Бактерицидный эффект нетепловой плазмы in vitro, в отношении

биологических пленок и моделей инфицированных ран у животных

Нетепловая (низкотемпературная) плазма активно исследуется в качестве
альтернативного метода контроля поверхностных раневых и кожных
инфекций, когда эффективность химических факторов является низкой за
счет собственно действия патогена или сопротивления биопленки. Цель
данного исследования заключалась в проверке индивидуальной устойчивости
патогенной бактерии к нетепловой плазме аргона и в оценке эффективности
воздействия плазмы против бактерий в биопленках или раневых
поверхностях. В целом, грамотрицательные бактерии проявляли большую
устойчивость к действию плазмы, чем грамположительные бактерии. После
воздействия плазмой на грамотрицательные бактерии Pseudomonas
aeruginosa, Burkholderia cenocepacia и Escherichia coli в течение 5 минут при
изначальном значении КОЕ 10^5 не наблюдали выживших. Устойчивость
грамположительных бактерий оказалась видо- и штамм-специфической.
Streptococcus pyogenes оказались наиболее устойчивыми, наблюдали 17%
выживших после воздействия плазмой в течение 5 минут при изначальном
КОЕ 10^5. Staphylococcus aureus показали штамм-зависимую устойчивость от
0 и 10% выживших при изначальном значении КОЕ 10^5 у штаммов Sa 78 и
ATCC 6538 соответственно. Staphylococcus epidermidis и Enterococcus faecium
проявляли среднюю устойчивость. Неионизированный газ аргона не
проявлял бактерицидного эффекта. Биопленки частично защищали бактерии,
причем степень защиты зависела от толщины биологической пленки.
Выживаемость бактерий в более глубоких слоях биопленки после
воздействия плазмой была выше. Для определения эффективности лечения
плазмой аргона использовали модель резаной раны, инфицированной
P.aerugenosa и чувствительный к плазме штамм Staphylococcus aureus Sa 78.
10 минут воздействия значительно снизили бактериальную обсемененность
на раневой поверхности. Животные, получавшие пятидневный курс
ежедневных сеансов лечения плазмой, избавились от P.aerugenosa на 2 дня
раньше, чем контрольная группа. Статистически значимое увеличение
скорости ушивания раны у животных наблюдалось после третьего дня курса
лечения плазмой. Заживление ран у животных, получающих лечение
плазмой, замедлилось после завершения курса. В целом результаты показали
значительный потенциал нетепловой плазмы аргона при ликвидации
патогенетических бактерий из биопленок и поверхностей ран.
ВВЕДЕНИЕ

Оппортунистические бактериальные патогены являются повсеместными

обитателями как окружающей среды, так и среды человеческого организма,
вызывая серьезные инфекции у пациентов с имуннодефицитом. Такие
бактерии, как Staphylococcus aureus, виды Streptococcus и Pseudomonas
aeruginosa являются частыми возбудителями кожных и раневых инфекций
(Brook&Frazier,1988). Применение антибиотиков при терапии часто
оказывается не эффективным в лечении оппортунистических инфекций
вследствие распространенной устойчивости патогенов к антибиотикам (Rice,
2009; Strateva & Yordanov, 2009). Биопленки, образованные прикрепленными
бактериями, в дальнейшем затрудняют уничтожение бактерий (Davey &
O’Toole, 2000; Lynch & Robertson,2008).

Для борьбы с оппортунистическими инфекциями большинство исследований

сосредоточились на поисках химических бактерицидных средств.
Применение физических методов воздействия представляется
альтернативным, если использование химических факторов неэффективно
вследствие собственной устойчивости патогена или биопленки. Одним из
методов физического воздействия с микробоцидным эффектом является
использование нетепловой (низкотемпературной) плазмы (Kayes et al., 2007;
Lee et al., 2006; Venezia et al., 2008). Нетепловая плазма представляет собой
поток частично ионизированного нейтрального газа при контрольной
температуре окружающего воздуха и атмосферном давлении (Kong et al.,
2009; Moreau et al., 2007, 2008). Плазменная горелка содержит электроны,
ионы, свободные радикалы и молекулы в возбужденном состоянии наряду с
УФ радиацией (Hury et al., 1998; Lassen et al., 2005; Lerouge et al., 2000a;
Purevdorj et al., 2003; Shimizu et al., 2008). Антимикробный эффект плазмы
обусловлен совместным действием реактивных частиц горелки и УФ, что
вызывает окислительный стресс и разрушение структуры ДНК (Kong et al.,
2009;Moisan et al., 2001; Moreau et al., 2007; Sharma et al., 2009; Shimizu et al.,
2008).

