МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФГБОУ ВО «Кубанский государственный аграрный

университет имени И. Т. Трубилина»

Н. Л. Мачнева, А. Н. Гнеуш, А. Г. Кощаев

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Учебное пособие

Краснодар
КубГАУ
2021

1
УДК 601 (075.8)
ББК 40.0
М37
Реце нз ент ы:
Ю В. Подушин – доцент кафедры физиологии и биохимии растений
факультета Агрохимии и защиты растений ФГБОУ ВО «Кубанский
государственный аграрный университет
имени И. Т. Трубилина», к. с.-х. наук;

Н. С. Томашевич – ст. науч. сотрудник лаборатории создания

микробиологических средств защиты растений и коллекции
микроорганизмов, к. с.-х. наук.

Мачнева Н. Л.
М37 Основы биотехнологии : учеб. пособие / Н. Л. Мачнева, А. Н. Гнеуш,
А. Г. Кощаев. – Краснодар : КубГАУ, 2021. – 218 с.

ISBN

Учебное пособие содержит теоретический материал, посвященный ос-

новам биотехнологии. Рассматриваются вопросы становления и развития
науки, ключевые положения молекулярной генетики и генной инженерии.
Значительное внимание уделено биологическим методам конверсии, обес-
печения безопасности и экологической составляющей при производстве
сельскохозяйственной продукции.
Предназначено для обучающихся по программам бакалавриата и маги-
стратуры направления 35.03.04 Агрономия.

УДК 601 (075.8)

ББК 40.0

© Мачнева Н. Л.,
Гнеуш А. Н., Кощаев А. Г.,
2021
© ФГБОУ ВО «Кубанский
государственный аграрный
университет имени
ISBN И. Т. Трубилина», 2021

2
 ВВЕДЕНИЕ

Биотехнологические методы и знания поникают во все

среды деятельности: сельское хозяйство, пищевая промыш-
ленность, медицина, биоэнергетика, охрана окружающей
среды и т.д. и являются неотъемлемой частью технологиче-
ских процессов и обеспечивают получение качественной и
разнообразной продукции.
Это научная область и дисциплина, освоение которой
имеет важное значение при подготовке специалистов, профес-
сиональная деятельность которых будет связана с биологией,
медициной, сельским хозяйством и пищевой промышленно-
стью.
Дисциплина «Биотехнология» позволяет сформировать
целостное представление о современном состоянии и пер-
спективах развития биотехнологии как междисциплинарной
области знаний (биологических, химических и технических),
имеющем в своей арсенале биотехнологические объекты
(клетки микроорганизмов, растений, животных и т.п.) или мо-
лекулы (нуклеиновые кислоты, белки-ферменты, углеводы,
липиды в индивидуальном виде или в виде их смеси, комплек-
сов и пр.) которые используются для создания новых техно-
логических процессов в промышленном производстве, здра-
воохранении, в решении экологических задач. При этом пред-
полагается, что обучающиеся имеют базовые знания по разде-
лам химии, биохимии и молекулярной биологии, общей био-
логии и микробиологии.
В ходе освоения материалов учебного пособия студент не
только знакомится с ключевыми положениями дисциплины,
но и закрепляет знания по фундаментальным естественным
наукам.

3
 ГЛАВА 1. ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

1.1 Предмет биотехнологии

Биотехнология в современном понимании – это наука о
практическом использовании достижений биологии (культур
бактерий, дрожжей, животных или растений). В результате
метаболизма и синтетических реакций с их участием обеспе-
чивается выработка специфических специфических веществ,
применяемых в медицине, экологии, сельском хозяйстве и
промышленности.
Современная биотехнология – это интеграция естествен-
ных и инженерных наук, позволяющая наиболее полно реали-
зовать возможности живых организмов для производства про-
дуктов питания, лекарственных препаратов, решения проблем
в области энергетики и охраны окружающей среды.
Основная цель и задачи биотехнологии направлены на раз-
работку методов и приемов, позволяющих получать биологиче-
ски активные вещества БАВ (ферменты, гормоны, аминокис-
лоты и вакцины), а также конструировать молекулы новых ве-
ществ и создавать формы организмов, отсутствующих в природе
(химерные гибридные молекулы, химерные живые организмы).
Современная биотехнология тесно связана с рядом науч-
ных дисциплин, позволяет реализовывать их и предоставлять
инструментарий для научных исследований:
– физиология – наука о функциях растительного и живот-
ного организмов. Некоторые белки и вторичные метаболиты мо-
гут быть получены только путем культивирования клеток эука-
риот. Растительные клетки могут служить источником ряда со-
единений – атропин, никотин, алкалоиды, сапонины и др.;
– генетика – наука о законах и механизмах наследствен-
ности. Ее достижения используются в области генной инже-
нерии. Клетки животных и человека также продуцируют ряд
биологически активным соединений. Например, клетки гипо-
физа – липотропин, стимулирующий расщепление жиров, и
соматотропин – гормон, регулирующий рост;

4
 – экология – наука о связях живых организмов с окружа-
ющей среды;
– микробиология – наука, изучающая микроорганизмы,
их строение, функции, взаимосвязи; позволяет улучшать тра-
диционные технологии и создавать новые. Достижения в об-
ласти микробиологии лежат в основе развития двух разделов
биотехнологии: генной и биологический инженерии. Микро-
биологическая промышленность в настоящее время исполь-
зует тысячи штаммов различных микроорганизмов. В боль-
шинстве случаев они улучшены путем индуцированного му-
тагенеза и последующей селекции. Это позволяет вести широ-
комасштабный синтез различных веществ;
– молекулярная биология и биохимия – науки, изучающие
молекулярные основы структуры и функций клеток. Откры-
тия и технологические решения этих наук используются во
всех разделах биотехнологии. В молекулярной биологии при-
менение биотехнологических методов позволяет определить
структуру генома, понять механизм экспрессии генов, смоде-
лировать клеточные мембраны с целью изучения их функций
и т. д. Конструирование необходимых генов методами генной
и клеточной инженерии позволяет управлять наследственно-
стью и жизнедеятельностью животных, растений и микроор-
ганизмов и создавать организмы с новыми полезными для че-
ловека свойствами, ранее не наблюдавшимися в природе;
– иммунология – наука, изучающая биологические меха-
низмы самозащиты организма от любых чужеродных ве-
ществ. Благодаря достижениям в области иммунологии созда-
ются новые технологии для диагностики и лечения заболева-
ний, производства и применения лекарственных препаратов.

1.2 История биотехнологии

Технологии приготовления пищевых продуктов с исполь-
зованием биологических объектов (выпечка хлеба, пивоваре-
ние) были известны с глубокой древности. Усовершенствова-

5
лись способы хранения и переработки продуктов путем фер-
ментации (производство сыра, уксуса, соевого соуса), произво-
дились мыло из жиров, изготавливали простейшие лекарства,
спиртные напитки, перерабатывали отходы.
Термин «биотехнология» становится общепринятым при-
мерно с конца 70-х гг. XX в. До этого для обозначения наиболее
тесно связанных с биологией разнообразных технологий ис-
пользовали такие названия, как прикладная микробиология,
прикладная биохимия, технология ферментов, биоинженерия,
прикладная генетика и прикладная биология (таблица 1).

Таблица 1 – История развития биотехнологических процессов

Дата Научные открытия
1 2
III тыс. л. Использование дрожжей для получения хлеба, пива, вина
до н.э.
1857 г. Луи Пастер установил, что микроорганизмы играют ключевую
роль в процессах брожения, и показал, что в образовании раз-
ных продуктов участвуют разные микроорганизмы
1865 г. Грегор Мендель открыл законы наследственности
1875 г. Роберт Кох разработал метод чистых культур, гарантирующий,
что в посевном материале будут содержаться только клетки
определенного вида
1925 г. Г.А. Надсон, Г. С. Филиппович установили возможность искус-
ственного мутагенеза микроорганизмов (грибов) под влиянием
рентгеновского облучения
1940 г. Флеминг, Флори, Чейни организовали промышленное произ-
водство антибиотиков
1953 г. Джеймс Уотсон и Френсис Крик открыли структуру ДНК в
виде двойной спирали; установлена структура инсулина
1963 г. Маршалл Ниренберг расшифровал генетический код, который
оказался одинаковым для бактерий и человека; осуществлён
синтез биополимеров по установленной структуре
1970 г. Выделена первая рестрикционная эндонуклеаза; осуществлён
синтез ДНК
1972 г. Пол Берг разработал технологию рекомбинантных ДНК; был
синтезирован полноразмерный ген транспортной РНК

6
Продолжение таблицы 1
1 2
1975 г. Получены моноклональные антитела
1976 г. Разработаны методы определения нуклеотидной последова-
тельности ДНК
1977 г. Уолтер Гилберт и Аллан Максам опубликовали метод быстрого
определения последовательности ДНК;
1978 Фирма «Genentech» выпустила препарат, аналогичный челове-
ческому инсулину, полученный с помощью Е. соli;
– синтезированы фрагменты нуклеиновых кислот;
– разрешена к применению в Европе первая вакцина для жи-
вотных, полученная по технологии рекомбинантных ДНК;
1983 г. Гибридные Ti-плазмиды применены для трансформации расте-
ний
1996 г. Ежегодный объем продаж первого рекомбинантного белка
(эритропоэтина) превысил 1 млрд долл.
1997 г. Ян Уильмут клонировал первое млекопитающее – овцу Долли.
Исследования генома человека:
1977 г. Секвенирован первый ген человека (кодирующий белок хори-
онный соматотропин)
1988 г. Создание международного проекта «Геном человека», поста-
вившего своей целью полное секвенирование ДНК человека, в
СССР научный совет по геномной программе возглавил акаде-
мик А. А. Баев
1990 г. Международную организацию «Геном человека» возглавил
российский академик А. Д. Мирзабеков
1990 г. Официально начаты работы над проектом «геном человека»
1994- Опубликованы подробные генетические и физические карты
1995 гг. хромосом человека
1997 г. Клонировано млекопитающее из дифференцированной сомати-
ческой клетки
2003 г. Расшифрован геном (набор генов, присущий организму) чело-
века, содержащий приблизительно 30 тысяч генов и три милли-
арда «букв» молекул ДНК
2004 г. Британские ученые заявили о клонировании человека
2005 г. Полностью расшифрован геном человека

7
 Формальной датой рождения современной биотехнологии
является 1972 г., когда Полом Бергом была разработана тех-
нология рекомбинантных ДНК; синтезирован полноразмер-
ный ген транспортной РНК. Рекомбинантные молекулы
ДНК – молекулы, полученные вне живой клетки (пробирки)
путем соединения природных или синтетических молекул
ДНК, способных реплицироваться в клетке.

1.3 Объекты биотехнологии

Объектами биотехнологии служат различные живые орга-
низмы: вирусы, бактерии, грибы, клетки, ткани растений и
животных, которые являются продуцентами разнообразных
веществ.
Современное промышленное производство продуктов
биосинтеза представляет собой единую биотехнологическую
систему, которая складывается из последовательных стадий и
операций, количество и особенности которых зависят от вида
производимой продукции и ее товарной формы.
Структура и особенности биотехнологии могут охватывать
отдельные операции или процесс в целом. Совершенствование
биотехнологического процесса может привести к созданию но-
вых структурных единиц и к ликвидации устаревших.
Определяющими факторами в этом случае являются:
– используемый биологический агент (объект);
– субстрат и его биохимические и биофизические харак-
теристики;
– аппаратурное оформление, включая системы контроля и
управления;
– технологический режим или способ реализации;
– соответствие технологических процессов, оборудова-
ния, помещений, качества продукции и ее упаковки требова-
ниям стандартов.
Биологическим агентом (объектом) биотехнологической
системы являются различные представители живой природы,

8
которые делятся на три надцарства: акариоты (безъядерные),
прокариоты (предъядерные) и эукариоты (ядерные) и
пять царств: вирусы, бактерии, в том числе микроскопические
водоросли, грибы, а также растения и животные, в их числе –
простейшие. Субстратом является питательная среда для
культивирования клеток, продуктом – биомасса клеток, виру-
сов или синтезируемое клетками вещество, которому при со-
ответствующей обработке придается товарный вид. Одним из
основных элементов аппаратурного обеспечения биотехноло-
гического процесса является биореактор (аппарат культива-
тор, ферментер). При определенных параметрах и режимах
культивирования в биореакторах можно выращивать практи-
чески любые клетки.
Вирусы представляют собой бесклеточные частицы разме-
ром несколько нанометров и видны только в электронном мик-
роскопе. Они являются облигатными (т. е. обязательными) па-
разитами и могут размножаться только в клетках других орга-
низмов. Вне клеток вирусы существуют в виде вирионов, пред-
ставляющих собой комплекс нуклеиновой кислоты (ДНК или
РНК) с белком, которые связаны между собой нековалентными
связями. Белковые молекулы, окружающие РНК или ДНК, со-
здают оболочку вируса, называемую капсидом. По типу нукле-
иновой кислоты вирусы делятся на РНК-содержащие (вирусы
растений, а также вирусы, вызывающие грипп, бешенство, по-
лиомиелит, СПИД и другие заболевания человека) и ДНК-со-
держащие (бактериофаги, некоторые вирусы человека и живот-
ных, например, герпеса, оспы и другие).
Бактерии представляют собой безъядерные, одноклеточ-
ные (как правило) организмы, размером 0,2–10,0 мкм, имею-
щие определенную форму (палочки, кокки, спиралевидные
формы и т. д.). Внутреннее содержимое бактериальной клетки
(цитоплазма) изолировано от внешней среды клеточной обо-
лочкой, состоящей из тонкой мембраны и стенки, на которую
приходится до 20 % сухого вещества бактерий. Клеточная
стенка имеет сложное строение и придает бактериальной

9
клетке определенную форму. Исключение составляют мико-
плазмы, у которых нет клеточной стенки и, соответственно,
определенной формы. Бактериальные клетки, лишенные кле-
точной стенки, называются протопластами. Они использу-
ются в клеточно-инженерных исследованиях.
Бактерии отличаются чрезвычайным разнообразием по
условиям обитания, приспособляемости, способам питания и
биоэнергообразованию, а также по отношению к макроорга-
низмам – животным и растениям.
Благодаря большому разнообразию бактерий, обладаю-
щих широким диапазоном биохимического состава и своеоб-
разием протекающих в них реакций, они наиболее часто слу-
жат биотехнологическими объектами. Из биомассы бактерий
получают различные органические вещества, в частности,
аминокислоты, разнообразные белковые вещества, в том
числе ферменты.
Бактерии являются удобным объектом для генетических
исследований, так как быстро размножаются и содержат плаз-
мидную ДНК, способную включать в свой состав чужеродные
фрагменты. Генетически модифицированные и иммобилизо-
ванные на носителях клетки бактерии используются в научно-
исследовательских и промышленных целях. Наиболее изучен-
ной и широко применяемой в генноинженерных исследова-
ниях клеткой является кишечная палочка, обитающая в тол-
стом кишечнике человека.
Грибы, насчитывающие десятки тысяч видов, сочетают в
себе черты клеток растений и животных. Они имеют клеточ-
ное ядро, как и растения – прочную клеточную стенку. Ана-
логично клеткам животных они нуждаются в некоторых вита-
минах и способны синтезировать свойственные животным по-
лисахариды – хитин и гликоген. Наибольший интерес для био-
технологии представляют микроскопические грибы, к кото-
рым относятся дрожжи, плесневые и другие микроорганизмы,
применяемые в хлебопечении, пивоварении и в молочной про-

10
мышленности. Они используются также для получения спир-
тов, органических кислот, антибиотиков, различных биологи-
чески активных веществ и кормового белка.
Самостоятельную группу организмов, представляющих
собой симбиоз (сожительство) грибов с водорослями или с ци-
анобактериями, составляют лишайники, которые являются
перспективными источниками ряда биологически активных
веществ.
Растения, насчитывающие около 500 000 видов, состоят
из ядерных клеток, которые имеют сложное строение и вы-
полняют различные специализированные функции. К ним от-
носятся водоросли, являющиеся водными организмами, и
высшие растения, обитающие преимущественно на суше.
Один из видов водорослей – морская капуста – используется
в пищу. Из водорослей добывают агар-агар и альгинаты – по-
лисахариды, используемые для изготовления микробиологи-
ческих сред и в пищевой промышленности.
Высшие растения – многоклеточные организмы, имею-
щие специализированные органы, такие как корни, стебли, ли-
стья. Они состоят из тканей, образованных дифференцирован-
ными клетками. Ткани различаются химическим составом,
строением и выполняют различные функции: механические,
покровные, выделительные, проводящие и другие. Особое
значение для биотехнологии имеет одна из тканей растений,
называемая меристемой. Ее клетки способны к делению, бла-
годаря чему осуществляется рост, а также образование тканей
и органов растений. Они не утрачивают способности делиться
и после удаления из растения. При выращивании на специаль-
ных питательных средах из меристемных клеток образуется
масса делящихся клеток – каллус, который можно длительно
культивировать, получать из него новые растения или исполь-
зовать для извлечения нужных веществ. Наиболее сложным,
но в то же время более эффективным является выращивание
отдельных растительных клеток в жидких средах (в суспензи-
онных культурах).

11
 Благодаря способности улавливать световую энергию
солнца и использовать ее в синтезе органических веществ рас-
тения служат поставщиками питательных веществ для других
организмов. Растения составляют большую часть биомассы
Земли, поэтому производство и переработка растительного
сырья для удовлетворения различных потребностей человека
используется с древнейших времен.
Животные бывают простейшими (одноклеточными) и
высшими (многоклеточными). Как и растения, они состоят из
ядерных клеток. Среди простейших имеются паразиты и воз-
будители болезней высших животных и человека. Культиви-
рование их на искусственных средах чрезвычайно затруднено.
Однако некоторые простейшие выращиваются и использу-
ются для целей биоиндикации, в токсикологических исследо-
ваниях и для получения отдельных веществ. Ткани высших
животных являются источниками полноценного белка, липид-
ных веществ и некоторых витаминов, необходимых для пита-
ния человека. Из органов и крови животных получают различ-
ные белковые препараты (альбумин, иммуноглобулины, фер-
менты), некоторые гормоны и другие биологически активные
вещества. Поскольку сырье животного происхождения явля-
ется наиболее дорогим, а выход конечных продуктов недоста-
точно высок, то в современных технологиях все чаще исполь-
зуются культуры клеток животных или человека, выращивае-
мых на искусственных средах (получение интерферона, мо-
ноклональных антител).
Наиболее перспективным и экономичным способом про-
изводства биологически активных веществ является генная
инженерия, позволяющая внедрить ген животного в клетку
бактерии, которая начинает синтезировать нужное вещество.
Так получают в настоящее время человеческий инсулин – гор-
мон белковой природы, без которого невозможен нормальный
обмен веществ, гормон роста и некоторые другие вещества.
Клетки растений и животных являются сложно организо-
ванными образованиями, состоящими из цитоплазмы и более

12
плотного ядра. В цитоплазме содержатся внутриклеточные
органеллы: митохондрии, рибосомы и лизосомы, шерохова-
тые и гладкие мембраны эндоплазматической сети, погружен-
ные в водорастворимую среду клетки (цитозоль). Клетка
окружена плазматической мембраной, обладающей избира-
тельной проницаемостью благодаря наличию специальных
механизмов транспорта веществ. Клеточные ядра служат для
хранения генетической информации, носителем которой явля-
ется ДНК.
Митохондрии снабжают клетку энергией за счет окисле-
ния веществ при участии кислорода. В них синтезируются
также собственные белки митохондрий, что является исклю-
чением из общего правила. Все остальные клеточные белки
синтезируются на рибосомах.
Лизосомы содержат ферменты для расщепления различ-
ных биополимеров.
Мембраны эндоплазматической сети формируют внутрен-
нюю структуру (каркас) клетки, в которой осуществляются
превращения внутриклеточных веществ, а также реакции обез-
вреживания чужеродных соединений (ксенобиотиков).
С мембранами эндоплазматической сети связан аппарат
Гольджи, представляющий собой систему микротрубочек. В
аппарате Гольджи происходят реакции химической моди-
фикации белков, а также синтез резервных и секретируемых
из клетки веществ.
Жидкая часть клетки – цитозоль содержит ферменты син-
теза и анаэробного окисления веществ, а также низкомолеку-
лярные органические и неорганические соединения.
Особенностью строения растительных клеток является
наличие хлоропластов, в которых происходят процессы фото-
синтеза. От клеток животных растительная клетка отличается
также твердой стенкой, в состав которой входят вещества по-
лисахаридной природы, в том числе целлюлоза, гемицеллю-
лозы, пектины и полифенольный полимер лигнин.

13
 1.4 Основные разделы биотехнологии
Биотехнология – это уникальная наука, в которой для ис-
следования используются живые организмы и биологические
процессы, имеющие практический интерес для человека.
В результате получается улучшить качество, питательную
ценность и безопасность как сельскохозяйственных культур,
так и продуктов животного происхождения, составляющих ос-
нову используемого пищевой промышленностью сырья.
В биотехнологии как в науке можно выделить три основ-
ные части:
– промышленная биотехнология – общие принципы осу-
ществления биотехнологических процессов, основные объ-
екты и сферы применения биотехнологии, крупномасштабные
промышленные биотехнологические производства, использу-
ющие микроорганизмы;
– клеточная инженерия – методы ведения культур клеток и
практическое использование этих объектов. В рамках этого
раздела выделяют культивирование растительных клеток и ме-
тоды культивирования животных клеток, так как подходы к
культивированию этих объектов различаются в силу их прин-
ципиальных биологических различий. Клеточная биотехноло-
гия обеспечила ускоренное получение новых важных форм и
линий растений и животных, используемых в селекции на
устойчивость, продуктивность и качество; размножение цен-
ных генотипов, получение ценных биологических препаратов
пищевого, кормового и медицинского назначения;
– генная инженерия – генетическая трансформация, пере-
несение чужеродных генов и других материальных носителей
наследственности в клетки растений, животных и микроорга-
низмов, получение трансгенных организмов с новыми или
усиленными свойствами и признаками.
Возможности биотехнологий огромны по возобновляю-
щимся ресурсам, резервам природного биологического сырья
и организмов-продуцентов, разнообразию процессов и полу-

14
чаемой продукции. Промышленные биотехнологии вносят су-
щественный вклад в увеличение производства продуктов пи-
тания и кормов для животных, в повышение плодородия
почвы, в борьбу с вредителями сельского хозяйства. Сочета-
ния биотехнологии с культуральными формами выращивания
некоторых растений и животных, синтез ценных биопрепара-
тов, витаминов и лекарств, производство тканевых биозаме-
нителей, создание иммобилизованных ферментов-суперката-
лизаторов, применение их в тонкой органической химии и
микрометаллургии, борьба с коррозией и остатками синтети-
ческих ксенобиотиков, вклад в экологичную энергетику и в
очистку промышленных эмиссии – вот далеко не полный пе-
речень возможных применений биотехнологий. Этот диапа-
зон быстро увеличивается благодаря научным достижениям в
микробиологии, биохимии, генной инженерии.

1.5 Области применения современной биотехнологии

Возможности использования биологических технологий в
современном мире гораздо больше, чем в древности. В насто-
ящее время можно обозначить ряд отраслей народного хозяй-
ства и деятельности человека, потребности которых обеспе-
чиваются этой наукой.
В таблице 2 указаны направления, развивающиеся на ос-
нове биотехнологии, и продукты, получаемые с ее помощью.

Таблица 2 – Основные направления биотехнологии

Отрасль Получаемые продукты
производства
1 2
Материаловедение Выщелачивание руд, дальнейшее изучение и контроль
биоразложения. Производство биополимеров.

15
Продолжение таблицы 2

1 2
Сельское Производство белково-витаминных концентратов.
хозяйство Селекция, клонирование и генетическая инженерия
животных и растений.
Использование антибиотиков для лечения животных
и птиц. Производство вакцин.
Производство биоинсектицидов.
Применение гормонов и других стимуляторов роста
Получение новых штаммов микроорганизмов.
Сохранение генофонда растений и животных
с помощью замораживания клеток в жидком азоте.
Производство Получение органических кислот, аминокислот, анти-
химических биотиков. Производство ферментов для использования
веществ в составе моющих средств. Культивирование микрово-
дорослей в качестве продуцентов химических веществ
– внеклеточных метаболитов.
Энергетика Увеличение потребления биогаза, крупномасштабное
производство этанола как жидкого топлива
Контроль за состо- Очистка отходов различных производств, токсических ве-
янием окружаю- ществ. Улучшение методов тестирования, прогнозирова-
щей среды ние превращения отходов с помощью микроорганизмов.
Создание биологических фильтров из корней растений,
очищающих сточные воды от тяжелых металлов.
Пищевая Создание новых методов переработки и хранения пи-
промышленность щевых продуктов, получение пищевых добавок, ис-
пользование белка, синтезируемого одноклеточными
организмами.
Медицина Применение ферментов для усовершенствования диа-
гностики, создание датчиков на основе ферментов, ис-
пользование микроорганизмов и ферментов при произ-
водстве сложных лекарств (например, стероидов), син-
тез новых антибиотиков, применение ферментов в те-
рапии. Получение вторичных метаболитов, в первую
очередь лекарственных препаратов.

16
 Контрольные вопросы

1. Определение понятия «биотехнология».

2. Связь биотехнологии с другими науками.
3. История становления науки «биотехнология».
4. Объекты биотехнологии.
5. Основные разделы биотехнологии.
6. Применение знаний биотехнологии в сельском хозяйстве.
7. Применение знаний биотехнологии в медицине.
8. Применение знаний биотехнологии в вопросах охраны
окружающей среды.

17
ГЛАВА 2. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ

Генетическая (генная) инженерия – совокупность приемов,

методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК,
выделения генов из организма (клеток), осуществления мани-
пуляций с генами и введения их в другие организмы. Они
направлены на получение желаемых качеств изменяемого ор-
ганизма. Генная инженерия не является наукой в широком
смысле, но является инструментом биотехнологии, используя
исследования таких биологических наук, как молекулярная
биология, цитология, генетика, микробиология.
В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала постав-
щиком таких важных гормонов, как инсулин и соматотропин.
Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной же-
лезы животных, поэтому стоимость его была очень высока.
Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется
800–1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы ве-
сит 200–250 г. Это делало инсулин дорогим и труднодоступ-
ным для широкого круга диабетиков. В 1978 г. исследователи
из компании «Генентек» впервые получили инсулин в специ-
ально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсу-
лин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и
30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями
образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было пока-
зано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других
примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных,
а по биологической активности от него не отличается. Впослед-
ствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина,
для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы
синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученный про-
инсулин расщепили до нативного инсулина, при этом этапы
экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму.
Из 1000 л культуральной жидкости можно получать до 200 г
гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого
из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

18
 Соматотропин – гормон роста человека, секретируемый ги-
пофизом. Его недостаток приводит к гипофизарной карликово-
сти. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на 1 кг веса три
раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недо-
статка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного
материала, из одного трупа 4–6 мг соматотропина в пересчете
на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, до-
ступные количества гормона были ограничены, кроме того, полу-
чаемый таким способом, он был неоднороден и мог содержать
медленно развивающиеся вирусы. Компания «Genentec» в 1980 г.
разработала технологию производства соматотропина с помо-
щью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков.
В 1982 г. гормон роста человека был получен в культуре E. coli и
животных клеток в Институте Пастера во Франции. С 1984 г.
было начато промышленное производство инсулина в СССР. При
производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae
(дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформирован-
ных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также без-
опасные и дешевые вакцины.
Организмы с чужеродными генами называют трансген-
ными.
Методы, на которых основана генная инженерия, позво-
ляют:
– найти среди имеющегося природного генофонда ген, от-
ветственный за какой-либо фенотипический признак, и выде-
лить его в форме ДНК либо мРНК;
– получить этот ген различными способами, зная первич-
ную его структуру (его нуклеотидную последовательность), в
необходимом количестве;
– ввести ген в организм-реципиент и получить его феноти-
пическое проявление.

19
 2.1 Генетическая информация в клетке
Воспроизведение себе подобных является одним из фун-
даментальных свойств живого. Благодаря этому явлению су-
ществует сходство не только между организмами, но и между
отдельными клетками, а также их органоидами (митохондри-
ями и пластидами). Материальной основой этого сходства яв-
ляется передача зашифрованной в последовательности нук-
леотидов ДНК генетической информации, которая осуществ-
ляется благодаря процессам репликации (самоудвоения) ДНК.
Все признаки и свойства клеток и организмов реализуются
благодаря белкам, структуру которых в первую очередь опре-
деляют последовательности нуклеотидов ДНК. Поэтому пер-
востепенное значение в процессах метаболизма играет био-
синтез нуклеиновых кислот и белка. Структурной единицей
наследственной информации является ген.

2.2 Гены, генетический код и его свойства

Наследственная информация в клетке не является моно-
литной, она разбита на отдельные гены это элементарные еди-
ницы генетической информации.
Работы по программе «Геном человека», которые прово-
дились одновременно в нескольких странах и были завер-
шены в начале XX в., позволили установить, что у человека
всего около 25–30 тыс. генов. Однако информация с большей
части нашей ДНК не считывается никогда, так как в ней со-
держится огромное количество бессмысленных участков, по-
второв и генов, кодирующих признаки, утратившие значение
для человека (хвост, оволосение тела и др.). Кроме того, был
расшифрован ряд генов, отвечающих за развитие наслед-
ственных заболеваний, а также генов-мишеней лекарствен-
ных препаратов. Однако практическое применение результа-
тов, полученных в ходе реализации этой программы, отклады-
вается, пока не будут расшифрованы геномы большего коли-
чества людей и станет понятно, чем они различаются.

20
 Гены, кодирующие первичную структуру белка, рибосо-
мальной или транспортной РНК, называются структурными, а
гены, обеспечивающие активацию или подавление считыва-
ния информации со структурных генов, – регуляторными. Од-
нако даже структурные гены содержат регуляторные участки.
Наследственная информация организмов зашифрована в
ДНК в виде определенных сочетаний нуклеотидов и их после-
довательности – генетического кода. Его свойствами явля-
ются: триплетность, специфичность, универсальность, избы-
точность и неперекрываемость. Кроме того, в генетическом
коде отсутствуют знаки препинания.
Каждая аминокислота закодирована в ДНК тремя нуклео-
тидами – триплетом. Например, метионин закодирован три-
плетом ТАЦ, то есть код триплетен. С другой стороны, каж-
дый триплет кодирует только одну аминокислоту, в чем за-
ключается его специфичность или однозначность. Генетиче-
ский код универсален для всех живых организмов, то есть
наследственная информация о белках человека может считы-
ваться бактериями и наоборот. Это свидетельствует о един-
стве происхождения органического мира. Однако 64 комбина-
циям нуклеотидов по три соответствует только 20 аминокис-
лот, вследствие чего одну аминокислоту может кодировать 2–
6 триплетами, то есть генетический код избыточен или вы-
рожден. Три триплета не имеют соответствующих аминокис-
лот, их называют стоп-кодонами, так как они обозначают
окончание синтеза полипептидной цепи.
Последовательность оснований в триплетах ДНК и коди-
руемые ими аминокислоты
Сокращения названий аминокислот: Ала – аланин; Арг –
аргинин; Асн – аспарагин; Асп – аспарагиновая кислота;
Вал – валин; Гис – гистидин; Гли – глицин; Глн – глутамин;
Глу – глутаминовая кислота; Иле – изолейцин; Лей – лейцин;
Лиз – лизин; Мет – метионин; Про – пролин; Сер – серин;
Тир – тирозин; Тре – треонин; Три – триптофан; Фен – фенил-
аланин; Цис – цистеин.

21
 Если начать считывание генетической информации не с
первого нуклеотида в триплете, а со второго, то произойдет не
только смещение рамки считывания. Синтезированный таким
образом белок будет совсем иным не только по последова-
тельности нуклеотидов, но и по структуре и свойствам.
Между триплетами отсутствуют какие бы то ни было «знаки
препинания», поэтому нет никаких препятствий для переме-
щения рамки считывания, поэтому возникают и сохраняются
мутации.

2.3 Биосинтез белка и нуклеиновых кислот

Репликация ДНК – процесс самовоспроизведения молекул
нуклеиновых кислот, сопровождающийся передачей по
наследству (от клетки к клетке) точных копий генетической
информации. При этом генетический материал,
зашифрованный в ДНК, удваивается и делится между
дочерними клетками (рисунок 1).
Синтез ДНК является последовательным и
полуконсервативным. Последовательным, так как удвоение
ДНК происходит путем последовательного соединения
нуклеотидов в соответствии с правилом комплементарности
(G-C и A-T). Полуконсервативным, потому что после одного
раунда репликации одна цепь в каждой из двух дочерних
молекул является родительской (т. е. консервативной), а
другая – синтезированной заново. Поскольку две цепи имеют
противоположную направленность, их называют
антипараллельными.
Процесс репликации на самом деле крайне сложен, так
как в нем участвует ряд белков.

22
 Рисунок 1 – Репликация ДНК: 1 – материнская цепь; 2 – дочерняя цепь

В процессе репликации участвуют:

– ДНК-хеликаза и дестабилизирующие белки; они
расплетают двойную спираль родительской ДНК и формируют
репликационную вилку;
– ДНК-полимеразы, которые катализируют синтез
полинуклеотидной цепи ДНК в направлении 3'-5', копируя в
репликационной вилке матрицу с высокой степенью точности.
Поскольку две цепи двойной спирали ДНК антипараллельны, в
направлении 5'-3' непрерывно синтезируется лишь одна из двух
цепей, ведущая; другая цепь, отстающая, синтезируется в виде
коротких фрагментов Оказаки. ДНК-полимераза способна к
исправлению собственных ошибок, но не может
самостоятельно начать синтез новой цепи;
– ДНК-праймаза – катализирует короткие молекулы РНК-
затравки. Впоследствии фрагменты РНК удаляются – их
заменяет ДНК;
– ДНК-топоизомеразы, помогающие решить проблемы
кручения и спутывания спирали ДНК;

23
 – инициаторные белки, связывающиеся в точке начала
репликации и способствующие образованию нового
репликационного глазка с одной или двумя вилками. В каждой
из них вслед за инициаторными белками к расплетенной ДНК
сначала присоединяется белковый комплекс, состоящий из
ДНК-хеликазы и ДНК-праймазы (праймосома). Затем к
праймосоме добавляются другие белки и возникает
«репликационная машина», которая осуществляет синтез ДНК.
Ошибки в процессе репликации возникают крайне редко,
однако если они происходят, то очень быстро устраняются как
ДНК-полимеразами, так и специальными ферментами репара-
ции, поскольку любая ошибка в последовательности нуклео-
тидов может привести к необратимому изменению структуры
и функций белка и в конечном итоге неблагоприятно ска-
заться на жизнеспособности новой клетки или даже особи.
Биосинтез белка. Как образно выразился философ XIX в.
Ф. Энгельс: «Жизнь есть форма существования белковых
тел». Структура и свойства белковых молекул определяются
их первичной структурой, т. е. последовательностью амино-
кислот, зашифрованной в ДНК. От точности воспроизведения
этой информации зависит не только существование самого
полипептида, но и функционирование клетки в целом, по-
этому процесс синтеза белка имеет огромное значение. Он яв-
ляется одним из сложных процессов синтеза в клетке, по-
скольку в нем участвуют до трехсот различных ферментов и
других макромолекул. Кроме того, он протекает с высокой
скоростью, что требует еще большей точности.
В биосинтезе белка выделяют два основных этапа: тран-
скрипция и трансляция.
Транскрипция (от лат. транскрипцио – переписывание) –
это биосинтез молекул иРНК на матрице ДНК.
Поскольку молекула ДНК содержит две антипараллель-
ных цепи, то считывание информации с обеих цепей привело
бы к образованию совершенно различных иРНК, поэтому их

24
биосинтез возможен только на одной из цепей, которую назы-
вают кодирующей, или кодогенной, в отличие от второй,
некодирующей, или некодогенной (рисунок 2). Процесс пере-
писывания обеспечивает специальный фермент РНК-полиме-
раза, который подбирает нуклеотиды РНК по принципу ком-
плементарности. Этот процесс может протекать как в ядре,
так и в органоидах, имеющих собственную ДНК, – митохон-
дриях и пластидах.

Рисунок 2 – Транскрипция

Синтезированные в процессе транскрипции молекулы

иРНК проходят сложный процесс подготовки к трансляции
(митохондриальные и пластидные иРНК могут оставаться
внутри органоидов, где и происходит второй этап биосинтеза
белка). В процессе созревания иРНК к ней присоединяются
первые три нуклеотида (АУГ) и хвост из адениловых нуклео-
тидов, длина которого определяет, сколько копий белка может
синтезироваться на данной молекуле. Только потом зрелые
иРНК покидают ядро через ядерные поры.
Параллельно в цитоплазме происходит процесс активации
аминокислот, в ходе которого аминокислота присоединяется к
соответствующей свободной тРНК. Этот процесс катализиру-
ется специальным ферментом, на него затрачивается АТФ.

25
 Трансляция (от лат. трансляцио – передача) – это биосин-
тез полипептидной цепи на матрице иРНК, при котором про-
исходит перевод генетической информации в последователь-
ность аминокислот полипептидной цепи (рисунок 3).

Рисунок 3 – Трансляция

Второй этап синтеза белка чаще всего происходит в цито-

плазме, например на шероховатой эндоплазматической сети
(ЭПС). Для его протекания необходимы наличие рибосом, ак-
тивация тРНК, в ходе которой они присоединяют соответству-
ющие аминокислоты, присутствие ионов Mg2+, а также опти-
мальные условия среды (температура, рН, давление и т. д.).
Для начала трансляции (инициации) к готовой к синтезу
молекуле иРНК присоединяется малая субъединица рибо-
сомы, а затем по принципу комплементарности к первому ко-
дону (АУГ) подбирается тРНК, несущая аминокислоту мети-
онин. После этого присоединяется большая субъединица ри-
босомы. В пределах собранной рибосомы оказываются два ко-
дона иРНК, первый из которых уже занят. К соседнему с ним
кодону присоединяется вторая тРНК, также несущая амино-
кислоту, после чего между остатками аминокислот с помо-
щью ферментов образуется пептидная связь. Рибосома пере-

26
двигается на один кодон иРНК; первая из тРНК, освободив-
шаяся от аминокислоты, возвращается в цитоплазму за следу-
ющей аминокислотой, а фрагмент будущей полипептидной
цепи как бы повисает на оставшейся тРНК. К новому кодону,
оказавшемуся в пределах рибосомы, присоединяется следую-
щая тРНК, процесс повторяется, и шаг за шагом полипептид-
ная цепь удлиняется, т. е. происходит ее элонгация.
Окончание синтеза белка (терминация) происходит, как
только в молекуле иРНК встретится специфическая последо-
вательность нуклеотидов, которая не кодирует аминокислоту
(стоп-кодон). После этого рибосома, иРНК и полипептидная
цепь разделяются, а вновь синтезированный белок приобре-
тает соответствующую структуру и транспортируется в ту
часть клетки, где он будет выполнять свои функции.
Трансляция является весьма энергоемким процессом, по-
скольку на присоединение одной аминокислоты к тРНК рас-
ходуется энергия одной молекулы АТФ, еще несколько ис-
пользуются для продвижения рибосомы по молекуле иРНК.
Для ускорения синтеза определенных белковых молекул к мо-
лекуле иРНК могут присоединяться последовательно несколько
рибосом, которые образуют единую структуру – полисому.

2.4 Электрофорез нуклеиновых кислот

Электрофорез – метод разделения макромолекул, разли-
чающихся по размеру, молекулярной массе, пространствен-
ной конфигурацией, вторичной структурой или электриче-
скому заряду. Это направленное перемещение заряженных ча-
стиц в дисперсионной среде под действием внешнего электри-
ческого поля.
Метод широко используется для разделения
биологических макромолекул – белков, нуклеиновых кислот,
антигeнов и антител (иммуноэлектрофорез), мелких хромосом.
Впервые этот метод был открыт профессорами Москов-
ского университета П. И. Страховым и Ф. Ф. Рейссом в 1809 г.

27
 На этот момент электрофорез в агарозном или
акриламидном геле является стандартным, используемый для
разделения, идентификации и очистки фрагментов ДНК.
Конформация ДНК – это ее пространственная структура,
зависящая от нативности молекулы. В цитоплазме плазмидная
ДНК, помимо спирали, обусловленной ее двухнитевой
структурой, закручена в спирали более высокого порядка
(сверхспирализованная ДНК). Такая структура наиболее
компактна и подвижна в вязкой среде.
Принцип метода электрофореза белков
Молекулы в буферном растворе обладают электрическим
зарядом, величина и знак которого зависят от pH среды. При
пропускании электрического тока через раствор в нем формиру-
ется направленное электрическое поле, напряженность которого
измеряется разностью потенциалов по концам емкости, в кото-
рой производится электрофорез. Под действием поля молекулы
начинают движение в направлении катода или анода. Скорость
движения зависит от величины заряда, размеров и трения окру-
жающей среды. С течением времени смесь разделяется на фрак-
ции, состоящие из молекул, движущихся с одинаковой скоро-
стью. В современных экспериментах рабочий канал приборов
для электрофореза заполняют гелем, имеющим структуру сетки.
В этом случае основное влияние на подвижность молекул и их
степень разделения оказывают их линейные размеры. В некото-
рых случаях может возникнуть ситуация, при которой особо
крупные молекулы не проходят через поры геля.
При разделении в геле можно следить за положением
ДНК непосредственно при проведении фореза, так как полосы
ДНК в геле можно окрашивать флуоресцирующим и интерка-
лирующим (встраивающимся) в ДНК красителем бромистым
этидием в низкой концентрации, который добавляют в гель в
процессе его изготовления. Просматривая прокрашенный
гель в ультрафиолетовом свете, можно заметить даже 1 нг
ДНК. Скорость миграции ДНК через агарозный гель при элек-
трофорезе определяется четырьмя главными параметрами:

28
размером молекул, концентрацией агарозы, напряженностью
электрического поля, конформацией ДНК.

2.5 Ферменты генной инженерии

Генетическая инженерия – совокупность методов и техно-
логий, появлявшихся в результате развития молекулярной ге-
нетики, достижениям генетической энзимологии и химии нук-
леиновых кислот, так как инструментами молекулярного мани-
пулирования являются ферменты.
Эти ферменты издавна существуют в клетке, выполняя ра-
боты по репликации (удвоению) ДНК при делении клетки, ре-
парации повреждений (восстановлению целостности моле-
кулы), в процессах считывания и переноса генетической ин-
формации из клетки в клетку или в пределах клетки. Задача
генного инженера – подобрать фермент, который выполнил бы
поставленные задачи, то есть смог бы работать с определенным
участком нуклеиновой кислоты.
Ферменты, применяемые в генной инженерии, лишены ви-
довой специфичности, поэтому экспериментатор может соче-
тать в единое целое фрагменты ДНК любого происхождения в
избранной им последовательности. Это позволяет генной ин-
женерии преодолевать установленные природой видовые барь-
еры и осуществлять межвидовое скрещивание.
Ферменты, применяемые при конструировании рекомби-
нантных ДНК, можно разделить на несколько групп:
– ферменты, с помощью которых получают фрагменты
ДНК (рестриктазы);
– ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (поли-
меразы) или РНК (обратные транскриптазы);
– ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
– ферменты, позволяющие осуществить изменение струк-
туры концов фрагментов ДНК.

