 8 1 6 0
R U

Стр.: 4
RU 2 578 160 C1

Область техники
Изобретение относится к иммунологии и вирусологии и может быть использовано
в качестве специфического профилактического средства против заболеваний, вызванных
вирусом Эбола.
5 Предшествующий уровень техники.
Геморрагическая лихорадка Эбола - это острая вирусная высококонтагиозная
болезнь, вызываемая вирусом Эбола, летальность от которой доходит до 90%. Вирус
передается людям от диких животных и затем распространяется от человека к человеку.
Впервые данное заболевание было зарегистрировано в 1976 году. С этого времени
10 наблюдалось более 10 вспышек лихорадки Эбола, самая крупная из которых в 2014
году переросла в эпидемию, охватила крупные города и сельские районы 5 стран
Западной и Центральной Африки и унесла жизни более девяти тысяч человек. При этом
разрешенных к применению превентивных средств против данного заболевания пока
не существует.
15 Одной из наиболее перспективных разработок в данной области являются вакцины,
основанные на вирусных системах доставки, которые содержат гены протективных
антигенов вируса Эбола.
Известно решение согласно патенту WO 2011130627 А2, в котором для индукции
иммунного ответа к филовирусам (вирус Эбола, вирус Марбург) предполагается
20 использование аденовирусов шимпанзе, которые содержат гены различных белков
данных вирусов, в том числе белок GP вируса Эбола.
Существует решение по патенту СА 2821289 А1, согласно которому для индукции
иммунного ответа против филовирусов используют рекомбинантный аденовирусный
вектор на основе аденовирусов 26 и 35 серотипа, которые экспрессируют антигены
25 данных вирусов.
Известно решение согласно патенту US 20100047282 А1, где в качестве вакцины
против геморрагической лихорадки Эбола используют рекомбинантный аденовирус,
содержащий ген гликопротеина вируса Эбола (GP).
Известно решение согласно патенту СА 2493142 С, в котором для стимуляции
30 иммунного ответа к вирусу Эбола используют рекомбинантный вирус везикулярного
стоматита (VSV), содержащий ген гликопротеина, выбранный из группы, состоящей
из гликопротеина вируса лихорадки Ласса, гликопротеина вируса Марбург и
гликопротеина вируса Эбола, вставленный в вирусный геном так, что данная
последовательность заменила исходный ген гликопротеина VSV.
35 Технические решения согласно патентам US 20100047282 А1 и СА 2493142 С как
наиболее близкие к заявляемому по составу действующего вещества и способу его
использования выбраны авторами заявляемого изобретения за прототип. В связи с тем
что на дату национального приоритета данных заявок 2 августа 2004 года и 26 июля
2002 года ничего не было известно о штамме вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/
40 Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, так как впервые данный возбудитель выделен
и охарактеризован в июле 2014 года, нуклеотидная последовательность его генов не
могла быть использована для конструирования рекомбинантных вирусов.
Соответственно, заявители не имели возможности создать конструкцию с
охарактеризованными культурально-морфологическими свойствами, уровнем экспрессии
45 и иммуногенными свойствами. Это является существенным недостатком данных
конструкций, так как не позволяет использовать их для получения специфического
иммунитета к вирусу Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID
KM233045.1.

Стр.: 5
RU 2 578 160 C1

Раскрытие настоящего изобретения.


Задачей каждого из вариантов настоящего изобретения является создание
иммунобиологического средства для эффективной индукции иммунного ответа против
вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1.
5 Указанная задача решается за счет того, что создано иммунобиологическое средство,
заключающееся в том, что в него входит рекомбинантный аденовирус, содержащий
кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/
Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ
ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 1).
10 Создано также иммунобиологическое средство, заключающееся в том, что в него
входит рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со
вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-
ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1,
SEQ ID NO 2 (вариант 2).
15 Создано также иммунобиологическое средство, заключающееся в том, что в него
входит рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со
вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire
GenBank ID AF086833.2 с последовательностью SEQ ID NO 3, и рекомбинантный вирус
везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена
20 GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с
последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, взятые в эффективных
соотношениях (вариант 3).
Способ использования иммунобиологического средства по варианту 1 реализуется
путем введения его в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции
25 специфического иммунитета к вирусу Эбола.
Способ использования иммунобиологического средства по варианту 2 реализуется
путем введения его в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции
специфического иммунитета к вирусу Эбола.
Способ использования иммунобиологического средства по варианту 3 реализуется
30 путем введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции
специфического иммунитета к вирусу Эбола.
Способ использования иммунобиологического средства по варианту 1 и варианту
2 заключается в их последовательном введении в организм млекопитающих с интервалом
более чем в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.
35 Способ использования иммунобиологического средства по варианту 1 и варианту
3 заключается в их последовательном введении в организм млекопитающих с интервалом
более чем в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность гена GP1 (SEQ ID NO 1),
40 которая представляет собой последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/
SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1, модифицированную путем
добавления в последовательность одного аденина (подробное описание модификации
приводится в пункте «Реализация изобретения»).
На фиг. 2 представлена нуклеотидная последовательность GP2 (SEQ ID NO 2), которая
45 представляет собой последовательность гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/
Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, модифицированную путем замены кодонов,
которые редко встречаются у человека на более часто встречающиеся (подробное
описание модификации приводится в пункте «Реализация изобретения»).

Стр.: 6
RU 2 578 160 C1

На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность GP3 (SEQ ID NO 3), которая


представляет собой немодифицированную последовательность гена GP вируса Эбола
/H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2.
На фиг. 4 представлена немодифицированная нуклеотидная последовательность
5 гена GP (SEQ ID NO 4) вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank
ID KM233045.1.
На фиг. 5 представлена нуклеотидная последовательность, которая представляет
собой экспрессионную кассету (SEQ ID NO 5), содержащую последовательность гена
GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1,
10 модифицированную путем добавления в последовательность одного аденина.
На фиг. 6 представлена нуклеотидная последовательность, которая представляет
собой экспрессионную кассету (SEQ ID NO 6), содержащую последовательность гена
GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1,
модифицированную путем замены кодонов, которые редко встречаются у человека на
15 более часто встречающиеся.
На фиг. 7 представлены результаты проверки качества разработанного
иммунологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего
кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/
Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ
20 ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем определения экспрессии GP в клетках HEK293 после
добавления к ним указанного иммунобиологического средства.
1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,
2 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-null,
3 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-wt,
25 4 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP1,
5 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP2.
На фиг. 8 представлены результаты проверки качества разработанного
иммунологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного
стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола
30 /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью,
выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем определения экспрессии GP в клетках
HEK293 после добавления к ним указанного иммунобиологического средства.
1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,
2 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-null,
35 3 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-wt,
4 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP1,
5 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP2.
На фиг. 9 представлены результаты проверки качества разработанного
иммунологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного
40 стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса
Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и
рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой
модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1
GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID
45 NO 2, путем определения экспрессии GP в клетках HEK293 после добавления к ним
указанного иммунобиологического средства.
1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,
2 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-null,

