Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
го
УДК 5 7 « v - 3 4 ^
Рецензенты:
зав. кафедрой пищевой биотехноло зав. кафедрой технологии микробио
гии Санкт-Петербургской государствен логического синтеза Санкт-Петербург
ной академии холода и пищевых техно ского государственного технологического
логий, член-корреспондент академии хо института, академик МАНЭБ Яковлев
лода, профессор Василинец И. М. В. И.
Блинов Н. П.
Е51 Основы биотехнологии. Для студентов институтов;
аспирантов и практических работников. Издательская
фирма "Наука" СПБ 1995 т.е., 600 стр. 166 ил.
ISBN 5-02-026027-4
Книга включает общую и специальную биотехнологии. В ней рассмотрены
объекты и методы, фундаментальные и прикладные аспекты микро-, фито- и
зообиотехнологии, приведены основные биотехнологические процессы получения
различных веществ с помощью микробных, растительных и животных клеток, дана
характеристика оборудования, используемого в конкретной биотехнологии, указа
ны пути утилизации и обезвреживания плотных и жидких отходов в соответству
ющих производствах.
ББК 30.16
8
ВВЕДЕНИЕ
Современный уровень развития биотехнологии обусловлен
общим прогрессом науки и техники, особенно — в течение послед
них 50 лет. Достаточно отметить лишь такие события, как установ
ление структуры и функций нуклеиновых кислот, обнаружение
ферментов рестрикции ДНК и выявление их значения в жизни
клеток с последующим использованием в генно-инженерных ра
ботах, создание гибридом и получение моноклональных антител,
внедрение ЭВМ и компьютерной техники в биотехнологические
процессы и т. д.
Изучение биотехнологии невозможно без знания основ хими
ческих дисциплин и, прежде всего, органической, биологической
и коллоидной химии, ряда биологических дисциплин (общей био
логии, микробиологии, ботаники, генетики, иммунологии, эколо
гии), а также процессов и аппаратов химической и биологической
технологии и ряда других общеинженерных дисциплин.
Биотехнологию относят к числу приоритетных наук, где можно
прогнозировать более быстрые и важнейшие достижения для
социально-экономического прогресса общества.
Ведущее положение в области внедрения биотехнологических
разработок ныне занимают США, где к концу 80-х. годов биотех
нологическими проблемами было занято 349 компаний, включая
296 — чисто биотехнологических, расходовавших на эти цели,
например, в 1987 г. 1 млрд. 200 млн. долларов. Среди них можно
назвать Genentech Inc., Alza сотр., Amgen Inc., Cetus сотр., Biogen,
Ceptocor Inc., Chiron сотр., Xoma corp., Immunex сотр., DNA Plant
Technology, Celgene сотр., Damon Biotech Inc., и др. При этом
области исследования включали: создание лекарств и диагности
ческих средств (467 млн. долларов), специальных химических
соединений (144 млн. долларов); животноводство и растениеводст
во (168 млн. долларов); оборудование (48 млн. долларов) и т. д.
Food and Drug Administration (FDA) в 1982 г. одобрила и
разрешила применение первого биотехнологического продукта —
генно-инженерного инсулина; в последующие годы было разреше
но применять еще 8 биотехнологических препаратов: два варианта
гормона роста человека, два варианта 2ос-интерферона для лечения
волосатоклеточной лейкемии, активатор тканевого плазминогена
(ТРА) для лечения тромбоза коронарных сосудов, вакцину против
гепатита В, фактор VIII для лечения гемофилии, мышиные моно-
клональные антитела для предупреждения отторжения почечных
трансплантатов.
9
К 1988 г. в США свыше 80 лекарственных веществ и вакцин
были объектами биотехнологических разработок, 14 и з которых
были представлены на утверждение в FDA: тромболитические
агенты; ферменты дисмутазы, предупреждающие клеточные по
вреждения, наступающие при реперфузии гипоксических тканей;
гормон эритропоэтин, стимулирующий эритропоэз; эпидермаль-
ный ростовой фактор для ускоренного заживления ран; монокло-
нальные антитела для трансплантации костного мозга, лечения
септического шока, рака и патологических состояний от передо
зировок лекарств и др. (к 1988 г. было одобрено 300 наборов
моноклональных антител). К 1995 г. стоимость поступающих на
рынок только моноклональных антител прогнозировалась в 6,4
биллиона долларов.
Из научных учреждений России ведущее место по биотехно
логии занимает институт биохимии и физиологии микроорганиз
мов РАН (ИБФМ), сотрудники которого, например, совместно с
учеными научно-исследовательского вычислительного центра
(НИВЦ) в 1985 г. создали автоматизированный комплекс "Фермен
тер-ЭВМ", что обеспечивает возрастание эффективности управле
ния процессом биосинтеза; существенный вклад в решение био
технологических проблем в России внесли коллективы ВНИИ
"Синтез-белок", ВНИИ биотехнологии, ВНИИА, Сибирское отде
ление РАН, институт молекулярной биологии РАН, институт гене
тики и селекции промышленных микроорганизмов и др.
В России давно и хорошо известны предприятия, выпускающие
биотехнологическую продукцию (антибиотики, ферменты, различ
ные дрожжи и т. д.). Это ж е можно сказать и о предприятиях в
странах СНГ.
Основной вклад в подготовку кадров инженеров-биотехнологов
с 1945 г. вносил и продолжает вносить Санкт-Петербургский
химико-фармацевтический институт; с начала 80-х годов подготов
ка таких специалистов была расширена за счет открытия новых
биотехнологических отделений и факультетов в других вузах
страны. Сегодня изучение биотехнологии является "велением вре
мени" для высших и средних специальных учебных заведений, в
которых подготавливаются молодые специалисты для соответству
ющих отраслей производства. Объем и программы курсов могут
варьировать в зависимости от профилизации учебного заведения.
В настоящем издании, по возможности, затронуты все основные
аспекты биотехнологии, и поэтому эта книга может быть исполь
зована также и сотрудниками учреждений^ призванных выпускать
биотехнологическую продукцию.
ю
Часть I
Биотехнология —
как научная дисциплина
Глава 1
ПРЕДМЕТ, ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ,
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ БИОТЕХНОЛОГИИ
Биотехнология — это наука об использовании биологических
процессов в технике и промышленном производстве. Название ее
происходит от греческих слов bios — жизнь, teken — искусство,
logos — слово, учение, наука. К числу биологических процессов
и
относят те из них, в которых применяют биологические объекты
различной природы (микробной, растительной или животной),
например, производство ряда продуктов медицинского, пищевого
и другого назначения — антибиотики, вакцины, ферменты, кор
мовой и пищевой белки, полисахариды, гормоны, гликозиды, ами
нокислоты, алкалоиды, биогаз, удобрения и пр.
В соответствии с определением Европейской Федерации Био
технологов (ЕФБ, 1984) биотехнология базируется на интегральном
использовании биохимии, микробиологии и инженерных наук в
целях промышленной реализации способностей микроорганизмов,
культур клеток тканей и их частей. Уже в самом определении
предмета отражено его местоположение как пограничного, благо
даря чему результаты фундаментальных исследований в области
биологических, химических и технических дисциплин приобрета
ют выраженно прикладное значение. Биотехнология непосредст
венно связана с общей биологией, микробиологией, ботаникой,
зоологией, анатомией и физиологией, биологической, органиче
ской, физической и коллоидной химией, иммунологией, биоинже
нерией, электроникой, технологией лекарств, генетикой и другими
научными дисциплинами.
Человек, рождающийся для познания мира (в том числе — и
самого себя), давным-давно освоил на практике различные процес
сы биотехнологии, не зная по существу, что они относились к
такому разряду. В самом деле, с библейских времен известно
виноделие, тысячелетия насчитывает хлебопечение и т. д.
Познавательная деятельность людей непосредственно сказыва
лась на уровне социального развития общества. Недаром вторую
половину XX столетия мы называем периодом научно-технической
революции. Наука сегодня имеет огромное значение в жизни
людей, и научный подход к решению любой задачи — веление и
требование времени.
Наука формировалась и эволюционировала по мере формиро
вания и развития человеческого общества. Это, в частности, не
посредственно относится и к биотехнологии. Ее возникновение,
становление и развитие условно можно подразделить на 4 периода:
эмпирический, этиологический, биотехнический и генотехниче-
ский. Эмпирический (от греч. empeirikos — опытный) или доисто
рический период — самый длительный, охватывающий примерно
8000 лет, из которых более 6000 лет — до нашей эры и около 2000
лет — нашей эры. Древние народы того времени интуитивно
использовали приемы и способы изготовления хлеба, пива и
12
некоторых других продуктов, которые теперь мы относим к раз
ряду биотехнологических. Кризис охотничьего промысла (хозяй
ства) стал побудительным мотивом революции в изготовлении
продуктов питания. Эта революция началась около 8000 лет назад
и привела к изобретению техники земледелия — началу произво
дительного ведения хозяйства (неолит и бронзовый века.) Стали
формироваться так называемые приречные цивилизации Месопо
тамии, Египта, Индии и Китая. Шумеры — первые жители Месо
потамии (на территории современного Ирака) создали цветущую
в те времена цивилизацию. Они выпекали хлеб из кислого теста,
владели искусством готовить пиво. В этом следовали им ассирийцы
и вавилоняне, жившие также в Месопотамии, египтяне и древние
индусы. В течение нескольких тысячелетий известен уксус, издрев
ле приготавливавшийся в домашних условиях, хотя о микробах —
индукторах этого процесса мир узнал в 1868 г. благодаря работам
Пастера, и это несмотря на существование с XIV в. так называемого
"Орлеанского способа" приготовления уксуса; первая дистилляция
вина осуществлена в XII в.; водку и з хлебных злаков получили в
XVI в.; шампанское известно с XVIII в., но получение почти
абсолютного этанола впервые удалось в XIV в. испанцу Раймунду
Луллию (ок. 1235 — 1315) благодаря перегонке вина с негашеной
известью.
В те древние времена продукты питания растительного и
животного происхождения использовались не только в пищу, но
и для лечебных целей. Например, в ассирийской столице Ниневии
(8 — 7 века до н. э.) была царская библиотека, насчитывавшая
более 30 000 клинописных табличек, из которых в 33 имелись
сведения о лекарственных средствах и их рецептуре, и в самом
городе размещался сад лекарственных растений.
К| тому ж е эмпирическому периоду относятся: получение кис
ломолочных продуктов, квашеной капусты, медовых алкогольных
напитков, силосование кормов, мочка лубоволокнистых растений.
Длительное накопление фактов происходило и в области ми
кологии (от греч. myxes — гриб). Сведения о грибах можно найти
в писаных источниках древности, а Луций Лициний Лукулл (106
— 56 гг. до н. э.), славившийся богатством, роскошью и пирами("лу-
куллов пир"), предпочитал всем съедобным грибам кесарев гриб
(Amanita cesarea, L.). Древние евреи хорошо знали ржавчину
хлебных злаков и головню. В IV — I веках до н. э. были собраны
интересные материалы о грибах, нашедшие отражение в работах
Аристотеля, Диоскорида, Плиния Младшего, Теофраста. В после-
13
дующие века нашей эры микология стала самостоятельной наукой
— велика роль в этом Д. Персоона и Э. М. Фриза, по праву
считающихся отцами систематической микологии.
Таким образом, народы исстари пользовались на практике
микробиологическими процессами, ничего не зная о микробах.
Эмпиризм также был характерен и в практике использования
полезных растений и животных.
Второй, этиологический (от греч. aitia — причина) период в
развитии биотехнологии охватывает вторую половину XIX века и
первую треть XX века (1856 — 1933 гг.). Он связан с выдающимися
исследованиями великого французского ученого Луи Пастера (1822
— 1895) — основоположника научной микробиологии и ряда
микробиологических дисциплин (промышленной, медицинской,
химической, санитарной). С аналитической микробиологией не
посредственно связано открытие Пастером молекулярной ассимет-
рии (стереоизомерии). Это, по существу, бриллиантовый век мик
робиологии. Пастер вскрыл микробную природу брожений, дока
зал возможность жизни в бескислородных условиях, эксперимен
тально опроверг ходячее тогда представление о самопроизвольном
зарождении живых существ, создал научные основы вакцинопро-
филактики и вакцинотерапии; предложил метод стерилизации,
называемый по его имени пастеризацией и т. д.
Немеркнущая слава Пастера не затмила имен его выдающихся
учеников и сотрудников: Э. Дюкло, Э. Ру, Ш. Э. Шамберлана, Ж .
А. Вильемена, И. И. Мечникова. В этот ж е период творили Р. Кох,
Д. Листер, Ш. Китазато, Г. Т. Риккетс, Д. И. Ивановский, А. Лаверан
и другие.
Параллельно с Пастером трудился в Германии, а позднее — во
Франции, выдающийся миколог А. де Бари (1831 — 1888) —
основоположник физиологической микологии. Изучив стадии раз
множения и историю индивидуального развития грибов (онтоге
нетический метод), с учетом их взаимоотношений с другими
видами, а также цитологических и биологических особенностей,
де Бари создал классификацию, которая и сегодня лежит в основе
современных классификационных схем микро- и макромицетов.
Де Бари — основоположник микофитопатологии — науки о
грибных болезнях растений (от греч. fiton — растение, pathos —
болезнь), под его руководством сформироваласьплеядавыдающих-
ся ученых (в том числе — из России): Ф. М Бальфур, И. В.
Баранецкий, М. Бейеринк, О. Брефельд, М. С. Воронин, А. Кох, А.
С. Фаминицин и др.
14
В биотехнологии важными являются питательные среды для
культивирования ряда биообъектов. Уже Л. Пастер приготовил
первую жидкую питательную среду в 1859 году, метод выращива
ния грибов на желатине предложил О. Брефельд в 1864 г., Ж. Ролен
сообщил о жидких средах для выращивания нитчатых грибов в
1870 г., Р. Коху в 1876 г. удалось вырастить бациллы сибирской
язвы в капле водянистой влаги, извлеченной из глаза погибшей
коровы. В 80-е годы XIX столетия Р. Кох предложил метод культи
вирования бактерий на стерильных ломтиках картофеля и затем
— на агаризованных питательных средах.
В настоящее время, предлагая самые сложные и необычные в
каком-либо отношении среды для выращивания биообъектов, мы
опираемся на основополагающие результаты этих выдающихся
ученых. Аналогичным образом можно сказать и о вариантах
способов стерилизации питательных сред, имея в виду тиндализа-
цию, кипячение, дробную стерилизацию и др. Все они основыва
лись на необходимости уничтожения посторонней микрофлоры,
которая попадала в среды в процессе их изготовления.
В ряду открытий всемирного значения стоит обнаружение в
1892 г. вируса мозаичной болезни табака Д. И. Ивановским (1864
— 1920). Последовавшие за этим обнаружения других вирусов
обеспечили становление новой научной дисциплины — вирусоло
гии: Ф. Леффлер и П. Фрош в 1898 г. открыли вирус ящура, Д.
Кэррол в 1901 г. — вирус желтой лихорадки, ф. Туорт в 1915 г. и
Ф. д'Эрелльв 1917 г. — вирусы бактерий (бактериофаги). Большой
вклад в вирусологию был внесен отечественными и зарубежными
учеными — Л. А. Зильбером, А. А. Смородинцевым, М. П. Чума
ковым, А. Борелем, К. Левадити, К. Ландштейнером, В. Стэнли, П.
Лейддоу, П. Руа, П. Ф. Эндерсом и многими другими-
Этиологический период знаменателен тем, что удалось доказать
индивидуальность микробов и получить их в чистых культурах.
Более того, каждый вид мог быть размножен на питательных средах
и использован в целях воспроизведения соответствующих процес
сов (бродильных, окислительных и др.). Например, маслянокислые
бактерии и вызываемое ими маслянокислое брожение, лактобак-
терии и молочнокислое брожение, дрожжи — сахаромицеты и
спиртовое брожение, уксуснокислые бактерии и окисление этано
ла до уксусной кислоты и т. д. В этот период было начато
изготовление прессованных пищевых дрожжей, а также некото
рых продуктов обмена (метаболизма) — ацетона, бутанола, лимон
ной и молочной кислот; во Франции приступили к созданию
15
биоустановок для микробиологической очистки сточных вод.
Знание причин биологических процессов еще не исключало
нестерильные операции, хотя и стремились к использованию
чистых культур микроорганизмов.
Для всестороннего изучения морфолого-физиологических
свойств и продуктов обмена, прежде всего, микробов все ранее
предложенные способы их выращивания оказались малопригод
ными. Более того, накопление однородной по возрасту большой
массы клеток оставалось исключительно трудоемким процессом.
Вот почему требовался принципиально иной подход для решения
многих задач в области биотехнологии. В 1933 году А Клюйвер и
Л. X. Ц. Перкин опубликовали работу "Методы изучения обмена
веществ у плесневых грибов", в которой изложили основные
технические приемы, а также подходы к оценке и интерпретации
получаемых результатов при глубинном культивировании грибов.
С этого времени начинается третий период в развитии биологи
ческой технологии — биотехнический. Началось внедрение в
биотехнологию крупномасштабного герметизированного оборудо
вания, обеспечившего проведение процессов в стерильных усло
виях. Особенно мощный толчок в развитии промышленного био
технологического оборудования был отмечен в период становления
и развития производства антибиотиков (время второй мировой
войны 1939 — 1945 гг., когда возникла острая необходимость в
противомикробных препаратах для лечения больных с инфициро
ванными ранами). Все прогрессивное в области биологических и
технических дисциплин, достигнутое к тому времени, нашло свое
отражение в биотехнологии. Следует отметить, что уже в 1869 г.,
Ф. Мишер получил "нуклеин" (ДНК) из гнойных телец (лейкоци
тов); В. Оствальд в 1893 г. установил каталитическую функцию
ферментов; Т. Леб в 1897 г. установил способность к выживанию
вне организма (в пробирках с плазмой или сывороткой крови)
клеток крови и соединительной ткани; Г. Хаберланд в 1902 г.
показал возможность культивирования клеток различных тканей
растений в простых питательных растворах; Ц. Нейберг В 1912 г.
раскрыл механизм процессов брожения; Л. Михаэлис и М. Л.
Ментен в 1913 г. разработали кинетику ферментативных реакций,
а А. Каррел усовершенствовал способ выращивания клеток тканей
животных и человека и впервые применил экстракт эмбрионов
для ускорения их роста; Г. А. Надсон и Г. С. Филлипов в 1925 г.
доказали мутагенное действие рентгеновских лучей на дрожжи, а
в 1937 г. Г. Кребс открыл цикл трикарбоновых кислот (ЦТК); в 1960
16
г. Ж. Барски и др. впервые обнаружили соматические гибриды
опухолевых клеток мыши. Следовательно, накопленные научные
факты стали побудительным мотивом для разработки способов
крупномасштабного культивирования клеток различного проис
хождения. Это.необходимо было для получения различных клеточ
ных продуктов и самих клеток для нужд человека, и, прежде всего,
в качестве или в составе лечебных и профилактических средств:
пенициллина, стрептомицина, тетрациклинов, декстрана, ряда ами
нокислот и многих других веществ. К 1950 г. Ж. Моно (Франция)
разработал теоретические основы непрерывного управляемого
культивирования микробов; в 50-е годы вопросам практической
реализации непрерывного культивирования микроорганизмов по
святили свои исследования М. Стефенсон, И. Малек, Н. Д. Иеру
салимский и др.
Примерно за 40 лет третьего периода были решены основные
задачи по конструированию, созданию и внедрению в практику
необходимого оборудования, в том числе главного из них —
биореакторов. Это оборудование используют и в настоящее время.
Четвертый период в биотехнологии — генотехнический (от
греч. genesis — происхождение, возникновение, рождение) начал
ся с 1972 г. В этом году П. Берг со своими сотрудниками в США
создали первую рекомбинантную молекулу ДНК. Однако следует
отметить, что в 1969 г. Дж. Бекуит с коллегами выделил в химически
чистом виде лактозный ген из кишечной палочки, показав тем
самым возможность направленных манипуляций с генетическим
материалом бактерий.
Естественно, что без фундаментальной работы Ф. Крика и Дж.
Уотсона (1953) по установлению структуры ДНК было невозмож
ным достигнуть современных результатов в области биотехноло
гии. Выяснение механизмов функционирования и регуляции ДНК,
выделение и изучение специфичных ферментов привело к фор
мированию строго научного подхода к разработке биотехнологи
ческих процессов на основе генно-инженерных работ. В этом суть
генотехнического периода.
Уже в 1982 г. поступил в продажу человеческий инсулин,
выработанный кишечными палочками, несущими в себе искусст
венно встроенную генетическую информацию об этом гормоне.
На таком же уровне или с близким к тому заделом находятся
следующие генно-инженерные препараты: интерфероны, фактор
некротизации опухоли (TNF), интерлейкин-2, соматотропный гор
мон человека и аналог его соматомеднн Ц и другие^ _ _ , '" •"""**"
] 7 I f . Я " •":.::'• А
i ;:..-,-•;-.- :• L :, '..-'/•' - т с •: н и о й
•-;.,,;:,, '•... с i '.'.':;. с к о й л " , л ;л хл-м
Зная строение аппарата наследственности у разных организ
мов, удается манипулировать не только нуклеиновыми кислотами,
но и целыми хромосомами (хромосомная инженерия) и клетками
(клеточная инженерия).
Для генотехнического периода характерны: разработка интен
сивных процессов (вместо экстенсивных) на основе направленных
фундаментальных исследований (с продуцентами антибиотиков,
ферментов, аминокислот, витаминов), получение суперпродуцен
тов; создание продуцентов, несущих в себе бессмысленную гене
тическую информацию (например, гены интерферона человека в
клетках Pseudomonas aeruginosa); создание необычных организ
мов, ранее не существовавших в природе (неклубеньковых расте
ний, несущих гены азотобактерий, ответствейные за способность
фиксировать молекулярный азот из воздуха); разработка и внед
рение экологически чистых и, по возможности, безотходных тех
нологий; разработка и внедрение в практику специальной аппара
туры блочного (сменного) типа для различных биотехнологических
схем; автоматизация и компьютеризация биотехнологических про
цессов; создание экономически оптимальных производственных
процессов при максимальном использовании сырья и минималь
ном потреблении энергии. Вот почему инженер — биотехнолог в
современном пониманикгдолжен быть широко и глубоко подготов
ленным специалистом, в распоряжении которого оказываются
сложнейшие биологические системы (или аналоги их), синхронно
работающие в заданном направлении. В любом биотехнологиче
ском процессе наиважнейшим звеном является биообъект, "кап
ризы" которого по любому поводу могут пагубно сказаться на
результатах этого процесса.
В течение последних 10 — 15 лет текущего столетия происхо
дило бурное развитие биотехнологии, определились сферы при
оритетного внедрения конкретных результатов биотехнологиче
ских разработок, и, как следствие, появились такие названия, как
медицинская биотехнология, иммунобиотехнология (от лат.
immunus — невосприимчивый), биогеотехнология (от греч. део —
земля), инженерная энзимология (от греч. en — в, zyme — заква
ска) . ОДНИ из них прочно входят в лексикон специалистов, напри
мер, иммунобиотехнология, инженерная энзимология, другие на
звания приживаются плохо или с трудом (медицинская биотехно
логия, биогеотехнология). К м е д и ц и н с к о й биотехнологии
относили те производственные процессы, которые завершались
созданием с помощью биообъектов средств или веществ медицин
ского назначения (прежде всего профилактического или лечебного
18
действия на организм человека). Это — антибиотики, некоторые
витамины, коферменты и ферменты, отдельные микробные пол
исахариды — как самостоятельные препараты или вспомогатель
ные вещества при создании различных лекарственных форм,
аминокислоты, нуклеозиды и др.
И м м у н о б и о т е х н о л о г и я объединяет производства
вакцин, иммуноглобулинов крови, иммуномодуляторов, иммуно-
медиаторов, моноклональных антител и некоторых других. Можно
заметить, что на основе иммунобиотехнологических процессов
создаются также профилактические и лечебные средства, объеди
няемые под эгидой медицинской биотехнологии. Следовательно
иммунобиотехнология представляется здесь частным случаем ме
дицинской биотехнологии. Вместе с тем, иммунобиотехнологиче-
ские процессы по целевым продуктам вышли за пределы медицин
ского назначения (например, в иммуноферментном анализе, им-
муноблотинге). В равной мере большинство ферментов (как и
аминокислот или некоторых других продуктов) производится не
для целей здравоохранения. Поэтому термин "Медицинская био
технология" представляется во многом искусственным и, очевидно,
отсюда плохо приживающимся. Напротив, вычленение иммуноби-
отехнологии в качестве самостоятельной научной субдисциплины
является обоснованным, и производственные процессы здесьчетко
ограничены использованием иммунной системы того или иного
макроорганизма или отдельных компонентов ее (макрофаги, лим
фоциты, различные иммуноглобулины).
Б и о г е о т е х н о л о г и я — это субдисциплина, ранее
называвшаяся геологической микробиологией. Сущность ее сво
дится к использованию микроорганизмов для добычи полезных
ископаемых, например, цветных металлов, нефти; для окисления
метана в угольных шахтах и пр. Спектр биогеотехнологических
производственных процессов невелик, но очень важен для жизне
обеспечения народного хозяйства. Необходимо подчеркнуть, что
не все процессы, относимые ныне к биогеотехнологическим, яв
ляются сугубо технологическими (например, окисление метана с
помощью специальных микроорганизмов). Обычно принято счи
тать, что в результате биотехнологического процесса образуется
какой-то целевой продукт, используемый на практике. В приведен
ном примере окисления метана преследуется иная цель — сниже
ние концентрации метана до безопасного (например, для шахте
ров) уровня. Хотя и в этой реакции образуются конечные продук
ты, которые могут быть использованы на практике:
С Щ + 0 2 — • СО2 + 2Н 2
19
И н ж е н е р н а я э н з и м о л о г и я — это отрасль
биотехнологии, базирующаяся на использовании каталитических
функций ферментов (или ферментных систем) в изолированном
состоянии или в составе живых клеток для получения соответст
вующих целевых продуктов. Биообъект здесь — фермент (или
комплекс ферментов). На практике обычно используют иммоби
лизованные ферменты (реже — иммобилизованные клетки), бла
годаря чему стабилизируется и пролонгируется их ферментативная
-активность. Иногда инженерную энзимологию отождествляют с
биотехнологией. В этом содержится большая доля истины, так как
все реакции в клетках катализируются ферментами. Однако слово
"инженерная" привносит свою специфику, заключающуюся в
акценте на создание конструкции (от франц. engin — машина), в
данном случае — на конструирование биокатализаторов с задан
ными свойствами с последующим использованием в биотехноло
гическом процессе.
В научной литературе можно встретить и другие названия
биотехнологических процессов, например, "Биотехнология живо
тной клетки", "Экономическая микробиология", "Ферментация и
биоинженерия", "Промышленная микробиология", "Сельскохозяй
ственная биотехнология", "Биохимическая инженерия" и др. Более
того, в принципе можно говорить и писать о биотехнологии
каждого индивидуального продукта, образуемого каким-либо мик
робом, какими-либо клетками растений и животных, или появля
ющегося под каталитическим воздействием фермента; в равной
мере речь может идти и о биотехнологии продуцентов каких-либо
веществ, например, о Panax ginzeng (жень-шень), о Rauwolfia
serpentina (Раувольфия змеевидная), об Actinomyces spp. (актино-
мицеты) и т. д. Поэтому наиболее рациональным является подраз
деление биотехнологии на микробную биотехнологию, раститель
ную, или фитобиотехнологию, и животную, или зообиотехноло-
гию, включающую также и биотехнологические процессы, осно
ванные на использовании клеток человека.
Из приведенной схемы видно, что наибольшее число реализо
ванных процессов имеет место в микробной биотехнологии. Мно
гие микроорганизмы обладают заметным преимуществом перед
растительными и животными объектами по таким показателям,
как скорость размножения, лабильность и быстрота адаптации к
изменяющимся условиям среды обитания. Этим и определяется
диапазон применения микробов в различных отраслях производ
ственной деятельности человека, то есть все то, что составляет
20
I Биотехнология .
I " •. | I
микробиотехнология фитобиотехиология зообиотехиология
использование
в легкой в агропромышленном в животноводстве,
промышленности, в комплексе, в медицинской
пищевой в медицинской и промышленности,
промышленности, косметической в пищевой
в медицинской промышленности промышленности
промышленности,
в химической
промышленности,
в металлургии,
в нефтедобывающей
промышленности,
в водном хозяйстве,
в защите окружающей
среды,
в энергетике,
в косметической
промышленности
Глава 2
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ БИОТЕХНОЛОГИИ
Объектами биотехнологии являются вирусы, бактерии, грибы
— микромицеты и макромицеты, протозоиные организмы, клетки
22
(ткани) растений, животных и человека, некоторые биогенные и
функционально сходные с ними вещества (например, ферменты,
простагландины, лектины, нуклеиновые кислоты и др.). Следова
тельно, объекты биотехнологии могут быть представлены органи
зованными частицами (вирусы), клетками (тканями) или их мета
болитами (первичными, вторичными). Даже при использовании
биомолекулы как объекта биотехнологии исходный биосинтез ее
осуществляется в большинстве случаев соответствующими клет
ками. В этой связи можно сказать, что объекты биотехнологии
относятся либо к микробам, либо к растительным и животным
организмам. В свою очередь организм можно образно характери
зовать как систему экономного, сложнейшего, компактного, само
регулируемого и, следовательно, целенаправленного биохимиче
ского производства, устойчиво и активно протекающего при оп
тимальном поддержании всех необходимых параметров. Из такого
определения следует, что вирусы не являются организмами, но по
содержанию молекул наследственности, приспособляемости, из
менчивости и некоторым другим свойствам они относятся к пред
ставителям живой природы.
Как видно из приводимой схемы, объекты биотехнологии
исключительно разнообразны, диапазон их распространяется от
организованных частиц (вирусов) (рис. 1А) до человека.
Вирусы занимают положение между живой и неживой приро
дой, у них нет ядра, хотя имеется наследственный ядерный мате
риал — рибонуклеиновая кислота (РНК) или дезоксирибонуклеи-
новая кислота (ДНК).
В отличие от микробов клеточной организации РНК и ДНК в
вирусных частицах вместе никогда не обнаруживаются.
Из сказанного следует, что названия "биологическая техноло
гия, или биотехнология" и "биохимическая технология" тождест
венны, так как биологические процессы, используемые в технике
и промышленном производстве, базируются на биохимической
основе.
В настоящее время большинство объектов биотехнологии со
ставляют микробы, относящиеся к трем надцарствам (безъядер
ные, предъядерные, ядерные) и пяти царствам (вирусы, бактерии,
грибы, растения и животные). Причем первые два надцарства
состоят исключительно из микробов, тогда как третье — преиму
щественно из растений и животных.
23
Безъядерные Предъядерные Ядерные
(Acaiyotae) (Procaryotae) (Eucaryotae)
Царства
I
Вирусы Бактерии Грибы
(Vira) (Bacteria) (Mycota)
Растения
(Plantes).
Животные
(Animalia)
М о р ф о л о г и ч е с к а я э л е м е н тар н а я
единица
Неклеточная
организованная Клетка Клетка
частица
Тип с о д е р ж а щ е й с я н у к л е и н о в о й
к и с л о т ы - ДНК и / и л и РНК
ний" . :«S* .
•та -0т. ф&. , & ,J
• • « ,
Ар х е о б а к т е р и и • Эубактерии
Предковые формы
Фототрофными бактериями являются оксигенные цианобакте-
рии, аноксигенные пурпурные и зеленые бактерии; хемотрофными
— грамположительные и грамотрицательные бактерии и бациллы,
миксобактерии, стебельковые и почкующиеся бактерии, вибрио
ны, спириллы, спирохеты, актиномицеты, коринебактерии, мико-
бактерии, риккетсии, хламидии, микоплазмы и спироплазмы.
Галобактерии включают роды Haloarcula, Halobacterium,
Halococcus, Natrobacterium, Natrococcus. Они обнаруживаются в
морских солеварнях (оптимум натрия хлорида для них 3,5 — 5 М).
Термоацидофильные бактерии обитают в кислых горячих ис
точниках при рН 2 — 3 и температуре 70° — 90°С (Sulfolobus
acidocoldarius), в самонагревающихся терриконах угольных шахт
при рН 1 — 2 и температуре 59°С (Thermoplasma acidophilum), в
горячих источниках на дне морей и на склонах вулканов при
температуре 85 — 105°С (Thermoproteus tenax, Т. neutrophilia и
АР-)-
Метаногенные бактерии, к которым относятся кокки
(Methanococcus vannielli), сарцины (Methanosarcinabarkeri), палоч
ки (Methanobacteriumformicicum, Methanobrevibacterruminantium),
спириллы (Methanospirillum hungatei) и другие формы, являются
анаэробными микроорганизмами. Они обитают в отстойниках
сточных вод городов и населенных пунктов, в навозе, в осадках на
дне прудов и озер, в рисовых полях, в лиманах и эстуариях (от лат.
aestuarium — берег, заливаемый приливом), в рубце жвачных
28
животных. Приуроченность их к широкому диапазону температур
естественна, учитывая среды обитания. Тем не менее, например в
рубце жвачных животных температура достаточно постоянная. .
Согласно определителю Д. X. Берги (1984, 1986) археобактерии
относятся к отделу мендосикутов, все другие бактерии, или эубак-
терии — к отделам: грациликутов, фирмикутов и тенерикутов (от
лат. mendosus—ложный, фальшивый, gracilis—стройный, тонкий,
firmus — прочный, tener—чувствительный, нежный, cutis — кожа).
Грациликуты объединяют грамотрицательные бактерии с двух
слойной клеточной стенкой (они, как правило, содержат фосфо-
липидную мембрану во внешнем слое клеточной стенки). Форма
клеток у них различная — от сферической до палочковидной, от
прямых до искривленных (изогнутых); подвижные или неподвиж
ные; не образуют эндоспор, размножаются делением (некоторые
— почкованием); многие обладают пилями (волосками, или фимб-
риями). По типам питания к грациликутам относятся фототрофы
(включая цианобактерии) и хемотрофы, по типам дыхания —
аэробы, анаэробы и факультативные анаэробы, по патогенности
— сапрофиты и паразиты.
Микроорганизмы с многослойным муреиновым каркасом от
носятся к фирмикутам. Все они грамположительные, спорообра-
зующие или не образующие спор; сюда же включены актиноми-
цеты и родственные им бактерии. Форма клеток различная —
круглые, палочковидные, ветвящиеся, нитевидные, неветвящиеся.
По типу питания — преимущественно хемогетеротрофы, по типу
дыхания — аэробы, анаэробы и микроаэрофилы, патогенные и
сапрофиты.
К тенерикутам относятся микоплазмы и спироплазмы (от греч.
myxes — гриб, plasma — вязкая, эластичная; speira — завиток,
спираль, кольцо) (рис. 1Б). Это мельчайшие свободноживущие
полиморфные бактерии, без клеточной стенки, сгруппированные
в классе Mollicutes (от лат. mollis — мягкий). Воспроизводятся они
почкованием, делением, сегментацией ветвистых структур; цитоп-
лазматическая мембрана трехслойна; все известные виды микоп-
лазм патогенны. Диаметр их 0,15 — 0,25 мкм, хотя полиморфизм
по длине клеток весьма широкий. Микоплазмы полностью устой
чивы к пенициллину; растут на специальных агаризованных сре
дах.
К мендосикутам относится единственный уже рассмотренный
класс археобактерии, заметно отличающийся от других микроор
ганизмов.
Известны еще так называемые мини- и макси-клетки бактерий,
29
в частности, Е. coli. Установленно, что клетки кишечной палочки,
несущие две мутации (min А и min В) делятся ассиметрично и в
каждое второе деление образуется круглая безъядерная мини-клет
ка (примерно в 3 раза меньше родительской клетки по размеру).
Мутации в генах гее А и uvr А сопровождаются инактивацией
основных систем репарации и существенным возрастанием чувст
вительности клеток к ультрафиолетовым лучам. Клетки Е. coli при
этом увеличиваются в размерах (макси-клетки). Мини- и макси-
клетки используются для включения многокопииных плазмид при
постановке генно-инженерного эксперимента.
Бактерии подразделяют на группы по источникам энергии,
углерода и донорам электронов (таблица 2), благодаря чему можно
выделить типичных представителей в каждой из них.
Так, цианобактерии относят к первой подгруппе, зеленые
несерные бактерии — к второй, нитрифицирующие бактерии —
к третьей, водородные бактерии — к четвертой и, наконец, бациллы
и другие микроорганизмы — к пятой. Для сравнения можно
указать, что дрожжи и нитчатые грибы из эукариот также отно
сятся к хемогетероорганотрофам.
В учебной и научной литературе можно встретить и такие
термины, как прототрофы, метатрофы, паратрофы, миксотрофы.
Следует подчеркнуть, что все эти термины были предложены в
начале XX в. в связи с разделением бактерий на группы по типам
Таблица 2. Деление микробов на группы по источникам энергии, углерода
и доноров электронов.
Источник
Номер
Группа доноров и название
энергии углерода электронов подгруппы
(водорода)
Фотот- Свет Неоргани Неорганические 1. Фотоавтолито-
рофные ческий вещества трофы
бактерии Органи Органические 2. Фотогетероор-
ческий вещества ган строфы
Хемот- Химичес Неоргани Неорганические 3. Хемоавтолито-
рофные кие ческий вещества трофы
бактерии реакции Органи Неорганические 4. Хемогетероли-
окисления ческий вещества тотрофы
- восста Органические 5. Хемогетероор-
новления вещества ганотрофы |
Примечание: + От греч. photos — свет, autos — сам, lythos — камень, trophia —
питание, etheros — иной, другой, organicos — органический.
30
питания. Так А. Фишер в 1903 г. предложил различать прототрофы
(автотрофы —'• по В. Пфеферу), не нуждающиеся в готовом орга
ническом веществе для питания, метатрофы (гетеротрофы — по
В. Пфеферу), нуждающиеся в органическом веществе — это
большинство сапрофитных микроорганизмов, и паратрофы, пита
ющиеся живым белком и обитающие лишь в организме других
существ — это все облигатные болезнетворные микробы; те виды,
которые могут расти на питательной среде в пробирке (in vitro) и
в организме чувствительного животного (in vivo), были названы В.
Пфефером миксотрофами (от лат. mixtus — смешанный). Приве
денные названия (прототрофы, метатрофы и миксотрофы) теперь
имеют больше исторический смысл. В 1946 г. была предложена
классификация микробов по способам питания, или трофики,
которой пользуются и в настоящее время (таблица 3).
| фундаментальные прикладные
| Открытие Г. Менделем единиц На основании принципов Менделя -
I наследственности у садового гороха; Моргана были созданы
I исследования Т. Моргана и рациональные методы селекции в
I сотрудников с мушкой дрозофилой, растениеводстве и животноводстве, в
1 приведшие к всеобщему признанию микробиологии. С помощью этих
| законов Менделя. методов были выведены новые сорта
сельскохозяйственных растений,
новые породы домашних животных,
высокопродуктивные штаммы
микроорганизмов; выявлены
наследственные болезни у человека,
определены пути и созданы методы
рациональной их профилактики и
терапии.
| Вскрытие Л. Пастером причины Разработаны и осуществлены меры
1 болезни шелковичных червей во по спасению производства шелка.
I Франции.
I Обезвреживание болезнетворных Создание профилактических и
I микробов при сохранении их лечебных иммунопрепаратов
| антигенности. (вакцин, сывороток,
иммуноглобулинов).
I Выведение М. Фарадеем законов Создание методов и приборов для
I электролиза на основании изучения выделения веществ при электролизе,
1 действия электрического тока на для определения
I водные растворы различных веществ. электропроводности, для
профилактической и
терапевтической электростимуляции
при некоторых патологических
состояниях у людей и т. д.
| Открытие радиоактивных элементов Создание и применение
I Марией и Пьером Кюри. рентгеновских методов
исследования, радиотерапия раковых
заболеваний, эксплуатация атомных
электростанций и др.
I Формулирование проблемы Создание промышленности
| антагонизма между микробами и ее антибиотиков и применение
I экспериментальное подтверждение. антибиотических препаратов в
здравоохранении.
Глава 3
Фундаментальные исследования
в области энзимологии
Любая клетка - целостная система, составные части которой
структурно и функционально взаимозависимы. Эта зависимость
выражается прежде всего в генетически обусловленном синтезе
белковых молекул - преимущественно ферментов. В хронологиче
ском порядке только белки - продукты матричного синтеза должны
45
относиться к разряду первичных; все другие молекулы, возника
ющие под каталитическим .действием ферментов, оказываются
вторичными. Выдающийся шведский химик И. Я. Берцелиус,
предложивший в 1836 г. термин "катализ" (за 35 лет до выявления
М. Манасеиной каталитических функций дрожжевого сока в 1871
г.), пророчески писал: "У нас есть все основания предполагать, что
в тканях и жидкостях растений и животных происходят тысячи
каталитических процессов". И это в то время, когда ферменты еще
не были известны науке. Теперь, например, утверждается, что в
мельчайшей клетке (0,1 мкм в диаметре), относящейся к Mollicutes,
содержится более, чем 100 ферментов, то есть столько, чтобы
клетка могла самостоятельно функционировать как организм. Ес
тественно, что в клетке других прокариот и эукариот насчитывают
более 1000 биокатализаторов. Большинство микробов лишено спе
циализированных структур, хотя бы отдаленно напоминающих
органы дыхания, пищеварения и другие, присущих высшим эука-
риотам. Поэтому основная метаболическая нагрузка (метаболизм
- это биологический обмен веществ и энергии) в процессах их
роста, развития и размножения падает на ферменты. В любой
живой клетке находятся малые и большие (полимерные) молекулы
различных веществ. Они должны синтезироваться в клетке, а
некоторые секретироваться из нее (нередко, распадаясь перед этим
на более мелкие составные части или их производные). Во всех
таких процессах участвуют ферменты. Уже сегодня известно около
2000 индивидуальных ферментов и это не предел. В клетках
прокариот и эукариот ферменты распределены и локализованы
целесообразно, например, в цитоплазме находятся почти все фер
менты гликолиза, в матриксе митохондрий - ферменты цикла
трикарбоновых кислот и |3-окисления жирных кислот, ферменты
окислительного фосфорилирования - во внутренней мембране
митохондрий.
В клетке E.coli нить ДНК имеет размеры 1,4»106хЗ,0 нм, а массу
1»10"14 г. В разомкнутом состоянии длина ее составит примерно 1,4
мм, то есть подобная ДНК приблизительно в 500 раз длиннее
бактериальной клетки, вмещающей эту ДНК. Такая хромосома
кишечной палочки заключает в себя- информацию, достаточную
для кодирования 4500 белков, значительная часть которых будет
представлена ферментами.
Ферменты составляют основную массу клеточных белков. На
долю одного фермента приходится от сотых долей процента (у
некоторых вирусов) до 10-12% (у ряда микроорганизмов клеточной
организации, например у E.coli). В то ж е время хромосомная ДНК
не есть простая последовательность множества генов. Поэтому
46
нельзя считать, что количество хромосомной ДНК, например у
представителей эукариотических организмов пропорционально
уровню их эволюционного развития. В таком случае некоторые
лягушки и рыбы были бы развиты более, чем животные и человек,
поскольку у них размер генома достигает 1010 - 1 0 " пар нуклеотидов
(пн), а у млекопитающих и человека он на 1 - 2 порядка н и ж е (109
- 1010 пн). Суть здесь в том, что у высокоразвитых существ
значительная часть ДНК оказываетсяя молчащей, так как она
образована не генными последовательностями (у человека к этому
типу относится 80 - 90% всей ДНК) или повторяющимися огромное
число раз идентичными последовательностями. Все это не может
не сказываться на ферментном наборе в клетках, органах и тканях,
равно как и на их функциональной активности.
Ферменты давно являются объектами биотехнологии - их ин
дустрия зародилась в начале XX в., и объемы ферментного произ
водства продолжают нарастать, а что касается публикаций о био
катализаторах, то в мире появляется более 10 000 статей ежегодно.
Ферменты присущи любой живой клетке и, в небольшом ассорти
менте - организованным частицам (вирусами). Наука, изучающая
ферменты, называется энзимологией, а инженерная энзимология
- это ветвь или субдисциплина биологической технологии, изуча
ющая биотехнологические процессы, в которых используется ка
талитическое действие ферментов. Главная задача инженерной
энзимологии заключается в практической реализации фермента
тивных процессов в целях экономичного получения различных
веществ и энергии для нужд народного хозяйства.
Чтобы выйти на уровень инженерной энзимологии, необходи
мо решать многие основополагающие проблемы и задачи, к кото
рым можно отнести:
1) способы выделения и очистки ферментов в зависимости от
их топологии в биообъекте или при выделении в среду обитания;
2) определение состава и строения фермента;
3) особенности кинетики ферментативного действия в зависи
мости от внешних условий;
4) оценку активности ферментов в зависимости от их чистоты
или, напротив, от наличия естественных примесей или искусствен
ных добавок;
5) механизмы и пути регуляции синтеза и активности фермен
тов;
6) моделирование действия ферментов в иммобилизованном
состоянии, учитывая при этом иммобилизацию индивидуальных
ферментов и полиферментных систем, каковыми являются ж и в ы е
клетки;
47
7) аппаратурное оформление ферментативных процессов;
8) экономичность ферментативных процессов, рекомендуемых
к внедрению в производство.
Некоторые из этих проблем и задач будут рассмотрены в
данном разделе, другие (6-8) - во второй части учебника.
Распределение ферментов в клеточных структурах неравноз
начное, и независимо от того, что биосинтез их осуществляется в
элементах ядерного аппарата, часть ферментов секретируется
внеклеточно - преимущественно гидролазы. Это обусловлено не
обходимостью расщепления полимерных веществ до такого уров
ня, чтобы продукты гидролиза могли поступить в клетку для
конструктивного и/или энергетического обменов.
К ферментам внеклеточного типа можно отнести микробные
амилазы, липазы и пешид-гидролазы, катализирующие реакции
гидролиза соответственно крахмала, жиров и белков. Животная
протеаза (пепсин) условно также может быть причислена в разряд
внеклеточных, так как она поступает из соответствующих клеток
(главных клеток слизистой оболочки желудка) в полость желудка;
то же можно сказать и о ферментах поджелудочной железы,
поступающих в просвет двенадцатиперстной кишки.
Следует иметь в виду, что многие ферменты синтезируемые в
клетках, являются з и м о г е н а м и , или неактивными
ферментами, и для трансформации их в активные формы необхо
дим ограниченный (специфический) посттрансляционный проте-
олиз.