29
 Рестриктазы (рестрицирующие эндонуклеазы, эндонукле-
азы рестрикции) – это ферменты, узнающие и атакующие опре-
деленные последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК
(сайты рестрикции).
За открытие рестриктаз и возможность их применения в
молекулярной генетике В. Арбер, Х. Смит и Д. Натанс были
удостоены в 1978 г. Нобелевской премии.
Все рестрикционные эндонуклеазы бактерий «узнают»
специфические, довольно короткие последовательности ДНК и
связываются с ними. Этот процесс сопровождается разреза-
нием молекулы ДНК либо в самом сайте узнавания, либо в ка-
ком-то другом, что определяется типом фермента. Наряду с ре-
стрикционной активностью, бактериальный штамм обладает
способностью метилировать ДНК: после завершения реплика-
ции ДНК бактерий специфически модифицируется – фермент
метилаза добавляет метильные группы к адениновым или ци-
тозиновым остаткам в том же сайте, в котором связывается ре-
стрикционный фермент. В результате метилирования сайт ста-
новится устойчивым к рестрикции. Различие в модификации
делает чужеродную ДНК чувствительной к действию рестрик-
таз. Системы рестрикции и модификации широко распростра-
нены у бактерий; их существование играет важную роль в за-
щите собственной ДНК от загрязнения последовательностями
чужеродного происхождения.
Различают три основных класса рестриктаз.
Все рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго
определенные последовательности, но рестриктазы 1-го класса
осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК,
а рестриктазы 2-го и 3-го классов «узнаю»т и расщепляют ДНК
в строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на
фиксированном от них расстоянии.
Ферменты типов 1 и 3 имеют сложную субъединичную
структуру и обладают двумя типами активностей – модифици-
рующей (метилирующей) и АТФ-зависимой эндонуклеазной.
Ферменты второго класса состоят из 2-х отдельных белков:

30
рестрицирующей эндонуклеазы и модифицирующей метилазы,
поэтому в генной инженерии используются исключительно
ферменты 2-го класса. Они нуждаются в ионах магния в
качестве кофакторов.
Рестриктазы по-разному расщепляют ДНК. Одни вносят
разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности
(Hpa I, Ssp I); другие – со сдвигом, со «ступенькой» (Pst I).
В первом случае образуются так называемые «тупые»
концы, а во втором – «липкие», то есть фрагменты имеют на
своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки
длиной в четыре нуклеотида. Такие фрагменты особенно
удобны для создания рекомбинантных ДНК.
Механизм действия рестриктаз. В качестве мишеней (мест
узнавания) часто выступают палиндромы из 4–6 пар основа-
ний – сайты рестрикции. Точки узнавания рестриктазами сим-
метричны относительно поворота на 180 °С, то есть последова-
тельность нуклеотидов слева направо в одной нити такая же, как
справа налево в другой. Симметрия подразумевает, что те из
них, которые должны быть метилированы, встречаются на обеих
цепях ДНК. В результате сайт-мишень может быть полностью
метилирован (обе цепи модифицированы), полуметилирован
(только одна цепь метилирована) или не метилирован.
Конструирование рекомбинантных ДНК. Под рекомби-
нантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro
(в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из
различных биологических источников. Ключевыми в этом
определении являются слова «фрагмент ДНК» и «объединение
in vitro», что указывает на сущность генетической инженерии
и ее отличие от всех остальных методов получения гибридных
(или химерных) организмов, таких как генетическая селекция,
эмбриональная инженерия и т.д.
Полимеразы
Впервые ДНК-полимераза была выделена А. Корнбергом с
сотрудниками в 1958 г. из E. coli.

31
 ДНК-полимераза I E. coli (Pol I) не связывается с молеку-
лами двухцепочечной кольцевой ДНК. Однако, если такие мо-
лекулы денатурировать и получить одноцепочечные формы, то
с последними полимераза связывается в количествах, пропор-
циональных длине этих участков – примерно одна молекула на
300 нуклеотидных остатков. Pol I связывается с одноцепочеч-
ными участками двойной спирали ДНК, в местах одноцепочеч-
ных разрывов с 3’-гидроксилом и 5’-фосфатом, а также с кон-
цами двухцепочечных молекул ДНК.
Фермент состоит из мономерной полипептидной цепи и
имеет 3-доменную структуру. Каждый домен обладает своей
ферментативной активностью: 5’-3’ полимеразной, 3’-5’ экзо-
нуклезной, 5’-3’ экзонуклеазной.
Такое сочетание ферментативных активностей позволяет
ДНК-полимеразе I E. coli играть активную роль в репарации
повреждений ДНК in vivo. N – концевой домен соединен с со-
седним петлей из аминокислотных остатков и легко отделяется
с помощью протеолитических ферментов. Оставшаяся часть
бифункциональна, так как состоит из полимеразы и 3’-5’ экзо-
нуклезы. Она названа фрагментом Кленова (по фамилии од-
ного из авторов, описавших ее). Фрагмент Кленова (Pol IK)
обычно используют для достройки одноцепочечных 5’-концов
на двухцепочечной ДНК, часто генерируемых рестриктазами,
до тупых; для синтеза второй цепи на одноцепочечной ДНК, а
также для гидролиза одноцепочечных 3’-концов на двухцепо-
чечных молекулах ДНК.
Обратная транскриптаза или ревертаза
Обратная транскриптаза используется для транскрипции
мРНК в комплементарную цепь ДНК.
Обратная транскриптаза обладает, по крайней мере, тремя
ферментативными активностями:
– ДНК-полимеразной, использующей в качестве матрицы
как РНК, так и ДНК;
– активностью РНКазы Н, гидролизующей РНК в составе
гибрида РНК-ДНК, но не одно- или двухцепочечную РНК;

32
 – ДНК-эндонуклеазной активностью.
Первые две активности необходимы для синтеза вирусной
ДНК, а эндонуклеаза важна для интеграции вирусной ДНК в
геном клетки-хозяина. Для того чтобы начать синтез, ревер-
тазе, как и другим полимеразам, необходим короткий двухце-
почечный участок (праймер). Праймером может служить одно-
цепочечный сегмент как РНК, так и ДНК, которые в процессе
реакции оказываются ковалентно связанными с новосинтези-
рованной цепью ДНК.
Лигазы
В 1961 г. Мезельсон и Вейгл на примере фага l показали,
что рекомбинация включает разрыв и последующее воссоеди-
нение молекул ДНК. Это положило начало поискам фермента,
участвующего в сшивании фрагментов ДНК. В 1967 г. такой
фермент был найден и получил название ДНК-лигаза. Он ката-
лизирует синтез фосфодиэфирной связи в 2-цепочечной моле-
куле нуклеиновой кислоты.
ДНК-лигазы сшивают рядом расположенные нуклеотиды,
образуя связь между остатками сахаров. Они абсолютно необ-
ходимы в процессах репарации ДНК и репликации – при удво-
ении цепи ДНК.
Ферменты, изменяющие структуру концов фрагментов
ДНК
Терминальная трансфераза (концевая дезоксинуклеотиди-
лтрансфераза) была обнаружена Боллумом в 1962 г. в тимусе
теленка.
При введении в реакцию, направляемую терминальной
трансферазой, лишь одного типа дезоксинуклеотидов образу-
ются молекулы ДНК, имеющие гомополимерные 1-цепочеч-
ные 3’-концы. Таким образом можно достроить другим моле-
кулам ДНК гомополимерные 3’-концы, комплементарные пер-
вым. Смешение полученных препаратов ДНК при определен-
ных условиях может приводить к формированию гибридных
молекул ДНК.

33
 2.6 Векторы генной инженерии
Ввести рекомбинантный ген в клетку можно двумя спосо-
бами: используя векторы или путем прямого введения.
Объединение разных молекул ДНК само по себе беспо-
лезно, если рекомбинатные ДНК не будут нормально функци-
онировать в клетке-хозяине. Таким образом, если одна часть
рекомбинантной молекулы ДНК несет нужный ген, то другая
должна содержать информацию, необходимую для репликации
и экспрессии в клетке.
Вектор – молекула ДНК или РНК, состоящая из двух ком-
понентов: векторной части (носителя) и клонируемого чуже-
родного гена. Задача вектора – донести выбранную ДНК в
клетку-рецепиент, встроить ее в геном, позволить идентифика-
цию трансформированных клеток, обеспечить стабильную экс-
прессию введенного гена.
Таким образом, вектор должен быть прежде всего:
– способным поддерживаться в клетке-хозяине (реплици-
роваться);
– многократно копироваться (ампфлицироваться);
– экспрессировать соответствующий ген (содержать соот-
ветствующие регуляторные последовательности);
– должен иметь маркерный ген, позволяющий различать
гибридные клетки для эффективной их селекции;
– должен быть способен передаваться в клетку соответ-
ствующего организма;
– быть небольшим;
– иметь уникальный сайт рестрикции.
Генетический маркер – ген, детерминирующий отчетливо
выраженный фенотипический признак, используемый для ге-
нетического картирования и индивидуальной идентификации
организмов или клеток.
Векторами могут быть:
– плазмиды (внехромосомные генетические элементы
клетки);
– ДНК вируса или фага;

34
 – методами генной инженерии получены искусственные
плазмиды, которые являются удобными в работе векторами,
позволяющими клонировать фрагменты ДНК размером в не-
сколько тысяч пар оснований, что вполне достаточно для боль-
шинства генов.
Плазмиды – это внехромосомные автономно реплицирую-
щиеся двухцепочечные кольцевые молекулы ДНК. Плазмиды
есть практически у всех бактерий.
Одни из них могут нести следующие функции:
– информацию, обеспечивающую их собственный перенос
из одной клетки в другую (F-плазмида);
– гены устойчивости к антибиотикам (R-плазмиды);
– специфические наборы генов, ответственные за утилиза-
цию необычных метаболитов (плазмиды деградации);
– гены, функции которых еще не выявлены (криптические
плазмиды, от англ. cryptic – скрытый, латентный).
Некоторые плазмиды представлены в клетке 10–100 копи-
ями, они называются высококопийными. Низкокопийные плаз-
миды присутствуют в клетке в числе 1–4 копий.
Как автономно реплицирующиеся генетические элементы
плазмиды обладают всеми основными свойствами, которые
позволяют использовать их в качестве вектора для переноса ре-
комбинантной ДНК. Но довольно часто природные плазмиды
обладют или небольшим размером, или уникальным сайтом ре-
стрикции, или не имеют удобный генетический маркер для
идентификации реципиентных клеток, несущих рекомбинант-
ную ДНК. Поэтому плазмидные векторы эффективней созда-
вать с помощью генной инженерии.
Плазмидный вектор pBR322. Одна их наиболее часто упо-
требляемых плазмид для клонирования pBR322 создана на ос-
нове плазмид природного происхождения, выделенных из
E. coli. Эта плазмида содержит гены устойчивости к двум анти-
биотикам: ампициллину и тетрациклину, причем в генах устой-
чивости к этим антибиотикам имеются сайты рестрикции. Если
фрагмент чужеродной ДНК встраивается в один из генов

35
устойчивости, то последний инактивируется. Следовательно,
успешное встраивание фрагмента чужеродной ДНК в один из
этих генов легко детектировать по исчезновению у бактерий
устойчивости к этому антибиотику. При этом сохраняется
устойчивость к другому антибиотику. Таким образом, вектор
дает возможность детектировать только те клоны бактерий, ко-
торые содержат рекомбинантную плазмиду.
Очищенную кольцевую плазмиду pBR322 обрабатывают
рестриктазой, расположенной в одном из генов устойчивости к
тому или другому антибиотику. Образуется линейная молекула
с липкими концами. Такие молекулы смешивают с донорской
ДНК, содержащей нужный ген и предварительно обработанной
такой же рестриктазой. Поскольку липкие концы этих двух
ДНК взаимно комплементарны, они спариваются с образова-
нием гибридных молекул. Далее смесь обрабатывают ДНК-ли-
газой Т4 в присутствии АТФ. В результате образуется множе-
ство разных комбинаций фрагментов, в том числе нежелатель-
ных продуктов.
Вирусы
Существуют вирусы, которые не приводят клетки к гибели,
но встраиваются в геном клетки-хозяина и размножаются вме-
сте с ней, либо вызывают ее неконтролируемый рост, т. е. пре-
вращают в раковую. К таким относятся ДНК-вирусы SV-40 и
вирус полиомы. Внедрение некоторых опухолевых РНК-виру-
сов ведет к отпочковыванию вирусных частиц от клетки без ее
лизиса. К таким вирусам относятся, например, ретровирусы
(вирус саркомы Рауса и СПИДа).
Для бактериальных клеток в качестве вектора часто ис-
пользуют бактериофаги. Вирусы являются одними из главных
кандидатов на роль векторов для введения чужеродной ДНК.
При вирусной инфекции каждая клетка может получить боль-
шое число копий чужеродного гена.
Наиболее распространенные векторы состоят из плазмиды
рВR322 и интактного раннего района транскрипции ДНК SV40,

36
а важный ген встраивается под контроль промотора поздних
генов или дополнительного раннего промотора.
Вирус должен быть жизнеспособным после рекомбиниро-
вания его ДНК. Легче всего вирусы вводятся в бактерии. Недо-
статком вирусов как векторов является их небольшая емкость.
Кроме того, вирусы заражают небольшой круг хозяев.
Из всех известных в настоящее время инфекционных аген-
тов вироиды имеют ранг наиболее странных. Известно, что са-
мые мелкие вирусы, способные к независимой репликации,
имеют размеры генома, соответствующие молекулярной массе
1 М, то есть около 1500 тыс. пар оснований. Установлено, что
они реплицируются ферментами клетки-хозяина, не трансли-
руются в видоспецифичные полипептиды, интегрируются в ге-
ном клетки-хозяина.
ДНК митохондрий и хлоропластов
Хлоропласты и митохондрии содержат полноценную гене-
тическую систему (ДНК), то есть все компоненты, необходи-
мые для экспрессии генетической информации: ДНК, ДНК-по-
лимеразы, РНК-полимеразы и белоксинтезирующий аппарат
(рибосомы, т-РНК, аминоацил-тРНК-синтетазы). Хлоропласт-
ная и митохондриальная ДНК также привлекают внимание уче-
ных в качестве возможных векторов для переноса генов в
клетку.
Хлоропласты и другие пластиды обладают одинаковой ге-
нетической информацией, так называемым пластомом. У выс-
ших растений он представляет собой замкнутую молекулу
ДНК длиной 150 тыс. н. п., достаточную для кодирования при-
мерно 100 белков. Для синтеза пластид необходимо значи-
тельно больше белков. Остальные белки кодируются ядром,
синтезируются в цитоплазме и поступают в хлоропласты.
В составе митохондриальной ДНК имеются структурные
гены, кодирующие полипептиды, гены рибосомных и транс-
портных РНК. Однако большая часть белков митохондрий, как
и хлоропластов, кодируется ядерными генами.

37
 Транспозоны – сегменты ДНК, которые контролируют
собственную транспозицию (перемещение) из одного сайта
ДНК в другой путем вырезания из исходного сайта и внедре-
ния в новый сайт хромосомы или плазмиды. Сегменты ДНК
впервые были открыты в 40-х гг.XX в. американской ученой
Барбарой Мак-Клинток у кукурузы. Эти гены, индентифици-
рованные по их способности подавлять экспрессию других ге-
нов кукурузы, находящихся рядом с ними, не имели фиксиро-
ванного положения в хромосоме.
Таким образом, вектор должен быть небольшим, способ-
ным поддерживаться в клетке-хозяине (реплицироваться), мно-
гократно копироваться (ампфлицироваться), экспрессировать
соответствующий ген (содержать соответствующие регулятор-
ные последовательности), должен иметь маркерный ген, позво-
ляющий различать гибридные клетки для эффективной их се-
лекции; должен быть способен передаваться в клетку соответ-
ствующего организма.

2.7 Конструирование рекомбинантных ДНК

Фрагменты ДНК, в том числе содержащие гены, получают
с использованием ферментов рестриктаз. Они могут образовы-
вать фрагменты как с тупыми, так и с липкими концами.
Сшивка фрагментов ДНК производится тремя основными ме-
тодами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты
сшиваемых ДНК.
Рестриктазно лигазный метод предусматривает сшивку по
одноименным «липким» концам, является самым распростра-
ненным и популярным. Впервые этим способом гибридная
ДНК была получена С. Коэном с сотрудниками в 1973 г. Неко-
торые рестриктазы, например Pst I, внося в цепи ДНК симмет-
ричные, расположенные по диагонали друг от друга разрывы
на равных расстояниях от центра сайта узнавания и образую-
щие «ступеньку». Эти комплементарные друг другу участки
имеют тенденцию к ассоциации за счет спаривания оснований,

38
и поэтому их называют комплементарными (или липкими) кон-
цами. Спаривание оснований происходит только между ком-
плементарными последовательностями, поэтому ААТТ-концы,
образуемые Eco RI, не будут спариваться, например, с АГЦТ-
концами, образуемыми Hind III. Любые два фрагмента (незави-
симо от их происхождения), образовавшиеся под действием од-
ной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет формирова-
ния водородных связей между однонитиевыми участками ком-
плементарных нуклеотидов (рисунок 4).

Рисунок 4 – Схема рестриктазно-лигазного метода

Однако после такого спаривания полная целостность двой-

ной спирали не восстанавливается, поскольку остается два раз-
рыва в фосфодиэфирном остове. Для его восстановления, то
есть сшивания, или лигирования нитей используют фермент
ДНК-лигазу. В живой клетке он выполняет функцию сшивания
фрагментов ДНК, синтезирующихся при репликации.
Сшивка по «тупым» концам (коннекторный метод)
«Липкие» концы не абсолютно необходимы для связыва-
ния фрагментов ДНК. «Тупые» концы также могут быть соеди-
нены за счет действия ДНК-лигазы, если лигаза и тупые концы
присутствуют в реакционной смеси в высоких концентрациях.
В этом случае реакция лигирования имеет свои особенности и
ее эффективность ниже, чем при сшивке по «липким» концам
(рисунок 5).

39
 Для ковалентного соединения двух фрагментов использу-
ется ДНК-лигаза. Эти процедуры составляют основу для вто-
рого общего метода получения рекомбинантных молекул ДНК.

Рисунок 5 – Пришивание «липких» концов и сшивка фрагментов ДНК

Поскольку можно формировать достаточно длинные взаи-

мокомплементарные одноцепочечные концы, образуются высо-
коэффективные гибридные молекулы. В частности, поэтому при
клонировании ДНК-копий матричных РНК, которые доступны
в ограниченных количествах, обычно используют коннектор-
ный метод. При таком способе соединения между фрагментами
встраиваются участки ААААА. Такие дополнительные последо-
вательности ТТТТТ могут влиять на функции соединяемых мо-
лекул, и поэтому всегда, когда только возможно, для получения
рекомбинантных молекул ДНК пользуются липкими концами,
образовавшимися в результате действия рестриктаз.
Сшивка фрагментов с разноименными липкими концами
В ситуации, когда необходимо сшить фрагменты, образо-
ванные разными эндонуклеазами рестрикции, и имеющие раз-
ные, то есть некомплементарные друг другу «липкие» концы,
применяют так называемые линкеры (или «переходники»).
Это химически синтезированные олигонуклеотиды, представ-
ляющие собой сайты рестрикции или их комбинацию. Впер-
вые эту идею предложил Шеллер с сотрудниками в 1977 г.
Существуют большие наборы таких генных «переходни-
ков». При использовании линкеров должна учитываться необ-
ходимость соблюдения правил экспрессии генетической ин-
формации. Часто в середину линкера помещают какой-либо
регуляторный генетический элемент, например, промотор или

40
участок, связанный с рибосомой. В этом случае линкеры обес-
печивают не только объединение генов, но и обусловливают
их экспрессию. Существуют линкеры «тупой» конец – «лип-
кий» конец.
При необходимости «липкие» концы можно превратить в
«тупые». Это достигается либо отщеплением «липких» концов
с помощью фермента – эндонуклеазы S1, которая разрушает
только одноцепочечную ДНК, либо «липкие» концы «застраи-
вают», то есть с помощью ДНК-полимеразы I на однонитевых
липких концах синтезируют вторую нить.

2.8 Определение нуклеотидной последовательности

(секвенирование) ДНК
Олигонуклеотиды представляют собой фрагменты одноце-
почечной нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), состоящие из
небольшого количества остатков нуклеотидов, соединенных
фосфодиэфирной связью.
Построенные из дезоксинуклеотидов олигонуклеотиды ча-
сто используются в полимеразной цепной реакции (ПЦР) и из-
вестны как праймеры.
Основные области применения олигонуклеотидов:
– праймеры для полимеразной цепной реакции (ПЦР);
– праймеры и зонды для полимеразной цепной реакции в
режиме реального времени (ПЦР-РВ);
– секвенирование;
– клонирование;
– метод FISH (флюоресцентная гибридизация in situ);
– биочиповые технологии.
Синтезируют отдельные олигонуклеотиды длиной
от 20 до 60 звеньев каждый с такими нуклеотидными последо-
вательностями, чтобы при отжиге из них образовалась двухце-
почечная молекула.

41
 Секвенирование ДНК позволяет довольно быстро опреде-
лить полную нуклеотидную последовательность сегмента дли-
ной 100–500 нуклеотидных пар, образующегося при расщепле-
нии ДНК рестрикционными эндонуклеазами.
Один из методов секвенирования основан на химической
деградации ДНК. Он был предложен в 1976 г. Максамом и Гил-
бертом и назван их именем. Суть метода сводится к следую-
щему: один из концов фрагмента ДНК метят с помощью изо-
топа фосфора 32Р. В последнее время вместо радиоактивной
вводят флюоресцирующую метку. Ее можно «цеплять» и к нук-
леотидам, причем для каждого типа нуклеотидов подбирают
различную окраску. Препарат меченой ДНК делят на четыре
порции и каждую из них обрабатывают реагентом, специфиче-
ски разрушающим одно или два из четырех оснований, причем
условия реакции подбирают таким образом, чтобы на каждую
молекулу ДНК приходилось лишь несколько повреждений.
Разрушение происходит в два этапа. На первом этапе про-
исходит модификация азотистого основания и последующее
его выщепление. На втором этапе производят гидролиз ДНК в
местах выщепления оснований. Пуриновые основания моди-
фицируются диметилсульфатом. Адениновые остатки метили-
руются по третьему атому азота, гуаниновые – по положению
N7. Если такую модификацию обработать 0,1 М HCl при 0 °С,
то выщепляется метиладенин. При последующей инкубации в
щелочной среде (0,1 М NaOH) при температуре + 90 °С проис-
ходит разрушение сахаро-фосфатной связи в местах выщепле-
ния оснований. Обработка поврежденных молекул пипериди-
ном приводит к гидролизу ДНК по остаткам метилгуанина. Пи-
римидиновые основания модифицируются гидразином. В бес-
солевой среде модифицируется цитозин и тимин, в присут-
ствии 2 М NaCl модифицируется только цитозин. При дальней-
шей обработке пиперидином происходит расщепление ДНК по
точкам модификации. Можно использовать и другие реакции
химической модификации оснований и расщепления по ним

42
молекул ДНК. В результате получается набор меченых фраг-
ментов, длины которых определяются расстоянием от разру-
шенного основания до конца молекулы. Фрагменты, образовав-
шиеся во всех четырех реакциях, подвергают электрофорезу в
четырех соседних дорожках. Затем проводят радиоавтогра-
фию, и те фрагменты, которые содержат радиоактивную метку,
оставляют «отпечатки» на рентгеновской пленке. По положе-
нию отпечатков можно определить, на каком расстоянии от ме-
ченого конца находилось разрушенное основание, а зная это ос-
нование – его положение. Так набор полос на рентгеновской
пленке определяет нуклеотидную последовательность ДНК.
Аналогично наблюдают флюоресцентное окрашивание. Если
для каждого из четырех нуклеотидов был подобран свой цвет
флюоресцентной метки, то при электрофорезе их наносят на
одну дорожку. Тогда расположение нуклеотидов отмечено
штрихами разного цвета, а процедуру считывания легко автома-
тизировать.
Другой метод, разработанный Сэнгером и носящий его
имя, основан не на химическом, а на ферментативном подходе.
Cэнгер использовал ДНК-полимеразу I. В клетке этот фермент
участвует в процессе репликации, заполняя пробелы между
вновь синтезированными фрагментами ДНК (фрагментами
Оказаки). Для работы фермента в пробирке требуются предше-
ственники ДНК – дезоксирибонуклеотидтрифосфаты (dNTP), а
также одноцепочечная матрица, на которой должен быть не-
большой двухцепочечный участок – затравка, с которого начи-
нается синтез (рисунок 6). Были также синтезированы модифи-
цированные дидезоксирибонуклеотиды, в которых дезоксири-
боза 3’-ОН отсутствует, для каждого из четырех оснований
ДНК. ДНК-полимераза включает эти предшественники в ДНК.
Однако, включившись в ДНК, модифицированное основание
не может образовать фосфодиэфирную связь со следующим
дезоксирибонуклеотидом. В результате рост (элонгация) дан-
ной цепи останавливается (терминируется) в том месте, где в

43
ДНК включился дидезоксирибонуклеотид (ddNTP). Поэтому
их называют терминаторами элонгации.
Реакционная смесь по Сэнгеру состоит из цепи ДНК, нук-
леотидную последовательность которой надо определить, ко-
роткого фрагмента «меченой» ДНК, комплементарной конце-
вому отрезку этой цепи (затравка), одного из четырех ddNTP и
соответствующего dNTP в строго определенном соотношении
(чтобы они конкурировали), а также остальных трех dNTP. Го-
товят четыре смеси, каждая из которых содержит один из четы-
рех ddNTP. В каждой из пробирок образуется набор меченых
фрагментов разной длины. Она зависит от того, в каком месте в
цепь включен дефектный нуклеотид. Полученные меченые
фрагменты ДНК разделяют в полиакриламидном геле (с точно-
стью до одного нуклеотида), проводят радиоавтографию и по
картине распределения фрагментов в четырех пробах устанав-
ливают нуклеотидную последовательность ДНК (рисунок 6).

Рисунок 6 – Ферментативный метод секвенирования ДНК

В настоящее время определение точной нуклеотидной по-

следовательности любого сегмента ДНК умеренной длины –

44
вполне разрешимая задача. Определена последовательность
нескольких сотен генов про- и эукариот. Зная последователь-
ность гена и генетический код, легко определить аминокислот-
ную последовательность кодируемого им белка. Раньше для
определения структуры белка приходилось делать тщательный
и весьма трудоемкий анализ выделенного и очищенного белка.
В настоящее время часто бывает проще определить структуру
белка через нуклеотидную последовательность, чем с помо-
щью прямого секвенирования. Если оно занимает месяцы и
даже годы, то ДНК удается секвенировать за несколько недель.
Определение последовательности ДНК привело также к
тому, что были обнаружены области, которые не кодируют
белки, но принимают участие в регуляции экспрессии генов и
репликации ДНК. В 1996 г. был секвенирован геном дрожжей,
в 1998 г. – геном арабидопсиса, в 2000 г. – геном человека. Од-
нако в этом случае речь идет только об установлении последо-
вательности нуклеотидов, так как генетическая структура и
функции отдельных участков генома еще не идентифициро-
ваны, это более сложная задача.
Сразу вслед за разработкой быстрых методов секвенирова-
ния появились быстрые и простые методы синтеза сравни-
тельно длинных олигонуклеотидов с определенной, заранее за-
данной последовательностью. За 3–4 дня можно синтезировать
последовательность из 12–20 нуклеотидов. Автоматизация
этой процедуры еще более облегчает и ускоряет синтез. Появи-
лись приборы – ДНК-синтезаторы, которые выполняют эту ра-
боту за несколько часов.

2.9 Полимеразная цепная реакция

Методы молекулярной биологии позволили разработать
весьма эффективный способ копирования in vitro заданных
участков ДНК, широко используемый в настоящее время в ген-
ной инженерии и получивший название полимеразной цепной
реакции (ПЦР). Она была вновь открыта в 1983 г. у Кэри Мал-
лисом. Его целью было создание метода, который бы позволил

45
амплифицировать ДНК в ходе многократных последователь-
ных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента
ДНК-полимеразы. Через 7 лет после опубликования этой идеи
в 1993 г. Маллис получил за нее Нобелевскую премию.
Полимеразную цепную реакцию используют для анализа
индивидуальных вариаций последовательности нуклеотидов
определенных локусов, для повышения эффективности клони-
рования целевых последовательностей изучаемых геномов и их
прямого секвенирования, для детекции в организме патоген-
ных микроорганизмов и т. п.
Метод основан на многократном избирательном копирова-
нии определенного участка ДНК при помощи ферментов в ис-
кусственных условиях (in vitro). При этом происходит копиро-
вание только того участка, который удовлетворяет заданным
условиям, и только в том случае, если он присутствует в иссле-
дуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых ор-
ганизмах (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются от-
носительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе
длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар
оснований.
Принцип реализации метода
Для проведения ПЦР в простейшем случае требуются сле-
дующие компоненты:
ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который тре-
буется амплифицировать.
Праймеры – короткие синтетические олигонуклеотиды
длиной 18–30 оснований, комплементарные противоположным
концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК.
Термостабильная ДНК-полимераза – фермент, катализиру-
ющий реакцию полимеризации ДНК. Полимераза для исполь-
зования в ПЦР должна сохранять активность при высокой тем-
пературе длительное время, поэтому используют ферменты,
выделенные из термофилов – Thermus aquaticus (Taq-полиме-
раза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus
woesei (Pwo-полимераза) и другие.

46
 Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP,
dTTP).
Буферный раствор, обеспечивающий необходимые усло-
вия реакции. Она проводится в 30–50 циклов, каждый из кото-
рых состоит из трех стадий.
Денатурация. Двухцепочечную ДНК-матрицу нагревают
до 94…96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термо-
стабильная полимераза) на 0,5–2 мин, чтобы цепи ДНК разо-
шлись. Иногда перед первым циклом (до добавления полиме-
разы) проводят предварительный прогрев реакционной смеси в
течение 2–5 мин для полной денатурации матрицы и прайме-
ров. Такой прием называется горячим стартом, он позволяет
снизить количество неспецифичных продуктов реакции.
Отжиг. Когда цепи разошлись, температуру понижают,
чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей.
Температура отжига зависит от состава праймеров и обычно
выбирается на 4…5 °С ниже их температуры плавления. Время
стадии – 0,5–2 мин. Неправильный выбор температуры отжига
приводит либо к плохому связыванию праймеров с матрицей
(при завышенной температуре), либо к связыванию в неверном
месте и появлению неспецифических продуктов (при занижен-
ной температуре).
Элонгация. ДНК-полимераза реплицирует матричную
цепь, используя праймер в качестве затравки. Температура
элонгации зависит от полимеразы. Часто используемые поли-
меразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Время элонга-
ции зависит как от типа ДНК-полимеразы, так и от длины ам-
плифицируемого фрагмента. Обычно время элонгации прини-
мают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.
После окончания всех циклов часто проводят дополнительную
стадию финальной элонгации, чтобы достроить все одноцепо-
чечные фрагменты. Эта стадия длится 7–10 мин.
Количество специфического продукта реакции (ограни-
ченного праймерами) растет экспоненциально, а количество

47
«длинных» копий ДНК – линейно, поэтому в продуктах реак-
ции доминирует специфический фрагмент ДНК. Через некото-
рое количество циклов рост количества продуктов замедляется
за счет ограничения числа реагентов, наличия ингибиторов, по-
явления побочных продуктов реакции.

2.10 Прямое введение гена в клетку

Способы прямого введения гена в клетку:
– трансфекция;
– микроинъекция;
– электропорация;
– метод «мини-клеток»;
– упаковка в липосомы;
– электронная пушка.
При трансфекции ДНК адсорбируется на кристаллах фос-
фата кальция, образовавшиеся частицы поглощаются клеткой
путем фагоцитоза.
Для трансфекции можно использовать хромосомы или их
фрагменты. Рецепиентная клетка содержит фрагменты донор-
ных хромосом, которые могут встраиваться в геном, могут реп-
лицироваться самостоятельно. Во введенных фрагментах часто
наблюдаются делеции.
Не все клетки способны к трансформации геномной ДНК с
высокой частотой. Человеческие фибробласты эффективно
включают плазмидную ДНК и почти не включают геномную.
Микроинъекция ДНК в клетки млекопитающих стала воз-
можной с появлением прибора для изготовления микропипеток
диаметром 0,1–0,5 мк и микроманипулятора (рисунок 7).
Так, плазмиды, содержащие фрагмент вируса герпеса с ге-
ном тимидинкиназы (ТК) и плазмиду рВR322, были инъециро-
ваны в ТК-клетки и было показано, что ТК-ген проник в ядра и
нормально в них реплицировался. Метод введения ДНК с по-
мощью микроинъекций был разработан в начале 70-х гг. А. Ан-
дерсоном и Г. Диакумакосом. В принципе при наличии хоро-

48
шего оборудования можно за 1 ч инъецировать 500–1000 кле-
ток. В лучших экспериментах в 50 % клеток наблюдаются ста-
бильная интеграция и экспрессия инъецированных генов. Пре-
имущество описываемого метода заключается также в том, что
он позволяет вводить любую ДНК в любые клетки, и для со-
хранения в клетках введенного гена не требуется никакого се-
лективного давления.

Рисунок 7 – Введение ДНК путем микроинъекции

Электропорация основана на том, что импульсы высокого

напряжения обратимо увеличивают проницаемость биомем-
бран. В среду для электропорации добавляют клетки и фраг-
менты ДНК, которые необходимо ввести в клетки (рисунок 8).
Через среду пропускают высоковольтные импульсы (напряже-
ние 200–350 В, длительность импульса 54 мс), приводящие к
образованию пор (электропробой) в цитоплазматической мем-
бране, время существования и размер которых достаточны,
чтобы такие макромолекулы, как ДНК, могли из внешней
среды войти в клетку в результате действия осмотических сил.
При этом объем клетки увеличивается.
Многочисленные исследования продемонстрировали, что
электропорация может успешно использоваться для введения
молекул ДНК в разные типы клеток, такие как культивируе-

49
мые клетки животных, простейшие, дрожжи, бактерии и про-
топласты растений, в том числе для введения рекомбинант-
ных плазмид.
Электропорация – наиболее простой, эффективный и вос-
производимый метод введения молекул ДНК в клетки.

Рисунок 8 – Метод электропорации

«Мини-клетки» получают путем блокирования донорных

клеток митоза колцемидом. При продолжительной им обра-
ботке клеток в них вокруг каждой хромосомы формируется но-
вая ядерная мембрана. Обработка цитохалазином В и центри-
фугирование приводят к образованию мини-клеток, представ-
ляющих микроядра, инкапсулированные в цитоплазматиче-
скую мембрану.
Полученные мини-клетки очень чувствительны к разного
рода воздействиям, поэтому для слияния подбирают специаль-
ные мягкие условия. Метод трудный, отличающийся низкой
эффективностью – 10-6–10-7.
Упаковка в липосомы используется для защиты экзоген-
ного генетического материала от разрушающего действия ре-
стриктаз.

50
 Липосомы – сферические оболочки, состоящие из фосфо-
липидов. Их получают путем резкого встряхивания смеси вод-
ного раствора и липидов или обработкой ультразвуком водных
эмульсий фосфолипидов. Липосомы, состоящие из фосфати-
дилсерина и холестерина, наиболее пригодны для введения
ДНК в клетки животных и растений. Системы переноса с помо-
щью липосом низкотоксичны по отношению к клеткам.
Метод биологической баллистики (биолистики) является
одним из самых эффективных на сегодняшний день среди ме-
тодов трансформации растений, особенно однодольных.
Суть метода заключается в том, что на мельчайшие ча-
стички вольфрама, диаметром 0,6–1,2 мкм, напыляется ДНК
вектора, содержащего необходимую для трансформирования
генную конструкцию. Вольфрамовые частички, несущие
ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помещаются
внутрь биолистической пушки. Каллус или суспензия клеток
наносится в чашку Петри с агаризированной средой и поме-
щается под биолистическую пушку на расстоянии 10–15 см. В
ней вакуумным насосом уменьшается давление до 0,1 атм. В
момент сбрасывания давления вольфрамовые частички с
огромной скоростью выбрасываются из биолистической
пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и
ядро клеток.
Обычно клетки, располагающиеся непосредственно по
центру, погибают из-за огромного количества и давления воль-
фрамовых частиц, в то время как в зоне 0,6–1 см от центра нахо-
дятся наиболее удачно протрансформированные клетки. Далее
их осторожно переносят на среду для дальнейшего культиви-
рования и регенерации.

Контрольные вопросы
1. Приведите определение генной инженерии.
2. Что такое ген и генетический код.
3. Что представляет собой биосинтез белка?
4. Объясните, в чем заключается процесс репликации ДНК?

51
 5. Что такое транскрипция и трансляция?
6. В чем заключается основной принцип реализации ме-
тода электрофореза нуклеиновых кислот?
7. Какие известны ферменты генной инженерии?
8. Сформулируйте определение группы ферментов ре-
стриктазы.
9. Приведите определение полимеразы.
10. Сформулируйте определение лигазы.
11. Что такое электропорация?
12. Векторы генной инженерии и их свойства.
13. Что представляет собой генетический маркер?
14. Плазмиды и их функции.
15. Конструирование рекомбинантных ДНК.
16. В чем заключается принцип реализации метода поли-
меразной цепной реакции?.

52
ГЛАВА 3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

3.1 Понятие о культивировании микроорганизмов

Для осуществления любого биотехнологического процесса
необходимы:
– культура микроорганизмов;
– питательная среда;
– аппаратура для выращивания и проведения вспомога-
тельных операций;
– средства контроля и управления.
Внесение микроорганизмов в стерильную среду называ-
ется посевом, или инокуляцией. Посев микроорганизмов тре-
бует соблюдения определенных правил, чтобы предохранить
исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроор-
ганизмами. По окончании работы посуду с культурами микро-
организмов следует автоклавировать, чтобы убить клетки, и
только после этого мыть. Допускается заливать дезинфициру-
ющим раствором поверхность плотных сред. Через сутки
среды можно уничтожать и посуду мыть. Неаккуратное обра-
щение с культурами микроорганизмов приводит к возникнове-
нию бактериального аэрозоля.
Культивирование является основной стадией технологиче-
ского процесса и во многом определяет количественные и ка-
чественные характеристики производства биопрепаратов. На
стадии культивирования осуществляется накопление как самой
биомассы, так и продуктов метаболизма (жизнедеятельности)
микроорганизмов.
Например, при производстве бактериальных препаратов
целевым продуктом является сама биомасса, в других слу-
чаях – продукты, синтезируемые клеткой (антибиотики, фер-
менты, аминокислоты и др.). При этом синтезируемый продукт
может накапливаться как внутри клеток, так и выделяться в
культуральную жидкость.
В том случае, когда культура растет на поверхности жид-
кой или плотной питательной среды, потребляя содержащиеся

53
в ней субстраты и выделяя в эту среду продукты метаболизма,
такой способ культивирования называют поверхностным.
При твердофазном культивировании клетки растут на по-
верхности твердой (плотной) среды, содержащей достаточное
количество влаги и питательных веществ (чаще всего основу
такой среды составляют пшеничные отруби).
При жидкофазном (глубинном) культивировании микроор-
ганизмы распределяются по всему объекту жидкой питатель-
ной среды, а кислород поступает к клеткам в результате интен-
сивной операции перемешивания.
Последний способ наиболее широко применяется в насто-
ящее время в производстве большинства препаратов по следу-
ющим причинам:
– позволяет получить большое количество бактериальной
массы за короткое время. Так, при культивировании микроор-
ганизмов группы кишечной палочки в условиях состояния по-
коя количество микробов не превышает 1–2 млрд см3, а с при-
менением принудительной аэрации урожайность, в зависимо-
сти от состава питательной среды, достигает 50–60 млрд см3.
Это объясняется тем, что при аэрации практически отсутствует
начальная стационарная фаза и бактерии сразу начинают ин-
тенсивно размножаться, переходя в логарифмическую фазу;
– процесс легко управляем. При глубинном выращивании
имеются существенные различия в степени потребления угле-
родных и азотистых веществ. Они интенсивно потребляются
при аэрации культуральной жидкости, поэтому, чтобы процесс
роста и размножения не прекращался быстро, необходимо в
процессе культивирования дополнительно вводить углеродные
и азотистые соединения и другие стимуляторы роста микроор-
ганизмов.
Добавление питательных веществ, особенно углеводных
(глюкоза) и биологических стимуляторов, усиливает интенсив-
ность размножения, что приводит к увеличению концентрации
микроорганизмов в момент съема их биомассы. Этот способ
также позволяет легко корректировать рН среды в процессе

54
культивирования, что очень важно для достижения максималь-
ной интенсивности размножения;
– максимальная технологичность. Так, поверхностный ме-
тод менее технологичен и в промышленных условиях применя-
ется в исключительных случаях, когда невозможно воспользо-
ваться глубинным методом.
Технологический процесс глубинного выращивания мик-
роорганизмов в реакторах (ферментерах), также как и при ис-
пользовании плотных питательных сред, складывается из сле-
дующих этапов:
– отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними;
– приготовление посевной микробной культуры;
– приготовление и стерилизация питательных сред;
– подготовка биореактора к посеву;
– выращивание микроорганизмов в реакторе и контроль
процесса культивирования.
Кроме того, он включает ряд вспомогательных операций:
– стерилизацию оборудования и коммуникаций;
– приготовление и стерилизацию пеногасителей, растворов
и другие.

3.2 Отбор штаммов микроорганизмов и работа с ними

Эталонные, или референтные штаммы хранятся и поддер-
живаются на заданном уровне во ВГНКИ ветеринарных препа-
ратов. Эти штаммы, в свою очередь, являются производствен-
ными, поскольку на их основе готовятся вакцины. При этом
инактивированные вакцины, как правило, получают из высоко-
вирулентных штаммов, а живые вакцины – из аттенуирован-
ных (ослабленных), авирулентных штаммов.
Наряду с производственными и эталонными штаммами, во
ВГНКИ хранятся контрольные штаммы, которые используют
для оценки качества вакцинных препаратов. Эти штаммы
должны быть генетически однородными популяциями микро-
организмов со стабильными морфологическими, специфиче-

55
скими и биологическими свойствами. Основными требовани-
ями к этим штаммам являются их высокие антигенные и имму-
ногенные свойства.
Антигенные свойства штаммов оцениваются по титру ан-
тител в сыворотке крови чувствительных животных через
определенные сроки после введения им микроорганизмов.
Иммуногенные свойства штаммов определяются по устой-
чивости привитых животных к заражению возбудителем бо-
лезни определенной дозой контрольного (вирулентного)
штамма и выражают 50%-й дозой иммуногенности или по
нарастанию титра антител в сыворотке крови. При этом 80 %
привитых животных должны быть невосприимчивы к инфек-
ции, против которой их вакцинировали.
Безвредность (реактогенность) эталонного, производствен-
ного штамма проверяют по выраженности реакции у лаборатор-
ных и естественно-восприимчивых животных на 5–10-кратное
увеличение прививочной дозы.
Производственные, эталонные штаммы должны сохранять
генетическую стабильных антигенных, иммуногенных и других
присущих им биологических свойств на протяжении 10–20 по-
следовательных пересевов как in vivo, так и in vitro.

3.3 Приготовление посевной микробной культуры

Обычно производственное культивирование микроорганиз-
мов при изготовлении вакцин осуществляют в больших объемах.
Поэтому вначале из имеющегося эталонного штамма микроорга-
низма, находящегося, как правило, в лиофильно высушенном со-
стоянии в ампуле, делают посевы в небольшие емкости, например
во флаконы емкостью 100–200 см3, заполненные по 50–150 мл
производственной средой. Затем из флаконов делают высевы в
большие емкости – бутыли объемом 18–20 л.
При достаточном накоплении микроорганизмов такую
культуру вносят в реактор и называют посевной (матрацной,
матровой, маточной). При этом нужно предварительно рассчи-

56
тать необходимое количество посевной культуры для произ-
водственного культивирования микроорганизмов, исходя из
посевной дозы, которая обычно составляет от 1 до 10 % по объ-
ему. Посевные микробные культуры также контролируются на
сохранение ими типичных морфологических, культурально-
биохимических, антигенных и иммуногенных свойств и отсут-
ствие в них посторонней микрофлоры (ПМФ).