Стр.: 7
RU 2 578 160 C1

3 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-wt,


4 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP1,
5 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP2,
6 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP3.
5 На фиг. 10 представлены результаты оценки эффективности иммунизации
разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса,
содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-
wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной
из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по анализу лимфопролиферации.
10 Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - различные группы животных, которым вводили:
1. фосфатный буфер (100 мкл)
2. Ad-null 108 БОЕ/мышь
15
3. Ad-GP1 108 БОЕ/мышь
4. Ad-GP2 108 БОЕ/мышь
На фиг. 11 представлены результаты оценки эффективности иммунизации
разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного вируса
везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена
20 GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с
последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по анализу
лимфопролиферации.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - различные группы животных, которым вводили:
25 1. фосфатный буфер (100 мкл)
2. VSV-null 107 БОЕ/мышь
3. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь
4. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь
30 На фиг. 12 представлены результаты оценки эффективности иммунизации
разработанным иммунологическим средством на основе рекомбинантного вируса
везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного
гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID
NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со
35 вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-
ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1,
SEQ ID NO 2, по анализу лимфопролиферации.
Ось ординат - количество пролиферирующих клеток, %.
Ось абсцисс - различные группы животных, которым вводили:
40 1. фосфатный буфер (100 мкл)
2. VSV-null 107 БОЕ/мышь
3. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь
4. VSV-GP1 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь
45
5. VSV-GP1 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь
6. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь
7. VSV-GP2 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь

Стр.: 8
RU 2 578 160 C1

8. VSV-GP2 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь


Реализация изобретения.
Гликопротеин GP вируса Эбола является одним из наиболее перспективных
вакцинных антигенов, индукция иммунных реакций к которому обеспечивает защиту
5
от лихорадки Эбола. Для достижения максимально эффективной индукции иммунных
реакций авторы модифицировали нуклеотидную последовательность GP вируса Эбола
/H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1. Было получено два
вида модифицированного гена: GP1 (SEQ ID NO 1) и GP2 (SEQ ID NO 2).
GP1 (SEQ ID NO 1) был модифицирован путем замены последовательности
10
«АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ», которые отличаются на один
нуклеотид (аденин). Изменение последовательности гена GP было выполнено в
соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется
петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой.
L-полимераза вируса Эбола в отличие от полимеразы эукариотических клеток в этом
15
месте вставляет дополнительный нуклеотид, что сдвигает рамку считывания и изменяет
аминокислотную последовательность белка. Следовательно, для того, чтобы получить
полный вариант белка GP в эукариотических клетках, необходимо добавить один
нуклеотид в указанную последовательность.
GP2 (SEQ ID NO 2) был получен также, как и GP1 - путем замены последовательности
20
«АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ», и затем дополнительно
оптимизирован для экспрессии в клетках человека. Оптимизация нуклеотидной
последовательности - это процесс, при котором редко встречающиеся у человека кодоны
заменяют на часто встречающиеся. Чем чаще встречается кодон, тем больше в клетках
количество соответствующей ему тРНК и тем быстрее будут транспортироваться
25
аминокислоты к месту синтеза белка. Поэтому оптимизация последовательности
обеспечивает более высокую скорость синтеза белка.
Далее авторами было разработано несколько конструкций на основе аденовируса
человека пятого серотипа и вируса везикулярного стоматита для эффективной доставки
модифицированных генов GP в клетки млекопитающих.
30
Изобретение по варианту 1 представляет собой рекомбинантный аденовирус,
содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-
wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной
из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.
Данный вирусный вектор является одним из наиболее безопасных для человека и
35
вместе с тем эффективных векторов (Van Kampen K.R. et al., Safety and immunogenicity
of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans, Vaccine, 2005,
№23 (8), c. 1029-1036). Рекомбинантные аденовирусы обладают следующими
преимуществами: не способны размножаться в клетках человека, способны проникать
как в делящиеся, так и неделящиеся клетки, индуцируют как клеточный, так и
40
гуморальный иммунный ответ, обеспечивают высокий уровень экспрессии целевого
антигена.
Изобретение по варианту 2 представляет собой рекомбинантный вирус везикулярного
стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола
/H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ 124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью,
45
выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.
В данном изобретении в геноме рекомбинантного вируса везикулярного стоматита
(VSV) ген собственного гликопротеина заменили на ген гликопротеина вируса Эбола.
При сборке вируса VSV гликопротеин вируса Эбола включается в состав оболочки

Стр.: 9
RU 2 578 160 C1

вирусной частицы и экспонируется на ее поверхности, а следовательно, эффективно


распознается иммунной системой. Кроме того, при попадании вируса в клетку
происходит экспрессия данного белка на ее мембране. Такие клетки воспринимаются
иммунной системой как зараженные, и против белка GP развивается иммунный ответ.
5 В целом, можно сказать, что идеального вирусного вектора не существует и
использование того или иного вектора зависит в первую очередь от целевой группы
населения. Возможно проведение перед иммунизацией дополнительных тестов для
определения титра антител к тому или иному вирусному вектору.
Изобретение по варианту 3 также основано на вирусе везикулярного стоматита и
10 включает два вектора, один из которых содержит ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/
1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 с последовательностью SEQ ID NO 3, а другой
- модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1
GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID
NO 2, взятых в эффективных соотношениях.
15 Таким образом, данное иммунобиологическое средство обеспечивает одновременную
экспрессию в организме млекопитающего сразу двух видов гликопротеина, полученного
от разных штаммов вируса Эбола. Следовательно, оно является более универсальным
и индуцирует развитие иммунных реакций против двух наиболее опасных штаммов
вируса Эбола.
20 Авторами разработано несколько способов использования данных
иммунобиологических средств. Способы использования представлены далее в формуле
изобретения по пп. 4-6 и предусматривают введение вышеописанных
иммунобиологических средств по каждому из 3-х вариантов в организм млекопитающих
по отдельности в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета
25 к вирусу Эбола. Данный способ подходит для индукции иммунного ответа у широких
масс населения.
Однако есть категории населения (работники сферы здравоохранения, люди, живущие
в очаге эпидемии), для которых угроза заражения вирусом Эбола повышена. Для данной
категории были разработаны способы по пп. 7, 8, которые включают последовательную
30 иммунизацию (с интервалом более 1 недели) иммунобиологическими средствами по
варианту 1 и варианту 2 (по пп. 1 и 2 формулы) или по варианту 1 и варианту 3 (по пп.
1 и 3 формулы). Данные способы является очень эффективными, поскольку при
иммунизации различными вирусными векторами индуцируется мощный иммунный
ответ. Однако, в свою очередь, использование данного способа может быть
35 экономически нецелесообразно для иммунизации широких слоев населения.
Примеры
Пример 1. Получение различных нуклеотидных последовательностей гликопротеина
вируса Эбола
GP является самым иммуногенным белком вируса Эбола и наиболее перспективным
40 вакцинным антигеном. Авторами разработаны варианты иммунобиологического
средства, которые включают модифицированную последовательность гена GP вируса
Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, выбранную из
SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), или немодифицированную последовательность
/H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 SEQ ID NO 3 (GP3).
45 Модификация последовательности была произведена, как описано в пункте
«Реализация изобретения». Все нуклеотидные последовательности были получены
методом синтеза.
Пример 2. Получение иммунобиологического средства на основе рекомбинантного