В любом случае получение экзо- и эндоферментов на опреде
ленных этапах как бы унифицируется, когда все стадии выделения
и очистки будут определяться лишь их физико-химическими ха
рактеристиками. Так, при выделении экзофермента клетки проду
цента становятся отходом, а культуральная жидкость или, в другом
случае, желудочный сок - целевым продуктом-сырцом. Если речь
идет о необходимости получения эндоферментов, то содержащие
их клетки и ткани измельчают (дезинтегрируют) и экстрагируют
подходящим растворителем. Полученный раствор также представ
ляет собой полупродукт — сырец. И если речь здесь идет об одном
и том же ферменте,- но разного происхождения и топологии (экзо-
и эндо-), то, начиная с сырца, технологические схемы их выделения
будут во многом тождественными. В этом случае можно использо
вать такие подходы, как высаливание, сепарирование в градиентах
плотности каких-либо веществ, мембранную фильтрацию,- гель-
хроматографию, афинную хроматографию, ионный обмен и дру-
48
гие. При необходимости выделют ферменты, локализованные в
каких-либо структурах клетки. Тогда, с учетом физико-химических
характеристик таких структур (размер, плотность, форма), приме
няют дифференциальное центрифугирование после дезинтегра
ции клеток (тканей). При этом сферические частицы различной
плотности и/или размера будут перемещаться в центрифужной
пробирке на одно и то же расстояние за разное время. Время
прохождения частицы из одного положения (п) в другое (гг) можно
определить, исходя из следующего уравнения:
. 9 л т £2
2 0)2Д2(рр-р,) Ln
П •
где t — время, т| — вязкость центрифугируемой жидкости, ш
— угловая скорость, R — радиус частицы, рр — плотность частицы,
р/ — плотность центрифугируемой жидкости, -~ — коэффициент
силы тяжести.
Форма выделяемых частиц не всегда сферическая, и тогда в
используемые методы вносят необходимые поправки, или выбира
ют какие-либо другие способы изоляции и расчета. Ферменты —
глобулярные белки, поэтому при их разделении играют роль, в
основном, молекулярные массы (ММ) молекул, а не число субъ
единиц (С) в них. В качестве примера можно назвать химотрипсин
(ММ = 24500 Да, С = 3), щелочную фосфатазу (ММ = 80000 Да,
С = 2), лактатдегидрогеназу (ММ = 140000 Да, С = А), триптофаназу
(ММ = 220000 Да,С = 8), и др. Более того, известны ферменты,
катализирующие одну и ту же реакцию в организме одного вида,
но представляющие собой различные молекулярные формы. Их
называют изоферментами, выделение которых по высказанным
причинам заметно осложняется.
Большие по размеру компоненты (интактные клетки, неразру-^
шенные частицы ткани, ядра) осаждаются при дифференциальном
центрифугировании быстрее — их собирают в осадок при срав
нительно невысоких скоростях; супернатант (от. лат. supernatans
— всплывающий), или надосадок подвергают последующему цен
трифугированию при более высоких скоростях. При этом в осадке
могут быть митохондрии. В случае дальнейшего центрифугирова
ния при еще более высоких скоростях вращения ротора центри
фуги можно собрать рибосомы.
Во время вращения ротора с большой угловой скоростью со
развивается центробежное ускорение (G), во много раз превосхо
дящее силу тяжести и способное достигать величин 600—600000 g
49
(g = ускорение силы тяжести). G = со2г (г — расстояние, пройден
ное частицей). Так, для выделения ядер из дезинтеграта эукарио-
тических клеток требуется 10 минут центрифугирования при 600
д, для изоляции лизосом и митохондрий — 5 мин. при 15000 д, для
выделения рибосом — 1 час при 100000 д. Скорость продвижения
частицы в направлении г (Vr) описывается уравнением
Vr = -т- (t — время)
Центрифугирование дезинтеграта клеток или тканей при боль
ших скоростях в водной суспензии представляет собой турбулен
тный поток и сила сопротивления движению различных частиц
("твердых тел") определяется не вязкостью жидкости (т|), а ее
плотностью (р), тогда сила сопротивления называется гидравличе
ской и описывается формулой F = C/Spv2, где F — гидравлическая
сила сопротивления, Cf — коэффициент, зависимый от формы
твердого тела, S — площадь поперечного сечения тела. Для сфери
ческого тела значения Cf находятся в интервале 0,05 — 0,2 в
зависимости от характера поверхности (гладкая, шероховатая); для
тонкого диска, перпендикулярного потоку, Cf равна примерно 0,55.
Относительная роль динамического сопротивления и вязкого
трения сказывается на поведении движущейся жидкости и харак
теризуется безразмерным числом Рейнольдса:
T|iv Т|
где 1 — характерный линейный размер. При обтекании тел 1 —
это длина или поперечный размер, при течении в длинных трубках
1 — это диаметр трубки. В условиях центрифугирования скорости
частиц и, следовательно, их числа Рейнольдса очень малы. Поэтому
для определения силы сопротивления среды, действующей на
частицу, пользуются законом Стокса. Согласно этому закону сила
сопротивления, испытываемая твердым шаром при его медленном
поступательном движении в неограниченно вязкой жидкости,
описывается выражением F = 67rnRv, где R — радиус шара, т|
—коэффициент вязкости жидкости, v — скорость движения шара.
Параметры движения частицы можно вычислить по следующе
му уравнению, исключив из него коэффициент силы тяжести,
поскольку направление г перпендикулярно направлению силы
тяжести:
6m\RVr=^j- G(pp-p/),
где V r скорость частицы в направлении г, G — центробежное
ускорение, рр — плотность частицы, р/ -— плотность жидкости, Т|
— вязкость жидкости, R — радиус частицы.
50
При подходе к выбору биообъекта—продуцента того или иного
энзима важно иметь хорошую (по скорости роста, продуктивности
и активности фермента) культуру — штамм (не клон), так как
поддерживать его в лабораторных и производственных условиях
легче, чем клон. К тому ж е клоновые культуры используют, как
правило, для генетических целей.
Необходимо иметь в виду и такие факты, как полифермент-
ность культуральных жидкостей или тканевых экстрактов, и з
которых предстоит выделить те или иные ферменты в индивиду
альном виде. Это особенно относится к гликансинтетазам и глика-
назам, что является своеобразным отражением разветвленности
углеводных полимеров (участие в синтезе более, чем одной синте-
тазы) и их полидисперсности (опосредованность действия генети
ческого кода на процесс синтеза полисахарида во время роста и
развития культуры клеток или ткани, то есть здесь имеет место
нематричный синтез углеводного полимера). В таких случаях це
лесообразно применить афинную хроматографию (от англ. affinity
— сродство).
Афинная хроматография основана на специфичности биомо
лекул. Принципиально этим методом возможно получение абсо
лютно чистых веществ. В нативном состоянии ферменты за счет
своего активного центра и регуляторного участка (одного или
более) взаимодействуют с небольшим числом лигандов, которые
представляют собой субстраты, либо эффекторы. Благодаря высо
кому сродству активного участка фермента к лиганду, их обрати
мому связыванию и отсутствию какой-либо другой реакции между
лигандом и матрицей возможно эффективное проведение афинной
хроматографии.
В качестве лиганда обычно используют конкурентный обрати
мый ингибитор (см.), его ковалентно сшивают с соответствующей
нерастворимой матрицей так, чтобы он не терял своей способности
связываться с ферментом. Матрицей с лигандом в соответствую
щем буферном растворе заполняют колонку, а затем через нее
пропускают раствор фермента, подлежащий очистке. В колонке
задерживается лишь специфический фермент, а все другие при
меси уходят. После этого проводят элюцию специфического фер
мента, используя раствор субстрата в среде с другим рН и (или)
ионной силой. При разделении ферментов методом афинной хро
матографии необходимо знать все кинетические параметры целе
вого фермента, располагать хорошей матрицей и удачно подобран
ным лигандом. В качестве примера приводим схему путей сшива
ния лиганда с одной из возможных гидроксильных групп полиса-
51
харида агарозы (или сефарозы) через удлиняющие мостики, на
пример диаминов типа H2N(CH2)XNH2 (х = 2 — 6) и е-аминокапро-
новой кислоты:
н,с—сн—сн,—сн,
3 | 2 2
£• - а м и н о к а п р о н о в а я кислота
агарозная матрица
,CNBryR(CH2).NH2 ч, CN Br/NHj(CH 2 ) x NH 2
^*" бромциан
янтарный а н г и д р и д / С О (NH2^2
О
I
C=NH
I
(сн 2 ) х
R
производные
изомочееины
R - ЛИГАНД
о 5?
0 Н-н H-0-C-R
"\N-3-23X
гн.лн Б Э / ' ^ ГА \ Aar JT^-NH-CO-R
^-O-NH-c-CHjOH » l-c-NHCC^-NHj
I
CHjOH
о сно сно
II I I
-C-NH-CH-CH-JCHJ^-CH-CH-ICHJ^-CHO
(сн 2)3 NH
I , I ,
ЛИГАНД
сно
Рис. 9. Схема иммобилизации лиганда с трисакрилом, активированным глутараль
дегидом.
В любом случае выделение и очистка ферментов — это наука,
граничащая с искусством. В самом деле, если химическая реакция
протекает с выходом 0,1% и с сотней побочных продуктов, то вряд
ли химик-органик проявит интерес к процессу получения (и, тем
более, очистки) целевого продукта. Но именно такие задачи встают
перед биотехнологами, желающими получить индивидуальный бе
лок. В работе с биологическим материалом необходимы и важны
знания предварительных характеристик по содержанию белка в
различных биообъектах (даже в органах и тканях одного и того же
вида животного). От этого зависит выбор материала, его предва
рительная подготовка для включения в технологический процесс.
Молекулы ферментов чувствительны к различным воздействи
ям, поэтому при их выделении и очистке требуется соблюдать
необходимые меры предосторожности: контролировать темпера
туру (нередко поддерживать ее близкой к точке замерзания ис
пользуемого растворителя), рН (как правило — с помощью буфер-
54
ных растворов), концентрацию белка, ионную силу раствора,
концентрацию ионов тяжелых металлов (удаляют их с помощью
комплексообразователей, например ЭДТА), значение окислитель
но-восстановительного потенциала (Ео), который должен поддер
живаться на низком уровне (например, с помощью меркаптоэта-
нола). Следует иметь в виду и тот факт, что многие белки в
разбавленных растворах проявляют склонность к денатурации —
устойчивость возрастает в присутствии их субстратов.
Из вспомогательных приемов очистки ферментов часто поль
зуются диализом, лиофилизацией, пропусканием растворов через
соответствующие молекулярные сита (гелевые, мембранные). В
качестве примера очистки гипотетического фермента приведена
таблица 5. Из данных в таблице обращают на себя внимание
сокращение объемов раствора, содержащего целевой продукт (в
200 раз), уменьшение содержания белка в 5 раз при заметном
возрастании активности фермента в 100 раз (в расчете на 1 мг
белка).
Т а б л и ц а 5. Сравнительная характеристика методов очистки фермента "X"
Экстракт белков -
сырец 200 2,5 100 100 100 1
Высаливание
аммония
сульфатом 80 1,25 200 160 80 4
Хроматография на
Д ЭАЭ-целлюло зе 20 1,0 500 500 37,5 12,5
Препаративный
электрофорез 5 1,0 1500 1500 37,5 37,5
Изо электрическое
осаждение 3 0,3 2000 6700 30 167
55
Суммарный выход достаточно высокий, а степень очистки
превосходная - в 250 раз. Но такие показатели далеко не типичны
для разных ферментов.
В качестве критериев чистоты ферментов используют данные
электрофореза, ультрацентрифугирования (седиментограмма), оп
ределения молекулярной массы различными методами, по раство
римости (кривые растворения), оценки полидисперсности с опре
делением специфической активности каждой фракции, хроматог-
рафирования на различных носителях и в нескольких системах,
аминокислотного состава (особенно — при обнаружении белковых
примесей), включая секвенирование (от англ. sequence — после
довательность) на автоматизированных приборах - секвенаторах,
и т. д.
В последние годы продолжает расти интерес к внеклеточным
ферментам микроорганизмов, поскольку микробы — продуценты
относительно легко культивируются в. контролируемых условиях
и подвергаются направленному изменению в сторону получения
высокопродуктивных вариантов.
У грамположитёльных бактерий экзоферменты топологически
могут быть строго внеклеточными (многие протеазы, гликозидазы
и др.) и локализованными с наружной стороны клеточной мемб
раны, например, ос-глюкозидаза у Вас. licheniformis (это можно
доказать при протопластировании клеток, когда ферменты пере
ходят в окружающую среду после удаления клеточной стенки).
Грибы в отношении секреции экзоферментов уподобляют грам-
положительным бактериям. У грамотрицательных бактерий экзо
ферменты дополнительно могут находиться в периплазматическом
пространстве. Казалось бы, что такие ферменты должны рассмат
риваться внутриклеточными, однако они достаточно легко осво
бождаются при осмотическом шоке или в результате протоп-
ластирования клеток.
Строго внеклеточных ферментов у грамположитёльных бакте
рий больше, чем у грамотрицательных, однако среди последних
имеются выраженные продуценты их (аэромонасы, псевдомонасы,
некоторые энтеробактерии и др.).
Каким же образом секретируемые белки транспортируются
через структуры клеточной оболочки?
В конце 70-х годов XX в. была предложена так называемая
сигнальная гипотеза (Г. Блобели др., 1979). Согласно этой гипотезе
56
секретируемый белок через ЫН2-конец удлиняется на 15—30
аминокислот, вкупе составляющих л и д е р н ы й , или с и г н а
л ь н ы й пептид, направляющий рибосому, из которой он
появляется, к мембране. В мембране лидерный пептид вместе с
другими мембранными белками формирует канал, стабилизирую
щийся при присоединении рибосомы. Рибосома синтезирует бе
лок, и он тут же экспортируется через пору. Этот механизм
называется котрансляционной секрецией. После частичного или
полного экспорта белка сигнальный пептид удаляется с помощью
специфической сигнальной эндопептидазы. Решающую роль в
секреции играет гидрофобная центральная часть сигнальной по
следовательности размером около 5,5 нм (от 15 до 19 аминокислот)
и находящаяся в высокоупорядоченной конформации. 1ЧН2-Конец
в составе гидрофильного домена (от англ. domain — регион,
область) присоединяется к отрицательно заряженной внутренней
поверхности цитоплазматической мембраны. В ходе трансляции
белка гидрофобный участок сигнальной последовательности по
степенно внедряется в мембрану до появления участка расщепле
ния в форме петли на ее внешней стороне. После этого сигнальная
эндопептидаза отщепляет сигнальную последовательность от рас
тущей цепи полипептида, способствуя тем самым котрансляцион
ной секреции белка (рис. 10).
К настоящему времени доказано, что котрансляционная секре
ция присуща прокариотам и эукариотам. Таким путем секретиру-
ются, например, а-амилаза у Bac.subtilis, Р-лактамаза у
Bac.licheniformis, экзотоксин у Corynebacterium diphtheriae.
После завершения котрансляционного транспорта рецептор-
ные белки мембраны освобождаются и могут функционировать в
плоскости мембраны.
У прокариот и эукариот имеется также другой тип секреции
—посттрансляционный, когда через мембрану транспортируется
завершенный белок. Механизм транспорта объясняется либо с
привлечением триггерной гипотезы У. Уикнера (1979), либо ранее
рассмотренной сигнальной гипотезы (рис. 11). Согласно обеим
гипотезам роль белка - предшественника, обладающего сигнальной
последовательностью, весьма велика. В первом случае эта после
довательность обеспечивает скручивание полипептида так, что
гидрофобные области его связываются с мембраной. Затем белок
может освобождаться из мембраны благодаря отделению сигналь-
57
11 2 3 4 5 6 4 1 2 4 7 8 7 8 7 7 9 8110 711717
в
сд
(7Ъ
WWTOW
м
ш
Рис. 10. А - экспорт белка через мембрану путем котрансляционной секреции
(1 —рибосомы, 2 — мембрана, 3 — пора в мембране, 4 — сигнальная последо
вательность, 5 — сигнальный пептид, 6 — рецептор сигнального пептида, 7 —
сайт действия сигнальной эндопептидазы, 8 — рецептор рибосомы); Б —
строение сигнального пептида белка lam В Escherichia coli (A — гидрофильный
сегмент, Б — гидрофобный сегмент, р-сайт расщепления; последовательность
а лнокислот: 1—метионин, 2 — изолейцин, 3 — треонин, 4 — лейцин, 5 —
аргинин, 6 — лизин, 7 — аланин, 8 — валин, 9 — глицин, 10 — серии, 11 —
глутамин, 12 — пролин); С — секреция белка через мембрану (М) по типу петли
(1 — NH2 - конец, 2 — гидрофобный участок, СП — сигнальная пептидаза).
58
нои последовательности за счет 5'^
эндопротеолиза. Во втором слу- j -Q---3-
чае сигнальная последователь
ность полной полипептидной це
пи вместе с рецепторными бел
ками мембраны формирует по
ры. Белок развертывается и про
исходит перемещение (трансло
кация), сопровождаемая удале
нием сигнальной последователь
ности.
Для эукариот доказано, что
их эндоплазматический ретику-
лум содержит для работающей Рис. 11. Схема посттрансляционного
рибосомы своеобразные "при транспорта белков через мембрану со
чальные белки", к которым при гласно "триггерной гипотезе" по Уикне-
соединяется комплекс рибосомы ру (1979) — I и "сигнальной гипотезе" по
Блобелу и др. (1979) — И.
с частицей, узнающей сигналь
ную последовательность. Частица включает шесть полипептидных
цепей и небольшую молекулу РНК с константой седиментации 7S.
Причаливание рибосомы с частицей индуцирует трансляцию при
последующей секреции растущего белка (рис. 12) до момента
появления сигнального пептида из рибосомы, когда происходит
блокада трансляции.
На основе рассмотренной
"сигнальной гипотезы" мож
но сформулировать следую 'W
щие основные положения:
1) процесс экспорта бел
ков эволюционно консерва I П
тивен (прокариотические Рис. 12. Начальные этапы векторного пере
клетки узнают сигнальную носа белков в эукариотических клетках: I —
последовательность эукариот блокирование трансляции, II — снятие блока
трансляции после "причаливания" рибосомы
и наоборот); — 1, сигнальная последовательность — 2;
2) в мембране существует частица, узнающая сигнал — 3, "причаль
некий механизм экспорта, ный" белок — 4, мембрана — 5, сигнальный
пептид — 6.
или аппарат секреции;
3) свободные рибосомы в
цитоплазме клетки и рибосомы, связанные с мембраной, не раз
личаются между собой;
59
4) у эукариот на эндоплазматическом ретикулуме имеются так
называемые причальные белки для функционирующих рибосом,
соединенных с частицами, узнающими сигнальную последователь
ность;
5) секретируемые белки синтезируются обычно в форме более
длинного предшественника;
6) белки, как правило, секретируются котрансляционно (реже
— посттрансляционно), то есть растущий полипептид переносится
через мембрану по мере трансляции;
7) в структуре подлежащего секреции белка может существо
вать "стоп"-последовательность, останавливающая секрецию и да
ющая начало интегральному мембранному белку.
Следует вспомнить, что молекулярные массы (ММ) ферментов
достаточно большие и находятся в пределах примерно от 12 до
нескольких тысяч килодальтон (кДа). Ферменты с ММ более 100
кДа обычно представлены субъединицами (двумя и более).
Нелегко себе вообразить, например, что кишечная палочка,
размножающаяся в течение 20—30 минут, реализует множество
направленных и строго избирательных биокаталитических процес
сов. Прямыми и косвенными доказательствами в опытах с фер
ментом трансаминазой аспарагиновой кислоты установлено, что
отдельные стадии каталитической реакции протекают в простран
стве около нескольких сотен кубических миллимикрометров (нм)
за время от десятитысячных до миллионных долей секунды.
Для того, чтобы управлять действием ферментов, необходимы
фундаментальные исследования по расшифровке молекулярных
основ ферментативного катализа. Многое уже сделано в данном
направлении, но это лишь начало, а желательно знать как можно
больше о всех группах ферментов.
Согласно классификации (КФ) ферменты подразделяются на
шесть главных классов, каждый из которых включает подклассы
и подподклассы:
I. Оксидоредуктазы (КФ1.) — катализируют окислительно:вос-
становительные реакции;
II. Трансферазы (КФ2.) — катализируют реакции переноса
функциональных групп (фосфатных, ацильных, гликозильных, аль
дегидных и др.);
III. Гидролазы (КФЗ.) — катализируют реакции гидролиза
60
(перенос функциональных групп на молекулу воды);
IV. Лиазы (КФ4.) — катализируют реакции присоединения по
двойным связям и обратные реакции;
V. Изомеразы (КФ5.) — катализируют реакции изомеризации,
то есть перенос групп внутри молекулы с образованием изомерных
форм;
VI. Лигазы (КФ6.) — катализируют реакции образования связей
С — С, С — S, С — О и С — N, сопряженных с расходованием
энергии АТФ или других нуклеозидтрифосфатов.
Подкласс и подподкласс ферментов соответственно обозначают
вторым и третьим числами; порядковый номер фермента - четвер
тым числом в его подподклассе. Например, бетаин-гомоцистеин-
метилтрансфераза имеет кодовый номер (шифр) — КФ 2.1.1.5, то
есть согласно классификации (КФ) этот фермент относится к
трансферазам (И-й главный класс), переносящим одноуглеродные
остатки (первый подкласс) в форме метила — метилтрансферазы
(первый подподкласс), номер конкретного фермента 5 (бетаин:
L-гомоцистеин S-метилтрансфераза), катализируемая реакция
здесь следующая:
соог сн,—SH соон сн,—s—сн,
I . I *-. I Г
CH2-N + ==(CH3) 3 + CHj """"""Ч CH2-N = (CH3) + 0 ¾
. НС—NH, CH-NKj
6етаин
I диметипгпицин I
соон соон
L-гомоцистеин L- метионим
Металлобиомол
Изрмер§зы^_сицтетазы
63
своей не являются металлоферментами. Их следует называть ме-
таллоактивйрованными ферментами.
Можно утверждать, что в металлоферментах ионы металлов
выполняют и каталитическую и структурную роли, тогда как в
металлоактивированных ферментах — преимущественно катали
тическую. Тем не менее металлы в качестве коферментов и
кофакторов в какой-то части сходны в своих функциональных
проявлениях. Для металлоактивированных ферментов возможны
4 схемы трехчленных комплексов, участниками которых являются
фермент (Ф), субстрат (С) и металл (М) в стехиометрическом
соотношении 1:1:1.
М
1) Ф—С—М, 2) Ф—М—С, 3) М—Ф—С, 4) Ф <^ [
С
В первой схеме мостиковое положение занимает субстрат, во
второй — металл, в третьей — фермент и в четвертой — металл в
циклическом комплексе. Металлоферменты, например, не форми
руют комплекс Ф—С—М, так как при очистке они выявляются в
форме Ф—М.
Металлоферментами являются так называемые геминовые
ферменты (каталаза, пероксидаза, цитохромоксидаза), в составе
которых имеется простетическая железопорфириновая группи
ровка, или гем; трансферазы, у которых коферментная форма
витамина Вп представлена 5'-дезоксиаденозилкобаламином.
СОСг
66
фактор, восстанавливающий 0(¾
. Ф1 с Ф2 _ ФЗ г Ф4 .
А >Б *В >Г >Д
Наличие ( + ) или
отсутствие (-) и Вирион
Вирусы Супер- Тип
ММ (Да) хЮ 6
капсид симмет
рии Средний
ДНК РНК ММ (Да) размер,
хЮ 6 нм
Бактерий
(бактериофаги)
1. Колифаг <рХ174 + ( + ) 1,6 (-) Отсут К8 6,2
ствует (100x50)
х(80х95-
2. Колифаг Я ( + )33 (-) 100 100)
3. Колифаг Т2 ( + ) 130 (-) 300
4. Колифаг (-) (+)1 К 3,6 ~ 25
MS = 2 +
Растений
!. Мозаики табака (-) ( + )2,1 с 40 15-17
(ВТМ) хЗОО
2. Желтой (-) ( + )1,7 К 5 30
мозаики турнепса
Животных Име
1. Восточного (-) ( + )2 ется 50 50-70
энцефаломиелита
лошадей + Отсут
2. Обезьян SV-40 ( + )3,2 (-) ствует 3 40-50
Человека
1. Аденовирусных ( + )23 (-) 177 70-90
инфекций
2. Гриппа"1" (-) ( + -)4 Имеет с 300 80-120
ся
3. Полиомиелита"1" (-) ( + )2,2 К 6,8 28
/
кДа. Вследствие такой сегментированности геном вируса гриппа
отличается высокой частотой рекомбинации, способностью к ре
активации и синтезировать гемагглютинин и нейраминидазу после
химического подавления вирусной инфекционное™.
Частицы ВИЧ образуются из трех различных по составу и
молекулярной массе белков — протеина 25(24), гликопротеинов 41
и 120. Первый из них р25(24) входит в состав сердцевины вириона,
гликопротеины (др41 и др120) формируют "шипы" оболочки час
тицы. В сердцевину также входят однонитевая РНК, несущая
генетическую информацию, и фермент обратная транскриптаза,
под действием которой синтезируется провирус — ДНК-копия
вирусной РНК. Провирус встраивается в хромосомную ДНК клет
ки — реципиента и персистирует (от лат. persistens — стойкий,
сохраняющийся, остающийся) до того времени, пока не будет
активирован. После такой активации происходит его репродукция.
Если ретровирусные РНК структурно заканчиваются прямыми
повторами нуклеотидов числом 10 — 80 пар, то свободные линей
ные двухнитевые ДНК-копии заканчиваются длинными одинако
выми повторами — LTR (от англ. long terminal repeat) числом 250
— 1400 нуклеотидных пар, укороченных на две пары с каждого
конца (рис. 23).
s\*r\
Y3' S Y5' agpol Y3' S Y5' провирусная ДНК
LTR LTR
Рис. 23. LTR в составе линейной ДНК копии РНК вируса иммунодефицита человека
85
данг кокосовой пальмы (ВКККП), содержащий консервативную
центральную область, короткую последовательность пуринов, а за
пределами центральной области проявляет малую гомологию по
следовательностей;
3) вироиды болезни "солнечная пятнистость авокадо" (ВСПА)
с небольшой центральной консервативной областью и малой го
мологией последовательностей с последовательностями у любого
другого вироида.
Высказывается предположение в том, что вироиды произошли
от интронов (см.) и что недалеко то время, когда они будут
рекомендованы в качестве векторов в фитобиотехнологии реком-
бинантных ДНК.
4.2. Клетки прокариот. Почти во всех больших траксономиче-
ских группах имеются представители, с успехом использующиеся
в соответствующих биотехнологических процессах — будь это
сапрофитные или патогенные виды. Для сравнения можно указать
на лактобактерии и туберкулезные микобактерии. Первые исполь
зуются для приготовления молочнокислых продуктов и в силосо
вании кормов, вторые — для приготовления вакцины BCG и
туберкулина (диагностическое средство при туберкулезе). Из ар-
хеобактерий большое значение имеют метаногенные бактерии —
продуценты метана. Пневмококки используются для изготовления
полисахаридных вакцин, применяемых для профилактики и лече
ния пневмоний, вызванных различными сероварами Streptococcus
pneumoniae.
А р х е о б а к т е р и и заметно отличаются от эубактерий по
химическому составу клеточной стенки и клеточной мембраны, по
последовательности нуклеотидов в рибосомных нуклеиновых кис-
СООН лотах, или рРНК (в 5S- и 16S рРНК) и по
некоторым другим признакам. Так, в кле
точной стенке у них отсутствует типичный
пептидогликан — муреин, хотя у некото
н.он рых археобактерии имеется псевдомуре-
ин, в котором вместо ацетилмурамовой
кислоты содержится талозаминуроновая
кислота; интерпептидные мостики вклю
талозаминуроновая кислота
чают лишь L-аминокислоты, так как D-ами-
нокислоты отсутствуют в псевдомуреине.
У метанококков клеточная стенка формируется из белка, у мета-
носарцин — из нейтральных углеводов, уроновых кислот и ами-
носахаров, у метаноспирилл имеется полипептидный чехол.
Особенностями химического состава клеточной стенки архео
бактерии можно объяснить неэффективность пенициллина, цефа-
86
лоспорина и D-циклосерина против этих микроорганизмов. Иначе
говоря, для данных антибиотиков отсутствуют мишени в клетках
археобактерии. Клеточная мембрана их также существенно отли-
сн,—о
I
сн—о.
ChUOH
бифитанил-глицерин (бифитанил-диглицерол-диэфир)
сн,он
сн,
сн
сн—о
- СН,
2
сн2он
бифитанил-диглицерин (бифитамил-диглицерол-тетраэфир)
сесквитерпен ( С ] 5 )
Н,С=С—СН=СН- - С Н = С — С Н = С Н сн=с—сн=сн.
СН, СН, сн,
тритерпен (С 3 0 )
2' 3'
г/ \л
CH=N—N N—С1-Ц
\6_J/
рифампицин-3=(4'-метил-Г-пиперазинилиминометил)-рифамицин SV
Эукариоты
Водоросли
\
Грибы
/
Простейшие
/
] РИОТЫ
Эубактерии
-
Археобактерии
]!
ПРОКА—
РИОТЫ
Здесь донор электронов - вода. Следует иметь в виду, что среди цианобактерий
есть виды, способные окислять сероводород и переходить на фотосинтез без
выделения кислорода.
2. 2H7S+CO? — • CH70+H70+2S
2 2 пурпурные серные и зеленые 2 2
серные бактерии, некоторые
цианобактерий
90
Все обменные процессы развивающихся прокариотическйх
клеток осуществляются с участием клеточной мембраны. Через
мембрану поступают внутрь клетки питательные вещества, через
нее же секретируются определенные продукты из клетки в окру
жающую среду; мембраны участвуют в регуляторных процессах и
энергообеспечении клетки. Вот почему, начиная с 70-х — 80-х годов
XX в., когда удалось в чистом виде изолировать и исследовать
мембранные фракции различного происхождения, интерес к мем
бранам резко возрос. Сформировалась самостоятельная научная
дисциплина — м е м б р а н о л о г и я , а специалисты, работающие
в этой области, стали называться мембранологами.
Клеточная стенка прокариот занимает свое особое место в
структуре и архитектонике клеток. Ее нельзя исключать из мета
болических процессов, так как она занимает пограничное положе
ние между внутренней (протопласт) и внешней средами, и через
нее должны проходить различные вещества в обоих направлениях.
Однако главные функции ее — поддержание формы клетки и
защитная, тогда как основная функция клеточной мембраны —
регуляторно-метаболическая. Клеточная стенка и клеточная мем
брана вместе формируют о б о л о ч к у .
В эволюционно-биохимическом плане клеточная стенка у про
кариот претерпела структурные изменения в направлении: Архе-
обактерии —> Грамположительные бактерии —> Грамотрицатель-
ные бактерии. У археобактерий нет типичного пептидогликана,
хотя задатки к нему имеются; пептидогликан у грамположительных
бактерий многослоен, тогда как у грамотрицательных бактерий он
однослоен. Лишая клетки прокариот клеточной стенки, их относи
тельно легко удается получать в виде протопластов или сферопла-
стов, которые могут быть использованы в клеточно-инженерных
работах.
Вместе с возможным капсульным слоем на оболочку приходит
ся 20% и более сухой массы клетки. В оболочке имеются поры для
транспорта питательных веществ (диаметр их от 0,001 до 0,01 мкм)
и рецепторы (белки-порины) для фагов и бактериоцинов, а также
места взаимодействия с антителами и комплементом. В оболочках
грамотрицательных бактерий содержатся токсические и аллерген
ные соединения.
Электронно-микроскопические снимки поверхностей прока
риотических клеток отличаются большим разнообразием. Причем,
91
в противоположность сравнительно тонко очерченной поверхно
сти у грамположительных бактерий, большинство представителей
грамотрицательных видов имеет исключительно складчатую по
верхность.
У многих прокариот кнаружи от клеточной стенки располага
ется капсульн^й материал, состоящий в большинстве случаев из
полисахаридов — гликанов (например, у Acinetobacter spp.), либо
— из протеинов (например, у Вас. licheniformis).
Клеточная стенка утолщается с возрастом клетки и может
достигать, например у Lactobacillus acidophilus, 0,8 мкм. Клеточная
мембрана, напротив, остается более или менее постоянной по
толщине во.все периоды развития прокариотических клеток (0,0075
мкм) и с более или менее постоянными порами диаметром около
1 нм.
В клеточной стенке грамоположительных бактерий сосредото
чен пептидогликан — муреин, имеются тейхоевые кислоты, белки;
у стрептококков группы А в диффузно-распределенном виде в
наружном слое клеточной стенки находится также М протеин,
являющийся фактором вирулентности этих микробов. М протеин
может быть гидролизован с помощью трипсина без нарушения
жизнеспособности клеток.
У грамотрицательных бактерий четко обозначается трехслой-
ность клеточной стенки: липополисахаридный слой (О-антиген),
наружный слой (нередко обозначаемый как "внешняя мембрана"),
состоящий из двух фосфолипидных листков, и подлежащий липоп-
ротеиновый слой. Липополисахарид проявляет свойства эндоток
сина, он занимает пограничное положение между внешней средой
и подлежащим фосфолипидом (преимущественно — фосфатиди-
лэтаноламином).
Липополисахариды получают в производственных условиях в
качестве средств, обладающих различными биологическими свой
ствами: токсическими (связанными с липидом А в липополисаха-
риде), пирогенными, митогенными (для мышиных лимфоцитов),
стимуляторами развития клеток костного мозга, активаторами
фактора VII свертывания крови (фактор Хагемана) в тромбоцитах
и комплемента; липополисахарид в концентрации 1»10"12 г вызы
вает свертывание лизата амебоцитов дальневосточного краба
Limulus poliphemus. Реакцию широко используют при выявлении
липополисахарида в каких-либо субстратах, лекарственных сред
ствах и др. Взаимодействие между эндотоксином и лизатом аме
боцитов протекает по следующей схеме:
92
LAL = профермент эндотоксин
-» активированный^ — е)
фермент(ы)
коагулоген
активированные ферменты Хизат * белковые агрегаты
помутнение
методы оценки
Бактерии
грамположительные кислотоустойчивые грамотрицательные
Пептидогликан Пептидогликан Пептидогликан
(многослоен, толщина (однослоен!?, толщина (однослоен, толщина
0,02-0,6 мкм) 0,01 мкм) 0, 01 мкм)
Протеины Полипептиды Липопротеины
Липотейхоевые кислоты Миколовая кислота - ' Фосфолипиды
гликолипиды
Тейхоевые кислоты Арабиногалактаны Липополисахарид
Тейхуроновые кислоты Воск Д Протеины
Полисахариды Корд-фактор Полисахариды
Сульфолипиды
Микозиды
различия в компонентном составе клеток, относящихся к разным
группам, достаточно велики. Например, оценивая строение пепти
догликанов у Е. coli и Staphylococcus aureus, можно видеть различия
между ними в характере интерпептидных мостиков. Так, у Е. coli
(равно как и у всех грамотрицательных бактерий, коринебактерий
дифтерии, нокардий, микобактерий и видов, относящихся к роду
Bacillus) пептидогликан относится к типу А (рис. 25а), у
Staphylococcus aureus (стрептококков, микрококков) — к типу В
(рис. 256); пептидогликан типа С (рис. 25в) обнаруживается редко.
EZ3— —I М 1 1г I—
в
Рис. 25 Схемы (а, б, в), построения трех типов пептидогликанов (А, В, С) в которых
М—N-ацетилмурамовая кислота, Г—N-ацетилглюкозамин; 1,2,3,4-тетрапептид, со
стоящий из L-аланина (1), D-iso-глутаминовой кислоты (2), meso-DAP (или L-лизина)
(3), D-аланина (4), х и z-интерпептидные мостики, У-амидный заместитель, связанный
с а-карбоксигруппой D-iso-глутаминовой или 3-гидроксиглутаминовой кислоты.
95
Инвариантность тетрапептида обусловлена постоянным нали
чием D-аланина, выступающего связующей единицей между цепя
ми пептидогликана. Дисахаридные блоки МГ (см. рис. 25а, б, в)
численно варьируют от менее 10 до более 170, что зависит от вида
бактерий. С учетом сказанного можно изобразить связь пептидо
гликана с липопротеином в клеточной стенке Е. coli (рис. 26).
гпиколилмурамовая кислота,
где R - гпиколил
лактам мурамовой кислоты
сн 2 он
сн 3 —сн—со
96
Находят (около 2%) маннозамин мурамовой кислоты, например
у М. luteus. У микобактерий и некоторых нокардий (N. kirovani)
присутствует N-гликолилмурамовая кислота. В позиции С6 гидро-
ксильных групп мурамовой кислоты или глюкозамина могут нахо
диться фосфодиэфирные остатки, которые у грамположительных
бактерий способны связывать тейхоевую, тейхуроновую кислоты,
он он он
i
но-р-о-сн,-сн-сн-сн-сн,-с •р-о-сн,-сн-сн-сн-сн,-о р-о-сн -сн-сн-сн-сн,он
I I I I I I
OR О О OR о_^о
"%? "со"
I
со
I
CH-NH, CH-NH2 CH-NH,2
I
сн. сн. сн,
4 т. 8524 97
Различают а-, (3- и у-миколовые кислоты туберкулезных мико
бактерий; первые содержат от 78 до 88 углеродных атомов, вторые
— от 83 до 89, третьи — 91.
CH3-(CH,)-CH-CH-(CH,)v-CH-CH-(CH,)-CH-CH-COOH
у
\ / \ / I I
сн 2 сн 2 о н с24н49
а-миколовая кислота
р-миколовая кислота
<^У_ , миколовая
кислота
ОСОСН3 'сНг—О—СО—СН9
сульфогликолипид из М . tuberculosis
СН-а СНя
3
I 13
H 2 N O C — ( С Н 2 ) 2 — Q H — N H — С О — СН— NH—СО—СН—О
соон НзС0С
мурамилдипептид
^ СН 2 ОН
сн,он сн,он сн2он с н ^,н
7 - TNHC0yH
V NHCOCH3 NHCOi
3
3 МНСОСНз М Н С О С ^ йн
сн3—сн
г сн3—сн
СО— L—Ы*
С О—L-AU-jj^Glu-meso-DAP-D-Ala
105
как правило, отсутствует meso-ДАП в муреине. Эндоспоры —
сложные образования и, как видно из рис. 30, эндоспора Вас. cereus
представляется сферическим многослойным телом, формирование
которого, как правило, диктуется неблагоприятными условиями. В
кортексе спор у большинства спорообразующих видов найден
специфический пептидогликан.
о
В цитоплазме спор содержится до
15% дипиколината кальция. В белках
оболочек споры отмечается повышен-
"М^ ное количество гидрофобных амино-
°С С° кислот и цистеина. В связи со споро-
О ,0 образованием культуры ряда бацилл и
^а клостридий образуют белки, которые
дипикопинат кальция имеют важное народнохозяйственное
значение (циклопептидные антибиоти
ки, энтобактерин). С другой стороны, спорообразующие прокари
оты могут быть вредителями биотехнологических процессов. Спо
ры отличаются высокой устойчивостью к различным внешним
факторам, хорошо переносят их воздействия и поэтому могут
попасть в ферментационные среды или в готовый продукт при
несоблюдении правил асептики, антисептики и стерилизации.
Некоторые прокариоты (отдельные актиномицеты) могут обра
зовывать экзоспоры, которые выступают у них репродукционными
образованиями и покоящимися формами одновременно (эндоспо
ры — это покоящиеся формы и/или формы дифференцировки в
ходе развития и созревания клеток, например, у Вас. subtilis).
Покоящимися формами являются и цисты, которые могут
образовываться азотобактериями, миксобактериями, риккетсия-
ми, спирохетами.
4.3. Клетки эукариот. В биохимической технологии используют
эукариотические клетки различного происхождения. Источниками
их являются виды, относящиеся к царствам Mycota, Plantae и
Animalia. К настоящему времени ассортимент первых более ши
рокий, чем ассортимент растительных и животных клеток, эксплу
атируемых в производстве. Клетки эукариот во многом сходны
между собой, тем не менее, имеющиеся различия привносят свои
особенности, сказывающиеся на их структуре и функциях. На рис.
31 достаточно объективно отражены фактические данные, накоп
ленные исследователями при изучении строения клеток эукариот.
Клетки грибов и растений обладают прочной клеточной стен-
106
кои, которая отсутствует у
клеток животного проис
хождения. При этом мар
керной структурой для
большинства грибов стано
вится хитин, для большин
ства растений — целлюлоза.
Молекулярные массы их
близки и достигают величи
ны порядка 500-600 кДа.
Клеточные стенки грибов и
растений — двухфазные си
стемы. Одной фазой явля
ются микрофибриллярные
структуры, второй фазой — Рис. 31. Клетка эукариот: 1 — плазматическая
аморфный наполнитель. мембрана, 2 — пероксисома, 3 — ядро, 4 —
ядрышко, 5 — аппарат Гольджи, 6 — шерохо
Следовательно, грибная и ватый эндоплазматический ретикулум, 8 —
растительная клеточные центриоль, 9 — цитоскелет, 10 — секреторная
стенки являются природны гранула, 11 — экзоцитотический пузырек, 12
ми композитами, в химиче — эндоцитотический пузырек, 13 — эндосома,
14 — лизосома, 15 — цитозоль, 16 — митохон
ском составе которых пре дрия, 17 — рибосомы.
обладают углеводные ком-
«. СНоОН
т *- . СН2ОН С
wНi 22 О
v>Н _ CH2UH j
NHCOCHj NHCOCH3
Виды грибов
Компонент
Allomyces Mucor rouxii Saccharomyces
macroginus (нитчатая форма) cerevisiae
Азот 5,5 2,1
Белок 10,0 6,3 13,0
Глюкан 16,0 28,8
Липиды 7,8 8,5
Маннан 3,8 31,0
Фосфаты 23,3 0,31
Хитин 58,0 9,4 1,0
Хитозан 32,7
Другие углеводы 9,5
Сумма 74,0 55,4 60,8
углеводных
компонентов
ь £| /Ч
1 ч
т он
СН3О
Y ОН
ОСНз
ОН
ч ОСНз
нон2с
0арабином
н,он
галактоза
н,он
структурно-функциональ
ной общностью, формиру
ют систему — ткань. Раз
личают л о ж н ы е и и с
т и н н ы е т к а н и . Ложные
ткани образуются из групп
нитей (филаментов), кото
рые могут переплетаться или срастаться клеточными стенками, но
сохраняют свою самостоятельность, например, при поперечном
делении. Такая ткань присуща грибам и называют ее п л е к-
т е н х и м о й , или п с е в д о п а р е н х и м о й (от лат. plexus
— сплетение, parenchyma — живая ткань, паренхима, от греч.
pseudes — ложь, фальшь). Она напоминает меристему растений
лишь морфологически и типична для плодовых тел базидиальных
грибов, склероциев аскомицетов. Истинные ткани у грибов выяв
ляются редко, однако они имеются в перитециях сумчатых грибов
(на ранних стадиях их формирования), в пикнидах у несовершен
ных грибов.
Растениям присущи истинные ткани — простые (из одной
системы клеток) и сложные (из разных систем клеток).
Ложные и истинные ткани подразделяются по функциям на 6
112
групп: образовательные (меристемы), покровные, проводящие, ме
ханические, секреторные (выделительные) и базисные (основные).
О б р а з о в а т е л ь н ы е т к а н и , или м е р и с т е м ы (от
греч. meristos — делимый) состоят из активно метаболизирующих
клеток, способных делиться и образовывать новые клетки. Те из
них, которые служат родоначальницами всех других клеток, диф
ференцирующихся и превращающихся в клетки постоянных тка
ней, называются и н и ц и а л ь н ы м и (отлат. initialis — первичный,
начальный).
У грибов настоящие меристемы не развиты, деление клеток
сосредоточено на верхушках гиф.
Топологически, или по местоположению у растений (рис.34)
различают меристемы верхушечные, или апикальные (от лат. apex,
apicis — верхушка); боковые, или латеральные (от лат. lateralis —
боковой); п р о м е ж у т о ч н ы е , или интеркалярные (от лат.
mtercalaris — промежуточ
ный, вставной). Верхушеч
ные меристемы обеспечива
ют рост растений в длину,
они же образуют конусы
корней; боковые обеспечи
вают рост растений в тол
щину (к боковым меристе
мам относятся прокамбий, Itfk^uJtfl^Atf Yi±0:\
камбий, перицикл, фелло-
ген; от лат. cambium — сме
на, обмен; от греч. pro —
пред, вперед, ранее, peri —
вокруг, около; kiklos — крут,
ЦИКЛ" fellos п р о б к а - a e n o s ^110- ^ - Топология меристем в растениях. Схе-
матичный продольный разрез растительной
род, п р о и с х о ж д е н и е ) . почки: 1 — верхушечная меристема, 2 — лис-
В о с н о в а н и я х ч е р е ш к о в товые побеги, 3 — конус нарастания,
листьев, в междоузлиях локализуются промежуточные меристемы.
Клетки меристемы т о т и п о т е н т н ы (от лат. totum — все,
целое, potentium — способность, потенция), то есть они полностью
реализуют свой потенциал развития с образованием целого орга
низма. В биотехнологии особое значение приобрела верхушечная
меристема (см. рис. 34), так как она всегда остается свободной
(здоровой) от фитопатогенных микроорганизмов, например, виру-
113
сов (даже в тех случаях, когда все растение поражено патогеном).
Культивирование in vitro меристемньгх клеток от больного расте
ния в стерильных условиях завершается получением здорового
растения — посадочного материала.
Известны еще так называемые р а н е в ы е меристе -
м ы, образующиеся в местах повреждения органов и тканей
растений. В таких поврежденных участках разрастаются однород
ные паренхимные клетки, прикрывающие повреждения. Такие
ткани называются к а л л у с а м и (от лат. callus — мозоль).
Каллусные ткани стали широко культивировать на питательных
средах в целях получения посадочного и прививочного материала,
а также ценных метаболитов.
С меристемной тканью связан рост растений. Так, у большин
ства из них стебли и корни обладают верхушечным ростом, листья
нарастают благодаря базальному росту; в стеблях злаков преобла
дает промежуточный рост. Для грибов также характерен верху
шечный рост. В общем виде он протекает следующим образом. В
молодой нити гриба на всем ее протяжении достаточно легко
отдифференцировать три зоны: апикальную, субапикальную и
вакуолизированную дистальную (рис. 35). В апикальной зоне скап
ливается большое количество везикул (пузырьков), в субапикаль
ной - ядра, рибосомы, митохондрии, эндоплазматический ретику-
лум, микротельца, микротубули и т. д. Субапикальная зона пере
ходит в зону вакуолизации (дистальную), которая тем выраженнее,
чем дальше расположена от верхушки. В ней возрастает также
содержание липидов. Апикальные везикулы, образующиеся в суб
апикальной' зоне и перемещающиеся к верхушке, участвуют в
синтезе клеточной стенки. Там они секретируют свое содержимое
или сливаются с мембраной. В них так ж е могут быть экзофермен-
ты, способные к экструзии (от лат. extrusio — выталкивание) на
кончике гифы (рис. 36).