Нетепловая плазма может быть эффективна при стерилизации медицинского

оборудования, когда не подходит термическая обработка (Lee et al., 2006;
Moisan et al., 2001; Venezia et al., 2008). О применении нетепловой плазмы
для регенерации кожи в косметологии сообщали Bogle (2006) и Elsaie &
Kammer (2008). Микробицидное действие было обнаружено, когда плазму
применили при работе с контаминированными слоями дентина (Rupf et al.,
2010). Ее неспецифический и проникающий режимы действия позволяют
предположить возможность использования нетепловой плазмы для местного
обеззараживания тканей.

Мы проверили возможность применения нетепловой плазмы аргона для

дезинфекции раневых поверхностей. Бактерицидная активность аргонной
плазмы в отношении основных возбудителей раневых инфекций, среди
которых P. aeruginosa, Staphylococcus aureus и Streptococcus pyogenes, была
проверена in vitro, с последующей проверкой эффективности воздействия
плазмой на бактерии в биопленках и поверхностных ранах затылка у крыс.

МЕТОДЫ

Условия образования штамма и роста бактерий

Список протестированных бактериальных штаммов представлен в Таблице 1.

8 штаммов являлись клиническими изолятами, собранными в больницах
Москвы в 2002-2009 (Avetisian et al., 2009; Shaginian et al., 2010), два были
взяты из коллекции типичных штаммов и один находился в продаже
(Таблица 1). Штамм Burkholderia cenocepacia Bc 46 был выведен из
клинического изолята B. cenocepacia Bc 370 (Shaginian et al., 2003). Bc 46
демонстрировал гиперпроизводительность биопленок вследствие
пласпозонной мутации гена, кодирующего информацию о глобальном
регуляторном белке TetR (Romanova et al., 2009).

Бактерии рутинно культивировали на чашках с кровяным агаром при

температуре 28̊ С (P.aeruginosa and B.cenocepacia) и 37̊ С (другие виды).

Образование биопленки

Для выращивания биопленок использовали штамм грамотрицательных

бактерий B.cenocepacia Bc 46 и штамм P.aeruginosa PA103. В целом, бактерии
выращивали в биопленках так, как описывалось ранее (Kaminskaya et al.,
2007). Вкратце, ночные культуры разводили в 1000 раз в бульоне Луриа-
Бертани и культивировали, не перемешивая, при температуре 28̊ С в течение
72 ч. На матрас вертикально помещали покровное стекло площадью 1.5см^2,
чтобы позволить биопленке образоваться на его поверхности. Стекло
извлекали через 72 ч, осторожно промывали фосфатно-буферным раствором
и воздействовали на биопленки, как описано ниже.

Инфицирование животных

Эксперименты на животных проводились с разрешения Animal Care и Use

Committee of Gamaleya Institute of Epidemiology and Microbiology. Была
проведена анестезия взрослых самцов Sprague Dawley весом 560-700 г
смесью 100 µl Xyla (xylazine, 20 мг мл^-1; Interchemie) and 100 µl Zoletil 50
(Virbac). Раны были сделаны на затылке крысы путем удаления части кожи и
подкожных отеков стерильным скальпелем. Свежие раны покрыли ватными
тампонами, пропитанными 1 мл суспензии смешанных культур P.aeruginosa
PA103 (10^8 КОЕ мл^-1) и Staphylococcus aureus Sa 78 (10^8 КОЕ мл^-1), и
зафиксировали лейкопластырем на 3 дня до их извлечения.

Воздействие на образцы нетепловой плазмой аргона или

неионизированным аргоном

Все эксперименты проводились при помощи устройства MicroPlaSter b device

(Shimizu et al., 2008), позволяющего исследователям использовать два
режима – режим аргонной плазмы и режим плацебо – при потоке
неионизированного аргона. Источник плазмы показан на рис.1. Плазменная
аргонная горелка составляла приблизительно 5 см в длину и 3.5 см в
диаметре. На протяжении всех экспериментов, на раневые поверхности
воздействовали на расстоянии 2+/- 0.2 см от источника при температуре газа
36+/-̊ С.

