Вы находитесь на странице: 1из 88

Современные методы

лабораторной диагностики
инфекционных заболеваний
Иванов Андрей Михайлович
доктор медицинских наук, профессор

Военно-медицинская академия
им. С.М. Кирова
Лабораторная диагностика
С.П. Боткин – Р. Вирхов
ИСТОРИЯ
Клиническая лабораторная
диагностика

• Лабораторная медицина в нашей стране имеет глубокие корни,


формировалась она, как и многие другие медицинские дисциплины,
на базе военной медицины. Первая клиническая лаборатория была
открыта при кафедре факультетской терапии Военно-медицинской
академии С.Петербурга в 1840 г.г. , начальником ее был доктор К.К.
Зейдлиц. Первые лаборатории делали примитивные исследования :
сахар в моче, мочевина, белок. Тем не менее, именно в этот период
был открыт белок Бенс-Джонса.
• С.П.Боткин создал клинико-экспериментальную лабораторию при
кафедре факультетской терапии Военно-медицинской академии
примерно в 1860 г для проведения клинико-экспериментальных
исследований. Затем этой лабораторией руководил И.П.Павлов, он в
этот период занимался фармакологией, затем перешел на кафедру
нормальной физиологии, где приобрел мировую известность. Эти
великие медики в пору становления лабораторной службы видели в
лаборатории источник объективной информации о больном, который
скрыт даже от самого опытного терапевта.
Кафедра факультетской терапии ВМедА
(Тыренко В.В. И соавт., 2011)
Методы диагностики Автор, год
Внедрен микроскоп для К.К. Зейдлиц, 1840
лабораторных исследований
Организована клиническая К.К. Зейдлиц, 1840
лаборатория
Организована физиологическая С.П. Боткин, И.П. Павлов, 1876
лаборатория
Значительно расширена С.П. Боткин, 1884
клиническая лаборатория
Организована бактериологическая Л.В. Попов, 1891
лаборатория
Культивирование анаэробов С.С. Боткин, 1891
(анаэростат)
Выявлена закономерность С.С. Боткин, Н.Я. Чистович,
лейкоцитарной реакции при 1891-92 гг.
инфекционных болезнях и
предложена методика
определения лейкоцитоза
Кафедра факультетской терапии
(Тыренко В.В. И соавт., 2011)

Методы диагностики Автор, год


Обоснованы методы С.С. Зимницкий, 1901-02 гг.
фракционного исследования
желудочной секреции и
мочеотделения
Предложен метод В.Н. Стасевич, 1903
морфологического исследования
плевральных экссудатов
Открыт и описан возбудитель С.С. Боткин, С.С. Зимницкий ,
«маньчжурского тифа» 1909
1884 год - Разделение кафедры химии:
- Кафедра неорганической химии
- Кафедра органической и физиологической
химии с физиолого-химической лабораторией
(фактическое разделение состоялось в 1892 году)
Член-корреспондент
Петербургской АН
Данилевский А.Я.
(1838 - 1923)
C 1906 по 1910 год –
начальник
Военно-медицинской академии
Конференция ВМедА
(1906-1910)
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций

• этиологическая диагностика

• ускорение лабораторного цикла обследования


пациентов

• изучение резистентности возбудителей к


антимикробным препаратам

• молекулярный мониторинг распространения


возбудителей
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций

• этиологическая диагностика

• ускорение лабораторного цикла обследования


пациентов

• изучение резистентности возбудителей к


антимикробным препаратам

• молекулярный мониторинг распространения


возбудителей
Проблемные вопросы при серологической
диагностике инфекционных заболеваний

• Активный процесс или анамнестическая


инфекция?
• Реинфекция или рецидив?
• Контроль излеченности?
• Целесообразность вакцинации?
• Эффективность поствакцинального
иммунитета?
• Нейроинфекция?
• Врожденная инфицированность?
Повышение информативности
серологической диагностики:

• получение искусственных аналогов микробных


антигенов и их использование в диагностических
препаратах

• раздельное выявление классов и подклассов


специфических иммуноглобулинов (IgM, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4)

• изменение трактовки результатов


серологического тестирования
Серологический профиль HIV-1 инфекции
(пример информативности определения спектра антител)
Относительная концентрация

