Diagnostic rapide de la

mammite clinique
Jean-Philippe Roy1, Jodi-Ann Wallace2 &
Caroline Vézina3
1Professeur adjoint, Faculté de médecine vétérinaire, Université de
Montréal
2Clinique vétérinaire Ormstown et étudiante M.Sc., FMV

3Productrice, Ferme Tranquillity, Brownsburg-Chatham

Colloque sur la santé des troupeaux laitiers

12 décembre 2007, Québec – Atelier mammite
 Introduction
• La mammite clinique = raison #1 pour l’usage des
antibiotiques chez les vaches (Erskine et al., The Vet. Clinics of N.A.,
2003)

• En basant certaines décisions de traitement sur

les résultats bactériologiques, l’utilisation
d’antibiotiques peut être significativement
diminuée (Silva, NMC, Proc. 2004)
• Une réduction de l’usage des antibiotiques
aiderait à :
1) prévenir les pertes de lait
2) réduire le risque d’avoir des résidus dans le lait
3) améliorer les taux de succès des traitements en raison
de traitements mieux ciblés (Neeser et al., JAMVA, 2006)
 Situation actuelle
• Actuellement, la bactériologie standard du
lait permet peu d’aider à la prise de
décision pour le traitement des mammites
cliniques (délais 2 à 5 jours)
• Il y a maintenant des outils diagnostiques
rapides de la mammite disponibles
• Comment intégrer ces outils dans la
gestion de la santé du pis à la ferme ou en
clinique vétérinaire ?
 Les pathogènes retrouvés sur
500 cas de mammite clinique
Catégorie de traitement n (%)
Aucune croissance 116 (23,3)
Gram positif 277 (55,4)
Gram négatif 92 (18,4)
Autres (levures/algue) 15 (3)
G. Keefe,
(RCRMB,
Total 500 cohorte
nationale)
 Pas de croissance
• 20 à 50 % des échantillons
• Causes :
– Élimination spontanée des bactéries
– Excrétion cyclique des bactéries
– Faible nombre de colonies (< 100 CFU/ ml)
– Bactéries phagocytées
Les agents pathogènes qui causent la mammite
Gram positif Gram négatif Autres
Staphylococcus spp. Escherichia coli Mycoplasma spp.
Staphylococcus aureus Klebsiella spp. Levures
Streptococcus uberis Enterobacter spp. Prototheca
Streptococcus dysgalactiae Serratia spp.
Streptococcus agalactiae Pasteurella spp.
Corynebacterium bovis Proteus spp.
A. pyogenes Pseudomonas spp.
Outils diagnostiques
 Minnesota Bi-plates

• Développé par Université du Minnesota

• Milieu sélectif : MacConkey et gélose au
sang avec 1 % esculine
• Permet classification des bactéries en
Gram + ou Gram -
• Parfois, peut permettre ID Staph aureus
Minnesota Tri-plates

• Développé par l’Université du Minnesota

• Permet identification Gram +, Gram – et
streptocoques
• Parfois peut permettre ID Staph aureus
 Petrifilm™
• Milieux de culture sélectifs de 3M Microbiologie
• Utilisés présentement dans le secteur alimentaire
(Tassinari et al, Food Quality Magazine, 2006; Ingham et al., J.Food Prot., 2003)

Plaques Staph Express Num. Aérobie (PAC)

(STX)
ID aérobies (Flore totale)
ID Staph. aureus
(Streptocoques)
22-26h - résultats finaux 24h & 48h - résultats
 Petrifilm™

Num. rapide des Num. Coliformes

Coliformes (RCC) (CC)
ID Coliformes ID Coliformes
Changement couleur 6 -12h 24h résultats finaux
24h résultats finaux
 Mise en garde
• La qualité de l’échantillon de lait prélevé
est primordiale
• La technique de prélèvement doit être le
plus stérile possible afin d’éviter la
contamination de l’échantillon et une
interprétation erronée
Application à la ferme

Mammite clinique
 Mammite Clinique
FIÈVRE et/ou ne
Pas de FIÈVRE, mange pas = Mam.
appétit normal = Grade 3 : traitement
Mam. Grade 1-2 : avec anti-
Examen inflammatoires,
prendre échantillon,
attendre résultats fluides, surveille, +/-
pour TX antibiotiques, ±
prendre échantillon
Ensemence 1cc de lait
sur 1.STX 2. CC