Воздействие на чистые культуры бактерий

Десятикратно разведенную бактериальную суспензию в фосфатно-буферном

растворе поместили на чашки с кровяным агаром при КОЕ 10^3-10^5 на
чашку. На бактерии воздействовали плазмой или неионизированным аргоном
в течение 2, 5 или 10 мин. Контрольные образцы оставляли
необработанными. Чашки инкубировали в течение 72 ч (Streptococcus
pyogenes) или в течение 48 ч (другие бактерии), и колонии бактерий были
подсчитаны при помощи устройства для подсчета колоний (Schuett-Biotec).
Эффективность воздействия определяли как процентное соотношение КОЕ
на обработанных чашках и КОЕ на необработанных чашках с самым низким
разведением, при котором наблюдали выживших бактерий.

Воздействие на биопленки и оценка

При проведениях данных экспериментов использовали биопленки,

культивированные на покровных стеклах, как было описано выше. Для
качественной оценки, стекла с культивированными биопленками P.aeruginosa
помещали в агар и обрабатывали плазмой или аргоном в течение 5 мин,
после чего их перемещали в стерильный фосфатно-буферный раствор и
инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч до полной гибели
бактерий. После этого биопленки метили, используя тест-систему Live/Dead
Cell Viability Assay (Invitrogen), согласно инструкции производителя.
Цифровые изображения были сделаны при помощи конфокального лазерного
микроскопа (Zeiss Axiovert 200M LSM 510 META) как было описано у
Kaminskaya et al. (2007).

Для качественной оценки, биопленки, образованные штаммом B.cenocepatica

Bc 46, соскабливали стерильным лезвием, перемещали в фосфатно-буферный
раствор и частично разрушали при помощи пипетирования. Суспензию
разделяли на две порции. Одну из них помещали в чашку Петри на слой
примерно 1 мм и обрабатывали плазмой или неионизированным аргоном в
течение 5 мин, как было описано выше. Другой образец оставляли
необработанным для контроля. Оба образца полностью дезагрегировали при
помощи интенсивного смешивания в ультразвуковом дезинтеграторе
мощностью 5 Вт в течение 7 s, затем серийные разведения помещали на
чашки с кровяным агаром. Разрушение биопленки контролировали при
помощи визуализации бактерий, применяя окрашивание по Граму (данные не
предоставлены).

Обработка раны и оценка бактериальной нагрузки

Во время проведения всех процедур животные находились под анестезией,

как было описано выше. Для сбора проб с поверхности инфицированных ран
после удаления с них струпьев использовался подходящий тампон-метод.
Тампоны помещали в стерильный фосфатно-буферный раствор, и серийные
разведения бактериальной суспензии высеивали на селективную среду для
подсчета специфических патогенов. Для подсчета количества P.aeruginosa и
Staphylococcus aureus, использовали цетримидный и глицин-теллуритный
агар, соответственно. Впоследствии на животных воздействовали при
помощи плазменной горелки в течение 5 или 10 мин, как было описано
выше, и затем пробы брали вновь. Контрольной являлась группа животных,
на которую перед взятием пробы воздействовали неионизированным аргоном
в течение 5 или 10 мин.

Для оценки влияния на процесс заживления раны с группой, состоящей из 7

животных, в течение 5 дней проводили ежедневные десятиминутные сеансы
плазменного воздействия. Контрольная группа, состоящая из 7 животных,
подвергалась воздействию неионизированным аргоном. После обработки
раны покрыли стерильной медицинской мембраной (Biokol). Пробы брали на
1, 3, 5, 8, и 15 дни. Заживление ран у крыс определяли путем измерения
площади раневой поверхности. Фотографии ран делали каждые 24 ч с начала
обработки до последнего дня проведения процедуры. Контрольные
фотографии делали на 8, 15 и 18 дни. Площадь раневой поверхности
определяли, используя UTHSCSA ImageTool v.3.0 для обработки
изображения.

Статистика

Все эксперименты проводились на дублированных образцах. Для оценки

результатов, полученных in vitro, средние значения и стандартную
погрешность рассчитывали в программе Excel software (Microsoft Office
2007). Для оценки статистической значимости использовали парный t-тест,
используя ту же программу.

