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Tema 10
Los métodos que se utilizan en análisis químico presentan una selectividad más o
menos alta, si bien, existen muy pocos que sean verdaderamente específicos. Por ello,
en muchas ocasiones, la separación del analito de las posibles sustancias interferentes
suele ser una etapa fundamental en los procedimientos analíticos. Sin duda, la
Cromatografía es uno de los métodos de separación más poderosos que se hayan
descubierto. Fue desarrollada originalmente por el botánico ruso M. S. Tswett como
técnica para la separación de pigmentos vegetales coloreados, y la I.U.P.A.C.* la define
como:
CaCO 3
eluato
a b c d
Figura 10.1. Separación hipotética de tres componentes de una mezcla por cromatografía en columna.
volumen o tiempo
Figura 10.2. Cromatograma de la mezcla de tres componentes de la figura 10.1.
* Aunque es posible recoger distintas fracciones de fase móvil que sale de la columna y determinar en cada
una de ellas la concentración de soluto, normalmente el efluente se monitoriza continuamente con un
detector que mide alguna propiedad física o química del soluto o de la fase móvil.
Introducción a los Métodos Cromatográficos 4
1. Cuando se utiliza como fase móvil un fluido a presión y temperatura superiores a la crítica se tiene un tipo
de cromatografía denominada de fluido supercrítico.
2. Además de los mecanismos mencionados existen otros tales como: fase enlazada, interacción iónica,
afinidad, quelación.
3. El mecanismo es de adsorción cuando la fase móvil en un líquido polar.
4. El mecanismo puede ser de reparto cuando la fase móvil es un líquido no polar
Columnas cromatográficas
* Las siglas HPLC corresponden a las iniciales de la denominación en inglés High Performance Liquid
Chromatography.
Introducción a los Métodos Cromatográficos 6
pared de la columna
a b c
Figura 10.4. Columnas tubulares abiertas. a) de capa porosa. b) con pared recubierta. c) con soporte
recubierto.
Intercambio catiónico:
Matriz-A– M+ + X+ —> Matriz-A–X+ + M+
Intercambio aniónico:
Matriz-A+M– + Y– —> Matriz-A+Y– +M–
La fase móvil suele ser una solución acuosa tamponada y la separación se produce
por la competencia que se establece entre los iones de la fase móvil y los iones del
analito por los centros activos de la resina. Este tipo de cromatografía se utiliza
ampliamente en química inorgánica para la separación de iones metálicos, así como en
sistemas biológicos para la separación de compuestos iónicos solubles en agua.
interfase
soluto
.
centros
activos
a) adsorción b) reparto
contraión
FUNDAMENTOS TEORICOS
AS
KA=
AM
KA > KB > KC
A B C
A BC A B C
RETENCION Y DISTRIBUCION
* En cromatografía de gases con detector de conductividad térmica suele inyectarse, junto con la muestra,
unos micro-litros de aire,.
Claudio González Pérez 11
tM: tiempo muerto (tiempo requerido para que una especie no retenida alcance el detector)
VM: volumen muerto (volumen de fase móvil que se requiere para eluir una especie no
retenida)
VR: volumen de retención (volumen de fase móvil que se requiere para eluir un soluto de la
columna cromatográfica)
h: altura de pico; w: anchura de pico; w1/2: anchura de pico a la semialtura
w0,1: anchura de pico a un décimo de la altura.
* Interacciones electrostáticas entre especies de carga opuesta, como las que tienen
lugar en separaciones por cromatografía iónica.
* Interacciones por fuerzas de van der Waals del tipo dipolo-dipolo (orientación) o del
tipo dipolo-dipolo inducido (inducción)
o lo que es lo mismo*,
' tR — tM
k =
tM
* La ecuación k' = m /m representa la relación entre la probabilidad de que una molécula de soluto
s M
permanezca en la fase estacionaria y en la fase móvil y esta relación de probabilidad es tambien igual a la
relación entre el tiempo que en promedio una molécula de soluto permanece en la fase estacionaria y en la
fase móvil.