Стр.: 10
RU 2 578 160 C1

аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса


Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с
последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 1)
Для получения рекомбинантного аденовируса методами генной инженерии было
5 сконструировано 2 плазмидных конструкции, которые включают различные варианты
модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1
GenBank ID KM233045.1: pShuttle-GP1 (содержит последовательность SEQ ID NO 1 (фиг.
1)), pShuttle-GP2 (содержит последовательность SEQ ID NO 2 (фиг. 2)), и 1 плазмидная
конструкция, которая содержит контрольную исходную немодифицированную
10 последовательность pShuttle-GPwt (SEQ ID NO 4 (фиг. 4)).
Далее вышеописанные плазмидные конструкции были обработаны эндонуклеазами
рестрикции PacI и BstII07l для извлечения экспрессионных кассет. Космида cAd5-EGFP
также была обработана эндонуклеазами PacI и BstII07l. Продукты гидролиза лигировали.
Полученную ДНК, содержащуюся в лигазной смеси, упаковывали в фаговые головки.
15 Далее компетентные клетки DH5α трансдуцировали фаговыми головками.
Трансформированные клетки отбирали по их росту на твердой среде LB с селективным
антибиотиком. Из выросших клеток выделяли плазмидную ДНК. Таким образом, было
получено 3 космиды. cAd5-GP1 содержит геном рекомбинантного аденовируса человека
пятого серотипа с экспрессионной кассетой (SEQ ID NO 5 (фиг. 5)), в состав которой
20 входит модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1
GenBank ID KM233045.1 SEQ ID NO 1 (фиг. 1). cAd5-GP2 содержит геном
рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа с экспрессионной кассетой
(SEQ ID NO 6 (фиг. 6), в состав которой входит модифицированный ген GP вируса Эбола
/H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 SEQ ID NO 2 (фиг. 2).
25 cAd5-GPwt содержит геном рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа
с экспрессионной кассетой, в состав которой входит немодифицированный ген GP
вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1.
На следующем этапе был проведен гидролиз полученных космид эндонуклеазами
рестрикции PacI и SwaI для удаления плазмидной части и трансфекция в эукариотические
30 клетки линии HEK293. Через 5 дней после трансфекции проводили слепые пассажи
материала для размножения рекомбинантных аденовирусов. После наступления
цитопатического действия вируса (данные микроскопирования) клетки с культуральной
средой трехкратно перемораживают для разрушения клеток и выхода вируса. В
результате был материал, который затем был использован для накопления
35 препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.
Таким образом, в результате проведенной работы было получено 3 рекомбинантных
аденовируса: Ad-GP1, Ad-GP2, Ad-GPwt.
Пример 3. Получение иммунобиологического средства на основе вируса
везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена
40 GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с
последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 2)
Для получения рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была использована
плазмида VSV-deltaG-GFP, представляющая собой кДНК, комплементарную геномной
РНК вируса везикулярного стоматита с удаленным геном гликопротеина. Методами
45 генной инженерии из данной плазмиды было получено 2 плазмидных вектора,
включающих последовательности модифицированного гена GP: pVSV-deltaG-GP1
(содержит последовательность SEQ ID NO 1 (фиг. 1)), pVSV-deltaG-GP2 (содержит
последовательность SEQ ID NO 2 (фиг. 2)), и 1 плазмидная конструкция, которая

Стр.: 11
RU 2 578 160 C1

содержит контрольную исходную немодифицированную последовательность: pVSV-


deltaG-GPwt (содержит последовательность SEQ ID NO 4 (фиг. 4)).
Для получения препаратов рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была
проведена трансфекция клеток CV-1 четырьмя плазмидами: pVSV-N (содержит гены
5 белков нуклеокапсида), VSV-P (содержит ген фосфопротеина), VSV-L (содержит ген
большой субъединицы полимеразы) и векторной плазмидой, выбранной из pVSV-deltaG-
GP1, pVSV-deltaG-GP2, pVSV-deltaG-GPwt. Трансфекцию проводили с помощью реагента
Lipofectamine-2000 (Life Technologies) согласно инструкции производителя.
Таким образом, было получено три препарата рекомбинантного вируса
10 везикулярного стоматита: VSV-GP1, VSV-GP2, VSV-GPwt.
Пример 4. Получение иммунобиологического средства на основе вируса
везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой GP вируса Эбола /H. sapiens-
wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и вируса везикулярного
стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола
15 /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью,
выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2 (вариант 3)
Для данного иммунобиологического средства были получены рекомбинантные
вирусы везикулярного стоматита, содержащие кассеты со вставкой модифицированного
гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1
20 (VSV-deltaG-GP1, VSV-deltaG-GP2), и вирус везикулярного стоматита, содержащий
кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/
Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (VSV-deltaG-GP3). В качестве контроля был получен
вирус, содержащий немодифицированную последовательность вируса Эбола /H. sapiens-
wt/SLE/2014/Makona-ЕМ 124.1 GenBank ID KM233045.1 (VSV-deltaG-GPwt). Все вирусы
25 были получены по методике, описанной в примере 2. Для получения
иммунобиологического средства смешивали:
рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой
немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank
ID AF086833.2, и рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету
30 со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-
EM124.1 GenBank ID KM233045.1, выбранный из VSV-deltaG-GP1, VSV-deltaG-GP2, в
соотношениях 1:1000, 1:100, 1:10, 1:1, 10:1, 100:1, 1000:1.
В результате проведенной работы были получены различные варианты
иммунобиологического средства по п. 3.
35 Пример 5. Проверка экспрессии белков GP в клетках после добавления
иммунобиологического средства на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего
кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/
Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ
ID NO 1, SEQ ID NO 2
40 Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной
телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°C и 5% CO2. Клетки помещали
на 35 мм2 культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения
70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты
45
рекомбинантных аденовирусов (Ad-GP1, Ad-GP2) и контрольные препараты (Ad-null -
рекомбинантный аденовирус, не содержащий вставок, Ad-GPwt - рекомбинантный
аденовирус, содержащий неоптимизированную последовательность GP) из расчета 100
БОЕ/клетку или фосфатный буфер в качестве отрицательного контроля. Через сутки
проверяли экспрессию антигенов вируса Эбола методом иммуноблоттинга. Для этого
Стр.: 12
RU 2 578 160 C1