Для численной оценки бактерицидного эффекта плазмы in vivo использовали

Stata 10 software (StataCorp LP). При анализе подсчета бактерий на раневых
поверхностях, у животных обнаружили заметное распространение
бактериальной обсемененности. Для корректировки численных данных с
приблизительно нормальным распределением применяли логарифмическое
преобразование данных. Стандартное логарифмическое отклонение, средняя
погрешность и 95% доверительных интервалов (CI) были рассчитаны для
преобразованных данных. Обратное преобразование отклонения дало
среднее геометрическое отношение и CI.

Таблица 1 Штаммы бактерий, использованные в исследовании

Виды Штам Генотип Устойчивос источник Ссылки/поставщ
м ть к:* ик
P.aerugenosa PA 103 дикого типа AZ, I коллекция Avetisian et al. (2009)
клинический Avetisian et al. (2009)
AZ, G, L, T, CX, изолят
Pa 12 CZ клинический Avetisian et al. (2009)
Pa 14 изолят
AZ, L, CX

Staphylococc ATCC дикого типа NF коллекция ATCC

us aureus Sa
6538 P
клинический Shaginian et al.,
A изолят
Sa 78 A, AZ, E, G клинический (2010)
Sa 85 изолят
B. Bc 46 Инсерция гена tetR, ND Дериват Romanova et al.,
cenocepacia стимулирующий клиническог (2009); Shaginian
образование о изолята
биопленок
et al.(2003)
Escherichia JM 109 F9 traD36 proAB ND В Fermentas
coli lacIqD(lacZ)M15/end свободной
A1
recA1 gyrA96(Nalr)
продаже
thi
hsdR17 (rk2mk+)
relA1
 supE44 D(lac–
proAB)
Staphylococc Se Дикого типа ND Клиническ Shaginian et al.
us 14990 ий изолят (2010)
epidermidis
Streptococcu Str 861 Дикого типа ND Клиническ Shaginian et al.
s epidermidis ий изолят (2010)
Enterococcus Ef 42 Дикого типа ND Клиническ Bukharin et al.
faecium ий изолят (1997)
* А, ампициллин; AZ, ацитромицин; CX, цефотаксим; CZ, цефотазидим, Е, эритромицин;
G, гентамицин; I, имипенем; L, левомицетин; Т, тобрамицин.

NF, не обнаружено; ND, не сделано

Рис.1Позиция источника плазмы по отношению к образцу, плазменная

горелка показана справа

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Бактерицидный эффект нетепловой плазмы in vitro

В первоначальном исследовании сравнивали индивидуальную

восприимчивость микроорганизмов, принадлежащих к различным видам и
штаммам в пределах одного вида, используя наиболее частые причинные
факторы нозокомиальных и раневых инфекций: P. aeruginosa, Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli и
Enterococcus faecium (Таблица 1). Большинство штаммов являлись
клиническими изолятами. Устойчивость P.аeruginosa и Staphylococcus к
антибиотикам была описана ранее (Таблица 1).

Восприимчивость к воздействию аргонной плазмой определяли путем

обработки плазмой планктонных клеток бактерий, выращенных на агаровой
питательной среде. Чтобы проверить влияние неионизированного аргона, им
обрабатывали параллельные образцы (см. Методы). В качестве контроля
оставляли чашки с необработанными бактериями. Бактерицидный эффект
определяли как процентное соотношение КОЕ после обработки плазмой или
неионизированным аргоном с необработанными контрольными образцами
(Рис. 2).

Все протестированные штаммы грамотрицательных бактерий P.аeruginosa,

Escherihia coli и B.cenocepacia имели одинаковую восприимчивость к
воздействию плазмой аргона: <1% входных КОЕ формировали колонии
после 2 мин воздействия (Р<0.005) (Рис.2) При изначальном КОЕ 10^5 после
5 мин обработки плазмой выживших не оставалось. Восприимчивость
грамположительных бактерий зависела от вида и штамма. Клинический
изолят штамма Staphylococcus aureus Sa 78 в целом обладал той же
чувствительностью, что и грамотрицательные бактерии; при изначальном
КОЕ 10^5 после 5 мин воздействия выживших не было. Клинический изолят
штамма Streptococcus pyogenes Str 861 и штамм ATCC 6538 (Sa 6538; рис.2)
Staphylococcus aureus из коллекции имели наименьшую чувствительность.
После 5 мин обработки выжили приблизительно 17 и 10% штаммов Str 861 и
Sa 6538, соответственно, с образованием только 5% колоний Streptococcus
pyogenes после 10 мин воздействия (Р<0.05). При воздействии
неионизированным аргоном бактерицидного эффекта не наблюдали.