Anti-HIV Env

Anti-HIV Core
Anti-HIV IgM

HIV Ag HIV Ag

HIV-1 недели месяцы годы


инфекция время
Пример расположения антигенов
в иммуноблоттинге
TpN47
TmpA
TpN17
TpN15 Антигены
Контроли
стрептавидин

± 1+ 3+
Биочипы
Повышение информативности
серологической диагностики:

• получение искусственных аналогов микробных


антигенов и их использование в диагностических
препаратах

• раздельное выявление классов и подклассов


специфических иммуноглобулинов (IgM, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4)

• изменение трактовки результатов


серологического тестирования
Биологические свойства иммуноглобулинов человека

КЛАССЫ И ПОДКЛАССЫ
СВОЙСТВА Ig
A1 A2 G1 G2 G3 G4 D E M

Активация комплемента - - ++ + ++ - - - -

Перенос через плаценту - - + + + + - - -


Перенос через слизистые + + - - - - - - -
Связывание с FcαR1 + + - - - - - - -
Связывание с FcγR-I - - ++ - ++ + - - -
Связывание с FcγR-II - - + - + - - - -
Связывание с FcγR-III - - + - + - - - -
Связывание с FcδR-I - - - - - - + - -
Связывание с FcεR (I и II) - - - - - - - ++ -
Связывание с FcμR - - - - - - - - +
Связывание РФ - - + + + + - - -
Связывание с белком А - - + + - + - - -
Связывание с белком G - - + + + + - - -
Биологические свойства подклассов иммуноглобулинов человека

Биологические Подклассы IgG


свойства
IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
Содержание в сыворотке, мг/мл 7,1 3,0 0,80 0,40
Содержание в сыворотке, % 58-71 19-31 5-10 3-6
Экспрессия на В-лимфоцитах, % 40 48 8 1
% плазмоцитов-продуцентов 64 26 8 1
Частота миелом-продуцентов, % 60-70 15-20 4-8 2-6
Связывание C1q ++ + +++ -
Связывание с FcγR-I +++ + +++ +
Связывание с FcγR-II ++ + ++ +
Связывание с FcγR-III ++ + ++ +
Связывание с РФ + + - +
Связывание с белком А ++ ++ - ++
Связывание с белком G ++ ++ ++ ++
Перенос через плаценту ++ + ++ ++
Время полужизни в крови 12-21 12-21 7-8 11-21
Блокир. активность при аллергии - - - +
Функциональная валентность 2 2 2 1
Перспективы совершенствования
методов серологической диагностики

• Использование Fab-фрагментов
антител при конструировании
биосенсоров

• Использование аптамерных и
пептидных лигандов

• Проточная цитометрия
Перспективные методы
серологической диагностики

• Клеточно-опосредованная детекция

• Химическая детекция

• Физическая детекция (поверхностные


плазмон резонансные биосенсоры)
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций

• этиологическая диагностика

• ускорение лабораторного цикла обследования


пациентов

• изучение резистентности возбудителей к


антимикробным препаратам

• молекулярный мониторинг распространения


возбудителей
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций

• этиологическая диагностика

• ускорение лабораторного цикла обследования


пациентов

• изучение резистентности возбудителей к


антимикробным препаратам

• молекулярный мониторинг распространения


возбудителей
Ускорение лабораторного цикла
обследования пациентов

• Рациональная организация лабораторного


диагностического процесса

• Использование методов экспресс-диагностики

• Миниатюризация формата исследования, за счет


новых биомедицинских технологий и
высокотехнологичных платформ лабораторного
анализа

• Компьютеризация
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций

• этиологическая диагностика

• ускорение лабораторного цикла обследования


пациентов

• изучение резистентности возбудителей к


антимикробным препаратам

• молекулярный мониторинг распространения


возбудителей
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций

• этиологическая диагностика

• ускорение лабораторного цикла обследования


пациентов

• изучение резистентности возбудителей к


антимикробным препаратам

• молекулярный мониторинг распространения


возбудителей
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций

• этиологическая диагностика

• ускорение лабораторного цикла обследования


пациентов

• изучение резистентности возбудителей к


антимикробным препаратам

• молекулярный мониторинг распространения


возбудителей
Молекулярный мониторинг распространения
возбудителей инфекционных заболеваний