был произведен отбор среды с клеток, клетки были промыты стерильным фосфатно-
солевым буфером, а затем лизированы с помощью RIPA буфера (Pierce) по протоколу
фирмы-производителя.
После лизиса клеток производили измерение концентрации тотального белка в
5 пробах с помощью реактива Bradford (Sigma) согласно инструкции производителя.
Аликвоту выровненных по содержанию белка образцов смешивали с Laemmli Sample
Buffer (Sigma) и инкубировали в течение 5 минут при 95°С.
Далее проводили электрофорез в денатурирующих условиях в 10% SDS-
полиакриламидном геле SPRINT NEXT GEL® 10% (Amresco) в NEXT GEL® Running
10 Buffer, 20X (Amresco) с помощью системы Mini-PROTEAN® Tetra Cell (Bio-Rad) в течение
20 минут при 250 V. После электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную
мембрану Trans-Blot® Turbo™ Mini Nitrocellulose Transfer Packs (Bio-Rad) в буфере Tris-
CAPS (Bio-Rad) с помощью системы для переноса Trans-Blot® SD Semi-Dry Transfer Cell
(Bio-Rad) в течение 15 минут при 25 V. Затем проводили блокирование неспецифического
15 сигнала. Для этого мембрану инкубировали в растворе 3% обезжиренного молока в
фосфатно-солевом буфере с 0,05% Твин 20 (ТФСБ) в течение часа при комнатной
температуре. После этого мембрану инкубировали 16 часов при 4°С с антителами к
белку GP в растворе 3% обезжиренного молока в ТФСБ. Далее проводили отмывку
мембраны раствором ТФСБ и обрабатывали мембрану раствором вторичных антител,
20 конъюгированных с пероксидазой хрена, в растворе 3% обезжиренного молока в ТФСБ
при 37°С на шейкере в течение 1 часа. Затем мембрану тщательно отмывали раствором
ТФСБ. Дальнейшую детекцию проводили с помощью набора Clarity™ Western ECL
Substrate (Bio-Rad) и проявляли на пленку Hyperfilm® ECL™ (Amersham). По такому же
протоколу проводили детекцию белка сравнения GAPDH с помощью антител Anti-
25 GAPDH.
Результаты представлена на фиг. 7:
1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,
2 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-null,
3 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-wt,
30 4 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP1,
5 - лизат клеток, к которым добавляли Ad-GP2.
Как видно из полученных данных, во всех клетках, трансдуцированных
рекомбинантными аденовирусами, содержащими как модифицированные, так и
немодифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1
35 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID
NO 2, наблюдалась экспрессия целевого белка GP. При этом в клетках, к которым
добавляли рекомбинантные аденовирусы, которые содержат модифицированные гены
GP (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2), наблюдались более высокие уровни экспрессии, чем в
клетках, трансдуцированных аденовирусом, экспрессирующим немодифицированный
40 ген GP (SEQ ID NO 4).
Пример 6. Проверка экспрессии белков GP в клетках после добавления
иммунобиологического средства на основе вируса везикулярного стоматита,
содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-
wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной
45 из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2
Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной
телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°С и 5% CO2. Клетки помещали
на 35 мм2 культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения
Стр.: 13
RU 2 578 160 C1

70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты


рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита (VSV-GP1, VSV-GP2) и контрольные
препараты (VSV-null - рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, не содержащий
вставок, VSV-GPwt - рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий
5 неоптимизированную последовательность GP) из расчета 10 БОЕ/клетку или фосфатный
буфер в качестве отрицательного контроля. Через сутки проверяли экспрессию антигенов
вируса Эбола методом иммуноблоттинга аналогично протоколу, описанному в примере
4.
Результаты представлены на фиг. 8:
10 1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,
2 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-null,
3 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GPwt,
4 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP1,
5 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP2.
15 Результаты эксперимента показали, что во всех клетках, трансдуцированных
рекомбинантными вирусами везикулярного стоматита, содержащими как
модифицированные, так и немодифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/
SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, наблюдалась экспрессия GP. При
этом в тех клетках, к которым добавляли рекомбинантные вирусы везикулярного
20 стоматита, которые содержат модифицированные гены GP, наблюдались более высокие
уровни экспрессии.
Пример 7. Проверка экспрессии белков GP в клетках после добавления
иммунобиологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного
стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса
25 /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и
рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой
модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1
GenBank ID KM233045 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO
2
30 Клетки HEK293 культивировали в среде DMEM с добавлением 10% эмбриональной
телячьей сыворотки в инкубаторе при температуре 37°С и 5% CO2. Клетки помещали
на 35 мм2 культуральные чашки Петри и инкубировали в течение суток до достижения
70% конфлюэнтности. Далее к клеткам добавляли исследуемые препараты
35
рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита, которые входят в состав
разработанного иммунобиологического средства (VSV-GP1, VSV-deltaG-GP2, VSV-
deltaG-GP3, VSV-deltaG-GP4, VSV-deltaG-GP5), и контрольные препараты (VSV-deltaG-
null - рекомбинантный аденовирус, не содержащий вставок, VSV-deltaG-GPwt -
рекомбинантный аденовирус, содержащий неоптимизированную последовательность
40
GP) из расчета 10 БОЕ/клетку или фосфатный буфер в качестве отрицательного
контроля. Через сутки проверяли экспрессию антигенов вируса Эбола методом
иммуноблоттинга аналогично протоколу, описанному в примере 4.
Результаты представлены на фиг. 9:
1 - лизат клеток, к которым добавляли фосфатно-солевой буфер,
45
2 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-null,
3 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GPwt,
4 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP1,
5 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP2,
6 - лизат клеток, к которым добавляли VSV-GP3.
Стр.: 14
RU 2 578 160 C1