Полученные результаты предполагают, что, в целом, нетепловая плазма

аргона более эффективна в отношении грамотрицательных, нежели чем
грамположительных бактерий. Различия в структуре клеточной стенки могут
быть критичными для разной чувствительности грамотрицательных и
грамположительных бактерий.

Действие плазмы аргона основано на сложном механизме, работающем при

совместном действии активных частиц различных видов, включая молекулы
ионизированного газа аргона, Ох и NOх и УФ излучение (Shimizu et al.,
2008). В нескольких исследованиях было продемонстрировано, что
бактерицидные дозы УФ излучения сопоставимы для грамотрицательных и
неспорообразующих грамположительных бактерий (Chang et al.,1985; Sharp,
1939). Активные частицы плазмы осуществляют общее механическое
действие на поверхность живых организмов, что было названо термином
"травление" (Chau et al., 1996; Lerouge et al., 2000a; Millard et al., 1976; Moisan
et al., 2001; Moisan et al., 2008). Травление происходит вследствие реакции
между высокоактивных радикалов газа и органическим материалом,
приводящей к образованию побочных продуктов, которые мгновенно
десорбируются с поверхности. Это приводит к перфорации мембран
микроорганизмов, которые, в свою очередь, устраняют препятствие для
вторичных активных частиц, которые могли образоваться в промежуточной
стадии. Эффективность травления зависит от состава плазмы (Lerouge et
al.,2000b). Эффект травления плазмы аргона может быть менее выраженным
у грамположительных бактерий, которые имеют более толстые клеточные
стенки.

В противоположность этому, существование высокочувствительных и

устойчивых штаммов, принадлежащих грамположительным видам
Staphylococcus aureus, использованных в данном исследовании, позволяет
предположить более сложный механизм, который может быть ответственным
за природную устойчивость определенных бактерий к воздействию плазмой.
Этот механизм может учитывать эффективность общего SOS-ответа и
различия липидного и/или протеинового состава, придавая ему значимость
для будущих исследований, в ходе которых следует осветить детали
вызываемых плазмой повреждений и реакции бактерий на них.

Споры бактерий более устойчивы к действию плазмы, чем вегетативные

бактериальные клетки (Hong et al.,2009; Kayes et al.,2007; Lee et al., 2006;
Venezia et al.,2008). При сравнении неспорообразующих грамположительных
и грамотрицательных бактерий получили спорные результаты. В некоторых
случаях не было обнаружено существенных различий (Kayes et al.,2007;
Venezia et al.,2006), тогда как при других исследованиях обнаружили, что
грамположительные бактерии обладали большей устойчивостью, чем
грамотрицательные бактерии (Lee et al.,2006). Такие расхождения можно
объяснить различиями в использованных плазменных устройствах, а
следовательно, и в составе плазмы, оказывающей различное влияние.
Несмотря на это, полученные результаты позволяют предположить, что
штамм-специфичные характеристики устойчивости бактерий также могут
быть причиной расхождений в результатах, опубликованных ранее, где
большая часть исследований проводилась с уникальным штаммом для видов
бактерий (Kayes et al.,2007; Lee et al., 2006; Venezia et al.,2008). Чтобы
определить, свойственна ли различная устойчивость к действию плазмы
только грамположительным бактериям и штамм-специфичная
чувствительность зависит от состава плазмы, необходимы дальнейшие
исследования с использованием большего разнообразия штаммов.

Рис.2

Выживаемость патогенных бактерий после обработки плазмой. Бактерии

выращивали на питательной агаровой среде и проводили 2,5 или 10 мин
экспозицию, как было указано. Процентное соотношение колоний,
образованных после воздействия плазмой, и необработанных контрольных
образцов представлено в качестве процента выживаемости. Крестиками
обозначено отсутствие выживаемости Pa, P. aeruginosa; Ec, Escherichia coli;
Bc, B.cenocepacia; Sa, Staphylococcus aureus; Se, Staphylococcus epidermidis;
Str, Streptococcus pyogenes; Ef, Enterococcus faecium при входном КОЕ 10^5
(Для уточнения деталей о штаммах см. Таблицу 1). Данные представлены с
учетом стандартной погрешности, полученной при проведении трех
экспериментов на дублированных образцах.
Бактерицидный эффект нетепловой плазмы в отношении бактерий в
биопленках