• Полиморфизм длины рестрикционных


фрагментов хромосомной и плазмидной
ДНК

• Саузерн-блоттинг

• Пульс-электрофорез

• ДНК-секвенирование
Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР

•Дает возможность индикации


геномной ДНК разных
микроорганизмов
одномоментно в одной пробе
биологического материала
•Особенно перспективной при
диагностике является
мультипраймерная
модификация ПЦР,
позволяющая за один анализ
из одной пробы определять
несколько типов возбудителей.
Прямая протеомная идентификация
микроорганизмов
Метод позволяет проводить прямой
масс-спектрометрический анализ
белковой фракции микробной клетки
(прямое белковое профилирование) и
получать уникальные масс-спектры с
высокой точностью и разрешением,
характеризующие исследуемый объект
по типу “отпечатков пальцев”.

Достоинства метода:
 Высокая аналитическая чувствительность -
достаточно 10-15 – 10-18 вещества
 Быстрая и простая пробоподготовка: 10 – 15 минут
 Высокая скорость измерения: 1 минута на образец
 Возможность автоматизации и роботизации всех
стадий исследования
 Возможность идентификации более 3000 бактерий и
грибов
Nobel Prize 2011 and Shaw Prize 2011
(medicine)

Charles Janeway – идея о существовании PRR


Bruce A. Beutler – экспериментальное подтверждение
PRR* мыши
Jules A. Hoffmann – экспериментальное подтверждение
PRR дрозофил
Ruslan Medzhitov – экспериментальное подтверждение
PRR человека
100-летие Нобелевской премии
И.И. Мечникова и П. Эрлиха
2008 год

«Лекции о
сравнительной
патологии воспаления»
1892 год
Максимов Александр Александрович [4.2.1874 -
4.12.1928] - выдающийся российский учёный,
гистолог и эмбриолог.

•А.А.Максимов родился в Санкт-


Петербурге, где в 1896 году с
отличием окончил Военно-
медицинскую академию. С 1903
по 1922 гг. А.А.Максимов
занимал пост профессора
кафедры гистологии Военно-
медицинской академии.
• В 1922 г. эмигрировал в США,
где с 1922 по 1928 годы являлся
профессором кафедры
анатомии медицинского
факультета Чикагского
университета.
Строение бактериальной клеточной стенки
Свойства патоген-ассоциированных
молекулярных паттернов (ПАМП)

• Синтезируются только микроорганизмами, их


синтез отсутствует в клетках макроорганизма.

• Являются наиболее общими для


микроорганизмов структурами.

• Структуры в составе ПАМП, распознаваемые


ПРР (а значит и врожденной иммунной
системой), являются важными для выживания и
патогенности микроорганизмов – отличаются
консервативностью и неподверженностью
мутациям.
Специфичность сигнальных рецепторов врожденного иммунитета

Тип
PRR Лиганды
патогена
TLR-1 Триациллипопептиды, модулин M. tuberculosis  грам-[+],
 грам-[–]
TLR-2 Липопротеиды большинства патогенов, пептидогликаны, липотейхоевые и  грам-[+],
маннуроновые кислоты, порины Neisseria, атипичные ЛПС, факторы  грам-[–],
 грибы,
вирулентности Yersinia, вирионы CMV, зимозан
 вирусы
TLR-3 Двунитчатая РНК  вирусы

TLR-4 ЛПС грам-отрицательных бактерий, HSP60, полимерные маннуроновые кислоты,  грам-[+],


флаволипиды, тейхуроновые кислоты, пневмолизин, оболочечный белок RSV  грам-[–],
 вирусы
TLR-5 Флагеллин  грам-[+]

TLR-6 Диациллипопептиды, модулин, липотейхоевая кислота, зимозан  грам-[+],


 грибы
TLR-7 Однонитчатая РНК, синтетические вещества  вирусы

TLR-8 Однонитчатая РНК, синтетические вещества  вирусы

TLR-9 Неметилированная СpG ДНК  грам-[+],


 грам-[–]
TLR-10 Неизвестны
TLR-11 Уропатогенные бактерии
NOD1 Пептидогликаны (GM-Tridap)  грам-[+]

NOD2 Пептидогликаны (ГМДП)  грам-[–]