Результаты эксперимента показали, что во всех клетках, трансдуцированных


рекомбинантными вирусами везикулярного стоматита, содержащими ген GP,
наблюдалась экспрессия гликопротеина вируса Эбола. Максимальная экспрессия была
обнаружена в группах №4 и №5, где добавляли рекомбинантные вирусы везикулярного
5 стоматита, несущие модифицированные гены GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/
Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 (SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2).
Пример 8. Способ использования иммунобиологического средства на основе
рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного
гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1
10 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем введения в
организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического
иммунитета к вирусу Эбола
Разработанное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного
аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса
15 Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с
последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), используется
путем введения в организм млекопитающих любым из известных для данного вирусного
вектора способов введения (подкожно, внутримышечно, внутривенно, интраназально).
При этом в организме млекопитающих развивается иммунный ответ к целевому белку
20 гликопротеина вируса Эбола.
Одной из основных характеристик эффективности иммунизации является титр антител.
В примере представлены данные, касающиеся изменения титра антител против
гликопротеина вируса Эбола, после двукратной (с интервалом в 1 неделю) подкожной
иммунизации животных иммунобиологическим средством, включающим
25 рекомбинантный аденовирус, содержащий модифицированный ген GP вируса Эбола
/H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, выбранный из GP1
(SEQ ID NO 1), GP2 (SEQ ID NO 2).
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии Balb/c, самки 18 г.
Все животные были разделены на 13 групп по 3 животных, которым внутримышечно
30 вводили:
1) Ad-GP1 107 БОЕ/мышь
2) Ad-GP1 108 БОЕ/мышь
3) Ad-GP1 109 БОЕ/мышь
35
4) Ad-GP1 1010 БОЕ/мышь
5) Ad-GP2 107 БОЕ/мышь
6) Ad-GP2 108 БОЕ/мышь
7) Ad-GP2 109 БОЕ/мышь
40
8) Ad-GP2 1010 БОЕ/мышь
9) Ad-null 107 БОЕ/мышь
10) Ad-null 108 БОЕ/мышь

45
11) Ad-null 109 БОЕ/мышь
12) Ad-null 1010 БОЕ/мышь
13) фосфатно-солевой буфер
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли

Стр.: 15
RU 2 578 160 C1

сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа по


следующему протоколу.
1) Белок (GP) адсорбировали на лунках 96-луночного планшета для ИФА в течение
16 часов при температуре +4°С.
5 2) Методом 2-кратных разведений разводили образцы сыворотки иммунизированных
мышей. Всего было приготовлено 8 разведений каждого образца.
3) Добавляли по 50 мкл каждого разведенного образца сыворотки в лунки планшета.
4) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
5) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
10 6) Затем добавляли вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши,
конъюгированные с биотином.
7) Далее проводили инкубацию в течение 1 часа при 37°С.
8) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
9) Затем в каждую лунку добавили конъюгат стрептовидина и пероксидазы хрена.
15 10) Далее проводили инкубацию в течение 30 минут при 37°С.
11) После инкубации проводилась трехкратная промывка лунок фосфатным буфером.
12) Затем добавили раствор ТМВ, который является субстратом пероксидазы хрена
и в результате реакции превращается в окрашенное соединение. Реакцию останавливали
через 15 минут добавлением серной кислоты. Далее с помощью спектрофотометра
20 измеряли оптическую плотность раствора (OD) в каждой лунке при длине волны 450
нм.
Титр антител определяли как последнее разведение, в котором оптическая плотность
раствора была достоверно выше, чем в группе отрицательного контроля. Полученные
результаты представлены в таблице 1.
25

30

35

40

45

Результаты эксперимента показали, что разработанное иммунобиологическое


средство по п. 1, введенное в организм млекопитающего, индуцирует иммунный ответ
Стр.: 16
RU 2 578 160 C1

к вирусу Эбола во всем диапазоне выбранных доз. При этом очевидно, что увеличение
доз будет приводить к увеличению титра антител в крови млекопитающих до
наступления токсического эффекта.
Пример 9. Способ использования иммунобиологического средства на основе
5 рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой
модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1
GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID
NO 2, путем введения в организм млекопитающих в эффективном количестве для
индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола
10 Разработанное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного вируса
везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена
GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с
последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1 (GP1), SEQ ID NO 2 (GP2), используется
путем введения в организм млекопитающих любым из известных для данного вирусного
15 вектора способов введения (подкожно, внутримышечно, внутривенно, интраназально).
При этом в организме млекопитающих развивается иммунный ответ к целевому белку
гликопротеина вируса Эбола.
На данном этапе работы оценивали эффективность иммунизации разработанным
иммунобиологическим средством, определив титр антител против гликопротеина вируса
20 Эбола, после двукратной (с интервалом в 1 неделю) подкожной иммунизации животных
иммунобиологическим средством, включающим рекомбинантный вирус везикулярного
стоматита, содержащий модифицированный ген GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/
2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1, выбранный из GP1 (SEQ ID NO 1), GP2
(SEQ ID NO 2). Эксперимент был выполнен по схеме, аналогичной описанной в примере
25 8.
В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии Balb/c, самки 18 г.
Все животные были разделены на 13 групп по 3 животных, которым внутримышечно
вводили:
1) VSV-GP1 106 БОЕ/мышь
30
2) VSV-GP1 107 БОЕ/мышь
3) VSV-GP1 108 БОЕ/мышь
4) VSV-GP1 109 БОЕ/мышь

35
5) VSV-GP2 106 БОЕ/мышь
6) VSV-GP2 107 БОЕ/мышь
7) VSV-GP2 108 БОЕ/мышь
8) VSV-GP2 109 БОЕ/мышь
40 9) VSV-null 106 БОЕ/мышь
10) VSV-null 107 БОЕ/мышь
11) VSV-null 108 БОЕ/мышь
12) VSV-null 109 БОЕ/мышь
45 13) фосфатно-солевой буфер
Через три недели у животных отбирали кровь из хвостовой вены и выделяли
сыворотку крови. Титр антител определяли методом иммуноферментного анализа по
протоколу, описанному в примере 8. Результаты эксперимента представлены в таблице

Стр.: 17
RU 2 578 160 C1

2.