3.4 Приготовление и стерилизация питательных сред

Одним из этапов получения биопрепаратов является куль-
тивирование микроорганизмов, которое невозможно без при-
менения достаточного количества разнообразных стандарт-
ных, эффективных и недорогих питательных сред (ПС).
В этой связи представляется целесообразным рассмотреть
основные принципы, лежащие в основе конструирования пита-
тельных сред, к которым относятся:
– удовлетворение питательных потребностей микроорга-
низмов;
– выбор сырьевых источников для конструирования пита-
тельных сред;
– дифференциация питательных сред по целевому назначе-
нию;
– оптимизация и стандартизация питательных сред.
Удовлетворение питательных потребностей микроорга-
низмов.
Основополагающим принципом конструирования ПС яв-
ляется полноценность, т. е. состав среды должен удовлетворять
питательным потребностям культивируемых микроорганиз-
мов.
В процессе роста микроорганизмы потребляют из окружа-
ющей их питательной среды ряд разнообразных химических
веществ, составляющих основу энергетического и конструк-
тивного обмена в клетках.
Поступление питательных веществ в цитоплазму может
осуществляться через всю поверхность клетки и связано с их

57
диффузией, а также с действием специальных транспортных
систем. Причем необходимые для роста и жизнедеятельности
клетки элементы должны находиться в определенной, легко-
усвояемой форме.
К основным компонентам, формирующим клеточное веще-
ство, относятся: углерод, азот, кислород и водород. Содержа-
ние этих элементов в различных микроорганизмах практически
постоянно.
Синтетические возможности микроорганизмов и способы
получения ими энергии разнообразны, следовательно, индиви-
дуальны их потребности в источниках питания.
Универсальных сред, одинаково пригодных для роста всех
без исключения микроорганизмов и клеток, не существует.
Разнообразие микроорганизмов проявляется, прежде
всего, в отношении к источникам углерода и азота. Эти эле-
менты представлены в средах различными веществами, и
именно они определяют специфичность сред.
В зависимости от формы, в которой микроорганизмы ис-
пользуют необходимые им питательные вещества, их подраз-
деляют на две большие группы:
– автотрофы – микроорганизмы, которые могут синтезиро-
вать вещества своей протоплазмы из простых неорганических
соединений. Например, они ассимилируют углерод из углекис-
лоты воздуха, азот из аммиака.
– гетеротрофы – микроорганизмы, для которых источни-
ком углерода и азота служат органические вещества. Они усва-
ивают органические углеродсодержащие соединения: угле-
воды, органические кислоты, спирты и углеводороды. Наибо-
лее доступные источники углеродного питания – углеводы, та-
кие как глюкоза, сахароза или мальтоза.
В зависимости от типов используемых азотистых соедине-
ний микроорганизмы разделяют на две группы:
– протеолитические, расщепляющие высокомолекулярные
белковые вещества и пептиды;

58
 – дезаминирующие, требующие присутствия в среде гото-
вых аминокислот, расщепление которых сопровождается выде-
лением аммиака.
Очень часто микроорганизмы и клетки нуждаются во мно-
гих природных аминокислотах, которые являются универсаль-
ными компонентами питания. Они целиком включаются в
структуру клетки.
Из всех незаменимых аминокислот ключевая роль принад-
лежит глутамину, а также аргинину, который имеет принципи-
альное значение для обезвреживания токсичных метаболитов
незаменимых аминокислот и аммиака.
Неорганические соли, входящие в состав питательных
сред, удовлетворяют потребности микроорганизмов в ионах
К+, Mg2+, Мп2+, Fe2+ или Fe3+, Р043-, SО42-. Они же определяют
необходимое осмотическое давление среды, величину рН и бу-
ферную емкость.
В питательной среде необходимо также наличие некото-
рых других ионов, в частности, Zn2+ Cu2+, Co2+, Ca2+, СL- и
других. Обычно они присутствуют в достаточном количестве
в виде примесей в питательных основах, минеральных компо-
нентах среды или содержатся в водопроводной воде, исполь-
зуемой для приготовления питательной среды.
Функция необходимых микроорганизмам и клеткам ионов
металлов заключается в том, что они служат активаторами и
кофакторами многих ферментов. Кроме того, они участвуют в
регуляции синтеза белка, являются компонентами белковых
комплексов.
В питательных средах должны присутствовать факторы
роста, различные по химической природе соединения, главным
образом, органические вещества (витамины, аминокислоты,
жирные кислоты, пуриновые и пиримидиновые основания), до-
бавление которых в очень незначительных количествах стиму-
лирует рост и размножение микроорганизмов.
К факторам роста относят: витамины группы В, гемин
(фактор X), путресцин, олеиновую кислоту, козимазу (фактор

59
Y) и ее ферменты, пуриновые (аденин, гуанин, ксантин, гипо-
ксантин) и пиримидиновые (цитозин, тиамин, урацил) основа-
ния, гормоны и другие.
Функции факторов роста разнообразны. Они участвуют в
процессах обмена веществ. Их отсутствие или недостаток в
среде приводит к бактериостатическому эффекту.
Выбор сырьевых источников для конструирования пита-
тельных сред
Качество питательных сред во многом определяется пол-
ноценностью состава питательных субстратов и исходного сы-
рья, используемого для их приготовления. Большое разнообра-
зие видов сырьевых источников обусловливает сложность за-
дач выбора наиболее перспективных, пригодных для констру-
ирования питательных сред требуемого качества. Определяю-
щую роль в этом вопросе играют, прежде всего, биохимические
показатели состава сырья, от которых зависит выбор способа и
режимов его переработки с целью наиболее полного и эффек-
тивного использования содержащихся в нем питательных ве-
ществ.
Для получения питательных сред с особо ценными свой-
ствами применяют прежде всего традиционные источники
белка животного происхождения, а именно – мясо крупного ро-
гатого скота (КРС), казеин, рыбу и продукты ее переработки.
Наиболее полно разработаны и широко применяются питатель-
ные среды на основе мяса КРС.
Учитывая дефицит кильки каспийской, широко применяе-
мой в недалеком прошлом, для получения рыбных питатель-
ных основ стала использоваться более дешевая и доступная
непищевая продукция рыбной промышленности – сухой криль,
отходы переработки его мяса, филетированный минтай и его
перезрелую икру. Наибольшее распространение получила рыб-
ная кормовая мука (РКМ), удовлетворяющая требованиям био-
логической ценности, доступности и относительной стандарт-
ности.

60
 Довольно активно используются питательные среды на ос-
нове казеина, который содержит все компоненты, имеющиеся
в молоке: жир, лактозу, витамины, ферменты и соли. В связи с
удорожанием продуктов переработки молока, а также повыше-
нием спроса на казеин на мировом рынке, применение имеет
ограниченный характер.
Из непищевых источников белка животного происхожде-
ния в качестве сырья для конструирования полноценных пита-
тельных сред необходимо выделить кровь убойных животных,
которая богата биологически активными веществами и микро-
элементами и, кроме того, содержит продукты клеточного и
тканевого обмена. Гидролизаты крови сельскохозяйственных
животных используются в качестве заменителей пептона в
дифференциально-диагностических питательных средах.
К другим видам белоксодержащего сырья животного про-
исхождения, которые могут быть использованы для конструи-
рования питательных сред, относятся: плацента и селезенка
КРС, сухой белковый концентрат – продукт переработки мяс-
ных отходов, спилковая обрезь, получаемая при обработке
кожи, эмбрионы домашних птиц – отход вакцинного производ-
ства, кровезаменители с истекшим сроком годности, творожная
сыворотка, мягкие ткани моллюсков и ластоногих.
Перспективно использование тушек пушных зверей из
зверо-хозяйств, крови КРС, получаемой на мясокомбинате,
обезжиренного молока и молочной сыворотки (отходы масло-
заводов).
В целом питательные среды, приготовленные из сырья жи-
вотного происхождения, имеют высокое содержание основных
питательных компонентов, являются полноценными и сбалан-
сированными по аминокислотному составу и достаточно хо-
рошо изучены.
Из продуктов растительного происхождения в качестве
белкового субстрата для питательных сред возможно исполь-
зование кукурузы, сои, гороха, картофеля, люпина и др. Однако

61
растительное сельскохозяйственное сырье содержит белок, не-
сбалансированный состав которого зависит от условий выра-
щивания культур, а также липиды в больших количествах, чем
продукты животного происхождения.
Обширную группу составляют питательные среды, изго-
тавливаемые из белкового сырья микробного происхождения
(дрожжи, бактерии и т.д.). Аминокислотный состав микроорга-
низмов, служащих субстратом для приготовления питательных
сред, хорошо изучен, а их биомасса является полноценной по
составу питательных веществ и характеризуется повышенным
содержанием лизина и треонина.
Разработан целый ряд питательных сред комбинирован-
ного состава из белковых субстратов различного происхожде-
ния. К ним относятся дрожжевая казеиновая питательная среда,
дрожжевая мясная и т.д.
Основой большинства известных питательных сред явля-
ются гидролизаты казеина, мяса КРС и рыбы (до 80 %). Удель-
ный вес непищевого сырья в технологии конструирования пи-
тательных сред составляет всего 15 % и в дальнейшем требует
увеличения.
Используемое для получения питательной основы непище-
вое сырье должно удовлетворять определенным требованиям,
а именно быть:
– полноценным (количественный и качественный состав
сырья должен, в основном, удовлетворять питательным по-
требностям микроорганизмов и клеток, для которых разраба-
тываются питательные среды);
– доступным (иметь достаточно обширную сырьевую
базу);
– технологичным (затраты на внедрение в производство
должны осуществляться с использованием имеющегося обору-
дования или существующей технологии);
– экономичным (затраты на внедрение технологии при пе-
реходе на новое сырье и его переработку не должны превосхо-
дить нормы затрат для получения целевого продукта);

62
 – стандартным (иметь длительные сроки хранения без из-
менения физико-химических свойств и питательной ценности).
Дифференциация питательных сред по целевому назначению
Прежде чем приступить к разработке питательных сред,
необходимо решить вопрос о предназначении будущей среды.
Следовательно, дифференциация питательных сред по целе-
вому назначению также является одним из основных принци-
пов их конструирования.
В соответствии с этим принципом среды подразделяют на:
– микробиологические (предназначенные для культивиро-
вания бактерий, дрожжей, грибов);
– для культур клеток, часть из которых относят также к ви-
русологическим средам.
По физическому состоянию питательные среды классифи-
цируются на:
– жидкие;
– жидкие концентрированные;
– полужидкие;
– твердые (плотные);
– сухие.
Жидкие среды лучше обогащать кислородом, по ним
проще изучить влияние на культуру различных факторов, опре-
делить бактериальную массу, образование веществ и побочных
продуктов. Жидкие среды используют для проведения более
точных исследований, их составом проще варьировать.
Полужидкие среды получают путем добавления к жидким
концентрирующих примесей, например 0,5 % агара, и исполь-
зуют, в частности, для культивирования анаэробных микроор-
ганизмов или при диагностике вирусов в чувствительных тка-
невых культурах.
Для культивирования клеток широко применяют жидкие
концентрированные среды, выпускаемые фирмами в виде 10-,
50- и 100-кратных концентратов.

63
 К плотным питательным средам обычно относят агаризо-
ванные, но в качестве уплотняющих веществ могут использо-
ваться желатин, силикагель, карбоксиметилцеллюлоза и другие.
К ним можно отнести: свернутую сыворотку, свернутый яичный
белок, картофель, ломтики моркови, зерна, пшено, рис и отруби.
Плотные питательные среды, в отличие от жидких, более
удобны в транспортировке. На них легко проводить микроско-
пическое изучение культур, выявлять заражение посторонней
микрофлорой и выделять чистую культуру из отдельных коло-
ний. Кроме того, для хранения микроорганизмов, как правило,
применяют плотные питательные среды. Однако, поскольку их
получают главным образом включением в их состав агара, то
вместе с ним могут быть внесены в качестве примесей различ-
ные катионы, питательные вещества и ростовые факторы в ко-
личестве, достаточном для проявления роста некоторых неже-
лательных культур.
Очень удобны в работе и перспективны в использовании
сухие питательные среды. Они стандартны, хорошо хранятся и
транспортируются, быстро растворяются в воде при комнатной
температуре. Их широко используют для получения диагности-
ческих питательных сред. Дифференциация питательных сред
проводится также по сложности. По этому признаку среды под-
разделяются на:
– простые, или обычные (пептонная вода, мясо-пептонный
бульон, мясо-пептонный агар, питательный желатин); их ино-
гда называют универсальными;
– сложные, политропные, или специальные (кровяной агар,
асцитический агар и бульон, мясо-пептонный сахарный бу-
льон, сывороточный агар и бульон, свернутая сыворотка, кро-
вяной бульон).
По происхождению и природе составных элементов среды
подразделяются на:
– естественные (натуральные, комплексные);
– полусинтетические;
– синтетические.

64
 Натуральные питательные среды – это природные, ком-
плексные органические среды неизвестного или неопределен-
ного состава, которые включают продукты животного или
растительного происхождения. К ним относятся пептоны,
кровь, отвары и экстракты, полученные из природных суб-
стратов (мясо, рыба, навоз, почва, крупы), овощные или фрук-
товые соки, сусло, молоко, ткани и сыворотка животных, кар-
тофель, соевые бобы и другие.
На натуральных средах хорошо развиваются многие мик-
роорганизмы, так как в них содержатся, как правило, все ком-
поненты, необходимые для их роста и развития. Но они имеют
сложный непостоянный химический состав, т. е. нестандартны,
что является их очевидным недостатком. Поэтому натуральные
среды мало пригодны для изучения физиологии обмена ве-
ществ микроорганизмов, так как не позволяют учесть потреб-
ление ряда компонентов среды и образование продуктов об-
мена по ходу развития.
Полусинтетические среды, кроме органических и неорга-
нических веществ известного состава, содержат в незначи-
тельных количествах продукты природного происхождения.
Эти питательные среды также отличаются нестандартностью
(хотя и более стандартны, чем натуральные). Примером могут
быть: картофельная среда с глюкозой, состав которой зависит
от сорта и возраста картофеля; дрожжевая среда; мясо-пеп-
тонный бульон и другие.
Синтетические питательные среды готовят из точно опре-
деленных количеств органических и неорганических химиче-
ских соединений известного состава и воды. Преимущество
синтетических сред – постоянный состав и воспроизводимость.
Однако, как правило, в них требуется вносить различные до-
бавки, в частности факторы роста.
Следует отметить, что среды, содержащие агар, нельзя рас-
сматривать как синтетические из-за сложности и недостаточ-
ной определенности состава агара.

65
 Возможность менять состав среды в нужном направлении
делает синтетические среды весьма пригодными для система-
тического изучения физиологии микроорганизмов путем син-
теза питательных веществ из определенных составных частей.
Отдельные штаммы одного и того же вида бактерий по-
разному относятся к различным химическим соединениям, и в
связи с этим он получил практическое приложение в вопросах
дифференциации отдельных штаммов внутри групп.
По набору питательных веществ выделяют:
– минимальные среды, которые содержат лишь источники
питания, достаточные для роста;
– богатые среды, в состав которых входят многие дополни-
тельные вещества.
В зависимости от назначения питательные среды разли-
чают: дифференциально-диагностические; элективные; селек-
тивные; ингибиторные; среды для поддержания культуры;
накопительные (насыщения, обогащения); консервирующие;
контрольные.
Дифференциально-диагностические – это сложные среды,
на которых микроорганизмы определенных видов растут по-
разному, в зависимости от биохимических свойств культуры.
Они предназначены для идентификации видовой принадлеж-
ности микроорганизмов, широко используются в клинической
бактериологии и в проведении генетических исследований.
Селективные, ингибиторные и элективные питательные
среды предназначены для выращивания строго определенного
вида микроорганизма. Эти среды служат для выделения бакте-
рий из смешанных популяций и дифференцирования их от
сходных видов. В их состав добавляют различные вещества,
подавляющие рост одних видов и не влияющие на рост других.
Например, для выделения грамотрицательных бактерий
рода Brucella из зараженной почвы или навоза применяют пи-
тательный агар с добавлением некоторых антибиотиков и кри-
сталлвиолета, которые подавляют большинство патогенных
грибов и бактерий, но не влияют на рост бруцелл. В больших

66
концентрациях хлорид натрия подавляет рост многих бакте-
рий, но хорошо переносится стафилококками.
Для достижения избирательности употребляют также азид,
цитрат, теллурит, лаурилсульфат и селенит натрия, йод и фени-
лэтанол. С этой целью используют натуральную желчь, очи-
щенные желчные соли и их заменители.
Среду можно сделать селективной за счет величины рН.
Примерами является среда Сабуро для культивирования
дрожжей с низким рН, а также среды с рН от 8 до 9 для выде-
ления холерного вибриона. В последнее время в качестве ве-
ществ, придающих средам селективный характер, применяют
антимикробные агенты, такие как антибиотики и другие хи-
миотерапевтические вещества.
Элективные ПС нашли широкое применение при выделе-
нии возбудителей кишечных инфекций. При добавлении мала-
хитовой или бриллиантовой зелени, солей желчных кислот (в
частности, таурохолево-кислого натрия), значительного коли-
чества хлорида натрия или лимоннокислых солей подавляется
рост кишечной палочки, но количество патогенных бактерий
кишечной группы не снижается. Некоторые элективные среды
готовят с добавлением антибиотиков.
Среды для поддержания культуры составляют так, чтобы в
них не было селективных веществ, способных вызывать измен-
чивость культур.
Накопительные питательные среды (обогащения, насыще-
ния) – это среды, на которых определенные виды или группы
культур растут быстрее и интенсивнее сопутствующих. При куль-
тивировании на этих средах обычно не применяются ингибитор-
ные вещества, а, наоборот, создают благоприятные условия для
определенного присутствующего в смеси вида. Основой сред
накопления являются желчь и ее соли, тетратионат натрия, раз-
личные красители, селенитовые соли, антибиотики и другие.
Консервирующие среды служат для первичного посева и
транспортировки исследуемого материала.

67
 Выделяют также контрольные питательные среды, кото-
рые применяют для контроля стерильности и общей бактери-
альной обсемененности антибиотиков. По масштабам исполь-
зования питательные среды подразделяются на:
– производственные (технологические);
– среды для научных исследований с ограниченным по
объему применением.
Производственные питательные среды должны быть до-
ступными, экономичными, удобными в приготовлении и ис-
пользовании для крупномасштабного культивирования. Среды
для научных исследований, как правило, бывают синтетиче-
скими и богатыми по набору питательных веществ.
Прописи применяемых в настоящее время питательных
сред очень многообразны. Особенно вариабельны по составу,
как наиболее многокомпонентные системы, прописи для кле-
точных культур, которые могут включать более шестидесяти
компонентов.
Оптимизация многокомпонентного состава питательной
среды
Несмотря на наличие большого количества работ, посвя-
щенных вопросам питания микроорганизмов, не всегда с до-
стоверной точностью удается определить количественные и ка-
чественные характеристики необходимых для развития и мета-
болизма клеток питательных веществ. Поэтому при конструи-
ровании новых питательных сред необходимо проведение ши-
роких исследований по выбору питательных сред и оптимиза-
ции качественных и количественных компонентов среды с це-
лью получения наиболее желаемого результата при ее исполь-
зовании.
Культивирование микроорганизмов неразрывно связано с
целесообразностью выявления оптимальных условий ведения
процесса. При этом приходится иметь дело с задачами опреде-
ления оптимальных параметров процесса в зависимости от вы-

68
бранного критерия оптимизации. Их решение связано с необ-
ходимостью максимизации продуктивности процесса по бакте-
риальной массе и минимизации затрат.
Процессы культивирования микроорганизмов можно опти-
мизировать методами, которые разделяются на две группы.
К первой группе относятся методы оптимизации по экспе-
риментальным данным. Они не требуют привлечения сложных
математических расчетов, но связаны со значительными затра-
тами времени, возникающими из-за необходимости проведе-
ния большого количества экспериментальных исследований.
Ко второй группе относятся методы с применением мате-
матических моделей.
В свою очередь последние подразделяются на две отлича-
ющиеся по сложности исполнения и точности описания реаль-
ного процесса подгруппы.
К первой следует отнести методы, основанные на построе-
нии математической зависимости (уравнения регрессии) про-
текания ограниченных процессов с использованием традици-
онного метода планирования эксперимента Бокса – Уилсона.
Он позволяет строить поисковые модели, когда исследователь,
не располагая сведениями о механизме соблюдаемого явления,
имеет лишь информацию о реакции системы на возмущение.
Ко второй подгруппе относятся методы, основанные на по-
строении моделей, базисом которых являются законы, описы-
вающие протекание фундаментальных процессов микробиоло-
гии (например, процесс размножения и отмирания микроорга-
низмов). В этом случае принимается за основу положение, что
комплекс всех изменений, происходящих в культуральной
жидкости (изменение содержания компонентов питательных
сред, образование и расходование промежуточных продуктов
биосинтеза, выделение метаболитов и катаболитов, трансфор-
мация органических соединений) – это следствие процессов са-
мовоспроизведения, а также результат реакций, связанных с
адаптацией и саморегуляцией микробной популяции.

69
 Оптимизация процессов микробиологического синтеза, ос-
нованная на использовании методов второй подгруппы, явля-
ется наиболее глубокой и точной, хотя и более трудоемка и
длинна, так как требует основательного изучения законов про-
текания элементарного акта на лабораторном уровне с целью
последующего создания математической модели в форме кине-
тических уравнений. На основе этой модели происходит даль-
нейшая балансировка состава питательных сред, а также поиск
оптимума основных режимов ведения процесса.
Задача оптимизации управляемого периодического про-
цесса культивирования по максимизации бактериальной массы
или целевого продукта в общем виде выглядит следующим об-
разом: определяются наиболее рациональный состав исходной
питательной среды, а затем профили изменения основных тех-
нологических параметров, обеспечивающих значение выбран-
ного критерия эффективности при заданных ограничениях.
Важнейшим элементом оптимизации технологического
процесса является выбор критерия эффективности. В качестве
критериев используют такие показатели, как концентрация
живых микробных клеток, съем целевого продукта с единицы
объема среды и т. д. Обычно оптимизация процесса культиви-
рования начинается с выбора питательной среды, обеспечива-
ющей питательные потребности популяции микробов или
синтез максимального количества продуктов метаболизма.
Количество компонентов, входящих в питательные среды для
выращивания микроорганизмов, может превышать десяток
элементов. Биологической роли каждого элемента, влияю-
щего в целом ряде случаев в микродозах на активность мета-
болических превращений в клетке, посвящено большое число
исследований.
Сложность выбора определяется еще тем, что на рост микро-
организмов влияет также взаимное соотношение компонентов.
Большое количество и взаимосвязь составляющих пита-
тельной среды ингредиентов обусловливает выбор методов

70
экспериментального исследования. Обычно используемые ме-
тоды однофакторного планирования в этих условиях малоэф-
фективны. Использование математических методов многофак-
торного планирования экспериментов позволяет установить
необходимые концентрации компонентов питания с учетом их
совместного влияния на скорость роста, качество биомассы и
количество целевого продукта.
Высокообъективным является метод балансировки состава
питательной среды, в основу которого положено спользование
уравнения ассимиляции микробной популяции, где учитыва-
ются такие показатели:
– концентрация потребляемого субстрата;
– время потребления;
– концентрация биомассы;
– коэффициент метаболизма;
– константы скорости образования и отмирания микроор-
ганизмов;
– концентрация субстрата в начальный момент культиви-
рования.
Обычно при периодическом процессе культивирования
большинство важных параметров, в том числе концентрация
питательных веществ в культуральной жидкости, изменяется в
течение времени. Профили их изменения не всегда близки к оп-
тимальным. Поэтому при подборе питательной среды для пе-
риодического культивирования возникает противоречие между
необходимостью внесения в нее достаточно большого количе-
ства субстратов и ингибирующим влиянием высоких концен-
траций одного или нескольких элементов питания на рост мик-
робной клетки и(или) биосинтез целевого продукта. Снижение
концентрации таких субстратов в исходной питательной среды
с последующим их добавлением в ферментер по определенной
программе позволяет исключить ингибирование процесса в
начальной фазе роста и в то же время не допустить его лимити-
рования в последующий период размножения микробов.

71
 3.5 Выращивание микроорганизмов в реакторе
и контроль за процессом культивирования
Примеры особенностей культивирования некоторых микро-
организмов с применением: активной аэрации микробных куль-
тур; а также в покоящемся состоянии без использования меха-
нических мешалок (без аэрации); в состоянии анаэробиоза.
Промышленное культивирование микроорганизмов с при-
менением активной аэрации
Процесс осуществляют в реакторах объемом от
0,01 до 100 м3, как правило, в асептических условиях. Пустой
аппарат тщательно моют, проверяют герметичность, стериль-
ность. Его и стерилизуют острым паром, одновременно все
коммуникации. Затем в реактор подают простерилизованную в
УНСи охлажденную до 25…35 °С питательную среду, вносят
посевной материал – 5–10 % объема питательной среды (0,2–
0,4 млрд живых микробных клеток в 1 мл по оптической кон-
центрации), включают систему аэрации и перемешивающее
устройство. Например, для листерий и сальмонелл скорость
вращения механической мешалки составляет 150–180 об./мин,
а культура микробов аэрируется подогретым до 37 °С очищен-
ным, стерильным воздухом с коэффициентом подачи 1,5 л воз-
духа на 1 л среды в одну минуту. Коэффициент заполнения ре-
актора – 0,5–0,8. Превышение этой величины может привести
к значительному уносу пены с отходящим воздухом и наруше-
нию асептических условий.
Температуру культивирования поддерживают путём по-
дачи охлаждающей воды в рубашку и другие теплообменные
устройства аппарата.
Оптимальная температура для разных микроорганизмов
различна, обычно 25…37 °С.
Для регулирования рН культуральной жидкости в ходе
культивирования добавляют соответствующие титрующие
агенты (щелочи, кислоты, раствор аммиака и другие). Продол-

72
жительность выращивания микроорганизмов в культива-
торе – 18–24 ч, спорообразующих – 40–48 ч и 200–250 ч – для
актиномицетов и микроскопических грибов.
Процесс культивирования контролируют по показателям
приборов – изменение температуры, рН, расход воздуха, ча-
стота вращения мешалки, а также путем периодического от-
бора проб (через 1–12 ч в зависимости от длительности про-
цесса).
В отобранных пробах определяют содержание углеводов,
общего и аммонийного азота, фосфора, биомассы, целевого
продукта метаболизма, морфологию микробных клеток, нали-
чие посторонней микрофлоры.
Периодическое культивирование микроорганизмов
В периодическом состоянии динамика роста и размноже-
ния микроорганизмов в жидкой питательной среде обладает ря-
дом особенностей, общих для бактерий, актиномицетов, мик-
роскопических грибов, микоплазм и других про- и эукариот.
При индивидуальном развитии им свойственна высокая ско-
рость размножения. Развитие происходит в виде последова-
тельных фаз, характер и продолжительность которых зависят
от физиологического состояния клеток, определяемого в свою
очередь условиями разнообразных факторов среды, в которой
развивается популяция того или иного организма.
Фазы роста микроорганизма отражают количественные и
качественные изменения в их биомассе и окружающей среде.
В простой гомогенной периодической культуре микроор-
ганизмов выделяют от 4 до 8 и даже до 16 фаз.
1. Исходная фаза (лаг-фаза или индукционный период) яв-
ляется фазой задержки роста, когда размножения микробных
клеток не происходит. Эта фаза характеризуется отсутствием
роста клеток. В этот период посевная культура приспосаблива-
ется к изменившимся внешним условиям и вырабатывает фер-
менты, необходимые для роста на этой питательной среде. В
лаг-фазе в клетках культуры происходят значительные каче-

73
ственные изменения: возрастет количество нуклеиновых кис-
лот, в первую очередь РНК, активизируются одни ферменты и
синтезируются другие.
Продолжительность лаг-фазы зависит от следующих фак-
торов:
– от состава питательной среды – если питательная среда
по составу мало отличается от среды, на которой росла посев-
ная культура, лаг-фаза может практически отсутствовать;
– от качества посевного материала – количества в нем жиз-
неспособных клеток, их возраста, способа хранения;
– от посевной дозы.
2. Период положительного ускорения роста. Длительность
этого периода для большинства микроорганизмов составляет
2 ч, и она зависит от температуры, состава питательной среды,
качества посевного материала. Многие авторы эти две фазы
рассматривают вместе. Число клеток остаётся постоянным из-
за отсутствия в этот период клеточного деления. Общее состо-
яние микробных клеток характеризуется как состояние при-
способления к питательной среде. В этот период усиливается
синтез веществ, клеток, они увеличиваются в размере, в них
образуется большое количество индуцибельных ферментов.
3. Фаза логарифмического (лог-фаза) или экспоненциаль-
ного (показательного) роста. Она характеризуется постоянной
и максимальной скоростью роста клеток. Рост микробов в эту
фазу происходит в геометрической прогрессии.
Продолжительность этой фазы зависит:
– от запаса питательных веществ в среде;
– от условий аэрации;
– от перемешивания и других факторов.
Для описания процессов роста микроорганизмов исполь-
зуют такие характеристики, как общая и удельная скорости ро-
ста биомассы (или числа клеток). Другой важной характеристи-
кой роста культуры является время генерации, за которое био-
масса культуры удваивается. Время генерации из разных куль-

74
тур микроорганизмов сильно различается. Наиболее быстро-
растущие бактерии при благоприятных условиях генерации
имеют период генерации – 20–25 мин.
Продолжительность генерации в лог-фазе у разных микро-
организмов не одинакова. Так, для сальмонелл она равна 20–
30 мин, для стрептококков и стафилококков – 25–35 мин, для
эшерихий – 15–17 мин.
На продолжительность генераций влияют температура,
рН и состав среды и т. д.
Высокая скорость развития микроорганизмов сохраняется
на всей экспоненциальной стадии. Однако эта зависимость
наблюдается в течение ограниченного времени. По мере роста
культуры в среде постепенно потребляются питательные веще-
ства, накапливаются продукты обмена, затрудняется транспорт
питательных веществ (в первую очередь кислорода) и метабо-
литов вследствие увеличения плотности популяции.
4. Фаза отрицательного ускорения. В эту фазу скорость
размножения замедляется, а время генерации увеличивается.
Наступление этой фазы обусловлено истощением питательной
среды и накоплением в культуральной жидкости токсических
веществ, которые начинают ингибировать развитие культуры.
Кроме того, в эту фазу происходит наивысшее накопление мик-
робной массы в единице объема.
5. Стационарная фаза роста, или максимума, на протяже-
нии которой численность микробной популяции не уменьша-
ется. В эту фазу скорость размножения и отмирания клеток
одинакова. Концентрация живых клеток в эту фазу достигает
максимума, и она называется М-концентрацией. В этой фазе
сама биомасса микроорганизмов и продукты их биосинтеза об-
ладают наибольшей биотехнологической ценностью.
6. Фаза отмирания микробной популяции. Любая микроб-
ная популяция, растущая в сосуде с несменяемой средой, всту-
пает после фазы стационарного роста в стадию отмирания. По
скорости отмирания вначале устанавливают фазу ускоренного
отмирания (VI), затем фазу постоянной скорости отмирания

75
(VII) и фазу замедленной скорости отмирания (VIII). Причи-
нами отмирания микробной популяции являются истощение
среды и накопление в ней большого количества токсических
продуктов метаболизма. В период стадии отмирания общее ко-
личество биомассы уменьшается, что чаще всего происходит за
счет аутолиза.
Продолжительность стадии отмирания у различных
микроорганизмов не одинакова: у пневмококка она составляет
2–3 сут, у эшерихий – несколько месяцев. В этот период в
культуре находят значительное уменьшение клеток. У них
уменьшается биохимическая и антигенная активность.
Учитывая это, для изготовления ряда биопрепаратов отби-
рают культуры микроорганизмов чаще всего в фазе отрица-
тельного ускорения роста или в начале стационарной фазы ро-
ста, когда концентрация живых микробных клеток приближа-
ется или равна М-концентрации.

3.6 Хемостатная культура, или метод непрерывного

культивирования микроорганизмов
Хемостатная, или непрерывная культура представляет со-
бой прочную культуру тех или иных микроорганизмов. В та-
ком случае возможность продления жизни микробной популя-
ции поддерживается с помощью непрерывной подачи свежей
среды и постоянного отбора микробной биомассы или образо-
вавшихся продуктов метаболизма, т. е. можно культуру микро-
организма как бы зафиксировать в одной, например, стацио-
нарной фазе роста и получать нужные продукты обмена или
биомассу во времени столько, сколько требуется. Таким обра-
зом, максимальная производительность в хемостатной куль-
туре всегда выше, чем максимальная производительность в пе-
риодической культуре.
До 50-х гг. для культивирования микроорганизмов с целью
их всестороннего изучения служила простая периодическая
культура. Только с переходом к методу хемостатного культи-
вирования обнаружился недостаток периодической культуры,

76
которая не дает полного представления обо всех изменениях,
происходящих в клетке, и о влиянии внешних факторов на про-
текающие в ней процессы.
Развитие хемостатного культивирования открыло возмож-
ность управлять процессом, контролируя рост и поведение
микроорганизмов, а при необходимости вмешиваться в этот
процесс, изменяя скорость роста до задаваемых пределов пу-
тем воздействия на такую культуру внешними факторами. В
настоящее время интерес к непрерывному культивированию
растет как в нашей стране, так и за рубежом. Несмотря на пре-
имущества хемостатных культур, в биологической промыш-
ленности при производстве вакцин они не получили ещё доста-
точного применения по следующим причинам:
– технические трудности, в первую очередь, связанные с
созданием асептических условий;
– не во всех случаях непрерывный процесс предпочтитель-
нее периодического, поскольку при низкой удельной скорости
роста биомассы периодический процесс по эффективности не
уступает непрерывному и более выгоден, так как его проще
осуществить;
– интенсивный биосинтез многих продуктов метаболизма
происходит при медленном росте биомассы, поэтому в перио-
дических процессах концентрация целевого продукта в культу-
ральной жидкости обычно выше, чем в непрерывных, что су-
щественно повышает эффективность стадий выделения и
очистки продукта. Это свидетельствует о том, что периодиче-
ские процессы в будущем будут применяться.

Контрольные вопросы
1. Сформулируйте общее представление о культивирова-
нии микроорганизмов.
2. Каково отношение микроорганизмов к молекулярному
кислороду?
3. Перечислите способы культивирования аэробных мик-
роорганизмов.

77
 4. Перечислите способы культивирования анаэробных
микроорганизмов.
5. Приготовление питательных сред.
6. Стерилизация питательных сред.
7. Сырьевые источники для питательных сред.
8. Дифференциация питательных сред по целевому назна-
чению.
9. Промышленное культивирование микроорганизмов.
10. Периодическое и непрерывное культивирование мик-
роорганизмов.

78
 ГЛАВА 4. БИОТЕХНОЛОГИЯ В РАСТЕНИЕВОДСТВЕ

4.1 Вегетативное размножение растений методом

культур тканей
Фитобиотехнология – составная часть биотехнологии (от
греческих слов phyton – растение, bios – жизнь, teken – искус-
ство и logos – наука, слово). Это наука об использовании рас-
тительных объектов в технике и промышленном производстве.
Объекты фитобиотехнологии – клетки и ткани растений, а
также биологически активные молекулы растительного проис-
хождения (ферменты, нуклеиновые кислоты, стероиды и др.).
К фитобиотехнологическим относят процессы, которые ба-
зируются на клеточном уровне, в том числе, когда клетки уже
использовались в генно-инженерном эксперименте.
С помощью методов фитобиотехнологии можно выращи-
вать на питательных средах in vitro клетки и ткани высших рас-
тений, продуцирующих БАВ, в несвойственных им климатиче-
ских зонах.
Растительные клетки и ткани способны культивироваться
в форме неорганизованной клеточной массы – каллуса. Каллу-
сную ткань можно «заставить» формировать зародышеподоб-
ные структуры, почки, побеги, а на их основе – растения-реге-
неранты. Все это происходит благодаря тотипотентности рас-
тительных клеток (от лат. totus – все, целый, potentia – сила,
потенция), когда клетка обладает способностью воспроизво-
дить целый организм.
Если в качестве биообъекта применяют изолированный за-
родыш, меристему верхушечных или пазушных почек, то все
получаемые растения-регенеранты полностью соответствуют
исходному растению. При применении изолированных клеток
и протопластов искусственно создают новые формы растений,
пригодные для селекции.
Самые ранние работы по изолированию культур принадле-
жат М. Блоцишевскому (1876 г.), Л. Брауну и Дж. Мор-

79
рису (1892 г.), С. Боннэ, Я. Саксу (1893г.). В этих исследова-
ниях зародыши вычленялись из семени и выращивались в ис-
кусственных условиях. Удачные методы выращивания изоли-
рованных тканей были впервые разработаны в 1949 г.
Ф. Уайтом и Р. Готре. Дальнейшее развитие методов получе-
ния каллусной ткани получено в 1963 г. в лабораториях
Б. Скуга и Р. Г. Бутенко.
Микроразмножение in vitro осуществляют из зародыша
растения, верхушки основного побега, пазушных побегов, сус-
пензионной культуры клеток, промежуточного каллуса и неко-
торых других. Для этого соответствующие ткани отбирают,
стерилизуют и переносят на подходящую питательную среду.
Установлено, что меристемные ткани, сердцевина луко-
виц, клубнелуковиц и корневищ, которые надежно защищены
листьями и чешуйками и являются стерильными. Перед удале-
нием покрывающих структур их каждый раз протирают 70 %
этанолом. Если источниками тканей являются открытые ор-
ганы, то их стерилизуют до 40 минут ртуть- или хлорсодержа-
щими агентами (гипохлориты натрия и кальция, сулема) или
пероксидом водорода.
После стерилизации растительный биообъект трижды про-
мывают свежей стерильной дистиллированной водой.
Компоненты питательных сред делят на три группы:
1) источники органического углерода (чаще – сахароза);
2) неорганические соли (включая источники азота);
3) стимуляторы роста (некоторые витамины группы В и
растительные гормоны – цитокинины (усиливают или поддер-
живают рост каллусов и/или корнеобразование in vitro) и аук-
сины (стимулируют образование почек).
Питательные среды могут быть плотными и жидкими.
Например, для микрокультуры ананасов предпочтительнее
жидкие среды.
В целях предотвращения возможного бактериального и
грибного загрязнения в питательные среды добавляют анти-
биотики (нистатин, цефалоспорин, левомицетин, гентамицин

80
сульфат, канамицин моносульфат, рифампицин и др.).
С помощью метода культур тканей повысили коэффициент
размножения садовых древесных растений (яблони) и травяни-
стых декоративных растений (ирис, нарцисс, петуния, фиалка
и др.). Доступными для производства стали клетки барбариса –
продуцента спазмолитика ятроризина, табака – продуцента
убихинона-10. Весьма перспективны каллусные культуры дре-
весных растений.
Перед высадкой проростков в грунт стимулируют корнеоб-
разование с помощью инолилмасляной кислоты.

4.2 Фитогормоны и синтетические регуляторы роста

и развития растений

Фитогормоны – это вещества, синтезируемые растениями

и регулирующие рост и органогенез растений. Открытие фито-
гормонов позволило после изучения их синтеза, транспорта и
функций разработать технологию их использования в целях ре-
гуляции развития растений, а также синтезировать аналоги.
Механизм действия фитогормонов заключается в образо-
вании ими активного комплекса с белками-мишенями. Воз-
можно два пути реализации фитогормональной активности: пу-
тем воздействия на уровне регуляции экспрессии генов, что
связано с синтезом новых белков, либо путем изменения актив-
ности ферментов. В первом случае проявление действия фито-
гормонов задерживается на период от десятков минут до не-
скольких часов, необходимых для изменения генетической
программы, во втором случае действие проявляется через не-
сколько минут.
Насчитывают восемь основных групп фитогормонов:
– ауксины вызывают рост клеток, их дедифференцировку,
изменение положения различных органов растения (тро-
пизмы). Апикальное доминирование также связано с аттраги-
рующими свойствами этого фитогормона;

81
 – цитокинины активируют клеточное деление, снимают
апикальное доминирование, задерживают старение листьев,
регулируют транспирацию, повышают устойчивость к небла-
гоприятным факторам окружающей среды – повреждающим
температурам, засоленности почвы, засухе;
– гиббереллины стимулируют ростовые процессы путем
усиления синтеза материала клеточной стенки растений и об-
ладают видовой специфичностью. Ускоряя рост стебля, эти фи-
тогормоны не влияют на рост листьев и угнетают развитие кор-
ней. Большую роль играют гиббереллины в процессе перехода
к формированию регенеративных органов и зацветанию, а у не-
которых розеточных растений даже в условиях неблагоприят-
ного светового дня;
– этилен – единственный известный газообразный фито-
гормон, ускоряющий созревание плодов и вызывающий их
опадание. Он обладает, как и другие стимуляторы, широким
спектром действия, включающим и антистрессовое;
– абсцизовая кислота (АБК) – фитогормон с мощным инги-
бирующим действием, проявляющимся в распаде нуклеиновых
кислот, белков, хлорофилла. Накопление АБК в органах семян,
почек и клубней переводит их в состояние глубокого покоя;
– брассиностероиды наряду со свойствами других фито-
гормонов обладают и специфичным – они регулируют рост се-
мяпочки и образование семян. Мощное образование стрессо-
вых белков, вызываемое этим фитогормоном, повышает устой-
чивость растений к стрессам и грибным заболеваниям;
– жасминовая кислота (ЖК) увеличивает уровень абсцизо-
вой кислоты, управляет активностью некоторых ферментов
клетки и ее действие близко к действию АБК;
– салициловая кислота блокирует синтез этилена, индуци-
рует зацветание короткодневных растений в условиях длин-
ного дня;
– олигосахариды, образующиеся при частичном гидролизе
клеточных стенок растений и грибов, повышают устойчивость
к вредоносным организмам;

82
 – ингибитор цветения BEHD представляет собой молекулу
липида с 18-ю углеродными атомами и несколькими ненасы-
щенными связями, синтезируется у растений в условиях неин-
дукционного фотопериода и играет значительную роль в пере-
ходе растений к формированию генеративных органов.
Фиторегуляторы используют в пищевой, фармацевтиче-
ской и микробиологической промышленности. Гибберелли-
нами обрабатывают прорастающее зерно ячменя для повыше-
ния активности α-амилазы при получении ячменного солода.
При получении ряда лекарств путем культивирования расти-
тельных клеток в ферментерах требуется введение на опреде-
ленных этапах фитогормонов для оптимизации процесса син-
теза продукта и повышения его выхода.
Синтетические регуляторы роста и развития растений –
биологически активные молекулы, влияющие на растение и не
являющиеся в используемых концентрациях токсинами либо
удобрениями. Они влияют на какой-либо компонент фитогор-
мональной системы, тем самым вызывая определенный физио-
логический эффект.
Как целое растение, так и его отдельные части могут вхо-
дить в состояние покоя. Покой может быть либо вынужден-
ным, либо физиологическим. В состояние вынужденного покоя
переходят растения, переживающие неблагоприятные условия
окружающей среды. Состояние покоя семян физиологически
обусловлено необходимостью переждать зимний период и, в
зависимости от типа растений, дать генерацию новому побегу
не только через год, но и через несколько лет.
Основной причиной плохой всхожести семян являются
естественные ингибиторы, присутствующие в семени. Другая
причина – недостаток стимуляторов, прежде всего гибберелли-
нов, активирующих действие протеаз, и цитокининов, стиму-
лирующих процессы клеточного деления. Поэтому фиторегу-
ляторы, повышающие уровень стимуляции или снижающие
уровень ингибиторов, будут ускорять прорастание семян, и
наоборот.

83
 Взаимодействие фитогормонов
Регуляторный эффект на рост и развитие растений дости-
гается двумя путями: 1) изменение дозы гормона; 2) взаимо-
действие фитогормонов. В зависимости от концентрации гор-
мона его действие на один и тот же процесс может изменяться
от стимуляции до ингибирования. Кроме того, изменение кон-
центрации может привести и к изменению характера действия
гормона и физиологического ответа.
Так, в культуре in vitro ауксины при оптимальных концен-
трациях способствуют корнеобразованию, а при высоких - вы-
зывают каллусогенез.
Важным фактором гормональной регуляции является вза-
имодействие фитогормонов, обеспечивающее единство гормо-
нальной системы растений. Действие фитогормонов может
проявляться последовательно (каскадно), когда один фитогор-
мон индуцирует действие другого. К примеру, брассиностеро-
иды стимулируют синтез ауксинов и цитокининов, а ауксины
способствуют синтезу этилена .
Взаимодействие гормонов растений может наблюдаться в
двух формах: синергизм и антагонизм. Синергическое дей-
ствие связано с взаимным усилением действия гормонов на ка-
кой-либо процесс. Так, например, регенерация побегов из кал-
луса будет активизироваться под действием цитокининов в
присутствии ауксинов.
Антагонизм действия гормонов связан с взаимодействием
стимуляторов и ингибиторов. Такое взаимодействие является
универсальным механизмом регуляции скорости протекания
физиологических процессов и обеспечивает приспособление
организма к условиям среды ( таблица 3).
Все процессы проходящие в онтогенезе, регулируются гор-
монально. Каждый из этапов онтогенеза имеет свою гормо-
нальную специфику. Обычно развитие высших растений под-
разделяют на четыре этапа. 1) эмбриональный – развитие заро-
дыша от образования зиготы до созревания семени; 2)ювениль-

84
ный – этап от прорастания семян до формирования вегетатив-
ных органов; 3) этап зрелости и размножения - этап готовности
к зацветанию и образованию органов вегетативного размноже-
ния, цветения, формирования плодов и семян; 4) этап старости
и отмирания – период от полного прекращения плодоношения
до естественной смерти организма.

Таблица 3 – Взаимодействие фитогормонов (по В.И. Кефели, 1984

с дополнениями)

Процесс* Рост семядолей Апикальное до- Зеленение

Стимулятор/ ЦТК/ минирование листа
Ингибитор АБК ИУК/ ЦТК/
ЦТК АБК
Растяжение кле- Ризогенез Рост корня Изгиб корня
ток Ауксины/ ИУК/ ИУК/
ИУК / Фенольный ин- АБК АБК
Фенольный ин- гибитор
гибитор
Рост стеля Опадение Старение Синтез РНК,
Гиббереллин/ Этилен/ Этилен, АБК/ белка
АБК Ауксины Ауксин, ГК,цито-
Цитоки-
кинины нины/
АБК
Замыкание Регенерация Регенерация кор- Сдвиг пола в
устьиц побегов in vitro ней мужскую
АБК/ Цитокинины/ in vitro сторону
Цитокинины Ауксины Ауксины/ Гибберел-
Цитокинины лины/
Этилен, Ци-
токинины
* В числителе – фактор, стимулирующий процесс, в знаменателе – по-
давляющий процесс.

На эмбриональном этапе первые фазы развития зиготы

идут под действием брассиностероидов, цитокининов и аукси-
нов, а при созревании семени их содержание уменьшается и
увеличивается содержание АБК.