Как видно из рисунка везикулы, воз-
111
п I никающие из эндоплазматического рети-
0 с у о й р £ ^ Щ Ж - ж о ^ кулума, сливаются и образуют цистерну
г, о , ^ • °<~i ••<**•••<-&<>£? внутренней (проксимальной) части дик-
Рис. 35. Апикальная — I, суб- тиосомы; содержимое цистерны и мемб-
апикальная-п,вакуолизиро- ы последовательно трансформируют-
г
ванная — III зоны в молодой г ~г г rj
растущей гифе одного из ни- ся, перемещаясь к наружной (дистальнои)
зших грибов (схема). части диктиосомы в связи с продолжаю-
114
Рис. 36. Схема формирования и перемещения апикальных визикул из субапи
кальной зоны к верхушке гифы (КС — клеточная стенка, М — клеточная
мембрана, В — везикулы, Д — диктиосомы, Р — рибосомы, ЭР — эндоплазма-
тический ретикулум, Ц — цистерны).
содержание
Компонент 12 %
пикограммы (10 г/клетка)
пределы размаха усредненно
величин в клетке
характеристика
1 Элементы
| цитоскелета структурная функциональная
диаметр, состав ММ агенты
нм ляющий белка, связь
белок кДа диссо ассоци
циа ации
ции
Микрофила- 2 миозин 450 АТФ с
менты актином
иСа+ +
в
сократит.
акте
Микроволокна 6-7 актин 42-46 цито- АТФ с
холазин цитокине
В зом,
пино- и
эндоци-
тозом
Микротру 25-28 тубулин 120 вин- ГТФ с митоти-
бочки блас- ческим
тин, верете
вин- ном,*'
крис- центри-
тин, олями,
колхи реснич
цин ками,
жгутика
ми и
экзоци-
тозом
12
Миозин в виде двойной молекулы формирует стержень, рав
ного которому по длине нет в природе аналогичных молекул
("цитомышца ). На рис. 39 представлен поперечный срез актоми-
озина, где показана ассоциация шести тонких актиновых фила-
ментов с толстым миозиновым филаментом. В зависимости от
^ диаметра филаменты подразделяют на тонкие (до
fbi fjf 6-7 нм), промежуточные (8-10 нм) и толстые (15-20
С*Г\&Х Нм)
'
^•7й1К<ГчО Рис 39. Схематичное строение актомиозинового пучка в попе-
fyj(jj^ речном разрезе: 1-актин, 2-миозин.
Актиновые филаменты ("цитокости"), чаще группирующиеся в
форме тонких пучков, составлены из глобулярных белков. Такие
глобулы имеют полярный и боковой сайты связывания, благодаря
которым они растут в длину в виде двойной цепи. В желобке
двухспирального филамента актина располагается тонкая белковая
нить тропонина (рис. 40), образующего вместе с миозином тропо-
миозин (от греч. tropos — поворачивать, mis — мышца).
Микроволокна актина могут разобщаться при вза
имодействии с цитохолазином В, или фомином [7,20-
дигидрокси-16-метил-10-фенил-24-окса- [ 14] -цитохала
за - 6(12),13(Е),21(Е)-триен,1,23-дион]. Цитохолазин В
образуется грибами Helminthosporium dematioideum и
Phoma exigua. В ряду цитохолазинов известны А, В, С,
D, E, F, G, H, J, родственными им явяются хетоглобо-
зины.
Со времени открытия цитохолазинов в 1964 г.
выполнено большое количество работ с ними. Показа- j
a _
~iCHi~CH*~J~~CH\ / C H 2 -CHJ
i A _ 0НД_с„/\н
/Ч MN"^N
адгезирующие, регулирую-
Щие и другие.
С учетом новых групп
н с
' I Ч.^^ .^sr белков, выявленных в цито-
Г 1 Г ]Г сн г~ сн ) скелете, становится очевид-
!* /чТ 1 * - ? - с н » ным, что само н а з в а н и е ка-
R
I ° жется не совсем адекват
ен* ^^
ным, поскольку ц и т о с к е л е т
винбластин: R= СНз _ э т о н е непод в и ж н ы й кар-
г
винкристин: К=СНО "^
кас, или скелет, а сложная и
гибкая система, способная в
К1НГПГН Р 5 ^ сл учаев к фрагмента-
3 ции и самосборке, к сколь-
Н^СО " ^ ^ ^ jfr""""'^ жению и другим функциям.
Тем не менее, определенные
Н^СО v ^ ^ / W ^ элементы цитоскелета дей
ствительно служат для со
здания статичного остова
гН^СО клетки (кератин в клетках
колхицин эпителия, десмин в мышеч
ных клетках, и т. д.).
При выделении молекулярных компонентов клетки и тополо
гической привязки их в фиксированных клетках необходимо
учитывать тот факт, что цитоскелетные структуры находятся в
процессе постоянных сборки и разборки в живых клетках.
В настоящее время выделяют 5 основных классов белков,
образующих так называемые п р о м е ж у т о ч н ы е фила-
м е н т ы : виментиновые (ММ = 55 кДа) в ткани мезенхимы
(зародышевая соединительная ткань большинства многоклеточных
животных и человека), глиальные (ММ = 53 кДа) в клетках глии
123
(клетки в головном и спинном мозге), десминовые (ММ = 52 кДа)
в мышцах, нейронные (три белка с ММ = 70 кДа, 150 кДа и 200
кДа) в нейронах, кератиновые (около 20 белков с ММ от 40кДа до
70 кДа). Функция их окончательно не установлена. Предполагают,
что они причастны к митозу, к развитию клеток в норме и при
опухолевой патологии, выполняют роль механического скелета.
Элементы цитоскелета поддерживают клеточную мембрану,
взаимодействуют с мембранами органелл и, как считают, участву
ют в трансмембранной передаче сигналов в обоих направлениях,
что исключительно важно при объединении отдельных клеток в
ткани. В трансмембранной передаче сигналов участвуют мембран
ные гликопротеины, или гликопротеиновые рецепторы, контакти
рующие с филаментами. Эти последние индуцируют систематиче
ское движение рецепторов. За обратимое "заякоривание" рецеп
торов ответственны тубулы, или микротрубочки. Эти данные
представляют большой интерес не только с точки зрения раскры
тия и познания фундаментальных биологических явлений, но и с
практической точки зрения, например, при использовании лекти-
нов (от лат. legere — читать, отбирать, выбирать) — как митогенных,
токсических и цитолитических агентов.
Цитоскелетные структуры имеют прямые связи, например,
микротрубочки с митохондриями, синаптическими пузырьками
(области контактов нервных клеток, или нейронов друг с другом
и с клетками исполнительных органов), ядром; промежуточные
филаменты — с ядром.
Эукариотические клетки многоклеточных организмов отлича
ются друг от друга в зависимости от ткани (органа), из которой
они изолированы. Например, у млекопитающих клетки кожи
отличаются от клеток печени, у растений клетки эпидермы отли
чаются от клеток колленхимы, у грибов рода Penicillium зароды
шевые клетки — экзоспоры, или конидии отличаются от клеток
вегетативного мицелия.
Клетки эукариот в большинстве своем крупнее клеток прока
риот по диаметру и объему, пространственно более организованны
и дифференцированны, чему во многом способствует цитоскелет.
Внутреннее содержимое клетки разделено на отграниченные мем
бранами пространства — отсеки, или компартменты (от англ.
compartment — отделение, купе, отсек). Поэтому компартментали-
зация типична для эукариотической клетки и несвойственна по
давляющему большинству прокариотических клеток.
Клеточная мембрана эукариот сходна по составу и строению с
124
клеточной мембраной прокариот — в ней содержатся белки (в том
числе — маркерный фермент — 5'-нуклеотидаза), липиды и угле
воды. Однако компонентный состав каждого из названных пол
имеров у эукариот и прокариот не идентичен. Например, ключе
вым гликозиллипидом мембраны прокариот является бактопренол
(ундекапренол). Это — С55-соединение, содержащее 9 цис-двойных
связей и 2 транс-двойные связи и относящееся к изопреноидным
липидам. Бактопренол участвует в процессах биосинтеза О-анти-
генов грамотрицательных бактерий, а так же пептидогликанов в
клеточных стенках грамположительных бактерий.
СНо си.
I 5
н]_сн2—с=сн—сн2--сн 2 -с=сн-снрн
10
бактопренол
сн. CH S .
СНо СН, C CH с=си-сн2— о
цИС -§W 4 сн<" "сн'
сн.
С£=СИ' сн 2 сн он. он—р=о
{
7-9 Man
Дрожжевая долихолфосфатманноза
125
Гидрофобная часть изопреноидов закрепляется в мембране, а
гидрофильная — выступает в цитоплазму.
fa Ж. &. tfi*
-s-s- -S-S- -s-s hS-
Маннопротеиновый^
слой
k-s-J-s-s
l-S-S-J-S-S-
I I связанные
'полипептидные
S-S- hs-s- s-s- . -s-s- цепи
№ № Глюкановый
слой
Маннан
Глюкан
Маннопротеины -
ферменты
EE-:i©^3CE| Периплазма
Плазмалемма
Р и с . 4 1 . С х е м а с т р о е н и я к л е т о ч н о й с т е н к и у S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e (по В,
Фаркашу, 1985).
сн
з
СИ,
СНу-СН== С — С Н о - Н »
#
сн 2,-сн
сн 3
г
- с н = о - C H J - C H J — С Н 2 — С Н — С Н ^ "И
J
3
Н 3 СО. сн 3 нэс
сн 3 I 3
Н 3 СО
н3с сн2-сн=с—он2-|-н
сн2—сн=с—сн2--н
6-10
убихиноны
4 CH,
"''TV ! J
^ ^ i ^ i J — C H 2 - - C H 2 — C H 2 — CH — CH 2
V I
CH, ° CH.
н3с сн 3
Н С-СН-(СН ) - С Н - ( С Н - ) - С Н - ( С Н ) - С = С Н - С Н O - C O - R
I 2'г I 2'г
сн сн, сн,
остаток фитола
R - M g - п о р ф и р и н о в ы й скелет
он он он
адреналин норадреналин
Н 3 0—СО—О—(СН 2 ) 2 —N=(CH 3 ) 3
ацегилхопин
<Uk
131
Из рис. 46 следует, что ионный канал в н-холинорецепторе
создается самим рецептором. Теперь доказано, что женщины,
болеющие раком молочной железы и не имеющие на раковых
клетках рецепторов эстрогена, излечиваются эндокринными пре
паратами лишь в 10% случаев. Напротив, при наличии таких
рецепторрв излечиваются подобными средствами в 50-65% случаев
и более. Заболевания типа тяжелой миастении (Myastenia gravis)
и редкой устойчивой к инсулину формы диабета обусловливаются
аутоиммунными реакциями, когда собственные антитела блокиру
ют рецепторы, вызывают их транспозицию (перемещение) внутрь
клетки и разрушение.
Рецепторы, соединяю-
*<'"2К щиеся с молекулами — ли-
::!•::••/ '••£"'. -¾° гандами, группируются в
; ;?\. j ' образовывающихся в мемб-
5••,,-• .-«ii' ране окаймленных ямках,
или
Рис. 46. н-холинорецептор электрического углублениях. Диаметр
ската; молекулы рецептора в составе фосфо- у г л у б л е н и й ОКОЛО 1 0 0 НМ. В
липидных пузырьков (А); розетка рецептора с т р у к т у р е и х в ы д е л я ю т ТЯ-
(Б) с двумя местами связывания а-бунгароток- , л , А » . пп » ч
сина желые (ММ = 180 кДа) и лег
кие (ММ = 35 кДа) цепи клат-
ринов (от лат. clathrum — решетчатый барьер), формирующих
ассамблею протомеров в форме корзинок, которые и покрывают
окаймленные углубления. При эндоцитозе клатриновая клетка —
ловушка втягивает внутрь участок мембраны — пэтч. При этом
углубления как бы опускаются внутрь клетки, края их сужаются,
остается маленькое отверстие, которое вскоре исчезает, и мемб
рана становится гладкой. Мембрана таким образом лишается пэтча,
трансформировавшегося внутри клетки в свободно передвигаю
щуюся везикулу (пузырек). В зависимости от процесса (фагоцитоз,
пиноцитоз) везикулу называют: "фагосома", "пиносома", "фагоци
тарная", "пиноцитарная" или "эндоцитарная вакуоль", эндосома.
Окаймленные ямки дают начало окаймленным пузырькам, теряю
щим впоследствии клатриновое покрытие и способным сливаться
с другими неокаймленными везикулами — эндосомами, лизосома-
ми по цис- и транс-м е х а н и з м а м . Цис-механизм заключается
в слиянии поверхностей мембран, непосредственно контактирую
щих с цитоплазмой. Транс-механизм заключается в сближении
наружных поверхностей мембраны. По цис-механизму протекает
132
экзоцитоз, слияние везикул в цитоплазме, поглощение одной ве
зикулы другой (аутофагия), почкование; по транс-механизму про
текают: захват мембранных везикул, разделение везикул, эндоци-
тоз.
Функция эндосомы — первичная внутриклеточная переработка
захваченных веществ при рН н и ж е 7,0 с последующим транспор
том их в лизосомы или, обходя последние, в места хранения
(гранулы).
Эндосомы могут сливаться с клеточной мембраной, и тогда их
содержимое выводится из клетки — э к з о ц и т о з . Участки
мембраны (пэтчи) могут отделяться с частью содержимого от
эндосомы и возвращаться в одних случаях — на прежнее место
(такой процесс называется р е г у р г и т а ц и е й , от франц.
regurgitation — излияние, извержение), в других случаях — на
противоположную сторону клетки, где сливаются с мембраной и
немодифицированный материал выводят наружу — д и а ц и-
т о з (от греч. dia — через). Продукты экзоцитоза (литические
ферменты, гормоны и другие вещества) поступают в околоклеточ
ные пространства, в кровяное русло, в специализированные сек
реторные протоки (например, слюна, секрет поджелудочной же
лезы и т. д.).
В некоторых случаях эндосомы на время превращаются в
вакуоли, то есть когда по каким-либо причинам слияние их с
лизосомами приостанавливается. Регуляторами таких процессов
могут выступать некоторые гликопротеины (например, конканава-
лин А), микобактерии туберкулеза и другие факторы.
Весьма существенной для жизнедеятельности эукариотических
клеток является способность мембран любых компартментов клет
ки сливаться и разъединяться. Поэтому регулируемый поток в
мембранных образованиях в направлении: клеточная мембра
на (эндоцитоз) —» эндосома —> лизосома —> комплекс Голь
джи —> ЭПР -» коплекс Гольджи -» секреторная гранула
(экзоцитоз) в основном экспериментально установлен и, следова
тельно, реален.
Лизосомы (0,5 х 2-3 мкм в диаметре) происходят из эндосом.
Их число в клетке может достигать нескольких сотен. Лизосомы
характеризуются большим полиморфизмом и размерами. Они
представляют собой мембранные образования, в которых проис
ходит "переваривание" поступающих в клетку веществ с помощью
гидролаз при р Н = 3,5-5,0. В лизосомах обнаружено свыше 50
133
гидролитических ферментов. Продукты гидролиза ранее поступив
шего материала проникают через мембрану лизосом во вне — в
цитозоль (основной наполнитель клетки, состоящий из воды с
водорастворимыми компонентами), в том числе — связанные с
выработкой энергии (гликолиз).
Известны лизосомотропные вещества, которые в непротони-
рованной форме (незаряженной) проникают через мембрану ли
зосом и могут накапливаться в них. Они, как правило, являются
лиофильными слабыми основаниями и могут быть использованы
в практических целях. К их числу относятся противомалярийный
NH-CH-(CH )-N=(C,H,), препаратхлорохин-про-
I I 23 ^ э* изводное 4-аминохиноли-
^^Nf"^^ 3 на. Накапливаясь в лизо-
сомах, хлорохин блокиру
ет метаболизм гемоглоби
на — единственного ис
хлорохин
точника питания малярий
ного плазмодия.
Лизосомотропизм слабых оснований базируется на механизме
протонной ловушки. Такой механизм присущ и эндосомам, неко
торым отделам комплекса Гольд-
жи
П ?' . п ^ - (Рис' 47
'-
Классификационный
Фермент - маркер номер фермента Органелла
1КФ)
Аденилатциклаза 4.6.1.1 Клеточная мембрана
(базолатеральная)
Na+,K+-АТФ-аза 3.6.1.37 —"—
5' - Нуклеотидаза 3.1.3.5 Клеточная мембрана
(апикальная)
Лейцинаминопептидаза 3.4.11.1 —"—
у - Глутамилтранспептидаза 2.3.2.12 —"—
Глюкозо-6-фосфатаза 3.1.3.9 ЭПР
НАДФ»-цитохром- 1.6.2.4 —"—
О-редуктаза
Эпоксигидролаза 3.3.2.3 -— —
Галактозилтрансфераза , 2.4.1.38 Аппарат Гольджи
Сиалилтрансфераза 2.4.99.1 — —
НАДф-фосфатаза 3.6.1.22 —"—
Сукцинатдегидрогеназа 1.3.99.1 Митохондрии
(внутренняя
мембрана)
Цитохромокисидаза 1.9.3.1 —"—
Ротенон -нечувствительная
НАД»Н-цитохром
с-редуктаза 1.6.99.1 —"—
Моноаминооксидаза 1.4.3.4 Митохондрии
(наружная мембрана)
Кинуренин -3-гидроксилаза 1.14.13.9 —"—
Кислая фосфатаза 3.1.3.2 Лизосомы
р - Глюкуронидаза 3.2.1.31 —
Каталаза 1.11.1.6 Пероксисомы
Лактатдегидрогеназа 1.1.1.22 Цитозоль
***>Аж.
138
-isSeSLfc
•7Н20 1 250 25
Марганца
сульфат • 5НгО 0,008 20 2
Цинка сульфат 0,1 20 2 <.
Калия
дигидрофосфат 14 2*10 3 200
Кальция карбонат 30 3*103 300
Кислота
фенилуксусная 7 1»103 100
140
ИНКЗ^НЫ;^
м а м
СООН соон
I I
(сн2)2 сн2
I
соон
янтарная кислота (метаболит) малоновая кислота (антиметаболит)
145
NH=C-NH-(CH,)-CH-COOH NH=C-NH-0-(CH,)-CH-COOH
2'3 I . 22 ,
NH, NH, NH, NH,
S02NHR
сгсг
соон никотиновая пиридин-3-сульфоновая
п-аминобензойная сульфаниламиды кислота кислота
кислота (метаболит) (антиметаболиты) (метаболит) (антиметаболит)
NH SH
to to
аденин (метаболит)
N
н
6-меркаптопурин (антиметаболит)
сн 2 -сн-сн, х у /C,H-Ch4 J
I tS-CH3 CHO-CO-CH 0 N_CH3 CHO-CO-CH
Ч
сн2-сн-сн2 сн2он с'н-сн/ снр
атропин скополамин
кислоту):
Те же, но не дифференцированные культуры, не синтезируют
названные алкалоиды.
В других случаях не дифференцированные культуры тканей
способны синтезировать вторичные метаболиты, но в меньших
количествах, чем дифференцированные аналоги их (например,
алкалоид никотин, образуемый Nicotiana tabacum).
Применительно к бактериальным культурам можно назвать
Вас. thuringiensis, формирующей при дифференциации — фаза
спорообразования белковый ромбовидный параспоральньй кри
сталл, обладающий токсическим действием 'преимущественно в
отношении насекомых из отряда чешуекрылых, и поэтому исполь
зующийся в борьбе с вредителями, например, лесного хозяйства.
В отличие от бактерий грибы более дифференцированные
организмы, и у них также отмечена зависимость синтеза ряда
вторичных метаболитов от степени дифференцировки. Например,
биосинтез пигментов у большинства дейтеромицетов приурочен к
началу к о н и д и е о б р а з о в а н и я или, у некоторых видов
(Aureobasidium pullulans), он связан по времени с формированием
хламидоспор.
Казалось бы, что приведенные примеры могут служить дока
зательством существования общей закономерности, относящейся
к прямо пропорциональной зависимости синтезируемого вторич
ного метаболита от уровня дифференцировки клеток, то есть, чем
выше дифференцировка, тем больше образуется метаболита. Во
многих случаях это так и есть. Однако, что касается растений, то
имеются многочисленные данные о высокой активности дедиффе-
р е н ц и р о в а н н ы х культур, н а п р и м е р раувольфии змеевидной
(Rauwolfia serpentia), синтезирующих индольные алкалоиды. Оче
видно, тотипотентность клеток растений является одним из важ
нейших задатков способности их синтезировать вторичные мета
болиты при подборе адекватных условий культивирования и сти
мулирования, то есть воздействуя на триггерные (от англ. trigger
— спусковой крючок) или эффекторные механизмы метаболиче
ских путей вторичного обмена.
Растительные и животные клетки примерно в 10 - 100 раз
больше по размерам, чем клетки бактерий и грибов, диаметр
многих из них варьирует в пределах 20 - 150 мкм. Однако только
животные клетки и прокариотические микоплазмы лишены ригид
ной клеточной стенки. Тем не менее прокариотические и эукари-
отические клетки в процессе роста и развития стремятся к орга
низационной завершенности (бактериальные — в пределах минут-
часов, грибные — в пределах часов-суток, растительные и живо
тные — в пределах нескольких суток).
В случаях поддержания многоклеточных популяций в гистоло
гически организованной форме, соответствующей исходным тка
ням, и при сохранении специализированных для этих тканей
функций, говорят о культурах тканей. При диссоциации тканей
на клетки с утратой ими гистологической организации и специа
лизированных функций при выращивании in vitro говорят о куль
турах клеток. Разъединение клеток стимулирует их рост.
При выращивании животных клеток в культуре в целях пол
учения специальных продуктов необходимо принимать во внима
ние и учитывать их генетическую нестабильность и, как следствие,
вариабельность фенотипической экспрессии с последующими ста
рением и отмиранием. Всего этого удается избегать при использо
вании гибридомных клеток.
Если старение и гибель клетки были бы предопределены гене
тически, то это значило бы, что позитивная дифференциация
является логическим следствием роста и развития клетки, достиг
шей высшей стадии специализации, и она завершается смертью.
Согласно все более подтверждающейся на практике клонально-се-
лекционной (стохастической, от греч. stochasticos — случайный,
вероятностный) теории смерть клетки происходит вследствие по-
148
степенного накопления трансляционных ошибок в работе генома
под влиянием инфекций, радиационного облучения и других му
тагенных воздействий, то есть когда наступат критическое возра
стание энтропии.
Кроме дифференциации клеток важной особенностью их яв
ляется склонность к аггломерации (от лат. agglomeratus — скоп
ление). Это может происходить в различных условиях и с клетками
различного уровня организации — прокариотами и эукариотами.
Те из них, которые имеют клеточную стенку, чаще аггломерируют
за счет химических компонентов, локализованных в ней. Причем
процесс "скучивания" является физико-химическим (адсорбция,
ионное и ковалентное взаимодействия), зависящим не только от
особенностей клеток, но и от компонентов среды, используемой
для их культивирования. Поэтому аггломерация может быть след
ствием: 1. адгезии (от лат. adhaesio — склеивание, слипание) клеток
друг к другу или к поверхности культурального сосуда за счет
веществ — адгезинов, расположенных на их поверхности, и других
причин; 2. агглютинации по схеме "антиген-антитело", когда в
качестве антигена оказываются культивируемые клетки, а в каче
стве антитела — гомологичные или гетерологичные агглютиниру
ющие иммунные сыворотки; 3. слияния клеток с образованием
гибридов.
Известные к настоящему времени адгезины, например, в клет
ках дрожжей и ряде растений представляют собой преимущест
венно гликопротеины. В поверхостных структурах гриба
Histoplasma capsulatum за адгезию к эпителиальным клеткам от
ветственны галактоза, манноза и фукоза (в меньшей степени —
глюкоза), но не N-ацетилглюкозамин.
На поверхности ростковых трубок Candida albicans располага
ются антигенные эпитопы, или детерминанты (от греч. epi — на,
поверх, к; topos — место; от лат. determinatio — определение) с
ММ 60-230 кДа, проявляющие адгезию к фибриногену. Такие
эпитопы называют еще фибриногеносвязывающими факторами.
На каждой ростковой трубке располагается до 4000 мест фиксации
фибриногена. На поверхности дрожжевых псевдомицелиальных
клеток того же вида располагается маннопротеин (ММ 60 кДа),
белковая часть которого может связываться с производным СЗ-
фракции комплемента (iC3b), проявляя свойства адгезина.
У бактерий и некоторых грибов функцию адгезинов выполняют
белки фимбрий. Вместе с тем у грамотрицательных бактерий могут
образовываться так называемые локальные зоны адгезии между
клеточной мембраной и клеточной стенкой, лишенной пептидог-
ликанового слоя. В этих зонах два фосфолипидных слоя входят в
149
соприкосновение друг с другом (рис. 50). Таких зон может быть
порядка 200-400 на клетку (около 5% поверхности клеточной
мембраны). Локальные зоны адгезии служат воротами для транс-
псрта-в обоих направлениях.
3
2 , ' 6
NHCOCH,
NH2 HjC
СО
NHOH lL,CO
О
гидрокси-
5-аминоурацил мочевина колхицин '
|
ТАЦА ТАТААТ ЦАТ АГГЛ АТГ ТАА ЦЦГЦ ГГЦГиг ТГТТ ДНК, где располагают
ся названные элемен
ты.
Структурные гены
ЧШ СР Уп4
I
I
&к.
I.TK
I
I
1
ответственны за син
тез белковых молекул
1 :о
|Г-" (рис. 52). Ген-термина
! f- ЦГ УУУУ' тор блокирует транс
в5'ф!
3№- !>AAU "
5'-ЦТТЦГАТГГААГ-3'
3'- ГААГЦТАЦЦТТЦ - 5'
о
Репликация
однонаправ
'(Репликация
может про
новки репликации ter (от
лат. terminalis — конечный,
пограничный). Единицы
сегрегации и репликации в
бактериальной хромосоме
ленная исходить в совпадают, поскольку бак
I обратном
направлении териальная хромосома со
Репликация т ^
держит только один репли
двунаправ- \ g | кой. В то же время каждая
ленная плазмида, если она имеется
в бактериальной клетке,
Рис. 57. Две репликационные вилки в ДНК: 1 и представляет собой авто
3 — нереплицированная ДНК, 2 — репликаци- номную кольцевидную ге
онный глазок, 4 — стационарная точка начала, нетическую структуру и
5 — движущаяся репликационная вилка, 6 — является самостоятельным
две репликационные вилки.
репликоном.
Плазмиды, представленные в бактериальной клетке лишь в
одной копии, называются однокопийными, другие плазмиды, пред
ставленные более чем одной копией, называются многокопийны-
ми.
В эукариотической клетке содержится большое число репли-
конов и единица сегрегации у них включает много единиц репли
кации. Все компоненты аппарата ре
пликации называют реплисомой. Ре
пликация ДНК начинается в стартовой
точке, или репликационной вилке, в
одном (однонаправленная реплика
ция) или в двух противоположных
(двунаправленная репликация) на Разрыв
правлениях. В последнем случае будет
две репликационных вилки (рис. 57).
Реплицированная часть ДНК приобре
тает форму "глазка", представляюще
гося 0-структурой.
В случае кольцевой матричной
структуры ДНК точка роста одной раз
резанной цепи спирали "скользит" Точка роста
вокруг второй кольцевой матричной
цепи. Возникает структура катящегося
\fi
•5'Вытесняемая
цепь
кольца (рис. 58).
Рост клеток бактерий и репликация Рис. 58. "Катящееся" кольцо мат
ДНК в них тесно связаны между собой. ричной цепи.
167
Цикл клеточного деления на примере Е. coli можно представить
двумя временными интервалами, обозначаемыми латинскими бук
вами С и D. Первая из них обозначает фиксированное время,
необходимое для репликации всей бактериальной хромосомы (на
пример, 15 мин.), что соответствует скорости движения отдельной
Точка начала -. 35/0 гКонцевая точка
т_»>£гл°«и«м т.»™ репликационнои вилки с присоединени-
30 *" "~\ , ем около 50000 пар оснований в 1 мин.;
D соответствует промежутку времени
(порядка 20 мин.) между завершением
\ репликации ДНК и делением клетки —
((
25 это как бы накопительный период. Сле
\ / довательно, весь так называемый корот
кий клеточный цикл деления Е coli ук
20 15 ладывается в среднем в 35 минут (рис.
Рис. 59. Цикл деления Е. coli — 59).
о б р а з о в а н и е х р о м о с о м ы со
многими вилками в процессе
Длинный цикл клеточного деления
репликации (а — инициация, б наблюдается тогда, когда велико время
— деление, в — терминация); до начала инициации. Для диплоидных
ц и ф р ы обозначают минуты кле клеток эукариот характерно митотиче-
точного цикла. ское деление ядра с последующим обра
зованием новых (дочерних) клеток. Этот
митотический цикл подразделют на 4 фазы: Gj, S, G2 и М. Фаза
Gi обозначает время роста клетки до синтеза ДНК (от англ. gap —
пробел); в фазу S происходит синтез ДНК (от англ. synthesis); G2
— вторая фаза роста в период.после синтеза ДНК; М — фаза
митоза (от англ. mytosis). На рис 60 представлена схема цикла
эукариотических клеток с обозначением продолжительности фаз
в культивируемых линиях дрожжевых клеток Schizosaccharomyces
pombe и клеток млекопитающих. На весь цикл деления клеток
эукариот усредненно приходится следующая доля времени: на
1 г
Рис. 60. Схема цикла клеточного деления эукариотических клеток: 1 —
Schizosaccharomyces pombe, 2 — клетки млекопитающих.
У 60 ? репликативный синтез
митохондриальной ДНК -
2-15%
'ччнч^тчч^т^
Т Ц А Г А Г Т Т А Ц Г
..5'
А Г У Ц У Г Ц
ОН
Авто - транс •
каталитическая этерификации
j : H^JT^POHJ^
Ш
Дрожжи HeLa Tetrahymena
174
и з в н а Этим доказываются автокаталитические свойства нуклеи
новых кислот, и предложенный Т. Чехом термин "рибозим" не
представляется алогичным.
Компартментализация эукариотической клетки служит веским
доказательством специального (более высокого, чем у прокариот)
разграничения функций и привязки их к определенным структу
рам. Это относится и к белковому синтезу. Мономерные рибосомы,
в отличие от полисом, находятся в цитоплазме клетки в свободном
состоянии. Полисомы, как правило, располагаются либо цепочкой
ближе к ядерной мембране (связанные полисомы) и в тех местах,
где мРНК входит в цитоплазму, либо они (так называемые "сво
бодные полисомы") ассоциируются через посредство мРНК с
клеточным цитоскелетом (см.). Это обусловлено качеством синте
зируемых белков на полисомах.
В 1980 г. Трифонов и Зусман выяснили, что в геноме человека
пары адениновых нуклеотидов встречаются с периодичностью 10,5
на протяжении любой последовательности ДНК, которая взаимо
действует с единицей гистонового ок-
тамера и образует нуклеосому. Эта
периодичность хорошо коррелирует с
периодичностью завитков в В-спирали
(см.) молекулы ДНК. Указанная пери
одичность адениновых пар кодирует
закручивание спирали ДНК в одном
направлении вокруг комплекса гисто-
новых октамеров (рис. 64) и этот код
был назван "хроматиновым" или "код
упаковки хроматина". Высказано
предположение, что в структурах бло
ков тандемно повторяющихся после
довательностей потенциал скручива
ния спирали как бы амплифицируется
(отангл. amplification — обилие). Более
того, показано, что и при альтернатив
ных вариантах закручивания спирали
(например, левостороннем) обнару
живаются тандемные блоки пурино-
Рис. 64. Упаковка хроматина на
пиримидиновых оснований. Очевидно примере нуклеосомы: 1 — гистон
блоки тандемных повторов кодируют HI, 2 — двухнитевая ДНК, обви
локус-специфичную упаковку ДНК и тая вокруг структуры, содержа
структуру хроматина в ядре клеток щей 8 молекул гистонов — по 2
молекулы Н2А, Н2В, НЗ и Н4, 3
человека. — спейсерный участок ДНК.
175
Локус-специфичный "код упаковки хроматина" участвует не
только в структурной организации хромосом в ядре клетки, но
может выступать как "код экспрессии гена", "код репликации"
(сайты репликации на протяжении данной повторяющейся после
довательности) и "код рекомбинации".
Суммируя основные представления о структуре и функциях
генома акариотических, прокариотических и эукариотических ви
дов, необходимо подчеркнуть следующие его особенности:
1) Геном акариот и прокариот, а также митохондрий и пластид
эукариот является компактной совокупностью генов с небольшим
содержанием структурных повторов, что характеризует его эко
номичность. Он кольцевидно замкнут (непрерывен), интервалы
между генами минимальны. Например, вся генетическая инфор
мация умеренного фага X размещается в кольцевой молекуле ДНК
длиной в 50 kb, где содержится порядка 40 генов; плазмидная ДНК
из 95—97 kb включает до 100 генов; замкнутая ДНК Е. coli из 400
kb может содержать до 3000 генов (примерно 1500 пн составляют
один ген);
2) Генетический аппарат в клетках эукариот организован в
форме нескольких линейных хромосом, в которых ДНК прочно
связана с белками-гистонами, обеспечивающими упаковку и упо
рядочение ДНК в виде структурных единиц—н у к л е о с о м
(учитывая при этом "код упаковки хроматина" и экстраполируя
его на клетки большинства эукариот). Так, в гаплоидной клетке
Saccharomyces cerevisiae содержится 17 хромосом, в каждой из
которых детектировано ЮООкЬи, следовательно, число генов могло
бы достигать в такой клетке 11 000; для 23 хромосом в гаплоидной
клетке человека, где в одной хромосоме содержится 125 000 kb,
число генов должно бы возрасти до 2 млн. Предположительно
близкое число генов могло бы оказаться в гаплоидных клетках
кукурузы, где имеется 10 хромосом, в клетках кролика с 22
хромосомами, или мыши с 20 хромосомами. Однако, в хромосомах
эукариотических организмов содержится генов меньше, чем неко-
дирующих участков (спейсеров, или разделителей), и также име
ется масса сходных между собой фрагментов ДНК, повторяющихся
десятки-сотни тысяч раз. Вот почему, например, у человека лишь
10 - 20% всей ДНК относится к разряду кодирующей. Но и в этом
случае число генов в 23 хромосомах гаплоидной клетки может
достигать порядка 200 000.
176
3) Гены эукариот, нередко располагаясь в хромосомной ДНК
рядом, образуют м у л ь т и г е н н ы е с е м е й с т в а , состоящие
из небольшого числа родственных последовательностей. Напри
мер, гены, кодирующие рРНК у млекопитающих, обнаруживаются
в геноме сотнями своих копий, сгруппированных в зоны, а это
свидетельствует об избыточности генетических программ у вы
сших организмов (создание "повышенной прочности").
4) Представители микробного, растительного и животного мира
имеют в составе генетического материала одни и те ж е строитель
ные блоки, то есть их "кодовый словарь" в основном однотипен,
или универсален, и функционирует преимущественно в соответ
ствии с центральными постулатом молекулярной генетики, сфор
мулированным Ф. Криком в 1967 г.: генетическая информация
переносится по схеме ДНК —> РНК —» Белок (у вирусов может быть
несколько видоизменена), но никогда — от белка к РНК.
5) Каждый ген проявляет себя (экспрессируется) путем обра
зования, или биосинтеза мРНК (транскрипция гена) с последую
щим переводом (трансляция) информации в специфическую по-
липептидую цепь, фактически являющуюся продуктом гена. Ген и
его продукт к о л и н е а р н ы , т о есть последовательность кодонов
(триплетов) в гене точно соответствует последовательности амино
кислот в белке.
6)' Ген кодирует строение белковой молекулы и регулирует
процесс ее синтеза.
В таблице 19 суммированы основные представления о строении
и функциях генетического аппарата клеток разного уровня орга
низации.
Зная строение и функцию генов, а также владея методами их
выделения и переноса в различные клетки или молекулы нуклеи
новых кислот, можно с достаточной уверенностью подходить к
постановке генноинженерных работ.
5.2.КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ
ИНЖЕНЕРИИ;
рДНК-БИОТЕХНОЛОГИЯ
5.2.1. Общая характеристика генетической инженерии. Гене
тическая инженерия — это методы получения рекомбинантных
ДНК, объединяющих последовательности разного присхождения.
Некоторые ученые трактуют генетическую инженерию "как ис
кусство использования знаний, методов и техники физико-хими
ческой биологии и молекулярной генетики для конструирования
177
организмов с заданными наследственными свойствами" (В. Н.
Рыбчин, 1986).
Т а б л и ц а 19. Основные характеристики генетического аппарата у прокариот
и эукариот
энхансеров
тканеспецифичны
по строению типичен единый промоторы генов,
промоторов план строения; кодирующих
Е- наличие двух белки, имеют одну
консервативных консервативную
последованостей: последователь
ТАТААТ (-10) и ность TATA (А/Т)
ТТТАЦА (-35) А(А/Т) (-30) и
богатый
ГЦ-участок (-40...
- 100)
по мРНК колинеарна гену первичный
или оперону транскрипт
колинеарен гену.
"Зрелая" мРНК
образуется в
процессе
сплайсинга
по константе 70S (50S и 30S) 80S (60S и 40S)
седиментации
рибосом
ции
ности не выявлено
донам
,по ко-
178
Очевидно, что под искусством автор понимает умение органи
зовать и методически реализовать генноинженерную задачу —
получить рекомбинантную ДНК с последующим включением ее в
реципиентную клетку или осуществить перенос целых хромосом
от клеток-доноров в клетки-реципиенты.
Иногда понятия "генная инженерия" и "биотехнология" отож
дествляются (А. А.Баев, 1984), хотя несомненно генная инженерия
представляет собой один из методов науки биотехнология. В основу
генноинженерных методов заложена способность ферментов —
рестриктаз расщеплять ДНК на отдельные нуклеотидные последо
вательности, которые могут быть использованы для встраивания
их в геномы бактериальных плазмид и фагов с целью получения
г и б р и д н ы х , или х и м е р н ы х форм, состоящих и з собственной
ДНК и дополнительных встроенных фрагментов несвойственной
им ДНК. Поэтому методами генетической инженерии добиваются
к л о н и р о в а н и я генов, когда выделяют нужный отрезок ДНК
и з какого-либо биообъекта и затем получают любое количество
его, выращивая колонии генетически идентичных клеток, содер
жащих заданный участок ДНК. Другими словами клонирование
ДНК — это получение ее генетически идентичных копий.
Генетическую инженерию подразделяют на генную инжене
рию, геномную инженерию и хромосомную инженерию. Сущ
ность первой состоит в целенаправленном использовании пере
строек естественного генома, осуществляемых in vivo или in vitro,
для изменения генетических характеристик известных вирусов и
клеток. В качестве примеров генной инженерии in vivo можно
назвать: транслокацию (перемещение) в вирусные геномы некото
рых клеточных генов, придающих вирусам свойства онкогенности;
трансдукцию (перенос) клеточных генов от клеток-доноров в клет
ки-реципиенты с помощью фагов, и др. Примером генной инже
нерии in vitro является создание молекулярных химер и з фрагмен
тов ДНК разного происхождения, включение их в реципиентные
клетки Е. соП, Вас. subtilis и др. с последующим культивированием
этих организмов в целях получения необходимых белковых про
дуктов (пептидных гормонов, ферментов и т. д.).
Сущность геномной инженерии заключается в целенаправлен
ной глубокой перестройке генома акариот, прокариот или эукари-
от, вплоть до создания новых видов. При геномной инженерии
добиваются внесения большого количества дополнительной гене
тической информации и в результате получают гибридный орга
низм, отличающийся от исходного по многим признакам. Гибриды
179
оказываются жизнеспособными лишь в тех случаях, когда они
содержат все безусловно необходимые (облигатные) гены, когда у
них налажены и взаимно согласованы регуляторные связи между
совмещенными генами, и, наконец, когда имеется структурное
соответствие между продуктами матричного синтеза (белками).
При геномной инженерии возможно получение половых (сли
яние гамет) или соматических (слияние неполовых клеток) гибри
дов. Половые гибриды получают либо в естественных, либо в
искусственных (экспериментальных) условиях. Соматические гиб
риды способны формироваться лишь в искусственных условиях у
прокариот и эукариот, то есть у клеточных форм ( к л е т о ч н а я
инженерия).
Примером естественной (природной) геномной инженерии
является рекомбинация геномов вирусов гриппа, относящихся к
типу А. На основании антигенных характеристик рибонуклеопро-
теинов выделяют вирусы гриппа А, В и С. Изменения антигенных
свойств постоянно происходят у вирусов типа А, меньше — у типов
В, тогда как вирусы типа С являются антигенно стабильными. К
тому ж е известны штаммы вируса гриппа А, изолируемые от
свиней, лошадей, уток, цыплят. Некоторые изоляты вируса от
животных антигенно подобны штаммам, циркулирующим среди
людей. Поэтому более полно изученными к настоящему времени
также оказались вирусы типа А. Их геном состоит из 8 различных
однонитевых сегментов РНК с общей молекулярной массой 2—
А- 10 3 кДа (см. рис. 22а). Большая часть полинуклеотидов, состав
ляющих вирусные РНК-сегменты, содержат уридин на З'-конце. С
вирусным геномом ассоциирована РНК-зависимая РНК-полимера-
за. Рибонуклеопротеин окружен белковым слоем (М), образующим
внутреннюю часть вирусной оболочки. Белок М включает малый
протеин с ММ 26 кДа, составляющим 40% от всего белка вирусной
частицы. Порядка 20% массы частицы приходится на липидный
бислой, который, по-видимому, имеет клеточное происхождение.
Гемагглютинин отвечает за агглютинацию эритроцитов вирусом
А. Он представляет из себя гликопротеин с ММ 75 кДа. Нейрами-
нидаза ответственна за рецепторцо-разрушающую активность ви
руса, обеспечивая ему выход из эритроцита или клетки-"хозяина".
Нейраминидаза состоит из четырех полипептидных молекул с ММ
порядка 60 кДа, и, наряду с гемагглютинином, обладает антигенной
активностью. Их используют для регистрации и объяснения анти
генных изменений вируса. К началу 90-х годов было известно 11
подтипов гемагглютинина (HI—HI 1) и 8 подтипов нейраминидазы
180
(N1—N8) у вирусов А. Поэтому система обозначения вируса гриппа
включает название штамма, номера субтипов гемагглютинина и
неираминидазы. Например, вирус гриппа А(свиной) Тайвань
/1/70(H3N2). Это значит, что вирус изолирован от свиней на
острове Тайвань в 1970 году, содержит гемагглютинин 3(НЗ) и
нейраминидазу 2 (N2). Оба антигена (Н и N) формируются и
контролируются генами (РНК-фрагментами) независимо друг от
друга. Вследствие сегментарности генома вирус проявляет реком
бинацию с высокой частотой и, как следствие, происходят изме
нения в антигенных свойствах вирусов (прежде всего — по
гемагглютинину и нейраминидазе).
В экспериментальных условиях возможно проведение РНК —
РНК-гибридизации с последующим определением профилей плав
ления молекул гибридных РНК в присутствии формальдегида.
Известны некоторые вирусы бактерий, объединяющие в себе
свойства фагов и плазмид. Их назвали фазмидами. Они могут быть
природного и экспериментального (искусственного) происхожде
ния. К природным относятся некоторые умеренные coli-фаги (N15,
Р1), к искусственным — фазмида col 106, способная при 32°С
проявлять свойства плазмиды, а при 37°С индуцирует лизис реци-
пиентных клеток.
Благодаря высокой степени генетической гомологии Е. coli,
Salmonella spp. и Shigella spp. можно получать хромосомные гиб
риды между ними:
Доноры ДНК (хромосомы) Реципиенты ДНК (хромосомы)
Е. coli Различные штаммы Е. coli
Shigella spp.
Salmonella spp.
СН7ОН
сн2он ;са
он о ^0
половая соматическая
гибриди- гибридизация
зация (клеточная
инженерия)
Такое подразделение генетической инженерии и терминология
185
достаточно условны, поскольку, в конечном итоге, результаты
манипуляций с рекомбинантной ДНК получают на клеточных
культурах. Поэтому при выделении двух уровней биотехнологии
— м о л е к у л я р н ы й и к л е т о ч н ы й (включая к л е т о ч-
н о - и н ж е н е р н ы й ) следует иметь в виду, что первый относится
к получению и клонированию рекомбинантной ДНК, второй — к
выращиванию вирусов, клеток и тканей (клеточно-инженерный —
к протопластированию и гибридизации протопластов), хотя, как
у ж е было сказано, все уровни можно свести к одному — клеточ
ному.
У У / У У У У Ч А у А / ч л / У А АААДмРНК
ревертаза, или обратная
транскриптаза;
нуклеозидтрифосфаты;
олигодезокситимидин (dT)
S / V / 4 A . / 4 A / 4 A / V 4 / V / V A А А А А мРНК
II II II II II
—^—~—^————— Т Т Т Т Т комплементарная цепь
денатурация
ДНК=полимераза I
(фрагмент Кленова) + дезоксинуклеозидтри-
фосфат ((1НТФ)
AAAAA
С II II II II II ДНК с одноцепочечной
XXXXТ петлей
—Ц—Т—Г—Ц—А—Г
—Г—А—Ц—Г—Т—Ц—
Г
Pst 1
За счет этого вектор можно использовать для встраивания
полученного фрагмента ДНК с гомополимерными последователь
ностями йЦ.
Для изоляции неповрежденных генов из ДНК можно исполь
зовать ультразвук или гидродинамическое дробление ДНК в соот
ветствии с нижеследующей последовательностью этапов.
В соответствии с особенностями структуры полученного фраг-
187
мента его включение в pColi E1 будет обеспечиваться связыванием
типа поли-dA—dT.