По сравнению с отдельными бактериальными клетками, биопленки

демонстрируют основную форму бактериальной персистенции как на
медицинском оборудовании, так и в хронических ранах (Lynch&Robertson,
2008). В целом, бактерии в биопленках менее чувствительны к
антимикробному воздействию (Davey&O’Toole, 2000). Влияние образования
биопленки на восприимчивость к воздействию плазмой была изучена путем
взятия образцов грамотрицательных бактерий B. Cenocepacia и P. Aeroginosa.

Для количественной оценки бактерицидного эффекта нетепловой плазмы

использовали биопленки штамма Bc 46 B.сenocepacia Вс 46 образовывает
большее количество биопленок за счет мутации гена tetR (Romanova et
al.,2009). Снижение КОЕ в биопленках вследствие плазменной обработки
было обнаружено при проведении трех экспериментов (данные не
предоставлены). Однако, различия в выживаемости крыс,
продемонстрированные в данном исследовании, были намного больше, чем
для изолированных бактериальных клеток. Самый низкий уровень
выживаемости составлял 0.005% от изначальной бактериальной нагрузки,
тогда как 2% бактерий выжило в тех же условиях при проведении другого
эксперимента (Р<0.05). Неионизированный аргон не оказал статистически
значимых изменений в выживаемости бактерий в биопленках (данные не
предоставлены) или, когда им обрабатывали чашки с бактериальными
культурами.

Разброс в данных можно объяснить различной выживаемостью бактерий в

разных слоях биопленки, что указывает на зависимость бактерицидного
эффекта плазмы от толщины биопленки. Чтобы проверить это
предположение и убедиться в очевидности бактерицидного эффекта плазмы
аргона, мы провели микроскопическое исследование выживаемости бактерий
в различных слоях биопленок, образованных P.аeruginosa PA 103.
Эксперименты проводили, используя данный штамм, так как биопленки,
образованные штаммом B. Сenocepacia Вс 46, значительно различаются по
толщине слоев. Более того, важно было убедиться в летальном эффекте
плазмы в отношении бактерий в биопленках по отношению к другой
бактериальной модели.
Обработанные плазмой и неионизированным аргоном биопленки P.аeruginosa
окрашивали при помощи тест-системы Live/Dead Cell Viability Assay,
предоставляющей возможность оценки бактериальных клеток при помощи
двухцветных флуоресцентных меток, основанных на целостности мембраны
(Рис.3). Погибшие (красная метка) бактерии преобладали в обработанных
плазмой биопленках, тогда как биопленки, обработанные аргоном,
содержали больше живых клеток (зеленая метка), чем погибших. Более того,
по сравнению с контрольными образцами биопленок, обработанных
неионизированным аргоном, обработанные плазмой биопленки имели более
высокую концентрацию живых бактерий в более глубоких слоях.
Присутствие погибших клеток в обработанных аргоном биопленках не было
вызвано влиянием неионизированного аргона. Погибшие бактерии также
наблюдали в контрольных необработанных образцах (данные не
предоставлены) и их появление может объясняться условиями эксперимента,
в которых происходило образование биопленок. Случаи гибели бактерий в
биопленках, выращенных в стационарных условиях, были показаны ранее
(Takenaka et al.,2001).

Полученные результаты показали, что бактерии в биопленках были

чувствительны к обработке плазмой аргона, однако эффективность
воздействия от верхнего до глубокого слоев оказалась различной -
следовательно, влияние плазменной обработки может уменьшаться
пропорционально толщине биопленки. Наши данные согласуются с ранее
опубликованными результатами, которые демонстрируют уровень
инактивации вплоть до 99.9% Chromobacterium violaceum, использованных
в качестве модели грамотрицательных микроорганизмов, после 5 мин
обработки биопленки газоразрядной плазмой (Joaquin et al.,2009).
Восприимчивость к воздействию плазмой у грамположительных бактерий в
биопленках в данном исследовании не рассматривалась. Тем не менее, можно
предположить наличие слабого бактерицидного эффекта в отношении
биопленок планктонных клеток как грамотрицательных, так и
грамположительных бактерий. Действительно, исследование
восприимчивости грамположительных бактерий Staphylococcus epidermidis к
плазме скользящего разряда показали, что необходимы четкие временные
рамки для достижения одинакового бактерицидного эффекта в отношении
планктонных бактерий и бактерий в биопленках: наблюдали снижение на 6
логарифмических единиц за 15 мин у планктонных клеток и за 70 мин у
клеток биопленки (Kamgang et al., 2007).
Влияние нетепловой плазмы на инфекции у крыс, вызванные
Staphylococcus aureus и P.aerugenosa