10

15

20

25

Данные проведенных экспериментов показали, что разработанное


иммунобиологическое средство по п. 2, введенное в организм млекопитающего,
индуцирует иммунный ответ к вирусу Эбола во всем диапазоне выбранных доз. При
30 этом очевидно, что увеличение доз будет приводить к увеличению титра антител в
крови млекопитающих до наступления токсического эффекта.
Пример 10. Способ использования иммунобиологического средства на основе
рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой
немодифицированного гена GP вируса /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID
35 AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита,
содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-
wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной
из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, путем введения в организм млекопитающих в эффективном
количестве для индукции специфического иммунитета к вирусу Эбола.
40 Разработанное иммунобиологическое средство на основе рекомбинантного вируса
везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного
гена GP вируса /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3),
и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой
модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1
45 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID
NO 2, используется путем введения в организм млекопитающих любым из известных
для данного вирусного вектора способов введения (подкожно, внутримышечно,
внутривенно, интраназально). При этом в организме млекопитающих развивается

Стр.: 18
RU 2 578 160 C1

иммунный ответ к целевому белку гликопротеина вируса Эбола. Удобным способом


оценки эффективности иммунизации является определение титра антител против целевого
белка (GP).
Целью данного эксперимента являлось определение титра антител против
5 гликопротеина вируса Эбола после двукратной (с интервалом в 1 неделю) иммунизации
животных разработанным иммунобиологическим средством, включающим
рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой
немодифицированного гена GP вируса /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID
AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и рекомбинантный вирус везикулярного стоматита,
10 содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-
wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной
из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, взятых в эффективных соотношениях. Были взяты
следующие соотношения вирусных векторов: 1:1000, 1:100, 1:10, 1:1, 10:1, 100:1, 1000:1.
Эксперимент был выполнен по схеме, аналогичной описанной в примере 8.
15 В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии Balb/c, самки 18 г.
Все животные были разделены на 97 групп по 3 животных, которым внутримышечно
вводили:
1. VSV-GP1 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь (1:1)
20
2. VSV-GP1 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь (1:10)
3. VSV-GP1 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 108 БОЕ/мышь (1:100)
4. VSV-GP1 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь (1:1000)
5. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь (10:1)
25 6. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь (1:1)
7. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 108 БОЕ/мышь (1:10)
8. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь (1:100)
9. VSV-GP1 108 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь (100:1)
30
10. VSV-GP1 108 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь (10:1)
11. VSV-GP1 108 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь (1:1)
12. VSV-GP1 108 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь (1:10)
13. VSV-GP1 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь (1000:1)
35
14. VSV-GP1 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь (100:1)
15. VSV-GP1 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 108 БОЕ/мышь (10:1)
16. VSV-GP1 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь (1:1)

40
17. VSV-GP1 106 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
18. VSV-GP1 106 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
19. VSV-GP1 106 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
20. VSV-GP1 106 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
45 21. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
22. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
23. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь

Стр.: 19
RU 2 578 160 C1

24. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь


25. VSV-GP1 108 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
26. VSV-GP1 108 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
5
27. VSV-GP1 108 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
28. VSV-GP1 108 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
29. VSV-GP1 109 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
30. VSV-GP1 109 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
10
31. VSV-GP1 109 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
32. VSV-GP1 109 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
33. VSV-GP2 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь (1:1)

15
34. VSV-GP2 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь (1:10)
35. VSV-GP2 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 108 БОЕ/мышь (1:100)
36. VSV-GP2 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь (1:1000)
37. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь (10:1)
20 38. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь (1:1)
39. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 108 БОЕ/мышь (1:10)
40. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь (1:100)
41. VSV-GP2 108 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь (100:1)
25
42. VSV-GP2 108 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь (10:1)
43. VSV-GP2 108 БОЕ/мышь, VSV-GP3 108 БОЕ/мышь (1:1)
44. VSV-GP2 108 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь (1:10)
45. VSV-GP2 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь (1000:1)
30
46. VSV-GP2 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь (100:1)
47. VSV-GP2 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 108 БОЕ/мышь (10:1)
48. VSV-GP2 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь (1:1)
49. VSV-GP2 106 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
35
50. VSV-GP2 106 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
51. VSV-GP2 106 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
52. VSV-GP2 106 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
40 53. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
54. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
55. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
56. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
45 57. VSV-GP2 108 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
58. VSV-GP2 108 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
59. VSV-GP2 108 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь

Стр.: 20
RU 2 578 160 C1

60. VSV-GP2 108 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь


61. VSV-GP2 109 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
62. VSV-GP2 109 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
5
63. VSV-GP2 109 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
64. VSV-GP2 109 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
65. VSV-GP3 106 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
66. VSV-GP3 106 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
10
67. VSV-GP3 106 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
68. VSV-GP3 106 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
69. VSV-GP3 107 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь

15
70. VSV-GP3 107 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
71. VSV-GP3 107 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
72. VSV-GP3 107 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
73. VSV-GP3 108 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
20 74. VSV-GP3 108 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
75. VSV-GP3 108 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
76. VSV-GP3 108 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
77. VSV-GP3 109 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
25
78. VSV-GP3 109 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
79. VSV-GP3 109 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
80. VSV-GP3 109 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
81. VSV-null 106 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
30
82. VSV-null 106 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
83. VSV-null 106 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
84. VSV-null 106 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
85. VSV-null 107 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
35
86. VSV-null 107 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
87. VSV-null 107 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
88. VSV-null 107 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
40 89. VSV-null 108 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
90. VSV-null 108 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
91. VSV-null 108 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь
92. VSV-null 108 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь
45 93. VSV-null 109 БОЕ/мышь, VSV-null 106 БОЕ/мышь
94. VSV-null 109 БОЕ/мышь, VSV-null 107 БОЕ/мышь
95. VSV-null 109 БОЕ/мышь, VSV-null 108 БОЕ/мышь

Стр.: 21
RU 2 578 160 C1

96. VSV-null 109 БОЕ/мышь, VSV-null 109 БОЕ/мышь


97. фосфатно-солевой буфер
Результаты эксперимента представлены в таблице 3.
5

10

15

20

25

30

35

Результаты эксперимента показали, что разработанное иммунобиологическое


средство по п. 3, введенное в организм млекопитающего, индуцирует иммунный ответ
к вирусу Эбола во всем диапазоне выбранных доз и выбранных соотношений.
Пример 11. Определение эффективности иммунизации разработанным
40 иммунобиологическим средством на основе рекомбинантного аденовируса, содержащего
кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/
Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ
ID NO 1, SEQ ID NO 2, по оценке доли пролиферирующих лимфоцитов
Пролиферативный анализ позволяет оценивать способность лимфоцитов усиленно
45 делиться после встречи с антигеном. Для того чтобы оценить пролиферацию, авторы
использовали окраску лимфоцитов флуоресцентным красителем CFSE. Данный краситель
связывается с клеточными белками и сохраняется долгое время и при этом никогда не
передается соседним клеткам в популяции. Однако флуоресцентная метка передается