85
 На ювенильном этапе снова усиливается синтез ауксинов,
цитокининов и гиббереллина.
На этапе зрелости и размножения важную роль играют гиб-
береллины, которые обусловливают развитие цветоноса. Раз-
витие генеративных органов материнского организма совпа-
дает с ювениальным этапом дочернего (следующее поколение).
На этапе старости и отмирания уменьшается содержание
ауксинов и цитокининов и накапливаются АБК и этилен.
Присущая растениям полярность проявляется и на гормо-
нальном уровне. Можно выделить два основных доминирую-
щих центра в растении: верхушки побегов (ИУК) и кончики
корня (цитокинины). Доминирующие центры во взаимодей-
ствии с листьями, вырабатывающими гиббереллины и АБК
обеспечивают баланс развития надземной части и корневой си-
стемы и служат важнейшим эндогенным механизмом роста и
морфогенеза растения. Гормональная система на каждом этапе
развития характеризуется определенным статусом. Гормональ-
ный статус растения - состояние фитогормональной системы в
онтогенезе растений, уровни фитогормонов и соотношение
между ними в процессах образования, передвижения, исполь-
зования и инактивации в ответ на внешние воздействия. Гор-
мональный статус зависит от биологии растения, этапа онтоге-
неза, условий внешней среды. Он может быть изменен воздей-
ствием экзогенных факторов (технологические приемы возде-
лывания растений). Наиболее радикальный способ изменения
гормонального статуса растений и регуляции онтогенеза – воз-
действие экзогенными регуляторами роста.
Особую роль гормональный статус растения имеет в куль-
туре in vitro. К примеру, гормональный статус исходного рас-
тения и отдельных его органов определяет успех регенерации
из эксплантов, взятых с растения. Процесс клонального микро-
размножения на всех его этапах – пример активной регуляции
гормонального статуса растения для получения посадочного
материала.

86
 В настоящее время создано большое количество регулято-
ров роста различной природы, используемых в биотехнологии
и растениеводстве.
Фитогормоны и регуляторы роста в растениеводстве
Применение регуляторов роста является одним из основ-
ных элементов интенсивных технологий. Изменение гормо-
нального статуса растений под воздействием экзогенных регу-
ляторов роста обеспечивает повышение активности метаболи-
ческих процессов в растении, устойчивости к биотическим и
абиотическим стрессам, повышает урожайность и качество
продукции. Регуляторы роста весьма эффективны не только
для полевых, но также плодовых, ягодных, овощных и декора-
тивных культур. Применение регуляторов роста определяется
этапом онтогенеза, средовыми условиями и задачами, решае-
мыми с помощью фиторегуляторов (корнеобразования, выве-
дение семян из состояния покоя, регуляция развития вегетатив-
ных генеративных органов, регуляция плодообразования и со-
зревания, регуляция устойчивости растения, качества продук-
ции и другие).
Корнеобразование. Образование корней у черенков плодо-
вых и ягодных растений индуцируется экзогенными аукси-
нами. К числу часто употребляемых препаратов относится ге-
тероауксин путем замачивания черенков перед высадкой в
грунт в 0,005 – 0,02 % растворе в течение 10–24 ч. Высокой эф-
фективностью индукции корнеобразования обладают также
(ИМК и НУК) кислоты. Способностью ускорения развития
корневой системы у роз и тюльпанов обладает эпибрассинолид
(эпин), стимулирует корнеобразование озимой ржи и пшеницы
хитодекстрин.
Покой и прорастание. Состояние покоя наблюдается у се-
мян, почек или отдельных органов растения, во время которого
у них прекращается видимый рост, но происходят скрытые
процессы структурообразования. Различают глубокий покой,

87
вызванный внутренними причинами, и вынужденный, обу-
словленный неблагоприятными факторами внешней среды.
Способность организма или его органов переходить в состоя-
ние покоя сформировалась в процессе эволюции как способ пе-
ренесения неблагоприятных средовых условий (пониженной
или повышенной температуры, недостатка влаги и др.). Покой
семян может быть связан с несколькими причинами: недораз-
витие зародыша, его физиологическая незрелость, механиче-
ская устойчивость семян кожуры, непроницаемость семенных
покровов, присутствие ингибиторов прорастания (АБК, жасми-
новая кислота и другие).
Эндогенная стимуляция прорастания семян и покоящихся
органов связана с действием гиббереллинов, цитокининов,
брассиностероидов. В списке разрешенных препаратов для по-
вышения энергии прорастания рекомендованы бетастимулин
для сахарной свеклы, ивин – на моркови, капусте, томатах, пер-
цах, баклажанах, огурцах; мальтамин – на картофеле; оксидат
торфа – на озимой ржи, тритикале, ячмене и картофеле; фено-
мелан – на картофеле; хитодекстрин – на озимой ржи и пше-
нице, огурцах, томатах и моркови; эмистим С – на пшенице
озимой, ячмене яровом , огурцах, томатах, перцах, луке; эпин –
на капусте, томатах, огурцах и перце. Ряд регуляторов оказы-
вает комплексное действие на растение, стимулируя прораста-
ние семян, устойчивость к болезням, повышение урожайности
и качества.
Возможна и регуляция перехода растения или органа в со-
стояние покоя, что важно перед закладкой плодов и семян на
хранение.
Регуляция роста стебля. Рост стебля стимулируется содер-
жанием эндогенных гиббереллинов и ингибируется этиленом и
абсцизовой кислотой. Характер роста стебля, ветвление побе-
гов связаны с балансом ауксинов, вызывающих эффект апи-
кального доминирования и цитокининов, снимающих этот эф-
фект. Ряд природных и синтетических регуляторов роста ока-

88
зывают стимулирующий эффект на рост стебля, однако необ-
ходимость в специальной регуляции этого процесса возникает
при вероятности избыточного роста и полегания побегов.
При интенсивных технологиях возделывания зерновых куль-
тур, основанных на высоких дозах удобрений, во влажные годы
может наблюдаться полегание, снижающее урожай на 15–30 %.
Кроме того, затрудняется уборка и снижается качество продук-
ции. В таких условиях для получения высокого и качествен-
ного урожая обязательным приемом является применение ре-
тартантов, повышающее урожай на 3–10 ц/га. Особенно отзыв-
чивы на применение ретардантов пшеница и рожь.
В списке ретандантов, разрешенных к применению в рес-
публике, имеются следующие препараты: хлормекватхлорид
(назв. антивылегач) для яровой и озимой пшеницы, этефон
(назв. серон) для озимой пшеницы и ярового ячменя; хлормек-
ватхлорид 460 БАСФ для озимой пшеницы, озимой ржи, три-
тикале и ярового ячменя; терпал для ярового ячменя.
Регуляция минерального питания и транспорта веществ.
Транспорт веществ в растении определяется уровнем эндоген-
ных ауксинов, гиббереллинов и цитокининов, фитогормоны
обладают способностью к аттракции, то есть притягиванию ас-
симилятов и других метаболитов со стороны потребляющих
тканей и органов. Кроме того, фитогормоны регулируют про-
ницаемость мембран.
Регуляторы роста растений могут усиливать поступление
элементов питания в корневую систему и при их применении
могут быть снижены дозы минеральных удобрений. Установ-
лено, что более сильное действие регуляторов роста проявля-
ется при средних дозах удобрений. Это дает возможность без
ущерба для урожая снижать дозы минеральных удобрений на
25 %, что важно при создании энергосберегающих и природо-
охранных технологий в растениеводстве.
Регуляция роста и развития генеративных органов
Эндогенная регуляция роста и развития генеративных ор-

89
ганов происходит под действием брассиностероидов, гиббе-
реллинов и цитокининов, а в переходе семян и плодов в состо-
яние покоя участвуют абсцизовая кислота и этилен. Для регу-
лирования процесса опыления и оплодотворения в семеновод-
стве гетерозисных гибридов (пшеница и др.) могут быть ис-
пользованы гаметоциды (препараты, вызывающие мужскую
стерильность). Для этих целей используют этефон, гибберелло-
вую кислоту, ТИБК. Для повышения завязываемости плодов в
период цветения винограда, томата возможно использование
гиббереллина и его соединений (гибберсиб). В этом случае ча-
сто образуются бессемянные плоды. У плодовых культур в от-
дельные годы наблюдается избыточное завязывание плодов,
что приводит к уменьшению их размера, ухудшению качества,
перегрузке дерева и усилению периодичности плодоношения.
Для регуляции опадания плодов яблони во время или после
цветения может использоваться этефон, КАНУ (калиевая соль
нафтилуксусной кислоты).
Среди разрешенных к применению препаратов способно-
стью к регуляции развития генеративных органов обладают
следующие препараты: квартазин повышает семенную продук-
тивность кормового люпина и стимулирует образование пло-
довых почек яблони; люцис повышает семенную продуктив-
ность люцерны; эпин увеличивает количество завязей, предот-
вращает их опадение, ускоряет созревание плодов у томатов.
Регуляция устойчивости растения к абиотическим и био-
тическим стрессам
Устойчивость растения к абиотическим и биотическим
стрессам определяется физиологическим состоянием орга-
низма, в т. ч. его гормональным статусом. Известно, что стрес-
соустойчивость растения повышается под действием брассино-
стероидов, цитокининов и абсцизовой кислоты. Стрессовое
воздействие вызывает неспецифическое изменение в метабо-
лизме растений, при этом гормональный статус изменяется в
сторону усиления ингибиторной и ослабления стимуляторной
активности.

90
 На клеточном и органном уровнях растение реагирует на
стресс физиологическими реакциями (предотвращение потери
воды путем закрывания устьиц, выработкой защитных ве-
ществ: стрессовые белки, углеводы, пролин, фитонциды, фи-
тоалексины); на организменном уровне добавляются: а) меха-
низмы, способствующие формированию такого количества
плодоэлементов, которые вызревают при неблагоприятных
условиях, в) перестройка гормональной системы, ведущая к
торможению роста и переходу растения в состояние покоя. При
стрессах резко возрастает выработка этилена и АБК и снижа-
ется содержание ауксинов, цитокининов и гиббереллинов.
Повысить устойчивость растения к стрессу можно, изме-
нив гормональный статус растения в результате воздействия
экзогенными регуляторами роста. Среди разрешенных препа-
ратов такой способностью обладает ряд соединений: гидрогу-
мат повышает устойчивость к болезням зерновых культур, кар-
тофеля, гороха и бобов; гисинар и инкор повышают засухо-
устойчивость зерновых; оксигумат повышает устойчивость
зерновых, картофеля, огурцов, томатов к болезням; иммуноци-
тофит повышает иммунитет у озимой пшеницы и ярового яч-
меня, хитодекстрин – у ярового ячменя. Эпин повышает устой-
чивость к болезням и абиотическим стрессам у картофеля, яч-
меня, устойчивость к болезням у декоративных растений (гла-
диолус, тюльпан).
Регуляция качества продукции
Фиторегуляторы изменяют метаболизм растений, что в ко-
нечном итоге сказывается на накоплении биологически полез-
ных веществ (углеводы, белки, жиры и др.), а также поллютан-
тов, загрязняющих агроландшафт и продукцию (радио-
нуклиды, тяжелые металлы, нитраты, пестициды и другие).
Повышение качества продукции обеспечивается рядом
разрешенных препаратов (агростимулин, бетастимулин, квар-
тазин, мальтамин, сейбит, феномелан, эмистим, эпин). Среди
них особый интерес представляет эпин, снижающий содержа-
ние радионуклидов и тяжелых металлов у овощных растений.

91
 Таким образом, регуляция гормонального статуса в онто-
генезе путем использования экзогенных регуляторов роста яв-
ляется эффективным средством повышения продуктивности и
устойчивости сельскохозяйственных растений, а также каче-
ства продукции.

4.3 Клеточные технологии в растениеводстве

Многие полезные растения произрастают в определенных

климатических зонах и их развитие имеет сезонный характер.
Необходимость в лекарственных препаратах, являющихся вто-
ричными метаболитами растений (алкалоиды, глюкозиды, сте-
роиды и др.) требует источников сырья. Проблема может быть
успешно решена, если выращивать не растения, а их клетки.
Клетки и ткани растений, выращиваемые в искусственных пи-
тательных средах, называют культурой изолированных тка-
ней. Для работы необходимы стерильные растительные ткани,
питательные среды и инструменты. Поэтому все манипуляции
с клеточными культурами проводят в стерильных боксах либо
в ламинарбоксах.
Питательные среды для культивирования изолированных
клеток и тканей включают в себя набор необходимых расте-
ниям химических элементов, а также витаминов, углеводы, фи-
тогормоны и др. Наиболее часто применяют среду Мурасиге и
Скуга (таблица 4).
Фитогормоны необходимы для управления процессом де-
дифференцировки клеток и индукции клеточных делений. На
безгормональной среде живут опухолевые растительные ткани.
В качестве ауксинов используют индолилуксусную кислоту
(ИУК), роль цитокининов играет кинетин.
Культура изолированных тканей обычно бывает представ-
лена каллусными, реже – опухолевыми тканями. Каллусная
культура является колонией дедифферинцированных клеток.
Каллус в естественных условиях появляется на растении при

92
повреждении, представляет собой мозолеподобное образова-
ние, затягивающее рану. Каллусная ткань бывает белого или
желтого цвета и для своего развития не требует света, так как
лишена хлоропластов. Наиболее легко ее можно получить из
апикальной меристемы растений, не утратившей в отличие от
других клеток способности к делению.

Таблица 4 – Компоненты питательной среды, мг/л

Компонент питательной среды Концентрация, мг/л
NH4NO3 1650,0
KNO3 1900,0
CaCl2×2H2O 440,0
MgSO4×7H2O 370,0
KH2PO4 170,0
MnSO4×4H2O 22,3
CoCl2×6H2O 0,025
ZnSO4×7H2O 8,6
CuSO4×5H2O 0,025
Na2MoO4×2H2O 0,25
KI 0,83
Fe2SO4×7H2O 27,8
Na2-ЭДТА×2H2O 37,3
Тиамин-HCl 0,1
Пиродоксин-HCl 0,5
Никотиновая кислота 0,5
Мезоинозит 100,0
Глицин 0,2
Сахароза 30000,0

Обязательным условием дедифференцировки раститель-

ной клетки и превращения ее в каллусную является наличие в
питательной среде двух типов фитогормонов: ауксинов и цито-
кининов. Ауксины вызывают процесс дедиффенцировки
клетки, готовят ее к делению, а цитокинины стимулируют де-
ление. Каллусная ткань имеет свой онтогенез (развитие). Он
включает деление, растяжение и дефференцировку, как и у нор-
мальных клеток меристемы. Затем наступает старение и отми-
рание клетки. Поэтому первичный каллус необходимо через 4–

93
6 нед перенести на свежую питательную среду. Эту операцию
называют пассированием; при ее систематическом повторении
способность клеток к делению можно поддерживать в течении
десятков лет.
Каллусные клетки сохраняют многие черты, присущие
нормальным клеткам, но вместе с тем приобретают некоторые
отличительные свойства: потребляют меньше кислорода, гете-
рогенны по возрасту, у них более длительный жизненный цикл
и другие.
Каллусные клетки оказываются генетически неоднород-
ными, что выражается, прежде всего, в различной плоидности.
В каллусной ткани наряду с клетками, имеющими нормальной
диплоидный набор хромосом, встречаются и такие, которые
имеют 3–5 и более хромосомных наборов. Число полиплоид-
ных клеток и их плоидность растет с возрастом культуры.
Наряду с этим культивирование вызывает хромосомные абер-
рации, по морфологическим и физико-биологическим призна-
кам можно обнаружить и иные мутации. Генетическое разно-
образие каллусных клеток и высокая частота мутаций позво-
ляют использовать их для клеточной селекции на устойчивость
к неблагоприятным факторам окружающей среды, к фитопато-
генам и на повышенную продуктивность.
Из каллуса либо фрагмента листа получают клеточную
суспензию, которую можно культивировать в ферментере в
жидкой питательной среде. В биотехнологии клеточные сус-
пензии используют для получения вторичных метаболитов,
многие из которых являются ценными лекарственными препа-
ратами. Для этого каллус или лист обрабатывают пектиназой
для разделения клеток. Обязательным условием культивирова-
ния суспензии является постоянное перемешивание питатель-
ной среды с целью предотвращения образования каллусной
ткани.
Из каллусных клеток можно регенерировать полноценное
растение либо его части: корень, побег, лист, цветок. Путь, по

94
которому произойдет развитие органа, зависит от гормональ-
ного баланса питательной среды. Преобладание цитокинина
над ауксином часто приводит образованию стебля, в противо-
положном случае образуется корень. Способность отдельной
клетки полностью реализовывать свою генетическую про-
грамму и давать начало целому организму называется тотипо-
тентностью. Процессы образования органов в каллусных клет-
ках протекают асинхронно и продолжительно, что приводит к
одновременному появлению нескольких очагов органогенеза
на одном каллусе.
Способность каллусных тканей к регенерации целого рас-
тения открыла перспективы в селекции новых сортов растений.
При ферментативном гидролизе пектина и целлюлозы рас-
тительных клеточных стенок удается получить протопласты,
т. е. растительные клетки, ограниченные только плазматиче-
ской мембраной. Из протопластов также можно получить кал-
лус и потомство растений. Особенность протопластов – их спо-
собность в определенных условиях сливаться друг с другом,
образуя единую клетку с двумя ядрами. Это свойство исполь-
зуют для получения гибридов между растениями, относящи-
мися к разным видам, родам и семействам. Первый гибрид был
получен в 1978 г между картофелем и томатом. Полученное
растение было названо поматом и не имело коммерческой цен-
ности, однако показало перспективность метода получения ги-
бридов, которые не удается получить путем опыления. Этот ме-
тод позволяет вносить в растение гены, которые традицион-
ными способами внедрить невозможно.
В 1964 г. индийские исследователи Гуха и Махешвари при
культивировании в искусственной среде пыльников получили
сначала эмбрионы, а затем и гаплоидные растения. В последу-
ющем культура пыльцевых зерен стала основным источником
гаплоидных растений у декоративных, овощных, зерновых и
кормовых видов. Гаплоидные растения удобны тем, что содер-
жат только по одной копии гена, поэтому рецессивные мутации

95
не экранируются нормальными генами. Эти растения бес-
плодны, но с помощью колхицина удается удвоить набор хро-
мосом и получить плодовитые диплоидные гомозиготные рас-
тения.

4.4 Клональное размножение растений

Растения в природе размножаются семенами и вегета-
тивно. При семенном размножении посадочный материал гене-
тически неоднороден, а во многих случаях семена обладают
плохой всхожестью, либо она полностью отсутствует. Вегета-
тивное размножение позволяет получить генетически однород-
ный посадочный материал (клон), однако не все виды пород в
ювенильный период могут размножаться достаточно эффек-
тивно, возможно накопление инфекции, к тому же способ тру-
доемок. Методом черенкования удается размножать многие
древесные породы старше 10–15 лет. Способность раститель-
ных клеток реализовывать присущую им тотипотентность поз-
волило разработать принципиально новый метод вегетатив-
ного размножения – клональное микроразмножение с исполь-
зованием каллуса в качестве промежуточного этапа в этом про-
цессе. Основные преимущества этого метода состоят в следу-
ющем:
– получается генетически однородный материал;
– безвирусное потомство;
– высокий коэффициент размножения (104–106);
– сокращение продолжительности селекционного периода;
– сокращение перехода растений от ювенильной к репро-
дуктивной фазе развития;
– размножение растений, которые плохо размножаются
иными методами;
– независимость проведения работ от времени года, сокра-
щение площадей выращивания посадочного материала;
– возможность автоматизации процесса.

96
 Первые успехи в клональном микроразмножении были до-
стигнуты в конце 50-х годов Ж. Морелем, получившим из апи-
кальной меристемы растения – регенеранты орхидей. В Запад-
ной Европе орхидеи, выращенные методом клонального мик-
роразмножения, были первыми растениями, полученными био-
технологическими методами в коммерческих целях.
Первые работы по культуре тканей древесных растений,
проведенные Р. Готре в середине 20-х гг. XX в. установили спо-
собность камбиальных тканей вяза и сосны к каллусогенезу. В
40-х гг. удалось проследить образование адвентивных почек у
осины. Первые растения–регенеранты осины были доведены
до почвенной культуры только к середине 60-х гг. Матесом.
Значительно труднее было получить культуру тканей хвойных
пород, что объясняется ингибирующим действием продуктов
окисления фенолов, вырбатываемых этими растениями на рост
и деление клеток. Однако со временем и эти проблемы были
решены и число видов растений, размножаемых in vitro, посто-
янно растет, и это число – пихта, лиственница, кипарис, туя,
каштан, дуб, масличная пальма и др.
Существует много методов клонального микроразмноже-
ния. Основным же является активация развития уже существу-
ющих меристем. Метод основывается на снятии апикального
доминирования, что достигается двумя путями:
– удалением верхушечной меристемы стебля споследую-
щим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной
среде;
– добавлением в питательную среду веществ цитокинино-
вого типа действия, индуцирующих развития многочисленных
пазушных побегов.
Второй метод – это индукция образования адвентивных по-
чек непосредственно тканями экспланта, что возможно почти
для всех органов и тканей растения. Для этого питательная
среда содержит один цитокинин или в сочетании с ауксином в
соотношении 10 : 1 или 100 : 1. Нарциссы, лилии, гиацинты

97
были размножены из луковичных чешуй, некоторые виды ка-
пусты – из сегментов гипокотиля, листьев, некоторые древес-
ные растения – из изолированных зародышей.
Третий метод основан на дифференциации из соматиче-
ских клеток зародышеподобных структур, напоминающих зи-
готические зародыши и получивший название соматического
эмбриогенеза. Соматические зародыши (эмбриоиды) развива-
ются асексуально вне зародышевого мешка, и их формирова-
ние происходит в два этапа. На первом этапе клетки дифферен-
цируются за счет добавления ауксинов, концентрацию которых
затем уменьшают. На втором этапе использование техники
капсулирования позволяет получать из эмбриоидов искус-
ственные семена, в капсульную оболочку которых добавляют
необходимые питательные вещества, азотфиксирующие мик-
роорганизмы и другие компоненты, способствующие эффек-
тивному развитию и росту растений.
Четвертый метод клонального микроразмножения – диф-
ференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной
каллусной ткани. Этот метод экономически выгоден, а в ряде
случаев является единственно возможным методом размноже-
ния растений в культуре. Для селекционеров он представляет
большой интерес из-за высокой генетической вариабельности
каллусной ткани, выражающейся в увеличении плоидности
клеток, структурных перестроек хромосом и накоплении ген-
ных мутаций. Однако эта особенность метода ограничивает его
возможности при клональном микроразмножении.
На каждом этапе культивирования используют питатель-
ные среды определенного состава. Для выращивания необхо-
дима стерильная культура, которую можно получить двумя
способами: либо берут уже готовые стерильные пробирочные
растения, либо стерилизуют исходный растительный материал.
Стерилизацию проводят химическим путем, обрабатывая мате-
риал ртуть– или хлорсодержащими растворами (0,1–0,2%–я су-
лема, 10–15%-й хлорамин и другие) в течении 5–10 мин для
легкоповреждаемых тканей и 10–20 мин – для более прочных.

98
После трехкратной промывки в стерильной дистиллированной
воде культуру переносят на твердую питательную среду, со-
держащую минеральные соли по рецепту Мурасиге и Скуга,
различные биологически активные вещества и стимуляторы
роста в сочетаниях, подобранных для конкретного объекта.
При размножении древесных растений в питательную среду
вводят антибиотики в концентрации 100–200 мг/мл для подав-
ления накапливаемой этими культурами внутренней инфекции,
которую трудно убить стерилизующим раствором. При инги-
бировании роста первичного экспланта выделяемыми им же
токсическими веществами в питательную среду добавляют ан-
тиоксиданты аскорбиновую кислоту (1 мг/л), дитиотриэтол (1–
3 мг/л) и другие, а также активированный уголь в качестве ад-
сорбента.
На первом этапе, длительность которого составляет 1–2
мес., происходит рост меристематических тканей и формиро-
вание первичных побегов.
Второй этап позволяет получить максимальное количество
мериклонов, для чего исходный эксплант разделяют и рассажи-
вают в отдельные пробирки на ту же питательную среду, кото-
рую использовали на первом этапе. При необходимости эту
процедуру повторяют для увеличения численности растений.
На третьем этапе меняют состав питательной среды, стимули-
руя корнеобразование. Четвертый этап – пересадка растений в
грунт и адаптация к условиям окружающей среды – наиболее
трудоемкий и ответственный. Растения вынимают из питатель-
ного агара, корни отмывают от остатков питательной среды и
высаживают в стерильный почвенный субстрат. Растения по-
мещают в теплицу, где создают повышенную влажность, регу-
лируют температуру и световой режим. При размножении ви-
нограда укоренившиеся растения оставляют в пробирках, но
открывают пробку и оставляют в таком состоянии на две не-
дели. После адаптации пересаживают на стерильную почву

99
вместе с агаром. Микоризация растений на третьем либо чет-
вертом этапах играет положительную роль в минеральном пи-
тании и защите от фитопатогенов.
Использование меристемной ткани апекса и пазушных по-
чек позволяет получать безвирусный посадочный материал при
клональном микроразмножении. Для предотвращения попада-
ния вирусов в клон исходные растения подвергают термотера-
пии в специальных термокамерах. В течение первой недели
температуру повышают на 2 °С в сутки до 37 °С и выдержи-
вают растения в этих условиях в течение нескольких недель.
Применение термотерапии позволяет в некоторых случаях по-
лучить до 90 % растений-регенератов, свободных от вирусной
инфекции.
Для оптимизации условий клонального микроразмноже-
ния растений используют многофакторный анализ.

4.5 Поверхностное культивирование клеток растений

Осуществляют на полужидкой агаризованной среде, среде
с добавлением других желирующих полимеров, на дисках из
полиуретана, на мостиках из фильтровальной бумаги, полупо-
груженных в жидкую питательную среду. Можно также ис-
пользовать комочки ваты, пропитанные питательной средой,
которые сверху покрываются кусочком фильтровальной бу-
маги.
Для того, чтобы не произошло старения, утраты способно-
сти к делению и дальнейшему росту, а также отмирания каллу-
сных клеток, первичный каллус переносят на свежую питатель-
ную среду через 28–30 дней, то есть проводят пассирование
или субкультивирование каллусной ткани.
При пассировании ткани на среду, содержащую индукторы
органогенеза, клетки приступают к делению. Это приводит
либо к формированию почек и побегов (геммогенез), либо к ри-
зогенезу.

100
 4.6 Культивирование клеток растений
в глубинных условиях
Для глубинного культивирования растительных клеток
применимы способы, разработанные в микробиологии.
Различают два вида систем культивирования:
1) закрытая система культивирования – наиболее изу-
чена и распространена. Для нее характерен периодический ре-
жим выращивания. При этом клеточная масса помещается в
определенный объем среды. Система закрыта по всем парамет-
рам, кроме газов, до конца выращивания. Периодически пода-
ется свежая питательная среда, а старая удаляется в том же объ-
еме. Клетки остаются в системе в течение всего цикла выращи-
вания.
2) открытая (проточная) система культивирования – по-
ступает свежая питательная среда, при этом отбирается старая
питательная среда и часть урожая.
Первый крупномасштабный процесс по выращиванию
культур клеток растений (воробейника) был осуществлен в
начале 80-х гг. для получения вторичного метаболита – шико-
нина. Это натуральный ярко-красный краситель, обладающий
антисептическими свойствами. За один периодический про-
цесс получается около 5 кг конечного продукта, который
накапливается в клетках. На первой стадии клетки воробейника
выращивают 9 сут в биореакторе объемом 200 л на среде с по-
дачей стерильного воздуха. Затем культуру переносят в биоре-
актор меньшего размера со средой, которая стимулирует про-
дукцию шиконина. В третьем реакторе на 750 л ферментацию
проводят 2 нед. Клетки на первой стадии белые, на последней –
красные. Стоимость красителя в 1983 г. составляла
4000 долл./кг.
Суспензионные культуры используют для промышленного
получения вторичных метаболитов, которые применяют в ме-
дицине, парфюмерной промышленности, растениеводстве и
других отраслях. Это алкалоиды, терпеноиды, гликозиды, по-

101
лифенолы, полисахариды, эфирные масла, пигменты, антикан-
церогены, пептиды (ингибиторы фитовирусов). В настоящее
время в разных странах в биосинтетической промышленности
для получения экономически важных веществ используется
около ста видов растений (женьшень, беладонна, паслен доль-
чатый, дурман обыкновенный, ландыш майский, клещевина,
агава, мак снотворный и др.).

4.7 Иммобилизация растительных клеток

Иммобилизация клеток и тканей растений – это новый под-
ход, направленный на увеличение выхода вторичных метабо-
литов. В 1966 г. К. Мосбаху впервые удалось зафиксировать
клетки лишайника Umbilicaria pustulata в полиакриламидном
геле.
Методы иммобилизации клеток растений:
– иммобилизация клеток или субклеточных органелл в
инертном субстрате – при этом клетки обволакиваются цемен-
тирующей средой (альгинат, агар, коллаген, полиакриламид);
– адсорбция клеток на инертном субстрате – клетки прили-
пают к заряженным шарикам из альгината, полистирола, по-
лиакриламида;
– адсорбция клеток на инертном субстрате с помощью био-
логических макромолекул (например, лектин). Применяется
редко;
– ковалентное связывание с другим инертным носителем.
Применяется редко.
Иммобилизованные клетки имеют следующие преимуще-
ства перед каллусными и суспензионными культурами:
– они образуют биомассу гораздо медленнее, чем клетки,
растущие в жидких суспензионных культурах. Это способ-
ствует синтезу вторичных метаболитов;
– клетки растут в тесном физическом контакте друг с дру-
гом. Это благоприятно отражается и на химических контактах;
– выход вторичных метаболитов можно регулировать пу-
тем изменения химического состава окружающей среды;

102
 – удобство выделения вторичных метаболитов.
Существует два типа систем культивирования иммобили-
зованных клеток:
1) система культуры с плоской основой – клетки выращи-
ваются в горизонтально расположенном сосуде;
2) система колоночной культуры – клетки выращиваются в
вертикальном сосуде.
В обеих системах жидкая среда циркулирует вокруг физи-
чески неподвижных клеток.

4.8 Сохранение культур клеток растений

Криосохранение – это замораживание при сверхнизких
температурах, обычно – в жидком азоте, при температуре –
196 °C. Клетки для замораживания отбирают в середине экспо-
ненциальной фазы ростовой кривой.
Предварительно проводят культивирование в особых усло-
виях. В среду добавляют различные вещества, например: ман-
нит или сорбит – для уменьшения размера вакуолей; аминокис-
лота пролин – для связывания воды в клетке; диметилсульфок-
сид (ДМСО) – для увеличения проницаемости цитоплазмати-
ческой мембраны.
Кроме того, применяют искусственное закаливание к хо-
лоду. При этом клеточные культуры выдерживают несколько
суток при температуре 8…10 °C, а затем до 6 нед при 2…5 °C.
За час до замораживания в культуру вносят криопротек-
торы (сахароза, декстран, этиленгликоль, поливинилпирроли-
дон, диметилсульфоксид (ДМСО), глицерин). Они снижают
повреждающее действие физико-химических факторов путем
изменения проницаемости мембраны, а также точки замерза-
ния и оттаивания.
Охлаждение проводят в два этапа:
1) от плюс 20 до минус 35 °C со скоростью 0,5 °C в минуту,
выдерживают при этой температуре 15 мин;
2) погружение в жидкий азот (мгновенное охлаждение до
минус 196 °C).

103
 Замораживание производят в ампулах объемом 1 мл.
Размораживают ампулы на водяной бане с температурой
37…40 °С в течение 0,5–1 мин.
После размораживания клетки отмывают 3–10%-м раство-
ром сахарозы.
Далее клетки проверяют на жизнеспособность сначала с
помощью красителей, а затем по четкому возобновлению роста
на стандартных питательных средах для этой культуры.
Замедления роста можно добиться следующими мето-
дами: изменение газового состава и атмосферного давления
внутри культурального сосуда; изменение светового режима;
охлаждение до температуры прекращения активного роста;
применение гормональных (хлорхолинхлорид) и осмотиче-
ских (манит) ингибиторов и другие.
Например, для картофеля рекомендуется клубнеобразова-
ние в пробирках.

4.9 Использование методов генетической

инженерии в фитобиотехнологии
В генноинженерном эксперименте изолируют конкретный
ген, включают его в наследственный аппарат растительной
клетки и регенерируют растение с измененным наследствен-
ным признаком, которое способно приносить жизнеспособное
потомство.
Объединение геномов клеток разных особей осуществляют
благодаря:
– половой гибридизации – известна давно, реализуется в
природных и искусственных условиях, используется для выве-
дения новых сортов растений и для повышения их продуктив-
ности;
– соматической гибридизации – реализуется только в ис-
кусственных условиях. При этом соматические клетки предва-
рительно лишают клеточной стенки и трансформируют в про-
топласты. Они способны сохраняться и метаболизировать, а

104
также реконструировать клеточную стенку в подходящих усло-
виях. Они были впервые получены Дж. Клеркером в 1892 г. из
листьев водного растения – телореза.
Протопласты получают следующими методами:
– механические методы – 0,1%-м раствором сахарозы до-
биваются плазмолиза растительных тканей, затем разрезают
эпидермис и освобождают протопласты в окружающую пита-
тельную среду;
– биохимические (энзиматические) методы – при этом ис-
пользуют целлюлазы, пектиназы, гемицеллюлазы.
Протопласты используют для регенерации растения или
образования гетерокариотических гибридов. Относительно
легко регенерируют из протопластов картофель, люцерна, ма-
ниок, рапс, табак.
Первые трансгенные растения были получены в 1983 г. Это
растения табака со встроенными генами из микроорганизмов,
устойчивые к вирусной инфекции. Первые успешные полевые
испытания этих трансгенных растений были проведены в США
в 1986 г. Первые трансгенные продукты появились в продаже в
США в 1994 г. (томаты с замедленным созреванием, гербици-
дустойчивая соя), а через два года еще и кукуруза, картофель,
табак, рапс, кабачки, редис, хлопчатник. В настоящее время в
США генетически модифицированные растения составляют
около 50 % посевов кукурузы и сои и более 40 % посевов хлоп-
чатника.
Первоначально трансгенные растения содержали дополни-
тельные гены устойчивости (к болезням, гербицидам, вредите-
лям, порче при хранении, стрессам). В настоящее время разви-
вается «метаболическая инженерия». При этом ставится за-
дача: «научить» растение производить новые соединения, ис-
пользуемые в медицине, химическом производстве и других
областях.

105
 Контрольные вопросы
1. Что понимают под термином «фитобиотехнология»?
2. Что является объектами фитобиотехнологии?
3. Какие процессы относят к фитобиотехнологическим?
4. Что такое растения-регенеранты?
5. Охарактеризуете способ вегетативного размножения
растений методом культур тканей.
6. Охарактеризуйте способ поверхностного культивиро-
вания клеток растений.
7. Охарактеризуйте закрытую систему культивирования
растительных клеток в глубинных условиях.
8. Охарактеризуйте открытую (проточную) систему куль-
тивирования растительных клеток в глубинных условиях.
9. Когда было впервые осуществлено крупномасштабное
выращивание культур клеток растений?
10. В чем заключается принцип криосохранения?
11. Какие операции проводят перед криосохранением
культур клеток растений?
12. С какой целью в культуру клеток растений вносят
криопротекторы?
13. Какие вещества используют в качестве криопротекто-
ров?
14. Как проводят охлаждение культур клеток растений при
криосохранении?
15. Как проводят размораживание ампул с культурами
клеток растений после криосохранения?
16. В чем заключается принцип генно-инженерного экспе-
римента при создании растений с новыми признаками?

106
 ГЛАВА 5. БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ
КОНСЕРВИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ

5.1 Консерванты простого действия

Простое действие консервантов обусловлено тем, что пре-
параты только консервируют корма и не изменяют присущие
им свойства. К ним относятся летучие жирные кислоты
(ЛЖК) – уксусная, пропионовая, муравьиная. Они являются
естественными метаболитами в организме животных и обра-
зуются в преджелудках крупного рогатого скота ежесуточно в
количестве 870–1700 г, 340–1200 г, 400–600 г соответственно.
Муравьиная кислота HCOOH – бесцветная, едко пахнущая
жидкость, в любом соотношении смешивается с водой. При
концентрации 10 г в 1 л воды раствор имеет кислую реакцию
(рН 2,2). Молярная масса – 46,02 г/моль. НСООН играет важ-
ную роль в промежуточном обмене веществ. Поступившая в
организм кислота в незначительных количествах и без измене-
ний выводится из него вместе с мочой. Основная часть про-
дукта в процессе обмена веществ проходит путь преобразова-
ний. Организмом муравьиная кислота поглощается достаточно
легко. Возможно ее всасывание через кожу и слизистые обо-
лочки. Незначительные количества муравьиной кислоты обра-
зуются в процессе брожения, происходящем в рубце. Воздей-
ствие муравьиной кислоты на микроорганизмы, в особенности
это касается бактерий, основано на ее свойстве понижать вели-
чину рН. Она является самой сильной в ряду жирных кислот и
вследствие высокого значения константы диссоциации при-
годна для консервации в тех случаях, когда в рационе допу-
стимо использование сильнокислых продуктов с величиной
рН < 3,5. Относительной устойчивостью к воздействию мура-
вьиной кислоты обладают бактерии молочной кислоты и плес-
невые грибки.
Муравьиная кислота может использоваться для подкисле-
ния заменителей молочных продуктов, молока, обрата и сыво-
ротки. Тем самым эти жидкие продукты стабилизируются для

107
длительного хранения. Для подкисления жидких молочных
продуктов и их заменителей к их 10%-му раствору следует до-
бавлять 1–3 % и 0,1–0,3 % соответственно.
Большие добавки муравьиной кислоты (3–4 %) позволяют
силосовать рыбу. Она представляет собой прекрасный корм
для рыб, пушных зверей, свиней и птицы.
Уксусная кислота С2Н4О2(СН3СООН), молекулярный вес
60,05 – бесцветная жидкость с резким запахом, хорошо смеши-
вается с водой в любых пропорциях. Уксусная кислота содер-
жит 98,5 % основного вещества, 1 % воды и 0,5 % других кис-
лот. В основном уксусную кислоту применяют в виде раствора
для консервирования зерна и растительных кормов. По сравне-
нию с муравьиной кислотой консервирующее действие уксус-
ной слабее на 5–10 %, следовательно, рекомендуемая доза вне-
сения для растительных кормов несколько выше по сравнению
с муравьиной кислотой и составляет 5–6 л/т. Величина дозы
внесения также зависит от вида растительной массы, предна-
значенной для консервирования. Для легкосилосующихся рас-
тений доза составляет 5 л/т, для трудносилосующихся и неси-
лосующихся – 6 л/т. Механизм консервирующего действия ук-
сусной кислоты заключается в том, что она за счет подкисления
исходной массы корма подавляет (ингибирует) ферменты. За-
консервированный силос с использованием уксусной кислоты
целесообразно применять в рационах дойных коров, поскольку
он способствует повышению жирности молока.
Пропионовая кислота С3Н6О2(СН3СН2СООН), молярная
масса – 74,1 г/моль. Представляет собой прозрачную бесцвет-
ную (иногда желтоватую) с резким едким запахом жидкость,
при попадании на кожу вызывает ожог. В любом соотношении
смешивается с водой, при концентрации 100 г в 1 л воды рас-
твор имеет кислую реакцию (рН 2,3). Она содержит 99,2 % про-
пионовой кислоты, 0,8 % воды и других кислот. Это естествен-
ный метаболит. Пропионовая кислота, по сравнению с муравь-
иной и уксусной, обладает более сильным антигрибковым дей-
ствием, подавляет развитие плесени, поэтому используется для

108
обработки зерна и сена. Доза внесения для растительных кор-
мов – 3–5 л/т.
Пропионовая кислота хорошо подходит для консервации
комбикормов, а также состоящую из молотых и немолотых
компонентов (например, зерна).
Добавки пропионовой кислоты не оказывают никакого воз-
действия на содержащиеся в кормосмесях активные вещества.
В равной степени это касается и добавок пропионовой кислоты
к комбикормам, подвергаемым затем гранулированию. В це-
лом пропионовая кислота может рассматриваться как неток-
сичный продукт. У жвачных животных она является конечным
продуктом рубцовой ферментации, поглощается в больших ко-
личествах и проходит стадию промежуточного метаболизма.
Пропионовая кислота у моногастричных животных выступает
в роли физиологической связи, проявляясь в процессе обмена
веществ при расщеплении жирных кислот с нечетным числом
групп СООН, холестерина и некоторых аминокислот (напри-
мер, валина и изолейцина).
Пропионовая кислота (марка лупрозил) используется для
уничтожения сальмонелл в кормах, например, применяются
гидротермические процессы (гранулирование, экструзия, обра-
ботка) при температурах >80 °С. Применение гидротермиче-
ских процессов для борьбы с сальмонеллами в комбикормах
требует больших затрат энергии. Кроме того, негативному воз-
действию подвергаются такие чувствительные компоненты
кормов, как витамины, каротиноиды, аминокислоты, так как в
результате реакций снижается их биологическая ценность и
усвояемость.
Пропионовая кислота обладает сильной коррозийной ак-
тивностью. Для хранения и транспортировки должны приме-
няться не только коррозийно-стойкие материалы.
Пропионовая кислота, как хороший консервант, является
также эффективным средством сальмонеллеза. Более дей-
ственны в этом отношении смеси пропионовой и муравьиной
кислот. Такие смеси обеспечивают: быстрое обеззараживание,

109
длительную защиту от повторного заражения, консервацию
кормовых средств. Наряду с пропионовой и муравьиной кисло-
той производятся их смеси (таблица 5)

Таблица 5 – Химический состав препаратов из смеси пропионовой

и муравьиной кислот, %
Муравьиная кислота
Продукт Пропионовая кислота
(85 %)
Лупро-Тект 85 15
Лупро-Микс 50 50
Лупро-Сид 25 75

Пропионовая и муравьиная кислоты относятся к продук-

там, вызывающим коррозию, и входят в первую группу водо-
опасных веществ. Необходимо, чтобы упаковка емкости с
этими продуктами соответствовала предъявляемым к ним тре-
бованиям.
Бензойная кислота (С6Н5-СООН), молекулярная масса
122,12 г/моль. Это бесцветные кристаллы, плохо растворимые
в воде, обладающие сильными бактерицидными и незначитель-
ными фунгицидными свойствами. Основное вещество –
99,9 %, различные добавки – 0,1 %. Применяется для расти-
тельной массы корма, доза внесения для злаковых – 2,5–3 кг/т,
клевера – 3,5 кг/т, люцерны – 4 кг/т. Использование бензойной
кислоты в качестве консерванта при заготовке силоса позво-
ляет получать высококачественный, умеренно кислый корм с
минимальными потерями питательных веществ. При внесении
бензойной кислоты в массе корма значительно подавляется
развитие дрожжей и в меньшей степени – маслянокислых бак-
терий. Бензойная кислота на поздних периодах хранения не-
сколько угнетает и молочнокислое брожение. Силос, приготов-
ленный с бензойной кислотой, поедается крупным рогатым
скотом лучше, чем силос обычного приготовления.
К группе однофакторных консервантов относится препа-
рат БК (белорусский консервант), представляющий собой
водный раствор, включающий 23–35 % бензоата натрия и 0,9–

110
6,0 % толуилата натрия, рекомендуемый к использованию в
дозе 8–10 л/т викоовсяной смеси или отавы злаковых трав.

5.2 Консерванты комплексного действия

Эти консерванты характеризуются совокупностью не-
скольких полезных свойств. Помимо обычного консервирую-
щего действия одни из них обогащают корма элементами пита-
ния (азотом, серой, фосфором), другие – биологически актив-
ными веществами, способными стимулировать продуктив-
ность животных, третьи вносят в корма элементы питания и
биологически активные вещества.

5.3 Консерванты, обогащающие корма азотом

Для консервирования с одновременным обогащением азо-
том легкосилосующихся зеленых кормов предложены: аммиак
в дозе 0,35–0,40 % в массе корма; хлористый аммоний в дозе
0,8–1,0 % в массе корма; уксуснокислая мочевина в дозе 6 кг/т
корма; препарат УАС (смесь углеаммонийных солей) в дозе
5–6 кг/т в силосуемых кормов, 10–15 кг/т при раскислении си-
лоса и жома и 3–5 % к массе консервируемого сырого фураж-
ного зерна; мочевина в дозе 3–5 кг/т корма; аммонийные соли
органических кислот, в том числе муравьиной, уксусной, про-
пионовой, молочной, бензойной, акриловой и других, в дозе
0,6–1,0 % к кормовой массе; препарат ДММК, состоящий из
формалина и мочевины, в дозе 3 кг/т крестоцветных кормовых
культур; консервант-обогатитель № 1, включающий 1–2 части
уксусной кислоты и по 1 части формалина и мочевины, в дозе
4 кг/т зеленой кукурузы.
Использование газообразных консервантов имеет свои
преимущества и недостатки. Главное преимущество газообраз-
ных консервантов – увеличение объема при рекомендуемых
дозах – дает возможность резко повысить равномерность вне-
сения. Технически наиболее просто осуществлять его путем

111
введения газа в воздушный поток при вентилировании. Но ис-
пользование газообразных консервантов требует создания или
герметичных хранилищ, или тщательного укрытия корма при
обработке. Для хранения газообразных консервантов требуются
специальные емкости (баллоны, герметичные резервуары).