Для оценки эффективности антимикробного действия плазмы in vivo была

разработана модель поверхностной резаной раны у крыс. Свежие раны
затылка у взрослых особей Sprague Dawley были обсеменены смесью
бактериальных суспензий чувствительного к плазме штамма Staphylococcus
aureus Sa 78 и штамма P.aerugenosa РА 103 (КОЕ каждого 10^8), как
описывалось в Методах. Острая раневая инфекция развивалась в течение 3
дней, вызывая местное воспаление, отеки и нагноение (данные не
предоставлены).

Общее количество патогенов перед воздействием, определенное при помощи

взятия поверхностной пробы, находилось в диапазоне от 1×10^3 до 1×10^5
КОЕ на образец для P.aerugenosa и от 2×10^3 до 6×10^5 КОЕ на образец для
Staphylococcus aureus. Бактерицидный эффект плазмы выражали как процент
выживших КОЕ для каждого патогена (Рис.4). После 5 мин воздействия
средняя выживаемость находилась на уровне ˷100% (P<0.05), что
сопоставимо с результатами, полученными у контрольной группы животных,
на которых воздействовали неионизированным аргоном в режиме плацебо.

После десятиминутной обработки плазмой процент выживших КОЕ,

наблюдаемый у различных животных, находился в диапазоне от 0.1 до ˷
100% для P.aerugenosa РА103 и от 1.2 до ˷ 100% для Staphylococcus aureus Sa
78. Среднее геометрическое соотношение для P.aerugenosa равнялось 0.58%
(95% CI 0.3–100 %; P50.055). Для Staphylococcus aureus среднее
геометрическое соотношение составило 6.4% (95%CI 0.8–50.0 %; P,0.05).
Обработка неионизированным аргоном в течение 10 мин не вызвала
существенных отклонений бактериальной нагрузки.

Таким образом, наблюдали сопоставимый бактерицидный эффект в

отношении бактериальных клеток in vitro, биопленок и раневых ценозов
после 2, 5 и 10 мин воздействия (сравните рис. 2 и 4). Isbary et al. (2010)
использовал нитроцеллюлозные фильтры для оценки бактериальной
нагрузки при исследовании бактерицидного эффекта пятиминутного
воздействия нетепловой плазмой аргона в отношении пациентов с
хронически инфицированными ранами. Применение тампон-метода может
частично маскировать бактерицидный эффект на раневой поверхности, и мы
можем не обнаружить никакого влияния на бактериальную нагрузку после 5
мин воздействия. Расположение бактерий глубоко в тканях раны,
образование биопленок и специфический состав раневой жидкости также
может привести к снижению бактерицидного эффекта in vivo. Как бы то ни
было, наши результаты показывают, что бактерии на раневых поверхностях
восприимчивы к воздействию плазмой, хотя для их инактивации требуется
больше времени.

Для оценки потенциала плазмы аргона в качестве ранозаживляющего

фактора применяли пятидневный курс, начинающийся на 3 день после
заражения. Курс включал ежедневное десятиминутное воздействие плазмой.
Контрольную группу животных обрабатывали неионизированным аргоном.
После трех дней применения аргоновой плазмы P.aerugenosa были
полностью удалены из раневых поверхностей. В образцах, взятых у
контрольных животных, P.aerugenosa восстановились в течение двух
последующих дней, в отличие от животных, подвергавшихся обработке
плазмой. Однако, нам не удалось уничтожить Staphylococcus aureus за
пятидневный курс обработки плазмой, и бактерии Staphylococcus aureus
были удалены на восьмой день после начала курса.