Стр.: 22
RU 2 578 160 C1

дочерним клеткам. Концентрация метки, а следовательно, и интенсивность


флуоресценции снижаются ровно в 2 раза. Поэтому делящиеся клетки легко отслеживать
по уменьшению их флуоресценции.
В эксперименте использовались мыши линии Balb/c. Все животные были разделены
5 на 4 группы (по 3 животных), которым внутримышечно вводили:
1) фосфатный буфер (100 мкл)
2) Ad-null 108 БОЕ/мышь
3) Ad-GP1 108 БОЕ/мышь
10 4) Ad-GP2 108 БОЕ/мышь
Дозы рекомбинантных аденовирусов были выбраны на основании данных,
полученных при определении титра антител.
Через две недели животных усыпляли. Из селезенки выделяли лимфоциты методом
центрифугирования в градиенте фиколла-урографина. Затем выделенные клетки
15 окрашивали CFSE по методике (Monitoring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo with
the intracellular fluorescent dye carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester / Quah BJ, Warren
HS, Parish CR Nat Protoc. 2007; 2(9), с. 2049-2056) и культивировали в присутствии
антигена. Далее клетки анализировали методом проточной цитофлуориметрии.
Полученные результаты представлены в виде гистограммы (фиг. 10).
20 Как видно из результатов эксперимента, разработанное иммунобиологическое
средство по п. 1 в данной дозе эффективно стимулирует пролиферацию лимфоцитов.
Пример 12. Определение эффективности иммунизации разработанным
иммунобиологическим средством на основе вируса везикулярного стоматита,
содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-
25 wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной
из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, по оценке доли пролиферирующих лимфоцитов.
Целью данного эксперимента была проверка пролиферативной способности
лимфоцитов, выделенных из мышей C57/BI6 (18 г), которым вводили:
1. фосфатный буфер (100 мкл)
30
2. VSV-null 107 БОЕ/мышь
3. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь
4. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь
Дозы рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита были выбраны на основании
35 данных, полученных при определении титра антител. Эксперимент был выполнен
согласно протоколу, представленному в примере 11.
Результаты эксперимента представлены на фиг. 11.
Как видно из результатов эксперимента, разработанное иммунобиологическое
средство по п. 2 в данной дозе эффективно стимулирует пролиферацию лимфоцитов.
40 Пример 13. Определение эффективности иммунизации разработанным
иммунобиологическим средством на основе рекомбинантного вируса везикулярного
стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса
/H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3), и
рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой
45 модифицированного гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1
GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID
NO 2, по оценке доли пролиферирующих лимфоцитов.
В данном эксперименте был проведен пролиферативный анализ лимфоцитов,

Стр.: 23
RU 2 578 160 C1

выделенных из мышей, которым вводили:


1. фосфатный буфер (100 мкл)
2. VSV-null 107 БОЕ/мышь
5
3. VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь (1:1)
4. VSV-GP1 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь (1:1000)
5. VSV-GP1 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь (1000:1)
6. VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь (1:1)
10 7. VSV-GP2 106 БОЕ/мышь, VSV-GP3 109 БОЕ/мышь (1:1000)
8. VSV-GP2 109 БОЕ/мышь, VSV-GP3 106 БОЕ/мышь(1000:1)
Дозы рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита были выбраны на основании
данных, полученных при определении титра антител. Эксперимент был выполнен
согласно протоколу, представленному в примере 11.
15
Результаты эксперимента представлены на фиг. 12.
Как видно из результатов эксперимента, разработанное иммунобиологическое
средство по п. 3 в данной дозе эффективно стимулирует пролиферацию лимфоцитов.
Пример 14. Способ использования иммунобиологического средства на основе
рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного
20
гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1
с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, и
иммунобиологического средства на основе рекомбинантного вируса везикулярного
стоматита, содержащего кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола
/H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью,
25
выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, заключающийся в их последовательном
введении в организм млекопитающих с интервалом более чем в 1 неделю для индукции
специфического иммунитета к вирусу Эбола
Как видно из результатов экспериментов, описанных в примерах 8-10, разработанные
варианты иммунобиологического средства на основе аденовирусов и вирусов
30
везикулярного стоматита приводят к высоким титрам антител в крови
иммунизированных животных. Использование данных вариантов подойдет для индукции
иммунного ответа против вируса Эбола у подавляющей части населения.
Однако есть категории населения (работники сферы здравоохранения, люди, живущие
в очаге эпидемии), которые находятся в группе риска: это работники инфекционных
35
отделений больниц; работники сферы здравоохранения, направляющиеся в зону
эпидемии; люди, живущие в зоне эпидемии и др. Для данных категорий были
разработаны способы по пп. 7 и 8, которые включают последовательную иммунизацию
(с интервалом более 1 недели) иммунобиологическими средствами по пп. 1 и 2 или по
пп. 1 и 3.
40
Способ индукции иммунного ответа, при котором вводят вначале один
рекомбинантный вирусный вектор, а затем другой, будет более эффективным, чем если
вводить одинаковые вирусные векторы. Это связано с тем, что после первой
иммунизации антитела в организме вырабатываются не только к целевому антигену
(GP вируса Эбола), но также и к белкам вектора. Поэтому при повторной иммунизации
45
эти антитела препятствуют проникновению вирусного вектора в клетки. Следовательно,
экспрессия целевого белка будет также снижаться и иммунный ответ будет более слабым.
В данном примере приводятся экспериментальные данные, показывающие что
последовательная иммунизация животных разными вирусными векторами: вначале

Стр.: 24
RU 2 578 160 C1

иммунобиологическим средством по п. 1 (включающим рекомбинантный аденовирус,


содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-
wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной
из SEQ ID NO 1), а через неделю иммунобиологическим средством по п. 2 (включающим
5 рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой
модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1
GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID
NO 2) или наоборот приводит к более мощной индукции антител против целевого белка
(GP), чем иммунизация, проведенная по той же схеме, но одним и тем же
10 иммунобиологическим средством.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 8.
Все животные были разделены на 11 групп (по 3 животных), которым внутримышечно
вводили:
1) Ad-GP1 108 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 107 БОЕ/мышь
15
2) Ad-GP2 108 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 107 БОЕ/мышь
3) Ad-GP1 108 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 107 БОЕ/мышь
4) Ad-GP2 108 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 107 БОЕ/мышь

20
5) Ad-GP1 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad-GP1 108 БОЕ/мышь
6) Ad-GP2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad-GP2 108 БОЕ/мышь
7) VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 107 БОЕ/мышь
8) VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 107 БОЕ/мышь
25 9) Ad-null 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad-null 108 БОЕ/мышь
10) VSV-null 107 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-null 107 БОЕ/мышь
11) фосфатный буфер, а через неделю фосфатный буфер
Результаты представлены в таблице 4.