5.4 Консерванты, обогащающие корма серой

К этой группе относится серная кислота, но в связи с силь-
ной химической агрессивностью в чистом виде используется
очень редко, чаще она входит в состав комбинированных кон-
сервантов. К консервантам, обогащающим корма серой, отно-
сится бисульфит натрия, который вносят в дозе 8–10 кг/т
корма; сульфат натрия (глауберова соль) применяется только
при силосовании зеленой кукурузы в количестве 3–4 кг/т; пи-
росульфит натрия применяется в дозе на 1т легкосилосую-
щихся кормов – 3 кг, трудносилосующихся – 4 кг и несилосую-
щихся – 5 кг; бисульфит натрия и бисульфат натрия – 8–12 кг/т
зеленых кормов.
Пиросульфит натрия (Na2S2O5). Консервирование расте-
ний пиросульфитом натрия позволяет в значительной степени
сохранить каротин в кормах. По сравнению с обычным силосо-
ванием потери каротина снижаются от 5 % для кукурузы до
30 % для люцерны. При соблюдении технологии консервиро-
вания с пиросульфитом натрия корма получаются доброкаче-
ственными и хорошо поедаются животными. Действие его сле-
дующее: пиросульфит натрия, внесенный во влажную расти-
тельную массу, разлагается под действием влаги и соков расте-
ний на сульфат натрия, а также ионы водорода. Сульфат натрия
(глауберова соль) благоприятно действует на пищеварение
сельскохозяйственных животных.
Бисульфат натрия (NaHSO4) способствует получению хо-
рошего силоса и сокращает его потери при хранении. Доза вне-
сения – от 4 (для легкосилосующихся кормов) до 6 кг/т (для
трудносилосующихся кормов).

112
 Сернистый газ (SO2), или диоксид серы. Сернистый газ хо-
рошо консервирует растительную массу или фуражное зерно.
При этом получается силос хорошего качества с незначитель-
ными потерями питательных веществ. В дозах от 0,2 до 0,5 % к
массе зеленых кормов обеспечивает получение силосов хоро-
шего качества. Сернистый газ эффективно действует на плес-
невые грибы. Достаточно внести около 0,4 % сернистого газа к
общему весу зерна, чтобы гарантировать сохранность зерна
при хранении в течение нескольких месяцев.

5.5 Консерванты, обогащающие корма фосфором

Основным консервантов в этом случае является ортофос-
форная кислота в дозе на 1 т легкосилосующихся кормов – 4 л,
трудносилосующихся – 5 л, несилосующихся – 6 л. Чаще всего
фосфорная кислота используется не в чистом виде, а в различ-
ных смесях. Например, в Финляндии используют препарат
«АИВ-2», состоящий из 80 % муравьиной и 2 % ортофосфор-
ной кислоты, который вносят в дозе 3–7 л/т зеленого корма.
Иногда используют однозамещенный фосфорнокислый натрий
в дозе от 5 до 7 кг/т легкосилосующихся кормов.

5.6 Биологические консерванты

В качестве биологических консервантов в нашей стране в
последние годы наиболее широко используются бактериаль-
ные закваски, которые вносятся в силосуемое сырье со старто-
вой дозой питательной среды (ВНИИМС-ИНБИ, стамилобак)
или в виде препаратов комплексного действия, обладающих
способностью ферментировать широкий набор сложных угле-
водов консервированного растительного сырья, в особенности
крахмала, декстринов и пентоз (биосил, казахсил).
В результате этого бактериальные закваски нового поколе-
ний обладают щадящим действием на сохранность простых са-
харов, которые при обычном силосовании расходуются на об-
разование органических кислот силоса.

113
 Бактериальная закваска ВНИИМС-ИНБИ представляет
собой смесь молочнокислых палочек и молочнокислых стреп-
тококков вида Strptococcus lactis и Lactobacillus plantarum. В
состав закваски введены специально выделенные штаммы мо-
лочнокислых бактерий, обладающие специфическим дей-
ствием на бактерии группы кишечной палочки и маслянокис-
лые, что способствует повышению качества консервируемых
кормов.
Бактериальную закваску ВНИИМС-ИНБИ хозяйства полу-
чают от молочных заводов, где ее готовят в специальных емко-
стях, имеющих теплообменную рубашку. Сырьем для ее про-
изводства служит пастеризованная при температуре 80…85 °С
в течение 20 мин и охлажденное до температуры 30…37 °С све-
жая молочная сыворотка с добавлением 0,3 % кормового кон-
центрата витамина В12, в которую вносят сухой бактериальный
концентрат из расчета 3 г/т питательной среды (сыворотка с до-
бавлением кормового концентрата витамина В12). Культиви-
руют молочнокислые бактерии при температуре 30…37 °С в
течение 11–16 ч. После этого бактериальную закваску разли-
вают в чистые фляги или цистерны и отправляют потребителю.
Перед использованием в хозяйствах закваску смешивают с
водой в соотношении 1 : 10 и вводят в силосуемую зеленую
массу из расчета 15–20 л/т сырья.
Бактериальная закваска стамилобак включает в свой со-
став специальные штаммы мезофильных и термофильных мо-
лочнокислых стрептококков и палочек, обладающих высокой
амилолитической активностью и ингибирующих в силосуемых
кормах развитие посторонней микрофлоры. Ее готовят на мо-
лочных заводах с использованием подсырной и творожной сы-
вороток. Творожную сыворотку предварительно разводят во-
дой в соотношении 1 : 1. Для приготовления бактериальной за-
кваски сначала готовят среду культивирования, для чего в сы-
воротку вносят 0,4 % диаммонийфосфата кормового, затем ее
пастеризуют при температуре 80 ± 2 °С в течение 18 ± 1 мин.

114
После охлаждения до температуры 37 ± 1 °С в среду вносят ак-
тивизированный по специальной технологии бактериальный
концентрат из расчета 40 л активизированной культуры молоч-
нокислых бактерий на 1000 л среды культивирования. Приго-
товление закваски проводят при температуре 37 ± 1 °С в тече-
ние 14 ± 2 ч после чего она готова к применению.
Закваску транспортируют в хозяйства в молочных цистер-
нах или бидонах. Готовую закваску рекомендуется использо-
вать в день ее приготовления. Доза внесение – 15–20 л/т сило-
суемой зеленой массы.
Биосил – биологический препарат комплексного действия,
активное начало которого составляет биомасса живых клеток
гомоферментативных молочнокислых бактерий родов Lactoba-
cillus и Streptococcus, выращенных на питательной среде, со-
держащей кукурузную муку и БВК. Препарат производят в су-
хом или пастообразном виде. Биосил сухой – однородный по-
рошок без выраженного запаха, от светло-кремового до светло-
коричневого цвета, с массовой долей влаги не более 10 %,
легко суспендируется в воде. Биосил-паста представляет собой
однородную, без выраженного запаха пастообразную массу, от
кремового до коричневого цвета, массовой долей влаги – не бо-
лее 90 %, легко суспендируется в воде.
Входящие в состав препарата высокоэффективные штамма
гомоферментативных молочнокислых бактерий обладают ан-
тогонистическим действием по отношению к гнилостным, мас-
лянокислым бактериям, микроскопическим грибам, а также
ряду условно-патогенных и патогенных микроорганизмов. Мо-
лочнокислые бактерии, входящие в состав препарата, фермен-
тируют широкий набор субстратов, в том числе пентозные са-
хара, крахмал, декстрины.
Биосил предназначен для силосования многолетних и од-
нолетних злаковых трав и их смесей с бобовыми культурами,
кукурузы, подсолнечника и других видов растительного сырья
путем интенсивно направленного молочнокислого брожения и

115
эффективного подавления развития вредных микроорганиз-
мов. Препарат стабильно активен при температуре 0…8 °С и
сохранении герметичности заводской упаковки в течение
12 мес (сухой препарат), биосил-паста – 7 сут. Биосил сухой
может использоваться по истечении гарантийного срока хране-
ния. В этом случае он должен быть проверен на содержание ак-
тивного начала.
Биосил сухой расфасовывается в герметичную полиэтиле-
новую упаковку массой 0,5–2 кг, паста – в молочные фляги по
30–40 кг. На упаковочной этикетке указываются масса препа-
рата, содержание в нем активного начала и дата его изготовле-
ния. Сухой препарат содержит в 1 г 100±10 млрд живых клеток
молочнокислых бактерий, паста – 20±5 млрд живых клеток.
Биосил сухой вносится в количестве, обеспечивающем концен-
трацию живых клеток молочнокислых бактерий 1 млрд/кг, био-
сил-паста – 0,5 млрд/кг силосуемой массы. С учетом указанных
концентраций нормы расхода сухого препарата составляют
10 г/т, пасты – 25 г/т.
С целью равномерного распределения по всему объему си-
лосуемой массы препарат применяется в виде водной суспен-
зии из расчета разведения доз в 10±1 л воды. При использова-
нии биосила сухого приготовление суспензии осуществляется
в две стадии: предварительно препарат смешивают с водой в
соотношении 1 : 2, доводя смесь до гомогенного пастообраз-
ного состояния, затем растворяют ее в воде до требуемого объ-
ема. Приготовление водной суспензии производят в чистых ем-
костях из стали, алюминиевых сплавов и полимерных матери-
алов. Время использования ее не должно превышать 6 ч.
При силосовании растительного сырья с использованием
биосила необходимо строго соблюдать требования технологии
по срокам уборки кормовых культур, регулированию влажно-
сти силосуемой массы, степени измельчения растений, укладки
и уплотнения массы, продолжительности заполнения траншей
и их укрытия.

116
 К настоящему времени разработаны научные основы сило-
сования кормов, изучены видовой состав и численность микро-
организмов в силосном сырье, процессы, происходящие при
консервировании кормов. Все это доказывает необходимость
применения чистых культур молочнокислых и пропионовых
бактерий в качестве биологических консервантов.
Бактериальные закваски казахсил представлены препара-
тами ПКБ (пропионовокислые бактерии), ПМБ (пентозосбра-
живающие молочнокислые бактерии), АМС (амилолитический
молочнокислый стрептококк).
Пропионовокислые бактерии используются для микробио-
логического получения пропионовой кислоты, а также явля-
ются промышленным продуцентом витаминов В2, В6, В12. В
промышленных условиях для получения пропионовой кислоты
их выращивают на питательной среде, содержащей в своем со-
ставе 2 % глюкозы, дрожжевой автолизат (источник азота),
соли молочной кислоты. За 7–12 сут брожения, протекающего
в анаэробных условия, при кислотности 6,8–7,2 и температуре
30 °С в среде накапливаются пропионовая и уксусная кислоты
в соотношении 5 : 1, выделяется углекислый газ. При этом
около 75 % сахара используется на образование кислот и 20 %
– на выделение углекислого газа.
Пропионовую закваску получают в течение 18–24 ч в
среде, содержащей кукурузный экстракт, глюкозу, хлористый
кобальт, при кислотности 6,8–7,0. Сахара в среде должно быть
не менее 1,8–2,1 %, аминного азота – 50–60 мг%, температура
28…30 °С. Закваска в сухом виде представляет собой порошок
однородной массы от светлого до темно-кремового цвета, хо-
рошо растворимый в воде.
Внесение закваски ПКБ в силосуемую массу из высокоса-
харистых растений позволяет регулировать бродильные про-
цессы в силосе в желательном направлении и законсервировать
его на уровне активной кислотности 4,1–4,3. При хранении в
течение 8 мес перекисания корма не наблюдается. Соотноше-

117
ние органических кислот в большинстве образцов такого си-
лоса составляет: молочный – 71,54–66,77 %, уксусный – 29,01–
33,71 %, отношение молочной микрофлоры к общей – 1 : 2, то-
гда как в силосах спонтанного брожения – 1 : 3. Количество ор-
ганического вещества в силосе с закваской на 0,9–3,45 % выше,
чем в силосе спонтанного брожения. Больше также в нем со-
держится протеина – 1,3–2,05 %, БЭВ – 0,27–5,0 %, каротина –
3,76–13,4 мг/кг и меньше клетчатки – до 3,76 %.
Особое значение пропионовокислой закваски заключается
в том, что она обогащает силос витамином В12. В образцах си-
лоса из кукурузы витамина В12 содержится до 0,06–0,12, в си-
лосе без закваски – 0,04–0,06 мкг/г.
Амилолитический молочнокислый стрептококк (АМС)
гидролизует сложные полисахариды (декстрин, крахмал) и во-
влекает их в молочнокислое брожение. Культура выращива-
ется на питательной среде, состоящей из кукурузного экс-
тракта, пептона, крахмала, автолиза дрожжей, мела, агар-агара
и воды при кислотности среды, равной 7,0, давление в фермен-
тере 0,3–0,5 атм и температуре 35…37 °С в течение 24 ч. Куль-
туральная биологическая масса перед высушиванием в распы-
лительной сушилке нейтрализуется 20%-м раствором щелочи
натрия до получения кислотности 7,0 и обогащается наполни-
телем (сухим обезжиренным молоком) в количестве 20 кг на
100 л культуры.
Закваска АМС – это сухой порошок мелкокрупитчатой
структуры кремового цвета – от светлых до темных тонов.
Имеет вкус и запах обезжиренного молока, иногда с кислым
привкусом, запахом пептонной горечи и лимоннокислого
натрия. В 1 г закваски содержится 20 × 106-8 живых бактериаль-
ных клеток. Влажность закваски – 6–8 %, титруемая кислот-
ность культуральной жидкости – в пределах 60–120° по Тернеру.
Внесение закваски АМС в силосуемую массу активизирует
молочнокислое брожение, подкисляя корм до рН 4,6 и накап-

118
ливая 1,7–3,8 % молочной кислоты (в пересчете на сухое веще-
ство), при этом в силосе больше протеина на 3,52 %, жира –
1,15 %, каротина – на 11,3 мг/кг.
Внесение закваски в сенажируемую массу не вызывает из-
лишнего расхода углеводов на брожение и в то же время ста-
бильно консервирует корм, который при доступе воздуха не
подвергается плесневению в первые недели использования его
на корм скоту.
Пентозосбраживающие молочнокислые бактерии (ПМБ)
обладают свойствами сбраживать ксилозу, арабинозу, саха-
розу, мальтозу, глюкозу до молочной, уксусной или муравьи-
ной кислот. Культуру выращивают на агаризованной ксилозно-
арабинозной среде, содержащей кукурузный экстракт, ксилозу
или глюкозу, мел, дрожжевой автолизат, соли калия, марганца
и кальция. Титруемая кислотность культуральной жидкости –
в пределах 50–80° по Тернеру.
Процесс производства закваски ПМБ состоит в следую-
щем: выращенная культуральная биомасса для заквасок охла-
ждается, подается на сушку, где методом распыления в потоке
нагретого воздуха доводится до порошкообразного состояния.
Температура воздуха в сушильной установке на входе состав-
ляет 150 °С, на выходе – 70…80 °С. Готовую закваску фасуют
в полиэтиленовые мешки и рассылают потребителю.
Применять пентозосбраживающую молочнокислую за-
кваску (ПМБ) следует при силосовании как зеленых кормов,
так и соломы. Микробиологические процессы в соломе, заси-
лосованной с применением этого препарата, протекают с пре-
обладанием гетероферментативного молочнокислого броже-
ния, несмотря на то, что в соломе антагонизм бактерий прояв-
ляется очень слабо. Развитие пентозосбраживающих молочно-
кислых бактерий происходит при влажности 65 % и темпера-
туре 26…37 °С. Прогрев силоса отмечается на 5–10-е сутки по-
сле закладки. Кислотность силоса из соломы составляет 4,4–
5,4. Всего кислот содержится от 0,51 до 0,69 %, в том числе мо-
лочной – 0,36–0,52 %.

119
 Закваска силамп, состоящая из амилолитического молоч-
нокислого стрептококка и пропионовокислых бактерий в соот-
ношении 1 : 1, рекомендуется для приготовления умеренно
кислого силоса из кукурузы. В силосе, приготовленном с до-
бавками указанных бактерий, бродильные процессы имеют
направленный гомоферментативный молочно- и пропионово-
кислый характер. Об этом свидетельствуют данные резкого
преобладания в субстрате молочнокислых стрептококков и
пропионовокислых бактерий в ранние и поздние сроки созре-
вания силоса.
Присутствие в растительном соке амилолитического мо-
лочнокислого стрептококка интенсифицирует молочнокислое
брожение, полностью исключает возможный антагонизм мо-
лочнокислых бактерий к пропионовокислым и создает условия
для трансформации молочной кислоты в пропионовую. За-
кваска силамп синтезирует 0,22–0,43 мкг/г в силосе и до
0,33 мкг/г витамина В12 в рубце животных.
Бактериальные закваски АМС и ПМБ в смеси эффективно
консервируют люцерну, эспарцет, бобово-злаковые траво-
смеси и сдерживают повышение температуры в процессе со-
зревания корма. Температура в силосе из викоовсяной траво-
смеси с заквасками АМС+ПМБ в среднем на 1…2 °С ниже, чем
в корме без заквасок. При биологическом консервировании
подвяленного сырья смесью АМС+ПМБ молочнокислое бро-
жение принимает гомоферментативный характер, подавляя
продукцию уксусной кислоты. При этом лучше сохраняется са-
хар, его содержание выше на 1,74–1,93 %.
Бактериальные закваски повышают питательность викоов-
сяного силоса, при этом содержание протеина выше на 1,49 и
1,32 %, белка – 0,98 и 2,79 %. В сухом веществе силоса из раз-
личных бобовых, бобово-злаковых трав сохраняется больше
органических веществ – на 3,5 %, протеина – на 40 %, потери
каротина сводятся к минимуму, тогда как без закваски они уве-
личиваются в два раза. Водорастворимые сахара расходуются

120
в силосе с закваской на 74,22 %, без закваски – на 89,63 %, оста-
точного сахара – соответственно 2,18 г/кг и в 1,5 раза меньше.
Солома, силосованная с этой закваской, поедается животными
на 90 %.
Применение казахсила для консервирования силоса из кор-
мовых растений и силосования соломы основано на свойствах
закваски АМС восполнять запас легкосбраживаемых сахаров
путем расщепления крахмала на простые сахара (глюкозу),
ПКБ – раскислять силос из легкосилосующихся перекисляю-
щихся кормовпутем перевода избыточного содержания молоч-
ной кислоты в пропионовую, ПМБ – образовывать из гемицел-
люлозы соломы (ксилозы, арабинозы) молочную и уксусную
кислоты – консерванты силоса.
Смешанные закваски АМС, ПКБ (силамп) применяются
для консервирования силоса из легкосилосующихся (кукурузы,
сорго, подсолнечника) кормов, смесь АМС, ПМБ (АПП) из
многолетних и однолетних трав в смеси с сухой соломой; АМС,
ПКБ, ПМБ (АПП) – кукурузной соломы; АМС, ПМБ – пшенич-
ной, ячменной, ржаной, рисовой соломы в дозах по 1,5 г каж-
дый на 1 т массы. Из расчета дневной потребности перед обра-
боткой силосной массы смешанными заквасками их следует
смешать по 1,5 г каждой на 1 т массы и развести в 1 л воды, при
этом в растворе могут образовываться незначительные осадки.
Сухие закваски обязательно хранить в ненарушенной упаковке
при температуре 0…8 °С в сухих помещениях. Срок хранения
9 мес со дня изготовления. Готовить растворы необходимо
только перед употреблением.
Технология внесения заквасок в силосуемую массу проста:
на 1 т силосуемого сырья по 1,5 г концентрата разводится в 1 л
воды при силосовании кормовых культур, в 2 л – для соломы.
На 100 т силосуемой массы по 150 г АМС, ПКБ разводится в
10 л воды, затем раствор вносится в бочку со 100 л воды, кото-
рая оснащена трубкой – капельницей и установлена на трактор,
трамбующий силос.

121
 При закладке растительного сырья на силос необходимо с
особой тщательностью соблюдать технологию силосования
(поточная доставка и укладка силосуемой массы, особенно
тщательная трамбовка, надежное укрытие и др.).

5.7 Фитонцидные консерванты

Фитонцидные консерванты – это органические биологиче-
ски активные вещества, способные в силосуемых кормах уби-
вать и подавлять развитие различных микроорганизмов и тем
самым снижать разрушение питательных веществ.
Впервые способ фитонцидного консервирования был пред-
ложен в 1979 г. и апробирован Всесоюзным НИИ животновод-
ства и Ереванским зооветинститутом.
Добавка 10–30 % фитонцидоактивных трав при силосова-
нии любых зеленых кормовых культур позволяет сократить по-
тери питательных веществ на такую же величину, что и при хи-
мическом консервировании, и улучшить поедаемость готового
силоса, особенно кукурузного. Это подтверждается исследова-
ниями по силосованию зеленой кукурузы с борщевиком Сос-
новского в соотношении компонентов 85 и 15 % соответ-
ственно.
Для избежания затрат на подготовку кормов к силосова-
нию целесообразно выращивать кормовые культуры в смешан-
ных посевах с фитонцидоактивными травами с таким расчетом,
чтобы последние составляли не менее 15–25 % общего урожая
зеленой массы.
Фитонцидное консервирование, называемое иногда алле-
лопатическим (влияние растений друг на друга путем выделе-
ния ими различных веществ), является более прогрессивным,
выгодным и естественным приемом заготовки высококаче-
ственных силосов по сравнению с химическим консервирова-
нием. При этом исключаются расходы по приобретению и ис-
пользованию химических продуктов, исключается засорение
окружающей среды.

122
 Контрольные вопросы
1. Биотехнологические методы консервирования.
2. Консерванты простого действия.
3. Консерванты комплексного действия.
4. Консерванты, обогащающие корма азотом.
5. Консерванты, обогащающие корма серой.
6. Консерванты, обогащающие корма фосфором.
7. Биологические консерванты.
8. Фитонцидные консерванты.

123
ГЛАВА 6. БИОКОНВЕРСИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
И ОТХОДОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО
ПРОИЗВОДСТВА

Биоконверсия – процесс превращения веществ с участием

живых организмов, точнее процесс превращения одних соеди-
нений в другие при участии ферментных систем живых орга-
низмов.
Биологическую конверсию осуществляют для получения
целевых продуктов, которые можно разделить на: первичные
метаболиты, вторичные метаболиты, ферменты, клеточная
биомасса, либо трансформированный субстрат.
Первичные метаболиты – это низкомолекулярные соедине-
ния (молекулярная масса менее 1500 дальтон), необходимые
для роста микробов Одни из них являются строительными бло-
ками макромолекул, другие участвуют в синтезе коферментов.
Среди наиболее важных для промышленности метаболитов
можно выделить аминокислоты, органические кислоты, пури-
новые и примидиновые нуклеотиды, витамины и др. Исход-
ными штаммами для промышленных процессов служат при-
родные организмы и культуры с нарушениями регуляции син-
теза этих метаболитов, так как обычные микробные клетки не
производят избытка первичных метаболитов.
Вторичные метаболиты – это низкомолекулярные соедине-
ния, образующиеся на более поздних стадиях развития куль-
туры, не требующиеся для роста микроорганизмов. По химиче-
скому строению вторичные метаболиты относятся к различ-
ным группам соединений. К ним относят антибиотики, алкало-
иды, гормоны роста растений, токсины и пигменты.
В основе всех процессов биотрансформации лежит фер-
ментация (культивирование). Это совокупность последова-
тельных операций – от внесения в заранее приготовленную и
термостатированную питательную среду посевного материала
(инокулята) до завершения процессов роста и биосинтеза –
вследствие исчерпывания питательных веществ среды.

124
 Применяют различные методы биоконверсии в зависимо-
сти от требований продуцента. Для удобства их можно разде-
лить на следующие:
– по содержанию кислорода – на аэробные и анаэробные;
– по количеству стадий – на одно-, дву- и многостадийные;
– по наличию или отсутствию перемешивания – на дина-
мические и статические;
– по состоянию питательной среды – на поверхностные и
глубинные.
Особенности биоконверсии:
– превращение веществ-субстратов в структурно-родствен-
ные соединения (под воздействием ферментов органические
вещества превращаются в родственные им по структуре веще-
ства);
– отсутствует полная деградация субстрата, присутствует
лишь незначительные его изменения, которые приводят к по-
лучению целевого продукта.
При поверхностном культивировании посевной материал
высевают на поверхность питательной среды, распределенной
небольшим слоем (около 10 см).
При периодическом способе культивирования питатель-
ную среду (субстрат) засевают исходной культурой проду-
цента, и далее в этой же емкости микроорганизмы при опреде-
ленных условиях проходят через все стадии роста и развития
популяции. Когда процесс культивирования заканчивается, ем-
кость для выращивания освобождают, и цикл возобновляется,
начиная от засева питательной среды исходной культурой про-
дуцента. При таком способе культивирования (его можно
назвать «закрытой» системой, когда хотя бы один из компонен-
тов не может поступать в нее или выводиться из нее) скорость
роста биомассы всегда должна стремиться к нулю либо из-за
недостатка питательных веществ, либо из-за накопления в
среде токсических метаболитов.
Применение жидких питательных сред чаще требует пере-
мешивания культуры с целью выравнивания условий роста

125
микробов в разных частях рабочего сосуда и аэрирования
(насыщения кислородом). Для этого используются мешалки,
качалки, бутыли с барботажем газа.
При непрерывном способе культивирования микроорга-
низмы постоянно получают приток свежей стерильной пита-
тельной среды, а из аппарата непрерывно отбирается биомасса
вместе с образуемыми метаболитами (такой способ культиви-
рования можно назвать «открытой» системой). Культура не
отравляется продуктами обмена веществ – в этом большое пре-
имущество непрерывного способа культивирования по сравне-
нию с периодическим, преимущество «открытой» системы по
сравнению с «закрытой». Непрерывная ферментация может
проходить в гомогенной системе идеального смешения, си-
стеме полного вытеснения или твердожидкостного типа.

6.1 Классификация сырьевых ресурсов

Наибольшая часть отходов приходится на отрасль живот-
новодства (56 %), второе место занимают отходы растениевод-
ства (35,6 %). На долю перерабатывающих отраслей прихо-
дится 4,7 % отходов.
В биотехнологической биоконверсии все сырьевые ре-
сурсы сводятся к растительной базе, а точнее к веществам, со-
ставляющим растительный организм. При этом основными
макроэлементами также являются углерод, азот и фосфор.
Именно эти биогенные элементы составляют основную массу
живых организмов.
Растительные биогенные элементы химически связаны или
элименированы (экранированы) такими макромолекулами, как
целлюлоза, лигнин и комплексное вещество клетчатка. По-
этому для глубокого понимания трансформации растительных
материалов необходимо рассмотреть их физико-химическую
основу. Целлюлоза и лигнин являются наиболее сложными из
природных веществ для биологической трансформации. Такие
вещества, как белки, жиры, эфиры, олигосахариды имеют ско-

126
рость трансформации в разы или даже порядки выше, чем клет-
чатка. Однако интерес биотрансформации к клетчатке обуслов-
лен ее практически неограниченным объемом и условной неис-
черпаемостью. Даже в случае глобальных природных ката-
строф (пожары, наводнения, извержения вулканов) одни расти-
тельные сообщества сменяются другими, неизменно представ-
ляя собой ресурс для биотрансформации.
Биотехнология рассматривает биоконверсию раститель-
ного сырья в такие конечные продукты, как топливо, корма и
пищевые продукты, в полупродукты для химической и микро-
биологической промышленности. Деструкция и последующая
трансформация клетчатки осуществляется под действием
групп ферментов – полиферментных систем микроорганизмов.
На сегодняшний день энзимология раскрыла большинство фер-
ментов, задействованных в процессе трансформации целлю-
лозы и лигнина. Эти познания и технологические решения в об-
ласти получения чистых ферментов часто применяются для
осуществления трансформации чистыми ферментами, напри-
мер, получение мальтозы из крахмала. При использовании чи-
стых ферментов с природными субстратами возникает препят-
ствие в виде ингибирующих факторов, температурных усло-
вий, исчерпаемости ферментов и прочих
Применение живых систем, т. е. микроорганизмов позво-
лят часто преодолеть эти сложности, а кроме того получить
иные продукты (например, пищевые грибы, дрожжевую био-
массу). Работа с микробиологическими агентами требует осо-
бых подходов: поддержание жизнеспособности, селекции.
Классификация вторичных ресурсов агропромышленного
комплекса дает первичную информацию о качествах и свой-
ствах отдельных групп и классов ресурсов. Для систематиза-
ции выделяют следующие признаки:
1. По источникам образования:
 растительные остатки (стебли зерновых и технических
культур, льняная костра);

127
  переработка растениеводческого сырья (зернокарто-
фельная барда, виноградные выжимки).
2. По отраслевой принадлежности (отходы сахарной, мас-
ложировой, спиртовой, крахмалопаточной, пивоваренной, пло-
доовощной, табачной, зерноперерабатывающей промышлен-
ности).
3. По агрегатному состоянию:
 твердые – солома, подсолнечная лузга, хлопковая ше-
луха, кукурузный зародыш, плодоовощные семена;
 пастообразные – фильтрационный осадок, навоз, ме-
ласса, шламы сепараторов;
 жидкие – соапсток, мелассная барда, клеточный сок кар-
тофеля, дрожжевые осадки.
4. По технологическим стадиям получения:
 результат первичной переработки сырья – свеклович-
ный жом, плодовые косточки, плодово-ягодные выжимки;
 результат вторичной переработки продукции – рафи-
надная патока, фосфатидные концентраты, отбельные глины,
последрожжевая мелассная барда.
5. По материалоемкости:
 многотонажные (условно свыше 100 тыс. т в год) – со-
лома, свекловичный жом, дефекат, картофельная и кукурузная
мезга, навоз, птичий помет;
 малотонажные – гудрон, кофейные, чайные, табачные и
другие отходы в малых количествах.
6. По направлению последующего использования.

6.2 Ферментные системы микроорганизмов

Характерной особенностью микроорганизмов является то,
что они осуществляют внеклеточное преобразование питатель-
ных веществ, воздействуя на них ферментными системами кле-
ток.

128
 Микробная клетка способна синтезировать десятки экзо-
ферментов для преобразования пищевой среды. С целью био-
технологического процесса трансформации вторичного сырья
наиболее значимыми являются целлюлазы, лигниназы, липазы,
амилазы и протеазы. Исходя из названия типов ферментных си-
стем, становится понятным, за трансформацию каких веществ
отвечает каждая из них.
Ферменты – это вещества белковой природы, вырабаты-
ваемые живой клеткой. Они являются биологическими ката-
лизаторами и играют важную роль в обмене веществ микро-
организмов.
По химическому строению, свойствам и механизму дей-
ствия ферменты микробов сходны с ферментами, образующи-
мися в клетках и тканях животных и растений. Ферменты мик-
робной клетки локализуются в основном в цитоплазме, некото-
рые содержатся в ядре и клеточной оболочке. Микроорганизмы
могут синтезировать самые разнообразные ферменты, относя-
щиеся к шести известным классам: оксиредуктазы, трансфе-
разы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы.
Характерным свойством ферментов является специфич-
ность действия, т. е. каждый фермент реагирует с определен-
ным химическим соединением или катализирует одну, или не-
сколько близких химических реакций. Например, фермент лак-
таза расщепляет лактозу, мальтаза – мальтозу.
Активность ферментов зависит от температуры среды, рН и
других факторов. Ферменты микроорганизмов классифициру-
ются на экзоферменты и эндоферменты. Экзоферменты, выде-
ляясь во внешнюю среду, расщепляют макромолекулы пита-
тельных веществ до более простых соединений, которые могут
быть усвоены микробной клеткой. Так, к экзоферментам отно-
сят гидролазы, вызывающие гидролиз белков, жиров, углеводов.
В результате этих реакций белки расщепляются на аминокис-
лоты и пептоны, жиры – на жирные кислоты и глицерин, угле-
воды (полисахариды) – на дисахариды и моносахариды. Распад

129
белков вызывают ферменты протеазы, жиров – липазы, углево-
дов – карбогидразы. Эндоферменты участвуют в реакциях об-
мена веществ, происходящих внутри клетки.
У микроорганизмов различают также конститутивные и
индуктивные ферменты. Конститутивные ферменты постоянно
находятся в микробной клетке независимо от условий суще-
ствования. Это в основном ферменты клеточного обмена: про-
теазы, липазы, карбогидразы и др. Индуктивные (адаптивные)
ферменты синтезируются в клетке только под влиянием соот-
ветствующего субстрата, находящегося в питательной среде, и
когда микроорганизм вынужден его усваивать. Например, если
бактерии, не вырабатывающие в обычных условиях фермента
амилазы, расщепляющей крахмал, засеять на питательную
среду, где единственным источником углерода служит крах-
мал, то они начинают синтезировать этот фермент. Таким об-
разом, индуктивные ферменты позволяют микробной клетке
приспособиться к изменившимся условиям существования.
Целлюлаза – фермент, принадлежащий к классу гидролаз,
катализирующий гидролиз β (1,4)-гликозидных связей в цел-
люлозе с образованием глюкозы или дисахарида целлобиозы.
Липазы – ферменты класса гидролаз, катализирующие гид-
ролиз эфиров глицерина и высших карбоновых кислот.
Амилаза – фермент, гликозил-гидролаза, расщепляющий
крахмал до олигосахаридов.
Протеазы, протеиназы, протеолитические ферменты – фер-
менты из класса гидролаз, которые расщепляют пептидную
связь между аминокислотами в белках.
Лигнинлитические ферменты: лакказа (пара-бензендиол :
кислород оксидоредуктаза, п-дифенол оксидаза) – фермент, от-
носящийся к оксидазам. Катализирует ряд реакций окисления
ароматических и неароматических соединений. Так, к лигнин-
литическим ферментам относят лигнин-пероксидазу и марга-
нец-зависимую пероксидазу.

130
 6.3 Конверсия побочной продукции перерабатывающих
производств в дрожжевую биомассу
Биоконверсия послеспиртовой барды
Послеспиртовую барду используют в качестве питатель-
ного субстрата в производстве кормовых дрожжей. Их выра-
щивают или на одной послеспиртовой барде, или на послеспир-
товой барде с добавками гидролизного сусла.
Для производства кормовых дрожжей используют бесспо-
ровые дрожжеподобные грибы. По классификации Лоддера и
Крюгера ван Рейя аспорогенные дрожжи относятся к порядку
Cryptococcales.
Разные штаммы дрожжей, выделенные из разных источни-
ков, отличаются по активности ассимиляции углеводов, устой-
чивости к ингибиторам гидролизных сред, скорости роста и по
выходу биомассы. Из подсемейства Cryptococcoideae в микроб-
ных ассоциациях в качестве примеси встречаются дрожжи ро-
дов Torulopsis и Cryptococcus: Torulopsis sace, T. famata,
T. holnii, T. sphaerica, Cr. spesia и Cr. terreus и др. Это одиноч-
ные клетки, плохо флотирующиеся и снижающие выход био-
массы.
В микробных ассоциациях гидролизно-дрожжевых заводов
используют дрожжи рода Trichosporon. К этому роду относится
вид Trichosporon cutaneum, который имеет невысокую скорость
роста по сравнению с Candida scottii, но он более глубоко асси-
милирует органические вещества питательного субстрата, в том
числе пентозы и органические кислоты. Поэтому этот вид при-
меняют не только при ферментации гидролизного сусла, после-
спиртовой барды, но и отработанной культуральной жидкости
(ОКЖ – последрожжевой бражки).
В ассоциации с основной культурой С. scottii отмечается
симбиоз культур дрожжей и гриба, что способствует повыше-
нию выхода дрожжей и содержания в них белка по Барн-
штейну. В ассоциациях дрожжей ряда заводов используют
дрожжи Hansenula anomala, относящиеся к спорообразующим

131
грибам семейства Saccharomycetaceae. В качестве сопутствую-
щей миклофлоры в биореакторах присутствуют дрожжи рода
Zigofabospora (вид Z. marxiana), также относящиеся к семей-
ству Saccharomycetaceae. Присутствие их в ассоциации
дрожжей нежелательно, так как они снижают выход биомассы.
Кроме дрожжевых культур и культур гриба в составе биоцено-
зов промышленных ферментаторов всегда присутствуют бак-
терии.
Для поддержания в необходимом количестве основной ас-
социации дрожжей необходимо периодически осуществлять
подсев культуры основного продуцента белка. Вся сопутству-
ющая микрофлора, а также живые клетки продуцента убива-
ются в процессе термолиза дрожжевой суспензии перед суш-
кой. С целью повышения устойчивости к ингибиторам прово-
дится постоянная селекция производственных штаммов. Адап-
тация культур дрожжей к ингибиторам, присутствующим в
гидролизных средах, существенно повышает выход дрожжей и
содержание в них белка. Создание оптимальных условий для
выращивания культур-продуцентов белка обеспечивает доми-
нирование этих культур в биоценозе промышленных фермен-
таторов. Существенное влияние на состав микрофлоры оказы-
вает качество и состав гидролизных сред. Продукты распада
моносахаридов: фурфурол, оксиметилфурфурол, левулиновая
кислота, лигногуминовые вещества, а также другие примеси
гидролизата снижают скорость роста дрожжей и содержание
белка в биомассе. Наиболее сильное снижение белка наблюда-
ется при концентрации оксиметилфурфурола в гидролизном
сусле более 0,07 %.

Конверсия молочной сыворотки

Молочная сыворотка является ценным сырьевым ресурсом
для биоконверсии. Объемы этого сырья в России составляют
около 5 млн. т в год. Теоретический выход молочной сыво-
ротки достигает около 90 % от массы перерабатываемого мо-

132
лочного сырья, она содержит около 50 % сухих веществ мо-
лока. Многотоннажность молочной сыворотки и ее биогенный
состав обусловливают необходимость полного сбора и рацио-
нального использования сырьевого ресурса. К настоящему вре-
мени в России промышленной переработке подвергается лишь
30 % от общего объема молочной сыворотки.
Наиболее рациональный способ использования молочной
сыворотки – биоконверсия ее компонентов в белок путем куль-
тивирования микроорганизмов, которые способны использо-
вать лактозу в качестве источника энергии и превращать мине-
ральный азот в белок. Для биоконверсии молочной сыворотки
возможно использовать дрожжи, молочнокислые бактерии,
микроскопические грибы. Наиболее высоким коэффициентом
конверсии сыворотки в микробный белок обладают дрожжи.
Дрожжи Kluyveromyces marxianus способны использовать в ка-
честве источника углерода лактозу и инулин и продуцировать
высокоактивную b-фруктофуранозидазу. Данный фермент ка-
тализирует отщепление остатка b-фруктофуранозы от олиго- и
полисахаридов. Расщепляет сахарозу на глюкозу и фруктозу.
Эту реакцию называют инверсией, так как она сопровождается
изменением знака оптического вращения: правовращающая са-
хароза превращается в левовращающую смесь глюкозы и фрук-
тозы – так называемый инвертированный сахар.
Дрожжевая биомасса, полученная биоконверсией молоч-
ной сыворотки, представляет собой физиологически полноцен-
ный высокобелковый продукт, который может быть использо-
ван для пищевых и кормовых целей.
Во Всероссийской коллекции микроорганизмов (г. Пу-
щино) депонирован штамм дрожжей Kluyveromyces marxianus
Y-1148. Данный биологический род дрожжей систематически
наиболее близок к роду Saccharomyces (рисунок 9).

133
 Рисунок 9 – Схема эволюционного родства почкующихся дрожжей
(упрощенная адаптация): CTG – вид, у которого CTG-кодон соответствует
серину, а не лейцину; WGD – вид, у которого произошла дупликация генома

Эти дрожжи активно ассимилируют лактозу, что позволяет

осуществлять ферментацию молочной сыворотки без внесения
дополнительных сахаров. В качестве субстрата используют сы-
воротку, например, полученную после изготовления творога, с
содержанием сухого вещества – 5,0 %; лактозы – 4,7 %,
рН – 4,75. Сыворотку обогащают минеральными солями (%):
(NH4)2SO4 – 0,3; (NH4)2HPO4 – 0,2; КCl – 0,05. Культивирование
дрожжей проводят на термостатируемой качалке при
200 об./мин в течение 24 ч. Для инактивации дрожжей и дена-
турации белка культуральную жидкость подвергают тепловой
обработке (85…92 °С, 30 минут). Дрожжебелковую массу оса-
ждают центрифугированием при 2600 об./мин в течение 10 мин
при 2 °С.
К настоящему времени разработаны различные технологии
биоконверсии молочной сыворотки дрожжами штаммов рода
Kluyveromyces, Candida, Saccharomyces, Torulopsis для получе-
ния продуктов, используемых на пищевые и кормовые цели.
В большинстве случаев это сухие продукты, при получе-
нии которых технологии включают сгущение и распыление.
Возможно так же получение жидких концентратов дрожжеван-
ной сыворотки.

134
 Изучено влияние способа подготовки сыворотки и дозы
инокулята на эффективность биоконверсии и возможность ис-
пользования нестерильной сыворотки. Выявлено, что на несте-
рильной сыворотке максимальное накопление дрожжевой био-
массы и наибольший выход продукта (37 г/л) был при внесении
10 % инокулята. В этих условиях активно размножались «ди-
кие» дрожжи, которые угнетали развитие клюйвиромицетов.
На стерильной сыворотке максимальный выход продукта –
43,2 г/л при внесении 3 % инокулята, что выше на 13 % от вы-
хода, полученного при использовании «сырой» сыворотки. Та-
ким образом, выход дрожжесывороточного продукта зависит
от способа подготовки сыворотки, и применение стерильной
сыворотки более целесообразно.
При изучении влияния рН сыворотки и времени культиви-
рования на накопление биомассы установлено, что максималь-
ное накопление дрожжевой биомассы выявлено при рН сыво-
ротки 5,5 и времени культивирования 24 ч.
На основании проведенных исследований установлены оп-
тимальные режимы биоконверсии молочной сыворотки
К. marxianus У-1148: рН сыворотки – 5,5; температура культи-
вирования – 30…32 °С, время культивирования – 24 ч. Была
разработана биотехнология дрожжесывороточного продукта,
которая включает стадии: пастеризация сыворотки (72 °С,
20 с), приготовление растворов солей и обогащение молочной
сыворотки, получение посевного материала, ферментация
(30…32 °С) 24 ч, тепловая обработка культуральной жидкости
(85…92 °С, 30 мин), концентрирование дрожжеванной сыво-
ротки, пастеризация продукта (72 °С, 20 с), охлаждение про-
дукта (4…6 °С).
Выход продукта составляет около 10 % от исходной сыво-
ротки. Полученный дрожжесывороточный продукт напоми-
нает молоко, имеет белый цвет и приятный молочный запах.
Отсутствие сывороточного запаха и вкуса связано со способно-
стью дрожжей активно потреблять ацетальдегид, диацетил,

135
жирные низкомолекулярные кислоты, придающие сыворотке
нежелательные вкус и аромат.
Показано, что по сравнению с исходной сывороткой про-
дукт биоконверсии содержит белка больше в 2,5 раза, жира –
в 30 раз и по содержанию основных компонентов приближа-
ется к обезжиренному молоку.
Белки молочной сыворотки содержат все незаменимые
аминокислоты и некоторый избыток лизина.
В результате биоконверсии молочной сыворотки дрожжами
изменяется аминокислотный состав сыворотки за счет транс-
формации минеральных источников азота. Общее содержание
аминокислот в дрожжесывороточном продукте близко к его
уровню в белке молока и превышает в 2,4 раза эту величину в
сыворотке, а содержание суммы незаменимых аминокислот пре-
вышает это значение молочной сыворотки в 2,8 раза. По сравне-
нию с сывороткой увеличивается содержание лизина в 1,8 раз,
треонина – в 2,7 раз, лейцина и тирозина – почти в 5 раз, изолей-
цина – в 2,5 раз, суммы серосодержащих аминокислот метио-
нина и цистеина – в 3 раза, валина – 1,4 раза.
Было установлено, что биомасса дрожжей составляет
около 50 % дрожжесывороточной массы, что определяет высо-
кую биологическую ценность продукта. Изменения аминокис-
лотного состава полученного концентрата связаны с особенно-
стями аминокислотного состава белков дрожжей К. marxianus
У-1148. Белки дрожжесывороточного продукта более устой-
чивы к нагреванию, поскольку при высокотемпературной об-
работке белки молочной сыворотки теряют до 80 % лизина, а
белки дрожжей – только 5 %.

6.4 Биоконверсия агропромышленного сырья

в биотопливо
Одним из важных направлений биоконверсии, хотя и оста-
ющихся на сегодняшний день лишь перспективным, является
биоконверсия растительного сырья в биотопливо.