ДНК из E.coli
гидродинамическое дробление (или ультразвук)
фрагменты ДНК
5' — рестриктаза фага X
190
Продолжение табл. 20
Наименование Источник получения Сайт узнавания
фермента в последовательности ДНК
Fspl Fischerella species 5 / - ТГЦ/ГЦА - 3 /
НаеП Haemophilus aegyptius 5/ - Р и Г Ц Щ / Р у - 3 /
Нае III —"—"— 5 / - ГГ/ЦЦ - 3/
Hhal — " — haemolyticus 5/ - ГЦГ/Ц - 3 /
Hinc II — " — influenzae Re 5 ' - ГГРу/РиАЦ - 3 /
Hind III И з штамма E. coli, 5 / - А/АГЦТТ - 3/
несущего плазмиду
гиперчувствительности
Hind III
Hinf I Haemophilus influenzae 5У - Г/АГчГГЦ - з'
серовар f
Hpal Haemophilus 5У - ГГТ/ААЦ - 3/
parainfluenzae
Hpall —"—"— 5/ - Ц/ЦГТ - 3/
Kpnl Klebsiella pneumoniae 5/ - П Т А Ц / Ц - 3'
Mbo I Moraxella bovis 5/ - N/ГАЦТ - 3/
MboII —"—"— 5' - ГААГА (N) 8 / - 3/
Mlul Micrococcus luteus 5У - А/ЦГЦГТ - 3'
Msp I Moraxella species 5 / - Ц/ЦГТ - З 7
Ncol Nocardia caroffina 5 / - Ц/ЦАТГТ - 3'
Ndel Neisseria denitrificans Ъ' - ЦА/ТАТГ - 3'
PstI E. coli, Ъ' - Ц Т Щ А / Г - 3'
несущая плазмиду
гиперпродукции Pst I
PstI Providencia stuartii 5/ - Ц Т Щ А / Г - З1
Pvul Proteus vulgaris Ъ' - ЦГАТ/ЦГ - 3'
PvuII —"—"— 5 / - ЦАГ/ЦТГ - 3'
Sma I Serratia marcescens Sb 5/ - Ц Ц Ц / П Т - 3 '
Xbal Xanthomonas bardii 5/ - Т/ЦТАГА - 3/
Примечание: 1) в скобках указаны альтернативные нуклеотиды,
2) Ри.Ру — любое пуриновое, пиримидиновое основание,
3) N — любой нуклеотид,
4) Г к — метилированный гуанин,
5) (N)e — нуклеотид, повторяющийся 8 раз.
191
Расщепление сайтов может происходить симметрично (см. Alu
I, Bal I, Dpn I и др.) с образованием т у п ы х к о н ц о в в ДНК
и асимметрично (Aat II, Асе I, Ava I, II, Bam HI и др.) с образованием
липких концов:
Hinc II
А
-ЦТАГГЦАГЦТГГАЦГТ-
ДНК
- Г АТЦЦГ ТЦГ АЦЦ Т Г Ц А - _
Hinc II
-ЦТАГТЦАГ ЦТГГАЦГТ-
,-ГАТЦЦГТЦ, [ГАЦЦТГЦА-,
фрагменты ДНК с тупыми концами
Hind III
- ГТЦГТААГЦТТЦЦГТГ-
:'-::'••'::'•':::': ДНК
- ЦАГЦАТТЦГААГГЦАЦ- _
Hind HI
- ГТЦГТА АГЦТТЦЦГТГ-
|-ЦАГЦАТТЦГА | [ АГГЦАЦ-|
фрагменты ДНК с липкими концами
--о
|
СНг о
нуклеиновое
основание
"Г" \р
CH
s,0-
-н,о
нуклеиновое
основание
ОН ОН I I
О ОН
-- о
I " нуклеиновое
С «2 О^ основание
он—Р=О
о
| , нуклеиновое
CHj Q основание
о он
7 т. 8524 193
Таким путем восстанавливаются ковалентные связи в пробелах:
• • • 5/—Т—Ц—Т—А—Г—А—З7, *'
NH-CH-COOH
I
сн 3
октопин
(синтезируется из аргинине и пирувата}
HOOC-CH-NH-CH-COOH
I I
(СН 2 ) 2 (СН 2 ) 3
I I
СООН NH
I
ж2-с=ын
нопалин
i
196
Октопин и нопалин, равно как и атропин, относятся к группе
о
it
с
/ \
HjN-CCMCHpj-CH О
NH СН-(СНОН) - С Н О Н
\ /
с
н/Чн
агропим
Клонирование рДНК
Для клонирования рДНК используют так называемые
п е р м и с с и в н ы е клетки (от англ. permission — разрешение).
Клон — это большое число молекул или клеток, идентичных
198
исходной родительской молекуле или клетке. К числу пермиссив-
ных клеток для включения в них рДНК относятся такие, в которых:
1) не разрушаются чужеродные ДНК или РНК собственными
ферментами — нуклеазами,
2) срабатывает механизм репликации вектора,
3) проявляется выраженная активность промотора и/или тер
минатора транскрипции рДНК,
4) отмечается полный сплайсинг мРНК,
5) наблюдается эффективная трансляция мРНК,
6) нет выраженной активности пептидогидролаз, катализиру
ющих реакции гидролиза экспрессируемых чужеродных белков.
Излюбленными объектами в генной инженерии являются клет
ки Е. coli, Вас. subtilis, Saccharomyces cerevisiae и некоторые другие.
Е. coli — грамотрицательные, перитрихальные, прямые палочки
(1,1-1,5x2,0-6 мкм — живые, или 0,4-0,7x1,0-3,0 мкм — высушенные
и окрашенные); факультативный анаэроб, хорошо растет на про
стых питательных средах при 37°С, содержание Г + Ц в ДНК 50-51
мол% (по температуре плавления и плавучей плотности). Некото
рые серовары Е. coli патогенны для человека (01, 02, 06, 08, 09, 011,
015, 026, 055, 078, 0111, 0124, 0144, 0148 и др.). Е. coli чувствительна
к включению векторов.
Вас. subtilis — почвенные, спорообразующие, грамположитель-
ные, непатогенные, прямые, перитрихальные палочки (0,7-0,8 х
2,0-3,0 мкм), хорошо растет на простых питательных средах при
разных температурах (минимальная 5-20°С, максимальная 45-55°С),
содержание Г + Ц в ДНК от 32 до 62 мол%; обладает высокой
частотой трансформации (4%), с кольцевой хромосомой, на которой
известно более 2000 локусов; содержит сайт-специфические нук-
леазы, чувствительна к включению векторов.
Saccharomyces cerevisiae — аскомицетные, одноклеточные, сап
рофитные дрожжи (группа низших грибов), широко используемые
в микробной биотехнологии для получения разных биологически
активных веществ (БАВ). Вегетативные клетки этого вида однокле
точные, почкующиеся, круглые или, чаще, овальные, размером
2,5-11x2,5-30 мкм, хорошо растут на средах Сабуро, с пивным
неохмеленным суслом и других при температуре 26°С; содержание
Г + Ц в ядерной ДНК колеблется в средних пределах от 48 до 63
мол%; в отличие от бактерий они генетически более стабильны, не
подвергаются фаголизису, способны гликозилировать собствен
ные белки (продуцируемые эукариотическими клетками белки, как
199
правило, функционально активны в форме гликопротеинов), их
геном лишен оперонов, обладают тремя классами РНК-полимераз,
и т.д. Другими словами — сахаромицетные дрожжи являются
типичными эукариотами, поэтому в них лучше клонировать гены
растений и животных. У S. cerevisiae имеется 17 хромосом, на
которых картировано свыше 600 генов. Для клонирования чуже
родных ДНК в дрожжевых клетках нередко используют челночные
векторы, имеющие ori-сайты бактериальных и дрожжевых плаз-
мид, а поэтому способные самостоятельно реплицироваться в
бактериальных и дрожжевых клетках. На рис. 68 схематично
изображен челночный вектор иммунного интерферона (INF-y),
который реплицируется в клетках обезьяны и Е. coli. В этом векторе
содержится фрагмент из 342 пн, который включает ori-сайт и
промотор из вируса SV-40; данный фрагмент связан с фрагментом
кДНК, включающим кодирующую последовательность npe-INF-y,
и с фрагментом pBR322, содержащим ген резистентности к ампи
циллину и ori-сайт репликации pBR322.
У дрожжей выявлены 3 вида циклически замкнутых плазмид:
двух- и трехмикронная, митохондриальная (длина 24 мкм) ДНК.
Первые две относятся к разряду "эгоистических" криптических,
поскольку биологическое значение их остается скрытым, неясным.
Лишенные селективных маркеров они представляют ценность в
качестве векторов только после включения в них соответствующих
хромосомных генов дрожжей, функционирующих как в дрожже
вых, так и в бактериальных (Е. coli) клетках. К таким генам
относятся те из них, которые отвечают за биосинтез таких фер
ментных белков, как аргининсукцинатлиаза, аспартат-транскарба-
милаза, галактокиназа, дигидрооротатдегидрогеназа, триптофан-
синтаза и др.
Известно 5 типов дрожжевых векторов, образующих Y-rpyniry
(от англ. Yeasts — дрожжи): Yip, YEp, YRp, YCp, YLp. Первые из
них (Yip) представляют собой интегративные плазмиды, в которых
только один ген принадлежит дрожжевой ДНК, остальные гены
относятся к бактериальным. Yip не способны реплицироваться в
клетках S. cerevisiae, но осуществляют их трансформацию, интег-
рируясь в хромосому через рекомбинацию.
Векторы YEp — эписомальные плазмиды, сконструированные
на основе двухмикронной плазмиды. Частота трансформации S.
cerevisiae этими векторами на три порядка выше, чем в случае
использования Yip, но, к сожалению, получаемые трансформанты
мало стабильны.
200
Векторы YRp — репликативные плазмиды, включающие хро
мосомные репликаторные последовательности, именуемые ars-no-
следовательностями (от англ. autonomously replicating sequence —
автономно реплицирующаяся последовательность). Трансформан
ты дрожжей, получаемые с помощью YRp, нестабильны.
Векторы YCp в виде кольцевых мини-хромосом содержат цен
тромеры дрожжевых хромосом и репликаторы arsl и ars 2. Они
стабильны при митозе и мейозе, и наиболее перспективны для
клонирования генов.
Векторы YLp — линейные мини-хромосомы, конструируемые
на базе YCp. Для этого вводят специфические, шпилечные по
форме, нуклеотидные последовательности на концах хромосом
(теломеры) в кольцевые плазмиды YCp с последующей линеариза
цией плазмид.
Плазмиды и фаги обеспечивают перенос чужеродной ДНК в
качестве инертной части генома, поэтому их называют еще к л о
н и р у ю щ и м и в е к т о р а м и . В биологической технологии
выгодны мультикопийные плазмиды (10-20 на клетку). Если ж е
плазмиды находятся под ослабленным контролем репликации,
когда прекращается размножение бактерий, то они (плазмиды)
накапливаются числом до 1000 на клетку — в результате больше
образуется целевого продукта. В отличие от хромосомы репликация
плазмиды в пермиссивной клетке может происходить при останов
ке синтеза белка, Вот почему, например, при добавлении левоми-
цетина к культуральной жидкости сопровождается заметным воз
растанием числа копий плазмиды (увеличение степени клониро
вания).
Для включения рДНК в пермиссивные клетки пользуются
различными методами: трансформации, инфекции, микроинъек
ций. При естественной трансформации рДНК может проходить
через интактную клеточную стенку Вас. subtilis, Streptococcus
pneumoniae, некоторых штаммов Е. coli с ингибированной систе
мой деградации ДНК, и др.
В 1970 г. М. Мандель и А. Хига предложили метод обработки
бактерий хлористым кальцием на холоду в целях трансформации
ДНК фага в клетки Е. coli. Этот метод используется и теперь. Этапы
его примерно следующие:
1) выращивание культуры в питательной среде при оптималь
ной температуре в течение суток с последующим разведением
примерно в 50 раз свежим питательным бульоном, выращиванием
201
до Абоо = 0,2 (показатель плотности) и охлаждение во льду;
2) центрифугирование суспензии при 3000 g 10 мин, темпера
туре 4°С и разведение осадка клеток в 0,1 М CaCh, охлажденного
во льду, с последующим центрифугированием при тех же условиях;
3) ресуспендирование осадка в минимальном количестве (на
пример, в 1 мл) охлажденного во льду 0,1 М растворе СаОг,
хранение до использования при 4°С. Это и будут пермессивные
компетентные клетки, готовые претерпевать трансформацию; если
такие клетки, ресуспендированные в 0,1 М СаСЬ, 30% глицерине
заморозить при -70°С, то их можно хранить в течение нескольких
месяцев;
4) добавление плазмидной ДНК к компетентным клеткам (при
мерно 0,1 мкг ДНК в 0,2 мл суспензии клеток), выдерживание во
льду 1 час;
5) тепловой шок смеси при 42° С 5 мин.;
.6) разбавление пробы в 10 раз питательным бульоном, инкуба
ция 1 час на качалке при 37°С; за это время, например, признак
резистентности к какому-либо антибиотику успевает зкспресси-
роваться;
7) посев клеток в серии разведений на чашки Петри с пита
тельным агаром, содержащим соответствующий(-ие) антиби
отик (-и), выдерживание в течение суток при оптимальной темпе
ратуре;
8) изоляция нужной колонии и размножение клона.
рДНК можно ввести в клетки млекопитающих путем слияния
протопластов, например Е. coli, содержащих рДНК, с культивиру
емыми эукариотическими клетками в присутствии полиэтиленгли-
коля, или ПЭГ, способствующего слиянию протопластов.
Перенос рДНК в клетки прокариот или введение последова
тельностей клонированной ДНК в рецепторные эукариотические
клетки (например, млекопитающих) с помощью фаговых векторов
называют т р а н с ф е к ц и е й . Альтернативный метод —
использование вирусов эукариот, то есть когда эукариотическая
клетка и н ф и ц и р у е т с я — (заражается) вирусом. В качестве
векторов при этом чаще используют литические вирусы типа
вируса полиомы и SV40, а также челночные векторы, сконструи
рованные на основе ретровирусов и папилломавирусов.
На растительных объектах можно выполнить генно-инженер
ные эксперименты, используя методы трансформации и инфици
рования (см. рис. 141).
202
Метод микроинъекцйи используют в случаях механического
введения ДНК (в том числе рДНК) в ядра культивируемых клеток
млекопитающих, растений, используя для этого стеклянные мик
роиглы (рис 69). Этот метод впервые продемонстрировали Дж. Е.
Мерц и Дж. Б. Гердон в 1977 г. на ооцитах лягушек Xenopus.
5'
DGDDDD = В
DDDODDDl> = г
Цикл 1
J
5'Т ¥3
ДС
5 ff 3
' | ' 5rt|3-
3'1т5' 3^^5 1
—7
Цикл 2
г"1ГЧ
if р I*
rm m i
Циклы 3-25
В
30 ц J (0,5 pM)
0,5 p M PS ДНК
i o t a t oi Л" о | о s а"«
I afi УI «I ss gi яг S-10 pM SS ДНК
IV
вазэктомия*с
неполовозрелая производитель х половозрелая
¥ _ _ * с/ стерильный
самец
естественное
спаривание
гиперовуляция х ^ _ псевдобеременная
реципиентная
самка
коллекция преимплантированных
эмбрионов
оплодотворенное мышь-кормилица
одноклеточное яйцо
микроинъекции | пересадка
в яйцевод кесарево
и вскармливание
выделение и рождение
очистка Д Н К естественным путем
выделение Д Н К
изч ттканей
и хвоста•
к я и р и VRnf-тя *
анализ выделенной
ДНК
идентификация трансгенных
мышеи
210
пищу овечьего молока, где содержались бы такие факторы); удалось
ввести ген гормона роста крупнорогатых животных в геном клеток
поросят, заставили расти их быстрее и с меньшим количеством
жира. Однако подобные результаты, очевидно, будут сопряжены
и с неудачами. Необходимы кропотливые исследования во всех
направлениях генетической инженерии, чтобы добиться успехов
в практическом воплощении наиболее приемлемых результатов в
биологическую технологию.
В связи с экспрессией генов большое значение приобретает
"белковая инженерия", дорожку которой проторила генетическая
инженерия, первая вытекает из второй и, следовательно, белковая
инженерия также является методом науки "Биологическая техно
логия". Целевые установки здесь сводятся к изучению и понима
нию главного звена в структуре ферментов (почему они функци
онируют так, а не иначе?), к возможности научиться видоизменять
природные белки или, того больше, уметь их заново проектировать,
к выяснению причин и механизмов изменения фенотипа под
влиянием генотипа.
Природные белки имеют свою молекулярную архитектонику
— то это вытянутые, то специфически изогнутые или скрученные
структуры. Поэтому в научной литературе, посвященной белковой
инженерии, можно встретить выражение "архитектурный дизайн",
кода говорят о конструировании молекул белков с заданной архи
тектурой по заведомо и специально подобранным аминокислотным
текстам. Белковая инженерия в любом проявлении будет базиро
ваться в основном на продуктах экспрессии естественных и ре-
комбинантных генов.
Таким образом, последовательность этапов клонирования и
экспрессии гена может протекать в следующей очередности:
1) сортинг хромосом (может быть автоматизированным) и
получение ДНК (или только выделение ДНК, например, из прока-
риотических клеток);
2) введение ДНК в вектор (плазмидный);
3) трансформация (трансфекция, инфекция, инъекция);
4) обнаружение и накопление клона (клонирование) клеток;
5) выделение рДНК (плазмиды);
6) определение нуклеотидной последовательности в клониро
ванном фрагменте рДНК (может быть автоматизировано);
7) конструирование и построение плазмиды для экспрессии ее
функций;
8) трансформация;
211
9) обнаружение и накопление клана;
10) выделение плазмиды;
11) проверка нуклеотидной последовательности в рДНК (может
быть автоматизировано);
12) трансформация;
13) выращивание культуры на предмет получения экспресси-
руемого белка;
14) выделение белка.
Каковы же место и роль рДНК-биотехнологии в человеческом
обществе?
На фоне растущих народонаселения на планете Земля и эко
логических бед место и роль рДНК-биотехнологии определяются
потребностью людей в пищевых продуктах и, прежде всего, в
белках, в различных лекарствах; в исправлении многочисленных
наследственных заболеваний. В общенаучном плане важными
являются исследования: а) процессов переноса генетической ин
формации между видами и расшифровки механизмов функциони
рования клеток;
б) путей и методов создания новых существ — химер и новых
организмов, возможно — монстров;
в) эволюции различных существ, включая человека (при допу
щении альтернативной оценки всего живого как вечной материи,
подвергающейся изменчивости в пространстве и времени).
5.3. Изменчивость организмов и ее значение в биотехнологии.
С каждым годом взаимоотношения различных организмов с окру
жающей средой все более осложняются — растет народонаселение
Земли и неуклонно истощаются ее ресурсы. Уже сегодня количе
ство веществ, загрязняющих биосферу, трудно поддается учету
или, в ряде случаев, не поддается совсем. По имеющимся данным
первое место среди загрязнителей природы занимают пестициды
(от лат. pestis — зараза, caedo — убиваю), второе — тяжелые
металлы. С 1985 по 1990 год химическая промышленность произ
водила ежегодно не менее 250 млн. тонн продукции, из которых
до 30% поступало в окружающую среду.
Несмотря на резкое отрицательное отношение людей к атом
ным электростанциям, не просматривается альтернативы термо
ядерной энергии, которая вместе с генной инженерией могут
надолго обеспечить выживание человечества на нашей планете. С
другой стороны, возрастание в обществе роли ядерных изотопов
влекут за собой увеличение числа нежелательных мутаций (от лат.
mutare — превращаться) в соматических и половых клетках. Все
212
это не может не отразиться на изменчивости организмов, включая
и те из них, которые используются в биотехнологии.
Под изменчивостью понимают возникновение организмов с
новыми свойствами (признаками) среди существующего разнооб
разия живых организмов. Из трех типов изменчивости — моди
фикации, длительные модификации, мутации — наибольшее зна
чение для биотехнологии имеют мутации. Индуцированные мутан
ты теперь широко используются в производстве антибиотиков,
аминокислот, ферментов и других продуктов.
Длительные модификации присущи только клеточным формам
из надцарств прокариот и эукариот, но не акариот. При этом
генотип клеток остается неизменным, а измененный фенотип,
проявляющийся в формировании какого-либо устойчивого мета
болического цикла, кажущегося независимым от внешних условий,
выступает мерилом автономности внутриклеточной среды. При
многократных пересевах происходит как бы разбавление цитоп
лазмы в ряду последующих поколений клеток и исходные метабо
литы материнской клетки достигают ниже порогового предела,
когда указанный выше метаболический цикл исчезает. В других
случаях такой же эффект наблюдается при создании окружающих
условий, не поддерживающих один из типов метаболизма и клетки
из состояния длительной модификации возвращаются в исходное
с присущей виду комбинацией признаков (фенотип). Таким обра
зом, при возникающих или исчезающих модификациях наблюда
ются массовые однонаправленные изменения клеток однородного
генотипа, находящихся в среде обитания.
Особенности генотипа определяют фенотипические проявле
ния организма в заданных условиях. Поэтому и адаптацию можно
определить как приспособление наследственно компетентной клет
ки (культуры, организма) к конкретным условиям существования.
При мутациях изменяется генотип, или наследственная консти
туция клетки (организма). Мутации могут быть неконтролируемы
ми (спонтанными) и контролируемыми (индуцированными). Пер
вые происходят с частотой 1 • 10 — 1 • 10"7 на одну генерацию для
разных организмов; это значит, что за одну генерацию ненаправ
ленно изменяется одна клетка из 100 000 или из 106 клеток. Частота
индуцированных мутаций возрастает в десятки-тысячи раз.
Факторы, вызывающие мутации, относят к разряду физиче
ских, химических или биологических, и называют мутагенами.
Мутагены по действию подразделяют на два класса — прямого (на
нуклеиновые кислоты) и непрямого, или опосредованного дейст-
213
вении из клеточной воды свободных радикалов, вступающих в
реакции с кислородом клеточных структур (образование переки
сей), с органическими молекулами или взаимодействующих между
собой. Происходит окисление или передача энергии молекулам
ДНК (РНК). Свободно-радикальные процессы могут завершиться
дезаминированием и дегидроксилированием оснований, разрывом
N-гликозидных связей между основаниями и пентозой, деструк
цией пиримидинов, окислением пентозы, высвобождением пиро-
фосфата. Вот почему различные излучения могут индуцировать
самые разнообразные мутации. Так, например, одновременный
разрыв сестринских хроматид у традесканции составил (по числу
разрывов на 100 клеток/г) 0,99 — для нейтронов (Li + D); 2,1 —
для а-частиц (родон) и 3,02 — для тепловых нейтронов; 0,27; 0,26
и 0,44 — для рентгеновских лучей с X 0,015нм, 0,15нм и 0,41 нм
соответственно. Соотношения УФЛ и ионизирующих излучений
приведены в таблице 22.
Т а б л и ц а. 22. Некоторые характеристики части электромагнитного спектра
+1
(ДАБ) Диазоалкан
Бутилхлорэтилсульфид Хлорзтилсульфид
Глицидол Эпоксид
+I + 1 + I I I +
Диметилсульфат Диалкилсульфат
Диэтилнитрозамин N-Нитрозозамещенное
соединение
Диэпоксибутан Эпоксид
Диэтилоксибутан Алкан
Диэтилсульфат Диалкилсульфат 1
Иприт Хлорзтилсульфид
N-Метил-бис /хлорэтил-
амин (аналог иприта) Хлорзтилсульфид
Метилметансульфонат Алкилалкансульфонат
N-MeraA-N*-HHTpo-N- Нитрозозамещенное
1+
нитрозогуанидин соединение
Митомицин С Антибиотик
М-Нитрозо-№метилуретан +1+ Диазосоединение
N-Hmpo30-N-3THA-
мочевина N-Нитрозозамещенное
соединение
Нитрозометилоксаимид N-Нитрозозамещенное
I I ++
соединение
Пропиленоксид Эпоксид
Р-Пропиолактон Лактон
Фенол (карболовая
кислота) Фенол
I I I
Формальдегид Альдегид
Эпихлоргидрин Эпоксид
Окислители Азотистая кислота Кислота 1
Гидроксиламин - Амин 1
Диоксид водорода Перекись
Удлинители Акридиновый оранжевый Акридиновый
нитей ДНК краситель
Бромистый этидий - Производное
изохинолина
Профлавин Акридиновый
краситель
Ингибиторы Актиномицины - Антибиотики |
синтеза РНК
Комплексное Н, ОН Свободные радикалы 1
действие на Стрептомицин.гигро- - Антибиотики I
(дик. мицин В и др.
218
Как видно из таблицы 23 среди ингибиторов синтеза предше
ственников НК имеются антиметаболиты (азогуанидин, 5-аминоу-
рацил, 6-меркаптопурин, 5-фтордезоксиуридин). Нуклеозиды, со
держащиеся в клетках или добавляемые извне, играют роль анти
мутагенов, снижающих мутагенный эффект названных веществ.
На примере 5-аминоурацила — HNM
аналога урацила можно показать
путь возникновения 50% потомков
после двух циклов репликации му
тировавшей клетки под действием
мутагена. 5-Аминоурацил по хими 5-аминоурацил
аденин
ческому строению близок к тимину (кето-форма)
и поэтому легко комплексируется ОН--
с аденином. Кето-форма 5-аминоу NH
2Jw
рацила более стабильна, чем его
энольная форма, однако последняя
образуется и существует какое-то
ОХ
•НИМ I
Н
время, в течение которого он мо 5-аминоурацил
гуанин
(енольная ферма)
жет спариваться с гуанином — это
так называемая ошибка включе
ния. Тогда очевидно, что вместо пары Г-Ц появится пара АгТ или
Г А-5аминоУ (А-амУ). Аналогичная ситуация мо
III" «Si»., „ )| жет складываться при использовании 5-брому-
ч рацила (5-БУ) и прибавка в числе мутантов
•мУ Ц будет однократной. Мишень действия этого
мутагена — фермент рибонуклеотидредукта-
за. Мутации подобного рода происходят с не
большой частотой^ поскольку они всецело за
висят от времени существования аналога нук
леинового основания в энольной форме (а
время это, как прави f
ло, небольшое).
Смещение в комп
лементарное™ пар,
или ошибка реплика
к
ции может происхо
дить по другой схеме:
219
Мутация здесь сохраняется до конца репликации ДНК, содер
жащей 5амУ (или БУ) и общее число мутаций возрастает с ростом
числа циклов репликаций.
Подобный мутагенный э ф ф е к т оказыва
ют и другие аналоги НК, например 6-мер-
капто- или 6-аминопурин. Мутагенное дей
ствие 2-аминопурина проявляется на бакте
риях и бактериофагах, хотя в норме он
имеется в цианофагах. Будучи аналогом азо
тистых оснований нуклеиновых кислот, 2-
2-аминопурмн аминопурин (АЛ) индуцирует ошибку вклю
чения. В обоих случаях произош
ли мутации типа транзиций (см.). о ш и б . Р в к л ю ч е н и я
А \^ ошибка репликации
Ал может вызывать также и му- ^ -^- ====
тации типа трансверзий (см.), хо
тя и редко. Для всех аналогов
азотистых оснований характер
ны прямые и обратные мутации
типа простых замен, например
А = Т на Г = Ц или Ц = Г на Т = А
(обратные мутации здесь Г з= Ц
заменяется на А = Т и А = Т — на
Г-Ц).
Азасерин относится к двум подгруппам (см. таблицу 23). Его
мутагенный эффект связывают с нарушением биосинтеза пуринов
de novo и с радиомиметическими свойствами (от греч. mimicos
имитирующий).
Афлатоксин Bi вызывает сдвиг рамки считывания ДНК. Это
можно показать на следующем примере:
ТГГГАТГу
• выпадение одного Г
ТГГГГАТГЦ АЦЦЦТАЦГ
АЦЦЦЦТАЦГ ТГГГГГАТГЦ
2 *• i '. ' i • • i !*• • добавление одного Г
АЦ ЦЦЦТАЦГ
Супермутагены часто приводят к мутациям, возникающих на
пути 2. Кофеин в больших дозах оказывает прямой мутагенный
эффект, вызывая разрывы хромосом, например в клетках дрозо-
220
филы, человека и других эукариот. В меньших концентрациях он
действует как синергист с радиацией, ингибируя репарирующие
ферменты.
В основе алкилирования НК лежат такие реакции как депури-
низация с разрывом сахарно-фосфатной цепи в ДНК; взаимодей
ствие алкилирующих агентов с адениловой, цитидиловой и тими-
диловой кислотами с последующей утратой способности алкили-
рованных А, Ц и Т спариваться с комплементарными основаниями;
взаимодействие с фосфатными группами НК; взаимодействие двух
функциональных групп алкилирующего агента с нуклеофильными
группами НК. Так, например, в случае удаления .гуанина из ДНК
под влиянием какого-либо алкилирующего агента могут обнару
житься различные варианты изменений: восстановление исходной
пары Г з Ц, ее выпадение, перекрестная замена Г = Ц на Т = А
или на Ц 2= Г, простая замена Г = Ц на А = Т.
Супермутагены, вызывающие до 24% летальных мутаций, в
основном относят к группе алкилирующих агентов. Эту группу
подразделяют на следующие подгруппы:
1. Металлорганические соединения R-Me, где R— органический
радикал; например метилированная ртуть;
2. Галоидные алкилы (Алк) — (nH2n+i)R, где R — фтор, хлор,
бром, йод; например, 1,2-дихлорэтан, 1,2-дибромэтан, 1,3-дихлорп-
ропан;
3. Производные этилена (CH2=CH-R, где R — двуокись азота,
двуокись серы и др.); например, акрилоилэтиленимин;
4. Альдегиды (R-COH, где R=H, СН2-СН- и др.); например,
формальдегид, акролеин;
5. Уретаны (H2NCOOAAK); например, этил-уретан;
6. Диазоалканы (Алк = N + = N-); например, диазоуксусный эфир,
диазометан, 1,4-бисдиазоацетилбутан;
7. Нитрозозамещенные соединения ( / 1
R2
где Ri-H, Алк, a R2-AAK, остаток уретана, мочевины, гуанидина);
например, нитрозометилуретан, нитрозогуанидин, нитрозоалкил-
мочевины; Алк—О. л °
8. Диалкилсульфаты л^
Аяк—О О
где R = H
12. Эпоксиды, У°\ - А ^ и АР--:
Сн2—СН—R R=H.Anit например, этиленок-
сид,
или окись этилена;
13. Лактоны <СН2)п--С=0 например,
Р-пропиолактон;
к
14. Этиленимины
А .
сн 2 —c"- R
где R-Алк, Н и др.;
Кс
Кс
' III
Кс
,; ш°^ш
замени пс происходит
223
Ошибки при спаривании оснований происходят путем транзи-
ции или трансверсии. В первом случае один пурин заменяется
другим пурином, один пиримидин — другим пиримидином. Во
втором случае пурин замещается пиримидином или наоборот —
пиримидин замещается пурином. Под влиянием М-метил-Ы-нитро-
N-нитрозогуанидина больше возникает транзиций, чем трансвер
сий.
Мутагенный эффект гидроксиламина обусловлен его взаимо
действием с цитозином, тогда как гидразин разрывает кольца
урацила и цитозина.
Метаболическая активность различных организмов может со
провождаться образованием перекисей, которые в определенных
случаях могут быть мутагенами. Более того, перекиси выступают
как бы связующим звеном между химическим и физическим
мутагенезом (в частности, лучевым), учитывая факт их образования
во время облучения клеток или тканей. При этом перекиси оказы
ваются мутагенами первого порядка, а например, калия цианид —
мутагеном второго порядка. Это связано с тем, что KCN блокирует
фермент каталазу (антимутаген) и, как следствие, клетка лишается
защиты против мутагенного действия Н2О2.
каталаза
2Н 2 02 • 2НгО + 0 2
блокада реакции
калия цианидом
I 1 1 1 1 1
А Т Ц А Г Т
П 1 I I I Г II II III II IIIII
Т А Г Т Ц А
А Т Ц А Г Т I I I I I 1
Выпадение ЦТ
1 1 1 1 1
Т А АОТ Ц А А Т-А Г Т
J I I 1 1 L II II II 1 М !
Т А Т Ц А
I I I I i
I I I I I 1
А Т Ins А Г Т
1—1—1—1—г
II II III II IIIII
Т A Ins' Т Ц А
Т Ins А Г Т I I I I I
1
Вставка Ins sins'
I 1 1 1 1
А АО Т Ц
А Т А Г Т
_1 I I 1 _ II II II III II
Т А Т Ц А
Выпадение Ins — АО
224
Производные акридина (акридиновый оранжевый — АО, проф-
лавин) и некоторые производные изохинолина (бромистый этидий)
вызывают удлинение нитей ДНК (растяжение) на 1-2 нуклеотида,
что приводит в итоге к выпадению или вставке мононуклеотида
(прямые мутации).
Некоторые антибиотики — как мутагены
NH обладают различными механизмами дейст
2
н2
i О
и« н й
т
он ен, V^Hlf
CHj <
I
он
он
^
В бмомнцит А2 раднкт R прадсгаммт собой -NH-(CH,|, - $|СНэ)>
• бмоммцит ДМЛ2 радикалом ааляатся -HH-^CHJj -S-CH). • блммицина
BZ он следующий;
•ЫНЦСН,), -NH-C-NHj. и т. я,
NH
8 т. 8524 225
актиномицина). Они располагаются в малой бороздке нативной
ДНК, мешая функционированию РНК-полимеразе.
Гликопептидные антибиотики блеомицины ингибируют синтез
ДНК и клеточный митоз.
Аминогликозидные антибиотики (гигромицин В, стрептомицин)
являются непрямыми мутагенами. Они нарушают белковый синтез
благодаря взаимодействию с 30 S субъединицами бактериальных
рибосом и предотвращению связывания отдельных тРНК. При
этом неправильно считываются пиримидиновые основания.
. Ряд алкалоидов высших растений (из родов Heliotropium —
гелиотроповых, Senecio — крестовниковых и др.) и синтетических
лекарственных веществ (изониазид, хлорпромазид, нитрофураны
и др.) могут обладать мутагенным действием.
К биологическим мутагенам относят вирусы (фаги), живые
вакцины, некоторые биотоксины, образуемые грибами, протозоа
и гельминтами. Так, изменения в хромосомах вызывают цитоме-
галовирус, вирус простого герпеса, герпетиформный вирус, вирус
Сендай, вирус саркомы Роуса и др. Из грибных токсинов —
мутагенов ранее был назван афлатоксин Вь Можно назвать еще
треморген, образуемый рядом аспергиллов и др.
Фагоустойчивые мутанты актиномицетов и лактобактерий пред
ставляют интерес для соответствующих производств, например,
антибиотиков и молочнокислых продуктов.
Мутагены различных классов (физические, химические, биоло
гические) используют в работе с биообъектами. При этом стремят
ся получить штаммы либо с какими-то маркерными признаками,
важными для расшифровки механизмов мутагенеза, либо штаммы
— суперпродуценты БАВ, существенно увеличивающие выход
конечного продукта в сравнении с контролем.
При целенаправленном получении мутантов необходим их от
бор, или селекция, значение которой исключительно велико в
выведении различных пород животных, многих сортов злаковых,
декоративных и многих других растений, в получении микробов
— суперпродуцентов БАВ (ряда антибиотиков, аминокислот, вита
минов и других субстанций). Для сравнения можно указать на
успехи с селекцией мутантов пеницилла, исходный штамм которо
го, выделенный из воздуха А. Флемингом в 1928 г., продуцировал
лишь 50 единиц антибиотика пенициллина в 1 мл культуральной
жидкости.- Тяготы второй мировой войны 1939-1945 гг. вынудили
ученых вернуться к этому виду гриба и заняться генетико-селек-
ционной работой с ним. В 1951 г. путем рассева естественной
популяции клеток, выросших в глубинных условиях культивиро-
226
вания Penicillium chrysogenum, был выделен штамм № 1951 с
ативностью 100 ЕД/мл. Его колония и стала родоначальницей всех
производственных штаммов в различных странах мира. Используя
селекцию и комбинированное воздействие различными мутагена
ми (преимущественно — УФЛ и алкилирующие агенты), уже в
начале 60-х годов удалось передать в производство штамм, обра
зующий пенициллин в количестве 5 000 ЕД и более в 1 мл
культуральной жидкости. В настоящее время используются штам
мы, продуцирующие десятки тысяч единиц антибиотика в 1 мл
среды.
Следует различать понятия "селекция" и "интродукция" (от лат.
mtroductio — введение). При селекции используют методы выве
дения новых форм организмов, отличающихся по свойствам от
исходных родительских организмов. При интродукции выделяют
из естественных (природных) и искусственных (производствен
ных) условий существующие организмы, наиболее пригодные для
практических целей. В успехах селекции велика роль контролиру
емого мутагенеза, тогда как успехи интродукции опираются на
генофонд, заведомо присущий организму. Селекция и интродукция
животных и растений возникли раньше генетики. Основные под
ходы при этом концентрировались преимущественно на скрещи
вании организмов и отборе возникающего потомства.
Применительно к микробам сформировалось четыре подхода,
используемых в селекционной работе:
1. отбор естественных штаммов, обладающих ценными призна
ками, проявляющимися в конкретных условиях их существования
(этот подход во многом аналогичен интродукции высших эукариот);
при размножении такой культуры (с учетом частоты спонтанных
мутаций) наступает популяционное давление, когда наиболее при
способленная форма вытесняет исходную в популяции. В анализе
таких популяций полезны флуктуационный тест (от лат. fluctuatio
— колебание) и метод отпечатков. С помощью первого доказывают
спонтанность мутаций по маркерному признаку (от англ. mark —
знак, метка), с помощью второго отбирают нужные колонии,
вырастающие на селективной среде. Этот первый подход опира
ется на естественный ход событий у микроорганизмов в изменен
ных условиях (естественный отбор);
2. искусственный отбор клонов микроорганизмов с полезными
для человека признаками, возникшими на основе естественной
изменчивости родительских форм. К такому отбору прибегают
тогда, когда контролируемый признак биологически малоценен для
микроба и поэтому трудно создать условия выращивания культуры,
227
в которых относительно легко удавалось бы выделять нужные
варианты. При этом необходимо проверять большое число клонов
и субклонов, и если вариации между ними по контролируемому
признаку невелики, то успех выборки оказывается мало вероятным
или небольшим;
3. ступенчатая селекция — эффективный метод искусственного
отбора форм с применением мутагенов (см. ранее приведенный в
этом разделе пример с продуцентом пенициллина). С помощью
мутагенов увеличивают изменчивость тест-культур, а среди послед
них отбирают наиболее перспективные; такой подход, как правило,
использ\ ют многократно (ступенчато), добиваясь существенного
возрастания контролируемого показателя (активность, продуктив
ность и др.);
4. гибридизация — как метод выведения полезных форм мик
роорганизмов. Здесь имеется аналогия с методом скрещивания у
высших эукариот. О гибридизации см. в этой главе ранее.
Микроорганизмы, как и высшие организмы, способны соби
рать и перераспределять уже имеющуюся информацию между
родственными, но генотипически неоднородными клетками. Это
происходит при трансформации, трансдукции и конъюгации у
бактерий, при половой и соматической гибридизации у растений
и животных. Яркий пример здесь с гибридомами, продуцирующи
ми моноклональные антитела (см.).
*1
228
Часть III.
Процессы и аппараты в биотехнологии
Глава 6.
ПРОЦЕССЫ В БИОТЕХНОЛОГИИ
Биотехнология как наука базируется на использовании биоло
гических процессов в технике и промышленном производстве (см.
главу 1). Эти процессы (от лат. processus — продвижение) — как
совокупность последовательных действий специалистов направле
ны на достижение соответствующих результатов при эксплуатации
биообъекта(-ов). Говоря о процессах в биологической технологии,
нельзя путать их с процессами в химической технологии. Так,
главным компонентом первых является какой-либо биообъект
(вирус, бактерия, гриб, растительные или животные клетки, био
молекулы). Такие объекты отсутствуют в химической технологии.
Другой пример с высокими температурами, которые, как правило,
неприемлемы в биотехнологии, но часто используются в химиче
ской технологии. Наконец, многостадийность и высокие давления
также являются атрибутами (от лат. atributio — придаю, наделяю)
химической технологии, а не биотехнологии. Однако биохимиче
ские и химические реакции следуют принципу ле Шателье, соглас
но которому равновесие системы смещается в направлении умень
шения эффекта произведенного воздействия.
229
Т а б л и ц а 24. Систематизация биотехнологических процессов
Опевании
Побочные выделения целевого Отходы
продукты продукта производства
i
Упаковка, хранение и Обезвреживание,
утилизация
•ч
О 0=C-NH-CH-CH
-СН 2 С—N^C-CH
CH 2
2 ^tt
О '
соон
цепорин
В полусинтетических производных тетрациклина - доксицик-
лине и метациклине (рондомицине) Ri—R4 представлены соответ
ственно: —ОН, —СНз, —Н, — Н и —OH(Ri), —СН2—(R2 и Rj),
—H(R4).
232
•ji(CH3)2 Полусинтетическим аналогом
он урацила является противораковый
препарат 5 - фторурацил и т. д.
4
CONH 2 Многие процессы биологиче
ской технологии являются общими,
например на стадии ферментации,
поэтому можно выделять общие основы
биологической технологии. Это особен-
но показательно на аппаратурном офор
млении отдельных стадий биопроиз-
водств и, в частности, на выборе биоре-
акторов, сепарирующего оборудования;
b& ,
н
"
, г,, УРвЦип 5-фторурвцил
сушилок и т. д. (см. главу 7). - -»"*»»"•*•
Специальные биотехнологические процессы связаны в большей
степени с особенностями биообъектов. Достаточно сравнить здесь
культивирование вирусов гриппа на куриных эмбрионах для при
готовления вакцин и выращивание пеницилла — продуцента ан
тибиотика бензилпенициллина в биореакторах емкостью до 100 м3
и более; другой пример с гибридомными клетками млекопитаю
щих, продуцирующих моноклональные антитела, и с лейконосто-
ком — продуцентом полисахарида декстрана.
В каждом из этих процессов имеются свои специфические
особенности, благодаря которым выделяют биотехнологический
процесс в самостоятельный. С учетом сказанного мы группируем
все специальные биотехнологические процессы на микробиологи
ческие, фито- и зообиотехнологические. Другими словами, мы
выделяем микробную биотехнологию, фитобиотехнологию и зоо-
биотехнологию.- Общие процессы изложены в первой части учеб
ника, специальные - во второй.
6.1. Взаимосвязь процессов и биообъектов. Биообъекты харак
теризуются такими показателями, как уровень структурной орга
низации, способность к размножению (или репродукции), наличие
или отсутствие собственного метаболизма при культивировании в
подходящих условиях. Что касается характера биообъектов, то под
этим следует понимать их структурную организацию. В таком
случае биообъекты могут быть представлены молекулами (фермен
ты, иммуномодуляторы, нуклеозиды, олиго- и полипептиды, и т.
д.), организованными частицами (вирусы, фаги, вироиды), одно
клеточными (бактерии,' дрожжи) и многоклеточными особями
(нитчатые высшие грибы, растительные каллусы, однослойные
233
культуры клеток млекопитающих), целыми организмами растений
и животных.
Молекулярные биообъекты накладывают свой отпечаток на
организацию и аппаратурное оформление соответствующих био
технологических процессов.
Вирусы и фаги как облигатные паразиты могут культивиро
ваться только на живых клетках и тканях, то есть фактически
биотехнологические процессы здесь основываются на использова
нии клеток, зараженных вирусами или несущих вирус(-ы),
Одноклеточные виды прокариот и эукариот могут использо
ваться в биотехнологических процессах в виде монокультур или в
ассоциациях. Для сравнения можно назвать производство какого-
либо антибиотика (пенициллина, рифамицина и др.) с помощью
чистой культуры соответствующего продуцента, а также производ
ство кефира с помощью кефирных "зерен" ("грибков"), в состав
которых входят лактобактерии и дрожжи. Следовательно, в по
следнем случае применяют природную ассоциацию микроорганиз
мов, и кефир является продуктом смешанного брожения — молоч
нокислого и спиртового. Пировиноградная кислота как ключевой
продукт, возникающий из моносахаридов (моноз) после гидролиза
лактозы, трансформируется лактобактериями до молочной кисло
ты, а дрожжи "доводят" тот же пируват до этанола.
лактобактерии
и дрожжи
Q,H,„Q
ир -»2С«Н1206- > 6СН СОСООН пируват
12 22 11
лактоза глюкоза и
галактоза -6СО -И2Н
лактобактерии
дрожжи
jg-галактозидата 6СН 3 СН(ОН)СООН
+12Н
6СН 3 СОН- лактат
->бсн3сн2он
В природных условиях микроорганизмы, как правило, находят
ся в ассоциативных взаимоотношениях, часть из которых несом
ненно может быть привнесена в производство в виде самостоя
тельных биотехнологических процессов. Сегодня такие процессы
немногочисленны, так как природные ассоциации изучены крайне
234
недостаточно с точки зрения биологической технологии. К тому
же такие ассоциации складываются не только между микробами
— микробоценозы, но и другими организмами — микробами и
растениями, микробами и животными, между растениями, и т. д.;
в таких случаях говорят о биоценозах (от греч. bios — жизнь, coinos
— община). Если организмы выживают, но не размножаются в
данных конкретных условиях, то под этим подразумевают их
нахождение в состоянии анабиоза (от греч. ana — назад, обратное
действие, подобно, соответственно). Если же организмы растут,
развиваются и размножаются в среде обитания, то под этим
понимают их нахождение в состоянии метабиоза (от греч. meta —
между, посредине, изменение, следование в пространстве и вре
мени). Наконец, гибель организма(-ов) в ассоциации или вне ее
можно охарактеризовать понятием абиоз (от греч. an — нет, bios
— жизнь). В биотехнологии приходится постоянно встречаться с
такими явлениями как метабиоз, абиоз и анабиоз. Имеются и такие
ассоциации организмов, когда один (или более) из ассоциантов
может расцениваться хищником. Например, гриб Arthrobotrys
oligospora формирует сеть из мицелиальных петель — ловушек
нематод, в частности, относящихся к числу вредителей растений
(лука, клевера и др.). Такой нематодой является Ditylenchus dipsaci
— стеблевая нематода. В сельском хозяйстве заметен вред от
картофельной нематоды — Heterodera rostochiensis. Поэтому гри
бы-хищники оказываются союзниками человека в борьбе за уро
жаи ряда ценных культур растений, повреждающихся нематодами.
Растением-хищником является росянка (насекомоядное расте
ние). У нее на листьях имеются железистые волоски, выделяющие
ферментативно активную липкую жидкость, с помощью которой
схваченные насекомые прочнее адгезируются и перевариваются.
Среди микробов хищником является миксомицет Dictyostelium
discoideum, а его жертвой — кишечная палочка.
При хищничестве, присущем только эукариотическим организ
мам, жизнь партнера-жертвы ограничена во времени, то есть здесь
ассоциация организмов кратковременная.
Таким образом, анабиоз, метабиоз, абиоз и хищничество отно
сятся к разряду понятий об уровнях жизнедеятельности организ
мов. При метабиозе всегда предполагается наличие организмов-
партнеров, вступающих или вступивших во взаимоотношения.
Каковы же эти взаимоотношения? — Фактически их два —
симбиоз и антибиоз (таблица 25).