Négatif S. aureus, Positif Coliformes

Positif S. aureus Positif croissance

Vérifie CCS Nouvelle infection: Croissance G+ : Aucun Ab IMM;

1er cas, un quartier,
Si chronique, Vérifie CCS et Tx avec anti-
lactation 1 ou 2, bas
haut CCS; histoire de mamm, inflammatoires, fluides et
CCS : Thérapie
Aucun tx, surveille
prolongée Tx IMM produit
ségrégation,
homologué
réforme
S’il n’y a aucun changement Æ
envoyer échantillon congelé
au laboratoire pour une
bactériologie standard

Pas de FIÈVRE,
mange bien = Mam.
Grade 1-2 : prendre
échantillon,
attendre résultats
pour TX
Croissance dans zone
rouge et brune; Strep.
spp. = Tx avec Ab IMM
Staph. aureus:
Vérifie CCS
Si chronique haut CCS = Ou
Aucun tx, ségrégation,
réforme
Mammite Clinique
FIÈVRE et/ou mange
pas = Mam. Grade 3 :
traitement avec anti-
inflammatoires,
fluides, surveille, +/-
Examen antibiotiques, +/-
prendre échantillon
Ensemencer sur Tri-plate
Croissance dans zone
Croissance dans zone
G-; Aucun tx Ab,
G+ seulement : S. aureus
continuer les fluides,
ou Staph. spp.
anti-inflam. et surveille
Staph. aureus:
Staph. spp.
1er cas, un quartier,
lactation 1 ou 2, bas CCS :
Tx avec Ab IMM et surveille
Thérapie prolongée
Adapté de L.Tikofsky
S’il n’y a aucun changement Æ
envoyer échantillon congelé
au laboratoire pour une
bactériologie standard
Application à la ferme

Dépistage du Staph. aureus

 Dépistage de Staph. aureus au vêlage : Ferme XYZ

Vêlage, haut CMT

CCS, achats
+
•Prendre échantillon Composite ou
Surveille CCS
•Ensemence 1cc de lait
sur Petrifilm STX
Aucune
•congèle l’échantillon S. aureus - croissance

S. aureus + Négatif S. aureus, Positif

croissance
Vérifie CCS Nouvelle infection : 1er Croissance G+ :
Si chronique haut cas, un quartier, lactation 1
CCS = Aucun tx, ou 2, bas CCS = Thérapie Vérifie CCS et histoire de
ségrégation, réforme prolongée mammites
Tx IMM produit homologué

S’il n’y a aucun changement Æ envoyer Surveille CCS

échantillon congelé au laboratoire pour
bactériologie standard
Résultats d’études
 Mammite Clinique
FIÈVRE Mam. Grade
Pas de FIÈVRE Mam 3 : prendre
Grade 1-2 : prendre échantillon,
échantillon, attendre traitement avec
Examen
pour résultats de anti-inflammatoires,
culture fluides, surveille

Culture standard à la
ferme

S. aureus S. ag. Staph. spp Strep. spp Coliformes Pas de

croissance

ATB IMM, ATB IMM ATB IMM ATB IMM Pas ATB Pas ATB
ségrégation,
ségrégation Anti- Anti-
réforme
inflammatoire, inflammatoire,
surveille surveille
 Résultats
• Diminution 80 % de l’usage des
antibiotiques lors de mammites cliniques
• 55 % pas de croissance, 25 % Gram –
• Souvent signes de mammite absents 24h
plus tard
• TX = pas de retour plus rapide en
production, pas moins de quartiers perdus,
lait anormal aussi longtemps
 Résultats d’étude

• Étude Université du Wisconsin, 2004

– Implantation d’un protocole de traitement
avec cultures du lait sur STX, CC, PAC
– 600 vaches
– Comparaison des résultats de culture à la
ferme avec et sans protocole de traitement
 Mammite Clinique
FIÈVRE Mam. Grade
Pas de FIÈVRE 3 : prendre
Mam. Grade 1-2 : échantillon,
prendre échantillon, traitement avec
attendre pour
Examen
anti-inflammatoires,
résultats de culture fluides, +/-
antibiotiques &
Ensemencer 1cc de lait surveille
sur 1. STX 2. CC 3. PAC