Claudio González Pérez 13
' t R — t M VR — VM
k = =
tM VM
Los factores de retención grandes favorecen una buena separación, pero también
incrementan el tiempo de elución y el ancho de banda. Idealmente, las separaciones se
realizan en unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de
una mezcla oscilan entre 1 y 5.
VR = VM (1 + k')
VR = VM (1 + K VS/VM)
ó
VR = VM + K VS
VR = VM + kA As
y, por otra parte, puede determinarse fácilmente de forma directa midiendo los
tiempos de retención de las especies A y B sobre un cromatograma experimental, ya
que,
tR B — tM
α=
tR A — tM
La observación de los picos cromatográficos muestra una gran semejanza con las
curvas de error normal o Gaussianas, lo cual puede explicarse de la forma siguiente:
durante el desplazamiento por el interior de una columna cromatográfica, una
partícula individual de analito experimenta miles de transferencias entre las fases
móvil y estacionaria. El tiempo de residencia en una fase dada es muy irregular,
pudiendo ser muy pequeño en algunas etapas, y relativamente grande en otras. Por
ello, el tiempo de permanencia de la partícula en el interior de la columna también será
irregular, ya que solamente se eluye cuando reside en la fase móvil; algunas partículas
se desplazarán rápidamente, debido a que permanecen más tiempo en la fase móvil,
mientras que otras lo harán con mayor lentitud, como consecuencia de su mayor
permanencia accidental en la fase estacionaria.
w 1/2 =2.35 σ
1/2 h
w=4 σ
Volumen
Figura 10.9. Pico cromatográfico ideal.
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Por otra parte, la anchura de los picos está directamente relacionada con el
tiempo de residencia en la columna (inversamente proporcional a la velocidad de flujo
de la fase móvil), ya que a mayor tiempo, mayor dispersión, de forma que las especies
eluidas al final presentan picos más anchos que las eluidas al comienzo, como se
muestra en la figura 10.2.
L
H=
N
Es necesario indicar que las columnas se comportan a menudo como si tuvieran
distintos números de platos para distintos solutos en una mezcla.
CS .
CS CS
CM CM CM
Respuesta
Respuesta
Respuesta
a a b
b 10 % h
t t t
a b c
El cálculo del número de platos cuando los picos son asimétricos es más
complicado que cuando son simétricos. Para ello se han propuesto diversos métodos,
siendo uno de los más empleados el que hace uso de la relación
2
41.7 t R w
0,1
N=
a + 1.25
b
donde w0,1 es la anchura de pico a un décimo de la altura, y a/b (ver figura 10.10.) el
denominado factor de asimetría.
Teoría cinética
B
H=A+ +Cu
u
donde u es la velocidad lineal media de la fase móvil (u=L/tM; L=longitud de la columna;
tM=tiempo muerto).
fase
móvil 2
a b
Figura 10.11. Trayectorias de la fase móvil.
A = λ dp
donde λ es una constante que depende de las dimensiones, geometría y uniformidad
del empaquetamiento de la columna, y dp es el diámetro medio de las partículas de la
fase estacionaria. Según la expresión anterior, partículas pequeñas y uniformemente
empaquetadas conducirán a columnas más eficaces, si bien, ello implicará el empleo de
presiones altas. Por otra parte, el término A es cero para columnas tubulares abiertas,
debido a que la fase estacionaria en tales columnas se deposita directamente sobre la
pared de la columna.
perfil de
concentraciones
fase
móvil
a b
B = 2 γ DM
donde γ es un factor de impedimento que depende de las características del relleno de
la columna (γ suele ser 0.7 para columnas con relleno y 1.0 para columnas tubulares
abiertas)
Fase
móvil
Equilibrio
Fase
estacionaria
Fase
móvil
No equilibrio
Fase
estacionaria
En cromatografía de gases, los efectos de la fase móvil, CM, son mucho menores
que los correspondientes de la fase estacionaria, CS, mientras que en HPLC, CM y CS
tienen valores comparables.