136
 К биотопливу, полученному методами биоконверсии, при-
нято относить биоэтанол, биобутанол и метан.
Биосинтез этанола представляет собой двустадийную кон-
версию крахмалсодержащего сырья, включающую гидролиз
крахмала амилолитическими ферментами или кислотой до ди-
и моносахаров, а также спиртовое брожение.
В некоторых странах Европы и Латинской Америки объем
производимого биоэтанола значителен. Однако в этой связи
возникает проблема исчерпаемости агроресурсов. Огромные
площади используют под посев крахмало- и сахаросодержа-
щих культур: зерновые колосовые культуры, топинамбур, ма-
ниока, сахарный тростник.
Другим направлением биоконверсии с целью получения
топлива является ацетоно-бутиловое брожение (АББ). В этом
случае возможно использовать малоценное сырье и вторичные
сырьевые ресурсы. Синтез биотоплива при АББ осуществля-
ется анаэробными бактериями рода Clostridium. Субстратом
служат непищевые возобновляемые источники сырья: луговые
травы, древесные опилки, иное целюлозосодержащее сырье.
При этом, если сырье подвергнуть предварительному биоката-
лизируемому гидролизу, выход продуктов АББ смещается в
сторону биоэтанола.
Биобутанол, как жидкий энергоноситель, может частично
заменить углеводородное топливо благодаря высокой энерго-
емкости, смешиваемости, высокому актановому числу и низ-
кой летучести. Он щироко используется при производстве
пластика, как эстрагент в пищевой и парфюмерной промыш-
ленности.
Однако экономическая целесообразность такого биосин-
теза низкая. Показано, что в процеccе биоконверсии раститель-
ного сырья микроорганизмом Clostridium acetobutilicum в среде
накапливается бутанола – 8 г/л. Такой выход экономически не-
целесообразен.
Другим направлением биотоплива является производство
метана. Остановимся на этом процессе более подробно. Биогаз,

137
образующийся при метановом сбраживании, предстваляет со-
бой смесь, состоящую из 50–70 % метана, 20–30 % углекислого
газа, примерно 1 % сероводорода.
В процессе анаэробного разложения органического веще-
ства выделяют три основных стадии, которые протекают при
участии трех функциональных групп бактерий.
На первой стадии сложные многоуглеродные вещества,
представляющие собой основные классы органических соеди-
нений (белки, жиры, полисахариды), подвергаются фермента-
тивному гидролизу так называемыми «первичными анаэро-
бами». Одновременно под воздействием микроорганизмов
происходит гидролиз моносахаридов, органических кислот и
спиртов. В результате образуются водород, углекислый газ,
низкомолекулярные жирные кислоты, спирты и некоторые
другие соединения. В осуществлении этой стадии участвуют
анаэробные бактерии рода: Clostridium, Basteroides,
Rumiococcus, Butyri vibrio, а также факультативные: Escherichia
coli, Bacillus.
На второй стадии ацетогенные микроорганизмы, такие как:
Syntrophobacter, Syntrophomonas, Desulfovibrio ферментируют
более сложные вещества в низкомолекулярные органические
кислоты, а также в Н2 и СО2. Ацетогенные бактерии включают
в себя как облигатные, так и факультативные виды. Кроме того,
на этой стадии действуют также гомоацетогенные бактерии,
которые сбраживают одно- и многоуглеродсодержащие соеди-
нения только до уксусной кислоты без образования водорода.
На третьей стадии процесса дальнейший распад органиче-
ских веществ осуществляется метанобразующими и суль-
фатредуцирующими микроорганизмами, использующими для
поддержания своей жизнедеятельности метаболиты, которые
образовались на предыдущих стадиях. На этом этапе в систе-
мах с низким содержанием сульфатов оформируются, главным
образом, СН4 и СО2 и не большое количество H2S.

138
 Метанобразующие бактерии представляют собой физиоло-
гически однородную группу, но характеризуются большим раз-
нообразием морфологических типов, из которых можно выде-
лить четыре основных: палочки, кокки, вибрионы и спириллы.
С биохимической точки зрения метановое брожение пред-
ставляет собой анаэробное «дыхание», в ходе которого элек-
троны из органического вещества переносятся на углекислый
газ, который впоследствии восстанавливается до метана. По-
мимо различных органических субстратов (таких, как уксусная
кислота) донором электронов для метанобразующих бактерий
служит водород, который продуцируется несколькими типами
анаэробных бактерий. Для всех метанобактерий характерны
способность к росту в присутствии водорода и углекислого
газа, а также высокая чувствительность к кислороду и ингиби-
торам производства метана.
Наиболее важным субстратом является ацетат, из которого
при разложении сложных органических веществ образуется бо-
лее 40 % метана.
Метаногенные бактерии 90–95 % используемого углерода
превращают в метан, и лишь 5–10 % углерода переходит в био-
массу. Благодаря этому до 80–90 % органических веществ, раз-
лагающихся в процессе метанового консорциума, превраща-
ется в газ.
Процесс анаэробного брожения различают также по темпе-
ратуре его протекания. Есть три температурных диапазона, при
которых наблюдаются локальные максимумы интенсивности
процесса брожения. Косвенным показателем этой интенсивно-
сти является объем выделяемого биогаза в единицу времени.
Первый температурный режим анаэробного брожения называ-
ется психрофильным. Оно происходит в диапазоне температур
15…25 °C. Второй температурный режим называется мезо-
фильным. Мезофильное брожение происходит в диапазоне
температур 30…40 °C. Третий температурный режим называ-
ется термофильным. Термофильное брожение происходит в
диапазоне температур 50…56 °C.

139
 В каждом более теплом температурном режиме метабо-
лизм бактерий происходит примерно в два раза быстрее, чем в
предыдущем. Соответственно, биогаз выделяется примерно в
два раза быстрее. Но более высокотемпературный процесс ме-
нее устойчив, чем предыдущий. Поэтому самые простые био-
газовые установки работают обычно в психрофильном режиме.
Большие промышленные установки работают обычно в мезо-
фильном режиме.
Нормальная температура тела у млекопитающих на Земле
лежит в диапазоне 35…40 °C. Например, для человека это
36,6 °C. Отсюда становится понятно, почему большинство био-
газовых установок работают в мезофильном режиме при тем-
пературе реакции 37…38 °С.
Бактерии, работающие в двух первых фазах, эффективно
функционируют при температурах психрофильного режима.
Поэтому существует технология двухстадийного анаэробного
брожения, когда реакция происходит в двух последовательно
соединенных емкостях. В первой емкости происходят две пер-
вые фазы анаэробного брожения при температуре 25 °C. Во
второй емкости осуществляются третья и четвертая фазы при
температуре 37…38 °C. Такое решение позволяет оптимизиро-
вать и стабилизировать протекание процесса для некоторых ти-
пов сырья.
Если принять во внимание только значения выхода био-
газа, близкие к максимальным, то такое время будет лежать в
диапазоне двух-четырех недель для мезофильного режима. Это
время зависит от состава исходного сырья и называется дли-
тельностью цикла анаэробного брожения. Если остановить
брожение в конце этого цикла, то в реакторе останется ча-
стично разложенная органика. Обычно глубина разложения ор-
ганики в конце цикла составляет 40–60 %. Это значит, что в ко-
нечном субстрате масса органики составляет 40–60 % от массы
органики в субстрате, которым был изначально заполнен реак-
тор. На такое «недображивание» идут сознательно с целью по-

140
лучения максимальной скорости выхода биогаза и минимиза-
ции размеров биогазовой установки. Схема биогазовой уста-
новки представлена на рисунке 10.

Рисунок 10 – Принципиальная схема биогазовой установки

Обычно биогазовые установки не работают так, как в лабо-

ратории. В них сразу закладывают полную порцию сырья, чтобы
заполнить реактор. Потом, когда реакция начинается и стабили-
зируется, сырье добавляют регулярно небольшими порциями,
одновременно сливая перебродившую массу. Поэтому понятие
длительности цикла для них заменяется понятием «времени гид-
равлического пребывания» в реакторе. Это условная величина,
которая характеризует среднее время, которое проведет в реак-
торе очередная порция свежего субстрата.
Эффективный выход готового продукта в виде метана ха-
рактеризует процесс биоконверсии как экономически целесо-
образный в отличие от процесса синтеза биоэтанола. Однако
как было сказано выше, метановое брожение является термо-
фильным процессом и на определенной стадии требует подве-
дения тепла из вне. Для климатических условий России часть
синтезируемого метана должно сжигаться для подогрева реак-
тора. В этой связи эффективность применения биогазовых
установок оправдана на животноводческих комплексах.

141
6.5 Производство органических удобрений и питательных
грунтов для растений
По оценке специалистов, на животноводческих и птице-
водческих фермах страны получают около 286 млн т навоза и
помета, в том числе: навоза крупного рогатого скота –
217 млн т, свиного – 46 млн т, помета птицы – 17 млн т, навоза
других видов животных – 6 млн т в год.
Большое разнообразие технологий содержания животных,
способов уборки навоза из животноводческих помещений, ти-
пов и мощностей животноводческих ферм и комплексов, кли-
матических условий приводит к получению различного вида
навоза.
Данный вид органики является естественным источником
макроэлементов – азота, фосфора и калия, а также ряда микро-
элементов, таких, как известь, магнезия, сера, хлор и кремний,
необходимых для полноценной жизнедеятельности растений.
В то же время навоз и помет являются потенциальным ис-
точником распространения инфекционных и инвазионных за-
болеваний животных и человека. Кроме того, в навозе содер-
жится большое количество семян сорных растений, которые
наносят значительный экономический ущерб при производстве
продукции растениеводства.
Таким образом, с одной стороны, навоз является ценным
органическим удобрением, а с другой – непосредственное его
использование без предварительной подготовки представляет
серьезную экологическую опасность для окружающей среды,
животных и людей.
Различные исходные свойства получаемого навоза обусло-
вили разработку разнообразных технологий подготовки его к
использованию.
Существует множество методов, которые помогают
быстро изменить структуру свежей органики и улучшить ее по-
требительские качества.

142
 Компостирование. Процесс компостирования имеет есте-
ственное происхождение и заключается в разложении специ-
альными группами аэробных микроорганизмов (находящихся
изначально в любых органических материалах) органической
субстанции компостной смеси.
Для компостирования важно создать оптимальные условия
жизнедеятельности и роста микроорганизмов. К таким усло-
виям относятся:
 соотношение углерода и азота (C : N) в компостируемой
массе;
 гранулометрический состав;
 влажность;
 равномерность смешивания;
 содержание кислорода;
 температура.
Наиболее благоприятным для компостирования является
соотношение C : N в пределах 20 : 1. В навозе оно обычно не
превышает 15 : 1. Компостирование может протекать и при та-
ком соотношении, но при этом неизбежны большие потери
азота в виде аммиака. Поэтому для максимально возможного
сохранения азота навоз перед компостированием необходимо
смешивать с органосодержащими наполнителями (торф, со-
лома, опилки и т. п.). При этом равномерность смешивания ис-
ходных компонентов – не меньше 80 %.
В настоящее время в большинстве случаев компостирова-
ние навоза производят на открытых бетонированных площад-
ках с помощью бульдозеров и погрузчиков путем послойной
укладки навоза и соломы или торфа с последующим перемеши-
ванием компонентов этими же машинами. Вследствие измене-
ния температуры наружного воздуха и выпадения атмосфер-
ных осадков биотермические процессы протекают в компости-
руемой на открытых площадках массе неравномерно, что не га-
рантирует ее стерилизации от патогенной микрофлоры и семян
сорных растений, приводит к большим потерям органического
вещества и общего азота.

143
 Экспресс-компостирование. В настоящее время с использо-
ванием принципа интенсивной аэрации компостной смеси раз-
работаны ускоренные способы компостирования (называемые
также экспресс-компостированием) периодического и непре-
рывного действия.
Получение качественных органических удобрений с задан-
ными свойствами проходит в биореакторах периодического или
непрерывного действия. Биореакторы позволяют осуществлять
процесс обработки в непрерывном режиме, что обеспечивает
стабильную ферментацию, в том числе в зимний период, когда
исходный материал имеет низкую начальную температуру.
Получаемые при этом органические удобрения представ-
ляют собой однородную сыпучую массу (влажность 55–70 %)
темно-коричневого цвета без неприятного запаха, семян сор-
ных растений и патогенной микрофлоры.
Вермикультивирование. В последние годы набирает попу-
лярность органическое земледелие, которое использует методы
натурального возобновления питательных веществ в почве, без
использования химии и минеральных удобрений.
Применять технологию вермикультивирования рекомен-
дуется для получения органических удобрений с улучшенными
свойствами. Главным элементом этой технологии является
навозный червь, продуцирующий в результате переработки
компостов в экологически чистое органическое удобрение –
биогумус (вермикомпост), который содержит в сбалансирован-
ном сочетании комплекс необходимых питательных веществ и
микроэлементов, ферменты, почвенные антибиотики, вита-
мины, гормоны роста и развития растений.
Из всего разнообразия дождевых червей для вермикуль-
туры пригодны только несколько видов:
 навозный червь Eisenia foetida;
 подвиды Е. foetida foetid, foetida andrel;
 обыкновенный дождевой червь (или большой красный
выползок)
 Lumbricus terrestris;

144
  малый красный червь (малый выползок) Lumbricus
rubellus;
 несколько других видов (дендробена Dendrobaena и др.).
Наиболее широко используется в вермикультуре навозный
(компостный) червь E. Foetida.
Черви в результате своей жизнедеятельности выделяют в
окружающую среду значительное количество ферментов, вита-
минов и других биологически активных веществ. Кроме того,
пропуская органический субстрат через пищеварительный
тракт, черви осуществляют своеобразный селективный отбор
микроорганизмов, подавляя одни виды и, напротив, стимули-
руя размножение других. В результате этого состав биогумуса
(продукта вермикультуры), произведенного червями, карди-
нально меняется по сравнению с исходным субстратом. Име-
ются данные, что в биогумусе после прохождения субстрата
через кишечник патогенная фауна и семена сорняков уничто-
жаются на 95–100 %.
Биогумус обладает ценными качествами для ремедиации
загрязненных, рекультивации и реабилитации истощенных
почв. Внесение вермикомпоста улучшает структуру почвы, ее
физико-химические свойства, устойчивость к ветровой и вод-
ной эрозии, сокращает сроки восполнения гумуса и восстанов-
ления плодородия почв. Внесенные гуминовые вещества обес-
печивают процессы микробной деградации органических за-
грязнений необходимой энергией, кофакторами, частично пи-
тательными веществами. В результате повышается деструктив-
ная активность почвенных микроорганизмов, ускоряются про-
цессы разложения различных токсических веществ, попавших
в почву, процессы самоочищения почвенной среды. Гумус, об-
ладающий повышенными сорбционными и связующими свой-
ствами ко многим загрязнениям, включает ПАУ, тяжелые ме-
таллы и радионуклиды, существенно уменьшает их поступле-
ние в растительную сельскохозяйственную продукцию. Напри-
мер, внесение биогумуса в количестве 5–7,5 т/га снижает в

145
почве содержание радионуклидов на 30 % и уменьшает их по-
ступление в растения на 60–70 %.
Ускоренная ферментация с использованием гуматов
Биодобавки используют для ускорения процесса фермен-
тации навозного субстрата при его компостировании.
Применяют гуматы для ферментирования органики следу-
ющим образом – за 2–3 мес до внесения ее в почву (обычно
ранней весной, как только установятся постоянные положи-
тельные температуры) навозный бурт проливают раствором гу-
матов, внося около 10 г биостимулятров на 10 кг навоза. После
проведения процедуры навоз тщательно перемешивают, для
ускорения процессов переработки.
В России зарегистрированы и выпускаются под торговыми
марками «Гуматы» следующие препараты:
 гумат натрия – с содержанием не менее 70 % солей гу-
миновых кислот. Растворимый порошок или гранулы;
 гумат калия – жидкий концентрированный 12%-й вод-
ный раствор;
 гумат калия (хелаты) – жидкий концентрированный
12%-й водный раствор, обогащенный микроэлементами в хе-
латной форме.
Высокотемпературная сушка. Наиболее приемлемым спо-
собом переработки отходов животноводства и птицеводства яв-
ляется в настоящее время конвективная тепловая сушка.
Реализация конвективной сушки проводится в барабанных
сушилка, в вибросушилках с псевдоожиженным слоем и распы-
лительных сушилках. Недостатком такого метода являются
большие экономические затраты на удаление влаги из сырого
помета, содержание влаги в котором при поступлении в сушиль-
ную установку составляет до 80 %. Положительными сторонами
способа переработки методом термической сушки является
практически полная стерилизация продукта в процессе перера-
ботки, получение концентрированного комплексного органиче-
ского удобрения с широким спектром применения, снижение

146
потерь питательных веществ в процессе переработки и хране-
ния, загрязнений окружающей среды, уменьшение потребности
в площадях для хранения готовых удобрений. Получаемые
удобрения удобны для применения и транспортировки.
Технологический процесс получения органических удоб-
рений методом термической сушки состоит из следующих ос-
новных операций: доставка отходов к месту переработки мо-
бильным транспортом, отделение крупных примесей, соб-
ственно высокотемпературная сушка, охлаждение высушен-
ного продукта и отправка его на хранение, очистка выбрасыва-
емых в атмосферу паров и газов.
Гранулирование навоза и помета. Среди современных ме-
тодов переработки отходов животноводства и птицеводства
следует отметить гранулирование навоза и помета птиц. В ре-
зультате применения этого способа получаются спрессованные
гранулы, в которых макро- и микроэлементы содержатся в оп-
тимальном количестве и нормальной влажности. Этот вид ор-
ганического удобрения может быть эффективно использован
для любого вида растения и типа почвы.
Наиболее ценным продуктом гранулирования являются
гранулы, которые изготовлены из птичьего помета. Они легко-
растворимы и содержат питательные вещества, которые хо-
рошо усваиваются растениями. Преимуществом этого способа
является уменьшение объема исходного сырья практически в
10 раз. Питательные вещества, которые содержатся в экскре-
ментах животных и птиц, могут конкурировать с минераль-
ными удобрениями по эффективности использования. С уче-
том того, что на фермах по выращиванию крупного рогатого
скота часто возникает проблема хранения и утилизации навоза
КРС и помета птиц, установки, которые позволяют получить
гранулированный навоз, могут быть эффективны.
Удобрения, полученные технологией гранулирования,
имеют следующие преимущества:
 отсутствует патогенная микрофлора;

147
  в оптимальном количестве содержатся все полезные ве-
щества, необходимые для почвы и питания сельскохозяйствен-
ных культур;
 длительный срок хранения;
 продукт нетоксичен для человека и животных.
Процесс выпуска гранулированного удобрения состоит из
нескольких этапов:
 сушка навоза или помета до влажности 10–12 %;
 измельчение;
 гранулирование;
 охлаждение;
 фасовка готового удобрения.

Контрольные вопросы

1. Сформулируйте определение понятия «биоконверсия».

2. Что такое первичные и вторичные метаболиты?
3. Особенности биоконверсиии.
4. Классификация сырьевых ресурсов.
5. Ферментные системы микроорганизмов.
6. Биоконверсия послеспиртовой барды.
7. Конверсия молочной сыворотки.
8. Биоконверсия агропромышленного сырья в биотопливо.
9. Что такое компостирование и вермикультивирование?
10. Гранулирование помета.

148
 ГЛАВА 7. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ УДОБРЕНИЯ

7.1 Биоудобрения
Микроорганизмы, находящиеся в почве, играют значитель-
ную роль в улучшении ее плодородия. При интенсивных сель-
скохозяйственных процессах происходит значительное сниже-
ние содержания почвенного азота, который выносится вместе с
урожаем. С давних времен для восстановления количества
этого элемента в земле использовали явление диазотрофности,
в результате которого бобовые растения вступали в симбиоз с
азотфиксирующими микробами.
Когда стала известна роль симбиотических бактерий, при-
надлежащих роду Rhizobium, в усвоении атмосферного азота,
стали доступны различные способы внесения микроорганиз-
мов в почву. Они несложны в применении и требуют мало за-
трат, а также позволяют бороться с эрозией.
В настоящее время актуальной проблемой является загряз-
нение экологических ниш сельскохозяйственными удобрени-
ями. Однако использование биоудобрений может решить эту
проблему, так как они являются чистым экологическим про-
дуктом, и позволяют исключить семена растений, сорняков и
вредных микробов.
Общая характеристика биоудобрений
Биоудобрения – это шлам, который образуется в процессе
бескислородного брожения органических веществ. Они ис-
пользуются для повышения качества сельскохозяйственной
продукции, улучшения устойчивости растений к заболеваниям
и вредителям. Растения снабжаются питательными вещества за
счет богатой микрофлоры биоудобрений, которая реализует
природный механизм. При температуре 55 °С погибает абсо-
лютно вся пaтогенная микрофлорa. Аналогичная перспектива
ожидает яйца гeльминтов, семена сорняков утрачивают всхо-
жесть, накапливаются биологически активные соединения.
Биоудобрения высокоактивны даже при невысоких

149
концeнтрaциях и дозaх. Наилучшими дозами внесения био-
удобрений являются 0,5–1 т/га, в результате живая микрофлора
содействует образованию гумуса и улучшению плодородия.
В результате микробиологического процесса развиваются
микроорганизмы, которые способны продуцировать aнтибио-
тические веществa, зaтормaживающие размножение вредных
бактерий, что позволяет снизить применение ядохимикатов.
После удобрительного действия получаемые биоудобрения вы-
ходят на новый качеcтвенный уровень и в силу своих особен-
ных свойств могут не только зaмeнить минeральные aзотно-
фосфорные и кaлийные удобрeния, но и при этом восстановить
плодородие.
Биоудобрения безвредны для жизни людей и животных (4-
й класс опасности). На животноводческих комплексах образу-
ются органические отходы, КПД которых составляет всего
лишь 10–15 % от возможного. При переработке отходов на
биогaзовой установке осуществляется колоссальное улуч-
шeние их свойств. В зависимости от длительности и способа
хранения органические отходы утрачивают от 25–50 % органи-
ческого вещества и питательных элементов. При промерзаниии
наблюдаются еще большие потери со следующим оттаива-
нием – до 70 %.
В настоящее время используется новая энергосберегaющая
технология переработки органических отходов в биоудобрения.
С помощью этой технологии можно получить нaтуральное био-
удобрение, в состав которого входит большое количество мик-
роэлементов и биологически активных веществ.
Распространенные биоудобрения:
– нитрагин – это препарат, в состав которого входят клу-
беньковые бактерии, которые обеспечивают растения азотом.
Подбирается определенный вид культуры;
– азотобактерин – это препарат, в состав которого входят
азотобактерии. Это также богатый источник азота. Но в отли-
чие от нитрагина, он универсален и используется на различных
культурах;

150
 – фосфобактерин – это препарат, в состав которого входят
фосфобактерии. Это поставщик фосфора корням;
– ЭМ-препарат (эффективные микроорганизмы) – в состав
входит несколько разных видов микробов, которые совместно
влияют на растения.
Для биоудобрений, полученных в ходе анаэробного сбра-
живания, характерной чертой является небольшая норма вне-
сения (до 1 т/га).
При внесении необходимо соблюдать следующие условия:
– почва должна содержать достаточно влажности;
– раствор должен вноситься аккуратно, чтобы избежать по-
падания его на растения;
– препарат лучше всего вносить вечером;
Ослабленные растения либо растения, которые недавно по-
садили, не рекомендовано удобрять таким образом, так как они
находятся в ослабленном состоянии.
Азотные бактериальные удобрения. Азот является основ-
ным компонентом атмосферного воздуха, а в почве наблюдается
его дефицит, поскольку он потребляется растениями и микроор-
ганизмами в связанном виде. Для повышения урожайности рас-
тений в почву вносится азот в виде органических и минеральных
удобрений. Ежегодная потребность в минеральных удобрениях
составляет более 100 млн т, в том числе в Республике Беларусь –
около 500 тыс. т.
Бактерии, способные к фиксации азота, развиваются в сим-
биозе с бобовыми растениями (клубеньковые бактерии рода
Rhizobium) либо относятся к свободноживущим (Azotobacter,
Clostridium).
Препараты на основе бактерий рода Rhizobium. Каждый
вид Rhizobium специфичен в отношении небольшого числа ви-
дов растений и не взаимодействует с другими видами, которые
не являются его природными хозяевами (таблица 6).

151
Таблица 6 – Специфичность видов микроорганизмов-азотфиксаторов
в отношении разных растений
Бактерии Растения-хозяева
Rhizobium leguminosarum sabs. trifolli Клевер
Rhizobium leguminosarum sabs. phaseoli Фасоль
Rhizobium leguminosarum sabs. viciae Горох, фасоль
Rhizobium leguminosarum sabs. lupini Люпин
Rhizobium meliloti Люцерна
Bradyrhisobium japonicum Соя

На определенной стадии жизненного цикла бактерии про-

никают в клетки корня растений и формируются корневые клу-
беньки. Внутри них находятся бактерии в форме, не имеющей
клеточной стенки. Они связывают атмосферный азот с помо-
щью фермента нитрогеназы. Внутри клубенька она защищена
от токсического действия атмосферного кислорода. Растения
обеспечивают бактерии необходимыми источниками углерода
и энергии, образующимися при фотосинтезе, а от них получают
связанный азот, регуляторы роста, витамины.
В производстве ризоторфина используют быстрорастущие
клубеньковые бактерии (БРКБ) – симбионты фасоли, гороха,
клевера и медленнорастущие (МРКБ), развивающиеся в симби-
озе с люпином и соей.
Препарат на основе свободноживущих азотфиксаторов.
Доказано, что при использовании азотобактерина рост расте-
ний стимулируется не только фиксацией азота, но и способно-
стью культуры продуцировать биологически активные веще-
ства, прежде всего, витамины группы В.
Проблемы и перспективы производства азотных бактери-
альных удобрений. При фиксации атмосферного азота побоч-
ной реакцией является восстановление нитрогеназой Н+ до Н2,
в ходе которого расходуется энергия аденозинтрифосфата
(АТФ). В результате только 40–60 % потока электронов, прохо-
дящих через нитрогеназный комплекс, передается на N2, что зна-
чительно уменьшает эффективность процесса фиксации азота.
Если попытаться блокировать побочную реакцию, изменив

152
структуру фермента, то вследствие особенностей строения нит-
рогеназы происходит уменьшение ее активности.
Вторая проблема заключается в том, что созданные путем
мутагенеза и последующего отбора активные азотфиксаторы не
выдерживают конкуренции с природными штаммами в процессе
формирования клубеньков на корнях растений-хозяев.
Фосфорные бактериальные удобрения. Ионы фосфата в
почве малоподвижны, и довольно часто вблизи корневой зоны
растений обнаруживается дефицит фосфора. Внутри и вокруг
мелких корешков растений в результате заражения почвен-
ными непатогенными грибами (семейства Endogonaceae) фор-
мируются особые структуры – везикулярно-арбускулярная ми-
кориза. Возникает симбиоз между растениями и грибами.
Гифы микоризы распространяются далеко за пределы корне-
вой системы растения и доставляют корням фосфат-ионы и
микроэлементы. Микориза обнаружена у большинства видов
культурных растений. Установлено, что в таких растениях
выше концентрация гормонов роста. Формирование микоризы
зависит от типа почвы, условий, температуры, для ускорения
ее создания можно проводить инокуляцию растений выделен-
ными спорами, инфицированной почвой или корнями растений
с микоризой.
На основе бактерий Bacillus megatherium var. phosphaticum
получают препарат фосфобактерин. Это спорообразующие, па-
лочковидные бактерии, способные переводить минеральные
фосфаты и фосфорорганические соединения в доступные для
растений формы. Получение препарата на основе бактерий ана-
логично получению нитрагина и азотобактерина.

7.2 Биоудобрения на основе азотфиксирующих

микроорганизмов
Для улучшения азотного питания растений в настоящее
время разработаны и применяются следующие разновидности
микробных удобрений, основанные на четырех известных
группах азотфиксирующих микроорганизмов:

153
 – биопрепараты на основе ризосферных диазотрофов (ас-
социативные азотфиксаторы);
– азотобактерин представляет собой препарат бактерий р.
Azotobacter (несимбиотические свободноживущие азотфикса-
торы);
– нитрагин и его аналоги представляют собой препараты
клубеньковых бактерий р. Rhizobium под бобовые культуры
(симбиотические азотфиксаторы);
– биопрепараты на основе папоротника Azolla в симбиозе с
цианобактериями.
Экспериментально установлено, что азот, фиксированный
микроорганизмами, полностью усваивается растениями, в то
время как азот минеральных удобрений – всего половина.
Кроме того, биологический азот практически бесплатный, так
как бактерии для осуществления азотфиксации используют
энергию органических веществ, синтезированных растениями
в процессе фотосинтеза.
В мировой практике биоудобрения применяются доста-
точно широко, и количество поступающего в почву минераль-
ного и биологического азота вполне сопоставимо. Например, в
Великобритании с минеральными удобрениями в почву еже-
годно вносят около 1,6 млн т азота. Бобовые растения при этом
обеспечивают поступление почти 0,5 млн т азота. В США с ми-
неральными удобрениями в почву поступает 9,4 млн т азота, а
бобовые растения привносят 8,7 млн т.
Биопрепараты и биоудобрения представлены большей ча-
стью российскими производителями. Импорт биопрепаратов в
Россию незначителен и не превышает 4 %, что создает хорошие
возможности для наращивания данного направления силами
российских производителей. Например, уже сейчас потенци-
ально российские ВНИИ могут нарабатывать до 90 % мирового
ассортимента энтомофагов. Успешное применение средств
биологической защиты российского производства в современ-
ных тепличных комплексах достигает 100 %. Слабым местом

154
рынка биопрепаратов является то, что 98 % приходится на био-
фунгициды с одними и теми же действующими веществами,
также фальсификат и отсутствие контроля за незарегистриро-
ванными препаратами. Биогербициды пока отсутствуют на оте-
чественном рынке.
Биоудобрения ни основе симбиотических
азотфиксаторов р. Rhizobium
Положительное влияние бобовых растений на плодородие
почвы известно довольно давно. Еще греческий философ Тео-
фраст, живший в третьем столетии до н. э., в своей работе «Ис-
следования о растениях» писал о том, что бобовые растения
лучше всего восстанавливают почву. В Фессалии и Македонии
бобовые запахивали в землю в качестве зеленого удобрения.
Древние римляне включали бобовые в севообороты с зерно-
выми культурами. Однако научное обоснование пользы, при-
носимой бобовыми растениями, было получено сравнительно
недавно – в конце IX в.
В 1838 г. французский ученый Буссенго высказал впервые
идею о возможности фиксации азота из атмосферы. Однако эту
роль он приписывал самим растениям. Впоследствии из-за не-
правильно поставленного эксперимента с семенами бобовых
растений, высаживаемых в прокаленный песок, он отказался от
своих первоначальных выводов.
Вновь к этой идее вернулись уже в 1886 г. немецкие ученые
Хельригель и Вильфарт, обнаружившие в тканях клубеньков
клетки бактерий. В 1866 г. почти за 20 лет до этого русский
ученый М. С. Воронин также наблюдал клубеньковые бакте-
рии. В чистую культуру эти микроорганизмы были выделены и
морфологически описаны в 1888 г. М. Бейеринком. При этом
была окончательно доказана их роль в фиксации атмосферного
азота.
Почти сразу после открытия клубеньковых бактерий рас-
сматривалась идея возможности их использования для усиле-
ния азотфиксации бобовыми культурами. Первый препарат

155
клубеньковых бактерий под названием «Нитрагин» был изго-
товлен в 1896 г. в Германии и представлял собой измельченные
клубеньки в смеси с почвой.
Клубеньковые бактерии образуют прочный симбиоз с бо-
бовыми культурами, заражая корни растений и посе- ляясь
внутри образовавшихся вздутий – клубеньков. В ризосфере не-
бобовых растений за редким исключением клубеньковые бак-
терии не размножаются. Кроме того, симбиоз обычно отлича-
ется строгой специфичностью, т. е. каждому виду растений со-
путствует определенный набор штаммов ризобий. При этом ви-
довое название бактериям обычно дается по растению- хозяину
(Rh. lupini, Rh. rifoli).
Специфичность симбиоза между клубеньковыми бактери-
ями и бобовыми растениями обусловлена выделением корнями
бобовых особых белков – лектинов, которые играют ключевую
роль в адгезии клеток бактерий на поверхности корня. При
этом адгезия осуществляется по иммунному принципу «анти-
ген-антитело», когда макромолекулы на поверхности корне-
вого волоска и клеточные оболочки ризобий сшиваются друг с
другом как замок-молния при помощи связующего компо-
нента – белка лектина. Он бивалентен и одним концом соеди-
няется с полисахаридами поверхности корневого волоска, а
другим – с полисахаридами капсулы ризобий, которые, веро-
ятно, идентичны. Таким образом, лектин, вырабатываемый
определенным видом бобовых, присоединит клетки только тех
штаммов ризобий, полисахаридная оболочка которых иден-
тична оболочке корневого волоска и подойдет к лектину, как
ключ к замку.
После адгезии клеток ризобий на поверхности корневого
волоска последний начинает закругляться, образуя на месте из-
гиба пространство для размножения бактерий. При этом они
начинают формировать инфекционную нить – тонкий, запол-
ненный слизью канал, пронизывающий ткани корня и спо- соб-
ствующий свободному проникновению бактерий. Встретив на

156
своем пути тетраплоидные клетки коры корня, ризобии начи-
нают активно размножаться, вызывая вздутие оболочек. Кроме
того, бактерии одновременно стимулируют деление клеток са-
мого корня. В результате на поверхности инфицирован-ных
корневых волосков формируются вздутия, которые называ-
ются клубеньками.
Уровень накопления азота клубеньковыми бактериями в
симбиозе с бобовыми растениями колеблется в зависимости от
вида растения. Например, соя обеспечивает 57–152 кг/га азота;
кормовые бобы 326–648; горох 69–85; люцерна 128–300; кле-
вер 98–220.
Биоудобрения на основе несимбиотических
азотфиксаторов р. Azotobacter
Помимо клубеньковых бактерий в почве обитает большое
количество так называемых свободноживущих азотфиксирую-
щих микроорганизмов, способных связывать азот атмосферы
вне контакта с клетками корня растений. Однако наибольший
практический интерес среди них вызывают бактерии
р. Azotobacter.
На основе Az. chroococcuin в 20-е гг. был создан первый
бактериальным препарат «Азотобактерин». Однако результаты
полевых испытаний нового удобрения оказались весьма неод-
нозначными, так как положительный эффект от применения
азотобактерина оказался нестабильным. В большинстве слу-
чаев прибавка урожая при использовании препарата не превы-
шала 10 %, что находится в пределах систематической ошибки
полевого опыта. Это привело к тому, что в 70-е гг. препарат
азотобактерин был снят с промышленного производства в Со-
ветском Союзе.
Однако за рубежом исследования продолжались и пока-
зали возможность получения штаммов, способных фиксиро-
вать до 13–15 кг/га азота на пастбищах и до 22–25 кг/га азота
на пашне. Проблемы, возникающие при использовании азото-

157
бактерина, обусловлены в основном тем, что он весьма требо-
вателен к условиям среды. Например, он плохо переносит от-
клонения от нейтральной реакции почвенного раствора, а тем-
пературный оптимум лежит в пределах 25…30 °С. Кроме того,
азотобактер нуждается в достаточном количестве органиче-
ского вещества. Поэтому его применение, как правило, обеспе-
чивает положительный эффект только при его внесении по
фону органических удобрений, таких как навоз, солома или
разнообразные компосты. Кроме того, хорошо зарекомендо-
вало себя применение азотобактерина в условиях защищенного
грунта на богатых органических субстратах. При этом бактери-
зация семян овощных культур увеличивает урожай на 20–30 %
и ускоряет его созревание.
В настоящее время установлено, что положительный эф-
фект от применения азотобактерина в основном обусловлен
продуцированием азотобактером большого количества биоло-
гически активных веществ, таких как витамины группы В, пан-
тотеновая и никотиновая кислоты, биотин, пиридоксин, гетеро-
ауксииы и гибберелины, придающих препарату свойства сти-
мулятора роста растений. Внесение азотобактерина способ-
ствует заметному увеличению содержания в плодах аскорбино-
вой кислоты. Кроме того, еще Е. Н. Мишустиным было дока-
зано продуцирование азотобактером фунгицидных веществ из
группы анисомицина с широким спектром воздействия.
С бактериями р. Azotobacter широко ведутся работы по се-
лекции новых активных штаммов с заданными свойствами. Так
как природные расы азотобактера не способны колонизировать
поверхность корней растений, методами генной инженерии
был создан штамм К-азотобактера, несущий трансмиссивную
плазмиду с широким кругом хозяев. Клетки этого штамма вно-
сили в ризосферу определенного вида растений, и после их дли-
тельного культивирования отбирали изоляты, плотно связан-
ные с ризопланой. Таким образом, были получены штаммы азо-
тобактера, адаптированные к корням ячменя и томатов. Бакте-

158
ризация растений новыми штаммами обеспечила 40%-ю при-
бавку урожая. На основании штамма К для окультуренных ого-
родных почв и тепличных грунтов был разработан новый пре-
парат на торфяной основе под названием «Ризофил».
Биопрепараты на основе ассоциативных
азотфиксаторов (ризосферных и филосферных диазотрофов)
Азотфиксируюшие микроорганизмы представляют собой
обширную и разнообразную по своим свойствам группу, в ко-
торой особое внимание уделяют бактериям, способным усваи-
вать азот атмосферы посредством ассоциативных связей с кор-
невой системой или наземной вегетативной частью растений
злаковых, пасленовых и других семейств.
Широко развернувшиеся в последние два десятилетия ис-
следования позволили установить обширность ареала распро-
странения этих микроорганизмов и их большое значение в по-
полнении азотом природных экосистем. В настоящее время
уже выявлено около 50 видов диазотрофов, относящихся к
12 семействам. Наиболее активные представители принадле-
жат к родам: Azospirillum, Bacillus, Beijerinkia, Clostridium,
Corinebacterium, Enterobacter, Klebsiella, Pseudomonas и др.
Способность фиксировать молекулярный азот и наличие
нитрогеназного комплекса у Azospirillum были доказаны в
1975 г. бразильцем Доберейнером. В настоящее время среди
диазотрофов бактерии рода Azospirillum являются наиболее
изученными микроорганизмами из-за своей широкой распро-
страненности в почвах всех климатических поясов. Темпера-
турный оптимум для азоспирилл составляет примерно
25…30 °С, но развиваться и фиксировать азот они могут в ши-
роком диапазоне температур – 0…40 °С.
В отличие от азоспирилл клебсиелла и энтеробактер в ос-
новном распространены в почвах умеренных широт. Они могут
фиксировать азот атмосферы в диапазоне температур 10…30 °С
с оптимумом при 20 °С. Поэтому данные микроорганизмы

159
практически никогда не выделяются из почв тропического ре-
гиона.
Развитие ассоциативных азотфиксаторов может происхо-
дить в широком интервале pH среды – от 5,5 до 8,0. Оптимум
для каждого вида бактерий свой.
Азоспириллы в условиях жаркого климата в основном об-
разуют ассоциации с зерновыми культурами – пшеницей, ри-
сом, кукурузой и др., а в зоне умеренных широт – со злаковыми
травами (овсяницей и тимофеевкой).
Биопрепараты на основе цианобактерий
Цианобактерии (сине-зеленые водоросли) широко распро-
странены как в водоемах, так и в почвах. Ареал их распростра-
нения, не ограничиваясь тропическим и субтропическим поя-
сом, простирается на регионы с умеренным климатом. Среди
цианобактерий выделено около 40 видов, способных к азотфик-
сации. В почве сине-зеленые водоросли локализованы в верх-
нем 5-сантиметровом слое.
Согласно данным английских исследователей сырая масса
водорослей на пшеничном поле может достигать 80 г/м. При
такой биомассе за год они в среднем смогут накапливать азота
около 25–30 кг/га. А иногда после сильных дождей особенно в
конце лета цианобактерии фиксируют до 1–2 кг/га в сутки.
В областях с умеренным климатом наибольшее распро-
странение имеют сине-зеленые водоросли р. Nostoc. Исследо-
вания ведутся с представителями различных родов, но пре-
имущественно с цианобактериями родов Anabaena, Nostoc,
Cylindrosporum, Tolypothryx и Aulosura.
На интенсивность азотфиксации цианобактериями влияют
те же факторы, что и у других азотфиксаторов: температура,
влажность, pH, уровень освещения и т. д. Лучше всего водо-
росли развиваются при 100%-й влажности от ПВ и слабоще-
лочной реакции среды (pH не менее 7,0). По отношению к тем-
пературе различают холодоустойчивые и теплолюбивые виды.

160
Даже для холодоустойчивых видов оптимальные значения тем-
пературы не опускаются ниже 20 °Т. Для большинства циа-
нобактерий температурный оптимум колеблется в пределах
25…30 °С.
Цианобактерии, как большинство азотфиксирующих мик-
роорганизмов, негативно реагируют на внесение минерального
азота. Применение органических азотных удобрений иногда
стимулирует рост цианобактерий. Внесение соломы и других
целлюлозосодержащих субстратов усиливает рост цианобакте-
рий и их азотфиксирующую способность более чем в 3 раза.
Положительно реагируют сине-зеленые водоросли на внесение
фосфорных удобрений.
Отношение к пестицидам и другим средствам химизации у
разных видов цианобактерий неодинаково. Например,
Anabaena очень чувствительна к большинству пестицидов, а
вот Tolypothryx и Aulosura довольно устойчивы к широкому
спектру пестицидов.

7.3 Комплексные биоудобрения

Многолетние исследования по бактеризации сельскохозяй-
ственных культур свидетельствуют о том, что применение бак-
териальных удобрений далеко не всегда обеспечивает положи-
тельный эффект. Для более точного прогнозирования результа-
тов бактеризации растений необходимо учитывать следующие
важные факторы:
– уровень питательных элементов в почве;
– состояние микробного сообщества почвы.
Многолетняя практика бактеризации свидетельствует о
том, что применение азотобактера и монокультуры ассоциа-
тивных диазотрофов на бедных почвах часто бывает неэффек-
тивно, а иногда приводит к снижению урожайности.
Причины не всегда эффективного применения бактериза-
ции почвы должны рассматриваться в комплексе. Успешно
проведенная бактеризация растений азотфиксирующими мик-

161
роорганизмами в любом случае приводит к усилению азотфик-
сации. Однако известно, что растение удовлетворяет свои по-
требности в азотном питании за счет азотфиксации только на
20–30 %. Остальные 70–80 % оно должно получить из почвы.
Поэтому при существенном дефиците азота в почве 20 % азота,
получаемого за счет азотфиксации, для растения не достаточны.
Кроме того, бактерии сами нуждаются в источниках азот-
ного питания и при недостатке азота в почве существенную фик-
сированного ими азота используют для удовлетворения соб-
ственных потребностей, усваивая к тому же корневые выделе-
ния растений – продукты фотосинтеза. Таким образом, симбио-
тические отношения между интродуцированными клубенько-
выми бактериями и растением-хозяином на бедных почвах и при
резком дефиците азота могут перейти в отношения конкуренции
за субстрат. Поэтому при внесении в почву бактериальных пре-
паратов на основе азотфиксируюших бактерий необходимо
обеспечить в нем минимальный уровень азотного питания. Од-
нако делать это нужно осторожно, так как при передозировке
азотных минеральных удобрений интродуцированные азотфик-
сируюшие бактерии переходят на субстратный тип азотного пи-
тания, менее энегроемкий, чем азотфиксация, и бактеризация
растений в этом случае теряет всякий смысл.
Ситуация усугубляется, если наряду с азотом в почве имеет
место недостаток фосфора. В этом случае можно ожидать пря-
мой конкуренции интродуцированных азотфиксаторов с расте-
нием за фосфор. Это часто приводит к снижению урожайности
при использовании бактериальных удобрений на основе моно-
культуры на бедных почвах без внесения органических удоб-
рений.
По этой причине в последнее время стали переходить на
применение одновременно нескольких бактериальных удобре-
ний, т. е. на комплексное их использование. Наиболее эффектив-
ным является совместное применение азотфиксирующих и фос-
фатмобилизующих микроорганизмов, так как при этом частично

162
устраняется конкуренция между азотфиксаторами и растением-
хозяином за источники фосфатного питания.
Двойная инокуляция клубеньковыми бактериями и мико-
ризой обеспечила увеличение урожая люцерны в 2 раза, тогда
как только микоризация – в 1,5 раза.
Хорошие результаты были получены при инокуляции пре-
паратами фосфатмобилизующих бактерий, такими как агро-
фил, флавобактерин, ризоагрин совместно с азотобактерином
котовника кошачьего – эфиромасличной культуры из семей-
ства губоцветных, масло которого используется в медицине и
парфюмерной промышленности. При этом наибольшую при-
бавку урожая (25–30 %) обеспечило комплексное применение
азотобактерина с флавобактерином. Кроме того, было заме-
чено, что комплексное использование бактериальных удобре-
ний приводит к более заметному снижению содержания нитра-
тов в продукции. Например, при обработке котовника только
одним «экстрасолом» (препаратом на основе бактерий
р. Pseudomonas) количество нитратов, по сравнению с контро-
лем, снизилось на 15 %, а при совместной инокуляции с азото-
бактерином – на 18–20 %.
Помимо обеспечения необходимого минимума элементов
питания в почве вторым важным моментом при бактеризации
является состав микробного сообщества самой почвы. Напри-
мер, в почве при интенсивном возделывании одной и той же
культуры в течение ряда лет обычно наблюдается снижение ви-
дового разнообразия микроорганизмов и доминирование гри-
бов с ярко выраженными фитопатогенными свойствами. Это
явление называется «почвоутомлением». Длительное примене-
ние минеральных удобрений еще более усугубляет ситуацию.
В таких случаях интродукция в почву любого сапрофитного
микроорганизма или комплекса микроорганизмов в составе ка-
кого-либо органического удобрения приведет к расширению
видового разнообразия микробиоценоза почвы и снижению
значимости в структуре микробного сообщества нежелатель-

163
ных патогенных популяций (например, фитопатогенных гри-
бов). Их доля резко сократится, а соответственно уменьшится,
причиняемый ими ущерб.
В этом случае положительный эффект при внесении бакте-
риального удобрения достигается не столько за счет прямого
воздействия на растение (например, усиления азотфиксации
при внесении клубеньковых бактерий), а посредством улучше-
ния общей микробиологической обстановки в прикорневой
зоне растений. Поэтому на почвах с ярко выраженными при-
знаками почвоутомления более эффективным и экономически
оправданным будет внесение органических компостов.
Таким образом, эффективность микробных удобрений в
значительной степени определяется структурными особенно-
стями микробного сообщества почвы в целом, а для повышения
уровня биоразнообразия целесообразно применять не отдель-
ные виды микроорганизмов, отвечающих за какую-то одну
функцию, например азотфиксацию или фосфатмобилизацию, а
целый комплекс микроорганизмов. Причем перспективность
той или иной комбинации микроорганизмов можно определить
по результатам почвенных популяционных исследований.
Например, установлено, что при наличии в почве эндофита
Glomus niosseae одновременно растет численность и актив-
ность азоспирилл и псевдомонад. Следовательно, между дан-
ными микроорганизмами отсутствует антагонизм. Поэтому
можно предположить об эффективности комплексного препа-
рата на их основе, совмещающего функции, присущие мико-
ризе (т. е. фосфатмобилизацию), азотфиксаторам и агентам
биоконтроля псевдомонадам – антагонистам патогенной мик-
рофлоры
Клубеньковые бактерии и азоспириллы не всегда ужива-
ются в одном объеме почвы, и комплексные препараты на их ос-
нове часто бывают неэффективными. Поэтому при создании
комплексных бактериальных удобрений сначала в лаборатор-
ных условиях выделяют природные ассоциации микроорганиз-

164
мов из почвы, а затем проводят отбор наиболее активных штам-
мов по заданным свойствам.
По такому принципу, наряду с уже перечисленными приме-
рами комплексных биоудобрений, был создан так называемый
грунт АМБ. Препарат АМБ был разработан в 40-е гг. коллекти-
вом сотрудников Всероссийского института сельскохозяй-
ственной микробиологии под руководством А. М. Лазарева. Он
рекомендуется к использованию на торфяно-болотных и дер-
ново-подзолистых почвах для активации микробиологической
минерализации перегноя с целью улучшения корневого питания
растений при недостатке минеральных удобрений.