Négatif S. aureus, Positif Coliformes ou

Positif S. aureus aucune croissance
Positif croissance
PAC +
Vérifie CCS Nouvelle infection:
1er cas, un quartier, Aucun Ab IMM;
Si chronique Croissance G+:
lactation 1 ou 2, bas Tx avec anti-
haut CCS;
CCS: Thérapie Vérifie CCS et inflammatoires, fluides et
Aucun tx,
prolongée histoire de mamm., surveille
ségrégation,
réforme Tx IMM produit
homologué
 Résultats d’étude
Sans Avec
Résultats protocole protocole P value
(n=100 cas) (n=267 cas)

Jours lait jeté 19,7 7,8 <0,001

# tubes IMM/cas 33,3 5,3 * <0,001

Cas qui reçoit tubes
IMM
87 % 33 % <0,001
Coût des tubes et
lait jeté / cas
264 $ 90 $

*une partie de la réduction est due à une changement des tubes IMM à 1x/jr
 Impact économique
• Étude Iowa State : Coût par 100 animaux
présentant une mammite clinique
– Traitement tous les cas : 285 $/100 cas
– Traitement basé sur la culture : 99 $/100 cas
– Le succès thérapeutiques n’était pas différent
entre les groupes malgré un délai de 24
heures
 Impact économique
• Université de Cornell : Un troupeau de 100
vaches peut économiser 3 000 $ par an en
utilisant les traitements basés sur les
résultats de culture
• Si traitement seulement des
streptocoques, économie jusqu’à 5 000 $
par an
 Avantages d’un programme de
contrôle incluant des traitements
basés sur les résultats de culture
• Réduction des coûts des Ab
• Réduction du risque de résidus dans le lait
• Réduction des pertes de lait car moins de
cas traités avec Ab
• Réduction du délai d’attente pour la
réforme
 Avantages de faire la culture à la
ferme ou en clinique vétérinaire

• Accessibilité du laboratoire
– fins de semaine et congés
• Rapidité
– Résultats préliminaires sont disponibles en 24h
 Limitations
• Ne permet pas l’identification des
mycoplasmes
• Les levures peuvent croître sur les
plaques comme un Gram + mais le
traitement antibiotique risque d’empirer la
situation
 Coûts
Bi-plate : 1,75 $

Tri-plate : 2,80 $

Plus frais de transport

 Coûts ($)
Boîte Caisse
•Petrifilm Staph Express 2,34 1,99
•Staph Express Disques 1,53 1,37
•Petrifilm Coliformes 1,00 0,81
•Petrifilm Coliformes Rapides 2,14 1,65
•Petrifilm Count Aérobique 0,91 0,76
•Pipettes stériles 0,17
•Tubes de dilution 1,10
 Coûts de démarrage

EQUIPEMENT COÛTS ($)

Incubateur (aérobie) 37OC 100 - 400
Réfrigérateur/Congélateur 80 - 300
Applicateurs stériles 20 - 40
Matériel pour prise d’échantillons de lait Variable
Pièce propre, tempérée, bien éclairée Variable
Poubelle pour déchets bio-médicaux Variable
MEDIA
 Matériel additionnel

• Microscope et coloration Gram

• Test coagulase
• Autres tests biochimiques
 Prix des incubateurs

HovaBator Incubateur Incubateur de

~ 125 $ portatif ~ 100 $ laboratoire
Compact Incubator
Ranch Cunicole #004-3100 557 $
450-799-5170 Certified Incubator
St-Hyacinthe, QC Thermometer #195-3032 Disponible chez 3M
Nelson Jameson
800-826-8302
 Conclusions
• Ces systèmes de culture ne remplacent
pas les laboratoires commerciaux car ils
ne permettent pas d’identifier tous les
pathogènes présents
• La mise en place d’un protocole de
traitement et de prévention adapté à la
ferme est primordiale (collaboration
producteur - médecin vétérinaire)
 Conclusions
• Permettraient une utilisation plus
rationnelle, économique et
responsable des antibiotiques
• Les milieux de culture sélectifs
Petrifilm et Bi & Tri-plates ont le
potentiel d’être des outils diagnostics
importants à la ferme ou en clinique
vétérinaire
Ferme Tranquillity
 Ferme Tranquillity
• < 2004 : 35 vaches en stabulation attachée
• 2004 : nouvelle étable
– 6 rangées, 130 logettes
– 115 vaches en lactation
– Salon de traite D-8
Westfalia-Surge
Ferme Tranquillity
 Ferme Tranquillity
• 2005 : augmentation des mammites cliniques
– Mammites Grade 3/Sévères
– Envoyer plusieurs échantillons au laboratoire Æ
Mycoplasmes
• Les vaches positives pour Mycoplasmes =
Réforme
• Échantillon du réservoir mensuellement pour
prévention
• Ne pas congeler le lait pour l’analyse des
mycoplasmes
 Ferme Tranquillity
• Été 2005 : Beaucoup de mammites
environnementales; Gram négatifs
(coliformes), et des streptocoques
• On a réalisé que les traitements IMM avec
Ab de tous les cas de mammite n’étaient
pas efficaces ou économiques
– Commande de Tri-plates de Minnesota
 Ferme Tranquillity
• Tri-plates
– Commande 15 Tri-plates à la fois
– Coût : 2,80 $/plaque + coût de transport
~ 77 $ pour 15 = 5,13 $/plaque
• Achat Hova-Bater
• Applicateurs coton-tige
• Tubes d’échantillon pour le lait
• Période d’entraînement
– Un guide d’utilisation (en anglais seulement)
– Suggère de travailler avec votre vétérinaire
 Congélation des
échantillons
(sauf pour mycoplasmes)