235
Т а б л и ц а 25. Виды взаимоотношений при метабиозе между организмами в
природных условиях.
Взаимооотношения
Вид Подвид Краткая характеристика
Симбиоз Комменсализм (от лат. Один вид из ассоциантов
commensalis - сотрапезник) живет за счет другого, не
причиняя ему вреда
Мутуализм (от лат. Оба ассоцианта помогают
mutualismus - взаимосвязь, друг другу
сожительство)
Нейтрализм (!?) Ассоцианты не влияют друг
на друга
Паразитизм Один из ассоциантов живет
за счет другого, нанося ему
вред
Антибиоз Собственно антибиоз и Один вид ингибирует
антагонизм развитие другого (других) или
1) односторонний (моно- и убивает его (их) своими
полинаправленный) метаболитами
6-аминопемицилиллаповая
кислота ( 6 - А П К )
+ C$HS— СН2-СООН
фепилуксусиая кислота
он у он
он
он т он XX
он он
шикимовая кислота галловая кислота пирогаллол
О
Когда гидродинамические условия в биореакторе, концентра
ция С>2 и отношение площади поверхности раздела фаз к объему
одинаковы, тогда Qo 2 равна Qo2-
Обычно при вполне благоприятном аэрировании среды кон
центрация клеток в биореакторе может достигать величины 108
/мл. Исходя из усредненных размеров клеток бактерий по диамет
ру 1 мкм, дрожжей — 7 мкм, нитчатых грибов » 20 мкм объемы
их в процентах к объему среды составят около 0,005, 1,8 и 2
соответственно, то есть бактериальная масса будет примерно в 400
раз меньше грибной массы. Удельная поверхность раздела всех
клеток будет 3,1 см 2 /см 3 - для бактерий, 153 см 2 /см 3 - для дрожжей
и 40 см2/см3 — для нитчатых грибов. Следовательно, эффективная
поверхность в данных примерах будет больше у дрожжей. Поэтому
адекватная доставка кислорода — как лимитирующего фактора
зависит от морфофункциональных особенностей культивируемого
биообъекта и условий его выращивания.
На скорость потребления кислорода биообъектом влияют:
1) возраст культуры (делящиеся, или размножающиеся клетки
потребляют кислорода больше, чем не делящиеся);
2) межклеточная адгезия, когда при выраженной адгезии обра-
264
зуются аггломераты, или комочки клеток, и, напротив, при малой
или совсем не проявляющейся адгезии клетки находятся в изоли
рованном состоянии друг от друга; в первом случае потребление
кислорода уменьшается в сравнении с вторым, когда клетки обла
дают большей площадью своей поверхности;
3) от быстроты динамических изменений в среде выращивания
биообъекта (например, в производстве экзополисахаридов, проду
цируемых аэробными микроорганизмами, заметно возрастающая
вязкость среды снижает поступление О2 к клеткам);
4) скорость накопления биомассы клеток — чем больше био
масса, тем скорость поглощения кислорода быстрее снижается, то
есть зависимость здесь обратно пропорциональная;
5) качество источников питания, подлежащих окислению. Для
сравнения можно назвать такие источники углерода, как глюкоза
и предельные углеводороды из нефти. Молекулы глюкозы в пита
тельной среде и в клетках одинаковы, так как степень восстанов
ленное™ атомов углерода в данных молекулах одинаковы. Поэтому
и отношение потребленного кислорода к количеству превращен
ной глюкозы меньше, чем это имеет место в случае использования
углеводородов;
6) пеногасители, добавляемые к вспенивающимся культураль-
ным жидкостям в процессе выращивания некоторых биообъектов.
Так, например, натрия лаурилсульфат в концентрации 10 млн "'
снижает коэффициент массопередачи Ог на 56% (в сравнении с
водой);
7) продукты метаболизма, например, секретируемые белки,
также снижают массопередачу кислорода.
Действие всех перечисленных факторов проявляется во време
ни и сказывается не только на показателях массообмена, но и
теплообмена — ферментации протекают в растворах неньютонов
ских псевдопластических жидкостей. В биотехнологических про
цессах теплообмен — постоянно учитываемый и контролируемый
фактор — либо требуется подача тепла, например, в случаях
стерилизации питательных сред или при культивировании анаэро
бов при 55—56°С (биологическая обработка отходов в бескисло
родных условиях), либо, напротив, необходим отвод тепла, обра
зующегося в биореакторах, в которых выращивают аэробные
клетки. В этих целях пользуются рубашками аппаратов, в которые
подается горячая или холодная вода, змеевиками, вмонтированны
ми внутри аппаратов, "выносными" теплообменниками и др. Вза
имосвязь скоростей отвода и образования теплоты описывается
265
уравнением Q = UAAT, где Q—теплота, U—общий коэффициент
теплообмена, А—площадь поверхности теплообмена, AT—харак
терная межфазная разность температур между культуральной
жидкостью и нагревающей (охлаждающей) жидкостью. Под общим
коэффициентом теплообмена (U) понимают количество теплоты,
передаваемое в единицу времени через единичную поверхность
при разности температур в ГС. Поэтому и теплообмен в общем
виде можно определить как перераспределение тепловой энергии
между взаимодействующими фазами в биореакторе. Теплообмен
зависит от ряда факторов:
1) ламинарного или турбулентного движения теплоносителя,
2) толщины и качества материала стенок биореактора,
3) вязкости среды,
4) скорости потока при полунепрерывном и непрерывном
способах культивирования биообъектов,
5) характера охлаждения биореактора.
Познание этих факторов является необходимым для констру
ирования оптимальных биореакторов и наиболее выгодного про
ведения биотехнологических процессов.
Массообмен в биологических системах связан не только с
доставкой кислорода к клеткам аэробных видов и теплообменом,
но и с выделением диоксида углерода как конечного продукта
различных катализируемых реакций, транспортом других веществ
через клеточные мембраны (в том числе — анаэробных организ
мов).
Диоксид углерода может находиться в четырех различных
формах, с различной степенью растворяясь в воде: СО§", НСОз,
Н2СО3 и COi. Растворимость СОг зависит от рН жидкости и он
переносится через границу раздела фаз "газ-жидкость" лишь в
растворенном виде.
Для оценки газообмена при культивировании отдельных био
объектов, а также в целях контроля за микробами — загрязните
лями зерна, пищевых продуктов, других жидких и плотных мате
риалов используют специальное оборудование типа "О2/СО2 ре
спирометров", в том числе — с компьютерным контролем (напри
мер, "Микро-оксимакс О2/СО2 респирометр" фирмы Columbus
Instruments, США).
Транспорт питательных веществ через мембраны клетки осу
ществляется различными путями в системах "жидкость-твердое
тело": п р о с т о й ( п а с с и в н о й ) д и ф ф у з и е й , о б л е г -
266
ченной диффузией иблагодаря активному
т р а н с п о р т у, а у ряда эукариотических организмов — с
помощью эндоцитоза. В нормальном состоянии мембрана непро
ницаема для большинства полярных молекул, но некоторые газы
(С02, N2) и водные растворы многих веществ свободно диффун
дируют через мембрану благодаря соответствующим к о н ц е н т
рационному и электохимическом у гради
е н т а м . Градиент концентраций - это разность концентраций, а
диффузия — суммарное перемещение вещества, зависимое от
градиента концентраций. Электрохимический потенциал склады
вается из суммы зарядов диффундируемых веществ. Электроны
медленно проходят через мембрану, и чем больше их заряд, тем
меньше транспорт.
• При пассивной диффузии молекула растворенного вещества
не изменяет свою первоначальную молекулярную форму. Значе
ние свободной энергии (AG) при этом всегда отрицательно.
•'-'• С\ - - '
Fe 2 + • Fe 3 + (Leptothrix)
+0
H2 • H2O (Hydrogenomonas)
+0
CO . CO2 (Carboxydomonas)
б) н е о р г а н и ч е с к и е в е щ е с т в а ( а н а э р о б н о е дыхание):
N 0 3 l SOl", CO3-
H2 • НгО
} некоторые водородные бактерии
N05 • N2
Н2 • Н20
} некоторые виды Desulfovibrio
SOl" •Н2О
Н2 • Н20
} некоторые метайогенные бактерии
со|- ^сн4 " '
4Н2.+ С 0 2 • СНз С О О Н + 2H20 Clostridium aceticum
S • SOl"
} Thiobacillus nitrificans
NO3 *N 2
2) доноры водорода — органические вещества (органотрофия);
акцепторы водорода:
а) кислород (аэробное дыхание); в эту группу относят все
гетеротрофные организмы, которые могут использовать органиче
ские вещества в качестве доноров водорода;
б) н е о р г а н и ч е с к и е в е щ е с т в а ( а н а э р о б н о е д ы х а н и е ) :
N 0 3 , S O t , СО3-
272
ЫОз • N2 денитрификаторы
NO3 • ИНз нитратредуцирующие бактерии
SOi — • H2S Desulfovibrio
СОз" »СН4 метаногенные бактерии
в) органические вещества (брожение); сюда относят все виды
бродильных процессов (молочнокислое, маслянокислое, спиртовое
и др.). ..
Уравнение, с помощью которого описывают взаимоотношение
энергетических компонентов, включает общую энергию системы,
или энталпию (Н, в Джоулях), меру разупорядоченности системы,
или энтропию (S, в Джоулях/градусы) и свободную энергию
системы (G, в кДж/моль), представляется в следующем виде:
G = АН — TAS (Т— абсолютная температура),
G АТФ = —30,56.4 кДж/моль.
В большинстве случаев изучение энергетического метаболизма
сводится к оценке продукции АТФ и трансмембранного потенциала
(Дц^Г), пороговая величина которого, необходимая для окислитель
ного фосфорилирования, составляет 180—270 мВ; Auff формиру
ется на клеточных мембранах у различных организмов (кроме
облигатных анаэробов).
Клетки, как правило, метаболизируют при изотермических
условиях и значительная часть энергии ими не используется (в
противном случае мог бы возникнуть перегрев системы) — она
теряется. При этом возрастает энтропия, и клетки могут погибнуть.
Смерть — это большая положительная величина энтропии, тогда
как негативная величина ее и упорядоченность — это жизнь.
Суммируя дыхательные процессы, сопряженные с получением
энергии, приводим таблицу 31, в которой отражены основные типы
дыхания и указаны представители, "ведущие" эти процессы, а на
рис. 81 представлена схема путей образования и расходования
унифицированных форм энергии [по В. П. Скулачеву (1984) в
некоторо'м видоизменении В. К. Акименко (1989)]. На рис. 81
обобщена сущность хемиосмотического принципа П. Митчелла о
сопряжении процессов генерации и потребления энергий, доступ
ной для клетки. Здесь речь идет'о трансмембранном потенциале
HQHOB водорода — А uff , который представляет собой унифици
рованную форму энергии, обеспечивающей (наряду с АТФ при
гликолизе у анаэробов, и у некоторых видов - A\iNa+) все энерго
потребности клеток.
273
Т а б л и ц а 31. Механизм дыхательных процессов у различных организмов
Доноры водорода Неорганические или органические вещества ( H j , НгО, H2S, глюкоза и др.)
(электронов)
фумарат ацеталь-
Дегид,
пируват и
др.
Образующийся
NC5
s2- s2- , о СЩ Fe2+ сукцинат этанол,
лактат и
НгО
конечный продукт
N20
N2 ы др.
продукты
брожения
Название типа дыхания нитратное сульфат серное карбонатное "железное' фума- брожение окисли- J
ное ратное тельное
фосфо-
рилиро-
вание
Организмы, факульта облигат- облигат- анаэроб анаэроб анаэроб анаэроб анаэроб аэробные |
участвующие в тивные ные ные и ные аце- ные м е - ные желе ные ные прокариоты
дыхательном процессе анаэроб анаэробы факуль тогенные танобра- зобакте сукцино- дрожжи, и
ные и тативные бактерии зующие рии генные пекто- эукариоты 1
аэробные анаэробы бактерии бактерии бактерии
бактерии
13 Скорость
вращения
Механический
(тахометрия)
14 Скорость
добавления
Механический
/расходомеры
мешалки питательных •• (счетчик,
веществ капель, •
в растворах динамомет
рические дат
чики и др.)/
4 Redox- Физический 15 Давление Механический
потенциал /электропро . (манометрия)
водность 16 Вязкость • Физический
(определение (вискози
окислительно- метрия)
восстановит. 17 рн Химический
потенциала)/ (рН-метрия)
5 Количество Физико- 18 Отбор (слив) Механический
растворенного химический культуральной (регулиро
кислорода (электрохими жидкости вание уровня,
ческий и др.) динамо-
*метрический
датчик)
Гб Количество Физико- 19 Фермента Еиохими- 1
растворенного химический тивная ческий, 1
со2 (ИК- активность физико- 1
спектрометрия химический I
и др.)
17 Обнаружение
пены
Физический
(электро
20 Антибиотичес
кая активность
Биологический,
химический,
проводность) физико-
химический 1
278
1
Продолжение табл. 32
9 Потребление Химический
глюкозы физико-
химический
10 Потребление Химический,
азота физико-
химический
возмущение
заданное значение
регулируемого
параметра
измеряемый
параметр
регулируемого
параметра*
j Документирование |—^¾ -8
8.
•[Помощь оператору г~*"<^
X
Изучение в реальном масштабе
времени —Q
Обычные системы
Измерение, ^¾¾¾¾^ управления
отображение
и хранение —<э
данных Запись данных в
аналоговой системе
Микробиологический процесс
Рис. 84. Три уровня сложности расчетов оптимизации микробиологического
процесса в биотехнологии (Л. Валентини, Ф. Андреони, М. Буволи, П. Пенелла,
1982).
В последнее десятилетие все больше расширяется применение
различных ЭВМ и микропроцессоров для управления биотехноло
гическими процессами. Их конструкции постоянно совершенству
ются, цены снижаются, а программное обеспечение заметно убы
стряется. Тем не менее, многие существующие биотехнологиче
ские производства частично или полностью еще нельзя отнести к
автоматизированным системам управления (АСУТП).
6. 7. Системы GLP и GMP в связи с качеством биотехнологи
ческих продуктов. В целях организации качественного проведения
283
доклинических испытаний лекарственных и других биологически
активных веществ (пищевых добавок, агрохимикатов и др.) в
промышленно развитых странах (Англия, Германия, США, Фран
ция, Япония и др.) утверждены единые правила системы GLP (Good
Laboratory Practice). Существует группа GLP в Европейском Центре
по экологии и токсикологии химической промышленности; в США
система GLP действует с июня 1979 г. Главными в такой системе
являются следующие основные действия:
1) заблаговременная разработка стандартной методики прове
дения испытаний, или SOP (Standard Operating Procedure) приме
нительно ко всем ее этапам;
2) назначение руководителя и ответственных за каждый вид
испытаний;
. 3) каждому ответственному исполнителю поручается строго
выполнять все операции в отведенных ему пределах;
4) результаты выполнения операций должны быть внесены в
специальный протокол, датированы и подписаны;
5) в, случае выполнения сложных операций, во избежание
ошибок, рекомендуется прибегать к двойной проверке;
6) в установленном порядке исполнитель докладывает руково
дителю о ходе испытаний. Руководитель должен быть компетент
ным во всех делах, связанных с испытанием;
7) фактические данные, записи и препараты (вещества) должны
храниться в полном порядке таким образом, чтобы всегда можно
было отыскать требуемое (необходимое);
8) окончательный отчет по своему содержанию должен отра
жать свежие и еще не обработанные данные, а также сопровож
даться обсуждением, составленным ответственным исполнителем;
на отчете прос:швляю^гсядата и подписи (отве^сттШШото-ясполни-
теля[^в^л1щТг1одтверждающих содержание отчета); ^
9) должна быть служба качественной оценки испытаний —QAU
(Quality Assuarance Unit). Лица, занятые в этой службе, обязаны
стремиться к тому, чтобы свою внутреннюю инспекцию проводить
в установленном порядке и по необходимости выдавать рекомен
дации,гйсшравленные на совершенствование процессов проведе
ния испытаний. . ~~
На систему GLP опираются в случаях испытания веществ: на
микробную обсемененность, на пирогенность; острую, пОдострую
и хроническую токсичность, на специфическую токсичность (кан-
церогенность, антигенность, лекарственную зависимость, повреж-
284
дение зародышевых клеток; раздражение слизистых оболочек,
кожи и в месте введения вещества; мутагенность, тератогенность
— От греч. teratos — чудовище, урод; цитотоксичность), на безопас
ность для макроорганизма при введении in vivo (абсорбция, рас
пределение, скорость выведения, метаболизм); проводят фармако
логические испытания с оценкой фармакокинетики (действие
изучаемого лекарственного вещества на организм) и фармакоди-
намики (изучение силы действия лекарственного вещества).
В связи с необходимостью проведения названных испытаний
создают специальные группы: общую (в том числе для контроля за
гигиеной и санитарией личного состава), микробиологическую,
метаболизма, общефармакологических испытаний, общих клини
ческих исследований, патологоанатомическую, проведения экспе
риментов на животных, обработки данных (с включением управ
ления ЭВМ), по приготовлению проб, аналитическую, по управле
нию исследованием и, при необходимости, другие. Во главе каждой
группы утверждается руководитель, который не должен совмещать
свои прямые обязанности с работой в группе инспекций.
Соблюдение требований системы GLP должно быть подкреп
лено совершенством организации всех вспомогательных служб и
достаточным материальным обеспечением. Желательно иметь от
дельное здание для проведения биологических испытаний, где
экспериментальные животные размещались бы в помещениях
соответствующих классов: для гнотобионтов, зараженных, конт
рольных, предназначенных для работы с радиоизотопами, для
карантинизации и т. д.
В работе с животными должны учитываться все инфекционные
заболевания, которые могут сказаться на результатах эксперимен
тов. При этом необходимо иметь в виду и тот факт, что отдельные
возбудители инфекционных заболеваний могут передаваться от
человека к животным и наоборот. К их числу относятся вирусы
бешенства, лимфоцитарногохориоменингита, шигеллы, некоторые
бруцеллы (Brucella canis), сальмонеллы, микобактерии туберкулеза,
токсоплазмы (Toxoplazma gondii), дизентерийная амеба.
Одобренный препарат (вещество) после лабораторных пред-
клинических испытаний по системе GLP и последующей клиниче
ской проверки разрешается к выпуску в условиях промышленного
производства. Для обеспечения изготовления высокого качества
продукта Всемирная Организация Здравоохранения (ВОЗ) еще в
1968 г. утвердила "Требования для практики качественного произ-
285
водства при изготовлении и контроле качества лекарств и к
специалистам в области фармации". Годом позже эти требования,
вошедшие (с небольшими уточнениями и изменениями) в правила
системы GMP (Good Manufacturing Practice) были рекомендованы
Ассамблеей ВОЗ для международной торговли, а в 1971 г. они были
изданы в качестве приложения ко второму изданию Международ
v
ной Фармакопеи.
GMP — это единая система требований пЪ контролю качества <•
лекарственных средств с начала переработки сырья до производ
ства готовых препаратов, включая общие требования к помещени
ям, оборудованию и персоналу. С 1975 г. правила GMP расширены,
и они касаются различных химических и биологических веществ
в индивидуальном виде, ветеринарных препаратов, применяемых
в животноводстве; исходных материалов для использования в
дозированных формах, если они включены в законодательства
стран-экспортеров и стран-импортеров; и, наконец, информации
о безопасности и эффективности перечисленных веществ, мате
риалов и препаратов.
С учетом издания в 1987 г. руководств Международной Орга
низации Стандартизации (ISO) серии ISO 9000—9004 по системам
качества возникла необходимость пересмотреть существовавшие
требования GMP. В сентябре 1991 г. на специальной конференции
по GMP в г. Москве представлен пересмотренный проект требо
ваний GMP, включающий три части:
1) "Управление качеством в промышленном производстве ле
карственных средств: философия и основные составляющие";
2) "Практика качественного производства и контроль качества";
3) "Дополнительные и вспомогательные направления".
Первая часть содержит 12 разделов, касающихся организации
контроля за качеством производства, санитарии и гигиены, заклю
чения контрактов, стандартных рабочих методик, оформления
необходимой документации и др.
Вторая часть содержит два раздела — производство и контроль
качества. Применительно к производству лекарственных средств
указано, что оно должно опираться на принцип четкого соблюдения
методов ведения технологического процесса согласно норматив
но-технической документации с целью получения продукта требу
емого качества и в соответствии с разрешением на его изготовле
ние и продажу. По возможности избегать любых отклонений от
методик или инструкций. При наличии таких отклонений необхо-
286
димо согласование, разрешение, утверждение и подпись назначен
ного ответственного лица, а при необходимости — привлечение
службы отдела контроля качества.
Операции с различными продуктами не должны выполняться
одновременно и последовательно в одном и том же помещении
пока не устранен риск перемешивания или перекрестного загряз
нения.
Доступ в производственные помещения должен быть ограничен
лишь определенным кругом лиц, занятых в производстве. Избегать
изготовления немедицинской продукции в зонах и на оборудова
нии, предназначенных для изготовления фармацевтической про
дукции. При работе с сухими материалами и продуктами необхо
димы меры предосторожности для предупреждения возникнове
ния, накопления и распространения пыли, что может привести к
перекрестному загрязнению изготавливаемых продуктов или к их
микробному загрязнению. Микробы могут попадать в воздух и на
частицы пыли из обсемененных ими материалов и продуктов при
изготовлении, с загрязненных оборудования и одежды, кожи
работающих людей. Перекрестное загрязнение может быть пред
отвращено изготовлением каждого целевого продукта в раздель
ных зонах (пенициллины, живые вакцины и другие БАВ) или, по
крайней мере, разделением изготовления их по времени; обеспе
чением соответствующих воздушных шлюзов; ношением защит
ной технологической одежды; использованием средств эффектив
ной деконтаминации оборудования, стен, и пр.; использованием
"закрытых систем" производства и т. д.
Необходимо проверять правильность и надежность сочленения
трубопроводов и другое оборудование, используемое для транс
портировки продуктов (материалов) из одной зоны в другую.
Дистиллированная или деионизированная вода, поступающая по
трубам, должна соответствовать санитарно-микробиологическим
нормативам. Операции по техническому обслуживанию или ре
монту не должны сказываться на качестве продукции.
Контроль качества продукции касается процесса забора проб,
проведения исследований, документации и пр. Все исследования
должны проводиться согласно утвержденным инструкциям для
каждого материала или продукта.
Забор проб осуществляют таким образом, чтобы не загрязнить
их или не подвергнуть нежелательному воздействию, сказываю
щемуся на качестве продукта или, напротив, чтобы отбираемый
287
материал не был токсичным (вредным) для здоровья оператора.
' Для каждой партии продукта до выпуска должна иметься
лабораторная документация с подтверждением соответствия ко
нечного продукта спецификациям.
Из каждой партии целевого продукта оставляют пробы на
хранение при рекомендуемых условиях сроком не менее года,
превышающего срок годности. Пробы должны храниться в таком
количестве, чтобы можно было при необходимости провести как
минимум два повторных исследования.
Третья часть требований GMP включает разделы о стерильных
фармацевтических продуктах и практике качественного производ
ства основной массы лекарственных субстанций.
Необходимо помнить о том, что лица, обладающие повышенной
чувствительностью к конкретному веществу — действующему или
вспомогательному, не должны включаться в группу исполнителей.
Для них допустима работа в отделении или цехе упаковки, где
исключен контакт с аллергеном.
В 1991 г. правила GMP утверждены.в нашей стране примени
тельно к производству и контролю качества лекарственных
средств. Эти правила соответствуют Международной Системе
GMP и включают следующие разделы: введение, терминология,
персонал, здания и помещения, оборудование, процесс производ
ства, отдел технического контроля, аттестация и контроль произ
водства; выделены требования к стерильным лекарственным сред
ствам и описаны особенности их производства.
Соблюдение правил GMP обеспечивает выпуск качественных
продуктов и гарантирует благополучие потребителей. В 1995 г. ВСЗЗ
планирует утвердить GPP (Good Pharmacy Practice) по предложе
нию Международной Фармацевтической Федерации (FIP).
Глава 7.
ТЕХНИЧЕСКАЯ ВООРУЖЕННОСТЬ
БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ
В большинстве случаев биотехнологические процессы
рассчитаны на использование живых клеток и тканей различного
происхождения, и даже в инженерной энзимологии применение
молеклул ферментов сопряжено с рядом ограничений, присущих
288
живым клеткам или тканям. К их числу относят поддержание
оптимальных температуры (достаточно низкой), рН, стерильности,
концентрации растворенного кислорода (в случаях эксплуатации
биообъектов — аэрофилов). Микробные клетки, за редким исклю
чением (например, микоплазмы), и клетки растений имеют кле
точную стенку , которой не обладают клетки животных организ
мов; вирусы как организованные частицы реплицируются и пара
зитируют на живых культурах клеток или в тканях, поэтому
отмеченные выше ограничения относятся больше к этим послед
ним, а не к вирусным частицам. Наличие клеточной стенки у
биообъекта заведомо обеспечивает ему более высокую устойчи
вость в различных условиях существования, чем биообъектам,
лишенным клеточной стенки. Даже при большой густоте, напри
мер, бактерий, они активно размножаются, если им обеспечива
ются достаточные пищевые потребности.
Вирусам — как облигатным паразитам — присуща еще и весьма
высокая специфичность применительно к организмам-хозяевам
(вирусы бактерий, грибов, растений, животных) и, даже тканям
(вирусы бешенства и полиомиелита — в отношении нервной ткани,
вирус оспы — в отношении кожи, аденовирусы — в отношении
железистой ткани).
Таким образом, особенности биообъектов обусловливают сле
дующие принципы технического оснащения -биопроизводств:
1. конструкционное совершенство и относительная универсаль
ность биореакторов;
2. инертность, или коррозионная стойкость материалов биоре
акторов и другого технологического оборудования, вмещающих
биообъект или контактирующих с ним или продуктами его мета
болизма;
3. эксплуатационная надежность технологического оборудова
ния;
4. доступность, эстетичность и легкость обслуживания, замены,
смазки, чистки, обработки антисептиками или дезинфектантами
узлов и соответствующих частей оборудования.
Эти принципы рассматриваются более подробно в самостоя
тельной научной дисциплине "Процессы и аппараты биотехноло
гии", или "Биоинженерия". В настоящем учебнике они изложены
в объеме, необходимом для целостного восприятия общих и спе
циальных разделов биотехнологии, и данная глава, в основном,
посвящена биореакторам.
Шт. 8524 289
Согласно первому принципу желательно конструировать такие
биореакторы, которые можно использовать для реализации био
технологических процессов, основанных на использовании разных
биообъектов (бактерий, грибов, клеток растений и млекопитаю
щих). Под совершенством и относительной универсальностью
следует понимать возможность создания оптимальных условий
культивирования разных биообъектов в одном и том же биореак
торе с автоматическим регулированием заданных параметров.
Многоцелевые реакторы высоких стандартов изготавливает нидер-
ладская фирма ADI (Applikon Dependable Instruments). Они при
годны для флокулирующих организмов, иммобилизованных клеток
(микробных, растительных, животных) в целях повышения выхода
биомассы и достижения их выраженной продуктивности.
Чтобы обеспечить биореакторы компьютерным контролем,
фирма ADI выпускает биопроцессор, с помощью которого обеспе
чивается полное регулирование заданных параметров в течение
роста биообъекта (рис. 85).
Рис. 85. Многоцелевой биопроцессор ADI 1020 Рис. 86. Циклонный колон-
с компьютерным контролем различных параметров ный ферментатор (схема).
во время культивирования биообъектов.
Заманчивой представляется конструкция ферментатора в виде
циклонной колонны (рис. 86), создающей возможность проведения
периодических, непрерывных и фазовых ферментации, и обеспе-
290
чивающей новые подходы к оценке клеточных циклов и поведению
самих клеток.
Поддержание заданных параметров — дело не простое, когда
непрерывно изменяются условия культивирования биообъекта
вследствие многокомпонентности исходной питательной среды и
культуральной жидкости на заключительной стадии ферментации,
изменения рН в процессе роста, размножения и развития биообъ
екта, сложности регуляторных механизмов при биосинтезе целе
вых продуктов, к тому же возможно — нестабильных, различный
уровень структурно-функциональной дифференцировки акариот,
прокариот и эукариот, и пр. Лишь при эксплуатации в колоннах
иммобилизованных ферментов аппаратурное оформление техно
логических процессов существенно отличается от оформления
процессов, когда используют, прежде всего, специальные биоре
акторы.
Второй принцип технического оснащения касается инертности
материалов, используемых для изготовления биореакторов и дру
гого технологического оборудования. Это означает, что в процессе
культивирования биообъекта как будто не будет происходить его
взаимодействия (равно как и продуктов метаболизма) с металли
ческими и неметаллическими конструкциями, постоянно или вре
менно находящимися в контакте с ним.
Реально при выборе конструкционных материалов фермента
торов необходимо учитьшатьтот факт, что эти аппараты в процессе
работы подвергаются механическим, химическим и физическим
(тепловым) воздействиям. Стерилизацию ферментаторов осущест
вляют острым паром при 127—130°С с последующим охлаждением
до 24—28°С. В результате непрерывной аэрации культуральной
жидкости внутренние поверхности аппаратов испытывают посто
янное окисляющее действие кислорода; кроме того, развитие
продуцента сопровождается выделением в среду агрессивных ме
таболитов (например, органических кислот).
Весьма существенно также влияние на стенки аппарата интен
сивных газожидкостных потоков, кавитации, вибрации; содержа
ние в среде абразивных примесей—частиц масла и муки — создает
дополнительный истирающий эффект.
Для обеспечения стерильности необходима систематическая
обработка аппарата моющими средствами и антисептиками (рас
творами триполифосфата, хлорамина, формалина).
Материалы, идущие на изготовление ферментационного обо-
291
рудования, должны быть химически стойкими и не подвергаться
коррозии в течение длительного времени эксплуатации. К о р р о
з и я (от лат. corrosion — разъедание) — это процесс молекулярного
разрушения материала (ограниченного — локального или распро
страненного) под воздействием внешних факторов. Коррозионные
процессы можно подразделить на 3 большие группы: химическая,
физическая (электрохимическая) и биологическая коррозии. Хи
мическая коррозия индуцируется сухими газами и жидкостями,
неспособными проводить электрический ток. Физическая— (элек
трохимическая) коррозия имеет место в случаях возникновения
местных электрических токов — гальванокоррозия, например, в
конструкциях, где контактируют несколько металлов с разными
электродными потенциалами (электролиты здесь особенно благо
приятны для протекания электрохимической коррозии). Возник
новение такой коррозии возможно даже при неоднородности
одного и того же металла в случае его неравноценной обработки
на отдельных участках.
Биологическая коррозия обусловливается биологическими
объектами (бактериями, микромицетами и другими организмами).
По. механизму развития биокоррозию можно отнести к химиче
ской. Однако наличие биообъекта в среде и на объекте коррозии
привносит дополнительный фактор — клеточную биомассу (фак
тор обрастания или/и зарастания). Поэтому биокоррозия нередко
сопрягается с биоповреждением. Биоповреждение — понятие
более широкое, чем биокоррозия;
. биоповреждение
биокоррозия механическое
(химическая (физическое)
молекулярная повреждение
деструкция конструкции (аппарата,
материала) прибора, сооружения)
биообъектом
Коррозии подразделяют еще по средам, где они протекают:
а т м о с ф е р н а я , п о ч в е н н а я . в о д н а я ; по распространенности
—о г р а н и ч е н н а я и р а с п р о с т р а н е н н а я
(поверхностные, сквозные); по локализации: н о ж е в а я (по
сварным швам), м е ж к р и с т а л л и т н а я, п о с л о й н а я .
Интенсивность коррозионных процессов оценивают в так на
зываемых массовом (Кт) и глубинном (D) показателях. Первый из
292
i них рассчитывают в случаях неравномерной коррозии, исходя из
I уменьшения массы материала, в кг на 1 м2 поверхности за 1 час:
Km
,j -~sT~'
i где М — масса материала до (Mi) и после (Nfe) коррозии, S —
}\ поверхность материала (м2), t — длительность коррозии в часах.
I Глубинный показатель оценивают при равномерной коррозии
I по уменьшению толщины металл в мм за год:
1 Kin-24-365-1000 • - ТЛ
D 5 ( р плотность металла, кг/м ). Исходя из
Р
оценочных показателей К т и D, выделяют группы стойкости
металлов. Например, D более 10, металл оценивают баллом 9 и
относят к разряду нестойких (группа VI); D менее 0,001, металл
оценивают баллом 0 и относят к совершенно стойким (группа 1).
Весьма стойкие и просто стойкие металлы характеризуются соот
ветственно следующими показателями: D = 0,001 —0,005 (1 балл)
и 0,005 — 0,01 (2 балла) — II группа; D = 0,01—0,05 (3 балла) и
0,05—0,1 (4 балла) — III группа. Очевидно, что в различных средах
стойкость одного и того же материала к коррозии различна.
В биотехнологии, где среды чаще не агрессивны, применяют
обычные углеродистые стали с повышенной прочностью и выра
женной упругостью. Нержавеющая сталь сохраняет большую стой
кость в условиях атмосферной коррозии.
Крупнейшие отечественные заводы антибиотиков были осна
щены ферментаторами из углеродистой стали марки Ст-3. Однако
по отношению к углеродистой стали культуральные жидкости
оказались агрессивными. По данным ВНИИА скорость коррозии
стали марки Ст-3 достигает 0,2—0,4 мм/год; по стандартной клас
сификации такой показатель соответствует 6 баллам, т. е. харак
теризует материал пониженной стойкости. При этом происходит
не только уменьшение толщины стенок аппаратов, но возможно
также появление раковин и каверн. Железо, попадая в среду,
подавляет активность ферментов продуцента, угнетает биосинтез,
инактивирует некоторые антибиотики.
Несмотря на коррозию, возможность использовать стальные
ферментаторы обусловлена образованием на внутренних поверх
ностях аппаратов пассивирующей пленки, которая состоит из
окислов железа и веществ, выделившихся из среды. Эта пленка
замедляет коррозию.
Хорошо удовлетворяет всем требованиям, предъявляемым к
293
материалам для ферментационной аппаратуры, хромоникелевая
нержавеющая сталь марки Х18Н10Т, которая содержит 0,01%
углерода, 18% хрома, 10% никеля и менее 1% титана. Аппараты из
этой стали долговечны, удобны в эксплуатации, "универсальны",
то есть пригодны для производства любых антибиотиков, витами
нов, ферментов и других БАВ. Однако высоколегированная сталь
очень дорога, поэтому ферментаторы вместимостью 32 м3 и более
изготовляют из двухслойной стали: корпус — из Ст-3, внутренний
тонкий слой — из хромо-никелевой стали.
Обычно кислотоустойчивые и нержавеющие стали — это спла
вы железа с хромом и легированные в целях улучшения их
сопротивляемости молибденом, никелем, титаном, марганцем и
другими элементами. Содержание углерода в них порядка 0,15%.
Жаропрочные стали включают железо, хром, никель; их исполь
зуют для изготовления арматуры печей, муфелей, воздухоподогре
вателей. Вольфрам и молибден используют в качестве легирующих
веществ.
В биотехнологии также широко применяют чугун, из которого
делают компрессоры, поршневые кольца, рамы фильтрпрессов и
др.; некоторые чугунные аппараты покрывают эмалью. Хром,
никель, молибден — как легирующие элементы повышают жаро
стойкость и химическую стойкость чугуна. Такой чугун полезен,
например, для изготовления отдельных частей барабанных суши
лок, работающих при повышенных температурах.
Различные конструкции, используемые во многих аппаратах,
состоят из алюминия (или включают его). Этот металл быстро
подвергается электрохимической коррозии, но вследствие легко
образующейся окисной защитной пленки, дальнейшее разрушение
алюминия прекращается. Продукты его коррозии неядовиты.
Стекло, полиэтилен, "пищевая" резина и другие полимерные
материалы также широко используют в биотехнологических про
цессах.
Защиту материалов от коррозионных процессов осуществляют
различными способами: применяют специальные ингибиторы хи
мической и биологической коррозии, катодную и протекторную
защиту- от электрохимической коррозии.
Третий принцип технического оснащения биопроизводств ка
сается эксплуатационной надежности технологического оборудо
вания. Эта надежность обеспечивается соответствием аппаратов,
приборов и другого оборудования целевому назначению, в част
ности, по конструкционному совершенству, полностью обеспечи-
294
вающему оптимальные условия для протекания технологического
процесса и контроля за ним (в том числе, с учетом требований по
технике безопасности). Лишь в подобных случаях достигают мак
симально возможной интенсивности работы оборудования, то есть
его производительности, отнесенной к выбранной основной еди
нице, например, количество упаренной воды в расчете на 1 час и
на 1 м2 поверхности нагрева:
V\-V2
Qw = —г—^ , где Qw — масса упаренной воды, V — масса воды
л.о упаривания (Vi) и после упаривания (V2), S — поверхность
нагрева (м2), t — время в часах.
Критерием оптимальности работы аппарата выступает себесто
имость продукции.
Интенсивность работы оборудования может быть повышена за
счет автоматизации и замены периодических процессов непрерыв
ными, снижения энергоемкости аппаратов благодаря уменьшению
расхода энергии на единицу сырья или конечного продукта.
Эксплуатационная надежность технологического оборудова
ния обеспечивается также стабильностью его работы в заданном
режиме и временном интервале, при максимальном соответствии
условий труда физическим и психическим возможностям людей,
занятых в конкретном производстве ( э р г о н о м и к а ) .
Рассмотренный третий принцип напрямую связан с экономи
кой биотехнологического процесса. Оборудование с высокими
конструктивными и эксплуатационными показателями обеспечи
вает, как правило, и высокие экономические показатели.
Четвертый принцип технического оснащения биопроизводств
касается эстетичности, легкости и удобства обслуживания, замены,
смазки, чистки, обработки антисептиками или дезинфектантами
узлов и соответствующих частей оборудования.
Любой прибор или аппарат, легко доступный для сборки и
разборки, загрузки материалами, питательными средами и выгруз
ки, для чистки, мойки, смазки, ремонта и пр.; оценивается выше,
чем оборудование с усложненным доступом к его частям.
Масса аппаратов, используемых, например, в микробной био
технологии, различна, и требования здесь определяются большей
частью экономическими соображениями. Применительно к фер
ментаторам различают следующие типы их: лабораторные емко
стью 0,5—100 л, пилотные емкостью 100л—10 м3, промышленные
емкостью 10—100 м3 и более.
295
При масштабировании добиваются соответствия важнейших
характеристик процесса, а не сохранения принципа конструкции.
Применяемое в биотехнологии оборудование должно вносить
определенную долю эстетичности в интерьер цеха или отделения
("ласкать глаз"). В ходе его эксплуатации и вне ее оборудование
должно быть легко доступным, содержащимся и функционирую
щим в определенных рамках требований гигиены и санитарии.
В случае замены каких-либо частей или деталей в аппарате,
смазки и чистки узлов при текущем ремонте, и т. д., загрязнения
не должны попадать внутрь биореакторов, в материальные поточ
ные коммуникационные линии, в конечные продукты.
Техническую вооруженность биотехнологических процессов
целесообразно условно ограничить аппаратурным оформлением
производств, базирующихся на культивировании: 1) бактерий и
грибов, 2) клеток и тканей растений, 3) клеток и тканей животных
организмов и человека. Такое подразделение обусловлено тем, что
бактерии и грибы в большинстве своем выращивают в однотипных
биореакторах, имеющих почти однотипную обвязку, в которую
входят: ферментатор, многокорпусный вентиль стерильный (для
подачи питательной среды, посевного материала, подпитки и пр.),
системы регулирования рН, t°, подачи пеногасителя, система кон
троля расхода воздуха, пробоотборник, электродвигатель.
Растительные клетки, имеющие клеточную стенку (также как
бактерии и грибы) растут, размножаются и развиваются значи
тельно дольше, чем большинство бактерий и грибов, а это вносит
определенные коррективы в аппаратурное оформление соответст
вующих биотехнологических процессов.
Культуры клеток животных и человека, не имеющие клеточных
стенок, являются более ранимыми и требовательными к условиям
своего существования, чем клетки других эукариот и прокариот.
Поэтому оборудование для них можно отнести к разряду "тихо
ходного", обеспечивающего нежное обращение с биообъектами.
Несомненно, в отдельных случаях допустимы исключения,
например, когда возможно культивирование в глубинных условиях
некоторых растительных клеток (суспензионная культура жень
шеня), используя ферментационное оборудование, рассчитанное
на выращивание, например, бактерий или грибов.
К. Шюгерль в 1982 г. предложил подразделить биореакторы на
3 основные группы согласно способу потребления энергии для
перемешивания и диспергирования стерильного воздуха (газа):
296
— в биореакторах I типа энергия расходуется на механическое
движение внутренних устройств;
— в биореакторах II типа энергия расходуется на работу
внешнего насоса, обеспечивающего рециркуляцию жидкости
и/или газа;
— в биореакторах III типа энергия расходуется на сжатие и
подачу газа в культуральную жидкость.
На рис. 87 схематично изображены некоторые из таких био
реакторов.
Л ж, л
\к
о- -с /.оп
щ
г'Ш
\
—" __ж
1
Рис. 87. Биореакторы для аэробных процессов: с расходом энергии на механи
ческое движение внутренних устройств а — 1, 2, 3; с расходом энергии на работу
насоса, обеспечивающего рециркуляцию культуральной жидкости б — 4; с расхо
дом энергии на сжатие и подачу газовой фазы в — 5 (г — газ, ж — жидкая фаза,
д — двигатель):
7.1. Аппаратурное оснащение микробиологических произ
водств. Человек с древнейших времен эмпирически применял
.дрожжевые организмы в примитивных по аппаратурному оформ
лению биотехнологических процессах (хлебопечение, виноделие
и пр.). Развитие промышленности антибиотиков продвинуло дале
ко вперед проблему создания специальной аппаратуры для куль
тивирования микробов — продуцентов БАВ (аминокислот, анти
биотиков, полисахаридов, витаминов, ферментов и других соеди
нений). Были предложены различного типа биореакторы для вы
ращивания микроорганизмов, однако все конструкции фермента
торов (ферментеров) оставались в основном сходными по боль
шинству параметров и, усредненно, их можно подразделить на 2
типа: без подводки стерильного воздуха (для анаэробов) и с под
водкой его (для аэробов). Аэрируемые биореакторы могут быть с
мешалками и без них (рис. 88).
297
Рис. 88. Ферментатор периодического действия (1 — турбинная трехярусная
мешалка, 2 — охлаждающий змеевик, 3 — секционная рубашка, 4 — отражательная
перегородка, 5 — барботер, П-пар); I—XI — материальные и вспомогательные •
трубопроводы с запорно-регулирующими устройствами (I — посевная линия, II
—подача стерильного сжатого воздуха, III — подача пара, IV — удаление отрабо
танного воздуха, V — загрузочная линия, VI — линия введения добавок, VII —
подача пеногасителя, VIII — подача моющего раствора, IX — пробоотборник, X —
выдача продукта, XI — выдача в канализацию через нижний спуск).
В последние годы апробированы мембранные биореакторы,
биореакторы с полыми волокнами и некоторые другие.
При расчете и конструировании биореакторов необходимо
учитывать время протекания различных биологических процессов
у представителей различных групп организмов (рис. 89).
298
Рис. 89. Ориентировочное усреднен
ное время протекания биологических
III процессов у различных групп организ
мов (по Дж. Роуилсу, 1982): 1 — репли
кация хромосомы, 2 — продолжитель
ность клеточного цикла, 3 — бактерии,
4 — дрожжи, 5 — плесени, 6 — расти
тельные и животные клетки, 7 — эле
Ю'7 ID'5 yf 10* 10*10' ментарные химические реакции, 8 —
регуляция транскрипции, 9 — аллосте-
* гс
рическая регуляция белков, 10 — изме
нение концентрации ферментов, 11 —
"• возникновение мутантов.
Некоторые технические характеристики промышленного би
ореактора в сравнении с пилотным и лабораторным приведены в
таблице 33.
Т а б л и ц а 33. Технические характеристики биореакторов
VrfC, кг , WaC з»
P
"P =
1^C"[KW ]
Р а р = - ^ - , где Vcf(M)-объем
культуральной жидкости за весь процесс ферментации; Acf (ЕД/мл)
— активность культуральной жидкости; С (кг/м3) — концентрация
целевого продукта в культуральной жидкости; Wcf (м3/час) —
скорость слива культуральной жидкости из ферментатора; Vf (м3)
— вместимость ферментатора; Xе (час) — время цикла работы
ферментатора.
Общую продуктивность для непрерывных процессов (рис. 93)
определяют в установившемся режиме, а для периодических про
цессов и полунепрерывных — с учетом времени на подготовку
ферментатора к работе.
304
Объемная продуктивность про |В«да
УсМс/Ю 6 , ЕД
Рср —
Vnm-Xc м час
VcfC . к г
~ср- VnmXc L,3
м3часJ
Рис. 93. Ферментатор непрерывного
непрерывный процесс действия с эжекционной системой аэра-.
W c Mcf 10й , ЕД ции (Б-50): 1 — кольцевой Канал, 2 —
Рср — воздуховод, 3 — пеногаситель, 4 — се
Vnm мучас паратор, 5 — цилиндр, 6 — привод, 7 —
WcfC кг ], где теплообменник, 8 — диффузор, 9 —
"ср цилиндрический стакан, 10 — эжекци-
пт м час онное устройство.
Vnm(M3) — объем питательной среды.
р5Э •Л
1 2 3 4 6
Рис. 94. Схема получения мицелия вешенки обыкновенной для пищевых целей
(периодическое культивирование): 1 — семисуточная культура P.ostreatus в пробир
ке на сусло-агаре, 2 — шестисуточная стационарная культура на жидкой среде в
колбе с отбойниками и периодическим встряхиванием в течение 5 мин., 3 —
четырехсуточная культура в колбах на качалке, 4 — дезинтеграция грибных
агломератов до частиц размером 100—200 мкм, 5 — инокулят 0,4—0,5 г/л, 6 —
культивирование в ферментаторе в течение 5 сут., 7 — отделение конечного продукта
(мицелия).
В производстве антибиотиков, наряду с периодическим куль
тивированием, все чаще начинают использовать методы, занима
ющие промежуточное положение между периодическим и непре
рывным культивированием, то есть полунепрерывный отъемно-до-
ливной метод. Таким способом удается в 2-3 раза увеличить время
307
пребывания продуцента в активной фазе. Недостаток состоит в
том, что доливы осуществляют питательной средой полного соста
ва. Этого недостатка лишен метод полунепрерывной регулируемой
ферментации. Суть этого метода состоит в том, что в определенное
время, начиная с логарифмической фазы размножения, по специ
ально разработанной программе, в культуральную жидкость до
бавляют отдельные компоненты питательной среды (раствор Саха
ров, аммония сульфат, жир и т. д.), поддерживая их концентрацию
на постоянном благоприятном уровне — вначале для роста био
массы клеток, а затем — для синтеза целевого продукта.