Контрольные вопросы
1. Характеристика биоудобрений.
2. Азотные бактериальные удобрения.
3. Биоудобрения на основе азотфиксирующих микроорга-
низмов.
4. Биопрепараты на основе цианобактерий.
5. Фосфорные удобрения растений.
6. Комплексные удобрения.

165
 ГЛАВА 8. ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ

8.1 Экологическая биотехнология как наука

В классическом понимании под термином «биотехноло-
гия» понимается наука о методах и технологиях производства
различных ценных веществ и продуктов с использованием при-
родных биологических объектов (микроорганизмов, раститель-
ных и животных клеток), частей клеток (клеточных мембран,
рибосом, митохондрий, хлоропластов) и процессов.
Биотехнологические процессы известны с давних времен,
когда человек начал выпекать хлеб, производить вино и пиво,
а также заниматься другими видами деятельности, связанными
с приготовлением пищи.
Только благодаря работам французского ученого, осново-
положника современной микробиологии и иммунологии Луи
Пастера (1822–1895 гг.), биотехнология начинает существовать
как самостоятельная наука.
Термин «биотехнология» впервые предложил венгерский ин-
женер Карл Эреки (1917 г.), когда описывал производство сви-
нины (конечный продукт) с использованием сахарной свеклы
(сырье) в качестве корма для свиней (биотрансформация).
Под биотехнологией К. Эреки понимал «все виды работ, при
которых из сырьевых материалов с помощью живых организмов
производятся те или иные продукты». Все последующие опре-
деления этого понятия – всего лишь вариации классической
формулировки К. Эреки.
Активное развитие молекулярной биологии и генетики
началось в ХХ в. благодаря достижениям в таких науках, как
физика и химия. Начиная с 1970-х гг. активно развивались ген-
ная и клеточная инженерии, благодаря которым в биотехноло-
гии начался новый этап становления. Так, обычное производ-
ство спирта в процессе брожения – это «старая» биотехноло-
гия, но использование в этом процессе дрожжей, улучшенных
методами генной инженерии с целью увеличения выхода
спирта, – «новая» биотехнология.

166
 В целом биотехнология изучает способы, с помощью кото-
рых возможны преобразования природной среды, окружающей
человека, и методы, которые позволяют провести изменения,
основываясь на его потребностях с помощью биологических
объектов, включенных в технологические процессы.
Современная биотехнология – это направление, в котором
изыскиваются пути промышленного применения биологиче-
ских агентов и процессов. В основе биотехнологии лежит прин-
цип использования микроорганизмов с целью получения но-
вых продуктов, позволяющих решить актуальные проблемы
для человека.
Основная цель биотехнологии – это разработка методов и
приемов, позволяющих получать биологически активные соеди-
нения, а также конструировать молекулы новых веществ и со-
здавать новые формы организмов, отсутствующие в природе.
Биотехнология решает следующие задачи:
– поддержание и активация путей клеточного обмена, при-
водящих к накоплению целевых продуктов и ингибированию
других реакций обмена у культивируемого организма;
– получение клеток или их составных частей (в первую
очередь ферментов) для направленного изменения сложных
молекул (например, рестриктазы, изомеразы и т. д.);
– углубление и совершенствование методов генетической
и клеточной инженерии для получения ценных результатов
в фундаментальных и прикладных разработках;
– создание безотходных и экологически безопасных био-
технологических процессов;
– совершенствование и оптимизация аппаратурного
оформления биотехнологических процессов для повышения
выхода целевых продуктов;
– повышение технико-экономических показателей биотехно-
логических процессов по сравнению с существующими.
Классификация биотехнологических процессов
1. Классификация по уровню организации биотехнологи-
ческих процессов: макроуровень (уровень аппаратурного

167
оформления биотехнологического процесса); микроуровень
(уровень, соответствующий применяемому в технологическом
процессе биообъекту).
2. Классификация по применяемому объекту:
По типу применяемого биообъекта: одноклеточные (моно-
культуры и ассоциации), культуры клеток и тканей, органеллы
клеток, ферменты.
По степени усовершенствования применяемого биообъ-
екта: стихийно возникающие биоценозы микроорганизмов, чи-
стые культуры, мутанты, иммобилизованные ферменты и
клетки, клеточные культуры многоклеточных организмов,
генно-инженерные штаммы.
3. Классификация по типу процесса, который преобладает:
биосинтез, деструкция и трансформация.
4. Классификация процессов, применяемых в биотехноло-
гии, по масштабу: мелкомасштабные, среднемасштабные,
крупномасштабные.
5. Классификация по технологиям, применяемым в процес-
сах: поверхностные и глубинные, периодические и непрерыв-
ные, аэробные и анаэробные.
6. Классификация процессов биотехнологии в зависимости
от истории появления и их сложности:
– процессы, включающие переработку продуктов питания
(приготовление напитков, хлебопечение);
– бродильные производства, которые позволяют получить
большое количество органических кислот, растворителей, а
также органическое сырье (производство в условиях, не явля-
ющихся стерильными);
– биотехнологические процессы, проводимые с применением
оборудования специального назначения (для очистки загрязнен-
ных сточных вод, обеспечения обезвреживания отходов произ-
водства, при этом описанные процессы главным образом исполь-
зуются в сфере экологии (при нестерильных условиях);
– производство в промышленных условиях биологической
массы, применимой как для кормовых, так и для технических

168
целей (при необязательном соблюдении стерильности условий,
в которых проводится процесс, необходимо применение специ-
ального оборудования);
– производство биомассы микробов в асептических условиях;
– получение метаболитов микробного происхождения с
намерением получить антибиотики, ферменты, органические
кислоты, полисахариды и т. д. (высокие требования условиям
стерильности, необходимость сложного оборудования для того,
чтобы получить и очистить целевой продукт);
– применение иммобилизованных клеток или ферментов;
– биотрансформация веществ органического происхождения;
– культивирование клеток, являющихся частями многокле-
точного организма (например, клональное размножение);
– использование микробиологических процессов в нетра-
диционных областях биологии ( выщелачивание металлов, обо-
гащение руд, удаление метана из шахт, повышение нефтеот-
дачи пластов).
Применение биотехнологических методов и приемов ока-
зывает благоприятное воздействие на различные производства,
в частности:
– химическая промышленность: использование биокатали-
заторов для синтеза новых соединений, уменьшения количе-
ства побочных продуктов и повышения степени очистки про-
дукции;
– производство пластмасс: снижение количества использу-
емой для производства пластмассы нефти за счет перехода на
экологически чистый, изготовленный из сельскохозяйствен-
ного сырья: кукурузы или сои;
– бумажная промышленность: повышение эффективности
производственного процесса, в том числе за счет ферментов,
снижающих количество токсичных побочных продуктов;
– текстильная промышленность: снижение образования
токсичных побочных продуктов. Повышение качества фабрич-
ных детергентов за счет добавления ферментов;

169
 – пищевая промышленность: улучшение процессов хлебо-
печения, использование получаемых с помощью ферментации
консервантов;
– промышленное животноводство: применение ферментов
для повышения усвояемости питательных веществ и снижения
выделения соединений фосфора в окружающую среду;
– энергетическая промышленность: использование фер-
ментов для создания экологически чистого топлива из сельско-
хозяйственных отходов.
Одним из актуальных направлений является экологическая
биотехнология, в основе которой подразумевается применение
живых организмов, используемых для переработки опасных от-
ходов и борьбы с загрязнением окружающей среды.
Экологическая биотехнология подразумевает использова-
ние живых организмов для переработки опасных отходов и
борьбы с загрязнением окружающей среды, переработки раз-
личных отходов, комплексного применения биологических ме-
тодов очистки и химических, физико-химических технологий,
а также создание «дружественных природе» способов получе-
ния пищи, энергии, минерального сырья и пр.
Методы экологической биотехнологии обеспечивают более
эффективное по сравнению с традиционными подходами обез-
вреживание разнообразных токсических отходов. Используе-
мые методы в значительной степени снижают зависимость от
сжигания мусора, и создания хранилищ токсических отходов.
К сфере экологической биотехнологии относятся следую-
щие основные направления:
– биологическая очистка сточных вод;
– биообработка твердых отходов (утилизация ила сточных
вод, переработка ТБО, обезвреживание и ликвидация опасных
промышленных отходов);
– биологическая очистка воздуха от ароматических ве-
ществ;
– биодеградация ксенобиотиков в окружающей среде;

170
 – биологическая рекультивация почв, загрязненных отхо-
дами производства органических химических веществ и
нефтью;
– обеспечение возобновляемыми источниками энергии и
сырья на основе органических отходов и биомассы (получение
биогаза и других видов вторичного топлива, трансформация
органических удобрений и др.);
– создание безопасных и эффективных средств биологиче-
ской борьбы с болезнями и вредителями сельскохозяйственных
культур, альтернативных химическим пестицидам.

8.2 Биологическая очистка сточных вод

Загрязнение вод проявляется в изменении физических и
органолептических свойств, увеличении содержания сульфа-
тов, хлоридов, нитратов, токсичных тяжелых металлов, сокра-
щении растворенного в воде кислорода, появлении радиоак-
тивных элементов, болезнетворных бактерий и других загряз-
нителей.
Чтобы сточные воды не загрязняли окружающую среду,
перед их сбросом необходимо выполнять процедуру очищения.
Для самоочищения той или иной системы понадобится время,
вода, бактерии и кислород. Эти методы стали использоваться
для обеззараживания сточных вод.
В сточных водах содержатся различные примеси, коллоид-
ные и грубодисперсные частицы, минеральные, органические,
биологические вещества. Для того чтобы сточные воды не ока-
зывали негативного влияния на экологию, необходимо прово-
дить их очистку, главная задача которой состоит в обеззаражи-
вании, осветлении, дегазации, дистилляции и умягчении.
Очистка сточных вод, загрязненных различными химическими
веществами, производится разными способами: механические,
химические, физико-химические и биологические.
Основными источниками загрязнения гидросферы явля-
ются: промышленные сточные воды, хозяйственно-бытовые

171
сточные воды, дренажные воды с орошаемых земель, сельско-
хозяйственные поля и крупные животноводческие комплексы,
водный транспорт.
Виды загрязнения воды:
Наиболее опасно содержание в воде радиоактивных ве-
ществ даже в малых концентрациях.
Механическое загрязнение характеризуется попаданием в
воду различных механических примесей (шлам, песок, ил и
др.), которые могут значительно ухудшать органолептические
показатели.
Тепловое загрязнение связано с повышением температуры
природных вод в результате их смешивания с технологическими
водами. Температура сточных вод ТЭС, АЭС выше температуры
окружающих водоемов на 10 °C. При повышении температуры
происходит изменение газового и химического состава воды,
что ведет к размножению анаэробных бактерий, выделению ядо-
витых газов – Н2S, СН4. Происходит цветение воды, ускоренное
развитие микрофлоры и микрофауны.
Загрязнители сточных вод подразделяются на три группы:
1) биологические: микроорганизмы – вирусы, бактерии;
растения – водоросли; дрожжи, плесневые грибки;
2) химические: наиболее распространенными загрязните-
лями являются нефть и нефтепродукты, СПАВ, пестициды, тя-
желые металлы, диоксины, фенолы, аммонийный и нитритный
азот и др.;
3) физические: радиоактивные элементы, взвешенные
твердые частицы, шлам, песок, ил, тепло и др.
Загрязняющие примеси могут быть органическими и мине-
ральными, растворимыми и нерастворимыми, ядовитыми и не-
ядовитыми.
Оценка качества водных ресурсов
Состав и свойства воды водотоков и водоемов в местах хо-
зяйственно-питьевого, коммунально-бытового и рыбохозяй-
ственного водопользования оценивают физическими, химиче-

172
скими и санитарно-биологическими показателями. К физиче-
ским показателям относят: температуру, содержание взвешен-
ных веществ (мутность), окраску, запах, привкус и др. Химиче-
ский состав воды характеризуют ионным составом, жесткостью,
щелочностью, окисляемостью, активной концентрацией водо-
родных ионов (pH), сухим остатком, общим солесодержанием,
содержанием растворенного кислорода, свободной углекис-
лоты, сероводорода, активного хлора и др. Основными сани-
тарно-биологическими показателями качества воды являются
коли-титр (коли-индекс), общее микробное число, наличие па-
тогенных бактерий и вирусов.
Состав природных вод оценивается физическими, химиче-
скими и санитарно-бактериологическими показателями.
Физические показатели: температура; цветность – показа-
тель, обусловленный наличием в воде гуминовых кислот, при-
сутствием соединений железа; запахи и привкусы – органолеп-
тические показатели качества воды.
Запахи вызывают летучие пахнущие вещества. Мутность
обусловлена присутствием нерастворенных и коллоидных ве-
ществ неорганического (глина, песок) и органического (ил,
нефтепродукты, микроорганизмы) происхождения.
Химические показатели: ионный состав – общее солесо-
держание природных вод определяется в большинстве случаев
катионами Na+, K+, Ca2+, Mg2+ и анионами SO42–, HCO3–, Cl–;
содержание железа и марганца, щелочность, жесткость,
рН среды; вода хозяйственно-питьевого назначения имеет рН
6,5–8,5; содержание растворенных газов О2, СО2, Н2S и др.
Санитарно-биологические показатели: коли-индекс –
число бактерий Е.Coli в 1 л воды (≤3); коли-титр – наименьший
объем воды (в мл), содержащий 1 кишечную палочку; микроб-
ное число – общее число аэробных сапрофитов служит для
оценки загрязненности органическими веществами.

173
 Аэробная биологическая очистка сточных вод
Очистку сточной воды в аэробных условиях осуществляют
в сооружениях двух основных модификаций: в аэротенках с ак-
тивной биомассой (активный ил), взвешенной в воде, или в
биофильтрах, где активная биомасса (биопленка) прикреплена
к зернам инертной загрузки.
Состав микрофлоры и микрофауны илов и биопленки фор-
мируется в зависимости от экологических условий, основными
из которых являются состав обрабатываемых сточных вод, уро-
вень растворенного кислорода, температура, pH, соотношение
количества пищи и микроорганизмов, наличие токсичных ве-
ществ и т. д.
Бионаселение активного ила и биопленки образует слож-
ный биоценоз, представленный бактериями, простейшими,
грибами, водорослями и некоторыми многоклеточными орга-
низмами, такими как коловратки, черви, личинки насекомых.
Основную роль в процессах окисления органических и не-
которых неорганических примесей сточных вод играют бакте-
рии. Общее количество их в активном иле достигает 108–1014
клеток на 1 г сухого вещества. К числу самых распространен-
ных видов бактерий относятся псевдомонады. Кроме них, в
илах городских очистных сооружений обнаруживают бактерии
родов Bacillus, Bacterium, Achromobacters Zoogloea и др., а
также семейства энтеробактерий. В активном иле практически
всегда присутствуют актиномицеты.
Из животного населения ила наиболее многочисленны
простейшие, представленные двумя типами: саркомастигофо-
рами и инфузориями. Простейшие питаются бактериями, при
этом сохраняя бактериальное равновесие в иле. Поедая не
только старые, но и молодые клетки, простейшие способ-
ствуют омоложению ила и развитию новых жизнеспособных
клеток. Происходит высвобождение в воду дополнительного
количества экзоферментов. Простейшие питаются частицами
исходных загрязнений, таким образом осуществляется допол-
нительное осветление воды. По численности простейших и их

174
состоянию, определяемому по внешнему виду, можно судить
об условиях работы очистного сооружения и намечать меры
оперативного управления процессом.
В иле эффективно работающего аэротенка обычно находят
10–15 равномерно представленных видов простейших. В таком
иле редко обнаруживаются мелкие амебы и жгутиковые, в ос-
новном развиваются разнообразные инфузории, но преобла-
дают брюхоресничные и кругоресничные инфузории.
Любое нарушение в работе аэротенка приводит к снижению
числа видов простейших, преобладанию одного или двух видов,
к изменению размера и подвижности организмов. Так, при недо-
статке в сооружении кислорода преимущественное развитие по-
лучают простейшие, способные существовать в условиях кисло-
родного дефицита. Это в основном жгутиковые простейшие, из
инфузорий развивается инфузория-туфелька. Вортицеллы отры-
ваются от стебелька и раздуваются. У кругоресничных инфузо-
рий ресничный диск замкнут.
Кроме простейших, фауна активного ила представлена коло-
вратками, выполняющими те же функции, что и простейшие.
Реже в иле появляются черви.
Видовой состав бактерий биопленки практически не отли-
чается от активного ила при условии обработки сточных вод
одного и того же состава. Существенные различия между ак-
тивным илом и биопленкой наблюдаются в составе фауны. В
биопленке в большом количестве развиваются черви, потреб-
ляющие в качестве питания избыточную биомассу. Минерали-
зуя биопленку, они способствуют ее выносу из загрузки, а, про-
рывая ходы в биопленке, черви облегчают доступ кислорода к
глубоким ее слоям.
Анаэробная биологическая очистка сточных вод
В технологии очистки городских сточных вод анаэробное
окисление применяют в основном к концентрированным суб-
стратам. На станции биологической очистки к их числу отно-

175
сятся сырой осадок, образующийся при предварительном (пе-
ред биологической очисткой) отстаивании сточной воды, и из-
быточный активный ил, или биопленка. Осадок и активный ил
относятся к группе гигрофильных органических субстратов,
легко загнивающих и потому подлежащих обработке.
Основными органическими компонентами осадка и ила яв-
ляются белки, жиры и углеводы, в сумме составляющие 75–85 %
беззольного (органического) вещества. Остальные 15–20 % при-
ходятся на долю лигниногумусового комплекса. Количествен-
ные соотношения веществ указанных классов в осадке и иле за-
метно различаются. В активном иле больше белков, т. к. они
представляют собой живую биомассу, а в осадке преобладают
жиры и углеводы.
Важная характеристика осадка и ила – бактериальная обсе-
мененность и наличие яиц гельминтов. Около 40–50 % бакте-
рий, присутствующих в сточной воде, и примерно столько же
яиц гельминтов при отстаивании переходят в осадок. Еще около
40 % биологических загрязнений оказывается в активном иле.
Так как суммарный объем этих осадков обычно не превышает
1 % от объема сточной воды, очевидно, что концентрация био-
логических загрязнений в них существенно больше, чем в исход-
ной воде. Так, содержание коли-форм в 1 г сухого вещества
осадка составляет 107–108, а содержание активного ила – 106–
107. Это делает осадки чрезвычайно опасными в санитарно-эпи-
демиологическом отношении, поэтому одной из целей обра-
ботки осадков является их обезвреживание.
Преимущество анаэробных очистных систем – незначи-
тельное образование биомассы вредных микроорганизмов. Ме-
тод целесообразно использовать при невысоком уровне грун-
товых вод.
Процессы анаэробной очистки воды происходят в метантен-
ках и биореакторах (установки являются герметичными). По-
скольку сложная система контроля за условиями среды в этом
случае не требуется, стоимость методики получается сравни-
тельно невысокой. Главный недостаток анаэробной очистки –

176
образование в результате деятельности анаэробов горючего газа
метана. Поэтому конструкции можно устанавливать только на
ровных, хорошо продуваемых поверхностях, по их периметру
нужно обустраивать газоанализаторы с последующим подклю-
чением к системе пожарного оповещения. Анаэробная очистка в
большинстве случаев применяется для обслуживания загород-
ных домов и участков дач в локальных очистных сооружениях
(ЛОС).
Активный ил
Биоценоз зоогенных скоплений (колоний) бактерий и про-
стейших организмов, которые участвуют в очистке сточных
вод называется активным илом.
Богатое видовое разнообразие (не менее 25 видов простей-
ших) организмов активного ила свидетельствует о благополу-
чии биологической системы аэротенка, высокой эффективно-
сти очистки и устойчивости биоценоза к повреждающему воз-
действию токсичных сточных вод.
Видовой состав активного ила (АИ) прежде всего зависит
от состава поступающих в аэротенк стоков, то есть питатель-
ной среды для метаболизма микрофлоры ила.
Количество микрофлоры активного ила – это есть био-
масса. Простейшие микроорганизмы в процессе своей жизне-
деятельности поедают бактерии, что способствует омолажива-
нию популяции и приросту активного ила.
Ил начинает испытывать недостаток кислорода («голо-
дать»), что приводит к ухудшению результата его деятельности
и ухудшению очистки сточных вод. Поэтому в процессе экс-
плуатации требуется постоянно выводить из аэрационной си-
стемы излишки активного ила. Однако следует помнить, что
слишком большое снижение концентрации ила может вызвать
перегрузку микроорганизмов, в результате чего снизится их
активность, а следовательно, ухудшится качество очистки
воды.

177
 Одним из показателей состояния активного ила (его каче-
ства) является иловый индекс (ИИ). Под этим термином пони-
мают объем (1 мл) активного ила после отстаивания в течение
30 мин, отнесенный к 1 г сухого вещества. Величина илового
индекса зависит от нагрузки загрязнений по БПК20 на 1 г без-
зольного вещества ила. На графике приведена зависимость ило-
вого индекса от нагрузки на ил. Оптимальной величиной
нагрузки считают ту, при которой ИИ не превышает 100 см3/г.
Зимой и в районах с суровым климатом для обеспечения необ-
ходимого качества очистки нагрузка должна быть ниже.
Летом или в южных районах нагрузка на ил может повы-
шаться. При ИИ более 100 см3/г активный ил занимает боль-
шой объем, становится легким, теряет хлопьевидную струк-
туру, плохо оседает, не уплотняется и в большом количестве
выносится из вторичных отстойников, ухудшая эффективность
работы очистных сооружений.
Для непрерывного протекания биохимического процесса в
аэротенки постоянно должен подаваться возвратный (циркуля-
ционный) активный ил. Этот рецикл обеспечивается перекач-
кой осажденного во вторичных отстойниках активного ила об-
ратно в аэротенки. Объем возвратного ила, удаляемого из вто-
ричных отстойников, обычно составляет 30–50 % объема сточ-
ной воды. Он зависит от содержания сухого вещества актив-
ного ила во всем объеме сточных вод.
При затрудненной аэрации или избыточном поступлении в
аэротенк органических загрязнений наблюдается смена биоце-
ноза активного ила. При длительности анаэробных условий бо-
лее 15 мин происходит значительное увеличение количества
факультативных анаэробных и подавляется жизнедеятельность
аэробных форм. Подобная смена групп микроорганизмов со-
провождается образованием неоседающего ила (вспуханием).
При этом в активном иле наблюдается массовое развитие нит-
чатых бактерий и грибов (Fusarium).

178
 Режим работы активного ила
Суммарный эффект воздействия разнообразных факторов,
основным из которых следует считать удельные нагрузки, фор-
мирует специфический для каждого очистного сооружения ак-
тивный ил, который может быть подразделен на основные
типы:
– ил, работающий на неполное окисление органических за-
грязнений;
– полное окисление;
– полное окисление с последующей нитрификацией.
Сооружения биологической очистки, работающие в ре-
жиме неполного окисления, как правило, имеют высокие
удельные нагрузки (400–600 мг БПК на 1 г активного ила). При
этом формируется биоценоз с бедным видовым разнообразием
(5–13 видов) простейших и численным преобладанием отдель-
ных групп, таких как жгутиконосцы, раковинные амебы, нит-
чатые бактерии, крупные свободноплавающие инфузории,
«бентосные» раковинные амебы, мелкие корненожки.
При сниженных нагрузках на ил до 250–300 мг/г обеспечи-
вается полное окисление растворенных органических веществ.
Такие сооружения обычно очищают сточные воды смешанного
состава (бытовые и производственные). Неоднородное, много-
компонентное загрязнение среды обитания дает возможность
организмам ила приобрести и сохранять необходимый уровень
приспособленности в широком спектре непрерывно меняю-
щихся условий. Биоценозы на таких очистных сооружениях
разнообразны по видам, динамичны, подвижны и чутко реаги-
руют на внешнее воздействие. При нормально протекающем
процессе очистки в них отсутствуют численно доминирующие
виды или такое доминирование минимально.
При удельных нагрузках 80–150 мг/г обеспечиваются пол-
ное окисление и нитрификация азотосодержащих загрязнений.
При полном окислении поступающих на очистку растворенных
органических веществ, ненарушенном балансе их сорбции и

179
окислении, низких нагрузках на активный ил и развитом про-
цессе нитрификации формируется наиболее экологически со-
вершенный биоценоз – нитрифицирующий активный ил. Нит-
рифицирующие хлопья ила крупные, компактные, хорошо осе-
дающие, наполненные пузырьками газа, наблюдается самопро-
извольная флотация ила, вызванная процессами денитрифика-
ции. Процесс денитрификации, протекающий во вторичных от-
стойниках, может ухудшать качество очищенной воды за счет
избыточного выноса активного ила, особенно в теплое время
года.
Биоценоз нитрифицирующего активного ила характеризу-
ется в целом наиболее сложной экологической структурой с вы-
соким таксономическим разнообразием (до 45 видов простей-
ших) без численного преобладания различных видов. Нитчатые
бактерии, мелкие бесцветные жгутиконосцы, мелкие формы как
голых, так и раковинных амеб практически полностью вытесня-
ются из биоценоза или их численность минимальна. Из инфузо-
рий преобладают брюхоресничные и прикрепленные формы,
жизнедеятельность которых тесно связана с хорошо сформиро-
ванными, флокулированными хлопьями активного ила. Присут-
ствуют представители высшего звена – хищники, что положи-
тельно влияет на степень очищения воды от органических за-
грязняющих веществ за счет повышения интенсивности обмена.
В нитрифицирующем иле всегда присутствуют (не достигая
массового развития) хищные коловратки, сосущие инфузории,
хищные грибы и черви рода Chaetogaster, периодически встре-
чаются тихоходки.
Способность к флокуляции
Своеобразные условия существования формируют актив-
ный ил и его способность к флокуляции, которая является од-
ной из важнейших характеристик состояния биоценоза. Струк-
тура и биологические свойства хлопьев ила определяют эффек-
тивность и качество биологической очистки. При нормально
идущих процессах очистки масса активного ила представлена
хлопьями с плотностью в среднем 1,1–1,37 г/см3 и размером от

180
53 до 212 мкм. Бактериальные клетки расположены внутри и
на поверхности хлопьев. Они могут быть представлены незна-
чительным количеством одиночных бактерий, не связанных с
хлопьями: палочками, кокками, спирохетами и микроколони-
ями из палочек. Бактерии активного ила синтезируют и секре-
тируют в среду внеклеточный биополимер – полисахаридный
гель. Его наличие обусловливает агрегацию микроорганизмов
и образование хлопьевидных скоплений – флокул. Активный
ил только в флокулированном состоянии может обеспечивать
высокие скорости окисления загрязняющих веществ, и по су-
ществу качество очищенной воды определяется его способно-
стью к флокуляции.
Для нормальной работы сооружений (двухъярусных отстой-
ников, метантенков), в которых происходит разложение осадка,
необходимо создавать условия для непременного прохождения
второй стадии – щелочного или метанового брожения. Нормаль-
ное течение процесса метанового брожения определяется такими
факторами, как температура, время сбраживания, степень пере-
мешивания, соотношение между количеством свежего и сбро-
женного осадка, химический состав осадка, pH, щелочность,
концентрация летучих органических кислот, наличие токсичных
примесей, биогенных элементов, достаточное количество микро-
организмов. Термофильное брожение имеет ряд преимуществ
перед мезофильным. К ним относятся большая скорость и глу-
бина распада органических соединений, увеличение объема вы-
деляющегося газа. При перегрузке метантенка свежим осадком
создаются условия для протекания кислого брожения. Сбражи-
вание осадка нарушается также при поступлении в бродящую
массу веществ, токсичных для метанпродуцирующих бактерий
(таблица 7).
При термофильном брожении наблюдается полное отмира-
ние патогенных микроорганизмов и дегельминтизация. Яйца
гельминтов погибают при 49 °C в течение 3 ч, а при 53 °C –
через час. Возбудители брюшного тифа, дизентерии, паратифа
отмирают при термофильном брожении через несколько часов.

181
 Метановые бактерии очень чувствительны к колебаниям
температуры. Поэтому в интервале температур 37…42 °C бро-
жение осадка замедляется, что связано с неблагоприятным воз-
действием температуры, низкой для развития термофилов и
высокой – для мезофилов.
Таблица 7 – Предельно допустимые концентрации некоторых
соединений, влияющие на процесс брожения
Концентрация, мг/л
Соединения
допустимая вредная
Хром 3 6
Медь 20 30
Свинец 50 70
Cu2+ +Pb2+ 7,5–25 25
Толуол 20 200
Амиловый спирт 50 100
Ацетон 100 200
Бензол 50 200

Образующийся газ содержит обычно 62–65 % метана и 30–

35 % углекислого газа. Сероводород при нормально протекаю-
щем щелочном брожении отсутствует, т. к. он связывается в
форме сульфидов. Водорода содержится не более 0,5 %, азота –
около 2,2–2,8 %. Количество газа и его состав зависят от соот-
ношения различных групп органических загрязнений в осадке.
Так, при увеличении количества белков или снижении содер-
жания жиров в осадке выход газов уменьшается.
Метановое брожение происходит в интервале pH 5,6–8,2.
Оптимум составляет 7,0–7,6. Несмотря на присутствие кислот,
pH бродящей массы изменяется очень незначительно, что свя-
зано с буферными свойствами иловой воды, обусловленными
присутствием свободной угольной кислоты и гидрокарбона-
тов. Повышение щелочности вызывается наличием аммоний-
ного азота. Свободная угольная кислота, взаимодействуя с ос-
нованиями, частично переходит в гидрокарбонаты, что также
способствует повышению pH. Контроль над работой метан-

182
тенка ведется по качественному составу и количеству образу-
ющегося газа, осадка и по иловой жидкости. В иловой воде и
сброженном осадке содержится значительное количество био-
генных веществ. При нормальном протекании метанового бро-
жения иловая вода должна иметь следующие показатели: pH
6,8–7,5; щелочность – 40–60 мг-экв./л, жирные кислоты – не бо-
лее 10–12 мг-экв./л, NН+ более 500 мг/л. Метановое брожение
нарушается при появлении условий, задерживающих про-
цессы, происходящие на стадии кислого брожения. Этому спо-
собствуют перегрузка сооружения свежим осадком, малое ко-
личество микроорганизмов, резкое колебание температуры и
pH свежего осадка ниже оптимума, неравномерное поступле-
ние осадка. Нарушение процесса метанового брожения прояв-
ляется в снижении выхода газа с единицы объема поступаю-
щего осадка, изменении его качественного состава и уменьше-
нии содержания метана, возрастании количества диоксида уг-
лерода и водорода и выделении сероводорода. В иловой воде
увеличивается содержание органических (жирных) кислот,
снижаются щелочность и pH. Вспенивающийся осадок увели-
чивается в объеме, появляется неприятный запах и происходит
изменение его цвета (из темно-серого цвета он превращается в
грязно-желтый). Сброженный осадок содержит большое коли-
чество соединений азота, фосфора и других биогенных элемен-
тов. Эта особенность позволяет использовать обезвоженный и
высушенный осадок в качестве удобрения.
По сравнению со сточной жидкостью процесс высушива-
ния способствует снижению содержания бактерий в 3 800 раза
и полному отсутствию кишечной палочки, что указывает на
безопасность ила в санитарно-гигиеническом отношении.
Аэробная стабилизация осадка
В последние годы для обработки избыточного активного
ила и смеси его с осадком из первичных отстойников исполь-
зуется аэробная стабилизация. Она заключается в частичном
окислении органических примесей, входящих в состав твердой
фазы, при длительной аэрации в сооружениях типа аэротенков.

183
Эффективность обработки осадка зависит от состава и свойств
осадка, длительности и интенсивности аэрации. Для стабили-
зации активного ила она составляет 7–10 сут, для осадка из пер-
вичных отстойников – 10–15 сут. При аэробной стабилизации
происходит и самоокисление клеточного вещества бактерий.
Изменение свойств осадка, степень разложения органических
примесей при использовании этого метода примерно соответ-
ствуют эффекту, получаемому при анаэробном сбраживании.
Иногда процесс аэробной стабилизации называют аэробным
сбраживанием. Это не совсем верно, так как брожение является
анаэробным процессом и не может происходить в аэробных
условиях.
Биологические очистные сооружения
В последние годы тема защиты окружающей среды стано-
вится особенно актуальной. Важным вопросом в этой теме яв-
ляется очистка сточных вод перед сбросом их в близлежащие
водоемы. Одним из способов решения этой проблемы может
стать биологическая очистка сточных вод. Сущность такой
очистки – расщепление органических соединений при помощи
микроорганизмов до конечных продуктов, а именно – воды, уг-
лекислого газа, нитрита сульфатионов и др.
Биологические методы очистки сточных вод можно клас-
сифицировать по типу микроорганизмов, которые участвуют в
разложении органических соединений, на аэробные (жизнеде-
ятельность микроорганизмов невозможна без кислорода) и
анаэробные (жизнедеятельность без кислорода возможна). По-
мимо этого имеются такие организмы, для жизни которых тре-
буется азот.
Далее можно произвести классификацию аэробных методов
очистки. Их различают по типу резервуара, в котором происходит
очистка вод. Итак, резервуаром могут быть: поле фильтрации,
биологический пруд, аэротенки, биофильтры. На способ очистки
тип резервуара не влияет, и способ минерализации органических
соединений одинаков для всех резервуаров.

184
 Поле фильтрации – участок земли, отведенный для накопле-
ния отработанных вод, населенный аэробными микроорганиз-
мами. При попадании сточных вод на поля фильтрации они
вступают в реакцию с микроорганизмами, в результате чего
происходит отделение воды и углекислого газа.
Микроорганизмы, обитающие в воде, способствуют ее очи-
щению в биологических прудах. При этом биологический пруд
является искусственно созданным водоемом, в котором сохраня-
ются идеальные условия для жизнедеятельности микроорганиз-
мов (маленькая глубина, отсутствие течения, заселение водоема
водорослями, насыщающими воду кислородом и другое). Подоб-
ные пруды создаются как для очистки сточных канализационных
вод, так и для очистки воды в реках, впадающих в водохрани-
лища. Малая пропускная способность, большие занимаемые пло-
щади, сезонный характер работы и постоянный контроль за уров-
нем грунтовых вод определяют основные недостатки биологиче-
ских прудов и полей фильтрации.
Аэротенки и биофильтры относятся к искусственным соору-
жениям, используемым для фильтрации сточных вод. Они спо-
собны долгое время сохранять пригодные условия для роста и
развития населяющих их микроорганизмов (такие показатели,
как насыщение кислородом, уровень кислотности, температура и
другие, остаются практически неизменными). Очистка сточных
вод в биофильтрах имитирует работу полей фильтрации, а в аэро-
тенках – в биологических прудах. Биопленка, произрастающая на
биозагрузке, испытывает меньше «стрессовых» ситуаций, связан-
ных с неравномерностью качества поступающего стока, чем
аквтивный ил аэротенка. По этой причине количество сточной
жидкости, поступающей в биофильтр, при равных по объему со-
оружениях может быть больше на 50–200 %.
Септики представляют собой подземные, герметично за-
крытые горизонтальные емкости, на дне которых образуется
твердый осадок, который проходит стадии гниения и разлаже-
ния. Эти процессы возможны благодаря воздействию анаэроб-
ных микроорганизмов. Главная задача септика анаэробной

185
установки – отделение растворимых частиц жидкости от нерас-
творимых и разложение загрязнений посредством обработки
анаэробными микроорганизмами.
Преимущества аэробного и анаэробного метода очистки
сточных вод
Основное преимущество методик биологической очистки
стоков заключается в доступной цене – стоимость очистки ку-
бометра стоков с применением химического и механического
методов выше, чем биологического. Простота использования,
надежность – после запуска в работу станции биоочистки начи-
нают работать полностью автономно. Закупать расходные ма-
териалы не требуется. Экологичность – прошедшие очистку
сточные воды можно сливать в грунт, не опасаясь за состояние
окружающей среды. После работы станции не остается ника-
ких реагентов, которые нужно утилизировать соответствую-
щим образом. Оседающий на дно камеры ил – отличное удоб-
рение. Степень очистки составляет 99 %, то есть очищенную
биологическим способом воду теоретически можно пить, но
практически этого лучше не делать. Колонии бактерий имеют
способность к самовоспроизведению, заменять их достаточно
один раз в пять лет.
Природная биологическая очистка. В природе протекают
свои процессы биологической очистки вод, но на это уходят
годы. Если загрязненные стоки попадают в грунт, они сразу впи-
тываются в почву, где перерабатываются особыми микроорга-
низмами. При попадании жидкости на глинистые почвы образу-
ется биопруд, в нем сточные воды постепенно под воздействием
процесса гравитации осветляются, на дне образуется органиче-
ский осадок. На эти процессы требуется очень много времени, а
пока природа сама очищает воду от загрязнений, экологическая
ситуация стремительно ухудшается.
У анаэробного метода очистки сточных вод существуют
свои преимущества и недостатки. В процессе очистки не обра-
зуется в большом количестве активный ил, а значит, его не

186
нужно утилизировать. Применять этот способ можно только
при низких концентрациях субстрата. Около 89 % энергии ухо-
дит на выработку метана, скорость прироста биомассы низкая.
Эффективность очистки рассматриваемым способом высокая,
но в ряде случаев стоки все равно доочищаются.

8.3 Биологическая очистка и дезодорация

газовоздушных выбросов
Обезвреживание и очистка газовоздушных выбросов
Обезвреживание – обработка примесей до безвредного для
людей, животных, растений и в целом для окружающей среды
состояния.
Если концентрация примесей в газовоздушных выбросах
незначительна (десятки миллиграммов на кубометр), улавлива-
ние их экономически и технически нецелесообразно. Выбор
метода очистки отходящих газов зависит от конкретных усло-
вий производства и определяется рядом основных факторов:
объемом и температурой отходящих газов, агрегатным состоя-
нием и физико-химическими свойствами примесей, концентра-
цией и составом примесей, необходимостью рекуперации или
возвращения их в технологический процесс, капитальными и
эксплуатационными затратами, экологической обстановкой в
регионе.
Наиболее гарантированным методом снижения выбросов в
атмосферу является полное замыкание газовоздушных потоков
в циклы, что позволит не только решить экологические про-
блемы, но и снизить расход тепловой и электрической энергии,
утилизировать ценные компоненты, сократить потери товар-
ной продукции. Такие схемы реализованы в производстве ми-
неральных удобрений.
Способы борьбы с загрязнением атмосферы основаны на
применении конкретных приемов:
– усовершенствовании технологических процессов;

187
 – снижении до минимума количества отходов комплексным
использованием сырья;
– внедрении прогрессивных методов горения;
– использовании для газообразных выбросов высоких ды-
мовых труб, чтобы снизить концентрацию вредных веществ у
поверхности земли.
Очистка – удаление (выделение, улавливание) примесей из
различных сред.
Дезодорация – обработка одорантов (веществ, обладаю-
щих запахом), содержащихся в воздухе, воде или твердых сре-
дах, с целью устранения или снижения интенсивности запахов.
Применения биотехнологических методов
для очистки газовоздушных выбросов
и деградации ксенобиотиков
Биологические методы очистки газовоздушных выбросов
начали применять сравнительно недавно и пока в ограничен-
ных масштабах. Рассматриваемый метод очистки воздуха бази-
руются на способности микроорганизмов разрушать в аэроб-
ных условиях широкий спектр веществ и соединений до конеч-
ных продуктов СО2и Н2О.
Микроорганизмы утилизируют аммиак, окисляют серни-
стый газ, сероводород и диметилсульфоксид. Образуемые
сульфаты утилизируются другими микробными видами. Суще-
ствуют данные об эффективном окислении аэробными карбок-
сидобактериями моноокиси углерода, являющейся одним из
наиболее опасных воздушных загрязнителей.
Для биологической очистки воздуха применяют три типа
установок: биофильтры, биоскрубберы и биореакторы с омы-
ваемым слоем.
Биофильтры. Основным элементом биофильтра для очистки
воздуха является фильтрующий слой, который сорбирует токси-
ческие вещества из воздуха. Далее эти вещества в растворенном
виде диффундируют к микробным клеткам, включаются в них и

188
подвергаются деструкции. В качестве носителя для фильтрую-
щего слоя используют природные материалы – компост, торф и
др. Воздух, подлежащий очистке, подается вентилятором в си-
стему, проходит через фильтрующий слой в любом направлении,
снизу вверх или наоборот. При этом воздух должен проходить че-
рез всю массу фильтрующего слоя равномерно. Поэтому требу-
ются однородность слоя и определенная степень влажности.
Биоскрубберы. По сравнению с биофильтрами они зани-
мают меньшую площадь, так как представляют собой башни
высотой в несколько метров. Эксплуатационные затраты при
использовании биоскрубберов выше, так как процесс био-
очистки воды требует существенных затрат. Применение био-
скрубберов эффективно при наличии в воздухе хорошо раство-
римых токсических веществ. Производительность биоскруббе-
ров существенно выше по сравнению с биофильтрами, при
этом эффективность очистки также высока.
Биоскрубберы отличаются от биофильтров тем, что пред-
ставляют собой систему, состоящую из двух аппаратов. Пер-
вый аппарат представляет собой скруббер (абсорбционную ко-
лонну), где загрязняющие вещества абсорбируются в водной
фазе и второй – это биореактор, обычно блок очистки с актив-
ным илом, где соединения деградируют. Для повышения эф-
фективности улавливания в воду могут вводиться специальные
абсорбционные добавки.
Для обеспечения активной жизнедеятельности микроорга-
низмов в растворе поддерживается определенная минимальная
концентрация биогенных веществ: азота и фосфора. Очищен-
ный абсорбент вновь подается на орошение в абсорбер. Уста-
новка имеет замкнутый цикл циркуляции абсорбента и не
имеет стоков.
Биореакторы с омываемым слоем. Наиболее перспектив-
ными для очистки воздуха являются биореакторы с омывае-
мым слоем. Эти установки, практически не уступая в степени
очистки, характеризуются более высокой удельной производи-
тельностью (несколько тысяч кубометров очищаемого воздуха

189
в час). Такие малогабаритные установки очень эффективны для
очистки воздуха предприятий интенсивного животноводства.
Биореактор с омываемым слоем отличается от обычного био-
фильтра только тем, что биопленка, которая образуется на по-
верхности синтетической загрузки, не способна обеспечить мик-
роорганизмы требуемыми питательными веществами. Поэтому
они должны подаваться с водой, которая постоянно циркулирует
через реактор при прямо- или противоточном течении относи-
тельно газового потока. При этом избыточная биомасса удаляется
с поверхности загрузки, что предотвращает ее засорение и увели-
чивает срок службы.
Биодеградация ксенобиотиков – чужеродных для организ-
мов соединения (пестициды, ПАВ, красители, лекарственные
вещества и пр.), которые практически не включаются в элемент-
ные циклы углерода, азота, серы или фосфора.
Для биодеградации ксенобиотиков лучше использовать ас-
социации микроорганизмов, так как они более эффективны,
чем отдельно взятые виды. Один вид микроорганизмов может
непосредственно участвовать в разложении ксенобиотиков, а
другой – поставлять недостающие питательные вещества. Это
может быть метаболическая «атака» на субстрат, когда синте-
зируются разные компоненты ферментативного комплекса или
цепочка ферментативных реакций.
Особенно трудно разлагаются такие биоциды, как детер-
генты, пластики и углеводороды. Самыми способными к
борьбе с загрязнителями различного типа являются представи-
тели рода Pseudomonas – они практически «всеядны». Клетки
этих микроорганизмов способны разлагать большое число мо-
лекул углеводородов и ароматических соединений, таких как
бензол, ксилол, толуол.
Они более эффективны, чем бактерии, справляются с кос-
венными загрязнителями грибы. Они могут разрушать такие
вещества, как пентахлорбензол, пентахлофенол. В одном из
экспериментов грибами обработали около 10000 т почвы с тер-
ритории деревоперерабатывающего комплекса. В этой почве

190
содержание пентахлорфенола достигало 700 мг/кг, но за год де-
ятельности оно снизилось до 10 мг/кг, что является допустимой
нормой. Бактерии смогли бы переработать эту почву лишь за
4–5 лет. Грибы активны и зимой, разрушают высокомолекуляр-
ные полиароматические углеводороды, действуют внекле-
точно, выделяя неспецифические ферменты. Стоимость гриб-
ной и бактериальной очистки одинакова, но применение гри-
бов позволяет сокращать сроки деградации и существенно уде-
шевляет ее.
Большую опасность для окружающей среды представляют
полиароматические углеводороды. Так, полихлорбифенилы
(ПХБ) являются очень устойчивыми соединениями, долго при-
сутствующими в окружающей среде в результате прочной ад-
сорбции биологическими и осадочными породами и плохой
миграции. Микроорганизмы не способны глубоко деградиро-
вать эти соединения, тем не менее их модифицируют. Установ-
лена способность микробных сообществ деградировать про-
мышленные ПХБ с образованием новых типов углеводородов,
при этом молекулы с низкой степенью хлорирования расщеп-
ляются. Устойчивое полиароматическое соединение бензапи-
рен не минерализуется в системах активного ила, хотя описано
несколько микробных видов, способных частично его метабо-
лизировать. В ходе деградации бензапирена образуются канце-
рогенные соединения (гидрокси- и эпоксипроизводные).
Устойчив к деградации также полистирол, хотя описано не-
сколько случаев частичной деградации измельченных автомо-
бильных шин, изготовленных из стирол-бутадиеновой резины.
Известны сообщения о росте микробного сообщества на сти-
роле, в ходе которого разрушается ингибитор полимеризации
4-трет-бутилкатехол, далее происходит свободнорадикальная
полимеризация стирола с осаждением образующегося полисти-
рола. Этот полимер впоследствии под воздействием микроб-
ного сообщества исчезает из почвы.