Специфичность распознавания ПАМП различными TLR
ПАМП Патоген Рецептор
Триацетилированные липопептиды (липо­гликаны
липоманнан и липоарабиноманнан), Mycobacterium tuberculosis
фосфатидилинозитолдиманнозид и липопротеин Mycobacterium leprae TLR1/TLR2
19 кД)
Диацетилированные липопептиды TLR2/TLR6
Leptospira interrogans, Porphyromonas gingivalis, Helicobacter
Липополисахарид pylori
Белки вирусной оболочки цитомегаловирус, вирус кори, вирус герпеса HSV-1
TLR2
простейшие (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei,
Гликозилфосфатидилинозитол Toxoplasma gondii, Leishmania major, Plasmodium falciparum)

Липопротеины, пептидогликаны, липотейхоевые Грам-позитивные бактерии (Staphylococcus aureus,


кислоты Streptococcus pneumoniae)
TLR1/TLR2,
Зимозан грибы (дрожжи)
TLR2/TLR6
Гликолипиды Treponema pallidum
Модулин Staphylococcus epidermis
Двуцепочечная РНК вирусы и бактерии TLR3
Липополисахарид Грам-негативные бактерии
F(fusion)-протеин вирусной оболочки RSV
TLR4
простейшие (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei,
Гликозилфосфатидилинозитол Toxoplasma gondii, Leishmania major и Plasmodium falciparum)

Бактериальный флагеллин Legionella pneumophila, Salmonella typhimurium TLR5


вирус HCV TLR7
Одноцепочечная РНК
Mycobacterium tuberculosis, вирусы HCV, HIV-1, RSV TLR8
вирусы герпеса HSV-1 и HSV-2, HIV, простейшие (Trypanosoma
CpG ДНК cruzi, Trypanosoma brucei, Toxoplasma gondii, Leishmania major
и Plasmodium falciparum)
TLR9
Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Salmonella enterica,
REP-последовательности ДНК Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis
Активация сигнальных рецепторов
(TLR, NOD)

• NF-kB
• AP-1
• Fos
• Jun
Биологические эффекты цитокинов

Эффект цитокинов реализуется


в трех направлениях:
Фагоциты
ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ

 Фагоциты – активация фагоцитоза,


презентация антигена, продукция
ЦИТОКИНЫ

свободных радикалов
Зрелые Т-
и В- клетки  Зрелые Т- и В-клетки – усиле-
ние функций (увеличение продукции
Ig, активация киллеров)

Наивные Т-  Наивные Т- и В-клетки – акти-


и В- клетки вация и подготовка к иммунному
ответу
Алгоритм иммунологического обследования при
сифилисе
Клинико-лабораторная и серологическая
диагностика сифилиса
(скрининг + верификация)

Положительный Отрицательный
результат результат
(сифилис)

Сифилис
Определение исключается
IFN-γ, IL-1β, IL-2, ФЧ

Выраженных изменений IFN-γ ↑, IL-1β ↑, IL-2 ↑,


иммунологических показателей ФЧ ↓
не выявлено

Вероятность развития Вероятность развития


серорезистентности низкая серорезистентности
высокая
Влияние факторов иммунитета на
эффективность лечения хронического
трихомониаза
Хронический
трихомониаз

Определение
IFN-γ ↑, IL-1β ↑ IFN-γ, IL-1β, IL-8, CD19+↑, IL-8↑
CD19+↓, IL-8(N) CD19+ IFN-γ(N), IL-1β(N)

Th1 Th2

Неблагоприятный прогноз Благоприятный прогноз


эффективности терапии эффективности терапии
Критерии прогноза течения ХГС

TNF-α ↑ IL-10 ↑ IFN-γ ↑

Неблагоприятный
Ig A ↑ прогноз течения Ig G ↑
ХГС

ФЧ ↓
Прогноз при инфекционных заболеваниях
определяется активацией иммунной
системы в направлении наиболее
эффективного пути (Th1/Th2) элиминации
этиологического агента
АЛГОРИТМ ОЦЕНКИ
ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА В ПРОФИЛАКТИКЕ И ДИАГНОСТИКЕ
ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Генетические Фенотипические
факторы факторы