Les Tri-plates se
conservent au frigo
L’incubateur
L’incubateur
L’incubateur
 Notre expérience
• On traite beaucoup moins de cas de mammite
avec des antibiotiques
– $$$ épargnés
• Un autre outil très important pour gérer la santé
du pis
• Bonus : les résultats sont disponibles en 24h Æ
permet réagir rapidement
• Avertissements :
- L’entraînement est essentiel
- Quand vous êtes dans le doute : envoyer
l’échantillon congelé au laboratoire
Procédures de mise en culture
• Se laver les mains
• Assainir la surface de travail
• Sortir le matériel
• Sortir les échantillons
• Identifier les plaques
• Inoculer les plaques
• Incuber 24 heures @ 35°C
Technique d’ensemencement
et interprétation
Bi-plates & Tri-plates
 Technique d’ensemencement :
Bi-plates / Tri-plates
• Prendre l’échantillon de lait
• Mélanger l’échantillon
• Tremper l’applicateur coton-tige dans le
lait & ensemencer sur chaque
compartiment du média (retremper entre
chaque section)
• Incuber pour 18-24 heures @ 37°C
• Lecture des plaques pour la croissance
bactérienne
 1

3
 Technique d’interprétation :
Bi-plate
Croissance sur le coté rouge
(gélose au sang) = Gram +

Est-ce qu’il y a une zone claire

(hémolyse) autour de la colonie ?
OUI = Probablement S. aureus
NON = prob. Staph spp. ou Strep.
Technique d’interprétation:
Bi-plate
Croissance sur le côté rose
(MacConkey) = Gram -
Est-ce que la colonie est rose-sec, et la zone
autour de la colonie peut être rose ?
OUI = Probablement
E. coli
 Interprétation : Bi-plate
Est-ce que la colonie est rose-pâle/blanc, et a
l’air muqueux/gluant ?
OUI = Klebsiella
Technique d’interprétation :
Tri-plate

Croissance sur le coté MTKT

(brun) = Juste les Streptocoques
• Laisse à la température de la pièce pour
30 min (pour la réaction esculine)
• Strep. dysgalactiae : colonie bleue-grise
avec aucune hémolyse
• Strep. uberis : colonie très foncée ou noire
Interprétation : Tri-plate
Interprétation : Tri-plate
Interprétation : Tri-plate
Interprétation : Tri-plate

MacConkey
Tri-plates à la ferme
Tranquillity
S. aureus positif

NÉGATIF

NÉGATIF
Staph. spp.

Staph.
spp.
 Strep. spp.

Gram - : Aucune
croissance

Strep.
spp. ou
Strep.
uberis
Strep. uberis
Strep. dysgalactiae
Technique d’ensemencement
et d’interprétation : Petrifilm
STX, RCC, CC, PAC
 Technique d’ensemencement et
d’interprétation Petrifilm - STX
1. En maintenant la pipette perpendiculaire à la
plaque, déposer 1ml de lait au centre de la
plaque
2. Abaisser délicatement la pellicule supérieure
de haut en bas vers l’échantillon pour
empêcher que des bulles d’air ne s’infiltrent
(Ne pas laisser tomber la pellicule)
3. Répartir l’inoculum uniformément en zone
circulaire en exerçant une légère pression
avant que le gel ne se solidifie
4. Incuber les plaques en piles de 20 max à 35°C
24 heures +/- 2h
 Technique - STX
5. Lecture des plaques à 24 ± 2 heures
6. Si croissance de colonies Æ Soulever la
pellicule supérieure & mettre un disque
de Staph Express. Glisser fermement un
doigt sur le dessus de la pellicule
7. Lecture 1-3 hr après (suggère 3h)
• Compter toutes les zones roses, qu’une
colonie soit présente ou non
 Interprétation : Staph Express
Petrifilm (STX) :