Периодически из ферментатора отбирают определенные объ
емы культуральной жидкости со все возрастающей концентрацией
целевого продукта. Ферментацию прекращают после того как
активность продукта достигла максимума. Этим способом удается
не только продлить активную фазу, в которой находится продуцент,
но и повысить степень использования им субстрата, а в конечном
итоге — продуктивность процесса, то есть увеличить выход конеч
ного продукта в расчете на потребленный субстрат.
Из всего разнообразия способов проведения процессов био
технологии наиболее сложными являются регулируемые фермен
тации с соблюдением условий асептики. Реализация таких процес
сов рассчитана на использование ЭВМ при соответствующем
программном обеспечении. Кроме того для проведения процесса
в асептичных условиях необходимо введение дополнительных
стадий, обеспечивающих стерилизацию питательных сред и пода
ваемого в ферментаторы воздуха.
Стерильную питательную среду в инокуляторе — посевном
аппарате первой ступени (рис. 95) засевают с соблюдением правил
асептики через специальное устройство посевным материалом,
который предварительно был выращен в колбах (в лаборатории)..
Технологи создают и поддерживают необходимые режимы в
аппарате для размножения клеток продуцента (температуру, аэра
цию и перемешивание), а микробиологи контролируют и оцени
вают развитие культуры. При достижении требуемых стадий раз
вития и количества биомассы посевной материал передавливают
стерильным сжатым воздухом по посевному коллектору в посевной
аппарат большей вместимости. На этой второй ступени выращи
вания посевного материала стремятся получить больше биомассы
клеток, чтобы в ферментаторе можно было создать необходимую
для данного штамма продуцента исходную плотность популяции.
jso , да
выдержка
охлаждение
312
Часто для снижения вязкости питательной среды, содержащей
достаточно большую концентрацию кукурузной муки или крахма
ла, проводят их частичный гидролиз амилолитическим ферментом
— оризином (продуцент — Aspergillus oryzae) с последующей его
инактивацией нагреванием. Иногда необходимость проведения
такой операции обусловлена физиологией продуцента, для кото
рого предназначается среда.
В связи с тем, что в большинстве своем питательные среды
имеют жидкую и твердую фазы, возникает необходимость тонкого
измельчения твердых компонентов — отрубей, муки грубого по
мола, рыбно-костной муки, соевого жмыха. В этих целях с большой
эффективностью используют роторно-пульсационный аппарат,
или РПА, через который пропускают суспензию компонента перед
завариванием или после него. Благодаря этой процедуре не только
избавляются от комков, образовавшихся при заваривании, но и
повышают степень использования сырья, равно как и получают
возможность применять отдельные виды сырья (например, среды
с рыбно-костной мукой, плохо поддаюЩиеся стерилизации из-за
большого количества рыбьих глаз).
Растворы Сахаров, нуждающиеся в более щадящих режимах
стерилизации, рекомендуют готовить и стерилизовать отдельно,
смешивая с основной средой только в ферментаторе.
Некоторые виды сырья, например, соевая мука, вызывают
повышенное вспенивание среды, поэтому для снижения пенооб-
разования при стерилизации в такие среды добавляют жир в
качестве пеногасителя. Подобная мера вызвана технологической
необходимостью, в принципе, добавление жира в среду повышает
устойчивость спор к тепловому воздействию и поэтому крайне
нежелательно. Все жировые компоненты сред необходимо стери
лизовать отдельно. Для этого, как правило, предварительно готовят
водно-масляную или водно-.жировую эмульсию с хозяйственным
мылом, повышающим ее стойкость.
Качество используемой воды зависит от назначения питатель
ной среды. Чаще всего применяют артезианскую, реже — водо
проводную воду. В крупнотоннажных производствах кормовых
дрожжей и белкововитаминных концентратов (БВК) используют
воду, полученную по замкнутому циклу этого производства, то есть
прошедшую очистные сооружения. В производстве кровезамени
телей используют только апирогенную воду (бидистиллят).
Под стерилизацией сред обычно понимают любой метод воз
действия, обеспечивающий удаление из них микробов — конта-
313
минантов или разрушение последних. Наиболее распространен
ным и универсальным среди возможных методов, вызывающих
деструкцию микроорганизмов, является метод основанный на
использовании влажного тепла. Характерной особенностью, отли
чающей действие влажного тепла на микроорганизмы и химиче
ские вещества, является высокая энергия активации ц, которая
характерна для микробов (таблица 35).
Т а б л и ц а 35. Значение энергии активации бактериальных спор и некоторых
витаминов
стерильная
^реда
в фермен
татор
концентрат
вода
329
Оисп. = твлаги. • г, где твлаги — масса испарений влаги,
г (Дж/кг) — удельная теплота парообразования.
По абсолютному значению Оисп. — величина небольшая,
поэтому ее колебания, пропорциональные количеству подаваемого
воздуха, не оказывают заметного влияния на общее количество
тепла, образующегося в процессе ферментации.
Как правило, тепловой режим
в процессе ферментации поддер
живается на определенном уров
не и строго контролируется. Все
образующееся тепло должно быть
отведено охлаждающей водой.
В общем виде тепловой ба
ланс процесса ферментации мо
жет быть представлен следую
щим уравнением:
О ж + Q n + Овозд. Оисп- = Оохл.,
где Оохл. — тепло, отводимое ох
лаждающей водой, подаваемой в
теплообменные устройства;
Оохл- = ГПводы * С в о д ы (t2—11), где
гдводы — масса охлаждающей во
ды, Своды — теплоемкость ох
лаждающей воды, ti и t2 — тем
пература воды соответственно на
входе и выходе из теплоотводя-
щих устройств.
3 Для поддержания теплового ре
mt -ч жима в ферментаторе в настоя
щее время чаще всего используют
артезианскую воду 12—15°С или
ШШШ&
смесь артезианской и оборотной
воды 15—16°С; отработанная вода,
выходящая из теплообменных ус
Рис. 105. Теплотрубный теплооб тройств с температурой 18—20°С,
менник Херсонского индустриального в этом случае поступает в линию
университета: а — общий вид в сборке, оборотной воды и может быть ис
б — устройство тепловой трубы (1 —
подвод тепла, 2 — фитиль, 3 — жид
пользована в качестве охлаждаю
кость, 4 — пар, 5 — отвод тепла, 6 — щего агента в тепловых процессах
зона испарения, 7 — адиабатическая с высокими температурными ре
зона, 8 — зона конденсации). жимами (рис. 105).
ззо
Наиболее эффективно использование так называемой "захоло-
женной" воды (Ю°С), получаемой для цеха ферментации на спе-
; циальных установках. В теплоотводящих устройствах ферментато
ра она нагревается до 15—16°С и по коллектору возвращается на
I станцию получения "захоложенной" воды.
| Таким образом, применительно к тепловым процессам, проис-
| ходящим в ферментаторе, можно сказать, что все они (тепловой
эффект жизнедеятельности, перемешивания, тепло, привносимое
воздухом, тепло испарения, теплопередача при охлаждении водой)
i протекают одновременно с разной интенсивностью и динамично-
Л стью, отсюда понятны высокие требования к конструктивным
характеристикам теплообменных устройств.
7.4. Аппаратурное оформление процессов выделения и очист
ки некоторых продуктов микробного синтеза. Культуральная
жидкость, образующаяся в процессе ферментации, представляет
собой сложную многофазную систему: в водной фазе содержатся
клетки продуцента, продукты их жизнедеятельности, непотреблен-
ные компоненты питательной среды, мельчайшие капельки жира,
пузырьки воздуха, как правило, мел. В свою очередь водная фаза
j культуральной жидкости (нативный раствор) включает большое
число органических и неорганических веществ, коллоидных фрак :
( ций белков, сухой остаток культуральной жидкости — до 17% и
' более; содержание биомассы в культуральной жидкости достигает
8—10%. Концентрация целевого продукта чаще всего не превышает
1,5%, что составляет менее 10% сухого остатка.
В зависимости от целевого назначения конечного продукта (для
j здравоохранения, технических целей, сельского хозяйства и т. д.)
реализуют различной степени сложности схемы производства, при
этом учитывают и место накопления целевого продукта — внут-
риклеточно или внеклеточно.
Если способы выделения целевых продуктов можно разделить
на несколько типовых групп (рис. 106), то очистка каждого из них
практически индивидуальна, поскольку зависит от физико-хими-
i ческих свойств конкретного вещества.
Примером наиболее простой схемы может служить производ
ство биовита, базирующегося на использовании продуцента анти
биотика хлортетрациклина. Кальциевый комплекс хлортетрацик-
лина осажадают из культуральной жидкости при рН выше 7,0.
Формирующийся при этом осадок увлекает с собой и клетки
продуцента. Так в осадке вместе с биомассой оказываются внекле
точный антибиотик и внутриклеточный витамин Bi2. Осадок филь-
331
тр^ют, высушивают, размельчают, добавляют отруби в качестве
наполнителя и фасуют. Этот комплекс используют в качестве
Добавки к корму ддя скота.
Культуральная жидкость
Фракционирование {Осаждение
П^
,и
шV s
ьр-" шЩ и^у
вакуум '_
338
Образовавшаяся калиевая соль бензилпенициллина переходит
снова в водную фазу. Водный слой и бутилацетат разделяют при
отстаивании (контроль за разделением проводят визуально через
смотровое стекло, установленное на трубопроводе).
Водный концентрат калиевой соли бензилпенициллина после
фильтрации (24) передают на вакуум-упаривание (26) и кристал
лизацию. Этот процесс является процессом кристаллизации со
сменой растворителя. Калиевая соль бензилпенициллина кристал
лизуется в бутаноле после выпаривания воды, В случае проведения
процесса при пониженной температуре к водному раствору добав
ляют бутанол. Образовавшуюся азеотропную смесь "бутанол-вода"
отгоняют при 20°С. Кристаллы отфильтровывают от маточника (28),
промывают безводным бутанолом и высушивают.
Выделение и очистка канамицина из нативных растворов ос
нована на ионообменных методах. Канамицин — антибиотик
основного характера, его выделяют из нативных растворов сорб-
ционным методом. Для удаления ионов кальция культуральную
жидкость обрабатывают щавелевой кислотой. После отделения
осадка нативный раствор,(рН 6,8-*-7,2), содержащий канамицин
поступает на ионообменные колонны (рис. 109). При этих условиях
канамицин представляет собой шестивалентный катион.
Антибиотик сорбируется на карбоксильном катионите КБ-2 в
натриевой форме, так как активные центры этого сорбента заняты
ионом натрия. Процесс сорбции идет по схеме:
6RCOONa+KaH. +6 -* (RCOO)6 Кан.Ч- 6Na +
Нативный раствор канамицина проходит через батарею после
довательно соединенных колонн (5—7). Раствор подают снизу, так
как сорбция протекает во взвешенном слое сорбента. Здесь важ
ным является выбор рабочей скорости (Wpa6.), которая должна
быть больше критической скорости (WKpirr.), определяющей про
цесс псевдоожижения, и меньше скорости уноса (WyH.) — скорость,
при которой сорбент уносится с раствором из колонны,
Сорбцию ведут до тех пор, пока в отработанном растворе не
останется порядка 5—6% концентрации антибиотика от исходной.
Каждую колонну в батарее отключают после полного насыще
ния, промывают обессоленной водой (1) и подвергают десорбции.
Десорбцию канамицина проводят IN раствором аммиака (2) или
элюатом третьей фракции (10), укрепленным 25% раствором ам
миака. Процесс проводят в соответствии с реакцией (при подаче
раствора сверху):
339
на очисту стопи |
гбочек А .« __
НИЖНИЙ микропористый
I фильтр
проток свежей среды
Рис. 118. Проточный реактор с гибкими лопастными мешалками (по Дж. Фидеру
и У. Толберту, 1983).
Глава 8.
| Регенераторы к - Нвсосим
станция
1А.
| Ипоуппогнитеяи)
"Г" Избыточный активный ил
газы брожения
пар ] Метантанки |
Обезвоживание
сброженного
осадка
Т
Удобрение
NH NH
i i 2C
<hPr-
CI-C 6 H 4 -NH-C-NH-C-NH-(CH 2 ) 6 -NH-C-NH-C-NH-C 6 H 4 -CL
NH NH
хлоргексидин биглюконат (гексам тилен-1,6-6ис-р-хлорфенилбигуанидина диглюконат)
[НзС—(CH2)i5—N - (СНз)з]+Вг-
Цетавлон
Катионными ПАВ являются
циклопептидные антибиотики
(грамицидин С, полимиксин В,
циклоспорин А и др.).
L-Лей — п - ^ D-ФЕН — • " • L-Лро ••» — & L-8*i W> L-Орн
1
l-Op» « , ц „ -4 L-Про^ D-Ф.»-*
I WM N( ,2 ^ддщ ьлоц
•«•«.«««с ПопммксинВ
(ДАМ - а, у диямиио6утират,6 - МОК - м«гя-
361
L-Ana • * LnAm »> Me-L-Лвй • М*Ы1ей
t I
-L-Лвй if
Г
L-Вал
кМ-Лей
i
сн 3 сн 3
NaO-S02-4~^Vc-CH2-CH2-C-CH2--CH-CH3
2-метил-4.7-диметил-гептип-п-6ензолсульфонат
__ сн3 3
сн сн,
сн3 сн,
сн,
/=Л al k
7
3
б! 3
5 41 3
3 2 1
NaO-SQ 2 -^ у- сн
С-СН
3 2-СН-СН2-СН-СН2-СН2-СН3
4,6-диметил-8-диметил-октил-п-бензолсульфонат
362
сн,3
I
СН3—(СН2)9—СН—С6Н4—S03Na
г4»
C H j — ( C H ^ g — С—С6Н4—SOaNa
сн3
11-метил-ундецил-п-бензол-сульфонзт
10-диметил-децил-п-бензол-сульфонат
363
жирной кислоты. Твины являются сложными эфирами ангидро-
сорбита и жирных кислот, алкилированные окисью этилена; дру
гими словами — это эфиры циклизованных полиэтиленоксидов и
жирных кислот
din, \ H - C H , - O - R
I I
HOH2C-f-CH2-0-CH2-}-CH2-0-C!H CH-O-CHj-fC^-O-CH^CHpH
СгГ
O-CH^C^-O-CHj-J-CHpH
6 6"6L он
фенол, или орто- пара- диоксибензол
оксибензол (резорцин)
(карболовая
кислота)
«резолы
Усвояемость Эквива
Вид Содержание, % % лент
ность (в
продукта ВО л Пр Ц БЭВ 3 У У кг) 100 кг
ДЫ сви жва крахмала
ней чных
Влажные
дрожжи 86 0,2 6,9 0,4 5,9 0,9 85 85
Высушенные 0,4-
дрожжи 8-12 2-3 43-55 1,7 25-35 6-8 85 85 76,6
Белковый
остаток* 8,5 3,9 43,6 6,8 32,9 4,3
Солодовая
дробина 77 1,4 5,3 4 11 1,3 52,25 50 12,7
Хмелевая
дробина* 62 3.2' 4,46 5,4 26,15
367
сн 3 —со—с—-с—он
он ' * •*
гумулиновая кислота (мягкая смоле В)
•. . " . . • • * , . . - -
.тсн—с—он
он
дигидрогумулиновая кислота
СО
(СНч)5=гС=СН-СН,-СН О—СО-СН2-СН=<СН3)2
32
I I
СО с_ОН
\ г
(СН 3 ) 2 ==С = С Н - С Н г — С — С Н 2 - С Н = С — ( С Н 3 ) 2
лупулон
Дрожжевые клетки и солодовая дробина — хороший корм для
животных. В высушенном виде их можно сохранять впрок. Отмы
тые от горечей клетки дрожжей соответствуют по калорийности
говяжьему мясу при соотношении 1:2,5, то есть 1 кг сухих пивных
дрожжей равноценен 2,5 кг говядины. В них содержатся также
витамины группы В, в частности, тиамин и рибофлавин (50—:100
мг/кг), эргостерин (0,56%), микроэлементы. Следовательно, пивные
дрожжи полезны и человеку, и не, только в качестве пищевого
продукта, но и лечебного. Применение пивных дрожжей норма
лизует некоторые обменные процессы, восполняет дефицит от
дельных коферментов.
Солодовая дробина состоит из солода, оболочек зерен ячменя,
368
липидов, белков и других веществ (см. таблицу 39). При скармли
вании солодовой дробины, например, коровам, возрастает их
удойность. Если в день давать 2,5 кг сухого солода на голову скота,
удой молока возрастает примерно на 5 литров.
. Таким образом, пивоваренное производство можно отнести к
разряду м а л о о т х о д н ы х и, следовательно, выгодных с
. экономической и экологической точек зрения.
Производство многих антибиотиков, базирующееся на исполь
зовании бактерий —.стрептомицетов, также приближается (или
может быть приближено) к малоотходным. Плотные отходы после
термообезвреживания могут быть, использованы в качестве корма
для сельскохозяйственных животных, так как белковое, минераль
ное и, в ряде случаев, витаминное содержание (Bi2) клеток является
важной добавкой к их дневному рацирну. Однако по некоторым
данным, в клеточной биомассе не должно содержаться ощутимых
количеств остаточных антибиотических веществ, что, якобы, мб-
" жет сказаться на'селекиионировании резистентной микрофлоры,
включая патогенную и условно патогенную, (в частности, из семей
ства Enterobac'teriaceae). По другим данным антибиотики — не
только профилактические и лечебные средства, но и стимулируют"
прибавление веса, увеличивают эффективность» использования
кормов. Однако учитывая высокую биологическую активность
антибиотиков, целесообразно придерживаться первых рекоменда
ций. . ' '-•• ' \ .
Жидкие отходы в производстве антибиотиков передаются на
обезвреживание.
Применительно к микробной биотехнологии имеются данные
об использовании плотных отходов в производстве антибиотиков
и ферментов (биомассы клеток) в качестве армирующего накопи
теля в бетонных изделиях.
В призводстве декстрана возможна организация б е з о т х о
д н о й технологии. Исходя из механизма биосинтеза полисахарида
видно, что отходом производства является фруктоза. К сожалению,
декстрансахароза
с
12н22°11 *" (С6Н12°5>П * ЧС6К1206
сахароза декстран фруктоза
372
Часть IV.
Специальные биотехнологии
• Во второй части учебника изложены основные представления
о биотехнологии, базирующейся на использовании биообъектов
микробного, растительного и животного происхождения. В срав
нительном плане можно подчеркнуть следующие особенности
таких биотехнологий: во-первых, имеется много аналогий при
реализации биотехнологических процессов, в которых биообъекты
используются на молекулярном и клеточном уровнях; во-вторых,
только некоторые виды биотехнологий, осуществляемые с приме
нением клеток, могут быть подведены под рубрику "технологий на
организменном уровне" (микробная биотехнология); в-третьих,
лишь при использовании в биотехнологии микроскопических ор
ганизмов необходимо специальное аппаратурное оформление про
цессов, тогда как в случаях выращивания макроорганизмов (рас
тений и животных) в естественных, или природных условиях этого
делать не требуется, и, следовательно, посевы и сборы урожаев,
выращивание сельскохозяйственных животных в целях получения
373
молока, мяса, кож, шерсти и пр. не относится к новым и новейшим
биотехнологическим процессам в таком понимании предмета, по
скольку здесь выпадает ведущее звено, связанное с управляемым
культивированием биообъекта, например, в ферментаторах или в
других аппаратах. Однако третья особенность не является универ
сальной. В частности, к истинной биотехнологии тесно примыкает
технология выращивания некоторых растений на основе метода
гидропоники. Тем не менее, особенности каждой группы биотех
нологических процессов сохраняются и поэтому есть все основа
ния рассматривать их в качестве самостоятельных. К ним относят
микробную биотехнологию, фитобиотехнологию и зообиотехно-
логию, то есть главным критерием подразделения биотехнологий
являются биообъекты. Микроорганизмы в этом смысле занимают
первенствующее положение (сравнить число реализованных на
практике микробиологических и других производств по объему
выпускаемой продукции).
Существующие ветви биотехнологических субдисциплин (им-
мунобиотехнология, инженерная энзимология), применительно к
конкретным производствам, рассмотрены в соответствующих гла
вах второй части учебника. Например, генно-инженерные проти
вовирусные вакцины включены в главу "Микробная биотехноло
гия", тогда как вирусные вакцины, получаемые на культивируемых
клетках и тканях животных организмов, приведены в главе "Зоо-
биотехнология". Биохимические процессы на основе инженерной
энзимологии рассмотрены на примерах ферментов преимущест
венно микробного происхождения, поэтому и этот раздел включен
в главу 9.
Глава 9.
МИКРОБИОТЕХНОЛОГИЯ
Микробиотехнология, или микробная биотехнология базиру
ется на интегрированном использовании микробиологии, биохи
мии и инженерных наук. с целью реализации потенциальных
способностей микроорганизмов в технике и промышленном про
изводстве. По сути своей микробиотехнология тождественна про
мышленной (технической) микробиологии. Ее объектами являются
микробы-вирусы (включая вироиды и фаги), бактерии, грибы,
лишайники, протозоа (см. главу 2). В ряде случаев биообъектами
являются первичные метаболиты микробного происхождения —
ферменты, каталитическая активность которых лежит в основе
инженерной энзимологии.
374
В сравнении с растительными и животными клетками микробы
размножаются, как правило, быстрее и, следовательно, у них
быстрее протекают все метаболические (обменные) процессы.
Относительные преимущества большинства микробов как биообъ
ектов следующие:
1) большая "простота" организации генома,
2) достаточно легкая приспособляемость (лабильность) к среде
обитания в естественных и искусственных условиях,
3) выраженные скорости протекания ферментативных реакций
и нарастания клеточной массы в единицу времени.
Первое преимущество обеспечивает микробным клеткам луч
шие возможности для изменения и перестроек наследственного
материала, например, включение в него чужеродной генетической
информации, привнесение в клетки или, напротив, элиминация из
них плазмид, и пр.
Второе преимущество, связанное с лабильностью микробов,
можно показать на примере бактерий и грибов. Так, применитель
но к температуре микробы подразделяют на психрофилы, мезо-
филы и термофилы (от греч. psichria — холод, mesos — средний,
terme — теплота, fileo — люблю) со следующими оптимумами
показателей для них: ниже 20°С, 20—45°С и выше 45°С соответст
венно. Однако указанные интервалы, как правило, перекрываются.
Например, психрофильный вид Xanthomonas pharmiicola может
расти при температуре от 0°С до + 40°С, мезофильный Lactobacillus
lactis — от + 20°С до + 50°С, термофильный Вас. coagulans — от
+ 20°С до +65°С. Поэтому выделили дополнительные подгруппы:
облагатные психрофилы, факультативные психрофилы, стено-
термофилы и эвршпермофилы. Первые из них не растут при
температуре выше +20°С, для вторых верхний температурный
предел превышает + 20°С, третьи не растут при температуре ниже
+ 37°С, четвертые растут при температуре ниже + 37°С.
Кроме стенотермофилов и эвритермофилов целесообразно вы
делить еще одну подгруппу термофильных микроорганизмов под
названием супертермофилов, для которых температурный опти
мум составляет 105°С, то есть выше точки кипения воды (100°С).
К числу таких микробов относят бактерии родов Pyrodictium и
Pyrococcus. Так для Pyrococcus furiosus, изолированного из подвод
ного гидротермального излияния около средиземноморского ост
рова Вулкано, кардинальные точки температуры (minimum,
optimum, maximum) составляют 60°С, 105°С, 110СС. Среди супер
термофилов отдельные представители являются или могут быть
375
источником термостабильной ДНК-полимеразы, активной к тому
же при высоких давлениях (рис. 124).
v„«<*> Рис." 124. Скорость роста
• 1
I
г
1
3 или другой физиологиче
loa
л ской функции микроорга
80
низмов (V max) в процентах
60 \ / от максимального значения
to /\ !// \ /
для данных условий: 1 —
/ \ / I \1 пеихрофилы, 2 — мезофи-
/
20.
'r/ 1 лы, 3 — термофилы, 4 —
и' 105 но! *°« супертермофилы.
380
Продолжение табл. 40
Ингредиент Содержание, Ингредиент Содержание,
% о/
/о
/.= N 1
где 1—
0 9
N0 — число клеток перед началом их синхронного деления, N\
— число клеток после синхронного деления, Т — время, приходя
щееся на Log — фазу, g — продолжительность одной генерации.
Индекс синхронизации характеризует степень однородности по
пуляции.
При необходимости синхронизацию деления можно индуциро
вать, например, метаболическим шоком (предварительный посев
культуры на голодные среды), температурным шоком (смена тем
ператур, в частности, пониженных в начале на оптимальные в
последующем), или используя одинаковые по размеру клетки,
механически разделенные, например, фильтрованием (селектив
ные методы) и т. п.
В зависимости от плотности суспензии ее необходимое коли
чество может достигать 1—20% объема производственного фер
ментатора. Для аэробных микроорганизмов в инокулятор достав
ляют очищенный стерильный воздух.
В целом, предферментация схематично представлена на рис.
125. В инокуляторах, как и в промышленных ферментаторах,
целесообразно поддерживать незначительное избыточное давле
ние воздуха, когда случайные утечки будут происходить только в
направлении из системы, а не наоборот. Этим дополнительно
обеспечивается асептичность биотехнологического процесса.
Подготови
ВуСАШЩЯХ итательвых сред
цешшоа • малых объема*
Подготоая*
культуры
цежл
(yvacnu)
С самовсасывающей -» С перемешивающими
мешалкой устройствами
- С вибромешалками
ФГ с принудительной
-•
циркуляцией
-» Комбинированные
микроорганизмы
Рис. 126. Подход к выбору биореакторов для аэробных микроорганизмов.
384
Микроорганизм в виде суспензии определенной плотности
подают из инокулятора(-ов) в промышленный биореактор, или
ферментатор, в котором содержится стерильная жидкая питатель
ная среда. При этом не должно произойти попадания каких-либо
посторонних микробов в питательную среду вместе с продуцентом
— все соединения системы должны быть герметично закрытыми.
Схема запорно-регулирующих устройств представлена на рис. 127.
Ц
*,(*,- to) '
3) концентрация биомассы: X! = Хов ц (''~ w
для log-фазы размножения е=2,718;
4) продуктивность по целевому продукту (Ор, г/л • ч):
Р— Р
а) для периодического процесса: Ор = —
ц— t0
б) для непрерывного процесса: Q p =DP, где Р — концентра
ция продукта (г/л • ч);
5) удельная скорость образования целевого продукта (qp) в
г/г« ч:
Pi-Po
Яр
X^U-to)
6)s =удельная скорость потребления субстрата (qs, г/г'ч):
? ~v~7*—7\ > гл - е ^ — концентрация субстрата в г/л;
X-\(U— r0)
7) выход биомассы из субстрата, или экономический коэффи
циент (Yx/S) в г/г:
v - И Х '~ Х °
" * " *.~ 5 0 -S, '
8) выход целевого продукта (Ye/S) в г/г:
v ?Р Л " fl>
рЛ
~ qs~ So-Sr
9Ь.
т
-Ац КоА Щ- зСОСООН 1 сн 3 сн 2 сн 2 соон
соон
уксусная
киеяота.
СН3<СН2)3ОН СН3СН2СООН
бутаноп пропюноип
394
(Продолжение таблицы 41)
Оптимальные Выход Макси
параметры этанола, маль
культивирования %от ная
Микроорганизм макси кон Примечание
t°, маль цент
pH °с ного рация
этанола,
г/л
Ингредиенты %
Сухие вещества 11,5-12,2
Зола 1,2-2,1
Сульфаты 0,1
Сахара в сульфитных щелоках, например, из ели, обычно
включают глюкозу — около 29%, галактозу — 4,2%, маннозу — 43%,
пентозы — 17%, уроновые кислоты — 3%, фруктозу — 4%.
Сорта и происхождение древесины, условия сульфитной варки
сказываются на качественных и количественных показателях для
сульфитных щелоков.
398
Из щелоков извлекают прежде всего целлюлозу, после гидро
лиза которой сбраживание гексоз (глюкозы) осуществляют с по
мощью специальных рас Saccharomyces cerevisiae. "Сульфитный"
спирт — один из наиболее дешевых, он содержит до 2—8%
метанола, а также другие примеси. Его используют в технических
целях.
Применяя древесину, обычно стремятся совместить получение
этанола и дрожжей, хотя оба этих процесса можно вести по
отдельности. Ниже приведена схема комбинированного использо
вания целлюлозы.
Древесина
пар ^ > | + Н ^ О з " * SO,
Варка целлюлозы
Гидро Сепарирование ^ С у л ь ф и т н ы й щелок
лиз
Целлюлоза 4 Сепарирование
к-пар
Продувание щелока
+ известковое молоко
(аммиачная вода)
* ^ Нейтрализация
Осадок (отход) < I
Осветленный раствор
Охлаждение
4
Спиртовое брожение
I'
пар
Дистилляция и ректификация
Этанол, метанол и пр. < 1
Охлаждение
аэрация >U- питательные соли и
J дрожжи
Флотация, промывание, сепариро
вание, высушивание
Кормовые д р о ж ж и
399
Расчетами показано, что при совмещенном производстве
спирта и кормовых дрожжей "выходные" показатели на 1 т
абсолютно сухой древесины выглядят следующим образом:
этанол (абс.) — 175—182 л, метанол — 2 кг, сивушные масла —
0,3 кг, фурфурол (94%-й) — 5,6 кг, диоксид углерода (жидкий)
— 70 кг, дрожжи с остаточной влажностью 10% — 32 кг, лигнин
(абсолютно сухой) — 380 кг, гипс — 225 кг.
На сульфитных щелоках можно получать грибную кормо
вую массу, используя, например, сапрофитный Paecilomyces
varioti, который утилизирует гексозы, пентозы и ацетат. Подо
бная технология разработана в Финляндии.
При спиртовом брожении часто используют мелассу —
отход производства свекловичного или тростникового сахара
(патока). Она содержит в среднем 80% сухих веществ и 20%
воды. Примерно от 30—40% до 45—50% сухих веществ состав
ляет биоза-сахароза, 0,5—2% — раффиноза и до 12—18% —
инвертный сахар (смесь глюкозы и фруктозы), прочие вещества
представлены аминокислотами, бетаином (органическое осно
вание), некоторыми витаминами группы В, неорганическими
солями, пигментами; рН мелассы находится в диапазоне 7,2—
8,9.
Мелассу применяют одновременно для получения этанола
и кормовых дрожжей (Рис. 128а). Сравнивая "паточные" и
"гидролизные" дрожжи, можно привести следующие данные по
основным ингредиентам клеток (таблица 43).
В паточных дрожжах сравнительно меньше липидов, неко
торых витаминов (биотина, инозита, пиридоксина, рибофлави
на), углеводов, но несколько больше кислоты пантотеновой,
тиамина, холина и зольных элементов; паточные и гидролизные
дрожжи примерно одинаковы по содержанию белков и по
коэффициенту отягощения белка азотом нуклеиновых кислот,
или КОБА-коэффициенту, равному 20% ( N H ^ / N O ^ . • 100). Для
сравнения можно указать на КОБА-коэффициент для белка
нитчатых грибов — он равен 2—5%, что выгодно отличает его
от белка дрожжей и, тем более, от белка бактерий (КОБА-ко
эффициент 30%).
400
Т а б л и ц а 43. Химический состав "паточных" (ПД) и "гидролизных" дрожжей
(ГД), % от сухих веществ
Ингредиенты ПД ГД
Белки 46—52 43—58
5 4
Биотин 3-КГ —1,6-10 6-Ю" 5 —2,3-10" 4
д|д ^Ш^
з
Ш*
5 6
о- ^ U.
(а) Я ГУ
в! (б)
- * '
( + дрожжи - сахаромицеты) Спиртовое брожение (3-7 суток)
Г + С Н 3 С О О Н (в соотношении 1:100)
Выдерживание в анаэробных
условиях нескольких недель
(уксусная смесь)
Получение уксуса
Получение уксуса
по орлеанскому
(французскому), или по немецкому, или
медленному способу быстрому способу
1
I Концентрация, %
№ ферментатора
1 2 3 4 5
р-Вююио-мюм
Н0Н2С-(СНОН)4-СООН
глюкономя кислота
соон соон
лимонная кислота цис-аконитовая кислота
• • Н00С—СН2—С^ЯЦ
соон
итаконовая кислота
Н—С—СООН
II
СООН—С—Н
фумарома кислота
Фумаровая кислота способна трансформироваться в малеино-
вую, широко используемую для химического синтеза некоторых
лекарственных веществ, смол, лаков и красок. Однако конкурен
тоспособность синтетического малеинового ангидрида (из бензиг
на) для тех же целей служит веским ограничителем развития
производства фумаровой кислоты путем микробного синтеза. И,
очевидно, это будет продолжаться до тех пор, пока нефтяные
запасы в мире значительно не оскудеют.
9.3.3. Получение антимикробных веществ. К антимикробным
средствам относят антисептики, дезинфектанты и химиотерапев-
тические вещества. Антисептики — это химические вещества,
неизбирательно и губительно действующие на микроорганизмы (в
том числе — патогенные), находящиеся на поверхности тела и
слизистых оболочек открытых полостей. Дезинфектанты — это,
в основном, антисептики, действие которых направлено на пато
генные микроорганизмы, находящиеся на (в) объектах внешней
среды. Химиотерапевтические средства — это вещества синтети
ческого и природного происхождения, избирательно и губительно
действующие на патогенные микробы, клетки злокачественных
опухолей и гельминты.
Антисептики, дезинфектанты, неорганические и синтетиче
ские химиотерапевтические средства не имеют непосредственного
отношения к биотехнологии. В то же время подавляющее боль
шинство антибиотиков получают при ферментации микробов-про
дуцентов, или, в других случаях, применяют "антибиотическое
ядро" для синтеза целевого продукта — полусинтетического анти
биотика. Известны единичные антибиотики (ранее получаемые с
помощью биосинтеза или получаемые таким путем и ныне), кото
рые в настоящее время производят на предприятиях органического
синтеза (левомицетин и некоторые другие).
Таким образом, определение понятия "антибиотики" теперь
относят к веществам природного, полусинтетического и, реже,
синтетического происхождения, которые в малых концентрациях
ингибируют рост (размножение) каких-либо микроорганизмов.
Продуцентами одних антибиотиков (например, бацитрацина, по-
лимиксина и др.), являются бациллы, других — актиномицеты
(например, актиномицинов, гентамицинов, канамицинов), третьих
— нитчатые грибы (например, гризеофульвина, пенициллинов,
цефалоспоринов), четвертых—неспорообразующие бактерии (на
пример, монобактамов).
428
Антибиотики — р-лактамы
П е н и ц и л л и н ы . Пенициллин впервые получен из
культуральной жидкости в аморфном, а затем—в кристаллическом
виде А. Флемингом, X. Флори и Е. Чейном в 1940 г. До сих пор
пенициллиновые антибиотики составляют наиважнейшую группу
химиотерапевтических средств. Ядром пенициллинов является 6-
аминопенициллановая кислота, или 6-АПК, которую используют
для получения полусинтетических пенициллинов.
Один водород в аминогруппе 6-АПК
может быть заменен на какой-либо ра
A дикал (R), усиливающий и/или расширя
H ^ - C H - C H С=(СНз) 2 ющий (изменяющий) антимикробный
^ С — N —СН— СОО спектр полусинтетического производно
о го. Обычно 6-АПК получают из бензил-
6-АПК пенициллина (пенициллина G).
В настоящее время в различных странах производят биосинте
тические (с помощью Penicillium notatum или P.chrysogenum) ан
тибиотики и на их основе — полусинтетические антибиотики —
Р-лактамы, перечисленные в таблице 45.
Ц е ф а л о с п о р и н ы — другая обширная группа
экстрацеллюлярных Р-лактамных антибиотиков, в которых шести-
членное дигидротиазиновое кольцо соединено с Р-лактамным коль
цом. Благодаря этому ядром цефалоспоринов является 7-аминоце-
фалоспорановая кислота, или 7-АЦК (цефемовое ядро), впервые
выделенная в ходе очистки
/ \ цефалоспорина С (проду
R 1 -NH-CH-cA 1 2CH, цент Cephalosporium
Л acremonium), в котором
0=С—-N5' 3 C - C H - R 2
Известно около 20 це
фалоспоринов, созданных
СОО" методом полусинтеза из
7-АКЦ АЦК: цефалоридин (цепо-
рин), цефуроксим, цефок-
R, =~ООС—СН—(СН^—СО- ситин, цефалотин, цефа-
цетрил, цефалексин, цефа-
NH2 золин, цефаридин, цефо-
R 2 =— О—СО—СН3 таксим, цефтриаксон, цеф-
тазидим и др.
429
Т а б л и ц а 45. Природные и полусинтетические пенициллины
Бензилпенициллин * Бензил — — —
Феноксиметил- Феноксибензил + — —
пенициллин
Метициллин 2,6- — + + —
Диметоксифенил
Оксациллин 5-Метил-З-фенил- + + + —
4-изоксазолил
КлохсациЛлин З-о-Хлорфенил- + + + —
5-метил-
4-изооксазолил
Флуклоксациллин 2-Хлор-6-фтор- + + + —
фенил-5-метил-
4-изоксазолил
Карфециллин' Фенил + — + +
(феноксикарбонил)
-ацетил
Кариндациллин* Инден-5-ил- + — + +
оксикарбонилфенил-
ацетил
Пивампициллин* Аминофенилацетил + — +
430
Продолжение табл. 45
Пиперациллин** 2, 3- — — — —
Диоксопиперазин-1 -
ил-карбонил-амино
(фенил) ацетил
Азлоциллин** 4-Оксопиразолидин- — • — — —
1 -ил-карбонилами-
но-(фенил) ацетил
Мезлоциллин** З-Метилсульфонил-
2-
оксоимидазолидин-
1 -ил-карбонилами-
но-(фенил) ацетил
Мециллинам** Пергидроазепин- — о ?
1-ил-метилен
л7 с—со— — О СО—СН3
цвфотаимш
NH
II Оацатил
N—ОСН3
2-аминотиаэоп-4-ип-
(метоксиимино)ацетил
цвфтриагсон
радикал тот же
_J*.Ao
6-гидровси-2-метип-
5-оксо-2,5-дегидро-
-1,2,4-триазин-З-ип
-TWO...натриевая соль
HZN
N г-
I Г3
О с—COONa
о цафтаэидим
пиридил
I
СН3
2-аинио-0-{1н<арбо«*1
1,1-ДИМвтнл)-4-тиаэол-
карОогмдроиааюап...
натриевая соль
осн3 о
о н _^ у—сн— СО— N H - C — СН СН 2 м- N
COONa CH 3
432
К л а в а м ы — р-лактамные антибиотики, отличающиеся от
пенициллинов тем, что в тиазолидиновом кольце последних сера
заменена на кислород {клавемовое оксазолидимовое кольцо) и в
позиции 6 нет боковой цепи. Та
кой антибиотик — клавулановая А*\
кислота изолирована из с ^| —CHS С«СН— CH2OH
Streptomyces clavuligerus. Она it. I J
слабо активна против бактерий, 1т \ч i'
но является потенциальным ин- •••••• __ .
п 'С ООН
гибитором стафилококковой В-
а с кпшупановая шепота
лактамазы и р-лактамазы, обра
зуемой грамотрицательными
бактериями. Сочетание широкоспектральной клавулановой кисло
ты с 8-лактамазочувствитёльными ампициллином и амоксицилли-
ном является основой комбинированного препарата аугментин.
1 — К а р б а п е н е м ы — это новое семейство В-лактамных
антибиотиков, представляющих собой аналоги пенициллинов или
клавамов, в которых сера у первых и кислород у вторых замещены
на углерод:
С Но
• ¥ Г " Л Н г ?, н
г
0=С N 4 —ЧСН
1-карбапенемовое кольцо
/*~\~c| f ^ »"*
OH I II
0=C N С—COON.
тиеншицин (продуцент • Streptomyces olivaceus)
433
Н о к а р д и ц и н ы — новая группа.р-лактамных антибиотиков,
продуцируемых бактериями из рода Nocardia. Выделены нокарди
цины А, В, D, E, F, G. Наиболее активным из них против грамот-
рицательных бактерий (но не грамположительных) оказался но-
кардицин А.
*=" o=C—Ny
НООС^ ^fo
нокэрдицин А (продуцент - Nokardia sp.)
"R о
к
здмк
<и
азтреонам (продуцент - Pseudomonas acidophila)
А н т и б и о т и к и - т е т р а ц и к л и н ы — это
широкоспектральные антибиотики, активные против бактерий;'их
продуцентами являются стрептомицеты. Некоторые тетрациклины
относятся к ряду полусинтетических препаратов.
А н т и б и о т и к и - г л и к о з и д ы . Среди них можно
выделить структуры, содержащие О-, S- и N-гликозидные связи.
К числу первых относят аминогликозидные антибиотики и ново-
434
биоцин, ко вторым — клиндамицин и линкомицин, к третьим —
некоторые нуклеозидные антибиотики.
А н т и б и о т и к и — О - г л и к о з и д ы . Аминогликозиды
— содержат аминосахара в своей структуре. Большинство из них
(канамицины, гентамициныи др.) продуцируется актиномицетами;
тобрамщин — аналог канамицина В (З'-дезоксиканамицин В);
нетштицим является полусинтетическим производным сизомици-
на (N-этилсизомицин).
Все антибиотики-аминогликозиды обладают широким спект
ром действия на различные патогенные бактерии.
»tc —»
о
^ ^ • ^ ^ * (продуцент - Strptarnyces karwnycetieus)
гшамиминм n м ш ш т
гснтамицины
Hi ^1
IN—-о CHj ННСИ3
н нн 2
С Н 3 «И2
Н NMj
он
-*^сн*ын он
'сн ын он
3
но Продуцентом ген-
£^°
но. тамицинов является
"Л НО О
| ^ч
«Ни
^7NHCOCH(CH
он
I 2 ) 2 NH 2
Micromonospora
purpurea, а сагамици-
на — M.sagamiesis.
Сизомицин по строе
сн 2 он нию близок гентами-
он цинам и отличается от
но NH2
них лишь одним цик
(полусжплмасай амиатшояц -
лом
производим шшмцин*)
ои
сн 3 '
спирамицин I (продуцент - Streptomyces amboiadani)
сн3
сн3 сн3
^ЭН7 /
но-4— н •?Ч. сн3
СО—NH А-К
М / с
i/co—ym—рн
>э— сн.
линкомицин клиндамицин 4S-CH3
(продуцент - Sfevptomyces Ikttokienss)
сн2он >йомн,0
гужеротин
У MHj
об
НОН2С о / 1 " •
его невелико.
Антибиотики-
депсипептиды
>f/
NH
Все о н и продуцируют
ся, к а к правило, бациллами
и проявляют активность
I против грамположитель-
со
I /==\ ных и/или грамотрицатель-
грамотрицатель-
щ|, сн сц —/ JS—OCH3 ных патогенных бактерий
* ^-ff К числу циклопептидных
циклопептидныэ
антибиотиков относят ба-
цитрацины, грамицидины,
полимиксины и др.:
438
продуцент антибиотик активен против
Вас. lichenitormis бацитрацины грамположи-
телъных
(10 форм) бактерий
и грам-
отрицательных
кокков
Вас. brevis var.G.-B. грамицидины
(5 форм)
Вас. polymixa полимиксины,
Вас. circulans колистины, грамотри-
циркулины цательных
(22 формы) бактерий
Полимиксин В(, циркулин А и колистин различаются по еди
ничным аминокислотам в циклах.
К циклопептидным антибиотикам относится также циклоспо
рин А, продуцируемый мицелиальными грибами Cylindrocarpum
lucidum и Tolypocladium inflatum-Bauveria nives (рис. 134). Приме
чательным качеством антибиотика является иммуносупрессивное
действие, в связи с чем его преимущественно используют в
трансплантологии, хотя он также проявляет антифунгальную ак
тивность.
Антибиотики-акти-
н о м и ц и н ы составляют
большую группу сходных ве
ществ, образуемых стрептоми-
цетами. Некоторые из них обла
дают противоопухолевым и им-
муносупрессивным действием.
По химическому строению их
относят к хромопептидам, со
Рис. 134. Продуцент циклоспорина
держащим феноксазиновую
А — Tolypocladium inflatum (сканирую хромофорную группу и два пен-
щий электронномикроскопический сни тапептида в форме циклических
мок, х20000). лактонов. На практике хорошо
известен актиномицин (дакти-
номицин), ингибирующий ДНК-зависимый синтез РНК.
Антибиотики-полиены
Продуцентами антибиотиков-полиенов являются стрептомице-
ты и некоторые мицелиальные грибы, образующие структуры с
439
четырьмя-семью сопряженными двойными связями (тетра-, пента-,
гекса- и гептаены). Из группы полиеновых антибиотиков в меди
цинской практике известны нистатин, фумагиллин (тетраены),
амфотерицин В (гептаен) и полусивтетический амфоглюкамин,
обладающие противогрибковым действием (преимущественно —
в отношении патогенных дрожжевых организмов и некоторых
других диморфных грибов); фумагиллин ингибирует стафилокок
ки, дизентерийную амебу, бактериофаги. Нистатин (продуцент
Streptomyces noursei) — аналог амфотерицина В, но в его цепочке
(позиции 20—27) содержится 4 конъюгированных двойных связей.
А н т и б и о т и к и -а н з а м и ц и н ы (от лат. ansa — ручка).
В их молекулах к ароматическому ядру присоединяется алифати
ческая анза-цепь. Анзамицины образуются актиномицетами и
некоторыми растениями. Из природных и полусинтетических ри-
фамицинов наиболее известными являются: рифоцин (рифампи-
цин SV), рифампицин и рифамид. Анзамицины — щирокоспект-
ральные антибиотики, ингибирующие бактерии, отдельные вирусы
и некоторые эукариотические клетки.
• Рифампицин (продуцент — Streptomyces mediterranei) расцени
вают одним из лучших химиотерапевтических средств при тубер
кулезе, проявляющим бактерицидное действие против
Mycobacterium tuberculosis. Он проникает в спинномозговую жид
кость и поэтому эффективен при туберкулезном менингите.
А н т и б и о т и к и - с т е р о и д ы — к ним относят фузидиевую
кислоту, изготавливаемую в виде натриевой соли. Она образуется
мицелиальным грибом Fusarium coccineum. Антибиотик активен
против многих типов грамположительных бактерий, особенно —
стафилококков.
Пр о ч и е антибиотики
Гризеофульвин — продуцируется нитчатым грибом Penicillium
griseofulvum и другими, активен против болезнетворных грибов-
дерматофитов. Он состоит из конденсированных колец А, В, С.