30

35

40

45

Стр.: 25
RU 2 578 160 C1

10

15

20

25

При введении иммуностимулирующих средств по пп. 1 и 2 в обратном порядке


(вначале средства по п. 2, а затем средства по п. 1) были получены идентичные
30
результаты.
Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что
последовательная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами
по пп. 1 и 2, включающими различные вирусные векторы, вызовет более мощную
индукцию иммунного ответа, чем иммунизация по аналогичной схеме одним и тем же
35
вектором.
Пример 15. Способ использования иммунобиологического средства по п. 1 на основе
рекомбинантного аденовируса, содержащего кассету со вставкой модифицированного
гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1
с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, и
40
иммунобиологического средства по п. 3 на основе рекомбинантного вируса
везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой немодифицированного
гена GP вируса /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 (SEQ ID NO 3),
и рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего кассету со вставкой
модифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1
45
GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID
NO 2, заключающийся в их последовательном введении в организм млекопитающих с
интервалом более чем в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к вирусу
Эбола

Стр.: 26
RU 2 578 160 C1

Целью данного эксперимента является проверка того, что иммунизация животных


разными вирусными векторами:
1) вначале иммунобиологическим средством по п. 1 (включающим рекомбинантный
аденовирус, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола
5 /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью,
выбранной из SEQ ID NO 1),
2) а через неделю иммунобиологическим средством по п. 3 (включающим
рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой
немодифицированного гена GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank
10 ID AF086833.2 с последовательностью SEQ ID NO 3, и рекомбинантный вирус
везикулярного стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена
GP вируса Эбола /H. sapiens-wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с
последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, взятые в эффективном
соотношении)
15 или наоборот приводит к более мощной индукции антител против целевого белка
(GP), чем иммунизация, проведенная по той же схеме, но одним и тем же
иммунобиологическим средством.
Эксперимент был выполнен согласно протоколу, описанному в примере 8.
Все животные были разделены на 11 групп (по 3 животных), которым внутримышечно
20 вводили:
1) Ad-GP1 108 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107
БОЕ/мышь
2) Ad-GP2 108 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107
25
БОЕ/мышь
3) Ad-GP1 108 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107
БОЕ/мышь
4) Ad-GP2 108 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107
БОЕ/мышь
30
5) Ad-GP1 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad-GP1 108 БОЕ/мышь
6) Ad-GP2 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad-GP2 108 БОЕ/мышь
7) VSV-GP1 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP1 107

35
БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь
8) VSV-GP2 107 БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-GP2 107
БОЕ/мышь, VSV-GP3 107 БОЕ/мышь
9) Ad -null 108 БОЕ/мышь, а через неделю Ad-null 108 БОЕ/мышь
40 10) VSV-null 2*107 БОЕ/мышь, а через неделю VSV-null 2*107 БОЕ/мышь
11) фосфатный буфер, а через неделю фосфатный буфер
Результаты представлены в таблице 5.

45

Стр.: 27
RU 2 578 160 C1

10

15

20

25

30

35

При введении иммуностимулирующих средств по пп. 1 и 3 в обратном порядке


(вначале средства по п. 3, а затем средства по п. 1) были получены идентичные
40 результаты.
Таким образом, результаты эксперимента полностью подтвердили, что
последовательная иммунизация разработанными иммунобиологическими средствами
по пп. 1 и 3, включающими различные вирусные векторы, вызовет более мощную
индукцию иммунного ответа, чем иммунизация по аналогичной схеме одним и тем же
45 вектором.
Промышленная применимость
Все приведенные примеры подтверждают выполнение технической задачи, а также
промышленную применимость созданного технического решения.

Стр.: 28
RU 2 578 160 C1

Формула изобретения
1. Иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета к вирусу
Эбола, заключающееся в том, что в него входит рекомбинантный аденовирус,
5 содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H.sapiens-
wt/SLE/2014/Makona-ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной
из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.
2. Иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета к вирусу
Эбола, заключающееся в том, что в него входит рекомбинантный вирус везикулярного
10 стоматита, содержащий кассету со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола
/H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-EM124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью,
выбранной из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2.
3. Иммунобиологическое средство для индукции специфического иммунитета к вирусу
Эбола, заключающееся в том, что в него входит рекомбинантный вирус везикулярного
15 стоматита, содержащий кассету со вставкой немодифицированного гена GP вируса
Эбола /H.sapiens-wt/1976/Mayinga/Zaire GenBank ID AF086833.2 с последовательностью
SEQ ID NO 3, и рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий кассету
со вставкой модифицированного гена GP вируса Эбола /H.sapiens-wt/SLE/2014/Makona-
ЕМ124.1 GenBank ID KM233045.1 с последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 1,
20 SEQ ID NO 2, взятые в эффективных соотношениях.
4. Способ использования иммунобиологического средства по п. 1 путем введения в
организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического
иммунитета к вирусу Эбола.
5. Способ использования иммунобиологического средства по п. 2 путем введения в
25 организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического
иммунитета к вирусу Эбола.
6. Способ использования иммунобиологического средства по п. 3 путем введения в
организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического
иммунитета к вирусу Эбола.
30 7. Способ использования иммунобиологического средства по пп. 1 и 2,
заключающийся в их последовательном введении в организм млекопитающих с
интервалом более чем в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к вирусу
Эбола.
8. Способ использования иммунобиологического средства по пп. 1 и 3,
35 заключающийся в их последовательном введении в организм млекопитающих с
интервалом более чем в 1 неделю для индукции специфического иммунитета к вирусу
Эбола.

40

45

Стр.: 29
RU 2 578 160 C1

Стр.: 30
RU 2 578 160 C1

Стр.: 31
RU 2 578 160 C1

Стр.: 32
RU 2 578 160 C1

Стр.: 33
RU 2 578 160 C1

Стр.: 34
RU 2 578 160 C1

Стр.: 35
RU 2 578 160 C1

Стр.: 36
RU 2 578 160 C1

Стр.: 37
RU 2 578 160 C1

Стр.: 38
RU 2 578 160 C1

Стр.: 39
RU 2 578 160 C1

Стр.: 40
RU 2 578 160 C1

Стр.: 41
RU 2 578 160 C1

Стр.: 42
RU 2 578 160 C1

Стр.: 43

Вам также может понравиться