Détection : S. aureus

Si seulement des colonies

rouges-violacées sont
présentes :
Colonies rouges-violacées
sont comptées comme des
S. aureus
 Interprétation : STX
Utilisation du disque
• Colonies autres que
rouges-violacées sont
présentes
• Disque est inséré
• Plaque et disque sont
incubés à 35°C de 1-3
heures
• Les zones roses de
DNase sont comptées
comme des S. aureus
1 ml en plaque direct Dilution 1:10
¾ 150 et + colonies, colonies sont ¾ 130 zones roses présentes
petites et les zones sont aussi très ¾ Rapporter 1 300 UFC/ml
petites.
Staph. spp.
 Technique – RCC &CC
1. En maintenant la pipette perpendiculaire à la plaque
déposer 1ml de lait au centre de la plaque
2. Abaisser délicatement la pellicule supérieure de haut
en bas vers l’échantillon pour empêcher que des
bulles d’air ne s’infiltrent (Ne pas laisser tomber la
pellicule)
3. Répartir l’inoculum uniformément en zone circulaire en
exerçant une légère pression avant que le gel ne se
solidifie
4. Lecture des plaques :
• RCC : À 6-14h : noter un changement de couleur (les
zones acides jaunes avec ou sans centre rouge) (Oui
ou Non)
• RCC & CC : À 24h : noter le nombre de colonies et le
nombre de types de colonie (1 ou 2)
Interprétation : Num. rapide des
coliformes (RCC) :
• Num. des coliformes
par les zones acides
(6-14 heures)
• Dénombrer les zones
acides jaunes avec
ou sans centre rouge
comme des
coliformes
Interprétation : RCC
Num. des coliformes par les
zones acides (6-14 heures)
Interprétation : RCC = TNTC
 Plaque coliformes totaux Petrifilm (CC)

Détection : Coliformes
(bâtonnets Gram –)

Interpréter :
Toutes colonies rouges
avec gaz (bulle d’air)
1 ml en plaque direct Dilution 1:10
¾ Beaucoup de gaz et de petites ¾ 125 coliformes
colonies ¾ Rapporter 1250 UFC/ml
¾ TNTC
UFC/ml = (Nb de bactéries X facteur
de dilution) / Nb ml mis en
culture
 Technique d’ensemencement et
d’interprétation Petrifilm - PAC
1. En maintenant la pipette perpendiculaire à la
plaque, déposer 1ml de lait au centre de la
plaque
2. Déposer la pellicule supérieure en la laissant
tomber. Ne pas la déposer en la déroulant
3. Poser un étaleur, coté strié vers le bas, sur la
pellicule supérieure de l’inoculum. Appliquer
une légère pression sur l’étaleur afin d’étaler
l’inoculum sur la zone circulaire. Ne pas
tourner ni faire glisser l’étaleur
4. Lecture des plaques PAC :
• À 24 h : noter le nombre de colonies
Technique d’interprétation : PAC
 Est-ce applicable dans votre
ferme ou votre clinique ?
1. Est-ce que vous avez des protocoles différents
pour des types d’infections différentes ?
2. Est-ce que vous avez une personne fiable qui
aura le temps de faire les cultures ?
3. Est-ce que vous avez un nombre d’échantillons
suffisant de mammite/vêlage/aug. CCS pour
qu’une personne développe une expertise ?
4. Est-ce que les producteurs et médecins
vétérinaires sont prêts à embarquer dans ce
type de protocole ?
Petrifilm ou Bi-plate/Tri-plate ?
• Cela dépend de votre troupeau
– Le nombre de vaches, le nombre de cas
cliniques et sous-cliniques
• Durée de vie du milieu de culture
– La prévalence des différentes bactéries
(S. aureus vs streptocoques vs
coliformes)
– Vos objectifs en santé du pis
• Mammite clinique
• Mammite sous-clinique : Contrôle S. aureus
Parlez-en à votre médecin
vétérinaire!