191
 Контрольные вопросы

1. Что такое «экологическая биотехнология»

2. Биологическая очистка сточных вод.
3. Оценка качества водных ресурсов.
4. Аэробная биологическая очистка сточных вод.
5. Анаэробная биологическая очистка сточных вод.
6. Активный ил и его значение.
7. Биологические очистные сооружения.
8. Биологическая очистка и дезодорация газовоздушных
выбросов.

192
 ГЛАВА 9. ОБЕСПЕЧЕНИЕБИОЛОГИЧЕСКОЙ
БЕЗОПАСНОСТИ

Методы генной инженерии отличаются от манипуляций с

обычными патогенными микробами, поскольку большей ча-
стью они имеют дело с обычными кишечными бактериями, жи-
вущими в пищеварительной системе человека и, более того,
широко распространенными в окружающей среде. Поэтому
сконструированные штаммы могут очень легко распростра-
ниться и привести к серьезным последствиям. Возможные при-
ложения генной инженерии, как и все другие технические нов-
шества, следует рассматривать как их преимущества, так и не-
достатки. Например, перенос генов азотфиксации в злаки при
помощи микроорганизмов имеет неоспоримые выгоды. Однако
размножение таких микроорганизмов в почве может способ-
ствовать произрастанию и других растений и тем самым нару-
шать биологический баланс, как в растительных сообществах,
так и в животных биоценозах. С другой стороны, относитель-
ная скудость определенных биологических веществ, таких, как
гормоны, может быть с лихвой восполнена за счет разработки
синтетических веществ, получаемых при помощи микроорга-
низмов, сконструированных методами генной инженерии, а это
может привести к терапевтически не обоснованному примене-
нию этих веществ.
Учитывая соображения риска, многие специалисты при-
звали в июле 1974 г. к самоограничению при экспериментах по
генной инженерии. Однако в феврале 1975 г. на Асиломарской
конференции в Калифорнии 140 исследователей решили пре-
рвать мораторий, принятый ими же несколькими месяцами ра-
нее. С этого времени в США исследования такого рода
неуклонно расширяются, но под контролем соответствующих
организаций.
После периода сомнений в середине 1970-х гг. некоторые
биологи пришли к заключению, что потенциальные опасности

193
невелики, так как сконструированные генно-инженерным пу-
тем микробы имеют мало шансов выжить вне лабораторных
условий. Это привело к снижению защитных норм, во всяком
случае, в том, что касалось физического ограничения. Вместе с
тем немало биологов обеспокоены легкомысленной позицией в
вопросе об определении правил безопасности, а также отсут-
ствием регулирования будущей биоиндустрии, где для выра-
щивания микробов, полученных методами генной инженерии,
намерены применять ферментеры емкостью в несколько кубо-
метров, а не сосуды малой емкости, используемые в лаборато-
риях.
В феврале 1982 г. эксперты Национальных институтов здо-
ровья и Консультативного комитета по рекомбинантным ДНК
предложили ввести определенные изменения в систему регули-
рования исследований в области генной инженерии. Новые
ограничения вступили в действие с 21 апреля 1982 г. Это зна-
чило, что исследовательские институты должны иметь совет по
биологической безопасности; для тех исследований, где ра-
боты ведутся на уровнях защиты РЗ и Р4, должен быть назна-
чен специалист по биологической безопасности. Такая прину-
дительная система была принята как из-за опасений критики со
стороны широкой общественности, так и в связи с возможно-
стью (в случае отмены федерального регулирования) ограниче-
ний со стороны местных властей или властей штатов. Это бес-
покойство разделяли многие биопромышленные компании. По
их мнению, регулирование, осуществляемое беспорядочно на
местном уровне, может препятствовать развитию биоинду-
стрии. Еще одной причиной более жестких мер послужило бес-
покойство ряда ученых Консультативного совета по рекомби-
нантным ДНК относительно безопасности некоторых видов
экспериментов.
Во Франции в марте 1975 г. были образованы так называе-
мая этическая и техническая комиссии для изучения проблем,
связанных с применениями исследований по генной инжене-
рии. 13 сентября 1982 г. на международной конференции «От

194
Дарвина к дарвинизму: наука и идеология» французский ми-
нистр исследований и промышленности объявил об учрежде-
нии биоэтического медицинского комитета при Национальном
Институте здоровья и медицинских исследований (INSERM).
Комитет был призван разрешать моральные разногласия, вы-
званные биологическими и медицинскими экспериментами
или исследованиями в области здравоохранения, касающимися
отдельного человека, определенных социальных групп или об-
щества в целом.
В странах Европейского экономического сообщества
(ЕЭС) были проведены важные переговоры относительно
риска экспериментов по генной инженерии и принимаемым ме-
рам защиты, в частности, для лабораторий, работающих с уров-
нями защиты РЗ и Р4.
Экономический и социальный комитет ЕЭС в марте 1982 г.
пришел к выводу о том, что риск, связанный с работой по ре-
комбинантным ДНК, является незначительным. Однако под-
черкивалась необходимость продолжения исследований по
оценке риска и выполнения норм защиты, важность обучения
микробиологической безопасности и согласования практики
среди государств – членов ЕЭС. Эти меры обеспечат честную
конкуренцию и сходный уровень биологической безопасности.
Необходимость предотвращения риска, связанного с ис-
следованиями в области генной инженерии, обязывает ученых
объективно информировать общественность, чтобы она была
лучше подготовлена к участию в дебатах, которые ранее огра-
ничивались научными и правительственными кругами. Вот по-
чему важным фактором для выработки ответственной позиции
и объективного мнения о преимуществах и риске исследований
по генной инженерии является информация общественности
путем высококвалифицированной популяризации науки и тех-
нологии средствами массовой информации.
Наблюдающийся повышенный интерес к новым техноло-
гиям скорее всего объясняется тем, что их применение направ-
лено на улучшение экономической ситуации: новые продукты

195
станут необходимым условием конкурентоспособности на
рынке и в свою очередь объектами для применения новых тех-
нологий.
Выбор и распространение биотехнологий заслуживают
особого внимания. Нужно выбрать такую технологическую си-
стему, которая наилучшим образом соответствовала бы кон-
кретным экономическим, социальным и культурным условиям.
Например, развитие генной инженерии может оказаться для
страны чрезмерно дорогим и встретить не меньшие препят-
ствия, чем, например, робототехника. Когда биотехнология не
сводится исключительно к генной инженерии, а наряду с этим,
рассматриваются различные способы использования микроб-
ных ресурсов, то оказывается, что многие развивающиеся
страны обладают большим опытом и практикой, которые
можно усовершенствовать и которые окажутся ничуть не менее
полезными, чем генная инженерия. Так, можно развивать ме-
тоды ферментации в жидкой и твердой средах, компостирова-
ния и рециклизации отходов, а также усовершенствовать про-
изводство биогаза, гидролиз целлюлозы и разложение лигнина.
Это как раз те области, где использование результатов научных
исследований и распространение опыта и навыков, относя-
щихся к традиционным и усовершенствованным биотехноло-
гиям, может оказаться выгоднее для развивающихся стран, чем
ввоз более прогрессивных технологий. Использование адекват-
ных биотехнологий, а не наиболее сложных из них и соответ-
ствующее обучение определяются избытком рабочей силы и
биомассы и ограниченностью капитала.
В развивающихся странах, так же как и в промышленно
развитых, одной из первоочередных задач экономики является
уменьшение энергозатрат при производстве белков. Разработка
более коротких и, следовательно, менее дорогих цепей произ-
водства белков включает мелкомасштабные виды биотехноло-
гии в противовес технологиям, направленным на массовое по-
лучение аминокислот. Более того, такие укороченные произ-
водственные схемы обладают преимуществами: они защищают

196
почву, способствуют сохранению лесов и регулируют стабиль-
ность населения в сельской местности. Биотехнологии могут
оказать менее привилегированным странам помощь в разреше-
нии продовольственной проблемы и нехватки энергии, если бу-
дет проявлено должное внимание к их выбору, распростране-
нию и адаптации к конкретной социальной, экономической и
культурной обстановке. Обеспечив производство и распро-
странение вакцин, «первая биотехнологическая революция»,
которая началась с работ Пастера и его современников, позво-
лила спасти жизнь многих людей. «Вторая биотехнологическая
революция», связанная с прогрессом в биологических науках
за последние три десятилетия, не может позволить умирать от
голода детям, защита которых от инфекции обеспечена более
эффективными вакцинами. Поэтому биотехнология должна
внести решающий вклад в борьбу с нехваткой продовольствия,
ориентируясь на широкое распространение новейших знаний,
техники и оборудования.
Суть выведения новых сортов с использованием методов
генной инженерии заключается в переносе гена, кодирующего
полезный признак, в геном растений коммерческого сорта, не
обладающего таким признаком. Новый признак у нового сорта
появляется в результате добавления чужеродного гена.
Согласно Статьи 7 настоящего Закона генно-инженерная
деятельность в условиях открытых систем (система открытая –
система осуществления генно-инженерной деятельности, пред-
полагающая контакт генно-инженерно-модифицированных ор-
ганизмов с населением и окружающей средой при их намерен-
ном выпуске в окружающую среду, применение в медицинских
и алиментарных целях, экспорте и импорте, при передаче тех-
нологий) представляет потенциальную опасность и приравни-
вается к III и IV уровню риска.
III уровень риска соответствует работам, которые пред-
ставляют умеренную опасность для здоровья человека, и сопо-
ставим с опасностью при работах с микроорганизмами, потен-
циально способными к передаче инфекции;

197
 IV уровень риска соответствует работам, которые пред-
ставляют опасность для здоровья человека, и сопоставим с
опасностью при работах с возбудителями особо опасных ин-
фекций (ст. 7 настоящего Закона).
Риск – вероятность осуществления нежелательного воздей-
ствия генно- инженерно модифицированного организма на
окружающую среду, сохранение и устойчивое использование
биологического разнообразия, включая здоровье человека,
вследствие передачи генов.
Концепция риска включает два элемента – оценку риска и
управление им.
Оценка риска – научный анализ происхождения и степени
риска в конкретной ситуации, тогда как управление риском –
анализ рисковой ситуации и разработка решения (как правило,
в форме правового акта: закона, постановления, инструкции и
т. д.) направленного на минимизацию риска.
Оценка риска строится на фундаментальном естественно-
научном анализе самого источника риска (например, выпуск
генно-инженерно-модифицированных организмов в окружаю-
щую среду и/или изготовленных из них продуктов и компонен-
тов), особенностей конкретной экологической обстановки
(например, биоценоза или ландшафта) и механизма взаимодей-
ствия между ними, тогда как управление риском опирается на
экономический и технико-экономический анализ, а также на
юриспруденцию.
Передача и распространение информации о риске явля-
ются естественным продолжением процесса оценки риска.
Иначе говоря, оценка риска практически не имеет смысла, если
получаемые результаты не доводятся до сведения тех, кто при-
нимает решения по снижению риска и тех, кого такие решения
касаются.
До подачи заявки в Государственную комиссию по испы-
танию и охране селекционных достижений трансгенный сорт
должен пройти испытание на биобезопасность, пищевую без-
опасность и экологическую экспертизу. Заявка на проведение

198
испытаний на биобезопасность, подается в Межведомствен-
ную комиссию по проблемам генно-инженерной деятельности.
Одновременно должна быть подана заявка в Госанэпиднадзор
для оценки продукции сорта на пищевую безопасность. После
первого года испытаний на биобезопасность должна быть по-
дана заявка на проведение экологической экспертизы.
По окончании испытаний на биобезопасность и экологиче-
ской экспертизы и по согласованию с Госанэпиднадзором
Межведомственная комиссия по проблемам генно-инженерной
деятельности выдает временное разрешение на проведение гос-
ударственного сортоиспытания.
После окончания государственного сортоиспытания в слу-
чае получения положительных результатов испытаний на отли-
чимость, однородность и стабильность и положительного ре-
шения по пищевой безопасности сорт может быть включен в
Государственный реестр селекционных достижений, допущен-
ных к использованию. Только после этого возможен широко-
масштабный выпуск трансгенного организма в окружающую
среду и соответственно использование и реализация семян и
посадочного материала сорта, а также продуктов питания про-
изведенные из него.

9.1 Биологическая и пищевая безопасность

трансгенных растений и продукции из генетически
модифицированных источников
Согласно Статье 11 Федерального закона «О государствен-
ном регулировании в области генно-инженерной деятельно-
сти»: продукция (услуги), полученная с применением методов
генно-инженерной деятельности, должна соответствовать тре-
бованиям экологической безопасности, санитарных норм, фар-
макопейных статей, обязательным требованиям государствен-
ных стандартов Российской Федерации.
На основании этой статьи генно-модифицированные орга-
низмы оцениваются по критериям безопасности на:
– биобезопасность генно-модифицированных организмов;

199
 – пищевую безопасность генно-модифицированных орга-
низмов и продуктов питания из них.
Под биобезопасностью понимается система мероприятий
(законодательных актов и др.), направленная на обеспечение
эффективного использования достижений генетической инже-
нерии и биотехнологии, не допускающая при этом неблагопри-
ятных экологических последствий и непосредственной угрозы
здоровью людей.
Для выявления потенциальной экологической опасности
до начала широкого распространения генетическимодифици-
рованных растений в окружающей среде проводят оценку рис-
ков для окружающей среды и здоровья человека. К таким рис-
кам относятся:
– нарушение экологического равновесия: гибель нецеле-
вых организмов; вытеснение природных организмов из их эко-
логических ниш; уменьшение биологического разнообразия;
толерантность к гербицидам; толерантность к насекомым; из-
менение восприимчивости к болезням и вредителям; влияние
генетической конструкции на почвенную микрофлору.
– бесконтрольный горизонтальный и вертикальный пере-
нос чужеродных генов из трансгенных организмов в природ-
ные популяции растений и животных: в родственные и не род-
ственные виды растений; в не генетически модифицированные
культуры; внедрение в пищевые цепи; экспрессия гена устой-
чивости к антибиотикам в организме животных и человека.
– устойчивость к вирусам: изменение структуры оболочки
вируса; образование нового вируса; усиление симптомов забо-
левания.
– пищевая опасность: изменение биологической и пищевой
ценности; аллергенность; мутагенность; канцерогенность; из-
менение иммуномодулирующих свойств; гонадо- и эмбриоток-
сичность, тератогенность.
Исследование биобезопасности трансгенных растений в
России осуществляется путем проведения ограниченных поле-
вых испытаний на изолированных участках с применением

200
специальных мер ограничения рисков, в том числе сортоиспы-
таний.
Ограниченные полевые испытания в открытом грунте про-
водятся на огороженных охраняемых участках, сертифициро-
ванных Межведомственной комиссией по проблемам генно-
инженерной деятельности (МВКПГИД). Организация, осу-
ществляющая эти испытания, должна иметь высококвалифици-
рованный персонал и гарантировать защиту от несанкциониро-
ванного попадания исследуемых трансгенов в окружающую
среду. Для выполнения этих требований осуществляют следу-
ющие мероприятия:
– репродуктивная изоляция путем пространственного вре-
менного разграничения; в случае необходимости применение
биологических методов предотвращения цветения; надевание
защитных мешочков на цветки, соцветия, растения);
– регулирование устойчивости или распространения таких
репродуктивных структур, как побеги или семена;
– уничтожение самосевных растений после уборки.
Результатом изучения трансгенных растений на ограни-
ченных участках являются оценка их биобезопасности и вы-
дача МВКПГИД номера временной регистрации исследуемой
культуры для проведения сортоиспытаний.
Следующим этапом выпуска генно-модифицированного
организма в окружающую среду является проведение полевых
испытаний без использования специальных мер ограничения
рисков. Заключительный этап выпуска трансгенных растений
предусматривает широкомасштабное их возделывание.
В 2000 г. российские ученые Всероссийского НИИ защиты
растений (г. Краснодар) провели испытания фитосанитарной
безопасности двух американских трансгенных сортов карто-
феля, устойчивых к колорадскому жуку. Результаты оценки по-
ражаемости клубней трансгенных и нетрансгенных сортов кар-
тофеля при искусственном заражении изолированных тканей
клубней двумя штаммами гриба Fusarium solani, по мнению ав-

201
торов статьи, оказались неожиданными: ткани клубней транс-
генных сортов, по сравнению с контрольными, оказались более
устойчивыми к этому грибу.
В опыте с одним штаммом гриба F. solani ткани клубней
трансгенных сортов Рассет Бербанк НЛ и Супериор НЛ не за-
разились этим грибом, в то время как ломтики клубней не-
трансгенных сортов Рассет Бербанк и Санте поразились на
100 %. В опыте с другим штаммом заражение тканей трансген-
ных сортов имело место, но степень колонизации их мицелием
была существенно ниже по сравнению с нетрансгенными сор-
тами. Результаты этого исследования указывают на опасность
изменения восприимчивости к болезням и вредителям транс-
генных сортов.
В 2001 г. во Всероссийском НИИ защиты растений (г.
Краснодар) проходили испытания на биобезопасность следую-
щие трансгенные культуры: кукуруза, свекла, соя, картофель.
Таким образом, приведенные нами примеры потенциаль-
ных рисков биологической опасности должны насторожить
ученых и экспертов, проводящих экологическую экспертизу
трансгенных растений и ответственно подходить к получен-
ным результатам.
Безопасность пищевых продуктов – состояние обоснован-
ной уверенности в том, что пищевые продукты при обычных
условиях их использования не являются вредными и не пред-
ставляют опасности для здоровья нынешнего и будущих поко-
лений (Ст.1. ФЗ «О качестве и безопасности пищевых продук-
тов»).
Подобно тому, как расщепление атома вызвало в мире
большое беспокойство людей, так и трансформация биологи-
ческого клеточного ядра, направленная на изменение наслед-
ственности живых организмов, может иметь непредсказуемые
последствия. В то же время без использования трансгеноза не-
возможно решение ряда важнейших задач биологии и произ-
водства, среди которых на первое место вышла проблема со-
здания нового поколения биологических объектов, (растений,

202
животных и микроорганизмов), обладающих комплексной
устойчивостью к опасным вредным организмам и стрессовым
факторам среды и отрицательным последствиям деятельности
человека.
На современном этапе распределение позиций государств
по отношению на это выглядит следующим образом: наиболь-
шие подвижки в решении теоретических и практических задач
биотехнологии и генетической инженерии имеет место в США,
Канаде, Бразилии, в странах Восточной и Юго-Восточной Азии
(Китай, Индия, Япония). Именно в этих двух географических
регионах мира созданы экономически эффективные формы,
линии, сорта и гибриды растений с измененной наследственно-
стью (трансгенные растения), уже сегодня занимающие свыше
110 млн га пашни, составляющих четвертую часть всех произ-
водственных площадей, занятых под культурами – соей, куку-
рузой, сахарной свеклой, томатами, картофелем, рапсом, хлоп-
чатником и другими важнейшими сельскохозяйственными
культурами. Темпы расширения площадей под посевами транс-
генных культур в этих странах будут сохраняться и в ближай-
шей перспективе.
В государствах Западной Европы происходит смена обще-
ственного и официального (государственного) отношения к
этой проблеме – от полного отрицания к постепенному пере-
ходу к позиции «за», что окажет стимулирующее влияние на
развитие научных исследований по трансгенным технологиям
и повышение эффективности сельскохозяйственного произ-
водства в целом.
Последнее место в этом ряду занимает Россия. Являясь
первооткрывателем в разработке первой национальной про-
граммы по биотехнологии и успешной ее реализации в микро-
биологии, фармакологии, в медицине и ветеринарии, наша
страна оказалась неспособной развить эти направления в науке
и продовольственном цехе страны. У нас нет ни одного разре-
шенного для использования в производстве трансгенного объ-

203
екта ни в растениеводстве, ни в животноводстве. Не восстанов-
лен проект, объединяющий все основные направления биотех-
нологии и биоинженерии. В стране продолжаются дискуссии и
бессмысленные споры по поводу мнимой опасности и даже
возможного геноцида, который неизбежен, по мнению невеже-
ственных людей, в случае продолжения этих работ. Россия ока-
залась единственной страной мира, не поддержавшей признан-
ного ООН, руководителями многих государств, в первую оче-
редь, Китая, Кубы заявления о стратегическом приоритете био-
технологии и биоинженерии в текущем столетии.
Науке известны крупнейшие парадоксы, особенно, в теоре-
тической физике: фотометрический, гравитационный, термо-
динамический и некоторые другие. Это в науке, охватывающей
изучение закономерностей всей вселенной и существующей
уже тысячелетия. В биологии в момент открытия простран-
ственной и химической структуры ДНК (Уотсон и Крик) и по-
лучения первой рекомбинантной ее молекулы (Бэрг) возникла
ситуация, не парадоксальная, а гармоничная, открывающая ко-
лоссальные возможности для решения проблем эффективного
использования природных ресурсов и особенно решения про-
блемы продовольственной безопасности. Парадокс возник в
другой области – не в науке, а в использовании ее результатов
обществом. Его преодоление сегодня – дело не только ученых,
сколько руководителей страны и всего общества в целом.
Современная биотехнология в прикладном плане в настоя-
щее время дифференцируется по важнейшим областям исполь-
зования ее результатов: биотехнология в селекции растений и
растениеводстве, в животноводстве и ветеринарной медицине,
в хранении и переработке сельскохозяйственной продукции, в
экологии, в защите растений, в энергетике, в медицине и здра-
воохранении и других областях. Интенсивное развитие каж-
дого из этих направлений позволит в суммарном выражении за
счет повышения продуктивности и устойчивости биологиче-
ских объектов в растениеводстве и животноводстве увеличить

204
объем валовой продукции в 1,5–2 раза, при максимальном ис-
пользовании современных факторов интенсификации.
Биологизация сельского хозяйства, возникшая в ответ на
ускоренную деградацию почв и энтропию в энергетике, была
неизбежным и эффективным шагом в их приостановке и после-
дующем повышения потенциала продуктивности сельскохо-
зяйственного производства. Темпы биологизации оказались со-
вершенно недостаточными, чтобы сделать ее решающим фак-
тором в придании нового этапа развития сельскохозяйствен-
ного производства.
В мире сегодня трансгенные растения с высокой устойчи-
востью к патогенам и абиотическим стрессам, высоким каче-
ством продукции возделываются на площади 110 млн га. Со-
здаются принципиально новые линии и породы скота с повы-
шенной устойчивостью к опасным болезням и высокой продук-
тивностью. Созданы мировые банки эффективных генов и
сотни экономически эффективных сортов, гибридов, растений,
животных и птиц, штаммов микроорганизмов.
Известно, что генетические риски имеют место. Они свя-
заны с плейетропным эффектом, нарушением стабильности ге-
нома при несоблюдении правил и методических условий про-
ведения экспериментов, слабой изученности закономерностей
экспрессии генов, их свободной миграцией и ряда других при-
чин. Но риски могут и должны быть предотвращены при необ-
ходимом научном контроле в лабораторных условиях за воз-
можным образованием белков токсической и аллергенной при-
роды. Ни одного случая отрицательного развития событий в ла-
бораториях мира не выявлено. Работы проводятся с природ-
ными генами.
Высшим достижением новейшей биотехнологии является
генетическая трансформация – перенос чужеродных донорских
генов в реципиентные клетки растений, животных и микроор-
ганизмов. По своим целям и возможностям это направление в
биотехнологии является стратегическим. Оно позволяет
успешно решать главную задачу по повышению устойчивости

205
биологических ресурсов к вредным организмам, стрессовым
факторам среды, что значительно увеличивает эффективность
сельскохозяйственного производства. Для достижения этих це-
лей в ближайшие годы предстоит преодолеть значительные
биологические барьеры в идентификации и клонировании ге-
нов, в создании генетических банков, расшифровке механиз-
мов экспрессии важнейших полигенных признаков и свойств
организмов. Изучение условий гарантированной биобезопас-
ности, научно обоснованный прогноз свидетельствует о том,
что при решении этих фундаментальных задач в первой чет-
верти нынешнего века биотехнологическая продукция соста-
вит не менее 20 % всего объема таких товаров, поступающих
на мировой рынок.
В настоящее время большое развитие получили клеточная
и тканевая биотехнологии, основанные на дальнейшем углуб-
ленном изучении биологии клетки и использовании ее важней-
ших свойств – тотипотентности и продуцировании соединения
вторичного синтеза. Возникли новые высокоэффективные био-
технологические производства в фармацевтической, пищевой
и перерабатывающей промышленности.
В Российской Федерации нормативно-правовой базой для
оценки безопасности, качества и регистрации пищевой продук-
ции, полученной из генетически модифицированных источни-
ков, служат Законы Российской Федерации «О государствен-
ном регулировании в области генно-инженерной деятельно-
сти», «О санитарно-эпидемиологическом благополучии насе-
ления», «О защите прав потребителей», «О качестве и безопас-
ности пищевых продуктов», Приказ Министерства здравоохра-
нения РФ «О гигиенической оценке производства, поставки и
реализации продукции и товаров», Постановление Правитель-
ства Российской Федерации «О государственной регистрации
генно-инженерно-модифицированных организмов», Постанов-
ление Главного государственного санитарного врача РФ «О со-
вершенствовании системы контроля за реализацией сельскохо-

206
зяйственной продукции и медицинских препаратов, получен-
ных на основе генетически модифицированных источников»,
Постановление Главного государственного санитарного врача
РФ «О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой
продукции, полученной из генетически модифицированных
источников».
В Постановлении Главного государственного санитарного
В соответствии с этим Постановлением от 01.07.1999 г введена
государственная регистрация пищевых продуктов и продо-
вольственного сырья, а также компонентов (фрагментов) для
их производства, полученных из генетически модифицирован-
ных источников, утверждены форма Регистрационного удосто-
верения и Положение «О проведении гигиенической экспер-
тизы и регистрации пищевой продукции, полученной из гене-
тически модифицированных источников».
Согласно Положению, гигиеническая экспертиза пищевой
продукции, полученной из генетически модифицированных
источников, осуществляется Научно-исследовательским ин-
ститутом питания РАМН, а также учреждениями-соисполните-
лями: Институтом вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова
РАМН и Московским НИИ имени Ф. Ф. Эрисмана Минздрава
России.
Медико-генетическая оценка пищевой продукции, полу-
ченной из генетически модифицированных источников, осу-
ществляется Центром «Биоинженерия» РАН, а также учрежде-
нием-соисполнителем Медико-генетическим научным цен-
тром РАМН.
Технологическая оценка пищевой продукции, полученной
из генетически модифицированных источников, осуществля-
ется Московским государственным университетом прикладной
биотехнологии Министерства общего и профессионального
образования РФ.
Гигиеническая экспертиза, согласно Положению, осу-
ществляется в следующем порядке: организация, предприятие,
фирма (далее – регистрант) представляет в Центр санитарно-

207
эпидемиологического нормирования и экспертизы Минздрава
РФ комплект документации включающий:
– заявку (письмо) на проведение гигиенической оценки и
регистрации пищевой продукции;
– материалы, отражающие медико-генетическую оценку
пищевой продукции, полученной из генетически модифициро-
ванных источников, включая вносимую последовательность
генов, маркерные гены антибиотиков, промоторы, усилители и
эффекты выражения соседних генов, стабильность генетически
модифицированных организмов на протяжении нескольких по-
колений с учётом стабильности и уровня выражения генов;
– материалы, отражающие медико-биологическую оценку
пищевой продукции, полученной из генетически модифициро-
ванных источников, включая санитарно-химические показа-
тели качества и безопасности, результаты токсикологических
исследований на лабораторных животных, оценку аллергенных
свойств продукта, возможных мутагенных и канцерогенных
эффектов продукта, его влияния на функцию воспроизводства,
результаты наблюдений на добровольцах и эпидемиологиче-
ских исследований;
– материалы, характеризующие технологические свойства
пищевой продукции, полученной из генетически модифициро-
ванных источников: органолептические свойства, физико-хи-
мические свойства, сохранность и влияние генетической моди-
фикации на технологические параметры продукции.
К оригиналам документов страны-экспортера пищевой
продукции должен быть приложен нотариально заверенный их
перевод на русский язык.
Комплект документации и образцы пищевой продукции
(компоненты, фрагменты) передаются в Научно-исследова-
тельский институт гигиены питания РАМН и в учреждения со-
исполнители.
Гигиеническая экспертиза включает в себя экспертизу
представленной документации и образцов продукции. Объем и
программа проведения работ по оценке безопасности пищевой

208
продукции определяется по результатам экспертизы представ-
ленных материалов.
Результаты экспертизы основных видов продовольствен-
ного сырья, полученного из генетически модифицированных
источников, предварительно обсуждаются Рабочей группой по
правовым вопросам получения и использования пищи из транс-
генных источников при Межведомственной комиссии по
генно-инженерной деятельности.
По результатам экспертизы представленной документации
и образцов пищевой продукции Центр санитарно-эпидемиоло-
гического нормирования, гигиенической сертификации и экс-
пертизы Минздрава России оформляет бланк регистрацион-
ного удостоверения (или мотивированное заключение об от-
казе в регистрации) и передаёт его на подпись в Департамент
госсанэпиднадзора вместе с экспертным заключением Инсти-
тута питания РАМН.
Регистрационное удостоверение подписывается Главным
государственным санитарным врачом Российской Федерации,
в его отсутствие – начальником Департамента госсанэпиднад-
зора, заместителем Главного государственного санитарного
врача Российской Федерации.
Сведения о регистрации пищевой продукции заносятся в
Федеральный Реестр, который ведется Центром санитарно-
эпидемиологического нормирования, гигиенической сертифи-
кации и экспертизы Минздрава России и ежегодно, не позднее
15 февраля, официально издается.
Для сравнения Парламент Европейского Союза (ЕС) одоб-
рил законопроекты, ужесточающие правила регистрации и ис-
пользования генетически модифицированных (ГМ) продуктов.
Согласно этим законопроектам производители и создатели та-
ких семян, пищи и лекарственных препаратов обязаны зареги-
стрировать их, получить лицензию, гарантировать непрекра-
щающиеся наблюдения за товаром на всех стадиях – от изго-
товления до потребления. Покупатели должны быть уведом-
лены о природе продуктов.

209
 Примеры государственной регистрации трансгенных куль-
тур для пищевых целей в России, с одной стороны, указывают
на достижение генетической инженерии в области практиче-
ского использования трансгенных растений, а с другой – сто-
роны вызывают определенные опасения возможных негатив-
ных последствий приема «трансгенной» пищи для здоровья че-
ловека.
Теоретически введенный в растение ген – это участок ДНК,
а его продукт – белок. В желудочно-кишечном тракте нуклеи-
новые кислоты (ДНК и РНК) расщепляются на нуклеотиды
(аденин, гуанин, цитозин, тимин и урацил), а белки – на амино-
кислоты, которые не могут представлять никакой опасности.
В геном трансгенных растений добавляется чужеродная
ДНК, которая содержит функциональный ген, сигнальные эле-
менты трансгена (промотор, терминатор) и селективный (или
репортерный) ген.
В соответствии с Федеральным Законом «О государствен-
ном регулировании в области генно-инженерной деятельно-
сти» для выпуска в окружающую среду трансгенных сортов
необходимо выполнять условия системы безопасности в обла-
сти генно-инженерной деятельности. До подачи заявки в Госу-
дарственную комиссию по испытанию и охране селекционных
достижений трансгенный сорт должен пройти испытание на
биобезопасность, пищевую безопасность и экологическую экс-
пертизу. По окончании испытаний на биобезопасность и эколо-
гической экспертизы и по согласованию с Госанэпиднадзором
Межведомственная Комиссия по Проблемам Генно-инженер-
ной Деятельности выдает временное разрешение на проведе-
ние государственного сортоиспытания. После окончания госу-
дарственного сортоиспытания в случае получения положитель-
ных результатов испытаний на отличимость, однородность и
стабильность и положительного решения по пищевой безопас-
ности сорт может быть включен в Государственный реестр се-
лекционных достижений, допущенных к использованию.

210
 Обсуждение проблемы биологической и пищевой безопас-
ности трансгенных растений необходимо вести в рамках науч-
ных представлений на рациональной основе с обязательным
ознакомлением общественности в средствах массовой инфор-
мации обо всех этапах создания генетически модифицирован-
ных организмов, начиная с лабораторных и заканчивая произ-
водственными испытаниями, которые должны осуществляться
в строгом соответствии с законодательством и правовыми нор-
мами Российской Федерации.

Контрольные вопросы
1. Что такое «биобезопасность»?
2. Приведите определение понятий «риск», «оценка
риска», «управление риском».
3. Биологическая безопасность трансгенных растений.
4. Пищевая безопасность трансгенных растений.

211
 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Решение ключевых проблем биотехнологии (загрязнение

окружающей среды, нехватка продовольствия, регулирование
репродукции живого мира, профилактика и лечение инфекци-
онных и неинфекционных болезней, поиск альтернативных ис-
точников энергии и другие) вносит весомый вклад в повыше-
ние уровня жизни человека.
Развитие современных направлений биотехнологии проис-
ходит настолько быстро, что точные прогнозные оценки в этой
области весьма затруднительны. Биологические технологии
базируются на достижениях науки. Полученные достижения
научных лабораторных исследований сегодня активно внедря-
ются в производство.
В последние годы многочисленные исследования показали
перспективность ряда методов (ПЦР, секвенирование и др.) для
решения не только фундаментальных, но и прикладных задач
благодаря их высокой чувствительности и специфичности.
Увеличивающееся число биотехнологических предприятий со-
здает потребность в специалистах в области биотехнологии.
В учебном пособии рассмотрены основополагающие во-
просы предмета «Биотехнология».
Структурирование изложенного материала формирует у
студентов творческое мышление, а перечень контрольных во-
просов позволяет организовать систему самоконтроля качества
изучения учебного материала.

212
 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Акимова Т. А. Экология : учебник для вузов /

Т. А. Акимова, Т. В. Хаскин. – М. : ЮНИТИ, 1999. – 455 с.
2. Бобович Б. Б. Переработка отходов производства и по-
требления : учебник для вузов / Б. Б. Бобович, В. В. Девяткин. –
М.: «СП Интермет Инжиниринг», 1999. – 445 с.
3. Бутенко, Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro
и биотехнологии на их основе/ Р. Г. Бутенко. – М. : ФБк-
Пресс. – 1999. – Т. 160. – С. 3.
4. Волова Т. Г. Биотехнология. – Новосибирск : Изд-во Си-
бирского отделения Российской Академии наук, 1999. – 252 с.
5. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и
применение; пер. с англ. / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М. : Мир,
2002. – 589 с.
6. Гореликова Г. А. Основы современной пищевой биотех-
нологии : учеб. пособие / Г. А. Гореликова. – Кемерово : Кеме-
ровский технологический институт пищевой промышленно-
сти, 2004. – 100 с.
7. Грачева И. М. Биотехнология биологически активных
веществ : учеб. пособие для студентов высших учебных заве-
дений / И. М. Грачева, Л. А. Иванова. – М. : Изд-во НПО «Эле-
вар», 2006. – 453 с.
8. Грачева И. М. Биотехнология биологически активных
веществ / И. М. Грачева, Л. А. Иванова. – М. : Изд-во НПО
«Элевар», 2006.
9. Грачева И. М. Технология ферментных препаратов /
И. М. Грачева, А. Ю. Кривова. – М. : Из-во «Элевар», 2000. –
512 с.
10. Клунова С. М. Биотехнология: учебник / С. М. Клу-
нова, Т.А. Егорова, Е.А. Живухина. – М. : Академия, 2010. –
256 с.
11. Кузнецов А. Е. Прикладная экобиотехнология:
учеб. пособие. В 2 т. / А. Е. Кузнецов [и др]. – М. : Бином. Ла-
боратория знаний. – 2010. – Т. 1 – 629 с.; Т. 2. – 485 с.

213
 12. Миркин Б. М. Краткий курс общей экологии. Ч. 2 : Эко-
логия экосистем и биосферы : учебник / Б. Н. Миркин,
Л. Г. Наумова. – Уфа : Изд-во БГПУ, 2011. – 180 с.
13. Миркин Б. Н. Краткий курс общей экологии. Ч. 1. Эко-
логия видов и популяций : учебник / Б. Н. Миркин,
Л. Г. Наумова. – Уфа: Изд-во БГПУ, 2011. – 206 с.
14. Нетрусов А. И. Экология микроорганизмов: учеб. для
студ. вузов / А. И. Нетрусов. – М. : Изд. центр «Академия»,
2004. – 272 с.
15. Тарантул, В.З. Толковый биотехнологический сло-
варь русско-английский: справочное издание [Электронный
ресурс] / В. З. Тарантул. – М. : Языки славянских культур,
2009. – 936 с.
16. Трошкова Г. П. Экологическая биотехнология : учеб.
пособие / Г. П. Трошкова, Е. К. Емельянова, Н. О. Карабин-
цева. – Новосибирск : Сибмедиздат НГМУ, 2011. – 144 с.
17. Шевелуха В. С. Сельскохозяйственная биотехнология :
учебник / В. С. Шевелуха. – М. : Высшая школа, 2003. – 469 с.

214
 ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ……………………………………………… 3
ГЛАВА 1. ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ……………. 4
1.1 Предмет биотехнологии………………….. 4
1.2 История биотехнологии…………………... 6
1.3 Объекты биотехнологии………………….. 8
1.4 Основные разделы биотехнологии………. 14
1.5 Области применения современной
биотехнологии…………………………….. 15
ГЛАВА 2. ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В БИОТЕХНОЛОГИИ 18
2.1 Генетическая информация в клетке……... 20
2.2 Гены, генетический код и его свойства…. 20
2.3 Биосинтез белка и нуклеиновых кислот… 22
2.4 Электрофорез нуклеиновых кислот……… 27
2.5 Ферменты генной инженерии…………….. 29
2.6 Векторы генной инженерии………………. 34
2.7 Конструирование рекомбинантных ДНК... 38
2.8 Определение нуклеотидной последовательности
(секвенирование) ДНК………………………. 41
2.9 Полимеразная цепная реакция……………. 45
2.10 Прямое введение гена в клетку…………. 48
ГЛАВА 3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ 53
3.1 Понятие о культивировании микроорганизмов 53
3.2 Отбор штаммов микроорганизмов
и работа с ними……………………………… 55
3.3 Приготовление посевной микробной культуры 56
3.4 Приготовление и стерилизация
питательных сред…………………………… 57
3.5 Выращивание микроорганизмов
в реакторе и контроль за процессом
культивирования…………………………….. 72
3.6 Хемостатная культура, или метод
непрерывного культивирования
микроорганизмов…………………………... 76

215
ГЛАВА 4. БИОТЕХНОЛОГИЯ В РАСТЕНИЕВОД-
СТВЕ
4.1 Вегетативное размножение растений 79
методом культур тканей…………………
4.2 Фитогормоны и синтетические регуляторы 81
роста и развития растений
4.3 Клеточные технологии в растениеводстве 92
4.4 Клональное размножение растений 96
4.5 Поверхностное культивирование клеток 100
растений……………………………………
4.6 Культивирование клеток растений 101
в глубинных условиях……………………..
4.7 Иммобилизация растительных клеток…… 102
4.8 Сохранение культур клеток растений……. 103
4.9 Использование методов генетической 104
инженерии в фитобиотехнологии…………
ГЛАВА 5 БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ 107
КОНСЕРВИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ……
5.1 Консерванты простого действия…………. 107
5.2 Консерванты комплексного действия……. 111
5.3 Консерванты, обогащающие корма азотом 111
5.4 Консерванты, обогащающие корма серой 112
5.5 Консерванты, обогащающие корма фосфором 113
5.6 Биологические консерванты……………… 113
5.7 Фитонцидные консерванты……………….. 122
ГЛАВА 6. БИОКОНВЕРСИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ 124
И ОТХОДОВ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО
ПРОИЗВОДСТВА…………………………….
6.1 Классификация сырьевых ресурсов……….. 126
6.2 Ферментные системы микроорганизмов….. 128
6.3 Конверсия побочной продукции 131
перерабатывающих производств
в дрожжевую биомассу………………………..
6.4 Биоконверсия агропромышленного сырья в 136

216
 биотопливо……………………………………
6.5 Производство органических удобрений и 142
питательных грунтов для растений………..
ГЛАВА 7. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ УДОБРЕНИЯ………… 149
7.1 Биоудобрения………………………………. 149
7.2 Биоудобрения на основе азотфиксирующих 153
микроорганизмов…………………………..
7.3 Комплексные биоудобрения………………. 161
ГЛАВА 8. ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ. 166
8.1 Экологическая биотехнология как наука… 166
8.2 Биологическая очистка сточных вод……... 171
8.3 Биологическая очистка и дезодорация 187
газовоздушных выбросов………………….
ГЛАВА 9. ОБЕСПЕЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ 193
БЕЗОПАСНОСТИ……………………
9.1 Биологическая и пищевая безопасность 199
трансгенных растений и продукции из генети-
чески модифицированных источников
……………………..
ЗАКЛЮЧЕНИЕ…………………………………………. 212
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………. 213

217
 Учебное издание

Мачнева Надежда Леонидовна

Гнеуш Анна Николаевна
Кощаев Андрей Георгиевич

ОСНОВЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

Учебное пособие

В авторской редакции
Макет обложки – Н. П. Лиханская

Подписано в печать 00.01.2021. Формат 60 × 84 1/16.

Усл. печ. л. – 12,6. Уч.-изд. л. – 9,9.

Типография кубанского государственного

аграрного университета.
350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13

218