Предрасположенность
к инфекции

Геномный анализ-
определение SNP

Риск развития Течение Исход


заболевания заболевания заболевания
Генетический полиморфизм рецепторов TLR-семейства
Полиморфизм
Ген Полиморфизм белка Фенотипическая ассоциация
гена
1805G/T серин-602/изолейцин
944C/Т пролин-315/лейцин
TLR1 Туберкулез, лепра
743A/G аспарагин-248/серин
914A/Т гистидин-305/лейцин
септический шок, туберкулез,
2408G/A аргинин-753/глутамин менингит,
лепра, остеомиелит
туберкулез, менингит, лепра
TLR2 2180C/T аргинин-677/триптофан (особенно
лепроматозная)
2021C/A пролин-631/гистидин системная менингококкемия
туберкулез (особенно
597T/C аспарагин-199/аспарагин
милиарный)
пролин-680/гистидин
745Т/С серин-249/пролин
TLR6
752Т/А лейцин-251/стоп-кодон Туберкулез
2069А/С аспарагин-690/треонин
460/461Del AATAA ?
896A/G аспарагин-299/глицин Грам-негативные инфекции, в
TLR4 том числе сепсис и
1196C/T треонин-399/изолейцин
септический шок, вирус RSV
TLR5 1174С/Т аргинин-392/стоп-кодон пневмония
32A/T ?
TLR7 хроническая HCV-инфекция
2403G/A ?
Полиморфизм молекул иммуногенного сигналинга
Протеин Генный сайт SNP* Фенотип**
MyD88 rs6853 A/G IL-10, Ig
MD2 rs11466004 85С/Т IL-10, Ig
rs5029748 С/А IL-4
IK
rs3747811 Т/А IL-10
rs1801 C/G IL-12p40
rs230494 A/G
NFB rs230544 С/Т провоспалительные
rs230547 С/Т цитокины
rs1585213 G/A
TRAF6 rs5030419 С/G IFN-γ
IRAK1 rs1059703 6434С/Т***
IRAK3 rs3782347 48836A/G вакциноиндуцированные Ig
rs4251520 13423Т/С
? 877С/T
IL-1, IL-18
IRAK4 ? 620–621del
провоспалительные
? 34C/T (Arg12Cys)
цитокины
Jun rs11688 750G/A IL-6, TNF-
Ассоциации генотипа по HLA и фенотипа при инфекции
Ген Аллели и гаплотипы Патоген Фенотипическая ассоциация
DRB1*1101 HCV устойчивость к инфекции
DRB1*1101 спонтанный клиренс инфекции
DRB1*06, *08, *16 хронический гепатит

DRB1*07, DRB1*1101/1104, DRB1*1201 устойчивость к инфекции

DRB1*1301, *1302 спонтанный клиренс инфекции


DRB1*14 HBV ответ на лечение интерфероном
DRB1*03, *07, *09, *12, *15 хроническая инфекция
DR6, DR13 спонтанный клиренс инфекции
DR9 хроническая инфекция
HLA-DR DR10, DRB1*0301 хронический гепатит

DRB1*0101, *1101, *1104, *1501


HCV спонтанный клиренс инфекции
DR13
H. pylori-ассоциированный
DRB1*0301 H. pylori аутоиммунный тиреоидит и
аутоиммунный гастрит

DQB1*1001 тяжелая нецеребральная малярия


P. falciparum
DRB1*1302 устойчивость к малярии
DQB1*0303, DQB1*0301/*0304,
DQB1*0502, DQB1*0201, DQB1*0301, HBV хронический гепатит

HLA-DQ DQB1*0301, DQ9

DQB1*0301 устойчивость к инфекции


HCV
DQB1*0501, DQA1*0301,*0302 спонтанный клиренс инфекции
DQВ1*0501 P. falciparum устойчивость к малярии
прогрессирующие эпителиальные
DQ6 (B*0602) HPV16
поражения
HLA-DQ DQB1*0503 прогрессирование туберкулеза
Ассоциации генотипа по HLA и фенотипа при инфекции
Ген Аллели и гаплотипы Патоген Фенотипическая ассоциация
спонтанный клиренс
А*02, A* 0301 HBV
инфекции
HLA-А спонтанный клиренс
A*1101 HCV
инфекции
В*08, В*35, 44-Cw 1601, 44-Cw хроническая инфекция,
HBV
0501 хронический гепатит
спонтанный клиренс
B*57 HCV
инфекции
долговременное отсутствие
B*57, B*14, B*27, Bw-4, B*5701
HLA-В прогрессирования
HIV ускоренное
B*3501
прогрессирование
B*1801, *3520, В*57, В*5801 хроническая инфекция
В*46, В*56 церебральная малярия
P. falciparum
Bw53 устойчивость к малярии
спонтанный клиренс
Cw*0102 HCV
инфекции