CI Трихотецин — образуется нитча
тым грибом Trichothecium roseum и
некоторыми другими несовершен
ными грибами. Это — антифунгаль-
ный антибиотик, полезный, прежде
ОСНз ОСНз всего, для ветеринарии и растение
водства. В своем составе содержит
гриэеофулмин гетероциклы.
440
осо— сн=сн—сн3
i«?>
трихотацин
Ферментационные процессы получения антибиотиков еще не
достигли того совершенства, которое могло бы быть обеспечено
благодаря компьютерной технике и пониманию физиологии про
дуцентов. Своеобразным тормозом совершенствования техноло
гии выступают сами клеточные популяции микроорганизмов, ко
торые изменяются качественно и количественно в'течение всего
продуктивного цикла. Поэтому не удается получать полностью
идентичных результатов даже в двух смежных ферментациях,
равно как и весь технологический процесс удается сравнительно
хорошо проводить лишь в периодическом режиме.
В главе 7 приведены технологические схемы производства
пенициллина и канамицина, поскольку предферментационные и
ферментационные стадии во многом подобны, то нет необходимо
сти рассматривать технологию производства каждого антибиотика
в отдельности.
Так как антибиотические вещества являются вторичными ме-
тоболитами, то биосинтез их сопряжен с переходом культуры
продуцента в идиофазу. Следовательно, здесь целесообразно ли
митирование роста продуцента. Таким лимитирующим ингредиен
том (фактором) при биосинтезе пенициллина выступает глюкоза,
тогда как при биосинтезе антибиотиков стрептомицетами — фос
фаты. Все это важно при "компановке" питательных сред, подкор
мке штамма - продуцента в процессе биосинтеза антибиотика. Так,
среда для продукции пенициллина (она же пригодна для накопле
ния инокулюма) включает глюкозу — 1,5%, лактозу — 5% (лактоза
снимает катаболитную репрессию глюкозы), аммония сульфат и
фосфаты — 0,5—1%, кукурузный экстракт — 2—3%, предшествен
ники антибиотика — фенокси- или фенилуксусная кислота —
0,3—0,6%, мел — 0,5-1%, пеногаситель — 0,5—1%; температуру
ферментации поддерживают на уровне 22—26°С при рН от 5,0 до
7,5 и аэрации 1 м3 воздуха на 1 м3 среды в 1 минуту; продолжи
тельность ферментации — 4 суток.
441
Так называемая "всеядность" актиномицетов обеспечивает им
способность расти и продуцировать антибиотики на средах, содер
жащих белки (соевая мука, рыбная мука, белок клейковины пше
ницы и пр.), крахмал. Тем не менее, применительно к каждому
продуценту имеются свои особенности, обычно отмечаемые в
регламентной документации. Например, посевной материал
Streptomyces kanamyceticus получают на соево-крахмальной среде
и на ней же проводят основную ферментацию при 27—28°С в
течение 4—5 суток при поддержании рН на уровне 7,1-7,6.
При ферментации Str. floridae (продуцент виомицина, или
флоримицина) рекомендуют среду, содержащую глюкозу или гид-
рол, соевую муку, кукурузный экстракт, нитраты, мел; температуру
поддерживают в пределах 27—29°С, рН на уровне 7,0—7,3.
В случае ферментации Str. erythreus в питательную среду
добавляют пропиловыи спирт, как предшественник антибиотика
эритромицина.
Продуцент нистатина Str. noursei интенсивно потребляет аммо
нийный азот (не нитратный), и т. д.
Перед выделением антибиотика из культуральной жидкости
необходимо отделить твердую, или плотную фазу от жидкой. В
этих случаях, как правило, используют фильтрацию. Качество
твердой фазы заметно сказывается на эффективности фильтрации.
Здесь можно отметить следующую закономерность — нативная
бактериальная масса фильтруется хуже мицелиальной. С учетом
того факта, что высшие актиномицеты способны формировать
нитчатые структуры, то их отделение при фильтрации происходит
несколько легче, чем других бактерий.
Пути улучшения фильтрации: обработка культуральных жид
костей электролитами, тепловая коагуляция, добавление фильтру
ющих наполнителей, кислотная коагуляция и некоторые другие.
Трудности выделения антибиотиков обусловлены многокомпо-
нентностью культуральных жидкостей и малой концентрацией в
них целевых продуктов. Так, пенициллин может накапливаться
примерно до 30 г/л при 8%-м выходе от субстрата. При этом сухие
выщества после отделения мицелия обычно составляют порядка
3—6%, из которых лишь 15—30% приходятся на антибиотик. Поэ
тому любую культуральную среду необходимо обрабатывать так,
чтобы антибиотическое вещество переходило в ту фазу, из которой
затем он будет наиболее полно выделен. В ряде случаев этого можно
добиться подкислением (тетрациклины) или, напротив, подщела-
чиванием культуральной жидкости (новобиоцин), добавлением
442
солей, щавелевой кислоты (эритромицин) и т. д., до или после
коагуляции и осаждения белков из нативных растворов.
Если для выделения антибиотика применяют ионный обмен, то
нативный раствор стремятся освободить от ионов-конкурентов
(растворимые оксалаты — для удаления ионов кальция; натрия
триполифосфат — для связывания ионов магния; желтая кровяная
соль — для комплексования ионов железа).
Антибиотические вещества, накапливающиеся в клеточной
биомассе в процессе ферментации микробов-продуцентов, выде
ляют другими методами, нежели антибиотики, содержащиеся в
культуральной жидкости. В первом случае, как правило, необхо
дима экстракция каким-либо растворителем из нативных или
дезинтегрированных клеток (система "твердое тело-жидкость").
Примерная схема выделения целевого продукта (антибиотика)
из культуральной жидкости может быть представлена в следующем
виде (рис. 135). В приведенную схему должны быть внесены
соответствующие коррективы в зависимости от физико-химиче
ских характеристик целевого продукта и возможностей аппара
турного оформления процесса. В настоящее время все большее
распространение приобретают мембранные методы концентриро
вания и выделения различных веществ, хотя до сих пор в ряде
производств БАВ (включая антибиотики, например, пенициллин)
не удалось отказаться от традиционных способов выделения и
очистки целевых продуктов (экстракция в системе "жидкость-жид
кость", адсорбция на активированных углях, диализ).
Рис. 135. Примерная тех
нологическая схема выделе
ния антибиотика X из культу
ральной жидкости (КЖ): 1 —
предварительная обработка
КЖ, 2 — подготовка раство
ра, 3 — первый фильтр, 4 —
рнпомтю сборник первого фильтра, 5
— подготовка раствора для
фильтрации, 6 — дополни
тельная фильтрация, 7 — сте
рилизующая фильтрация, 8 —
коагуляция растворителем, 9
— предварительное осажде
ние, 10—промывание осадка,
И — вторичное осаждение,
12 — высушивание.
443
В сравнительном плане следует иметь в виду, что механическое
обезвоживание заметно дешевле термического и это сказывается
на себестоимости производимого продукта.
Широко используют методы хроматографии, например, при
выделении новобиоцина, стрептомицина и других антибиотиков.
В подобных случаях технологическая схема аппаратурного офор
мления процессов заметно упрощается.
9.3.4. Получение аминокислот. Аминокислоты играют большую
роль в здравоохранении, животноводстве и легкой промышленно
сти. По значению для макроорганизма аминокислоты подразделя
ют на заменимые и незаменимые. К незаменимым относят те
аминокислоты, которые не синтезируются в человеческом и/или
животном организме, они должны быть привнесены с пищей или
кормом для животных (таблица 46).
Т а б л и ц а 46. Незаменимые в заменимые аминокислоты
Незаменимые Заменимые
Аргинин (только для молодых Алании
растущих животных)
В алии Аспарагин
Гистидин Аспарагиновая кислота
Изолейцин Глицин
Лейцин Глутамин
Лизин Глутаминовая кислота
Метионин Пролин
Треонин Серии
Триптофан Тирозин
Фенилаланин Цистеин
Микроб — продуцентаминокислоты
культивирование в жидкой
1 ступень питательной среде
Биосинтез предтеств! анников аминокислоты и
ферментов, катализи]: ующих биосинтез целевого
продукта
биосинтез целевого продукта с
II ступень участием ферментов
Аминокислс та — целевой продукт
Если ферменты биосинтеза аминокислоты накапливаются
внутриклеточно, то после 1-й ступени клетки сепарируют, дезин
тегрируют и применяют клеточный сок. В других случаях для целей
биосинтеза целевых продуктов применяют непосредственно клет
ки.
Экономически целесообразными являются способы получения
аминокислот с помощью иммобилизованных ферментов и клеток.
Сравнительно давно реализован процесс получения L-аспарагино-
вой кислоты из фумаровой и аммиака в одну стадию с помощью
иммобилизованных клеток E.coli или Pseudomonas aeruginosa, об
ладающих аспартазной активностью (Е):
NH,
НС СООН . |
И » NHi— »> НООС—СН«—СН—СООН
л
ноос—сн
фуюровая mcram аспарапмомя шею»
nfJ ?"» . г»
L J L сн=сн—с=сн—сн=сн— с=сн—сн2он
сн,^сн3
аимымнА1
Gluconotoader oxydans
HOH;C(CH0H)4CH?0H
И
процесс
нон£со(снон),сн,он- .»(5о—с=с—Ъ— с-сн,ои
(трансформация) 1 1 1 ]
Ucopo= M OK ОН Н ОН
, ижжорбиношая кислота
453
Биологическая стадия процесса катализируется мембраносвя-
занной полиолдегидрогеназой, а последняя (химическая) включает
последовательно следующие этапы: конденсация сорбозы с диаце-
тоном и получение диацетон — L-сорбозы, окисление диацетон —
L-сорбозы до диацетон-2-кето-Ь-гулоновой кислоты, подвергаемой
затем гидролизу с получением 2-кето-Ь-гулоновой кислоты; послед
нюю подвергают энолизации с последующей трасформацией в
L-аскорбиновую кислоту.
Ферментацию G.oxydans проводят на средах, содержащих сор
бит (20%), кукурузный или дрожжевой экстракт, при интенсивной
аэрации (8—10 г 0 2 /л/ч). Выход L-сорбозы может достичь 98% за
одни-двое суток. При достижении культурой log-фазы можно
дополнительно внести в среду сорбит, доводя его концентрацию
до 25%. Также установлено, что G.oxydans может окислять и более
высокие концентрации полиспирта (30—50%), создаваемые на
последних стадиях процесса. Это происходит благодаря полиолде-
гидрогеназы, содержащейся в клеточной биомассе. Ферментацию
бактерий проводят в периодическом или непрерывном режиме.
Принципиально доказана возможность получения L-сорбозы из
сорбита с помощью иммобилизованных клеток в ПААГ.
Аскорбиновую кислоту используют как антиоксидант в здра
воохранении и пищевой промышленности.
Цианкобаламин, или витамин В12— получают только микроби
ологическим синтезом. Его продуцентами являются прокариоты и,
прежде всего, пропионовые бактерии, которые и в естественных
условиях образуют этот витамин. Мутанты Propionibacterium
shermanii M-82 и Pseudomonas denitrificans M-2436 продуцируют на
жидкой среде до 58—59 мг/л цианкобаламина.
Учитывая важную функцию витамина в организме человека
(он является противоанемическим фактором), его мировое произ
водство достигло 10 т в год из которых 6,5 т расходуют на
медицинские нужды, а 3,5 т — в животноводстве.
Отечественное производство цианкобаламина базируется на
использовании культуры P.freudenreichii var. shermanii, культиви
руемой в периодическом режиме без доступа кислорода. Фермен
тационная среда обычно содержит глюкозу, кукурузный экстракт,
соли аммония и кобальта, рН около 7,0 поддерживают добавлением
NH4OH; продолжительность ферментации 6 суток; через 3 суток в
среду добавляют 5,6-диметилбензимидазол — предшественник ви
тамина В12 и продолжают ферментацию еще 3 суток. Цианкобала
мин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции по
454
выделению витамина заключаются в следующем: сепарирование
клеток, экстрагирование водой при рН 4,5—5,0 и температуре
85—90°С, в присутствии стабилизатора (0,25% раствор натрия
нитрита). Экстракция протекает в течение часа, после чего водный
раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натра, добав
ляют коагулянты белка — хлорид железа трехвалентного и алю
миния сульфат с последующим фильтрованием. Фильтрат упари
вают и дополнительно очищают, используя методы ионного обмена
и хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина
при 3—4°С из водно-ацетонового раствора.
Кристаллический цианкобаламин можно получать с помощью
резорцина или фенола, образующих с ним аддукты! которые
сравнительно легко разлагаются на составляющие компоненты.
При реализации данного биотехнологического процесса не
забывать о высокой светочувствительности витамина Bi2, поэтому
все операции необходимо проводить в затемненных условиях (или
при красном свете).
На ацетонобутиловой и спиртовой бардах с добавлением солей
кобальта и метанола в нашей стране получают кормовой препарат
КМБ 12 — концентрат, содержащий витамин В12 и другие ростовые
вещества. Биообъектом здесь является смешанная культура мета-
ногенных бактерий.
9.3.6. Получение микробных препаратов — удобрителей почв,
стимуляторов и регуляторов роста растений. На основании более
чем векового изучения азотфиксирующих микроорганизмов ут
вердилось представление о целесообразности производства в про
мышленных масштабах лишь клубеньковых бактерий, поскольку
эффективность от внесения в почву препаратов из свободноживу-
щих азотфиксаторов по разным причинам является незначитель
ной. Однако ясно, что в условиях интенсивного земледелия и
бурного роста населения земли плодородие почвы — одна из
главнейших проблем, на решение которой должны быть направ
лены усилия различных специалистов, включая биотехнологов. И
нельзя считать, что свободноживущие азотфиксаторы не будут
вновь объектами биотехнологии. Очевидно не все изучено приме
нительно к их ассоциативным взаимоотношениям в среде обитания
и значение самой среды, заметно изменяющейся при энергичном
воздействии на нее человека.
Микроорганизмы, фиксирующие азот из воздуха, подразделя
ют на свободноживущие в природных условиях и на симбйотиче-
ские с растениями или другими микробами. К свободноживущим
455
относят азотобактеры, актиномицеты, определенные цианобакте-
рии и др., к микробам-симбионтам: азотоспириллы — симбионты
папоротника азолла, ризобии — симбионты бобовых растений,
отдельные виды цианобактерий в составе лишайников (лишайники
представляют собой пример устойчивого симбиоза некоторых
грибов с цианобактериями или водорослями), и др.
Микробы-азотофиксаторы ежегодно фиксируют примерно
17,5« 107 т молекулярного азота из воздуха, из которых 10—15%
приходится на цианобактерий. Очевидно, что до тех пор, пока не
будут созданы "молекулярные гибриды" микробов — азотофикса-
торов с широким набором полезных растений методами генной
инженерии, использование соответствующих "препаратов-удобри
телей" будет целесообразным и экономически оправданным.
В таком же ряду находятся микробные стимуляторы и регуля
торы роста растений — гиббереллины, фузикокцин и др.
Ризотрофин — своеобразный "потомок" коммерческого пре
парата "нитрагин", впервые созданного в 1896 г. в Германии. Он
представляет собой торфяную основу, смешанную с ризобактери
ями (5—8*109 клеток в 1 г торфа). Производство ризотрофина
разработано во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г.
Санкт-Петербург).
Технологический процесс производства ризотрофина включает
подготовку клубеньковых бактерий и получение инокулята, подго
товку торфа, "обсеменение" торфа ризобактериями (отбор видов'
с учетом целесообразных рекомендаций по выращиванию соответ
ствующих растений-"хозяев").
В производстве используют клубеньковые бактерии, быстро
или сравнительно медленно размножающиеся на простых средах,
содержащих растительные экстракты или отвары, сахарозу (рН
6,8—7,0) — для первых, почти то же самое — для вторых, но
добавляют глюкозу, маннит, сахарозу.
Инокулюм готовят в условиях умеренной аэрации на подобных
средах, но дополнительно вводят неорганические соли: фосфаты,
сульфаты, карбонаты (температура 28—30°С); необходимо пенога-
шение. Накапливают примерно 5 млрд клеток в 1 мл. Такую
суспензию вносят в "кислый" торф (рН 3,0—6,0) при 10-15°С.
Предпочтительнее использовать древесно-осоковые или осоковые
торфа с удельной площадью поверхности порядка 300 м2/г.
Торф до "обсеменения" бактериями должен быть специально
подготовленным —гомогенным, подсушенным, размолотым, ув
лажненным, смешанным с мелом, расфасованным в полиэтилено-
> 456
вые пакеты по 150—160 г и простерилизованным методом радиа
ционного облучения — 2,5 Мрад. В подготовленный торф "инъе
цируют" 50-60 мл суспензии бактерий (в торфе должно содержать
ся 0,5—1 млрд. клеток/г). После этого содержимое пакетов пере
мешивают во вращающемся барабане и продукт сохраняют до
полугода при 5—10°С — применительно к быстро растущим ризо
бактериям и при 12—15°С — применительно к медленно растущим
ризобактериям. Расход ризотрофина — 200 г на гектарную норму
семян любых бобовых растений.
В странах Юго-Восточной Азии используют цианобактерии
Anaboena azollae, обитающие в полостях листьев папоротника
Azolla. Азоллу выращивают в специальных прудах, откуда ее
вывозят по назначению. Такая симбиотическая ассоциация —
хороший "удобритель" азотом рисовых полей.
В последние годы много внимания уделяют бактериям рода
Asospirillum — активному азотофиксатору, обитающему в почве
(реже — на надземной части растений) в ассоциации с кукурузой,
просом, сахарным тростником и др.
Гибберелловая кислота — синтезируется микромицетом
Gibberella fujikuroi (ее несовершенная форма Fusarium
moniliforme); она в качестве равноправного члена находится в ряду
гиббереллинов Al..., A — группы растительных гормонов сложного
химического строения, ядром которых является тетракарбоциклич-
ный гиббан. Его образование представляет собой частный случай
биосинтеза терпенов, как и синтез каротинов и витамина D.
NH4OH
?нз . н3сосон2с
CH j = C H — С—О—С.Н. J
сн,—сн
сн
^ пнЛ. Х*т-снгОсоснз
сн
фузикокцин 3
абсцизовая кислота
о
котиленин
I Фермент Продуцент
Гидролазы
Гликозидазы:
П е н и ц и л л и н а з а Eschericliia coli
(пеницилдинацилаза,
пенициллинамидаза)
467
Другие белки и белковые продукты.
Токсины и анатоксины. Отдельные виды болезнетворных мик
роорганизмов образуют экзотоксины, которые могут быть отнесе
ны к "факторам агрессии". Они представляют собою высокополи
мерные термолабильные белки — продукты матричного синтеза,
секретирующиеся в окружающую среду. При попадании в орга
низм человека экзотоксины вызывают серьезные повреждения
функций определенных тканей или систем. Например, столбняч
ный токсин относят к числу нейротоксинов, нарушающих функ
цию нервно-мышечного аппарата; гангренозные токсины являются
некротоксинами, индуцирующими повреждение тканей; экзоток
сины определенных штаммов кишечной палочки повреждают ки
шечник и т. д. По механизму действия на ткани они сходны с
ферментами. Некоторые токсины применяют для диагностики
соответствующих заболеваний. Например, токсин дифтерийный
рекомендуют для постановки внутрикожной реакции Шика. Ток
син изготавливают по обычной схеме выделения экзобелков из
жидких питательных сред после выращивания определенных
штаммов дифтерийных бактерий. Препарат для реакции Шика
готовят из очищенного дифтерийного токсина, разводя его глице
рин о-желатиновой смесью до необходимой концентрации (1/40
часть одной смертельной дозы для морских свинок — одна Шик-
доза). Выпускаемый препарат — бесцветная прозрачная жидкость
в ампулах по 1 мл. Срок годности — 2 года, хранят при 3—10°С.
Обработка экзотоксинов формалином сопровождается их пол
ным обезвреживанием при сохранении антигенных свойств. Обез
вреженные токсины называют анатоксинами, или токсоидами. Их
используют для получения антитоксических сывороток (глобули
нов) . В практике здравоохранения находят применение следующие
анатоксины: ботулинический, гангренозный, дифтерийный, стафи
лококковый, столбнячный.
Технология получения экзотоксинов включает следующие ста
дии: культивирование соответствующего штамма патогенного мик
роба-продуцента на определенной питательной среде и при опти
мальных режимах (рН, температура, аэрация или анаэробиоз,
продолжительность выращивания), обезвреживание формалином
при 37—40°С, сепарирование клеток (отход) от культуральной
жидкости, содержащей анатоксин; очистка, концентрирование,
добавление адсорбента, фасовка, упаковка.
В качестве адсорбентов обычно используют неорганические
вещества — алюминия гидроксид, алюминия фосфат, кальция •
468
фосфат и т. п. (в России применяют гидроксид алюминия), которые
создают депо в организме при введении анатоксинов. Таким
образом, удается повысить эффективность иммунизации.
Очищенные адсорбированные анатоксины — это жидкие пре
параты-суспензии, расслаивающиеся на белый, светло-коричне
вый или желтоватый осадок и прозрачную надосадочную жид
кость.
Ботулинические и гангренозные анатоксины применяют для
иммунизации лошадей в целях получения специфических лечеб
ных иммунопрепаратов.
Дифтерийный анатоксин рекомендуют в качестве профилак
тического антидифтерийного средства для активной иммунизации.
Его выпускают в виде монопрепарата и в составе ассоциированных
вакцин и в каждом из них токсин адсорбирован на гидроксиде
алюминия. Монопрепарат— адсорбированный дифтерийный, или
АД-анатоксин — представляет собой очищенный концентрирован
ный продукт, содержащий в 1 мл 60 антигенных (флоккулирующих)
единиц анатоксина и не свыше 2 мг адсорбента. Флоккуляция —
это реакция взаимодействия дифтерийного анатоксина или токси
на с антитоксином (иммунной сывороткой). Флоккулирующая
единица — это минимальное количество антигена (токсина), обра
зующего флоккулят (от лат. flocculi — клочок).
АДС-анатоксин — это ассоциированный препарат из очищен
ных концентрированных дифтерийного и столбнячного анатокси
нов, адсорбированных на А1(ОН)3 и содержащих в 1 мл 60 анти
генных единиц дифтерийного анатоксина и 20 единиц (антиток-
синсвязывающих) столбнячного анатоксина и не более 2 мг адсор
бента. Известен и другой вариант препарата с содержанием в 1 мл
тех же ингредиентов в соотношении 1:1, адсорбент, как и в первом
варианте.
АКДС-вакцина - ассоциированный препарат, включающий те
же вещества, что и АДС-анатоксин, а также коклюшную вакцину.
В 1 мл такой вакцины содержатся дифтерийный и столбнячный
анатоксины по 30 и 10 антигенных единиц соответственно, не более
2 мг алюминия гидроксида и 20 млрд. клеток коклюшных бактерий,
убитых формалином или мертиолатом. Мертиолат используют как
консервант в концентрации 0,01%; в 0,5 мл вышеназванных пре
паратов содержится одна прививочная доза. Перед употреблением
их необходимо взбалтывать. Форма выпуска — ампулы с 1 мл
препарата. Хранят ампулы с АД- и АДС-анатоксинами при 3—10°С
до 3 лет (срок повторного контроля и определения возможности
469
дальнейшего хранения еще в течение 1 года). Что касается АКДС-
вакцины, то ее срок хранения в тех же условиях сокращается в 2
раза, т. е. до 1,5 лет с вероятностью продления его на 6 месяцев
после переконтроля. Прививки делают согласно схеме, утвержден
ной МЗ России.
В 1994 г. в Канаде введена в практику пентавалентная вакцина
против коклюша, дифтерии, столбняка, полиомиелита и заболева
ний, вызванных гемофильной палочкой серотипа b(Hib).
Дифтерийный анатоксин, как монопрепарат используется так
же для гипериммунизации лошадей в целях получения лечебной
противодифтерийной сыворотки, содержащей антитоксический
иммуноглобулин.
Профилактику столбняка осуществляют либо одним столбняч
ным анатоксином (20 ЕС в 1 мл с адсорбентом), либо в ассоциации
с другими препаратами, в частности, его применяют в составе
АДС-анатоксина и АКДС-ващины (см. выше), а также в составе
ТАВТе-вакцины — "химической" сорбированной тифо-паратифоз-
но-столбнячной вакцины, содержащей по 0,2 мг брюшнотифозного
и А-паратифозного, 0,25 мг В-паратифозного антигенов, 10 ЕС
столбнячного анатоксина и 1,5—2 мг А1(ОН)3. Выпускают во фла
конах, содержащих 8 мл препарата для инъекций, и консервант
мертиолат. Срок хранения — 3 года при 8—10°С (срок переконт
роля с возможностью хранения еще в течение 1 года). Иммуниза
цию людей проводят по схеме, утвержденной МЗ России.
Столбнячный анатоксин, реже — токсин используют для ги
периммунизации лошадей в целях изготовления противостолбняч
ной сыворотки, содержащей антитоксический иммуноглобулин.
Иммунопрепарат используют в качестве лечебного и экстренно-
профилактического средства.
Стафилококковый анатоксин представляет собой стерильный
фильтрат бульонной культуры золотистого стафилококка, содер
жащий экзотоксин, обезвреженный формалином. Количество ток
сина в такой жидкости должно быть не менее 5 ЕС в 1 мл препарата;
консервант не добавляют. В готовом виде нативный стафилокок
ковый анатоксин — прозрачная желтоватая жидкость для подкож
ного введения. Форма выпуска — ампулы по 2 мл. Из этого
анатоксина получают очищенный адсорбированный анатоксин
осаждением трихлоруксусной кислотой с последующей очисткой
этанолом и адсорбцией на гидроксиде алюминия. В 1 мл препара
та-суспензии содержится 10 ЕС.
470 '
Токсические белки энтомопато генных
бацилл.
Некоторые энтомопатогенные бациллы применяют в качестве
биологических средств защиты и борьбы с вредными насекомыми
(от греч. entomon-насекомое). К их числу относят Вас. popilliae и
Вас. thuringiensis, образующих в процессе спорообразования так
называемые параспоральные белковые кристаллы. Синтез такого
белка находится под контролем промотора гена, содержащегося в
плазмиде.
Вас. popilliae способна вызывать хроническое инфекционное
заболевание у насекомого, передающееся другим особям и распро
страняющееся среди популяции.
Вас. thuringiensis токсический параспоральный белковый кри
сталл действует на вредных насекомых как пестицид. К сожалению,
во внешней среде этот токсин длительно не сохраняется, поэтому
требуются повторные обработки данной культурой территорий с
вредными насекомыми.
Вас. popilliae и родственные ей микробы (Вас. lentimorbus, Вас.
euloomarhae и др.) индуцируют так называемую молочную болезнь
у жуков-скарабеев. Эти виды бацилл трудно культивировать на
искусственных питательных средах, но все же удается, если под
держивать анаэробные условия. Собирают спорулирующую массу,
споры сепарируют, смешивают с наполнителем, фасуют и упако
вывают. Применяют в виде порошка - дуста. Споры Вас. popilliae
заглатываются личинками насекомых, прорастают в кишечнике и
делятся, давая потомство. Бактерии попадают в гемолимфу и через
10 дней у насекомых возникают признаки молочной болезни.
Клетки затем спорулируют, образуя к моменту гибели одной
личинки порядка 5«109 спор.
Препарат на основе Bac.popilliae длительное время изготавли
вают в США в целях контроля численности японского жука—
Popillia japonica.
В России изготавливают препараты (дендробациллин, инсек-
тин, токсобактерин, энтобактерин-3 и др.) на основе Вас.
thuringiensis. Данный вид микроба образует два токсина — р и 6,
из которых Р-экзотоксин обладает широким спектром действия на
насекомых; он представляет собой адениннуклеотид, конкурентно
ингибирующий ферменты, которые катализируют реакции гидро
лиза АТФ и пирофосфата.
471
При введении Р-токсина млекопитающим животным он оказы
вается для них губительным. Поэтому в производстве используют
штаммы, не продуцирующие Р-экзотоксин, но образующие 8-ток-
син, который и представляет собой белковое кристаллическое
вещество - "параспоральное тело" - правильный восьмигранник.
Чтобы проявить токсичность, 6-токсин должен попасть в кишечник
личинок насекомых прежде всего - листогрызущих из отряда
чешуекрылых Lopidoptera), где растворяется в щелочной среде и
частично гидролизуется протеазами. Такой модифицированный
белок взаимодействует со стенкой кишки и изменяет ее так, что
содержимое кишечного тракта попадает в кровоток, вызывая
общий паралич. Смерть личинок наступает от септицемии.
5-Токсин безвреден для млекопитающих животных, человека,
птиц. В литературе о Вас. thuringiensis описано более 20 серотипов
(сероваров) микроба и 15 вариантов 5-токсина, часть из которых
имеет промышленное значение, например, thuringiensis или
berliner(I), alesti(III), dendrolimus(IV), galleria(V) и др.
Коммерческие препараты представляют собой сумму спор и
белковых кристаллов в клетках микроба-продуцента.
Технология получения энтомопатогенных препаратов включает
следующие стадии: 1) проверка маточной культуры на отсутствие
свободного фага, продуктивность спор и кристаллов, на вирулен
тность; 2) выращивание культуры в колбах до титра спор не менее
1,7* 109 в 1 мл; 3) пересев культуры из колб в посевной аппарат
(0,05% на объем среды); 4) засев посевным материалом основного
ферментатора (вносят 0,0012% инокулюма от объема среды в
биореакторе). Продолжительность выращивания в посевных и
головных ферментаторах - 35-40 часов при 28-30°С (исходное
значение рН 6,3) до получения указанной выше плотности спор в
1мл среды. В процессе культивирования среда защелачивается до
рН 8, 0-8, 5, поэтому перед тем, как передать ее на сепарирование,
рН доводят до 6,0-6,2 подкислением. После сепарирования получа
ют пасту (в среднем 100 кг из 1м3 культуральной жидкости) с
влажностью 85% и содержанием спор 2 • 1010 в 1 г.
Готовый продукт может быть в виде стойкой вязкой жидкости
кремового или светло-серого цвета, без запаха •< она содержит
наполнитель — кристаллическую микроцеллюлозу; другой вариант
- смачивающий порошок, приготовленный после высушивания на
распылительной сушилке (остаточная влажность 10%) и смешения
с каолином. Концентрация спор в препаратах 3 • 109 в 1 г.
472
Белки одноклеточных и многоклеточ
ных микроорганизмов
На белки приходится часть сухих веществ микробной клетки
от 19 до 90% (таблица 48).
Т а б л и ц а 4 8 . Содержание белка (% от сухой массы) в клетках
некоторых бактерий и грибов
Hansenula suaweolens 53
Содер
Название и назначение жание Продуцент Источник углерода
белка, %
А—полисахарид С—полисахарид
ультрацентри—
фугирование
Надосадок полисахарида С
+ этанол (4 объема) +
Осадок полисахарида А Осадок полисахаридаС
промывание этанолом, ацетоном;
высушивание над СаСЦ
483
В США изготавливают полисахаридные вакцины из некоторых
видов Pseudomonas (в частности, P. fluorescens).
Р и б о с о м а л ь н ы е в а к ц и н ы . У прокариот рибосомы
содержат примерно 60% РНК и 40% белка, у эукариот — 55% и 45%
соответственно. В стационарной фазе размножения бактериальная
клетка содержит 104 рибосом; это число возрастает в период
log-фазы. Впервые рибосомальный препарат из авирулентного
штамма Mycobacterium tuberculosis приготовили Юманс А. С. и
Юманс Г. П. (1965). Рибосомы в чистом виде не применяют в
качестве вакцин, но обогащенные ими полисахаридные и другие
антигенные препараты используют на практике. Наиболее извест
ный из них "Рибомунил D-53", выпускаемый во Франции. Он
включает рибосомы из клеток Klebsiella pneumoniae, Streptococcus
pneumoniae, S. pyogenes и Haemophilus influenzae с добавлением
протеогликана из К. pneumoniae: Применяют рибомунил интрана-
зально. Его рекомендуют для профилактики заболеваний дыхатель
ной системы и для лечения ринитов, риносинусйтов и ринофарин-
гитов — в особенности.
Известен препарат в виде экстракта из клеток Streptococcus
mutans, обогащенный рибосомами. Схема его приготовления сле
дующая:
Streptococcus mutans серотип g, нативные клетки — 100 г
1
Дезинтеграция клеток с помощью стеклянных бус — баллотини
(100 г) в 100 мл 10"2 М фосфатного буфера (рН 7,4) с 10"2 М МдС12
(РМВ) и 3 мкг ДНК-азы/мл.
1-
Неразрушенные клетки и остатки клеток отделяют низкоско
ростным центрифугированием (дважды по 10 мин. при 27000 g и
47000 д).
1
Рибосомы отмывают 5 раз в РМВ в течение 2,5 часов при 250000
д с последующим двухкратным центрифугированием в течение 20
мин. при 47000 д, а затем фильтруют через стерильный мембран
ный фильтр (0,45 мкм).
1
Препарат-экстракт S.mutans, обогащенный рибосомами.
В Японии для предупреждения коклюша у детей используют
вакцину из филаментозного гемагглютинина и лимфоцитстимули-
рующего фактора из Bordetella pertussis.
484
Вакцины из продуктов метаболизма патогенных микроорга
низмов
А н а т о к с и н ы (токсоиды) — см. раздел "Токсины и
анатоксины" в данной главе.
Вакцины вирусные.
По аналогии с бактериальными вакцинами вирусные также
подразделяют на ж и в ы е и и н а к т и в и р о в а н н ы е . Для
приготовления обоих типов вирусных вакцин необходимо нако
пить вирусный материал (вирионы), используя либо куриные
эмбрионы, либо культуры тканей из почек обезьян, куриного
эмбриона, диплоидных клеток человека. Так вакцинный вирус
гриппа (авирулентный) накапливают в аллантоисной жидкости
эмбриона, которую затем отсасывают и центрифугируют. Если
предполагают готовить живую вакцину, то вирус суспендируют и
разводят до нужной концентрации и подвергают лиофильному
высушиванию.
Для получения вакцины против желтой лихорадки также зара
жают куриный эмбрион, в нервных тканях которого накапливается
патоген (аттенуированный штамм 17 D). Последующие этапы
технологии получения вакцины заключаются в гомогенизации
эмбриона в стерильной воде, получают "пюре", которое центрифу
гируют, осадок представляет отход, а надосадочную жидкость,
содержащую вирус, лиофильно высушивают.
Культуры тканей, зараженные вирусами, выращивают в жид
ких средах, поэтому вирусный материал можно получить после
фильтрации культуральной жидкости. Учитывая тот факт, что
вакцинные штаммы вирусов являются, как правило, аттенуирован-
ными, то стадия инактивации при их изготовлении отпадает сама
собой. Однако, имеются исключения из этого правила — вакцины
против бешенства и полиомиелита; первую инактивируют 3-про-
пиолактоном, вторую — либо Р-пропиолактоном, либо формали
ном.
Очищенный вирусный материал, готовый для приготовления
вакцин, или готовые вирусные вакцины сохраняют при -70°С.
Вирусные вакцины не сочетают в себе разные виды, но,
например, инактивированная и живая полиомиелитные вакцины
или убитая гриппозная вакцина почти всегда содержат разные
серотипы вирусов.
Живые ослабленные вирусные вакцины в виде суспензий
теряют свою потенциальную активность достаточно быстро, поэ
тому их сохраняют либо в замороженном состоянии, или добавля
ют стабилизаторы — сахарозу, магния хлорид.
Живыми вирусными вакцинами являются: гриппозные интра-
назальные для детей и взрослых (профилактические), гриппозная
пероральная для детей и взрослых (лечебно-профилактическая),
485
против желтой лихорадки, коревая, против краснухи, полиомие-
литная пероральная, против свинки.
К инактивированным вирусным вакцинам относятся: антира-
бические сухая МИВП и типа Ферми, против клещевого энцефа
лита.
С у б ъ е д и н и ч н ы е , или р а с щ е п л.е и н ы е в а к
ц и н ы . Такие вакцины можно получать из оболочечных вирусных
конъюгированных или неконъюгированных белков. Пока внедре
на в производство лишь субъединичная гриппозная вакцина, вклю
чающая гликопротеин-гемагглютинин из одного или нескольких
штаммов вируса. Клиническим, испытаниям подвергаются вариан
ты субъединичных вакцин вируса иммунодефицита человека, уси
ленные мурамилди- и мурамилтрипептидами.
Технология получения гемагглютинина из гриппозных вирио-
нов заключается в следующем: накопленный вирусный материал
в аллантоисной жидкости куриного эмбриона сепарируют, подвер
гают микрофильтрации и фильтрационному концентрированию
примерно в 50 раз, при необходимости дополнительно очищают
ультрацентрйфугированием в градиенте плотности сахарозы; кон
центрированный вирионный материал обрабатывают катионным
ПАВ и отделяют гемагглютинины ультрафильтрацией с последую
щими диализом и стерилизующей фильтрацией. На последней
стадии стандартизируют и контролируют субъединичную вакцину
(особенно — на отсутствие живых гриппозных вирусов).
Генно-инженерные вакцины
Биотехнология таких вакцин базируется на возможности пере
носа фрагментов хромосомной ДНК или плазмид из бактерий или
вирусов в клетки других видов бактерий или дрожжей, то есть не
в природные для них реципиентные клетки. Таким путем создана
возможность продукции поверхностного антигена вируса гепатита
В (HBsAg) дрожжевыми клетками. Этот антиген отделяют от
дрожжей-продуцентов и используют для приготовления вакцины.
рДНК-биотехнология в этом направлении "становится на ноги"
и за ней большое будущее на пути создания генно-инженерных
вакцин, а также белковых иммуногенов и других белков, включая
стафилококковый белок А и стрептококковый белок М.
На подходе к широкому внедрению вакцины против некоторых
протозойных инфекционных заболеваний (например, малярии).
Диагностикумы
Диагностические приемы при инфекционных заболеваниях
могут быть сведены к серодиагностике, аллергодиагностике и
фагодиагностике, если иметь в виду лишь использование биопре
паратов. Серодиагностику выполняют с сыворотками крови, при
меняя соответствующие антигенные препараты, называемые
д и а г н о с т и к у м а м и ; аллергодиагностику проводят в форме
486
аллергических проб с аллергенами на людях (на животных — в
эксперименте или при наличии у них инфекционных заболеваний);
фаги оценивают по логическому действию на чувствительные
клетки соответствующих видов бактерий. Аллергены и бактерио
фаги выделены в самостоятельные подразделы (см.).
Диагностикумы могут представлять из себя убитые клетки с
выраженной чувствительностью к специфическим антителам, а
также отдельные, хорошо изученные антигенные компоненты. Так
у энтеробактерий известны Н-, О- и\ Vi-антигены, из которых
первый термолабилен, второй и третий — термостабильны. На
этом основано их выделение из клеток. Жгутиковый Н-антиген
изолируют с помощью 0,2% раствора формалина спустя сутки после
его добавления и выдержки при 37°С; О- и Vi-антигены экстраги
руют при повышенных температурах водой или другими раство
рителями. Такие антигены используют как таковые или в адсор
бированном виде на эритроцитах, предварительно обработанных
таннином или формалином.
Бактериальные и эритроцитарные диагностикумы применяют
соответственно в реакциях агглютинации и гемагглютинации.
Для диагностики сифилиса выпускают кардиолипиновый анти
ген для реакции микропреципитации. Этот антиген включает 3
очищенных липида: 0,03% 1,3-дифосфатглицерина (кардиолипин),
0,27% фосфатидилхолина (лецитин) и 0,9% холестерина в абсолют
ном этаноле. Препарат выпускают в ампулах по 2 мл. Срок
хранения — 4 год. Инактивированные вирусные диагностикумы
используют в реакциях связывания комплемента, нейтрализации
и торможения гемагглютинации.
Кроме вышеназванных диагностикумов производят: единый
бруцеллезный диагностикум из убитых фенолом бруцелл и под
крашенный метиленовым синим; гриппозный диагностикум в виде
взвеси инактивированных формалином или мертиолатом вирионов
в аллантоисной жидкости куриных эмбрионов; диагностикум инак-
тивированного вируса клещевого энцефалита (суспензия мозга
белых мышей, зараженных этим вирусом); эритроцитарный Vi-ди-
агностикум, содержащий Vi-антиген Salmonella typhi, и О-диагно-
стикум сальмонеллезный, включающий О-антиген из разных групп
сальмонелл.
Аллергены
Аллергень! по своему происхождению подразделяют на микро
бные, растительные и животные. Их используют для диагностики
патологических: процессов, в развитии которых заметную роль
играет сенсибилизация макроорганизма соответствующим антиге
ном-аллергеном.
Микробные аллергены изготавливают разными способами. На-
тивные аллергены — это взвесь убитых бактерий и растворимых
487
продуктов их метаболизма; очищенные аллергены — это осажден
ные и лиофильно высушенные термостабильные фракции фильт
ратов 5—6 суточных бульонных культур бактерий, в которых
содержатся свыше 80% белков, около 7% углеводов и до 10%
нуклеиновых кислот.
К разряду бактериальных относятся аллергены: антраксин,
бруцеллин, дизентерии, дифтероида, листерийный, малеин, ката
ральной нейссерии, лепромин, орнитозный, палочки дифтерийной
нетоксигенной, кишечной палочки, ложнодифтерийнрй палочки,
синегнойной палочки, пестин, стафилококковые видовые, стреп
тококковые видовые, токсоплазмин, энтерококковый, альттубер-
кулин Коха, туберкулин очищенный (PPD-Л), туберкулин очищен
ный сухой (PPD), тулярин и др.
Грибковые аллергены обычно выделяют из клеток зрелых
культур, реже — из культуральных жидкостей. Они представляют
собой белково-углеводные комплексы. Выпускают их в ампулах по
1 мл.
Из грибковых аллергенов известны: бластомицин, гистоплаз-
мин, кандидин, кокцидиоидин, а также аллергены из некоторых
плесневых грибов (аепергиллов, пенициллов) и дерматофитов.
Бактериофаги
Бактериофаги используют для фаготипирования бактерий и с
лечебно-профилактическими целями.
Для индикации бактерий изготавливают так называемые видо
вые и типовые фаги: брюшно-тифозные Vi-типовые, дизентерий
ные индикаторные, паратифозные В-типовые, сальмонеллезный
идикаторный, стафилококковые типовые.
Фаги для профилактики и лечения инфекционных заболеваний
выпускают моно- и поливалентными, их нельзя подменять диагно
стическими фагами, равно как и наоборот — диагностические фаги
нельзя использовать вместо лечебно-профилактических фагов. Из
числа последних отечественные предприятия выпускают жидкие
моновалентные стафилофаги, стрептококковый фаг, фаг пиоциа-
неус, фаги протейный и коли-протейный, коли-фаг, поливалентный
дизентерийный (жидкий, сухой и в суппозиториях), поливалентные
сальмонеллезные (жидкий и сухой).
Производство фагов основано на заражении бактериофагами
чувствительных бульонных культур определенных видов и штам
мов. "Вегетация" фагов сопровождается при этом лизисом бакте
риальных клеток. От части нелизировавшихся клеток и клеточного
детрита освобождаются стерилизующей фильтрацией. Фаги про
ходят через фильтр, фильтраты тестируют по эталонным культурам
чувствительных бактерий.
В жидкие препараты лечебно-профилактических фагов можно
добавлять консерванты.
488
Глава 10.
ФИТОБИОТЕХНОЛОГИЯ
Фитобиотехнология — составная часть биотехнологии. Объек
тами ее являются клетки и ткани растений — фотоавтотрофных
эукариот, а также биоактивные молекулы растительного проис
хождения (ферменты, нуклеиновые кислоты, стероиды и некото
рые другие сложные органические вещества). Следует обратить
внимание на тот факт, что растительные клетки в культуре обычно
являются хемогетеротрофамй.
Название фитобиотехнология слагается из четырех слов гре
ческого происхождения: phyton — растение, bios — жизнь, teken
— искусство, logos — наука, слово. Следовательно, это наука об
использовании растительных объектов в технике и промышленном
производстве. На первый взгляд выращивание растений (злаковых,
лекарственных, декоративных и т. д.) в полевых условиях подпадает
под рубрику "фитобиотехнология", однако, как и с животными,
здесь отсутствуют специфические методы промышленного куль
тивирования цельных растений в биореакторах. Таким образом, к
фитобиотехнологическим процессам относят те из них, которые
базируются на клеточном уровне, если даже клетки несут генети
ческую информацию, воспринятую ими в результате генно-инже
нерного эксперимента,
Клетки и ткани высших растений, выращиваемые на питатель
ных средах in vifro в строго контролируемых условиях, все шире
используют в фитобиотехнологии. Общирное царство растений —
потенциально неограниченный источник клеток и тканей, которые
могут быть введены в культуру и, как следствие, существуют
неограниченные возможности для создания новых фитобиотехно-
логических процессов, в которых нуждается человечество.
В настоящее время царство растений на земном шаре включает
порядка 300 000 видов. От рационального и бережного отношения
к растениям зависит благополучное выживание человечества на
планете Земля.
Представители царства растений (Plantae)
Надцарство — Eucaryota
Царство — Plantae
Отделы: 1. Водоросли — Algae
Типы: а) Красные — Rhodophyta .
б) Золотистые — Chrysophyta
489
в) Желтозеленые — Xanthophyta
г) Диатомовые — Bacillariophyla
д) Динофлагелляты и криптомонады — Dinophyta
е) Бурые — Phaoephyta
ж) Зеленые — Chlorophyta
з) Эвгленовые — Euglenophyta
Некоторые биологи выделяют дополнительный
(девятый) тип пиррофитовых водорослей —
Pyrrophyta.
2. Печеночники и мхи — Bryophyta
3. Папоротники, плауны и хвощи — Pteridophyta
4. Семенные растения — Spermatophyta
Типы: а) Голосеменные — Gymnospermae
б) Покрытосеменные (цветковые) —
Angiospermae.
В таком смысле фитобиотехнология является "палочкой-выру
чалочкой", способной освободить отдельные регионы и страны от
импорта и интродукции растений, им не свойственных или совсем
неспособных культивироваться в неподходящих климатических
зонах. Это тем более резонно, когда речь идет о растениях —
продуцентах БАВ.
Хотя растительные клетки и ткани принадлежат к более диф
ференцированным организмам в сравнении, например, с бактери
ями, тем не менее они способны культивироваться в форме
неорганизованной клеточной массы ( к а л л у с ) . Каллусную ткань
можно "заставить" формировать зародышеподобные структуры,
почки, побеги, а на их основе — растения-регенеранты. Все это
происходит благодаря т.о т и п о ' т е н т н о с т и растительных
клеток (от лат. torus — все, целый, potentia — сила, потенция).
Понятие "тотипотентность" является клеточной характеристикой;
в нем отражен потенциал клетки воспроизводить все типы клеток,
присущих взрослому организму. Другими словами клетка обладает
способностью воспроизводить целый организм.