B
A+ +Cu
u
Cu
B/u
Las curvas de la ecuación de van Deemter son similares para CG y para CL,
presentando, en todos los casos un valor mínimo de H para una determinada velocidad
de la fase móvil (condición óptima). A velocidades inferiores a la óptima la difusión
longitudinal (B) origina un incremento en la altura de plato y un ensanchamiento de la
banda, mientras que a velocidades superiores, la resistencia a la transferencia de
masa (equilibrio lento) entre fases provoca que el soluto se extienda.
estacionaria, de forma que cualquier zona del sistema en la que estén presentes el
soluto y la fase móvil, pero no expuesta a la fase estacionaria contribuye a la difusión
del soluto y, en consecuencia, al ensanchamiento de las bandas cromatográficas. Es
evidente, que deberán usarse tubos estrechos para las conexiones entre el sistema de
inyección y la columna, y entre ésta y el detector.
En cuanto a los detectores, su propio volumen podrá actuar como una verdadera
cámara de mezcla. Deberán diseñarse de forma que su volumen sea pequeño y de que
se mantenga un flujo laminar en su interior.
RESOLUCION Y SU OPTIMIZACION
2 t RB — t RA
R=
wA— wB
o. alternativamente,
2 t RB — t RA
R=
1.699 w 1/2 A + w 1/2 B
Si R=1.5, los dos picos solo se superponen un 0.3 %, mientras que si R=1, la
superposición es del orden del 2 %, que puede considerarse adecuada para muchos
análisis.
'
1 α—1 k
R= N
4 α '
1+k
donde k' es el valor medio de k'A y k'B. Esta expresión indica que la resolución
depende de la eficacia global de la columna (N), de la capacidad de la fase estacionaria
para retener a los componentes (α) y de las características de retención de cada
componente (k).
Cuando una muestra está constituida por un gran número de componentes, puede
ocurrir que se consigan las condiciones óptimas para la separación de algunos , pero
ello vaya en detrimento de otros. En estos casos suele recurrirse a cambiar las
condiciones mientras se realiza la separación, para lo cual, puede utilizarse la elución
con gradiente (variación gradual de la composición de la fase móvil durante la elución)
o la programación de temperatura (variación de la temperatura durante la elución).
Introducción a los Métodos Cromatográficos 26
En análisis cualitativo sus aplicaciones son bastante limitadas, sobre todo cuando
se compara la información que proporciona un cromatograma con la que puede
obtenerse con otras técnicas como espectroscopia infrarroja, de resonancia
magnética o de masas. De todas formas, la cromatografía es una herramienta
importante para reconocer la presencia o ausencia de componentes en mezclas que
contengan un número limitado de posibles especies de las que se conozca su identidad.
Por otra parte, en ocasiones interesa conocer si un determinado componente está
ausente en una muestra. En estos casos, muchas veces la cromatografía proporciona
una evidencia segura en este sentido, al no aparecer el pico, o la mancha,
correspondiente al patrón en las mismas condiciones de operación.
Análisis Cuantitativo
En cromatografía plana (papel y capa fina) el área ocupada por las especies
separadas es el parámetro utilizable en análisis cuantitativo.
* La altura de un pico cromatográfico se obtiene uniendo las líneas base a cada lado del pico por una línea
recta y midiendo la distancia perpendicular desde esta línea al pico.
* En el caso de no disponer de estos equipos, un método sencillo para picos simétricos consiste en
multiplicar la altura de pico por la anchura a la semi-altura. Otros métodos implican el uso de planímetros o
incluso la determinación gravimétrica, consistente en recortar el pico y determinar su peso relativo respecto
al peso de un área conocida del papel de registro.
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Muestra Muestra
(salida) (salida)
Eluyente Eluyente
Columna Columna
a) b)
Acorregida de x
% de x = . 100
Acorregidas