HLA-C Cw4
ускоренное
HIV прогрессирование
С*1507 хроническая инфекция
Ассоциация полиморфизмов генов цитокинов с инфекциями и их исходом
Полиморфизмы и
Ген Патоген Фенотипическая ассоциация
гаплотипы
+874A/T
HBV хроническая инфекция
СА-повторы
IFNG +874A/T M. tuberculosis туберкулез
–764G/С HСV спонтанный клиренс
–238G/A
HBV хронический гепатит В
–857C/T
–308G/–238G HBV хроническая инфекция
TNF
–308G/A H. pylori гастрит и рак желудка
СА-повторы HPV18 рак шейки матки
–1082G/А,–819T/C, –592A/C HCV хронический гепатит С и цирроз
–592 C/A
пневмония, осложненная
IL10 +734 G/T RSV и другие возбудители
сепсисом
+3367 G/A
–592A/C M. tuberculosis туберкулез
хроническое воспаление и
–174G/С разные возбудители
тяжелый сепсис
сепсис, острый респираторный

IL6 –174G/С разные возбудители дистресс-синдром,


генерализованное воспаление
–236G HIV и KSHV саркома Капоши
+4272C/T вирус кори корь
Фармакогенетика в персонализированной медицине

Фармакогенетика

Полиморфизм Скрининг SNP или других


генов-кандидатов полиморфизмов

Идентификация фармако-
логических мишеней

Идентификация локусов предрасположенности к болезни

Определение функционального значения полиморфизма

Молекулярная диагностика

Индивидуальная пациентоспецифичная терапия


Инновационная биосенсорная
технология PLEX
Метод основан на сочетании
мультиплексной ПЦР с время-
пролетной масс-спектрометрии
нуклеиновых кислот

Возможности технологии
• SNP-генотипирование
• Количественный анализ экспрессии генов
• Идентификация микроорганизмов (практически
все бактерии, вирусы, грибы, определенные
виды простейших, в том числе информация о
лекарственной устойчивости, вирулентности,
токсикогенности)
• Количественный анализ метилирования ДНК
• Профилирование редких соматических мутаций
Апоптоз
Энергозависимый, генетически
детерминированный процесс
упорядоченной гибели отдельных
клеток, который происходит в
нормальных и патологически
измененных тканях эукариотов под
действием внутри- и внеклеточных
стимулов.
“Термин “апоптоз” предложен для обозначения до сих
пор недостаточно понятного механизма
контролируемого разрушения клеток … это
активный, по сути программируемый феномен, для
которого доказана возможность активации или
подавления различными стимулами окружающей
среды, как физиологическими, так и
патологическими”.

Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. (из статьи “Апоптоз:


фундаментальный биологический феномен,
широко участвующий в кинетике тканей”, 1972 г.)
Сравнительная морфология апоптотического и
некротического типов гибели клетки (по: Wyllie et al., 1998)
Механизмы программированной
гибели клеток
• Внеклеточный (лиганд-рецепторное
взаимодействие)

• Внутриклеточный
- митохондриальные рецепторы (белки
суперсемейства Bcl-2)
- каспазы
- протеазы
- белки теплового шока
Методология исследования апоптоза
• Маркеры апоптотических процессов отличаются
лабильностью, а изменения регуляции апоптоза зачастую
предшествуют развитию клинической картины;
• При различных патологических процессах устойчивость
клеток к индукции апоптоза, механизмы его развития
могут существенно искажаться;
• Применение адекватных методов исследования апоптоза
при различных патологических процессах является
необходимым условием изучения патогенеза
заболеваний;
• В лабораторной практике требуется определение
нескольких показателей, а комплекс методов должен быть
взаимодополняющим по информативности
(феноменологические признаки, состояние молекулярных
механизмов инициации и регулирования);
Выделяют две группы
исследований