Если в качестве биообъекта применяют изолированный заро
дыш, меристему верхушечных или пазушных почек, то есть интег
рированную систему, то все получаемые растения-регенеранты
будут полностью соответствовать исходному растению, из которо
го была взята какая-либо интегрированная система из числа вы
шеназванных. Этим добиваются клонирования интересующих нас
растений (рис. 140).
_ 490
Исходный материал на Культура тканы
р а с т е ш и , выращиваемого I
традиционных методом J
Индукщя р о с т я быстро
го раямноыеяыя добавочных
мермстем (стеблевые апек-
ен ялы. ааредыво!] •непосред
ственно на родительской
тканы» а талые черва про
межуточный каллус ил*
J3« стекле - Раотенке - суспенаыониув культуру
мужской женский клеток
гаплоид гаплоид
Культуры тканей
Каллусная Почечная Другие клеточные линии
пролиферирующая
Возрастание веса Активное образование Активно растущий
каллуса почек или растеньиц каллус
Отсутствие Образование сильных Увеличение плотности
некротической ткани здоровых почек.без клеток
морфологических
аберраций
Внешне — — Выраженный рост
активный рост почек и корней
•A. "w?-"
флороглюцин
ОН О
кверцетин
рутин
г
г
1 2 3 4 5
Рис. 146. Перенос гена (а) из хромосомы (б) Escherichia coli в растение (5) с
помощью Т-ДНК (в) Ti-плазмиды (г) A.tumefaciens (2,3) в ядерную ДНК (д) расти
тельной клетки (4).
Разработаны векторные системы на основе растительных хло-
ропластов и митохондрий, ДНК которых имеют гомологичные
области с ядерной ДНК, что облегчает обмен участками между
ними при выполнении генноинженерных экспериментов.
Заманчивы в качестве векторных систем и транспозоны (см).
Их множество сулит многообещающие результаты в опытах с
однодольными растениями, устойчивыми к заражению агробакте-
риями и, следовательно, к восприятию Т-ДНК Ti-плазмиды.
В качестве векторов могут также использоваться вирусы рас
тений. Их нуклеиновые кислоты реплицируются и проявляют свои
функциональные свойства (экспрессируют) в клетках растений-
хозяев, где потенциал вирусов и воспринимающих клеток объеди
няется и реализуется в приумножении организованных частиц
патогена (например, для вируса мозаики табака в среднем 10'
частиц на клетку, для вируса мозаики цветной капусты — порядка
104 частиц на клетку).
Однако вирусы как векторы обладают четырьмя существенны
ми недостатками: они патогенны, их емкость небольшая, вирусы
не способны встраиваться в хромосомы растительных клеток, они,
в основном, видоспецифичны, то есть поражают определенный
круг растений — хозяев.
В качестве векторов могут быть использованы также и вироиды
(см.), представляющие собой однонитевые цепи ковалентно свя
занных кольцевых РНК, включающих 270—300 нуклеотидов, ли
шенных оболочки. Вироиды поражают виноград, картофель, коко
совую пальму, томаты и другие растения как по вертикали (через
17 т. 8524 513
зародышевые клетки), так и по горизонтали (распространяются по
растительному организму через клеточный сок или переносятся
механически).
Чтобы использовать вирусную (вироидную) РНК в качестве
вектора, необходимо выполнить следующие последовательные опе
рации (рис. 147).
Р Н К вируса (внронда)
516
гой), по которому возможно подтвердить достоверность получения
гибрида. В этом смысле удобны ауксотрофные мутанты.
Гетерокариотические соматические гибриды выделяют либо
вручную с помощью микроманипулятора, капиллярной пипетки и
шприца, либо автоматически на основе применения флуоресцен
тных систем.
Для биотехнологии также важна цибридизация, когда возника
ют гетерозиготы по внеядерным (цитоплазматическим) генам,
определяющим, например, устойчивость к гербицидам или признак
цитоплазматической мужской стерильности (рис. 148).
N H
•2Н
N »>
МН +2 Н?Р^.
уксусная 0,37 0
-40
£f трое охлаждение — клетка не
сжата, внутриклеточный лед,
-60 сг клетка не выживает, 5 - мед
ленное охлаждение — клетка
сжата, нет внутриклеточного
-80 h
льда, клетка выживает.
528
Чтобы уменьшить образование внутриклеточного льда в про
цессе охлаждения клеток, используют к р и о п р о т е к т о р ы
(в концентрации около 2 М) с разным механизмом действия. Они
снижают точки замерзания (точку плавления) и переохлаждения
воды (температура, при которой происходит гомогенная кристал
лизация льда), поднимают точку девитрификации раствора (тем
пература, при которой происходит исключение аморфности, стек
ловидное™ и когда начинается внезапная кристаллизация). Рас
твор остается аморфным, когда он охлаждается быстро, то есть
время, необходимое для роста кристаллов, ограничено. В этом
случае говорят, что раствор в и т р и ф и ц и р у е т с я . При
медленном нагревании такого раствора происходит выделение
тепла, совпадающее по времени и внезапной кристаллизацией или
девитрификацией.
К числу криопротекторов относят глицерин, гликаны, гликоп-
ротеины, ДМСО, сахарозу, ПВС, сыворотку крови и др. Их можно
использовать по отдельности или в смесях. Лучший способ стери
лизации растворов криопротекторов — мембранная фильтрация.
При получении культуры после криосохранения в парах азота
(-150°С) или в жидком азоте (-196°С) их оттаивание проводят
достаточно быстро в водяной бане при 35—40°С. После оттаивания
необходим тщательный уход за каждым образцом.
Установлено, что при криосохранении протопластов из многих
видов растений достигают 70—90%-й их выживаемости. При соче
тании медленного и ступенчатого замораживания и быстрого
оттаивания в качестве криопротектора рекомендуют 10% ДМСО.
Для криосохранения каллусов обычно применяют двух- или
трехкомпонентную смесь криопротекторов: 8% глюкоза, 10%
ДМСО и 10% ПЭГ (ММ 6 кДа).
В таблице 54 приведены различные типы культур растений и
применяемые условия их хранения.
Среди факторов, лимитирующих рост отдельных растений,
могут быть и ретарданты (от лат. retardatio — замедление), что
отмечено, например, для меристематических тканей паслена.
529
Т а б л и ц а 54. Способы хранения некоторых культур растительных тканей
Условия
Растение Тип культуры Криосохранение хранения,
лимитирующие
рост
Пыльник —196
Каллус —196
Зародыш —196
соматический/
клональныи регенерант
530
Продолжение табл. 54
Условия
, _ Тип культуры Криосохранение хранения,
< ГС) лимитирующие
рост
Каллус — Хранение
в условиях
недостатка
снабжения Ог
Кончики побегов — —
Пыльник —196 —
Суспензия клеток —196 —
Глава 11.
ЗООБИОТЕХНОЛОГИЯ
Зообиотехнология является ветвью биотехнологии. Принципи
альное отличие ее от микробной биотехнологии и фитобиотехно-
логии состоит в том, что объектами зообиотехнологии являются
клетки животных и человека. Наипростейшими животными суще
ствами клеточной организации являются протозойные организмы,
или Protozoa (от греч. protos — первый, zoon — животное, живое
существа), составляющие самостоятельный отдел в царстве
Animalia (таблица 55).
Т а б л и ц а 55. Представители царства Animalia
532
Из 65 тысяч видов Protozoa 55 тысяч являются свободно живу
щими в природе, а 10 тысяч ведут паразитический образ жизни.
Среди выделяемых ныне 9 типов простейших организмов
жгутиковым отводят место пограничных существ, являющихся
ближайшими предками многоклеточных животных и растений и
образующих мост между ними.
Поддержание Protozoa в культуре - дело достаточно сложное, •
однако многие виды удается выращивать на относительно простых
средах или на более сложных, рекомендованных для культивиро
вания клеток и тканей животных (например, среда № 199 и др.).
Для некоторых протозоиных видов целесообразно добавлять в
среды споровые бактерии (Вас. subtilis) и/или дрожжи
(Saccharomyces cerevisiae и др.). Это обусловлено их фагоцитарной
активностью.
С биотехнологических позиций попеременный интерес был
проявлен к препаратам круцин (Н. Г. Клюева, Г. И. Роскин) и его
аналогу — трипанозе (Ж. Кудер, Ж. Мишель-Брэн и др.), получа
емым с помощью Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi, астазилиду
(Н. Н. Сухарева-Немакова) — полусинтётическому продукту, вклю
чающему комплекс эфиров сахарозы и жирных кислот, выделен
ных из жгутиконосца Astasia longa, полисахаридам. В доклиниче
ских и клинических испытаниях они проявляли больший или
меньший противоопухолевый эффект. Однако из-за нестабильно
сти клинических результатов, неосвоенности крупномасштабного
культивирования Protozoa и некоторых других причин зообиотех-
нология в этом разделе мало продвинулась вперед.
Из всех других представителей царства животных наибольший
интерес представляют хордовые. Их подразделяют на два подтипа
— бесчерепные (Protochordata, или Acrania) и черепные, или
позвоночные (Craniata, или Vertebrata).. Всех черепных объединяют
в следующие классы: Cyclostomata (круглоротые), Pisces (рыбы),
Amphibia (земноводные), Reptilia (пресмыкающиеся), Aves (птицы)
и Mammalia (млекопитающие).
Значимость представителей царства животных в зообиотехно-
логии далеко неравноценная. Это связано с теми обстоятельствами,
что во многих случаях еще не разработаны способы культивиро
вания клеток не только в производственных, но и в лабораторных
условиях, или, как говорят, "еще не дошли руки" до конкретных
биообъектов животного происхождения, хотя техника однослой
ной культуры клеток впервые разработана еще в 1950 г. Ф. К.
Роббинсом и Дж. Ф. Эндерсом.
533
В настоящее время в промышленном масштабе освоены лим-
фобласты человека, продуцирующие интерферон, клетки-гибри-
домы, образующие моноклональные антитела; монослойные кле
точные культуры различных тканей, использующиеся, например,
для репродукции вирусов и т. д. Даже из этих немногочисленных
примеров можно заключить, что первостепенной задачей для
зообиотехнологических процессов является получение клеток и
клеточных культур.
11.1. Способы выращивания клеток животных. Любые клетки
животного организма происходят из оплодотворенной яйцеклетки,
которая со временем развивается и дифференцируется (рис. 151).
Зародышевый диск вклю
чает эктодерму, эндодерму
и мезодерму, из которых
впоследствии образуются
все ткани макроорганизма.
Но как только какую-либо
ткань перевести в культу
ру, то наступает дедиффе-
ренциация клеток и разли
чить их становится делом
трудным или невозмож-
Рис. 151. Эмбрион млекопитающего на ран- Н Ы М г и п о э т о м у р е г и с т р а -
ней стадии развития: 1 — зародышевый диск, 2 ц И Ю ^ в е д у т ПОЧТИ ИСКЛЮ-
- эктодерма, 3 - эндодерма, 4 - первичнвя ч и т е л ь н о п о п р о и с х о ж д е -
мезодерма, 5 - трофобласт. н и ю H a n p H M e p i д^ иссле.
I l i I i I
! ! ГО ' ГА1
дрот
подложка подложка
АС
а б
Рис. 153. Механизм адгезии животной клетки к субстрату (например, к
подложке), несущему положительные (а) и отрицательные (б) заряды (А — гликоп-
ротеиновый адгезии, стрелки — электростатические взаимодействия, пунктиры —
связывание при участии двухвалентных катионов; АС — адсорбционный слой,
равный приблизительно 5 нм).
543
Т а б л и ц а 55. Накопление клеток L 1210 при периодическом и непрерывном
культивировании (по М. Ж. Тови, 1985)
Урожайность клеток
Способ Объем
выращивания среды,л на 1 мг глюкозы на 1 мл в неделю
среды
СООН
СООН
S—СН2—СН—СО —NH—СН,—СООН
-СООН
I
NH-,
мйкотрааи Од
TGF — гормоноподобные вещества, которые могут индуциро
вать временный неопластический рост и дифференциацию нор
мальных клеток. Фибробласты в среде с TGF не нуждаются затем
в субстрате для роста и не отвечают на межклеточные контакты.
После удаления TGF из культуральной среды клетки возвращаются
к нормальному росту.
TGFa близко родственен эпидермальному ростовому фактору
(EGF) благодаря обладанию тем же клеточным рецептором.
552
TGFa — одиночный полипептид, содержащий 50 аминокислотных
остатков; он взаимодействует с тем же рецептором, что и EGF и
проявляет такую же потенцию в индуцировании тирозин-киназной
активности, связанной с EGF-рецептором. TGFa, в отличие от EGF,
"запускает" эмбриогенез и активацию протоонкогенеза в течение
регенерации поврежденных тканей.
TGFP — кислотостойкий полипептид, состоящий из двух иден
тичных субъединиц со 112 аминокислотами в каждой. Его ММ-25
кДа; изолированы TGF|3 — 1 и 2 с 7 1 % гомологией между ними и
сходной функциональной активностью. В частности, TGFp* играет
важную роль в генезе опухолей, развитии эмбриона, тканевой
репарации и иМмунорегуляции. TGFp — ингибитор роста для
большинства типов клеток, но может стимулировать образование
внеклеточных матриксных белков типа фибронектина и коллагена.
TGFa и (3 выступают синергистами при трансформации различных
клеточных линий.
В регуляции поведения клеток важную роль отводят семейству
из четырех синдеканов, являющихся поверхностными протеогли-
канами клеток. Из них более детально изучен с и н д е к а н - 1. В
его так называемом внешнем домене, или эктодомене содержатся
ковалентно связанные цепи гликозаминогликанов, состоящие пре
имущественно из гепарансульфата, а также из хондроитинсульфа-
та. Синдекан - 1 селективно связывает различные внеклеточные
матриксные молекулы через его гепарансульфатные цепи. Одно
временно он может связывать ростовые факторы и выступать
вектором сайта стимуляции роста; здесь (в месте взаимодействия
синдекана-1 с матриксом) иммобилизуется рецепторный комплекс
для тирозинкиназы (рис. 158).
Тип Характеристики
интер
клетки - индук число локали нали стабиль 'актив длина ч. амк-т ММ,
ферона
проду тор генов зация чие ность ность в кДа
центы интер- «хро нитро в пер в окон
при присут сигналь
фе- мосо нов в вичной чатель
рНг ствии ной
рона мах моле ной
генах ДОС после-
куле моле
дова-
куле
телычо-
стти"
(ч.амк-т)
v
а лейко вирус 14 -,-9 да -да 23 166 143 17
циты ная
пери индук
фери ция,
ческой двух-
крови нитевая
".
РНК
Р
1 фиб-
робла-
сты
—"— 2
15?»
9,2,5 _1 да да 21 166 145 17
Интерфероны Система
индуктор клетки-продуценты
Ж
Ш ных антител (МкАТ): 1 - диа
лизат с интерфероном и дру
гими бактериальными белка
ж ми, 2 - интерферон, 3 - балла-
i стные белки, 4 - МкАТ, 5 -
интерферон, связывавший с
МкАТ, 6 - слабая кислота.
563
Т а б л и ц а 58. Генетический компонент иммунной системы
Название Функция »
Иммуноглобулиновые гены Определяют» структуру вариабельных (v) и
константных (С) областей, Н (ц, у, а, е, 5).- и L
(к, \ - цепей иммуноглобулиновых генов на В-
лимфоцитах; v - область также образует часть
рецепторов для антигенов на Т-лимфоцитах»
Гены области I (HLA-D) Ответственны за взаимодействия макрофагов,
главного Т- и В-лимфоцитов (CI; от англ. cellinteraction)
комп
лекса 1г-гены Определяют индивидуальную чувствительность
гито- организма к заболеванию благодаря
совме- регулированию силы ответа' на
стимо- соответствующие антигены (от англ. Irhmune
сти response)
(МНС), гены, кодирующие Ответственны глайным образом за смешанную
или 1а-антигены реактивность лимфоцитов и за реакции типа
HLA+- "трансплантат против хозяина" (от англ. Immune
гены antigen) •
гены иммуно- вовлечены в синтез таких иммуномедиаторов,
медиаторо» как цитокииы (лимфокины, включая
интерлейкины • (IL); ^"Интерферон,
нёйротрансмиттерыЛ фактор задержки
миграции макрофагов (MIF) и др.
другие области определяющие: большой и малый
трансплантационные антигены, связанные с
отторжением трансплантантов и опухолей;
взаимодействия с патогенными вирусами;
синтез компонент^в^сйстемы комплемента
Гены дифференциации определяющие лимфоцитарные антигены (Lyt-1,
клеточных антигенов и 2,3 для различных субпопуляций Т-лимфоцитов;
рецепторов Lyb-3, 5 и др., дифференциально
экспрессирующиеся на определенных В-
лимфоцитах); Fc-рецепторы (FcRy - на В-
лимфоцитах, макрофагах и Т-супрессорах; FcRji
на макрофагах и Т-хелперах), рецепторы
комплемента на субпопуляциях В- и Т-клеток
Обозначе Характеристика
ние
антигена
CD1 Кортикальный маркер тимоцитов, исчезающий на последней
стадии созревания Т-клетки. Его находят также на клетках
Лангерганса+. Молекула CD 1 состоит из трех полипептидных цепей
с ММ 49 кДа (CDla), 45 кДа (CDIB) И 43 кДа (СД1с) и каждая из
них закодирована соответствующим геном на первой хромосоме.
Названные цепи ассоциированы с р"-2-микроглобулином и,
следовательно, антиген аналогичен классическим антигенам
гистосовместимости, хотя и закодированным на другой хромосоме.
CD2 Т-клеточный антиген, являющийся рецепторной молекулой для
эритроцитов барана (ЭБ), называемый еще Til-антиген и LFA-2.
Молекула его имеет ММ 46-50 кДа, и важно подчеркнуть его
значимость в Т-клеточном созревании, поскольку антитела против
одного эпитопа (см) могут индуцировать клеточную пролиферацию.
CD4 Молекула антигена с ММ 55 кДа представлена приблизительно на
2/3 цикрулирующих Т-клеток у человека, включая большинство
Т-хелперов. CD4 называют еще Т-4 антигеном. Его находят также
на моноцитах и макрофагах. Он выступает рецептором ВИЧ (вирус
СПИД, см. рис. 226).
CD5 Его называют еще Т-1 антигеном. Он имеет ММ 67 кДа; представлен
на большинстве Т-клеток у человека, на незрелых В-клетках плода
и, в небольшом числе, на покровной зоне В-клеток в лимфоидной
ткани взрослого человека.
CD7 Антиген имеет ММ 40 кДа, представлен на многих Т-клетках; он
полезен в качестве маркера Т-клеточных неоплазм, когда другие
Т-клеточные антигены отсутствуют. CD7 антиген, по-видимому,
является Fc-рецептором для IgM.
CD8 Антиген, называемый еще Т-8 антигеном и аналогичный Lyt 2(3)
антигену у мышей, имеет ММ 32-33 кДа. Широко используют в
качестве маркера для субпопуляции Т-клеток — суппрессов и
цитотоксических клеток. Антиген также имеется на
синусоидальных клетках селезенки.
CD 10 Этот антиген называют еще как антиген общей острой
лимфобластной лейкемии, или CALLA-антиген (от англ. Common
Acute Lympoblastic Leukaemia Antigen). Его MM 100 кДа. Он
представлен на многих типах клеток (стволовые, ростковые
клеточные центры, гранулоциты + + , макрофаги, почечный
эпителий, фибробласты, желчные канальцы)
CD16 Молекула антигена имеет ММ 50-60 кДа, она представлена
преимущественно на гранулоцитах. Он также может быть найден
на НК- и К-клетках, на некоторых микрофагах. Предположительно
молекула функционирует как низкоафинный рецептор для Fc-
области IgG.
568
Продолжение таблицы 59.
Обозначе Характеристика
ние
антигена
CD26 Состоит из двух полипептидных цепей с ММ 120 и 200 кДа
соответственно; представлен на активированных Т-клетках.
CD43 Молекула с ММ 95 кДа представлена на многих клетках, включая
Т-клетки, гранулоциты, эритоциты, эпителиальные клеточные
линии и мозг. 1
Примечание: Клетки Лангерганса локализуются в коже.
++
К гранулоцитам относят сегментоядерные нейтрофильные, эозино-
фильные и базофильные лейкоциты (микрофаги, полинуклеары)
Благодаря анализу рецепторов обнаружены так называемые
"двойные отрицательные (DN) Т-клетки", содержащие у/8-рецеп-
торы, контактирующие с CD3 рецепторами на а- и р- Т-клетках,
но не имеющие CD4 и CD8 рецепторов. Таких лимфоцитов мало
в тимусе и еще меньше в других лимфоидных тканях (не более
1%). Считают, что эти Т-клетки выполняют контролирующие фун
кции на поверхности эпителия (в частности, кишечника) и поэтому
их называют эпителиальными, лимфоцитами.
Молекулярный компонент иммунной системы, представлен
ный пятью классами иммуноглобулинов, формируется за счет
клеток В-ряда (в частности, плазматических), кооперативно взаи
модействующих с некоторыми другими ИКК (см. рис. 161).
Молекулы антител построены, в основном, по единому плану
(рис. 162). Несмотря на огромное разнообразие антиген-связыва-
ющих мест, вариабельная часть молекул антител представлена 5—6
каноническими вариантами пространственной укладки и, как по
лагает К. Милстейн (1990), мно
гообразие их репертуара обус
ловливается комбинаторикой
канонических структур в соче
тании с точковыми заменами
аминокислотных остатков в ан-
тиген-связывающих центрах.
Рис. 162. Схематичное строение мо
Fc Y- ~Y лекулы антитела IgGl человека: 1 — иди-
отип, 2 — изотип, 3 — аллотип, Па —
расщепление папаином, Fc — фрагмент,
J Fd — фрагмент, С — константная об
ласть, У — углевод, V — вариабельная
8
X
I 509
область, Н — тяжелая цепь, L — легкая
цога
"
Являясь белками сыворотки крови, строго специфичные анти
тела образуются после стимулирования иммунной системы соот
ветствующим антигеном. Благодаря своей исключительной специ
фичности (за счету областей), антитела находят все более широкое
применение не только в фундаментальных исследованиях, но и в
практике выделения и очистки различных антигенных веществ, в
профилактике, диагностике и лечении многих заболеваний.
11.5.2. Получение моноклональных антител (МкАТ). Вводимый
или попадающий в организм антиген признается и перерабатыва
ется макрофагами, затем антигенная информация представляется
лимфоцитам, содержащим рецепторы. Так, в частности, стимули
руется формирование клонов плазматических клеток, продуциру
ющих специфичные антитела. Качество и количество антител
зависят от качества и дозы антигена, способа его введения в
организм, от вида животного — реципиента. Однако при традици
онной технологии удается получать преимущественно гетероген
ные антитела. В то же время "жизнь диктовала" необходимость
получения моноклональных антител — продуктов единого клона
клеток. Важным шагом к этому было открытие Портера в 1972 г.,
связанное с установлением "антительной природы" парапротеинов
в сыворотке крови людей и животных с опухолевым поражением
лимфатической системы (миелома). Миеломные клетки представ
ляют собой трансформантов плазматической клетки, продуциру
ющих моноклональные антитела. К сожалению, антиген при этом
до сих пор остается неустановленным. Тем не менее, факт обра
зования моноклональных антител миеломными клетками был ре
шающим в создании гибридом, с помощью которых сделан огром
ный скачок в иммунобиотехнологии. Выдающийся вклад в это
внесли Г. Келер и К. Милстейн (1975), разработавшие метод
получения МкАТ желаемой специфичности и в большом количе
стве.
Теперь известно, что каждой антигенной детерминанте соот
ветствует свой клон В-клеток — антителопродуцентов (в организме
человека имеется в среднем 107 клонов В-клеток). Отсюда и
происходит понятие о МкАТ.
Келер и Милстейн слили мышиные миеломные клетки РЗ-Х63-
Ад8, культивируемые in vitro, с лимфоцитами селезенки иммуни
зированной овечьими эритроцитами мыши. При слиянии образо
вывались гомо(ди-, поли)кариотические гибридные клетки — гиб-
ридомы, сохраняющие признаки обеих родительских особей, а
именно — способность к неограниченному росту in vitro и in vivo
(признак миеломной клетки) и способность продуцировать специ-
570
фичное антитело (признак В-лимфоцита). Названием "гомо(ди-,
поли)кариотические гибридомы" подчеркивается факт происхож
дения клеток от одного вида животного. Принципиально этот метод
пригоден для получения антител против любого антигена.
Таким образом, при традиционных методах получения антител
после иммунизации животных имунные глобулины оказываются,
как правило, п о л и к л о н а л ь н ы м и, тогда как с помощью
гибридом получают МкАТ.
Однако следует помнить, что не все клетки подвергаются
соматической гибридизации — специализированные функции ро
дительских партнеров сохраняются лишь в том случае, если эти
клетки находятся на одной и той же стадии деления. Другие клетки
остаются неслившимися или сливаются с гомологичными особями.
Этапы получения гомо-, гетеро- или синкариотической гибридомы
являются следующими:
1) иммунизация антигеном (например, мыши),
2) взятие клеток селезенки (лимфоциты — плазматические
клетки) от иммунной мыши,
3) отбор миеломных клеток,
4) слияние клеток — получение гетерокариотических гибридом,
5) селекция гибридов,
6) клонирование гибридов,
7) накопление in vivo или in vitro антител и их выделение.
Клетки — гибридомы можно сохранять в замороженном виде,
например в 1% диметилсульфоксиде, или вначале их суспендируют
в смеси 5% диметилсульфоксида и 95% сыворотки в концентрации
106 — 107 клеток/мл. Замораживают при — 70°С и хранят в жидком
азоте.
Теперь имеются линии клеток, которые сохраняются в течение
ряда лет без потери способности выделять Ig. Но есть и коротко-
живущие линии; у таких мышиных линий обычно вначале исчезает
тяжелая цепь Ig (утрата 12-й хромосомы), а затем — легкая цепь
Ig (потеря 6-й хромосомы).
В целях получения гибридом используют разные линии мие
ломных клеток (таблица 60), из которой видно, что более прием
лемыми линиями являются 8226AR/NI Р4-1 и Sp 2/0, не продуци
рующие Ig. Следует иметь в виду и тот факт, что гибридомы легче
получаются при использовании клеток от одного вида животного
(гомокариотические гибриды). Межвидовые гибридизации (гете-
рокариотические гибриды) всегда мало удачны, так как один из
571
партнеров в гибридоме теряет ряд хромосом, включая и те из них,
которые контролируют образование Ig. И все же стабильные
гетерокариотические межвидовые гибриды удается получать, на
пример, при слиянии миеломных клеток мышей с крысиными
лимфоцитами.
Т а б л и ц а 60. Линии некоторых миеломных клеток, рекомендованные
для получения гибридом
NIP4-1
крысиная LOU 210.RCY3.
.Agl.2.3 Y3 к —
он-сн2
J0" /
форибозилтранс-
феразы (ГТФРТ) и
поэтому не способ
ны использовать
экзогенный гипо-
£н . ксантин для синте
за пуринов. ГГФРТ
еромдазмсииждин катализирует реак
цию взаимодейст-
" ш "* н 6 ''*° с *" вйя гипоксантина и
гуанина с 5'-фосфо-
рибозил-1-пирофосфатом с образованием соответствующих нук-
леотидов — инозин-5'-фосфата и гуанозин-5'-фосфата. Клетки,
устойчивые к бромдезоксиуридину, не обладают ферментом тими-
динкиназой (ТК); ТК катализирует реакцию превращения тимиди-
на в тимидин-5'-фосфат;
2) отсутствие образования нежелательных легких или тяжелых
цепей Ig (происхождение их может быть "миеломное"или "селезе
ночное").
573
«&?. Ar. &л
о
—он
он
он он
гуанозин-5'-фосфат
КГон он
тимцдин-5'-фосфат
6
м^,сн2—NH-/_V-CC-NH-<^-COOH
у Г>2
соон
аминоптерин (4-аминофолиевая кислота)
(а) (б)
I
20 минут на льду с периодическим встряхиванием
* - .
30 минут при 37'С с периодическим встряхиванием
1
Двухкратное отмывание в среде Дальбекко
*
Ресуспендирование в 50 мл той же среды
I.
Распределение суспензии в лунки планшет (по 1 мл в 48 лунок)
На
1
• дующий день добавление среды Дальбекко, садержащей ГАТ
1
Смена питательной среды в течение 14 дней (каждый второй или третий
день), удаление 0,5 объема + 0,5 объема свежей среды
Да < гибриды •
19 т. 8524 577
В последние годы отбор гибридом для клонирования проводят
с использованием автоматизированного оборудования. На после
дующем этапе получают массовую культуру гибридомных клеток:
1) в культуре ткани — предпочтительный способ, так как Ig
выделяют с большей чистотой;
2) в ферментаторах — суспензионная культура;
3) в организме сингенных животных (мыши, крысы). Накоп
ленные МкАТ (10—200 мгк/мл среды) выделяют с помощью выса
ливания аммония сульфатом до 95% чистоты, а, при необходимости,
подвергают очистке (рис. 163).
Рис. 163. Схема получе
ния моноклинальных анти
тел с помощью гибридом-
ной техники: АС — агент
слияния клеток, 1 —В-кдет-
ки из селезенки иммунной
мыши, 2 — культура мие-
ломных клеток мыши, 3 —
' гибридизация, 4 — гибри-
домы, 5 — селекция и кло
нирование гибридом, 6 —
гибридомы, образующие
моноклональные антитела,
7 —- введение гибридом, об
разующих моноклональ-
ные антитела, в организм
сингенной мыши, 8 — клет
ки гибридомы, образую
щие моноклональные анти
тела, культивируемые в ви
де культуры ткани, 9 — вы
ращивание гибридомных
клеток, образующих моно
клональные антитела, в
ферментаторе, 1дкж — им
муноглобулины в культу-
ральной жидкости, Igac —
иммуноглобулины в асци-
тической жидкости, 10 —
высаливание Ig-ов аммония
сульфатом, 11 — стандарти
зация Ig-ов, 12 — лиофили-
зация Ig-ов.
578
Перевод гибридных клеток в большие объемы среды при
крупномасштабном культивировании всегда сопряжен с большими
трудностями, так как не каждый их клон выживает в таких
условиях. Поэтому на практике стремятся делать разбавление
"маточных" клеток постепенно, вначале 1:2—1:3, а затем и более,
используя специальные культиваторы (рис. 164).
Для выращивания гибридом в
суспензионных культурах важны
бессывороточные среды, посколь
ку это улучшает процесс культи
вирования в больших емкостях,
снижает примерно в 500 раз бел
ковые примеси и заметно сказы
вается на снижении стоимости це
левого продукта. Фирма Sigma
(США) выпустила в продажу та
кую среду (в сухом/жидком виде)
под названием НуЬгу-Мах, не со
держащую сыворотки и белков
(SFPF-Serum Free, Protein Free).
SFPF-среда включает аминокис
лоты, витамины, нуклеотидные
предшественники, глюкозу, липи-
ды, прогестерон, неорганические
соли и микроэлементы. Подобная
среда рекомендована для слияния,
клонирования, выращивания гиб-
ридомных и миеломных клеток, а
также для поддержания на соот
ветствующем уровне продукции
антител. Всего в среде содержится
82 ингредиента (22 аминокисло
Рис. 164. Культиватор гибридомных ты, 12 витаминов, 27 неорганиче
клеток (общий вид) фирмы IBF ских веществ й 21 другое соеди
biotechnics. нение) .
11.5.3. Применение моноклональных антител. Практическое
использование МкАТ исключительно многообразное — в медицине
и ветеринарии (в целях диагностики, терапии), в биотехнологии
для получения, выделения и очистки специфических продуктов, в
исследованиях фундаментальных и прикладных проблем. Так,
например, стволовые клетки костного мозга не обладают какими-
579
либо характерными особенностями, по которым можно было бы
их отличить от других клеток. К тому же в костном мозге на них
приходится где-то порядка 0,05% от всех клеток.
Стволовая клетка и сывороточйый белок а-фетопротеин, от
крытый Г. И. Абелевым, впервые появляются в желточном мешке
эмбриона. Спустя некоторое время стволовые клетки переселяют
ся в печень эмбриона и там же интенсивно синтезируется сыво
роточный а-фетопротеин. В желточном мешке и печени протекает
активное кроветворение. Позже синтез этого белка прекращается,
а стволовая клетка перемещается в костный мозг, где и происходит
кроветворение в течение всей последующей жизни'Ърганизма.
Используя МкАТ против поверхностного CD-белка стволовых
клеток, ученые из США и Германии близко подошли к выделению
таких клеток, массовое получение которых могло бы быть реша
ющим в терапии лучевой болезни, талассемии, тяжелых осложне
ний при иммунодефицитах, лейкемии и других заболеваний. На
способности стволовых клеток к переселению основывается спо
соб лечения лучевой болезни внутривенным введением стериль
ного костного мозга.
Неоценимый вклад внесен в- оценку CD-рецепторов клеток с
помощью МкАТ. Это позволяет глубже понять механизмы клеточ
ных взаимодействий в целях направленного вмешательства для их
коррекции при патологических состояниях.
Непреходяще значение МкАТ в диагностике, в том числе —
при использовании иммуноферментного анализа в различных его
вариантах, включая метку коллоидного золота. Например, чтобы
локализовать тироксин-секретирующие клетки в образце ткани
щитовидной железы, эту
ткань инкубируют с мыши
ным моноклональным анти
тироксином. Затем на обра
зец наносят конъюгат "анти-
Ig-золото", специфичный к
Ig-антитироксину. Фиксиру
ясь на моноклональном ан
тителе, конъюгат становится
прекрасной меткой, выявля
емой в световом биологиче-
Рис. 165. Схема взаимодействия конъюгата с к о м м и к р о с к о п е ПО к р а с -
;;анти-1д-золото" с моноклональным антителом й с к е З О Л ОТа (рис.
антитироксин (2), заякоренным на срезе ткани г \г
щитовидной железы (1). loo).
580
Очень важно использование МкАТ для прицельной доставки
например цитостатиков в злокачественные клетки на предмет их
деструкции и, как следствие, для лечения соответствующего боль
ного с опухолевым процессом.
При диагностике, например СПИД, на покрытой моноклиналь
ными антителами ячейке выявляется концентрация антигенного
белка р24 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) порядка
1,0—1,56 пикограмма в течение 1,5—3 часов; при цитомегалови-
русной инфекции МкАТ типа Е-13 используют для выявления
позднего антигена спустя 72 часа после заражения; важен вклад
МкАТ в диагностику герпеса, краснухи, токсоплазмоза, различных
бактериальных и грибковых инфекций, и т. д. В настоящее время
около 30 компаний в мире производят МкАТ в виде диагностиче
ских наборов, а 13 компаний разработали оборудование или тех
нологические процессы, относящиеся к МкАТ; теперь на рынке
имеются такие антитела против классов и подклассов иммуногло
булинов человека, отдельных белков человека и животных, гормо
нов и лекарств, и многие другие. Например, в 1991 г. американская
компания "Centocor" выпустила в продажу новое моноклональное
лекарство "Центоксин" для лечения сепсиса, вызванного грамот-
рицательными бактериями.
Ныне издают книги и журналы, посвященные МкАТ, и уже это
одно является веским доводом в пользу огромной роли их в
фундаментальных и прикладных исследованиях самого широкого
профиля.
11.6. Трансгенные животные. Включение чужеродных после
довательностей ДНК или трансгенов в геном макроорганизма —
реципиента с последующей устойчивой их наследуемостью в ряду
поколений обеспечивает получение так называемых трансгенных
животных. Следовательно, процесс трансгенеза по своему меха
низму относится к генетической инженерии и, в частности, к
генной и клеточной инженерии.
Доказано, что трансгены нередко экспрессируются, вызывая
те или иные структуры и функциональные изменения вплоть до
изменения "программы" развития организма. Подобного рода экс
перименты сулят заметный прогресс в области фундаментальных
и прикладных разработок. К разряду фундаментальных относят:
анализ различных отклонений в экспрессии нормальных и мути
ровавших генов, включая онкогены; осуществление направленного
мутагенеза за счет введения в макроорганизм экспрессирующих
581
специальных "конструкций", предназначенных определенным ге
нам и т. д.
К разряду прикладных исследований можно отнести, например,
получение быстро растущих трансгенных свиней, выведение
трансгенных овец, образующих и накапливающих в молочных
железах некоторые факторы свертываемости крови человека и др.
Для получения трансгенных животных, в частности — мышей,
можно воспользоваться такими методами, как микроинъекции
ДНК в оплодотворенное одноклеточное яйцо, заражение предим-
плантированных эмбрионов рекомбинантными ретровирусами, и,
наконец, применение эмбриональных стволовых ES- или ЕК-кле-
ток.
Быстрота выполнения и надежность метода микроинъекций
сделали его наиболее популярным среди специалистов-экспери
ментаторов. Используют различных линейных мышей, обеспечен
ных всем необходимым при хорошем их содержании в условиях
вивария (животника). Обычно в опыт по микроинъекции берут не
менее 20 гибридных самцов-производителей первого поколения
(FI) в возрасте 8—12 месяцев, когда они характеризуются хорошей
производительностью. При слабой или низкой активности самцов
к подсаживаемым самкам их заменяют. Донорами оплодотворен
ных яйцеклеток выступают не менее 10 неполовозрелых (12—14
г) гибридных самок первого поколения (FI), подвергшихся супер
овуляции и спариванию с гибридными самцами FI. Оплодотворен
ные одноклеточные яйца выделяют из операционно вскрытых
яйцеводов самок-доноров спустя 12 часов после их спаривания с
самцами-производителями. Выделенные яйца помещают в культу
ру на срок от 3 до 36 часов. От 10 самок можно получить 250 яиц,
пригодных для микрринъекций.
Оплодотворенные яйцеклетки поддерживают на среде М16 в
микрокапельной культуре в С0 2 -инкубаторе тканей при 37°С и с
5% диоксида углерода. Все другие манипуляции с яйцеклетками
вне инкубатора проводят в HEPES-забуференной среде М2 (HEPES
— это N-2-гидроксиэтилпиперазин — Г\Г-2-этансульфоновая кис
лота). Компонентный состав сред (кроме HEPES) почти тождест
венен. Различие касается натрия бикарбоната, фенолового крас
ного, натрия пирувата и кальция хлорида дигидрата, доля которых
в среде М16 больше, чем в среде М2. Остальные ингредиенты
представлены KCL, NaCL, KH2P04, MgSO 4 • 7Н 2 0, натрия лактатом,
глюкозой, пенициллином, стрептомицином, бычьим сывороточным
альбумином (БСА), внесенными в бидистиллированную воду.
582
Изолированные оперативным вмешательством яйцеклетки из
яйцеводов выдерживают в атмосфере 5% С 0 2 при 37°С до микро
инъекции в них клонированных ДНК любого размера в количестве
1—2 нл 0,0001—0,0005% раствора ДНК с помощью микроманипу
лятора.
Для трансплантации оплодотворенных яйцеклеток, в которые
была инъецирована экзогенная ДНК, используют "суррогатных"
матерей — псевдобеременных реципиентных самок (12 часов post
coitum), вынашивающих такие яйцеклетки.
В целях получения псевдобеременных мышей половозрелые
самки F-1 (19—20 г) в стадии эструса (течки, овуляции) спаривают
со стерильными самцами, у которых операционно блокированы
семявыносящие протоки. Наилучшие результаты получают с сам
цами линии Parkes, обладающих высокой половой активностью.
Обычно используют 20—30 таких самцов, которых спаривают
через день с названными выше самками (получают в среднем 5
псевдобеременных самок в день). Псевдобеременные самки при
годны для пересадки донорских оплодотворенных яйцеклеток.
Отбирают яйцеклетки, переживших микроинъекцию ДНК, и
вводят их в специальную микропипетку, с помощью которой
привносят в яйцевод псевдобеременной мыши оплодотворенную
яйцеклетку с включенной в нее клонированной ДНК. Часть пере
саженных яиц погибает, а часть продолжает нормально развивать
ся. После этого естественным путем (или с помощью кесарева
сечения) получают трансгенное потомство, идентифицируемое с
помощью гибридизационного анализа высокомолекулярной геном
ной ДНК, изолированной из хвоста (отрезают кончик хвоста
длиной примерно 1 см).
При гомологии трансгена с каким-либо участком генома мыши
используют блот-гибризацию, если же гомология незначительна
или она отсутствует совсем, то ограничиваются дот-блот- или
слот-блот-анализом (от анг. blot — пятно, blotting — промокание,
dot — точка, slot — прорез, паз). В первом случае, когда трансген
идентичен эндогенному гену, он все равно окружен другими
нуклеотидными последовательностями. Поэтому, используя ре-
стриктазы, удается доказать локализацию трансгена в иных ре-
стрикционных фрагментах. Во втором случае, когда трансген
негомологичен геному мыши, то он ограничен другими сайтами
рестрикции, и здесь удобен дот-блот- или слот-блот-анализ в
качестве экпсресс-метода. Фрагменты анализируемой геномной
ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах выявляют при экспозиции с
рентгеновской пленкой.
583
Трансгенные линии животных получают после скрещивания
первичных трансгенных экземпляров.
Изложенные события по получению трансгенных мышей схе
матично представлены на рис. 72.
Как уже было сказано в начале этого раздела, другим методом
получения трансгенных животных (в частности, мышей) является
заражение предимплантированных эмбрионов рекомбинантными
ретровирусами, которые оказались удобными объектами для этих
целей. Геном ретровирусов сравнительно небольшой и с ним
относительно легко манипулировать, вводя в него чужеродные
гены; ретровирусы достаточно инфекционны в отношении пермис-
сивных клеток (почти 100% заражение их), а единственная копия
ретровирусного генома ДНК прочно и строго определённым обра
зом интегрируется с ДНК клетки-мишени и эти последние способ
ны экспрессировать привнесенные вирусом гены. Уровень экс
прессии клонированных генов заметно повышается вследствие
того, что в ретровирусах имеются весьма активные транскрипци
онные энхасеры, или усилители (см.). Известные ретровирусные
векторы ведут свое происхождение от вирусов лейкоза мышей
(MLV) или от вирусов птиц (ALV).
Геном ретровирусов функционирует по схеме:
этанол, 8% рН 7,2-7,3
Сыворотка ! * V = -3°С -» осадок в отходы
I—стадия предвари — центрифугирование
тельного осаждения
супернатант
+
- стадия первого • Осадок (альбумин,
осаждения этанол, 26% рН 7,1-7,2
Г = - 8 ° - 10'С а-глобулин, часть
Р-глобулина)
центрифугирование
супернатанта TZв последующую
утилизацию
этанол, 26%
IV- стадия третьего натрия бикарбонат
осаждения рН 7,2-7,3
ц=в,05;Г=-8-1(ГС
центрифугирование
Центрифугирование
(20—40 тыс. g 1-2ч.)
1
Концентрирование до
1/10 объема
1
Осадок лиофильно
высушивают и хранят
при t" ниже 0*С
(предпочтительнее при
-25'С)
598
ЛИТЕРАТУРА
Акименко В. К. Альтернативные оксидазы микроорганизмов.
М., Наука, 1989.
Бабьева И. П., Зенова Г. М. Биология почв. Под ред. Д. Г.
Звягинцева. МГУ, 1983.
Бациллы. Генетика и биотехнология. Под ред. К. Харвуда. М.,
Мир, 1992.
Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2-х
частях. М., Мир, 1989.
Бекер М. Е., Лиепиньш Г. К., Райпулис Е. П. Биотехнология,
М-, ВО Агропромиздат, 1990.
Биологические мембраны. Методы. Под ред. Дж. Финдлея, У.
Эванза, М., Мир., 1990.
Биотехнология в 8-ми томах. Под ред. Н. С. Егорова, В. Д.
Самуилова. Уч. пособие для вузов. М., Высшая школа, 1987—1988.
Биотехнология клеток животных. В 2-х томах. Под ред. Р. Е.
Спиера и Дж. Гриффитса. М., ВО Агропромиздат, 1989.
Биотехнология: принципы и применение. Под ред. И. Хиггинса,
Д. Беста, Дж. Джонса. М., Мир, 1988.
Биотехнология растений. Под ред. С. X. Мантелла и X. Смита.
М., ВО Агропромиздат, 1987.
Варфоломеев С. Д., Калюжный С. В. Биотехнология. Кинети
ческие основы микробиологических процессов. М., Высшая школа,
1990.
Виестур У. Э., Шмите И. А., Жилевич А. В. Биотехнология.
Биотехнологические агенты, технология, аппаратура. Рига, Зинат-
не, 1987.
Воробьева Л. И. Промышленная микробиология. М., МГУ, 1989.
Егоров А. М,, Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е. М.
Теория и практика иммуноферментного анализа. М., Высшая
школа, 1991.
Блинов Н. П. Химическая микробиология. М., Высшая школа,
1989.
Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж.
Вудворда. М., Мир, 1988.
Иммунологические методы. Под. ред. Г. Фримеля. М., Медици
на, 1987.
Иммунология. Под ред. У. Пола в 3-х томах. М., Мир, 1989.
Каратыгин И. В. Коэволюция грибов и растений. Санкт-Петер
бургский Гидрометеоиздат. С.-Пбг. 1993.
599
Коваль Э. 3., Сидоренко Л. П. Микодеструкторы промышлен
ных материалов. Киев, Наукова Думка, 1989.
Кузник Э. 3., Васильев Н. В., Цыбиков Н. Н. Иммуногенез,
гемостаз и неспецифическая резистентность организма. М., Ме
дицина, 1989.
Ленинджер А. Основы биохимии в 3-х томах. М., Мир, 1985.
Лиепиньш Г. К., Дунцэ М. Э. Сырье и питательные субстраты
для промышленной биотехнологии. Рига, Зинатне, 1986.
Льюин Б. Гены. М., Мир, 1988.
Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Сб. научн.
трудов под ред. С. Г. Инге-Вечтомова. Л., Наука, 1986.
Муромцев Г. С, Бутенко Р. Г., Тихоненко Т. И., Прокофьев М.
И. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. М., ВО Агропро-
миздат, 1990.
Перспективы биохимических исследований. Под ред. Дж. Туза
и С. Прентиса, М., Мир, 1987.
Петров Р. В. Иммунология. М., Медицина, 1987.
Промышленная микробиология. Под общей ред. Н. С. Егорова.
М., Высшая школа, 1989.
Рыбкин В. Н. Основы генетической инженерии. Минск, Вы-
шэйшая школа, 1986.
Сассон А- Биотехнология. Свершения и надежды. М., Мир.,
1987.
Седых Н. В., Кристапсонс М. Ш. Контроль качества в биотех
нологии. Рига, Зинатне, 1990.
Щелкунов С. Н. Клонирование генов. Новосибирск, Наука,
1986.