При измерении площади раны ежедневно во время проведения курса и на 8,

15 и 18 дни после его начала, статистически значимое увеличение скорости
закрытия раны у обрабатываемых плазмой животных наблюдали с 3 по 5
(последний) дни курса (P<0.05; рис.5). Закрытие раны наблюдали, начиная с
13 дня для контрольных и обработанных плазмой животных. Полное
закрытие раны у контрольных животных происходило на 15 день. Однако,
процесс заживления раны замедлялся у двух из семи обрабатываемых
плазмой животных, чьи раны заживали на 18 день.

Полученные результаты показали, что воздействие плазмой эффективно для

уничтожения бактерий P.aerugenosa и ускоряет процесс заживления ран
(рис.5). В противоположность этому, задержка закрытия раны после
воздействия плазмой у двух животных можно объяснить неполным
уничтожением Staphylococcus aureus или необнаруженной добавочной
инфекцией, так как на селективных средах маркировали только
определенные патогены. Также нельзя полностью исключать возможность
остаточного влияния плазмы на раненные ткани. Хотя воздействие плазмой
не приводило к заметному повреждению раневой поверхности, прямое
влияние плазмы на животные ткани, в частности на иммунные клетки,
которые способны изменить динамику заживления раны, в данном
исследовании не рассматривалось. Нетепловая плазма снижает
жизнеспособность и вызывает апоптоз опухолевых клеток in vitro (Calugaru et
al., 2005). По нашим сведениям, данные о результатах влияния плазмы на
активность иммунной системы и процесса регенерации клеток в ранах пока
не доступны.

В целом, результаты продемонстрировали значительный потенциал

нетепловой плазмы аргона в уничтожении патогенных бактерий как in vitro,
так и in vivo. Комфортная температура и относительно большая область
экспозиции при отсутствии специальных требований к рельефу
обрабатываемых поверхностей в сочетании с бактерицидным действием в
отношении широко распространенных организмов с множественной
устойчивостью к антибиотикам, позволили нам сделать вывод о нетепловой
плазме как о весьма выгодном методе стерилизации. Хотя применение
данного подхода к обработке инфицированных ран требует более обширных
исследований, нетепловая плазма представляется прогрессивным методом
антимикробной обработки ран, инфицированных оппортунистическими
бактериями, когда другие методы оказываются недейственными.

Рис. 4 Бактерицидный эффект плазмы в отношении бактерий в ранах.

Раны, нанесенные на затылки крыс, обсеменяли P.aerugenosa РА103 и

Staphylococcus aureus Sa 78 (КОЕ каждого 10^8). Образцы бактерий собрали
на третий день после инфицирования собрали ватными тампонами. Пробы
брали до и после воздействия плазмой в течение 5 или 10 мин (1 и 2
соответственно) или до и после обработки неионизированным аргоном в
течение 5 или 10 мин (3 и 4, соответственно). Бактерии с тампонов
поместили в фосфатно-буферный раствор и определяли бактериальную
нагрузку после посева серийных разведений на патоген-специфическую
селективную среду. Данные представлены как процентное соотношение
количества бактерий после обработки и изначальной бактериальной нагрузки
у каждого животного. Средние значения, представленные как
горизонтальные линии, были рассчитаны для групп по семь животных в
каждой.

Рис. 5

Влияние 5 дневного курса ежедневного воздействия плазмой на закрытие ран

у крыс. Инфицирование затылочной раны представлено в описании к рис.4.
Значение средней погрешности измеренных раневых площадей, как
описывалось в Методах, показано для групп из семи животных,
обработанных плазмой или неионизированным аргоном. Измерения
проводили, начиная со дня первой процедуры. Последний день обработки
плазмой обозначен стрелкой-указателем. День, когда каждый специфичный
патоген погибал у всех животных, обозначен как X и + для P.aerugenosa и
Staphylococcus aureus, соответственно.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим ADTEC Plasma Technology Co. Ltd, в частности Mr Urayama,

за их вклад в разработку устройства MicroPlaSter. Авторы признательны Dr
A. Valyshev и Dr I. Valysheva за штамм E. faecium Ef 42. Авторы очень
благодарны Professor M. Bland и Dr K. Belyaev за помощь в статистическом
анализе и Professor K. Mathee и анонимным рецензентам за ценные
комментарии рукописи. Работа была проведена при поддержке
Министерства Образования и Науки (гранты 14.740.11.0118 и 02.740.11.0310)
и Российского фонда фундаментальных исследований (грант 08-08-12226).