- Морфофункциональные (клеточный и
субклеточный уровень)

- Молекулярно-диагностические
(уровни: генетический, рецепторный,
регуляторный, эффекторный)
Морфофункциональные исследования
• Выявление интегральных структурно-
функциональных признаков апоптоза

• Определение специфичных для апоптоза


изменений плазматической мембраны
клеток

• Оценка митохондриальных процессов

• Изучение характера фрагментации ДНК


Морфофункциональные исследования
• Выявление интегральных структурно-
функциональных признаков апоптоза

• Определение специфичных для апоптоза


изменений плазматической мембраны
клеток

• Оценка митохондриальных процессов

• Изучение характера фрагментации ДНК


Характеристика флюорохромов,
применяемых для изучения апоптоза
Проникающая Характеристика
способность в клетку окраски
Краситель
интактная повреждѐнная ядро цитоплазма
мембрана мембрана (ДНК) (РНК)

Акридиновый
+ + зелѐная красно-оранжевая
оранжевый

Hoecsht 33342 + + голубая нет

Hoecsht 33258 - + голубая нет

DAPI (4’,6-диамидин-2’-
ярко
фенилиндол- - + нет
голубая
дигидрохлорид)

Этидиум бромид - + оранжевая слегка красная

Пропидиум йодид - + красная нет


Морфофункциональные исследования
• Выявление интегральных структурно-
функциональных признаков апоптоза

• Определение специфичных для апоптоза


изменений плазматической мембраны
клеток

• Оценка митохондриальных процессов

• Изучение характера фрагментации ДНК


Проточно-цитометрический анализ клеток линии Jurkat в состоянии
апоптоза: до (а) и после (б) обработки камптотецином. На левом графике
в нижнем правом квадранте расположены клетки, находящиеся в
состоянии апоптоза (аннексин V – позитивные, PI – негативные). Клетки,
не обработанные индуктором апоптоза, первоначально негативны по
аннексин V-FLUOS и PI. После обработки камптотецином и инкубации
клеток в течение нескольких часов выявляется довольно высокая доля
клеток, находящихся в состоянии апоптоза.
Люминесцентно-микроскопическое изображение клеток
линии SKW6.4, окрашенных препаратами и их сочетаниями:
а – аннексин V-FLUOS (окрашены только мембраны);
б – DAPI (видна характерная для апоптоза конденсация ядер);
в – аннексин V-FLUOS и пропидиум йодид (четко
дифференцируются апоптотические и некротические клетки).

а б в
Морфофункциональные исследования
• Выявление интегральных структурно-
функциональных признаков апоптоза

• Определение специфичных для апоптоза


изменений плазматической мембраны
клеток

• Оценка митохондриальных процессов

• Изучение характера фрагментации ДНК


Морфофункциональные исследования
• Выявление интегральных структурно-
функциональных признаков апоптоза

• Определение специфичных для апоптоза


изменений плазматической мембраны
клеток

• Оценка митохондриальных процессов

• Изучение характера фрагментации ДНК


Выявление апоптотических клеток
TUNEL-методом в эндометрии
Морфофункциональные исследования

Не позволяют определить
состояние ключевых
молекулярно-патологических
звеньев апоптоза
Молекулярно-диагностические
исследования
• Оценка эффективности рецепторных
механизмов активации апоптоза

• Оценка экспрессии ключевых регуляторных


белков

• Определение активности каспаз


Молекулярно-генетические
исследования
• Мутационные изменения

• Идентификация спонтанных и
индуцированных апоптотических процессов

• Малые интерферирующие РНК


Современные представления об
апоптозе
– сформированы единые представления о типах
гибели клеток;
– изучаются молекулярные механизмы и
феноменология программированной гибели
клеток;
– разрабатывается методология исследований
апоптоза как основного типа программированной
гибели клеток;
– идентифицируются молекулярные мишени
ключевых звеньев нарушений апоптоза при
различных заболеваниях;
– создаются фармакологические средства для
целенаправленного регулирования
программированной гибели клеток при различных
патологических процессах.
Кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики
ВМедА им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург
БЛАГОДАРЮ ЗА
ВНИМАНИЕ!

Вам также может понравиться